NOTES TECHNIQUES

SCIENCES DE LA MER
BIOLOGIE MARINE

2000

Protocoles opératoires de minéralisation

d'échantillons biologiques par chauffage
micro-ondes sous conditions hyperbares:
méthodologie et résultats préliminaires

Olivier MAGAND

Instrtut de recherche pour ledéveloppement

Centre de Nouméa
 NOTES TECHNIQUES

SCIENCES DE LA MER
BIOLOGIE MARINE

2000

Protocoles opératoires de minéralisation

d'échantillons biologiques par chauffage
micro-ondes sous conditions hyperbares:
méthodologie et résultats préliminaires

Olivier MAGAND

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Institut de recherche
pour le d veloppement
© IRD, Nouméa, 2000

/Magand, O.

Protocoles opératoires de minéralisation d'échantillons biologiques par chauffage

micro-ondes sous conditions hyperbares: méthodologie et résultats préliminaires

Nouméa: IRD. août 2000. 10S p.

Notes Tech. .. Sei. Mer .. Biol. Mar. 4

DES FAUNE; LAGON; CREVETTE; HOLOTHURIE; ALGUES; ECHANTILLON;

MINERALISATION; METHODOLOGIE; HYPERFREQUENCE; RENDEMENT; METAL LOURD;
BIVALVE; CAULERPE / NOUVELLE CALEDONIE

Imprimé par la Service de Reprograpnie

Centre IRD de Nouméa
Août 2000
 SOMMAIRE

AVANT-PROPOS

RESUME - ABSTRACT

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GENERALE ~ 9

CHAPITRE 2 : BIBLIOGRAPHIE ET TRAVAUX PRELIMINAIREs 13

1. Intêrêts du biomonitoring : notion de bioindicateurs 14

II. Procédures opératoires mises en œuvre dans la recherche de bioindicateurs : utilisation

du four micro-ondes , 15

CHAPITRE 3 : DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE ET ESSAIS 17

I. Principe & intérêts de la minéralisation par micro-ondes 18

II. Identification et description des paramètres étudiés 18

II.1. Masse d'échantillon 18
II.2. Nature et volume des acides et/ou mélanges d'acides 19
II.3. Puissance du four micro-ondes : 19

III. Précautions à prendre avec le four micro-ondes 22

IV. Assurance qualité: notions et emploi 22

IV.l. Introduction 22
IV.2. Performances analytiques 23
IV.2.1. Précision et justesse 23
IV.2.2. Blancs 24
IV.2.3. Matériaux de référence 24
IV.2.4. Vaisselle 25

V. Expérimentations 27
V.1. Schéma d'extractions chimiques pour les métaux 27
V.2. Volume de solution d'attaque 29
V.3. Temps d'exposition au four micro-ondes 29
V.4. Acide ou cocktail d'acides 29

VI. Dosage des éléments traces par ICP-OES 30

VI.l. Principes et intérêts 30
VI.2. Principes et description de l'appareil 30
VI.3. Avantages et limites de l' appareil. 32
VI.4. Calcul des concentrations 33

VII. Resultats & validité de la méthode 33

VII.1. Réplicabilité de la méthode 33
VII.l.l. Analyse des blancs de réactifs 33
 VII.1.2. Matériel standard DORM-l 34
VII.1.3. Matériel standard MA-A-l 35
VII.1.4. Cas particulier du cobalt 35
VI1.2. Justesse ou exactitude de la mesure 39
VII.2.1. Matériel standard DORM-l 39
VII.2.2. Matériel standard MA-A-l 39
VI1.3. Choix de la solution d'attaque 39
VI1.4. Analyses complémentaires 41
VII.4.1. Réplicabilité et répétabilité 41
VII.4.2. Exactitude de la mesure 42

VIII. Conclusion 42

CHAPITRE 4 : METHODOLOGIE APPLIQUEE SUR DES MATRICES BIOLOGIQUES 43

I. Echantillons biologiques étudiés 44

I.l. Sélection des organismes 44
I.2. Site d' étude et prélèvements 45
I.2.1. Site d' étude 45
1.2.2. Méthodes et période de récolte 46
I.2.3. Prélèvements 46
1.3. Traitement préliminaire des échantillons 46
I.3.1. Etape de dépuration 46
I.3.2. Etape de dissection, lyophilisation et broyage 48

II. Expérimentations 50
II.l. Masse d'échantillon 50
II.2. Cocktail d'acides 50
11.3. Temps de digestion au four micro-ondes 50
II.4. Expériences réalisées 51
II.4.1. Bivalves 51
II.4.2. Echinodermes (cas des holothuries) 51
II.4.2. Phanérogames 51

III. Identification et origine des métaux lourds étudiés 54

III.l. Métaux d' origine terrigène 55
III.2. Métaux d'origine marine 55
III.3. Métaux d' origine anthropique 56

IV. Résultats et discussion 56

IV.I. Analyse de "échantillon standard interne des bivalves 56
IV.l.l. Précision 56
IV.1.2. Evolution des teneurs en métaux 57
IV.2. Analyse des échantillons standards internes d'holothuries 59
IV.2.1. Précision 59
IV.2.2. Evolution des teneurs en métaux 60
IV.3. Analyse des échantillons standards internes de phanérogames 61
IV.3.1. Précision 61
IV.3.2. Evolution des teneurs en métaux 62

2
 CHAPITRE 5 : ANALYSE D'ECHANTILLONS DE CREVETTES D'ELEVAGE 65

I.Elevage des crevettes en Nouvelle-calédonie et problématique d'étude 66

1.1. Aquaculture et crevettes: intérêts et développement 66
1.2. Aquaculture et biomonitoring 66

II. Echantillons biologiques étudiés 67

II.1. Espèce sélectionnée: Litopenaeus sty/irostris 67
II.2. Site d'étude et prélèvements 67
II.3. Méthodes et périodes de récolte 67
lIA. Traitement préliminaire des échantillons 68
IIA.1. Description des traitements 68
IIA.2. Précision sur l'étape de broyage 69
II.5. Procédure d'extractions chimiques des métaux et analyse 69
II.5.1. Protocole opératoire 69
II.5.2. Problèmes opératoires rencontrés 70

III. Résultats 70
111.1. Validité de la méthode 70
II1.1.1. Analyse du matériel certifié 70
III.1.2. Analyse de la crevette Litopenaeus sty/irostris 70
III.2. Distribution et évolution des métaux 73
111.2.1. Introduction et rappels 73
III.2.2. Distribution des métaux dans les crevettes 73
... II1.2.3. Cas particulier des granulés alimentaires 76
111.3. Constats et hypothèses 76
IlIA. Notion de toxicité et contamination 77
111.4.1. Introduction 77
IIIA.2. Rappels sur les notions de toxicité et contamination 78
IIIA.3. Normes et santé humaine 78
IIIAA. Toxicologie et physiologie des crevettes 81

CHAPITRE 6 : CONCLUSION GENERALE 83

REFERENCES BIBUOGRAPHIQUES 87

ANNEXES 92

...
3
 J

4
 AVANT -PROPOS

" Don't dirty the water around you: you may have to drink it someday"

Proverbe mexicain

J'exprime toute ma reconnaissance aux Dr Renaud FICHEZ (Quelle polaire jaune,

mes aïeux Il!), responsable du programme de recherche ECOTROPE, et Jean-Michel
FERNANDEZ (a-t'il au moins constaté les efforts suprêmes déployés pour toute forme de
rangement ?), chargé de recherche en géochimie marine, pour m'avoir accueilli et accepté
pour la troisième fois (à ce niveau-là, ce n'est plus du courage, c'est un véritable challenge
!!!) au sein du laboratoire d'océanographie biologique du centre IRD de Nouméa.
Qu'ils reçoivent ici le témoignage de ma reconnaissance pour la qualité de leurs
encadrements, leurs conseils avisés, leur bonne humeur de chaque instant, et ce, malgré les
épreuves et obstacles parfois rencontrés.
Je les remercie pour la confiance qu'ils m'ont accordée, et leur aide précieuse à
des moments "clefs" de ma vie.

"AII the rivers run into the sea,' yet the sea is not fui/"

La bible, Ecclésiastique 1 : 7

Je tiens ensuite à remercier Ludovic BREAU, Roi des grisettes, Empereur

incontesté et incontestable des holothuries, et Grand Gourou, s'il en est, de la
transplantation transcendantale (qu'entends-je ?)... pour son aide précieuse, ses
connaissances écologiques, son caractère ("Bougonner est l'apanage des français purs
souchd' Auteur anonyme) et surtout son amitié. Bonne chance pour la suite !!!l

Une fois encore, un grand merci à Mister Benjamin MORETON (est-il vraiment
anglo-saxon ?), pour ses qualités d'homme torche, mais essentiellement pour ses qualités
propres, bien évidemment.

Je tiens également à exprimer toute ma reconnaissance à Chantal MUGNIER,

chargée de recherche à IFREMER, et Reine (non pas de la fête de la mer..) des crevettes,
pour son aide, et ses conseils précieux sur nos amis les pénéides.

Je remercie enfin l'ensemble des membres du Laboratoire d'océanographie, qu'ils

soient chargés de recherche, ingénieurs, techniciens, apprentis chercheurs ou stagiaires,
pour leur accueil, leur disponibilité, leur joie de vivre et leur passion de la science et du
grand large....

5
 RESUME

Ce rapport d'activités s'inscrit dans le cadre d'une action de recherche menée par
le centre IRD de Nouméa, le Centre d'Océanologie de Marseille (COM), et le Laboratoire
de Biologie et Biochimie Marines (université de la Rochelle) sur l'étude de l'accumulation
des métaux dans des organismes marins tropicaux, en vue de la recherche de
bioindicateurs. L'étude entreprise a pour objectif de définir et valider un ou plusieurs
protocole(s) opératoire(s) de digestion totale des échantillons biologiques. La multiplication
des expérimentations effectuées a entraîné la conception d'un ensemble de procédures
techniques simples d'application, rapides et efficaces en terme de minéralisation complète
des échantillons et de rendement optimum d'extraction des métaux liés aux différentes
matrices organiques étudiées. L'emploi de matériaux de référence agréés par la
communauté internationale a permis d'attester de la précision et de la justesse du
protocole nouvellement défini. Les premiers essais réalisés sur certaines espèces
d'organismes végétaux et animaux lagonaires donnent des résultats concluants et
encourageants, et montrent ['adaptation possible de ce protocole sur des matrices
biologiques de texture et composition diverses.

