Département de Génie Bio-Industrie et Environnement

Filière DUT : Génie Bio-Industriel

Rapport de Stage de Fin d’Études

Contrôle de la salubrité des aliments, des eaux

et des surfaces des hôtels

Champ d’application :

Laboratoire HACCP M. MAROC

Préparé par : Encadré par :

Mme Malika HACHAD Mme Bouchra BENNOUNA

Mme Fatima ABATACHE Mr. Hafid EL ABASSI

Soutenu le 13 Juin 2017 devant les membres de jury :

Mme Bouchra BENNOUNA : Professeur à l’EST Agadir

Mr. Fouad ACHEMCHEM : Professeur à l’EST Agadir

Année universitaire 2016/2017

À nos chers parents

À toutes nos familles

À tous nos amis...

 Remerciements
Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant de nous avoir aidé à porter

ce travail à son terme.

Ensuite, nous adressons nos remerciements à la direction de l’École

Supérieure de Technologie d’Agadir de nous avoir donné cette opportunité.

Aussi, nous souhaitons remercier particulièrement et infiniment Mme

Bouchra BENNOUNA, pour son encadrement fructueux, sa générosité, et son

suivi au cours de notre stage.

De plus, nos sincères remerciements vont à Mr. Samir MAHFOUD FILLALI

directeur du laboratoire qui nous a permis de faire ce stage. Ainsi, on exprime

notre gratitude à Mr. Hafid EL ABASSI technicien du laboratoire qui a

supervisé notre stage, à Mme Asmae MOUDDEN et Mme Majda SARAB

consultantes et auditrices pour leur soutien et les informations qu’elles nous

ont prodiguées avec intérêt.

Par ailleurs, on présente nos profonds respects et nos reconnaissances à

l’ensemble du corps enseignant de la filière Génie Bio Industriel pour la

formation qu’ils nous ont donné au cours de ces deux dernières années.

Enfin nos vifs remerciements vont à tous ceux qui ont participé du près ou de

loin à la rédaction de ce rapport.

 Sommaire
Remerciements

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste d’abréviations

Introduction générale .......................................................................................................... 6

Chapitre 1 : Présentation du champ d’application .......................................................... 7

1. Présentation du laboratoire ...................................................................... 8

2. Fiche technique ....................................................................................... 9
3. Organigramme ....................................................................................... 10
4. Activités du laboratoire ........................................................................ 10

Chapitre 2 : Synthèse bibliographique ............................................................................ 11

1. Microorganismes recherchés dans les aliments .................................... 12

2. Maladies d’origine alimentaire ............................................................. 14
3. Principe des analyses microbiologiques ............................................... 16
4. Principe des analyses physico-chimiques ................................................. 17

Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application .................................... 19

1. Analyses microbiologiques effectuées sur les aliments ........................ 20

2. Analyses effectuées sur l’eau ................................................................ 25
3. Contrôle des surfaces ............................................................................ 31
4. Exemple d’application ......................................................................... 33

Conclusion .......................................................................................................................... 38
Bibliographie ...................................................................................................................... 39

Annexe ................................................................................................................................ 40
 Liste des tableaux

Tableau 1.1. Fiche technique du laboratoire HACCP M. MAROC ............................... 9

Tableau 3.1. Microorganismes recherchés dans l’eau.................................................... 27

Tableau 3.2. Analyses microbiologiques sur les surfaces ............................................... 32

Tableau 3.3. Résultats bactériologiques de l’eau de piscine .......................................... 33

Tableau 3.4. Résultats des analyses microbiologiques de l’eau de cuisine ................... 34

Tableau 3.5. Résultats des analyses microbiologiques du gâteau au chocolat ............. 35

Tableau 3.6. Résultats des analyses microbiologiques de la salade composée ............. 36

Tableau 3.7. Résultats des analyses microbiologiques du tagine de viande ................. 36

 Liste des figures

Figure 1.1. HACCP GROUPE ........................................................................................... 8

Figure 1.2. Liste des clients du laboratoire HACCP M. MAROC ............................................. 8

Figure 1.3. Organigramme du laboratoire HACCP M. MAROC ................................... 10

Figure 2.1. Saccharomyces cerevisiae ............................................................................... 13

Figure 2.2. Escherichia coli ............................................................................................... 13

Figure 2.3. Clostridium perfringens .................................................................................. 14

Figure 2.4. Staphylococcus aureus .................................................................................... 14

Figure 2.5. Méthode d’ensemencement en surface ......................................................... 16

Figure 2.6. Méthode d’ensemencement en masse ........................................................... 16

Figure 2.7. Filtration sur membrane ............................................................................... 17

Figure 2.8. Dosage colorimétrique ................................................................................... 18

Figure 3.1. Milieux de culture et substances ajoutées .................................................... 21

Figure 3.2. Préparation des milieux de culture ............................................................... 22

Figure 3.3. Appareil de Stomacher .................................................................................. 22

Figure 3.4. Préparation des dilutions décimales ............................................................. 23

Figure 3.5. Mode opératoire de la filtration par membrane ......................................... 26

Figure 3.6. pH-mètre ......................................................................................................... 30

Figure 3.7. Comparateur à disque ................................................................................... 30

Figure 3.8. Méthode d’utilisation du pro-clean .............................................................. 31

Figure 3.9. Ecouvillon pro-clean ...................................................................................... 31

Figure 3.10. Prélèvement des surfaces par écouvillon .................................................... 32

 Liste d’abréviations
ASR Anaérobies Sulfito-Réducteurs
DPD Dipropyl-p-phénylénediamine
EDS Eau déstilée stérile
E.D.T. A Ethyline Diamine TétraAcétique
EPT Eau peptonée temponée
FMAT Flore Mésophile Aérobie Totale
HACCP Hazard analyticcritical control point
NET Noir d’Eriochrome T
PCA Plat Count Agar
pH Potentiel hydrogène
Ppm Partie par million
TA Titre alcalimétrique
TAC Titre alcalimétrique complet
TH Titre hydorthimétrique
TSC Tryptose-sulfite à la cyclosérine
UFC Unité Formant Colonie
VBRL La gélose à la bile, au rouge neutre, au cristal violet et au lactose
 Introduction générale
Le risque de contamination alimentaire est toujours présent dans n’importe quelle cuisine

ou dans n’importe quelle entreprise de restauration de plus grande envergure. Quelle que

soit la nature de l’activité de cette entreprise, elle doit répondre à certaines exigences en

matière de santé et de sécurité et respecter des règlementations strictes en matière

d’hygiène alimentaire. Une mauvaise hygiène alimentaire porte préjudice à la réputation du

personnel et à la rentabilité de l’établissement. Gérer ce risque est tout à fait possible, il

peut même être éliminé en appliquant les procédures adéquates.

HACCP M. MAROC est un laboratoire en microbiologie et sécurité des aliments au niveau

de la restauration collective, essentiellement les cuisines des hôtels tout en respectant un

guide de bonne pratique d’hygiène, d’enregistrement de traçabilité et de formation du

personnel.

Le laboratoire a pour mission de procéder à des analyses microbiologiques et physico-

chimiques, dans le cadre du contrôle de salubrité des aliments et l’eau.

Ce rapport est subdivisé en 3 chapitres :

➢ Le premier chapitre présente le laboratoire HACCP M. MAROC,

➢ Le deuxième chapitre expose une généralité sur l’ensemble des micro-organismes

recherchés et le principe des analyses microbiologiques et physico-chimiques,

➢ Et le troisième chapitre explique la méthodologie de travail et traite un exemple

d’application.

Enfin une conclusion, suivie de références bibliographiques et une annexe.

6
 Chapitre 1

Présentation
du champ d’application

7
 Chapitre 1 : Présentation du champ d’application

1. Présentation du laboratoire
HACCP M. MAROC est un laboratoire crée en 2009 par Dr Samir Mahfoud Filali,
spécialisé en microbiologie et sécurité des aliments au niveau de la restauration collective,
essentiellement les cuisines des hôtels dans le respect d’un guide de bonne pratique
d’hygiène, d’enregistrement de traçabilité et de formation du personnel.
Le laboratoire travaille en synergie avec des organismes reconnus dans
leur spécialité. Son partenaire en France est HACCP GROUPE, détenteur
de plusieurs certifications : ISO 9001, ISO 22000(figure1.1).

Les services du laboratoire s'articulent autour de la :

• Sécurité des aliments Figure 1.1. HACCP GROUPE
• Audit et conseil
• Mise en place et suivi des systèmes de qualité HACCP, ISO 9001, ISO 22000
• Formations
• Analyses bactériologiques et physico-chimiques des aliments

La figure 1.2 représente une liste des clients du laboratoire :

Figure 1. 2. Liste des clients du laboratoire HACCP M MAROC

8
 Chapitre 1 : Présentation du champ d’application

2. Fiche technique
Le tableau 1.1 représente la fiche technique du laboratoire HACCP M MAROC.

Nom du laboratoire HACCP M. MAROC

IMM AL AKHAOUAINE RUE DE LA FOIRE,

Adresse
Agadir

Statut juridique SARL-ASSOCIE UNIQUE

Téléphone 05 28 84 46 66

Fax 05288204 51

E-mail [email protected]

Domaine d’activité Hygiène alimentaire

Effectif global Effectif global : 5

Cadres supérieurs : 4
Techniciens supérieurs et agents de maîtrise : 1

Bureau des consultants –bureau directeur

-salle de préparation des milieux de culture salle
de réception des échantillons- salle
Descriptif des locaux
d’ensemencement-salle de
lecture des résultats - laverie-WC-accès de
secours -sortie déchets.

Tableau 1.1. Fiche technique du laboratoire HACCP M. MAROC

9
 Chapitre 1 : Présentation du champ d’application

3. Organigramme
La figure 1.3. représente l’organigramme du laboratoire.

Figure 1.3 Organigramme du laboratoire HACCP M. MAROC

4. Activités du laboratoire
Le laboratoire est capable de fournir plusieurs analyses :
• Analyse microbiologique des aliments préparés
• Analyse des surfaces de travail et des mains du personnel de la cuisine
• Analyse des eaux y compris les eaux marines
• Analyses physico-chimiques des eaux et des aliments

10
 Chapitre 2

Synthèse
Bibliographique

11
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

1. Microorganismes recherchés dans les aliments

Trois types de microorganismes sont conventionnellement recherchés, lors de l’analyse
microbiologique des denrées alimentaires. Il s’agit des micro-organismes responsables de
l’altération, des micro-organismes indicateurs de la contamination fécale et des micro-
organismes pathogènes responsables de toxi-infections alimentaires. Parmi les micro-
organismes responsables de l’altération des aliments, se trouvent la Flore Mésophile Aérobie
Totale (FMAT) et la Flore Fongique constituée par les Levures et Moisissures. Les micro-
organismes dits indicateurs de contamination fécale sont les Coliformes Totaux et les
Coliformes Fécaux. Les micro-organismes pathogènes responsables de toxi-infections
alimentaires sont les Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR), Staphylococcus aureus,
Salmonella sp, Listeria monocytogenes, Campylo bacterjejuni coli, Vibriocholerae.

1.1. Flore Mésophile Aérobie Totale

La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d’évaluer
le nombre d’Unité Formant Colonie (UFC) présent dans un produit ou sur une surface.
L’unité de dénombrement est l’Unité Formant Colonie, car une colonie observable, sur la
surface du milieu gélosé est le résultat d’un microorganisme vivant isolé à partir d’une spore
ou encore d’une association de microorganismes. Théoriquement, la flore mésophile dont la
température optimale de croissance se situe entre +20°C et +40°C. Son isolement se faisant
sur un milieu gélosé dit ordinaire ou nutritif, la plupart des microorganismes se développe,
sauf les micro-organismes exigeants et les microorganismes anaérobies stricts.

1.2. Levures et moisissures

Les levures sont des organismes unicellulaires qui se divisent par fission et par
bourgeonnement. Étant donné leur grande capacité d’adaptation à de nombreux substrats, les
levures sont très largement répandues dans l’environnement. Ce sont des champignons, chez
lesquels la forme unicellulaire est prédominante. Elles sont classées par genre et par espèce et
sont regroupées au sein de famille, selon leur morphologie et leur mode de reproduction.

12
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

Parmi elles, se trouvent, notamment Geotrichum,

Candidum et Saccharomyces cerevisiae (figure2.1).
Les moisissures sont des organismes pluricellulaires qui
se propagent par leurs spores. Tout comme les levures, les
moisissures peuvent être véhiculées par l’environnement.
Ce sont des microorganismes filamenteux qui sont
disséminés par l’émission des spores. Figure 2. 1. Saccharomyces cerevisiae

1.3. Coliformes Totaux et Coliformes Fécaux

Les coliformes sont recherchés dans les aliments, car ce sont
de bons marqueurs de l'hygiène de leurs manipulations.
D'origine fécale, ils sont retrouvés dans les eaux usées et le
sol. Étant des bactéries vivant dans les intestins d'animaux
ou de l’Homme, leur présence indique alors une pollution
fécale, dans le milieu hydrique. Ainsi, ils sont connus
comme étant des organismes indicateurs de la qualité de
l'eau. Cependant, ils ne provoquent pas d'intoxications
alimentaires, à l’exception d’Escherichia coli Figure 2. 2. Escherichia coli
(figure 2.2).

1.4. Streptocoques fécaux

Ce sont des hôtes normaux de l'intestin de l'homme et des animaux à sang chaud. Ce groupe
n'est généralement pas considéré comme pathogène. Les streptocoques fécaux appartiennent à
un groupe de streptocoques qui ne sont pas tous d'origine fécale. Toutefois, leur recherche
associée à celle des coliformes fécaux constitue un bon indice de contamination fécale. Ils
témoignent d'une contamination d'origine fécale ancienne tandis que les coliformes fécaux
témoignent d'une contamination d'origine fécale récente.

1.5. Anaérobies Sulfito-Réducteurs

Les anaérobies sulfito-réducteurs sont des micro-organismes qui se multiplient, en absence
d’air, au cœur des produits, leur résistance à la cuisson étant alors remarquable. Clostridium
perfringens est l’exemple typique de microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs. Elles
deviennent pathogènes quand elles pénètrent accidentellement dans l'organisme par voie

13
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

cutanée ou intestinale et y produisent leur toxine qui va ensuite altérer les fonctions de
défense de l'organisme.

Clostridium perfringens (figure 2.3.) est une bactérie très

ubiquitaire largement répandue dans tout l'environnement
(sol, sédiments, cadavres, poussières, surface des végétaux,
etc.). Elle est responsable d'intoxications alimentaires qui
surviennent uniquement, après la consommation d'aliments
fortement contaminés par une souche entérotoxinogène.
Figure 2. 3. Clostridium perfringens
1.6. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est, comme tous les
staphylocoques, une bactérie sous forme cocci, gram
positif, de 1 μm de diamètre environ, apparaissant en amas
à l'examen microscopique. Il est immobile, non sporulé et
ne présente pas de capsule visible au microscope optique.
Staphylococcus aureus cultive facilement sur des milieux
ordinaires, en aérobiose comme en anaérobiose.
Figure 2. 4. Staphylococcus aureus

Les aliments qui sont souvent impliqués dans des intoxications alimentaires à staphylocoques
sont la viande et les produits à base de viande, la volaille, les œufs, des salades, le thon, les
pommes de terre et les macaronis. Sont également impliqués les produits de boulangerie.