ABSTRACT

The present paper is part of research project carried out by IRD Noumea Center,
the Marseille Oceanology Center and the Marine Biology and Biochemistry Laboratory
(University of La Rochelle). The subject concerns metals accumulation studies in tropical
marine organisms. The final aim is to provide sound extraction techniques to be used in
bioindicators from the South-West lagoon of New-Caledonia. The determination and
validation of total digestion protocols of biological samples is presented. Numerous
experiments were conducted to test the efficiency of different technical procedures used
to reach complete metal extraction prior to ICP-OES detection. The use of referential
materials proved the new protocol to be highly accurate. Application to lagoon organisms
(animal and vegetal) give very consistent and conclusive results, and demonstrate the
protocol to be suitable, simple, quick and cost effective when applied to a large range of
biological samples of different nature and composition.

6
 Liste des figures
Figure 1 : Schéma du four micro-ondes de type ANTON-PAAR PERKIN-ELMER.
Figure 2 : Schéma du carroussel (ou rotor) sur lequel les 6 bombes en téflon sont disposées et fixées
par l'intermédiaire d'un système de vis entre les deux plateaux (source: Microwave Sample
Preparation System - Instruction Handbook).
Fi.9.ure 3 : Descrip'tion du ~stème de mesures de la pression et température interne des bombes en
téflon au cours au chauffage par l'intermédiaire d un détecteur infra-rouge (schéma d'une coup'e
transversale du carrousel et d une bombe en téflon). Le schéma montre également le système de
ventilation appliqué sur l'ensemble du jeu de carroussel lors du chauffage (source: Microwave Sample
Preparation System - Instruction Handbook).
Figure 4 - Schéma de la procédure d'extraction des éléments traces dans les matrices d'origine
biologique employé lors des études préliminaires (BREAU, 1999).
Figure 5 : Schéma de la nouvelle procédure d'extraction des éléments traces dans les matrices
d'origine biologique.
Figure 6 : Composants majeurs d'un aEparei/ de mesure ICP-OES (source : Hardware guide of ICP
Emission Spectroscopy - Optima 3000 family PERKIN-ELMER).
Figure 7 : Module de la torche à plasma, constituée du nébuliseur, d'une chambre de vaporisation, et
de la torche en quartz (source: Hardware guide of ICP Emission Spectroscopy - Optima 3000 family
PERKIN-ELMER).
Figure 8: Diagramme schématique du système oRtique de collecte et d'enregistrement de l'ICP-OES
Optima 3300 XL (source : Hardware guide of ICP Emission Spectroscopy - Optima 3000 family
PERKIN-ELMER).
Figure 9 : Carte de localisation des sites d'étude et de récolte dans le lagon sud-ouest de Nouvelle-
Calédonie.
Figure 10: Bassin de dépuration utilisé dans le cadre de cette étude.
Figure 11 : table de dissection et réalisation des mesures biométriques sur les différentes espèces
biologiques étudiées.
Figure 12: Récap'itulatif des expérimentations effectuées sur l'échantillon standard interne GT D65
(Gafrarium tumidum).
Figure 13: RécaEitulatif des expérimentations effectuées sur les échantillons standards internes
HE N27 Visc. & HE N27 Teg. (Holothuria edulis).
Figure 14: Récapitulatif des expérimentations effectuées sur "échantillon standard interne CT D43
(Caulerpa taxifolia).
Fi~re 15 à 17 : Evolution et distribution des concentrations en aluminium, cuivre et fer dans les
différentes parties anatomiques de l'espèce de crevettes Litopenaeus stylirostris.
Fi~re 18 à 20 : Evolution et distribution des concentrations en manganèse, nicklel et zinc dans les
différentes parties anatomiques de l'espèce de crevettes Litopenaeus stylirostris

Liste des tableaux

Tableau 1 : Récapitulatif des valeurs certifiées (l!g/g de poids sec ou PEm) et des intervalles de
confiance respectifs de quelques éléments métalliques des matériaux de réference DORM-l (NRCC)
et MA-A-l (AlEA), utilises pour la validation du protocole de minéralisation de la matrice biologique.
Tableau 2 : Récapitulatif des résultats obtenus pour l'analyse des éléments métalliques dans des
triplicats de blancs d'acide nitrique concentré et de péroryde d'hydrogène, utilisés dans la digestion
des échantillons biologiques. Détermination de leur degré d impuretés.
Tableau 3 : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
certifiées de l'échantillon de référence DORM-l (NRCC - muscles de chien de mer) pour l'analyse
des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et analytique
appliquée (test de réplicabilité et répétabilité).
Tableau 4a : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
... certifiées de l'échantillon de référence MA-A-I brut (AlEA - Homogénat de copépodes) pour
l'analyse des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et
analytique appliquée (test de réplicabilité et répétabilité).

7
Tableau 4b : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
certifiées de l'échantillon de référence MA-A-l reconditionne (AIEA - Homogénat de copépodes)
pour l'analyse des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire
et analytique appliquée (test de réplicabilité et répétabilité).
Tableau 5 :Comparaison entre les valeurs (moy. ± écart-type) obtenues (n=3) et les valeurs certifiées
de l'échantillon de référence DOLT-l (NRCC - foie de cnien de mer) pour l'analyse des métaux, et
estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et analytique (test de
réplicabilité et répétabilité).
Tableau 6 : Récapitulatif des organismes, organes ou tissus étudiés et description des mesures
biométriques effectuées.
Tableau 7 : Récapitulatif des valeurs de précisions ('0) de la procédure opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (GT D65)
du bivlalve Gafrarium tumldum (grisette). Les précisions sont estimées sur des triplicats
d'échantillons.
Tableau 8 : Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (lJ.g/g de poids sec ou l'pm) pour
"analyse des métaux dans l'échantillon standard interne (GT D65) du oivlalve Gafrarium tumldum
(grisette) (0 teneurs proches ou en deça des limites de detection et quantification). Les
concentrations sont estimées sur des triplicats d'échantillons.
Tableau 9 : Récapitulatif des valeurs de précisions ('0) des procédures opératoire et analytique
appliquées, obtenues p'our l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (HE N27)
de l'echinoderme Holothuria edu/is (holothurie) (0 teneurs proches ou en deça des limites de
détection et quantification). Les précisions sont estimées sur des triplicats d'échantillons.
Tableau 10: Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (Ilg/g de poids sec ou l'pm) pour
l'analyse des métaux dans les viscères et téguments de l'espèce H%thuria édu/is (0 teneurs
prodies ou en deça des limites de détection et quantification). Les concentrations sont estimées sur
des triplicats d'échantillon.
Tableau 11 : Récapitulatif des valeurs de précisions ('0) des procédures opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (CT D43)
de la phanérogame Cau/erpa taxifo/ia. Les précisions sont estimées sur des duplicats d'échantillons,
excepté pour les échantillons sur lesquels le programme de four classique a été appliqué.
Tableau 12 : Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (IJ.~/g de poids sec ou l'pm) pour
l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (CT D43 de la phanérogame Cau/erpa
taxifo/ia. Les concentrations sont estimées sur des duplicats d'éc antillons, excepté pour les
échantillons sur lesquels le programme de four classique a été appliqué.
Tableau 13: Récapitulatif des valeurs de précisions ('0) de la procédure opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans différentes parties corporelles de la crevette
«Litop'enaeus sty/irostris» (0 teneurs proches ou en deça des limites de détection et
quantification). Les précisions sont estimées sur des triplicats d'échantillons, exceptés pour les
cuticules de queues de crevettes (n = 4), et les céphalothorax (n = 2).

Tableau 14 : Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus ~~g/g de poids sec) pour
l'analyse des métaux dans différentes parties corporelles de la crevette Litopenaeus sty/irostris'
(0 teneurs proches ou en deçà des limites de détection et quantification). Les précisions sont
estimées sur des triplicats d'échantillons, exceptés pour les cuticules de queues, les granulés (n=4),
et les céphalothorax (n=2).
Tableau 15 : Rép'ertoire de quelques teneurs maximales admissibles pour la consommation humaine
(mg/kg de poids frais &pOids sec*) établies par la SASO, dans les tissus mous (queues décortiquées)
de crevettes (source: SASO, 1971a, 1977b, 1980a, 1980b; dans SADIQ, 1995).
* On considère un rapport poids frais/poids sec de "ordre de 4,5.
Tableau 16: Liste de «]ammes de concentrations (lJ.g/g de ~oids frais) détectées dans différentes
espèces de crustacées a travers le monde (source: CARBONELL et al., 1998).

8
 CHAPITRE 1

INTRODUCTION GENERALE

9
--~

La plupart des activités économiques en domaine maritime concerne les zones

côtières. Cinquante pour cent de la population mondiale se concentre à moins de cent
kilomètres de ces franges littorales qui ne représentent pourtant que huit pour cent de la
surface des océans. En conséquence directe, l'apport des continents, et en particulier, les
apports dt effluents, de déchets et polluants, aboutissent principalement dans les
écosystèmes côtiers. Ces apports dépassent en de nombreux endroits, la capacité de
digestion de la machine océan (MINSTER, 1997). Les écosystèmes littoraux coralliens des
états insulaires du pacifique loin de faire exception à cette constatation environnementale,
subissent d'importantes influences terrigènes et anthropiques. Ils sont actuellement
soumis à un essor démographique conséquent, qui se traduit par l'extension des centres
urbains, le développement d'agriculture intensive, la surexploitation des ressources
halieutiques ou encore les déforestations et exploitations minières (CLAVIER & FICHEZ,
1996).

La prise de conscience générale, au sein des communautés scientifiques, du danger

potentiel et des conséquences de la pression anthropique sur les écosystèmes tropicaux
(SALVAT, 1987; HUTCHINGS, 1994) a entraîné, à partir des années 80, le développement
d'études et programmes nationaux et régionaux, comme en polynésie française (POLI et a/,
1984; FRAIZIER et al, 1985; De NARDI, 1989; LONZOMAZINO et al., 1993; FICHEZ et
al., 1997; HARRIS, 1998). L'IRD (Institut de Recherche pour le Développement) participe
activement à cet effort de recherche, et a défini plusieurs projets fédérateurs dans cette
thématique, dont le programme ECOTROPE. Ce projet se propose de traiter de l'influence
des apports terrigènes et anthropiques sur les systèmes récifo-Iagonaires (biotopes et
biocénoses) situés autour des sites urbanisés de Nouméa (Nouvelle-Calédonie) et Suva
(Fidji) (CLAVIER & FICHEZ, 1996). Le programme comprend quatre grandes actions de
recherche dont deux qui se proposent de déterminer les conséquences des apports dissous
et particulaires sur les biotopes et caractériser le rôle indicateur et intégrateur des
biocénoses pélagiques et benthiques.