2. Maladies d’origine alimentaire

Une maladie d'origine alimentaire est une affection, en général, de nature infectieuse ou
toxique, provoquée par des agents qui pénètrent dans l'organisme par le biais des aliments
ingérés.

2.1. Infection à la flore fongique

Les concentrations de moisissures ambiantes ne causent pas d’effets sur la santé de la majorité
des personnes. Cependant, dans des situations où ces concentrations sont anormalement
élevées ou dans le cas de certaines personnes souffrant de problèmes respiratoires ou ayant un
système immunitaire déficient, l’exposition aux moisissures peut favoriser l’apparition de
symptômes de maladies. Les effets ressentis dépendent des espèces présentes, de leurs

14
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

produits métaboliques, de la concentration et de la durée de l’exposition ainsi que de la

susceptibilité individuelle. Les principaux effets sur la santé associés à une exposition aux
moisissures sont les réactions d’hypersensibilité (allergie), les infections et l’irritation. Mais,
il s’agit là de transmission par aérosols et non de d’infection par contamination alimentaire.

2.2. Infection aux coliformes fécaux

Escherichia coli est parmi les coliformes fécaux qui sont responsable de plusieurs pathologies,
dont la colite hémorragique, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), et le purpura
thrombotique thrombocytopénique (PTT). Cette bactérie, potentiellement mortelle, se trouve
généralement à l'intérieur des intestins des bovins. Elle est ainsi responsable de beaucoup
d'intoxications alimentaires causés par de la viande hachée dites « maladie du hamburger ».

2.3. Infection à Clostridium perfringens

Il est possible d’être infecté par Clostridium perfringens en consommant des aliments
contaminés. La contamination des aliments par ces bactéries provient de l’environnement, car
les bactéries se trouvent dans le sol, les eaux usées et la poussière. Les aliments contaminés
doivent habituellement contenir des bactéries en grand nombre pour entraîner la maladie.
Les bactéries prolifèrent à des températures allant de 20 °C à 60 °C. Cette plage de
température est propice à la prolifération de grandes quantités de bactéries, qui peuvent rendre
malade. Cela signifie que les aliments qui sont cuits lentement ou qui ne sont pas bien
conservés, refroidis ou réchauffés sont donc plus susceptibles de rendre malade.
La bactérie produit des toxines lorsqu’elle se trouve dans l’intestin, et ce sont les toxines qui
rendent les gens malades. Le fait de consommer des aliments qui sont cuits lentement ou qui
ne sont pas bien conservés, refroidis ou réchauffés augmente le risque d’infection. Parmi les
aliments associés à l’infection à Clostridium perfringens, on mentionne la viande crue, la
volaille crue et le bœuf cru, les produits de viande, ainsi que les sauces, les aliments séchés ou
précuits, et les haricots cuits. Les températures normales de cuisson ne permettent pas
d’éliminer les spores de Clostridium perfringens. C’est pourquoi il est si important que les
aliments soient bien conservés, refroidis et réchauffés.

2.4. Infection par staphylocoques aureus

Staphylococcus aureus est un pathogène opportuniste qui peut causer diverses maladies chez
les humains, allant des affections qui évoluent spontanément vers la guérison à des
pathologies mortelles. Cette bactérie est une des principales causes de toxi-infections

15
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

alimentaires, résultant de la consommation d’aliments contaminés par des entérotoxines.

L’intoxication alimentaire par les staphylocoques se caractérise par une apparition brutale de
nausées, de vomissements, de douleurs abdominales, de crampes et de diarrhée. Les
symptômes disparaissent habituellement après 24 heures.

3. Principe des analyses microbiologiques

Les contrôles microbiologiques se font régulièrement sur les denrées sur lesquelles on
recherchera et dénombrera la flore aérobie mésophile, responsable de l'altération des denrées,
les germes témoins de contamination fécale et les germes pathogènes (staphylocoques, et
anaérobies sulfito-réducteurs), aussi que sur l’eau et sur les surfaces pour contrôler l'efficacité
du nettoyage et des désinfectants.

3.1. Microbiologie des aliments

La première étape de l’analyse microbiologique alimentaire est constituée par la préparation
de l’échantillon. Les analyses s’effectuent toujours sur des suspensions préparées à partir de
l’échantillon alimentaire dilué dans un diluant assurant la survie de tous les micro-organismes.

Le principe de l’analyse bactériologique est de déterminer pour chaque type d’aliments un

groupe de bactéries à dénombrer ou à rechercher, en fonction des risques. Les techniques de
dénombrement mises en œuvre au laboratoire sont soit la méthode de dénombrement direct
par numération de colonies isolées après ensemencement sur ou dans un support nutritif
solide, nommé respectivement ensemencement en surface (figure 2.5) et ensemencement en
masse (figure 2.6). Soit la méthode de dénombrement indirect par calcul statistique après
répartition de l’inoculum dans des tubes de milieux de culture liquide (méthode dite du
nombre le plus probable : NPP).

Figure 2.5. Méthode Figure 2.6. Méthode

D’ensemencement en surface D’ensemencement en masse
16
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

3.2.Microbiologie de l’eau
Les analyses de microbiologie de l'eau consistent à vérifier que l’eau (soit l’eau potable ou
eau de piscine) satisfait à des critères assurant la protection du consommateur.
La filtration sur membrane est une technique de numération adaptée pour compter des
bactéries présentes à des concentrations très faibles dans l'eau. L'appareil (figure 2.7) est un
simple système de filtration sous pression réduite (trompe à eau). Il contient un support filtre
qui reçoit, sur une partie en inox fritte à larges pores, la membrane de filtration. Le godet
permet de recevoir l'eau à analyser (réservoir supérieur). Les membranes utilisées (en ester de
cellulose) sont généralement quadrillées, et les pores ont un diamètre de 0,45µm.

Figure 2.7. Appareil de filtration sur membrane

4. Principe des analyses physico-chimiques

Les analyses physico-chimiques permettent d’identifier la dureté totale, le titre alcalimétrique,
et le titre alcalimétrique complet de l’eau par la technique du dosage. Ainsi que l’acidité (pH),
la température, la conductivité électrique et le chlore libre, à partir d’un échantillon de l’eau.
La technique du dosage consiste à déterminer la concentration d'une substance précise
(l'analyte) présente dans l’eau. Parmi les types de dosage il y a :

17
 Chapitre 2 : Synthèse bibliographique

 Dosage colorimétrique :

Dans un dosage colorimétrique acido-basique (figure 2.6.), l’observable est la couleur de la

solution. Le changement de couleur à l’équivalence est provoqué par le virage d’un indicateur
coloré acido-basique introduit en très petite quantité.

Figure 2.8. Dosage colorimétrique

 Dosage complexométrique :

Réaction de complexation : C’est une réaction au cours de laquelle un complexe

se forme : un complexe est une entité polyatomique composée d’un ion central
(généralement un cation) lié à un ou plusieurs anions ou molécules. Ce sont des
espèces souvent colorées, leur formation s’accompagne alors d’un changement
de couleur du milieu.