Les études géochimiques menées jusqu'à présent au sein du programme ont permis
de mettre en évidence les influences des apports terrigènes et anthropiques (urbaines et
industrielles) au niveau de la zone côtière et urbaine de Nouméa (baie Ste-Marie, Grande
Rade..), et dans l'environnement côtier limitrophe (Baie de Dumbéa, Baie de Boulari...).
L'analyse des métaux lourds dans les matrices sédimentaires (sédiments de surface et
carottes) démontre nettement les perturbations subies par le milieu marin, et les
modifications engendrées sous l'influence de ces multiples apports (BREAU, 1998; CABON
et al., 1998). Par contre, il existe relativement peu de références bibliographiques sur les
actions et le devenir des métaux au sein des différentes communautés biologiques
présents dans le lagon calédonien (CHAVE & BUDDEMEIER, 1977; BINET & BOELY, 1981;
ROONEY et al., 1989; BREAU, 1999), et donc, à fortiori, sur les impacts néfastes ou pas,
de ces éléments potentiellement contaminants au sein des chaînes trophiques et du cycle
de la vie. Les zones côtières, et les écosystèmes estuariens inévitablement liés, par
lesquels transfèrent la majorité des éléments terrigènes et/ou anthropiques, constituent
effectivement de véritables "pièges à polluants" de par leurs caractéristiques
géomorphologiques et leurs propriétés physico-chimiques. La forte productivité et
l'activité biologique intense associées à ces milieux peuvent engendrer un rapide transfert
de ces éléments potentiellement contaminants au sein des chaînes alimentaires non
seulement dans les biocénoses côtières, mais également à plus grande échelle dans l'océan
du large, notamment au moyen des espèces de poissons pélagiques. Or, les organismes
marins vivant dans des environnements à 'risques', et pouvant accumuler des éléments

10
 ... toxiques en concentrations excessives représentent un véritable danger en terme de santé
publique pour les populations locales, dans la mesure où les environnements côtiers
représentent des zones de ressource nourricière et que beaucoup d'organismes ont un
statut commercial (SKERFVING, 1972;
BEBBINGTON et al., 1977; KFUPM/RI, 1988; SADIQ et al., 1995). La mise en place de
"Biomonitoring", permettant une surveillance et gestion de ces "zones à risques" s'avère de
plus en plus fatalement utile et indispensable, et ce, dans un souci à la fois écologique et
économique (préservation des biocénoses, des ressources nutritionnelles maritimes, santé
publique... ).

En conséquence et au regard de la relative absence de travaux concernant les

métaux et leurs conséquences potentielles sur le vivant en milieu tropical marin, il a semblé
utile d' intégrer un projet abordant ce thème dans le cadre du programme ECOTROPE. Un
sujet de recherche mené sous l'égide du centre IRD de Nouméa, du centre d' océanologie
de Marseille et du laboratoire de biologie et biochimie marines (université de la Rochelle),
sur "l'étude de l'accumulation des métaux dans quelques organismes marins: recherche de
bioindicateurs et application à la gestion de l'environnement dans le lagon sud-ouest de la
Nouvelle-Calédonie' a été divisé en trois actions précises:

~ La sélection des espèces bioindicatrices.

~ Etude des cinétiques d'accumulation et d'élimination des métaux et
détermination de la biodisponibilité des métaux vis-à-vis des espèces.
~ Réalisation de bioessais et étude de transferts in vitro.

Le présent travail s'inscrit dans le cadre de la première action de recherche et a

pour but de définir un protocole de digestion totale des échantillons biologiques en vue de
mesurer les teneurs en éléments métalliques dans les différentes matrices étudiées.

Ce rapport débute par un rapide récapitulatif des travaux déjà effectués sur ce
sujet dans cette région du Pacifique, puis présente les multiples expérimentations mises en
oeuvre et de la démarche scientifique suivie pour la mise au point et la validation du
protocole opératoire et de la méthode analytique employés à partir de matériaux de
référence. Une seconde partie présente les résultats obtenus dans le cadre d'une étude
effectuée en relation avec l' IFREMER Nouvelle-Calédonie sur les crevette d'élevage, ainsi
que les travaux réalisés sur les échantillons biologiques provenant d'organismes
potentiellement ou non bioindicateurs, collectés dans le cadre du projet de recherche
ECOTROPE sur la bioaccumulation.

....

Il
12
..

CHAPITRE 2

BIBLIOGRAPHIE ET TRAVAUX
PRELIMINAIRES

..

13
I. INTERETS DU BIOMONITORING NOTION DE BIOINDICATEURS

Les pays industrialisés (hémisphère nord essentiellement), localisés en milieu

climatique tempéré, sont - au cours des siècles derniers, et à fortiori, les dernières
décennies -, les principaux responsables des prélèvements massifs des ressources non
renouvelables et renouvables, des pollutions, et par-là même, du rejet dans l'environnement
de produits et déchets chimiques. L'industrialisation et l'urbanisation croissantes au sein
de ces sociétés de consommation constituent les vagues de mutation technologique
entrainant des dommages non négligeables et sans précédents au niveau environnemental,
dont les franges littorales, durement touchées (BEAUD, 1993).

Pour des raisons écologiques, socio-économiques (impact touristique...) et sanitaires,

le développement d'outils de gestion et de surveillance du milieu littoral, s'est avéré
rapidement comme une action prioritaire dans ces pays, afin de préserver un état de santé
correct de l'environnement et limiter les déséquilibres déjà engendrés (OCDE, 1991:
UNEP, 1991-1992; BEAUD, 1993).

Les réseaux de surveillance des écosystèmes côtiers utilisent notamment par

l'action du biomonitoring, des organismes marins pour leurs propriétés spécifiques en
terme de bioindicateurs. Un bioindicateur peut être défini comme une modification de la
réponse biologique d'un organisme, liée à une exposition aux polluants chimiques présents
dans l'environnement (McCARTHY et al., 1990). En d'autres termes, un bioindicateur est
une espèce animale ou végétale dont l'analyse permet d'obtenir des informations intégrées
dans le temps sur les conditions environnementales et sur la biodisponibilité spécifique des
contaminants présents dans le milieu ambiant, et qui ne peuvent pas être fournies par de
simples analyses chimiques d'eau de mer ou de sédiments (BREAU, com. pers.).

Cette approche, mise en œuvre pour la sauvegarde de l'environnement, est

instaurée en sur le long des zones côtières des pays industrialisés depuis plus de trois
décennies, et est actuellement largement répandue. Le Réseau National d'Observation
(RNO) de la qualité du milieu marin, ou encore le REPHY (étude et surveillance des
efflorescences algales toxiques), constituent deux actions de biomonitoring développées
sur le littoral français. Les études appliquées aux bioindicateurs concernent de nombreux
produits et déchets chimiques, mais les principaux polluants étudiés sont les métaux, les
pesticides ou les composés d'origine industrielle et anthropique (BURGEOT, 1994). L'étude
des métaux dans les organismes marins, en vue de définir leur potentiel en tant que
bioindicateurs, a fait l'objet d'un nombre de travaux importants en milieu tempéré
(MIRAMAND & GUARY, 1980; MIRAMAND & BENTLEY, 1992; FOWLER, 1985; BEEFTING
& NEUWESHUIZE, 1986; DEPLEDGE & RAINBOW, 1990; AYAS & KOLANKAYA, 1996;
RAINBOW, 1996; BAT et 01., 1998...). La liste de travaux cités précédemment est bien
évidemment loin d'être exaustive mais laisse transparaître le nombre conséquent d'études
mises en œuvre. En revanche, la littérature propose moins de travaux en rapport avec les
organismes d'origine tropicale, en milieu littoral, et les métaux traces (DENTON &
BURDON-JONES, 1986; SHARIF et 01., 1991: TARIQ et al., 1991). A fortiori, les études
sur les bioindicateurs potentiels pouvant être utilisés comme espèce sentinelle de
l'environnement dans ces régions du globe restent limitées, mais tendent à se développer
(SILVA & QASIM, 1979; DENTON & BURDON-JONES, 1986; KUMAR, 1988; LIM et al.,
1995; FLAMMANG et al.: 1997).

14
 En Nouvelle-Calédonie, un nombre limité d'articles évoquent des études sur les
concentrations en métaux dans des organismes de l'écosystème lagonaire (CHAVE &
BUDDEMEIER, 1977; BINET & BOELY, 1981; ROONEY et al., 1989; BREAU, 1999) et le
projet de recherche mise en œuvre au sein du programme ECOTROPE sur la définition de
bioindicateurs dans le lagon calédonien reste la première étude de ce genre sur le
territoire (thèse BREAU Ludovic, en cours).

II. PROCEDURES OPERATOIRES MISES EN ŒUVRE DANS LA RECHERCHE

DE BIOINDICATEURS : UTIUSATION DU FOUR MICRO-ONDES

En rapport avec les travaux cités précédemment, la détermination des

bioindicateurs nécessite une étude préalable sur les potentialités d'accumulation des
métaux par les organismes animaux et végétaux, et donc une analyse de ces éléments
traces au sein de ces matrices. Les différentes procédures opératoires, qui composent les
méthodes analytiques employées, impliquent une étape de digestion partielle ou complète
des espèces étudiées dans leur ensemble ou de certaines parties corporelles (tissus mous,
exosquelettes, téguments, viscères, muscles...). Deux techniques de digestion de digestion
à haute température (décomposition accélérée de la matrice et augmentation du
rendement d'extraction des éléments étudiés) sont couramment utilisées:

• La méthode de chauffage dite "classique" avec bain de sable chaud ou plaque chauffante
(-r'C "" 70 - 120 OC),
• Le four à micro-ondes (-r'C "" 250°C), une technique plus récente et qui semble prendre le
pas vis-à-vis de la technique précédente.