18
 Chapitre 3

Méthodologie de
travail et exemple
d’application

19
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

1. Analyses microbiologiques effectuées sur les aliments

1.1. Prélèvement des échantillons
L'étape d'échantillonnage influence directement la qualité des résultats analytiques
obtenus.
Le prélèvement de l’échantillon alimentaire sur lequel sera effectuée une analyse
microbiologique réglementaire doit être dans des conditions aseptiques, pour rechercher la
présence éventuelle des germes pathogènes et également la présence de germes dits :
témoins d’hygiène. Des précautions élémentaires doivent être prises pour obtenir un
échantillon représentatif, afin de minimiser les risques associés à la contamination et de
maîtriser la chaîne du froid. Pour effectuer un prélèvement des aliments, on prend d'abord
une cuillère stérile et un sachet à fermeture zip, ensuite on prend au minimum 100g de
l'aliment qu'on met dans le sachet tout en assurant sa fermeture.

En effet, les personnes qui font le prélèvement sont équipés de glacière avec source de
froid, et d’un véhicule réfrigéré pour le transport des échantillons jusqu’au laboratoire.
Lors de leur intervention, les préleveurs prennent soin de noter les informations nécessaires
à l’exploitation du résultat comme le nom du produit et son identification, le nom de
l’hôtel, et la date du prélèvement. Par la suite on cite d’autres conditions à respecter

• Tous les échantillons destinés aux analyses microbiologiques doivent toujours être
prélevés dans les contenants stériles.
• Il faut toujours débuter une campagne d’échantillonnage par les échantillons
destinés à l’analyse microbiologique, puis par ceux destinés à l’analyse chimique.
• Les conditions d'asepsie nécessaires doivent être respectées lors de la prise de
l’échantillon (éviter de mettre les doigts ou tout autre objet à l'intérieur du sachet du
contenant et limiter au minimum l'exposition à l'air libre du contenant lors de
l'échantillonnage.
• Boucher soigneusement et hermétiquement tous les contenants après le
prélèvement.

20
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

1.2. Préparation des milieux de culture

Un milieu de culture est un support qui permet la culture des micro-organismes afin de se
multiplier. Un milieu de culture doit donc satisfaire les exigences nutritives du
microorganisme étudié :
• Couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, en source de carbone
et en énergie.
• Présenter un pH voisin au pH optimal.
Ces milieux sont de différents types. Il s’agit soit de milieux de base permettant la
croissance d’espèces non ou peu exigeantes, soit de milieux enrichis par l’addition de
diverses substances (sérum, œuf…..) qui autorisent la croissance des bactéries plus
exigeantes. Il peut s’agir également de milieux rendus sélectifs par l’addition
d’antibiotiques ou de colorants.

Figure 3.1. Milieux de culture et substances ajoutées

 Les principales bases utilisées dans la préparation des milieux de culture :

Pour la préparation des milieux de culture, il faut toujours utiliser de l’eau fraîchement
distillée et à pH neutre.
Les récipients doivent être soigneusement rincés. Ils doivent être volumineux pour
permettre une agitation du milieu.
La qualité du produit final dépend souvent de la technique utilisée pour remettre les
milieux en solution. Pour cela il faut mettre la quantité désirée dans la moitié de la quantité
d’eau nécessaire ensuite mélanger, puis ajouter l’autre moitié d’eau, en rinçant les parois
du récipient pour entraîner les traces du milieu de culture adhérentes aux parois. La
dissolution se fera selon le milieu de culture car dans certains cas, la dissolution est

21
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

obtenue sans qu’il ne soit nécessaire de faire bouillir le milieu. Par la suite, on répartie en
tubes ou en flacons. Finalement, on stérilise à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.

Figure 3.2. Préparation des milieux de culture

1.3. Préparation des échantillons

On commence par la préparation de la suspension mère.
Dans un flacon taré contenant un sac en plastique stérile, sous les conditions d’asepsie, on
pèse une masse M en g ou un volume V en ml (10 g ou 10 ml). Ensuite, on ajoute 9*M ou
9*V du diluant eau peptonée tamponnée. Après broyage à l’aide du Stomacher (Figure
3.3), on verse le contenu du sac dans un tube et on obtient une suspension mère qui est
dilué 10-1.

Figure 3.3. Appareil de Stomacher

La prochaine étape est la préparation des dilutions par la dilution en cascade. Elle s’agit
d’une diminution successive de la concentration en effectuant des dilutions répétées de la
suspension mère afin d'amplifier rapidement le facteur de dilution. Brièvement, on prend à

22
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

chaque fois 1 ml de la dilution précédente et on la verse dans la prochaine dilution et ainsi

de suite (Figure 3.4).

Figure 3.4. Préparation des dilutions décimales

1.4. Dénombrement sur milieu solide

1.4.1 Flore mésophile aérobie totale (FMAT)
Le dénombrement de la FMAT se fait en transférant dans une boite de Pétri stérile à l'aide
d'une pipette stérile 1 ml de l'échantillon pour essai de la suspension-mère. Ces opérations
sont recommencées pour chaque dilution décimale à l'aide d'une nouvelle pipette stérile,
l’étape suivante consiste à couler dans chaque boîte de Pétri environ 15 ml de la gélose Plat
Count Agar pour dénombrement à 45°C+/- 0,5 °C. Le temps qui s’écoule entre la fin de la
préparation de la suspension mère et le moment ou les dilutions est en contact avec le
milieu de culture, ne doit pas dépasser 15 min. Ensuite on mélange soigneusement
l’inoculum au milieu de culture et laisser se solidifier en posant les boîtes de pétri sur une
surface fraîche et horizontale pour se solidifier. Enfin, on retourne les boîtes ainsi
préparées et on les incube à 37°C pendant 72 heures +/- 3 heures.

23
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

1.4.2 Coliformes Totaux et Fécaux

Pour la recherche des coliformes totaux et fécaux on va suivre les mêmes étapes
mentionnées pour la FMAT sauf qu’on utilise cette fois si15 ml de la gélose à la bile, au
rouge neutre, au cristal violet et au lactose VBRL refroidir à environ 47°C au bain d'eau.
Après solidification du mélange, on ajoute une couche d’environ 5 ml du milieu VRBL et
on laisse le milieu se solidifié.
Les boîtes ainsi préparées sont retournées et incubées dans l’étuve réglée à 30 °C durant
24h pour les coliformes totaux et à 44 °C durant 24h à 48h pour les coliformes fécaux.
Après l’incubation, ne retenir pour le dénombrement que les boîtes renfermant plus que
150 colonies caractéristiques.

Les colonies caractéristiques sont violets entourées d’une zone rouge âtre.

1.4.3 Staphylococcus aureus

A l’aide d’une pipette stérile, on transférer 0,1 ml de la suspension mère (dilution 10-1), à
la surface de deux boîtes du milieu gélosé Baird Parker. La même opération est répétée
avec la dilution 10-2 et les dilutions suivantes si nécessaire. Ensuite on étale soigneusement
l’inoculum le plus rapidement possible à la surface du milieu gélosé en essayant de ne pas
toucher les bords de la boîte avec l’étaleur en verre stéril. Puis on laisse sécher les boîtes
avec leurs couvercles durant environ 15 min à température ambiante. Après cette durée, on
retourne les boîtes et on les incube durant 24 à 48 heures dans l’étuve réglée à 37 ± 1°C.

Le dénombrement des staphilococcus aureus n’est retenu que si les boîtes renferment entre
15 et 150 colonies caractéristiques d’une couleur noire, d’une forme convexe et entourées
d’une zone claire qui peut être partiellement opaque.

1.4.4 Bactéries Anaérobies Sulfito-Réducteurs

Par la méthode d’ensemencement en masse, on introduit 1 ml de la dilution par une pipette
stérile dans une boîte de Pétri stérile. Ensuite on coule dans chaque boîte de Pétri 15 ml à
20 ml du milieu tryptose-sulfite à la cyclosérine (TSC), maintenu à 47°C au bain d'eau. Le
temps qui s'écoule entre le moment où l'on distribue l'inoculum dans la boîte et celui où le
milieu est coulé ne doit pas excéder 15 min. Par la suite, on mélange soigneusement
l'inoculum au milieu et on laisse le mélange se solidifier en posant les boîtes de Pétri sur
une surface fraîche et horizontale. Après solidification du mélange, on ajoute environ 10

24
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

ml du même milieu de culture, maintenu à 47°C et on laisse encore solidifier. Puis on

incube à 37°C pendant 48h à l'aide de l'étuve.

Le dénombrement des boîtes n’est retenu que lorsque les boîtes renferment moins de
colonies caractéristiques qui sont entourées d’un halo noir.

2. Analyses effectuées sur l’eau

2.1.Analyses microbiologiques
3.1.1. Prélèvement des échantillons
Les prélèvements de l’eau se font de façon aseptique ; utilisation de gants stériles ainsi que
les échantillons sont prélevés dans des flacons stériles.

 Prélèvement de l’eau potable au robinet

S’assurer d’abord que le point de prélèvement est propre ensuite désinfecter le robinet à
l’aide des lingettes antiseptiques. Ouvrir le robinet et laisser couler pendant au moins une
minute. Le flacon sera ensuite ouvert sous le jet d’eau pour se remplir jusqu’au dernier
trait. Refermer le flacon toujours sous le jet d’eau. Et bien sûre fermer le robinet.

 Prélèvement d’eau de la piscine

Prélèvement à l’opposé de l’arrivée de l’eau en subsurface (entre 10 à 30 cm de la surface

de l’eau) au moyen d’un flacon lesté. Sinon, sélectionner le point de prélèvement le plus
approprié et le plus représentatif : introduire le flacon à l’horizontale, puis le redresser
jusqu’à ce que le volume d’eau recueilli soit suffisant.

Lors du prélèvement il ne faut pas toucher avec les doigts le col et l’intérieur du bouchon,
le flacon doit être rempli jusqu’au dernier trait sans faire déborder et le mettre
immédiatement en glacière et ne pas utiliser l’échantillon destiné aux analyses
microbiologiques pour la mesure de la température ou autre mesure sur site

Les échantillons maintenus dans une enceinte réfrigérée entre 1°C et 10°C jusqu’à la
livraison au laboratoire, en évitant la congélation et l’exposition au rayonnement solaire.

3.1.2. Filtration sur membrane

Les bactéries présentes dans l’échantillon à analyser sont retenues sur un filtre dont les
pores sont inférieurs à la taille des bactéries (pore de 0,45 ou 0.22µm de diamètre). Le
filtre qui a retenu les bactéries contenues dans l'eau, est ensuite déposé sur un milieu de
25
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

culture approprié où les bactéries puisent les éléments nécessaires à sa croissance et se

développent. Après incubation, les UFC (unités formants colonies) sont comptées pour
évaluer la qualité microbiologique de l'eau. Selon le milieu de culture où est déposé le
filtre, on met en évidence la présence de différents types de microorganismes.

Le processus de filtration sur membrane commence d’abord par la désinfection du système

de filtration avant filtration d’eau. Ainsi, après montage du système, on désinfecte à
l’éthanol puis on rince à l’eau stérile tout en renouvelant entre chaque filtration d’eaux
différentes.

A l’aide d’une pince désinfectée à l’éthanol, on déposer délicatement le filtre tout en

veillant à ne pas déposer la protection du filtre en même temps que le filtre ou à la place du
filtre, car ce dernier est étanche et ne laisse pas filtrer l’eau. De même, le quadrillage du
filtre doit être vers le haut et bien centrée sur la plaque-support. Ensuite, on revisse le
récipient supérieur pour assurer de l'étanchéité du système, et on remplit le récipient
supérieur avec l'eau à analyser jusqu’à la graduation adéquate (100ml) et sans la refermer.
Ainsi, on place la pompe à vide manuelle puis on filtre en créant le vide. Finalement on
rince à l’eau stérile, on démonte le système, on retire le filtre à l’aide d’une pince
désinfectée à l’éthanol (a) et le pose sur le milieu adéquat dans une boîte de Pétri de 5 cm
de diamètre (c), en maintenant le quadrillage vers le haut, sans laisser de bulles d’air entre
le filtre et le milieu de culture pour que tout le filtre soit au contact du milieu de culture
(d).

La figure ci-dessous représente le mode opératoire de la rampe de filtration sur membrane

Figure 3.5. Mode opératoire de la filtration sur membrane

26
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

 Microorganismes recherchés dans l’eau

Le tableau suivant représente les microorganismes recherchés, le milieu de culture utilisé,

temps et température d’incubation, type du filtre utilisé et l’aspect des colonies après
incubation des boites de pétri.

Micro- Diamètre
Milieu de Aspect des
organismes Incubation du filtre
culture colonies
recherchés utilisé (µm)
colonies rouges,
Coliformes Tergitol
48h à 37°C 0.45 marron ou roses
totaux TTC
visibles
colonies rouges,
Coliformes Tergitol
48h à 44°C 0.45 marron ou roses
fécaux TTC
visibles
*Germes Toutes les
PCA 72 h à 22°C 0.45
totaux à 22°C colonies
**Germes Toutes les
PCA 48h à 37°C 0.45
totaux à 37°C colonies
colonies rouges,
Streptocoques Slanetz
48h à 37°C 0.45 marron ou roses
fécaux
visibles
***Clostridium TSC 48h à 37°C 0.22 Colonies noires

Tableau 3.1. Microorganismes recherchés dans l’eau

N.B

Pour les germes totaux 22° et 37° (*et**). L’analyse se fait par la méthode
d’ensemencement en masse.

Pour Clostridium (***), on place d’abord le flacon contenant l’échantillon dans un bain
marie à 75°C, le maintenir pendant 10 min, puis le refroidir rapidement dans un bain marie
glacé ou à l’eau de robinet. On fait la filtration d’un volume d’eau à analyser sur une
membrane stérile de porosité 0,2 µm, à déposer cette membrane renversée dans le fond
d’une boite de pétri, puis verser sur la membrane 18ml du milieu TSC liquéfié entier. Et
incuber la boite de pétri dans des conditions assurant l’anaérobiose.
27
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

2.2. Analyses physico-chimiques

2.2.1. Dureté totale (titre hydothymetrique) TH

La détermination de TH d’une eau se fait par la titration complexométrique qui est un

titrage molaire des ions calcium et magnésium avec une solution de sel disodique de
l’acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) à pH = 10 L’indicateur coloré est la NET
(Noir d’Eriochrome T), qui donne une couleur rouge foncé ou violette en présence des ions
calcium et magnésium.