En rapport avec l'étude des bioindicateurs dans les milieux récifo-Iagonaires, Il

convient de noter qu'il existe relativement peu de références bibliographiques dans le
domaine de la digestion des matrices biologiques (animales ou végétales), d'origine
tropicale, utilisant le four micro-ondes sous conditions de pression hyperbare.(SHARIF,
1991; LIM, 1995; BELLET, 1997; CABON et a/, 1998; BREAU, 1999). Toutefois, ces
différentes études et les travaux effectués par BREAU lors d'études préliminaires sur la
potentialité d'accumulation de certains métaux chez des espèces lagonaires de
l'écosystème corallien calédonien constituent un outil de base pour la mise en place et
l'optimisation d'un ou plusieurs protocoles de digestion totale de différentes matrices
biologiques. Le protocole opératoire appliqué lors de l'étude préliminaire (BREAU, 1999)
était le suivant:

• Peser environ 500 mg d'échantillons biologiques (préalablement traités, lyophilisés et broyés)

dans une bombe en téflon (MF 100) de capacité 100 ml.
• Verser progressivement 6 ml d'acide nitrique concentré 69'Yo.
• Fermer hermétiquement les bombes avec un bouchon muni d'une valve de sécurité, et placer les
bombes sur le carroussel du four micro-ondes de modèle ANTON-PAAR PERKIN-ELMER.
• Appliquer le programme de digestion suivant:

EchantIllon bivalves ("Gafrarium mutidum'') et éponges

Programme USER 005M 100 W -7 800 W en 10 mn

800 W -7 1000 W en 20 mn
1000 W pendant 8 mn
o W pendant 10 mn (refroidissement des bombes)

15
 ou
Programme USER 006M 1000 W pendant 20 mn
refroidissement des bombes.
Echantillons poissons-papillons

Programme USER OOlM (muscles) 500 W -71000 W en 5 mn

1000 W pendant 15 mn
refroidissement des bombes

Ce protocole avait été établi sur une base empirique et n' avait pas fait l'objet
d'expériences systématiques préalables permettant de définir avec exactitude le
protocole opératoire à adopter dans le cadre de cette étude. Cette première approche
était destinée à fournir des informations préliminaires sur les potentialités bioindicatrices
de certaines espèces lagonaires. Le présent rapport se propose de définir les conditions
optimum, sur une base rigoureusement méthodologique, du ou des protocole(s) de digestion
totale, par chauffage micro-ondes sous conditions de pression hyperbare, pour chaque
matrice biologique.

16
 CHAPITRE 3

. DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE ET

ESSAIS DE VALIDA TION EN LABORATOIRE

..

17
I. PRINCIPE & INTERETS DE LA MINERAUSATION PAR MICRO-ONDES

Par rapport à la méthode classique dite "du bain de sable" couramment utilisé dans
les processus de digestion totale des échantillons d'origine sédimentaire ou biologique, la
technologie proposée par le chauffage micro-ondes sous conditions hyperbares offre de
nombreuses possibilités et avantages techniques et expérimentaux.
Concernant la minéralisation des échantillons, cette technique permet le maintien
sous pression des solutions d'attaque, ce qui induit une augmentation de la température
d'ébullition des acides employés, limitant ainsi leur vaporisation et assurant un meilleur
rendement de l'extraction. Par exemple, l'acide nitrique, à pression atmosphérique,
possède une température d'ébullition limitée à 90°C. Le maintien sous pression de ce même
acide permet d'atteindre un point d'ébullition de l'ordre de 190°C; une température qui
accroît le pouvoir oxydant de la solution. Cette méthode permet ainsi une augmentation de
la cinétique de décomposition des différentes matrices biologiques étudiées, une
diminution de la consommation d'acides, et assure également une meilleure propreté et
sécurité au niveau du traitement de l'échantillon (KINGSTON, 1998).

II. IDENTIFICATION ET DESCRIPTION DES PARAMETRES ETUDIES.

Pour la mise au point d'un protocole de digestion totale par chauffage micro-ondes
sous condition de pression hyperbare, que ce soit sur une matrice sédimentaire ou
biologique, il semble nécessaire de prendre en compte et de faire varier les paramètres
suivants:

La masse d'échantillons (m) traitée à chaque attaque.

La nature et le volume d'acides ou mélanges de réactifs employés pour attaquer
complètement la matrice biologique.
La puissance (00) appliquée sur l'échantillon lors de la digestion (programmation sur le
four micro-ondes ANTON-PAAR PERKIN-ELMER).
Le temps d'exposition (t) optimum ou durée de minéralisation de l'échantillon aux
différentes gammes de puissance appliquées lors de la digestion (programmation sur le
four micro-ondes ANTON-PAAR PERKIN-ELMER).

ILL Masse d'échantillon:

Conformément au protocole déjà établi (BREAU, 1999), la masse d'échantillon

attaquée, fixée à 500 mg, a été conservée lors des premières expériences d'optimisation
du protocole opératoire sur des échantillons certifiés de référence (DORM-l, Conseil
National de Recherche du Canada; MA-A-1, AIEA). Des essais d'évaluation des quantités
minimales d'échantillon à attaquer, tout en restant dans des gammes de concentrations
analysables sur SAA ou ICP-OES, pourront par la suite être mis en place sur les
différentes matrices biologiques étudiées. :rI convient toutefois de noter que les études et
expériences menées par les services PERK:rN-ELMER préconisent une quantité minimale
d'échantillons à introduire dans les bombes en téflon, de l'ordre de 200 mg.

18
 II.2. Nature et volume des acides et/ou mélanges d'acides:

L'acide nitrique (HN0 3 69i'o), chlorhydrique (HCI 36i'o), ainsi que le péroxyde
d' hydrogène (HzO z) constituent les trois réactifs fréquemment soumis à l'essai pour la
digestion totale de la matière biologique en four micro-ondes sous conditions hyperbare.
De nombreux travaux prouvent l'efficacité de l'acide nitrique concentré (69%) chauffé
pour la déstructuration des tissus organiques (LORING & RANTALA, 1977; COSSA et al.,
1980; KINGSTON & J ASSrE, 1988; USERO et al., 1996). En effet, l'acide nitrique revêt
un fort pouvoir oxydant lorsqu'il est soumis à des températures supérieures à 200°C, en
système clos sous pression. Toutefois, plusieurs auteurs s'accordent pour affirmer que
l'acide nitrique n'est pas suffisamment puissant pour digérer complètement les composés
organiques (GUPTA & CHEN, 1975; TESSIER et a/., 1979), et que l'utilisation
complémentaire de "acide chlorhydrique et du péroxyde d' hydrogène peut s' avérer
relativement efficace dans le processus de minéralisation totale (EAKINS & MORISSON,
1978; EL DAOUSHY, 1991; SERRA, 1991). Lors de la digestion de matériel organique par
l'intermédiaire d'acide nitrique concentré, l'ajout de 5 à lOi'o d'acide chlorhydrique peut
s'avérer utile notamment en tant qu'agent décomplexant de certains métaux (Fe, Sb, Sn,
Ag, Zn) présents sous forme de chlorocomplexes. L'acide perchlorique (HCI0 4 ) peut
également parfois être employé pour la digestion des matrices d'origine biologique.
Toutefois, cet agent oxydant extrêmement fort comporte de nombreux risques et
désavantages lors de son utilisation. Explosif lorsqu'il est mélangé avec des composés
autres que des produits acides, il présente également des risques de contamination
potentielle des échantillons et peut être à l'origine de réactions hasardeuses lors de
fortes montées en température. Il n'a donc pas été testé dans le cadre de cette étude,
d'autant que les matrices d'origine biologique étudiées ne nécessitent pas
fondamentalement l'emploi d'un tel produit. Pour des raisons évidentes de fiabilité et
validité du protocole appliqué, des tests alliant différents mélanges de réactifs à des
proportions variables ont été effectués afin de déterminer l'efficacité des différents
acides et oxydants puissants (préparation de cocktails), ainsi que l'intérêt de leur emploi.

NB : Le péroxyde d'hydrogène soumis à de fortes températures perd une partie de son

efficacité. Cette constatation technique est essentiellement vérifiée lorsque cet oxydant,
fortement chauffé à pression atmosphérique, se dissocie. Dans le cas de cette étude, le
péroxyde sera soumis à de fortes températures, de l'ordre de 200 - 230°C, mais sous
conditions hyperbares; conditions qui limitent considérablement sa dissociation
(FERNANDEZ, com. Pers.). Il convient également de rappeler que des précautions doivent
être prises en ce qui concerne les quantités de péroxyde d'hydrogène versées et la
proportion relative de ce produit oxydant par rapport aux acides utilisés. Des quantités
trop importantes de péroxyde peuvent effectivement entraîner de violentes réactions
(Instruction Handbook, PERKIN-ELMER).

II.3. Puissance du four micro-ondes:

Le four micro-ondes de type ANTON-PAAR PERKIN-ELMER (figure 1) utilisé dans

le cadre de ce travail autorise une puissance maximale de 1000 W. C'est à cette puissance
que le processus de minéralisation de l'échantillon biologique sera optimal. La montée en
... puissance, de 0 à 1000 W, de l'appareil par paliers successifs est définie de façon à éviter
tous réactions vives des produits d'attaque. Toutefois, il convient de préciser que la valeur

19
de puissance maximale (1000 W) n'est pas toujours accessible selon les programmes
individuels de décomposition créés. En effet, le four micro-ondes et les bombes téflon
utilisés dans le cadre de cette étude autorise une énergie micro-ondes maximale de 30000
Joules pour chaque programme de digestion, et ce, sur toute la durée du dit programme.
L'énergie est définie comme le produit de la puissance micro-ondes dissipée au cours des
différentes étapes du protocole et la durée de ces mêmes étapes. En conséquence,
certains programmes nécessitent une diminution soit de la durée de certaines phases, soit
de la gamme de puissance appliquée sur l'échantillon afin de ne pas dépasser l'énergie
maximale requise. Les premières expériences (§ V.2. Chap. 3) se déroulent notamment avec
une puissance maximale réglée à 950 W. Cette limitation n'entache en rien le rendement
de décomposition de l'échantillon au cours de la manipulation, à partir du moment ou les
autres paramètres (durée d'exposition) du programme sont réglés de façon à compenser la
perte minime de puissance appliquée et obtenir un processus de digestion optimal. Les
expériences ultérieures à la détermination du volume optimal de solution d'attaque
pourront être réalisées avec un réglage de puissance maximale, soit 1000 W.

~--~---~---~----~~--

0000

Do
Cavity Rotor Drive Oponing for Oven Baso Plate Salety Ooor Contact
Boarlng Exhaust AIr

Figure 1 : Schéma du four micro-ondes de type ANTON-PAAR PERKIN-ELMER.

NB : Précisions sur les paramètres température et pression.

La puissance ou les gammes de puissance programmées dans le four micro-ondes
(1000 W maximum pour le four micro-ondes ANTON-PAAR PERKIN-ELMER) détermine la
vitesse de montée en température de la solution contenant l'échantillon, ainsi que la
température finale. Celle-ci dépend également du temps d'exposition, à savoir que la
température croît avec l'augmentation du temps d'exposition. La température des
solutions détermine pour sa part la pression exercée au sein des bombes en téflon utilisées
pour la digestion des échantillons. Or, les bombes en téflon employées admettent, pour un
fonctionnement optimal, une pression maximale (30 bars), et par-là même une température
maximale (230°C) (figure 2). Le dépassement de l'un ou l'autre de ces maxima entraine un
arrêt de la manipulation en cours, ainsi qu'une perte d'échantillons.
Dans le cadre de ce travail, et contrairement aux anciens modèles de four à micro-
ondes, les paramètres température et pression sont gérés par l'appareil lui-même, ce qui
réduit considérablement les problèmes méthodologiques cités auparavant (figure 3).

20
 ..
Rolor Upper Plaie

Rolor Faslening Screw

Lever

80mb Jackel

Deepening

Rolor Bollom Plaie Vessel Number

Figure 2 : Schéma du carroussel (ou rotor) sur lequel les 6 bombes en téflon sont disposées et fixées
par l'intermédiaire d'un système de vis entre les deux plateaux (source: Microwave Sample
Preparation System - Instruction Handbook).

Hydraullc System
Rotor Nul

Rolor Upper Plaie

,. Reaction Vessel Tension Red

a
Pressure Vessel
:)

Reler Bellom PlaIe

IR Oplical System
IR Delecter -----1•• Alr Duc1

Figure 3 : Description du système de mesures de la pression et température interne des bombes en

téflon au cours du chauffage par l'intermédiaire d'un détecteur infra-rouge (schéma d'une coupe
transversale du carrousel et d'une bombe en téflon). Le schéma montre également le système de
ventilation appliqué sur l'ensemble du jeu de carroussellors du chauffage (source: Microwave SampIe
Preparation System - Instruction Handbook).

...

21
III. PRECAUTIONS A PRENDRE AVEC LE FOUR MICRO-ONDES.

Les matériaux exposés aux radiations micro-ondes (ondes électromagnétiques de

gamme de fréquences 300 MHZ à 300 GHZ) montrent un comportement sensiblement
différent en fonction de leur texture ou matrice, soit plus exactement leur coefficient
diélectrique. Ce coefficient correspond à la capacité de l'échantillon à chauffer, et donc, à
se décomposer, en fonction des conditions opératoires appliquées par le chauffage au
micro-ondes, soit la programmation mise en place. Chaque échantillon réagit donc
différemment selon sa nature. C'est pourquoi, dans un souci de validation de la méthode
appliquée, il est nécessaire d'harmoniser ou homogénéiser les séries d'échantillons traités.
Il est préférable effectivement de traiter sur une même série des échantillons
relativement similaires en terme de composition, afin que les paramètres de travail
(température et pression) soient sensiblement analogues pour des conditions opératoires
données. Cette remarque est également valable pour la nature ainsi que les volumes de
solution d'attaque employés. En effet, des échantillons de composition différente, ou
encore des solutions et volumes d'attaque différents, sur une même série expérimentale
peuvent entraîner un ralentissement du processus de digestion, voire une procédure
incomplète.
Lors de la création de programmes individuels de décomposition, la valeur maximale
de puissance micro-ondes appliquée est peu significative, à partir du moment ou nous
travaillons à pleine puissance (capacité maximale du four 1000 W), l'appareil contrôlant et
gérant la pression et température soumise à l'échantillon. Par contre, il convient de rester
prudent sur les montées en puissance ou gradients de chauffage appliqués pour atteindre la
phase de plateau à pleine puissance. En effet, contrairement aux sédiments, les
échantillons d'origine organique, potentiellement sujet à des réactions chimiques
spontanées violentes, nécessitent un programme de décomposition alliant une montée en
puissance graduelle. Il n'est pas conseillé d'appliquer une pleine puissance dès le début de
la programmation. De plus, l'application d'une montée en puissance graduelle permet de
ménager le matériel d'extraction (bombes en téflon...), soumis à de rudes conditions
opératoires.

IV. ASSURANCE QUAUTE NOTIONS ET EMPLOI.

IV.!. Introduction

L'assurance qualité est une notion intégrante du domaine analytique marin. La

multitude des mesures et analyses réalisées annuellement dans le cadre de programmes de
surveillance de la pollution et le développement constant des techniques de mesures
nécessitent d'assurer une "qualité" optimale des résultats obtenus. Cette qualité est
indispensable pour valider et interpréter les données. Cette notion d'assurance qualité est
d'autant plus importante dans le domaine de l'analyse des éléments traces et ultra-traces
(faiblesse des niveaux de concentration).
L'assurance qualité est basée sur plusieurs paramètres que sont les performances
analytiques (précision, justesse, blanc ...), la qualité du matériel de laboratoire et le système
de validation des données entre autres. Ces notions constituent un ensemble de règles, de
procédures opératoires et d'usages établis par une structure de travail (agence

22
réglementaire, laboratoire..) qui assure adéquatement la qualité et la {iabl/ité des résultats
obtenus et produits par un laboratoire. Cet ensemble de règles qui représente les Bonnes
Pratiques de Laboratoire (IFREMER, 1989) sont présentées ci-dessous.

IV.2. Performances ana lytiques.

IV2.1. Précision et justesse.

La détermination de la reproductibilité et de la precIsion d'une méthode est

essentielle en vue de la validation des données obtenues, de leur valorisation et
interprétation dans le cadre du travail entrepris. Plusieurs critères permettent d'attester
de la qualité de la méthode employée et de l'analyse effectuée. L'incertitude appliquée aux
résultats est due à la combinaison d'erreurs aléatoires et systématiques.

• Les erreurs systématiques font l'objet de la section justesse (précision relative

ou exactitude de mesure). Celle-ci se définit comme "la différence entre une moyenne d'un
ensemble de résultats et la valeur acceptée comme étant la valeur vraie", soit la valeur
dite certifiée (QUEVAUVILLER et al, 1993). La précision relative se définit comme suit:

Erreur relative ('10) = 1001< ((Vc - Vol / Vc)

Ou Vc est la valeur certifiée de l'échantillon et Vo, la moyenne des valeurs observées.

Dans le cadre d'une analyse, la justesse est calculée à partir des résultats obtenus
sur le matériel de référence, base de la validation des données. Toutefois, il est souvent
considéré qu'il n'existe qu'une seule valeur certifiée pour le matériel de référence, ce qui
n'est pas le cas. Effectivement, les matériaux référentiels ne possèdent pas une valeur
certifiée unique, mais un intervalle de confiance, dans lequel les moyennes de valeurs
observées obtenues doivent s'inscrire afin de valider la méthode analytique appliquée.
• Les erreurs aléatoires (précision du processus analytique) sont évaluées en
effectuant des mesures sur des échantillons répliqués et en déterminant des coefficients
de variation. On distingue:

- Réplicabilité : A un niveau donné, étroitesse de l'accord entre les résultats individuels

successifs obtenus sur le même échantillon, soumis à l'essai dans le même laboratoire et
par le même analyste, même appareil, et même jour de dosage.
- Répétabilité: A un niveau donné, étroitesse de l'accord entre les résultats individuels
obtenus sur le même échantillon soumis à l'essai dans le même laboratoire et dont au moins
l'un des éléments suivants est différent, "analyste, l'appareil et le jour du dosage.
- Reproductibilité: A un niveau donné, étroitesse de l'accord entre les résultats individuels
successifs obtenus sur le même échantillon, soumis à l'essai dans des laboratoires
différents, et avec un analyste, un appareil et un jour de dosage différents.
Dans le cadre de cette étude, réplicabilité et répétabilité de la méthode analytique
ont été estimées, et non la reproductibilité. La précision relative ou exactitude de la
mesure est défini comme le rapport de l'écart-type à la moyenne exprimé en pourcentage:

CV (Coefficient de Variation) ('10) = 1001< 5/ M

Ou 5 est l'écart-type et M la moyenne des résultats obtenus.

23
Dans le cadre de ce travail, les différents protocoles mis en place seront testés sur des
triplicats. Il ne semble pas nécessaire de réaliser des tests sur un nombre de réplicats plus
importants.

rv.2.2. Blancs

Dans le domaine analytique, et notamment lors du dosage des métaux-traces, les

blancs se révèlent indispensables, en vue de l'exploitation des résultats. Il existe deux
types de blancs: le blanc d'analyse et de réactifs. Le blanc d'analyse fluctue en fonction
des variations de l'appareil (système électronique, etc ...). Il est nécessaire que ce blanc
soit régulièrement (à intervalles réguliers au cours de l'analyse) remis à zéro pour limiter
au maximum les risques d'erreurs liés à l'appareil. Le blanc de réactifs est alors dosé, dans
des conditions optimales lors de la manipulation, soit lorsque le blanc d'analyse est à zéro.
Dans le cadre de nos analyses, le blanc d'analyse et de réactifs se confondent et
correspondent à une solution d'acide nitrique 10'10 (concentration estimée de la matrice
finale).
Il convient de donner quelques précisions sur les notions de limites de détection et
quantification de l'appareil, déterminées à partir des mesures effectuées sur les blancs.
La limite de détection (LD) correspond à la limite analytique à partir de laquelle un
élément est détectable, alors que la limite de quantification (LQ), comme son nom "indique,
est la limite à partir de laquelle "élément considéré est quantifiable.
La différence entre ces deux critères est importante. En effet, la capacité de
détection d'un élément quelconque par un appareil de mesure n'implique pas
obligatoirement sa quantification. Plus la valeur obtenue lors de l'analyse se rapproche de
LD (3 fois l'écart-type des blancs), plus l'incertitude entourant la justesse de cette valeur
grandit. Lorsque la LD est basse et donc trop proche des propres limites de l'appareil, et il
n'est pas rigoureux d'accepter les résultats proches de cette LD. Ce problème justifie
alors l'emploi de la notion de LQ qui correspond à 10 fois l'écart -type obtenu sur les
blancs. On considère que, à partir de cette limite, les résultats obtenus sont fiables et
exploitables. Il est même souvent conseillé de ne prendre en compte que les résultats au
moins supérieurs à deux fois cette limite de quantification (COQUERY, com. pers.).

rv.2.3. Matériaux de référence.

Les premières séries d'expériences, destinées à optimiser et valider l'ensemble du
protocole opératoire de digestion, sont réalisées sur deux échantillons de référence issus
des laboratoires du Conseil National de Recherche du Canada (CNRC), et de l'Agence
Internationale de l'Energie Atomique (AlEA) :.

~ DORM-l (muscle de chien de mer Squa/us acanthias) - CNRC

~ MA-A-l (homogénat de copépodes) - AlEA

DORM-l est certifié pour les métaux-traces suivants : arsenic, cadmium, cobalt,
chrome, cuivre, fer, manganèse, mercure, nickel, plomb, selenium et zinc. Lors de leur
utilisation, et en vue d'une fiabilité optimale, il est préconisé d'analyser au minimum 250
mg d' échantillon. Le matériel de référence, préparé par le Laboratoire International de
l'Environnement Marin à l'AlEA, présente un certificat d'analyse pour les éléments
chrome, cobalt, cuivre, arsenic, argent, cadmium, manganèse, fer, zinc, nickel, sélénium,
mercure et plomb.