Le matériel utilisé est le suivant :

✓ Une éprouvette graduée de 100 ml

✓ Un erlenmeyer de 250 ml
✓ Un doseur (burette de 50 ml)
✓ Une solution tampon TH
✓ Un indicateur coloré noir ériochrome T
✓ Une solution complexions III 0,02 M (EDTA)

On mesure 100ml de l’échantillon, le verser dans l’erlenmeyer et ajouter 5ml de la solution

du tampon TH, ajouter aussi le bout d’une spatule de l’indicateur de noir eriochrome T,
remuer ensuite, si la couleur de la solution vire au bleu, la dureté de l’eau correspond à
zéro. Si la couleur de solution vire au rose, titré doucement avec la solution EDTA en
renouant jusqu’à ce que la solution vire au bleu
Le nombre de ml de la solution de titration correspond à la dureté totale de l’échantillon
exprimée en degré français F°. La dureté totale est calculée par la relation (1).
𝑽𝟏
𝑻𝑯 = 𝟏𝟎𝟎𝟎. 𝑪. (𝟏)
𝑽𝟐

Avec C concentration en mol/l de la solution complexons III et V1 et V2 les volumes de

complexons III et d’échantillon à doser.

2.2.2. Titre alcalimétrique TA

Le titre alcalimétrique correspond à la quantité d’ions carbonates pour amener le pH à 8,3.

En présence de l’indicateur phénolphtaléine virant du rouge à l’incolore à un pH de 8,3.
Généralement TA =0 pour les eaux douces d’un pH entre 7 et 8.5.

28
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

Les produits et le matériel utilisé pour la détermination du TA sont :

✓ Un erlenmeyer
✓ Une éprouvette
✓ Une burette
✓ Indicateur coloré (phénolphtaléine)
✓ Acide minéral
On commence par la mesure de 100 ml d'eau à analyser dans un erlenmeyer de 250 ml et
ajouter 1 à 2 gouttes de phénophtaléine (indicateur coloré) ensuite la burette remplie avec
de l’acide. Titrer jusqu’à l’incolore.
Lire et noter le nombre de ml de l’acide utilisé. Le résultat du titre alcalimétrique est
calculé par la relation(2) en °F.
𝑽𝒂𝒄𝒊𝒅𝒆 ×𝑵𝒂𝒄𝒊𝒅𝒆 ×𝟓𝟎𝟎𝟎
𝑻𝑨 = (𝟐)
𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒑𝒓𝒊𝒔𝒆 𝒅′ 𝒆𝒔𝒔𝒂𝒊

Vacide et Nacide sont le volume et la normalité de l’acide utilisé

2.2.3. Titre alcalimétrique complet TAC

Les mesures du titre alcalimétrique complet sont réalisées en neutralisant un certain

volume V0 d’eau par de l’acide sulfurique ou chlorhydrique de normalité N, en présence de
l'indicateur hélianthine virant du jaune à l’orangé à un pH de 4,3.
Par la suite, on cite les matériels et réactifs utilisés pour cette analyse :
✓ Erlenmeyer
✓ Éprouvette
✓ Burette
✓ Indicateur coloré (héliantine)
✓ Acide sulfurique
Pour effectuer cette analyse, on prélève un échantillon représentatif dans un erlenmeyer.
Ensuite on rince l’éprouvette avec l’eau distillée, on mesure 100 ml de l’échantillon, on
verse ce volume dans l’erlenmeyer et on ajoute 3 gouttes de l’indicateur coloré et on
remue. La burette est remplie avec de l’acide sulfurique 0,02 N, ajustée à 0. Par la suite on
titre jusqu’à ce que la couleur vire du vert à la rose pale. Le volume équivalent sera noté.

𝑻𝑨𝑪 = 𝑽(𝒎𝒍)×𝟒°𝑭 (𝟑)

V (ml) est le volume total de titrant versé.

29
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

2.2.4. Mesure du pH

Le pH est défini comme étant le logarithme négatif de l’activité de l’ion hydrogène. En

pratique, on détermine plutôt le pH dit « opérationnel » en comparant la différence de
potentiel mesuré entre une électrode indicatrice en verre et une électrode de référence (ou
une électrode combinée) lorsqu’elles sont plongées dans un échantillon à mesurer par
rapport à une solution étalon de référence d’activité d’ions hydrogène connue.

Pour contrôler le pH, on doit d’abord rincer le bout de l’électrode du pH-

mètre avec de l’eau distillée, ainsi que par l’échantillon à mesurer pour un
temps de réponse plus rapide et pour éviter toute pollution de l’échantillon.

Ensuite, on immerge l’électrode et on attend jusqu’à stabilisation de la

valeur affichée pour faire la lecture. Finalement, on rince l’électrode avec
l’eau distillé et on l’essuie avec du papier. Figure 3.6. pH-mètre

2.2.5. Dosage du chlore

L'application de la méthode colorométrique a fait ses preuves; elle caractérise par un

maniement simple et sur, tout en étant trés précise.
Le comparateur est équipé d'un prisme qui permet de voir, cote à cote, la couleur
développée dans l'échantillon et celle sur le disque.

✓ Comparateur à disque
✓ Des cellules de 2-5 mm (capacité 4 ml)
✓ Tablette DPD N°1

Figure 3.7. Comparateur à disque

Pour doser le chlore libre en prélève un échantillon représentatif, puis on rince plusieurs
fois la cellule avec l’eau à analyser. La prochaine étape consiste à mettre 10 ml de
l’échantillon dans la cellule de droite et ajouter un comprimé de DPD N°1. On fait
dissoudre le comprimé en agitant, et on remplit la seconde cellule avec l’eau prélevée.
Ensuite on placer les deux cellules dans le comparateur, l’échantillon se trouve dans le
compartiment droit, alors on lit la valeur au niveau de la troisième vitre, qu’elle correspond
à la concentration en chlore en ppm.

30
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

3. Contrôle des surfaces

Le contrôle de surface se fait également pour les mains du personnel et surface de travail
afin de vérifier la bonne application des procédures de nettoyage et évaluer le niveau
microbiologique après nettoyage des surfaces.

Le prélèvement de surface se fait en deux méthodes soit par un test rapide ou en effectuant
une analyse microbiologique.

3.1.Test rapide
Les prélèvements des surfaces (de travail ou des mains du personnel) sont réalisés avec un
écouvillon « Pro-Clean ». Ce test permet en détectant les résidus protéiques d’évaluer l’état
de propreté des surfaces en 10 minutes par la procédure représentée dans la figure3.8

Figure 3.8. Méthode d'utilisation du pro-clean

L’interprétation s’effectue par un simple code couleur comme il est représenté dans la
figure 3.9 En effet, la couleur verte reflète un bon nettoyage des surfaces et surtout
l’efficacité du produit de nettoyage utilisé. Par contre si la coloration tend à être grise ou
même d’une couleur violette, cela explique qu’il existe encore des résidus protéiques
même après nettoyage de surface, donc une qualité insuffisante.

Figure 3. 9. Ecouvillon pro-clean

31
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

3.2.Test microbiologique
Sortir un écouvillon de son emballage stérile, humidifier l’extrémité en le plongeant dans
un tube contenant le diluant (Eau Distillée Stérile), éliminer l’excès de diluant en le
pressant contre la paroi du tube. A l’aide de l’extrémité de l’écouvillon, tracer des stries sur
une surface estimée entre 20 et 100 cm2 en faisant tourner l’écouvillon entre le pouce et
l’index.

Figure 3.10. Prélèvement des surfaces par écouvillon

Replacer l’écouvillon dans le tube avec le diluant.

Différentes techniques d’analyses peuvent être appliquées pour ce type de prélèvement

selon qu’il s’agisse d’une détection ou d’un dénombrement de micro-organisme. Avant
analyse, homogénéiser l’écouvillon par passage au vortex pendant 30s. Cela constitue la
solution mère.

Le tableau 3.2 englobe les analyses bactériologiques effectuées sur les surfaces.