24
Tableau 1 : Récapitulatif des valeurs certifiées (/1g/g de poids sec ou ppm) et des intervalles de
confiance respectifs de quelques éléments métalliques des matériaux de référence DORM-1 (NRCC)
et MA-A-1 (AlEA), utilisés pour la validation du protocole de minéralisation de la matrice biologique.

DonM-l MA-A-l
(NRCC - muscles de chien de mer) (AlEA - Copépodes)
Element V. C. moy. (ug/g) Interv. Confiance V. C. moy. (uqlq) Interv. Confiance
Cd 0.086 0.074 - 0.098 0.75 0.72 - 0.78
Co 0.049 0.035 - 0.063 0.12 0.11 - 0.13
Cr 3.6 3.20 - 4.00 1.1 0.9 - 1.3
Cu 5.22 4.89 - 5.55 7.63 7.43 - 7.83
Fe 63.6 58.7 - 68.9 60 58 - 62
Mn 1.32 1.06 - 1.58 2.9 2.7 - 3.1
Ni 1.2 0.90 - 1.50 1.9 1.7 - 2.1
Zn 21.3 20.3 - 22.3 158 156 - 160

IV 2.4. Vaisselle

IV.2.4.1. Matériel pour métaux-traces: nature et emploi.

Le matériel de laboratoire, dans le cas de l'analyse des éléments-traces, possède

un rôle fondamental. Intervenant dans les multiples étapes de la préparation et traitement
de l'échantillon précédant l'analyse, il se doit d'être en conformité avec les "normes" de
propreté recommandées pour de telles analyses. Le choix du matériel, ainsi que le
traitement qu'il subit sont des données variables en fonction des éléments analysés, ainsi
que les différentes manipulations effectuées. Il est clair qu'une bonne compréhension de
la procédure analytique à appliquer, et une connaissance suffisante de la matrice chimique
du matériel utilisable et des interférences qu'il peut engendrer, constituent deux notions
primordiales dans le choix de la vaisselle et de son traitement (HOWARD & STATHAM,
1993).

Le matériel utilisé pour le stockage des échantillons et des réactifs pour l'analyse
des éléments-traces sont de nature plastique. Deux types de composites plastiques
peuvent être employés dans le cadre de ces expériences:

~ Le polypropylène, ou polyéthylène HDPE (haute densité), classiquement utilisés pour

l'ensemble des métaux-traces, exception faite du mercure.
~ Le téflon (fluorocarbone) constitue le matériau le plus efficace dans l'analyse des
éléments-traces. Sa composition lui assure une contamination inorganique de très faible
niveau. Toutefois, il nécessite, en contre-partie, un protocole de nettoyage extrêmement
strict.

Le téflon est le matériel principalement utilisé dans le cadre de ces

expérimentations dans l'ensemble des phases de la procédure opératoire. Seules les
seringues employées dans l'addition des réactifs et dans l'étape de filtration sont en
polypropylène.

25
 IV.2.4.2. Procédure de nettoyage.

- Procédure de nettoyage du matériel de prélèvement et de dépuration:

1° Rincer préalablement le matériel avec de l'eau déminéralisée (station).

2° Nettoyer le matériel avec de l'acide chlorhydrique HCI 5'Yo à froid.
3° Rincer abondamment à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17,7 MQ.cm- l )
4° Mettre à sécher, soit sous hotte laminaire soit à l'étuve (65°C), à l'abri de la poussière,
pour éviter toute contamination éventuelle.

- Procédure de nettoyage du matériel de dissection et traitement *:

1° Nettoyer préalablement le matériel avec un détergent liquide pour laboratoire (savon

COUNT-OFF™).
2° Rincer abondamment à l'eau déminéralisée (station).
3° Immerger le matériel dans un bain d'acide nitrique lO'Yo à froid pendant 24 heures.
4° Rincer abondamment à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17,7 MQ.cm-l ) .
5° Mettre à sécher, soit sous hotte laminaire soit à l'étuve (65°C), puis stocker à l'abri de
la poussière, pour éviter toute contamination éventuelle.

* La procédure de nettoyage décrite ci-dessus est valable pour l'ensemble du matériel en

polyéthylène et/ou téflon. Toutefois, il subsiste une procédure de nettoyage, plus rapide
et toute aussi efficace, des bombes en téflon de type MF (100 ml) avec le four micro-
ondes ANTON-PAAR, selon le protocole suivant:

1° Rincer préalablement abondamment des bombes avec de l'eau déminéralisée (Barnstead,

résistivité 17,7 MQ.cm- l ) .
2° Verser 5-10 ml d'acide nitrique concentré 68'Yo dans chaque bombe.
3° Fermer les bombes et les placer dans un cylindre en céramique prévu à cet effet,
4° Placer les cylindres sur le carroussel 6 places du four micro-ondes de modèle ANTON-
PAAR PERKIN-ELMER.
5° Appliquer le programme de nettoyage (PAAR 003M ou PAAR 007H *) correspondant à
l'application d'une puissance de 1000 W pendant 20 mn.
6° Rincer abondamment les bombes avec de l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17,7
MQ.cm-l ) .
T" Mettre à sécher, soit sous hotte laminaire soit à l'étuve (65°C), puis stocker à l'abri de
la poussière pour éviter toute contamination éventuelle.

* Programme PAAR 007H 1000 W ~ 1000 W pendant 20mn

o W pendant lOmn (refroidissement des bombes)
ou
Programme PAAR 003M 1000 W ~ 1000 W pendant 20mn
o W pendant 15mn (refroidissement des bombes)

26
 v. EXPERIMENTATIONS.
Les premières expérimentations, appliquées sur les matériaux de référence, sont
destinés à valider le protocole analytique utilisé.

V.l. Schéma d' extractions chimiques pour les métaux

Le protocole originel (figure 4), appliqué par BREAU (1999) préconise une étape
intermédiaire d'évaporation de la solution d'attaque après digestion de l'échantillon au
micro-ondes, puis une reprise du résidu par 5 ml d'acide chlorhydrique 0,5 M. L'échantillon
est ensuite filtré, puis stocké et analysé (annexe 1). L'absence de dommages occasionnés
par l'acide chlorhydrique de faible molarité au niveau du four graphite et de la torche rcp-
OES constitue la raison première de l'utilisation de cette solution HCI O,5M comme
matrice finale, et non l'acide nitrique concentré, produit d'attaque.

500 mg d'échantillon sec

dans bombes téflon

Î
Agitation manuelle et Evaporer à 90-95'}'o la
Ajout X ml HN03 68'}'o ou
digestion au four solution d'attaque au
cocktail d'acides
micro-ondes bain-marie 95°C

Séparation phase Liq/sol

Elimination du résidu final
par fMration (0,45 microns) Ajout de 5 ml HCI 0,5 M
potentiel (matériel
(stand en polysulfone et dissolution du résidu
réfractaire)
filtres Millipore 47mm) ......

Stockage de la solution "-

Récupération du surnageant contenant les éléments
Transfert dans flacon
dans une fiole jaugée 25 ml ~ traces extraits dons le
nalgène 30 ml
Compléter avec HCI 0,5 M réfrigérateur 2-4°C jusqu'à
analyse

Figure 4 - Schéma de la procédure d'extraction des éléments traces dans les matrices d'origine
biologique employé lors des études préliminaires (BREAU, 1999).

27
 Le temps nécessairement employé pour la phase d'évaporation ralentissant
considérablement la procédure, le protocole a été simplifié en procédant à l'élimination de
l'étape d'évaporation. De même, le procédé de filtration a été modifié. L'ancien protocole
préconise l'emploi de stand de filtration en polysulfone (composite non contaminant) avec
des filtres Millipore (0,45j.U'Tl) de diamètre 47 mm. Ce système impose des transvasements

/
500 mg d'échantillon sec
dans bombes téf Ion
....Ill

+ / '\
/ Séparation phase Liq/sol
par filtration (0,45 microns)
Agitation manuelle et
Ajout X ml HN03 68'10 ou
cocktail d'acides
~ digestion au four r+ (seringues en polyéthylène et
micro-ondes filtres-seringues en ester de
~ ....Ill
cellulose) ~

Elimination du résidu final

....
potentiel (matériel 1""'1
réfractaire)
~

Stockage de la solution "-

/'
~r
contenant les éléments ,
traces extraits dans le
réfrigérateur 2-4°C jusqu'a
~ Transfert dans flacon
~
Récupérat ion du surnageant
nalgène 30 ml dans une fiole jaugée 25 ml
analyse ~ ~ ....Ill

Figure 5 : Schéma de la nouvelle procédure d'extraction des éléments traces dans les matrices
d'origine biologique.

Successifs de l'échantillon, avec les risques de contamination et de perte que de telles

étapes comportent. Les contraintes observées nous amènent à appliquer un procédé plus
simple et plus rapide, avec l'emploi de seringues en polyéthylène et de filtres-seringues
(0,45~m) en ester de cellulose. L'échantillon digéré, est transvasé dans une coupelle en
téflon préalablement décontaminée à l'acide nitrique lO'Yo, puis aspiré et injecté, tout en
étant filtré, dans la fiole jaugée 25ml. Le schéma d'extractions chimiques employé dans le
cadre de cette étude est représenté sur le diagramme de la figure 5. Un protocole
opératoire plus détaillé pour chacune des étapes de la procédure est présenté en annexe 1.
L'étape de filtration se fait donc désormais directement à la suite de la digestion
des échantillons aux micro-ondes. La matrice finale est l'acide nitrique, dont la
%
concentration, après passage aux micro-ondes et dilution, est de l'ordre de 10 Cette •

concentration ne porte aucun préjudice au système d'analyse ICP-OES. Dans le cas ou le

signal d'un des éléments métalliques étudiés se révélerait trop faible sur l'ICP-OES,
l'échantillon peut être analysé sur le four graphite PERKIN-ELMER, dont les limites de
détection sont plus faibles. Dans ce cas, la matrice finale d'acide nitrique peut
endommager le four, obligeant le manipulateur à effectuer des rotations de four plus

28
 fréquentes qu'à l'accoutumée. Lors de la mise en place de ce nouveau protocole, il a
également été vérifié que les filtres-seringues employés résistaient à l'acide nitrique lO'Yo.

V.2. Volume de solution d'attaque.

Les expériences préalablement effectuées par BREAU (1999) préconisent l'emploi

de 6 ml d'acide nitrique 69'Yo pour 500 mg de matériel biologique. Des travaux annexes
réalisés par les services PERKIN-ELMER (KINGSTON, 1998) et WARNAU M. (Com. Pers.)
prévoient respectivement 9 ml d'acide nitrique concentré pour une masse d'échantillon
comprise entre 0,2 et 2g, et 2 ml d'acide nitrique 69'Yo en complément de 2 ml de péroxyde
d' hydrogène 30'Yo pour 19 d'échantillon. Certains auteurs préconisent des volumes d'acide
plus importants lors de la digestion de matériel organique plus réfractaire que les matrices
traitées dans le cadre de cette étude, comme les polymères (BESECKER et al., 1998;
YANDECASTEELE & BLOC, 1993). Au vu de ces différentes applications, et à la suite de
quelques essais préalables, il nous a semblé judicieux de fixer à 5 ml le volume d'acide
nitrique concentré employé pour la digestion des matériaux de référence au cours de cette
première étape de validation.
Au cours des expériences ultérieures, notamment sur les échantillons à traiter, des
essais de détermination de volume optimal de solution d'attaque seront appliqués afin de
définir la quantité d'acides (ou mélanges d'acides) nécessaire pour un rendement
d'extraction optimal des éléments métalliques recherchés et analysés.

V.3. Temps d' exposition au four micro-ondes.

Les temps d'exposition des différents échantillons biologiques étudiés au four

micro-ondes concernent à la fois la montée en puissance des échantillons (1 ère étape) et la
durée d'exposition de ces derniers soumis à la puissance maximale du four, de l'ordre de
1000 W (2 nde étape durant laquelle l'échantillon est totalement minéralisé). Dans le cadre
de l'étape de validation de la méthode analytique, la programmation au four micro-ondes
appliquée sur les matériaux de référence est la suivante:

Programme USER 011M 100 7 950 W en 10 mn ; puis 950 W pendant 25 mn.

o W pendant 15 mn (refroidissement des bombes)
Le temps de digestion a volontairement été exagéré compte tenu des matrices
biologiques étudiées. En effet, le programme employé utilise des temps de digestion
sensiblement analogues à ceux utilisés pour la digestion des polymères (BESECKER et al.,
1998), structures bien plus complexes et difficiles à solubiliser que les échantillons
analysés. Un ajustement de la durée de minéralisation est proposée ultérieurement. Les
temps d'exposition choisis pour les matériaux de référence correspondent à la durée
optimale préconisée par la notice technique du four micro-ondes pour un processus de
décomposition totale de la matière organique. Par souci de validation des expériences, nous
conservons cette donnée empirique.

VA. Acide ou cocktail d'acides.

.
Certains auteurs préconisent l'emploi d'un mélange tripartite avec l'acide nitrique,
chlorhydrique et le péroxyde d'hydrogène, ou encore un mélange acide nitrique/acide

29
sulfurique (BESECKER et al., 1998). Mais ces cocktails d'attaque sont généralement
réservés à la digestion de matériel organique très réfractaire, ou structure polymère, ce
qui n'est pas le cas des matériaux de référence, ni des échantillons traités dans le cadre
de cette étude. KINGSTON (1998) ou WARNAU (com. Pers.) emploient généralement
l'acide nitrique concentré comme solution d'attaque principale, parfois complétée par le
péroxyde d' hydrogène, pour la digestion respective de tissus d' huîtres et d'échinodermes.
Ces travaux constituent la base de notre choix pour l'emploi des deux produits d' attaque
cités précédemment. L'absence d'informations par rapport à nos échantillons, concernant
l'intérêt d'utiliser le péroxyde d'hydrogène en complément de l'acide nitrique nous a
poussé à réaliser des tests sur les matériaux de référence. Ces tests qui reposent sur la
variation des proportions relatives de ces deux composés dans la solution d'attaque, et ce
pour un volume constant (5 ml), permettent de définir l'influence de ces différents
mélanges sur le rendement d'extraction des éléments métalliques. Les résultats des tests
obtenus pour les matériaux de référence ne s'appliquent pas forcément sur les différents
groupes d'échantillons biologiques étudiés qui devront être testés ultérieurement. Il
convient également de noter que des tests blancs sont systématiquement effectués,
notamment avec le péroxyde d'hydrogène, afin de vérifier la pureté du produit utilisé.

VI. DOSAGE DES ELEMENTS TRACES PAR Iep-OES.

VI.!. Principes et intérêts

Les techniques couramment utilisées pour la détermination des éléments-traces

sont axées sur la spectrométrie atomique. Ces techniques sont basées sur l'absorption ou
l'émission de radiations électromagnétiques par les atomes ou formes ioniques d'un
élément chimique, et ce, à la suite d'un changement de niveau dans le cortège électronique.
Les changements d'énergie considérés concernent l'excitation des électrons sur les
différentes orbitales d'un élément atomique, d'un état fondamental à un niveau d'énergie
plus élevé (phénomène d'absorption), et la décroissance énergétique (phénomène
d'émission) qui accompagne le retour de cet élément à un niveau d'excitation plus faible.
Chaque élément chimique possède ses propres caractéristiques de niveaux énergétiques et
par là même, ses propres longueurs d'onde d'émission et d'absorption.
L'ICP-OES utilise le principe de la spectrométrie optique d'émission (OES).
L'échantillon est soumis à des températures élevées (jusqu'à 10 OOOOK) pour provoquer la
dissociation des atomes et leur ionisation (excitation par collision et chauffage) (BOSS &
FREDEEN, 1997). A l'état excité, les ions de chaque élément présent dans la solution
retournent à l'état fondamental par émission thermique ou radiative, et ce, dans des
longueurs d'onde spécifiques à l'élément analysé. L'intensité de la radiation est
proportionnelle à la concentration de l'élément considéré.

VI.2. Principes et description de l'appareil

L'ICP-OES est constitué d'un système d'introduction de l'échantillon, d'une source

thermique par décharge (système d'atomisation et d'ionisation), d'un système optique de
transmission des radiations émises, d'un détecteur et d'un système d'enregistrement
(figure 6). L'appareil utilisé dans le cadre de cette étude est de type PERKIN-ELMER
Optima 3300 DV.

30
 Transfer Optlc s
",""';-

Radio i'l
. ·· ........ 1.
" l'
Frequency
Ceneralor
,-------=='!IIi
1 Torch PMT
1 ICP çil L-
5pectrometer

--.- '

I------~'I' '-----, 1
,----L-_ _--'---,
Argon Nebullzer ----.. li",lloavo_........ Spray IMlcroprocessor
,~:~---L --I Chamber and Electronlcs
l '

1 1

rn
To Wasle
1

Sample
compUlerl

1 ~H-
1

Figure 6 : Composants majeurs d'un appareil de meSure lCP-OEs (source Hardware guide of lCP
Emission Spectroscopy - Optima 3000 family PERKlN-ELMER).

Quartz
Tarch~
"'-.....~l--_
"".......
...... - -/"
,-/'

J~, /"

\'
,,---- ~ ..'~:--.~
'\,=:~:--'=-':)"
__. "_... ~. ·Î~'.:.·,
/' ~­
.. >/;
Spray
Chamber-"

Tarch Black ' (~'-~, ;

/
""

Neb,bm/Eod Cep \

Figure 7 : Module de la torche à plasma, constituée du nébuliseur, d'une chambre de vaporisation, et

de la torche en quartz (source: Hardware guide of TCP Emission Spectroscopy - Optima 3000 family
PERKlN-ELMER)

31
 Introduction de Il échantillon : L' échantillon est généralement introduit dans le
plasma (source thermique d'ionisation) sous forme liquide par l'intermédiaire d'un
nébuliseur qui transforme la solution en fines gouttelettes au moyen d'un flux d'argon.

Source thermique ou torche à plasma : Le plasma est défini comme un gaz

partiellement ionisé. Le plasma est alimenté par un flux de gaz neutre, l'argon. Les atomes
d'argon rentrent en collision avec les électrons produits dans la torche, le choc du
mouvement des particules chargées provoque alors l'échauffement du courant de gaz, qui
peut atteindre des températures de l'ordre de 10 OOOoK (figure 7).

Collecte et détection des radiations d'émission : L'ensemble des radiations

émises pénètre ensuite dans un spectromètre. Ce dernier, par un système de jeu optique,
disperse les différentes longueurs d'onde d'émission et sélectionne celles correspondant
aux éléments préférentiellement étudiés. Les longueurs d'onde d'émission isolées, sont
collectées par un CCD (Charge Coupled Detector) qui mesure l'intensité de chacune des
lignes d'émission. Les données collectées et converties, sont enregistrées et stockées par
un système informatique directement connecté à l'ensemble de l'appareillage (figure 8).

Figure 8: Diagramme schématique du système optique de collecte et d'enregistrement de l'ICP-OES

Optima 3300 XL (source : Hardware guide of ICP Emission Spectroscopy - Optima 3000 family
PERKIN-ELMER).

VI.3. Avantages et limites de l'appareil.

L'rep-DES constitue un système d'analyse spectroscopique présentant de

nombreux avantages par rapport au spectromètre classiquement employé.

...

32
 Il permet l'analyse multi-élémentaire instantanée avec une sensibilité de
détections accrue, grâce à la température élevée Uusqu'à 10 OOOOK) et la haute stabilité
du plasma. Les capacités thermiques du plasma permettent l'excitation et l'ionisation de la
majorité des éléments de la table périodique de Mendeleïev, parfois difficilement dissociés
avec les systèmes d'analyse conventionnels. Les interférences chimiques se trouvent
réduites, voire éliminées. Le temps de résidence important (2 ms) de l'échantillon dans la
torche permet également de réduire les effets de matrice et accroît la sensibilité de
l' appare i 1.
Par contre, le système d'analyse multi-élémentaires induit parfois la présence
d'importantes interférences spectrales, qui nécessitent l'application de modèles
mathématiques de déconvolution du signal, appelées MSF (Multicomponent Spectral
Fitting). Ces méthodes permettent d'estimer et corriger les interférences spectrales des
éléments les uns par rapport aux autres.

VIA. Calcul des concentrations.

Les concentrations données par l'lCP-OES sont exprimées en mg/I de l'élément

chimique contenu dans la solution d'extraction. La conversion suivante est nécessaire pour
exprimer la teneur réelle (ou concentration totale) de cet élément dans l'échantillon
lyophilisé et sous forme de poudre après broyage (J.lg/g de poids sec ou ppm) :

Ctotale = ( [ Crcp ..... FD . . . V ] / mechan ) ..... 1000

Avec Ctotale correspond à la concentration totale de l'élément dans la fraction fine (poudre) de
l'échantillon sec (~g/g ou ppm), Crcp la concentration de l'élément dans la solution d'extraction (mg/I
ou ppm), FD le facteur de dilution, V le volume de la solution d'extraction (0,025 , dans notre cas) et
m la masse de l'échantillon.

VII. RESULTATS & VAUDITE DE LA METHODE

VII.1. Réplicabilité de la méthode

Les réplicabilités estimées sur les matériaux de référence DORM-l et MA-A-l sont
présentées dans les tableaux 3, 4a et 4b.