Temps et Aspect des

Micro- Milieu de
Méthode température colonies
organismes culture
d’incubation caractéristiques
Ensemencement PCA
FMAT 72h à 37°C Toutes colonies
en masse
Colonies violets
Coliformes Ensemencement VRBL 48h à 37°C entourées d’une
totaux en masse
zone rouge âtre
Colonies violets
Coliformes Ensemencement
VRBL 48hà 44°C entourées d’une
fécaux en masse
zone rouge âtre
Baird Colonies
Staphylococcus Ensemencement
24h à 37°C entourées d’une
aureus en surface Parker
zone claire

Tableau 3.2. Analyses microbiologiques sur les surfaces

32
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

4. Exemple d’application
Afin d’appliquer l’ensemble des analyses microbiologiques du laboratoire nous avons
effectué des prélèvements dans un hôtel tout en respectant les règles de prélèvement et de
transport. En effet, on a pris des échantillons d’eau de cuisine et d’eau de piscine, ainsi que
3 plats représentés comme suit :

-Plat froid : salade composée

-Plat chaud : tajine de viande

-Pâtisserie : gâteau au chocolat

Les résultats sont exprimés en UFC/g pour les aliments et en UFC/ml pour les eaux, et
chaque résultat d’analyse est comparé aux seuils de qualité des critères microbiologiques.

 Eau de piscine

Après avoir mené notre prélèvement au laboratoire, nous avons effectuées les analyses
d’eau pour dénombrer les microorganismes revivifiables à 37 °C, les coliformes totaux et
fécaux, les staphylococcus auréus, ainsi que les streptocoques fécaux et les anaérobies
sulfito réducteurs.

Paramètres analysés Résultats Limite

Microorganismes
1,2×103UFC/ml 100 UFC/ml
revivifiables à 37 °C

Coliformes totaux 25UFC/100ml 10 UFC / 100 ml

Coliformes fécaux Absence Absence / 100 ml

Staphylococcus aureus Absence Absence / 100 ml

Streptocoques fécaux Absence Absence / 100 ml

Anaérobies sulfito-
Absence Absence / 20 ml
réducteurs

Tableau 3.3. Résultats bactériologiques de l’eau de piscine

D’après les résultats trouvés nous pouvons dire que cette eau de piscine a une qualité
bactériologique non satisfaisante car elle est trop chargée en micro-organismes revivifiables
(1.2 103 UFC/ml). Ces derniers permettent de dénombrer les bactéries se développant dans

33
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

des conditions habituelles de culture et représentant la teneur moyenne en bactéries d'une

ressource naturelle. Ces germes n'ont pas d'effets directs sur la santé mais sous certaines
conditions, ils peuvent générer des problèmes. Ce sont des indicateurs qui révèlent la
présence possible d'une contamination bactériologique. Pour les coliformes totaux
également ils ont beaucoup dépassé la norme, ce sont des micro-organismes indice de
contamination une dégradation de la qualité bactérienne de l’eau.

 A partir des résultats obtenus, on peut dire que cette eau n’a pas subis un traitement de
désinfection efficace, possiblement dû à la faible quantité de chlore utilisée.
Cependant, cela n’a pas entrainé la présence de germe pathogène, Staphylococcus
aureus.

 Eau de cuisine

Comme il s’agit d’une eau potable, on a effectué des analyses des microorganismes
revivifiables à 22°C et à 37°C, en plus des coliformes totaux et fécaux, staphylococcus
aureus, streptocoques fécaux et les anaérobies sulfito-réducteurs.

Paramètres analysés Résultats Limite

Microorganismes
69UFC/ml 100 UFC/ml
revivifiables à 22 °C
Microorganismes
12UFC/ml 20 UFC/ml
revivifiables à 37 °C
Coliformes totaux Absence Absence / 100 ml

Coliformes fécaux Absence Absence / 100 ml

Staphylococcus aureus Absence Absence / 100 ml

Streptocoques fécaux Absence Absence / 100 ml

Anaérobies sulfito-
Absence Absence / 20 ml
réducteurs

Tableau 3.4. Résultats des analyses microbiologiques de l’eau de cuisine

 Les résultats d’analyses microbiologique trouvés sont tous conformes aux normes
donc cette eau est de qualité bactériologique satisfaisante.

34
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

 Gâteau au chocolat

Ce gâteau a une charge des micro-organismes aérobies de 1.36 104 UFC/g. Les
microorganismes aérobies 30°C sont des indicateurs du respect de la chaîne du froid et des
conditions de refroidissement ou d’une température de maintien au chaud insuffisante. Un
résultat satisfaisant de la recherche de ces microorganismes dans l’aliment témoigne d’une
bonne maîtrise des températures.

Paramètres analysés Résultats Limite

FMAT 1.36×10⁴UFC/g 3.10 5 UFC/g

Coliformes totaux 0 UFC/g 10 3UFC/g

Coliformes fécaux 0UFC/g 1UFC/g

Staphylococcus aureus 0 UFC/g 10 2 UFC/g

Anaérobies sulfito-
0 UFC/g 10 UFC/g
réducteurs

Tableau 3.5. Résultats des analyses microbiologiques du gâteau au chocolat

L’absence des bactéries sulfito Réductrices dans l’aliment témoigne d’une bonne maîtrise
des températures également, des conditions de stockage, du respect de la marche en avant
et de l’hygiène du personnel.

 Le gâteau au chocolat préparé et analysé est un aliment de qualité bactériologique

satisfaisante car tous les résultats des analyses bactériologiques ne dépassent pas les
normes.

35
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

 Salade composée

Le dénombrement des différents microorganismes dans cette salade composée a révélé les
résultats suivants :

Paramètres analysés Résultats Limite

FMAT 1,4×10⁴UFC/g 3.10 5 UFC/g

Coliformes totaux 4 UFC/g 10 3 UFC/g

Staphylococcus aureus 0 UFC/g 10 2 UFC/g

Anaérobies sulfito-
0 UFC/g 30 UFC/g
réducteurs

Tableau 3.6.Résultats des analyses microbiologiques de la salade composée

La présence des micro-organismes aérobies dans la salade composée à une valeur de 1.4
104 UFC/g renseigne sur soit un contact avec du matériel ou des ustensiles mal lavés ou
désinfectés ou peut-être elle renseigne sur une manipulation des denrées avec des mains
non lavées de toute façon cet aliment est de qualité bactériologique satisfaisante mais
laisse entrevoir des lacunes à corriger (application des bonnes pratiques d’hygiène BPH).

 Tajine de viande

Le tajine de viande prélevé a subis des analyses microbiologiques, ses résultats sont
représentés dans le tableau (3.7)

Paramètres analysés Résultats Limite

FMAT 2.32 ×10⁴ UFC/g 3.10 5 UFC/g

Coliformes totaux 1,7×10²UFC/g 10 3UFC/g

Coliformes fécaux 0 UFC/g 1 UFC/g

Staphylococcus aureus 8UFC/g 10 2 UFC/g

Anaérobies sulfito-
0 UFC/g 10 UFC/g
réducteurs

Tableau 3.7. Résultats des analyses microbiologiques sur le tagine de viande

36
 Chapitre 3 : Méthodologie de travail et exemple d’application

Staphylocoque est une commensale de l’Homme, sa présence dans l’aliment témoigne d’un
manque d’hygiène des manipulations et du lavage des mains. Le tagine de viande analysé
est aliment de qualité bactériologique satisfaisante.

➢ Interprétation globale :

Généralement, d’après les résultats microbiologiques obtenue, on assume que cet hôtel
respecte plus au moins les règles d’hygiène de raison qu’on n’observe pas une grande
présence des microorganismes de source d’hygiène. Cependant, le personnel et les
responsables doivent multiplier leurs efforts pour fournir une eau de bonne qualité, tout en
utilisant un bon traitement de chlore.

37
 Conclusion
Aujourd'hui dans le secteur alimentaire, la qualité est un élément essentiel de la stratégie
des hôtels et des restaurants pour garantir la sécurité des aliments mis à la disposition des
consommateurs. C’est pour cette raison que les hôtels et les restaurants veillent toujours à
garantir au client des aliments sains et salubres en vérifiant la validité et la conformité de
ces produits aux normes de la réglementation.

Le présent rapport est le résultat d’un travail réalisé au sein d’un laboratoire qui a pour
objectif de s’assurer de la conformité des aliments, des eaux (cuisine, piscine), aussi des
surfaces (travail, les mains du personnel) des hôtels.

Pour l’ensemble des analyses microbiologiques effectuées, on a obtenus des résultats

conformes aux normes en vigueur au niveau de l’eau de cuisine et les aliments, ce qui
signifie que les produits analysés sont sains et ne représentent aucun risque d’intoxication.
Cependant, nous avons obtenus des résultats non conformes aux normes pour l’eau de
piscine. Dans ce cas le laboratoire conseille le personnel de l’hôtel à veillez sur l’efficacité
du traitement du chlore et de fournir des formations en vue de l’hygiène de l’eau.

38
 Bibliographie

Abdelmassih M., Mahillon J., Goffaux M-J., Ferber F., Planchon V., 2010 Guide

pratique de microbiologie alimentaire. Wallonie.

Jean-Louis C., 2007.Microbiologie alimentaire : contrôle microbiologique des aliments.

Université Montpellier 2, département STIA.

Lien :http://mon.univmontp2.fr/claroline/backends/download.php?url=L0FuYWx5c2VzX7
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Jund A., 2010. Mise en place du plan de maîtrise sanitaire sur l’ucp du grand sauvoy.
Universite henri poincare nancy1, faculté des sciences et technologies master
microbiologie

Lien :http://labo.cantal.fr/585.592.0.0/microbiologie-alimentaire-produits-alimentaires-
denombrement-microbien-criteres-microbiologiques-hygiene-germes-pathogenes-tiac-
bacterie-salmonelle.html

39
40
 Gélose TSC (base) :
Composition :

Tryptone…………………………………………………….15g
Pertonepapainique de soja…………………………………..5g
Extrait autolytique de levure………………………………..5g
Métabisulfite de sodium…………………………………….1g
Citrate ferrique ammoniacal…………………………………1g
Agar agar bactériologique……………………………………15g

Préparation :

▪ Peser la quantité du milieu déshydraté indiquée par le fabriquant.

▪ Dissoudre dans l’eau par chauffage progressif jusqu’à ébullition.
▪ Stériliser pendant 20 min à l’autoclave à 120°C, le pH du milieu doit être de 7,6.

 Eau peptonée :
Composition :

Tryptone…………………………………………………10g
Sodium chloride………………………………………….5g
DL Tryptophan……………………………………….…..1g

Préparation :

▪ Peser la quantité du milieu déshydraté indiquée par le fabricant.

▪ Dissoudre dans l’eau distillée par chauffage jusqu’à dissolution complète.
▪ Distribuer 9ml par tube.
▪ Autoclaver 15 min à 121°C.

 TERGITOL – AGAR AU T.T.C :

Composition :

Peptone de viande…………………………….……………5g
Extrait de levure……………………....…………………...3g
Lactose……………………………...……………………10g
Heotadecyl sulfate de sodium………..………………….0.1g
Bleu de bromothymol………………….……………..0.025g
Agar-agar……………………………….………………..12g
Eau distillée………………………………………….1000ml

1
 Préparation :

▪ Peser la quantité du milieu déshydraté indiquée par le fabricant

▪ Dissoudre dans l’eau par chauffage progressif jusqu’à ébullition.
▪ Répartir le milieu homogénéisé dans les ballons de 250 ml à fond plat
▪ Stériliser pendant 20mn à l’autoclave à 120°C
▪ Refroidir à 45-50°C dans un bain marie thermostat.
▪ Ajouter, soit le volume d’une solution de chlorures de 2.3.5triphenyl tetrazolium
(T.T.C) indiqué ci-dessus.
▪ Bien homogénéiser et répartir dans des boites de pétri stériles de 55-60mm de
diamètre à raison d’au moins de 5ml de milieu par boite.
▪ Le pH du milieu doit être de 7.2 ± 0.2

 PCA (Plat Count Agar):

Composition :

Peptone de caséine (Tryptone)…..……….…………...…5g

Extrait de levure : …..………………....………...…….2.5g
Glucose. .………………………………………...………1g
Agar agar. . .…….…………………………….………..12g

Préparation :

▪ Peser la quantité du milieu déshydraté indiquée par le fabriquant.

• Dissoudre dans l’eau distillé

2
 • par chauffage progressif jusqu’à ébullition.
• Autoclaver 15 minutes à 120 °C.
• pH final 7,0 ± 0,2 à 25 °C

 VRBL (gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre) :

Composition :
Peptone……………………….………………...…..…..7g
Extrait autolytique de levure…………………………....3g
Lactose …………………………………………….….10g
Sels biliaires…………………………………………..1,5g
Chlorure de sodium…………………..…………….…..5g
Rouge neutre …………………………………..…..0, 03g
Cristal violet…………………………………..…...0,002g
Agar agar …………………………………………0…15g

Préparation :

▪ Mettre en suspension le milieu déshydratédans1 litre d’eau distillée ou

déminéralisée.
▪ Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir
durant le temps nécessaire à sa dissolution.
▪ Répartir en tubes, ou en flacons.
▪ Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes
▪ pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C : 7,4 ± 0,2

 Gélose BAIRD PARKER

Composition

Peptone :.................................................................10,0 g
Extrait de viande de bœuf :......................................4,0 g
Extrait de levure :.....................................................2,0 g
Pyruvate de sodium : .............................................10,0 g
Glycocolle..............................................................12,0 g
Chlorure de lithium :................................................5,0 g
Agar-agar :..............................................................20,0 g

Préparation

▪ Mettre en suspension le milieu déshydratédans1 litre d’eau distillée ou

déminéralisée.

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 ▪ Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir
durant le temps nécessaire à sa dissolution.
▪ Répartir en tubes, ou en flacons.
▪ Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes
▪ Ajouter 50 ml de l’émulsion jaune d’œuf dans des conditions stériles

 Gélose de SLANETZ et BARTLEY

Composition

Tryptose ..................................................................20,0g
Extrait autolytique de levure.....................................5,0g
Glucose .....................................................................2,0g
Phosphate dipotassique.............................................4,0g
Azide de sodium .......................................................0,4g
Chlorure de 2, 3, 5 triphényltétrazolium ...................0,1g
Agar agar bactériologique .......................................10,1g
pHdu milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.

Préparation

▪ Mettre en suspension une quantité bien définie du milieu déshydraté complet dans 1
litre d’eau distillée ou déminéralisée.
▪ Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir
durant le temps nécessaire à sa dissolution.
▪ Eviter tout chauffage excessif.
▪ Ne pas autoclaver.
▪ Refroidir et maintenir à 47°C (ne pas refondre un milieu repris en masse).
▪ Couler en boîtes de Petri stériles (l'épaisseur de gélose doit être au moins égale à 5
mm).
▪ Laisser solidifier sur une surface froide.