VILl.l. Analyse des blancs de réactifs

Les résultats d'analyse des échantillons de blancs de réactifs (HN0 3 69io et HzO z
30'}'0), analysés comme échantillons classiques, attestent de la pureté des produits
employés dans le mode opératoire. Les données sont répertoriées dans le tableau 2. Les
limites de détection et de quantification déterminées à partir des valeurs d'écart-type
obtenues sur chacun des blancs de réactifs et ce, pour l'ensemble des éléments
métalliques analysés, restent bien en deça des plus faibles valeurs observées pour les
échantillons de référence. Seules les teneurs en cobalt dans les matériaux de référence
sont proches des limites de quantification de l'appareil, d'ou les précisions médiocres
observées pour cet élément.

33
 Il convient de préciser que les limites de détection et quantification sont
généralement estimées à partir des blancs d'analyse. lors de la calibration de l'appareil
avec les solutions standards, et non des blancs de réactifs. Or. le tableau 2 décrit les
valeurs obtenues pour des blancs de réactifs, analysés à nCp-OES en tant qu'échantillons,
et confirme la validité et fiablité des résultats obtenus par rapport aux limites de
détection et quantification calculées. Une telle constatation ne fait que confirmer le bon
fonctionnement de la méthode analytique.

NB : Au niveau de "ICP-OES. chaque métal est analysé pour une gamme plus ou moins
importante de longueurs d'onde. Le traitement ultérieur des données obtenues se fait sur
une ou plusieurs longueurs d'onde sélectionnées en fonction de la sensibilité de chacune des
longueurs d'onde. des variations observées (Relative Standard Deviation) au cours de
l·analyse•...Les résultats cités dans ce document font apparaître une longueur d'onde
spécifique pour chaque métal. mais il convient de garder à l'esprit qu'il peut subsister
d'autres longueurs d'onde pour lesquelles les données récoltées sont sensiblement
similaires. Il ne semble pas nécessaire de décrire l'ensemble des longueurs d'onde
analysées pour chacun des métaux étudiés dans le cadre de cette étude.

Tableau 2 : Récapitulatif des résultats obtenus pour l'analyse des éléments métalliques dans des
triplicats de blancs d'acide nitrique concentré et de péroxyde d'hydrogène. utilisés dans la digestion
des échantillons biologiques. Détermination de leur degré d'impuretés.

HN03 69'Yo 5uprapur HzO z 30'Yo

(mg/l) (mg/I)
(moy. ± écart-type) (moy. ± écart-type)
Co 238.892 0.002 ± 0.0001 0.002 - 0.0001
Cr 267.716 0.003 ± 0.0001 0.003 - 0.0001
Cu 324.752 0.002 ± 0.0001 0.001 - 0.0001
Fe 259.939 0.016 ± 0.0002 0.026 - 0.0001
Mn 260.568 0.001 ± 0.00001 0.001 - 0.00001
Ni 232.003 0.001 ± 0.0001 0.001 - 0.0001
Zn 213.857 0.025 ± 0.0001 0.002 - 0.0001

VILJ.2. Matériel standard DORM-J

Les coefficients de variation (tableau 3), expression de la précision de l'ensemble

des procédures opératoires, apparaissent satisfaisants pour l'ensemble des éléments
métalliques (Cr, Cu. Fe, Mn, Ni & Zn) excepté le cobalt. et attestent de la faiblesse des
erreurs aléatoires imputables aux différentes étapes du protocole. Les précisions
analytiques sont inférieures à 10"0, mais fluctuent en fonction de l'élément considéré, ainsi
que de la procédure de digestion appliquée pour chacun de ces éléments. Les premières
séries de résultats tendent à montrer que les meilleures précisions sont généralement
obtenues pour une solution d'attaque composée d'un mélange de 4ml d'acide nitrique
concentré et Iml de péroxyde d'hydrogène (précisions comprises entre 0.5 et 5.5"0 pour
l'ensemble des éléments métalliques). Il faut rappeler et garder à l'esprit que ces
résultats sont valables pour une masse d'échantillons digérée de l'ordre de 500mg. La
bonne homogénéité de l'échantillon de référence favorise évidemment cette faible
variabilité. Les longueurs d'onde présumées donner les meilleurs résultats, pour chaque
élément. sont citées dans les tableaux 2 et 3. Le choix d'une longueur d'onde se base à la

34
fois sur les résultats obtenus sur les blancs d'analyse et de réactifs, sur la sensibilité de
cette longueur d'onde, et les déviations standards relatifs (triplicats d'un échantillon
donné pour un élément et une longueur d'onde données durant un temps d'intégration
préalablement défini) correspondant lors de l'analyse. Toutefois, les différences
observées entre les différentes longueurs d'onde pour un élément donné restent faibles,
ce qui atteste encore du bon déroulement de la méthode analytique.
Les précisions de la méthode analytique et chimique utilisée dans le cadre de ces
expérimentations, en ce qui concerne l'échantillon DORM-l, sont suffisantes pour
considérer le protocole opératoire comme réplicable et répétable (les expérimentations se
sont déroulées sur plusieurs jours) et ce pour l'ensemble des éléments

VIL1.3. Matériel standard MA-A-l

Les premières expériences réalisées avec le matériel de référence de l'AlEA ont

donné des résultats relativement médiocres, que ce soit en terme de précision de la
méthode analytique ou de justesse (tableau 3a). Des problèmes de conditionnement de
l'échantillon, et plus précisément de réhydratation de ce dernier, se sont avérés être à
l'origine des mauvais résultats rencontrés. Nous avons donc procédé à un séchage à
l'étuve, pendant 24h à 65°C, de réplicats de cet échantillon et un nouveau conditonnement
de ce dernier. Il a pu être déterminé un facteur de correction en fonction des teneurs en
eau estimées au sein du matériel dégradé, et appliquer ce facteur sur les données issues
des premières expériences. Le tableau 4a présente les résultats bruts non corrigés, et le
tableau 4b les données obtenues après application du facteur de correction estimée.
Les précisions analytiques apparaissent relativement satisfaisantes pour l'ensemble
des éléments, avec des coefficients de variation majoritairement inférieurs à 5'Yo; les
autres valeurs étant comprises entre 5 et lO'Yo. Seule une série de triplicats, pour
l'élément cuivre, donne un résultat médiocre avec une précision de l'ordre de l7,5'Yo. Par
analogie avec le matériel standard DORM-l, il semble que les meilleures précisions soient
généralement obtenues pour la solution de digestion composée d'un mélange de 4ml d'acide
nitrique concentré et lml de péroxyde d'hydrogène 30'Yo.
Les précisions obtenues sont en tout cas suffisantes pour considérer le protocole
opératoire comme réplicable, au même titre qu'avec le matériel de référence DORM-1.

VIL 1. 4. Cas particulier du cobalt

Les teneurs certifiées en cobalt estimées dans les échantillons de référence

DORM-l et MA-A-l, ainsi que les gammes de valeurs proposées (intervalle de confiance)
cotoîent les limites de détection analytique de l'ICP-OEs ce qui ne nous permet pas de
valider la méthode pour cet élément. Il apparaît donc nécessaire de doser les échantillons
avec le four graphite, pour lequel les limites de détection permettent des analyses de
l'ordre du ppb, pour le cobalt, mais également pour le cadmium. Dans le cadre de l'analyse
et étude des échantillons collectés dans le lagon sud-ouest de Nouvelle-Calédonie, il est
envisageable que l'analyse de certains éléments métalliques soit effectué en parallèle sur
l'ICP-OES et le four graphite.

35
Tableau 3 : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
certifiées de l'échantillon de référence DORM-l (NRCC - muscles de chien de mer) pour l'analyse
des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et analytique
appliquée (test de réplicabilité et répétabilité). Les valeurs de concentration sont exprimées en ~g/g
de poids sec (ppm); C.V. correspond au coefficient de variation ou précision de la mesure et Val.
Cert. à La valeur certifiée moyenne de l'élément considéré dans l'échantillon. L'intervalle de
confiance correspond aux gammes de valeurs à laquelle la donnée obtenue doit appartenir afin de
valider la méthode. Pour chaque élément métallique analysé, on distingue 3 protocoles différents, une
digestion avec 5ml d'HN0 3 69'Yo, (1), 4ml d'HN0 3 69'Yo et Iml HzO z 30'Yo (2), et 3ml d'HN0 3 69'Yo et
2ml d'HzO z 30'Yo (3).
* Pour l'élément fer, en ce qui concerne les échantillons traités avec 4ml D'HN0 3 69'Yo et lml d'HzO z
30'Yo, les calculs sont basés sur des duplicats, le troisième échantillon étant soumis à des problèmes
de contamination.

DORM-l (NRCC) C.V Vol. Cert. Intervalle Justesse

UJg/g) (%) UJg/g) De confiance (%)
(moy. ± écart-type) û.uI/g)
Co 238.892 (1) 0.050 ± 0.001 2.7 0.049 0.035 - 0.063 1.8
(2) 0.099 ± 0.001 1.4 0.049 0.035 - 0.063 103
(3) 0.050 ± 0.0003 0.9 0.049 0.035 - 0.063 3.0
Cr 267.716 (1) 3.752 ± 0.30 8.1 3.60 3.20 - 4.00 4.2
(2) 4.007 ± 0.02 0.5 3.60 3.20 - 4.00 11.3
(3) 3.821 ± 0.35 9.2 3.60 3.20 - 4.00 6.1
Cu 324.752 (1) 5.011 ± 0.31 6.2 5.22 4.89 - 5.55 4.0
(2) 5.414 ± 0.10 1.9 5.22 4.89 - 5.55 3.7
(3) 4.812 ± 0.07 1.5 5.22 4.89 - 5.55 7.8
Fe 259.939 (1) 59.986 ± 1.14 1.9 63.60 58.70 - 68.90 5.7
(2) 63.677 ± 0.80 * 1.3 63.60 58.70 - 68.90 0.1
(3) 61.935 ± 4.58 7.4 63.60 58.70 - 68.90 2.6
Mn 260.568 (1) 1.029 ± 0.07 7.2 1.32 1.06 - 1.58 22.1
(2) 1.159 ± 0.06 5.5 1.32 1.06 - 1.58 12.2
(3) 1.026 ± 0.04 3.6 1.32 1.06 - 1.58 22.2
Ni 232.003 (1) 1.229 ± 0.12 9.6 1.20 0.90 -1.50 2.4
(2) 1.391 ± 0.02 1.4 1.20 0.90 -1.50 15.9
(3) 1.195 ± 0.06 5.0 1.20 0.90 -1.50 0.5
Zn 213.857 (1) 18.864 ± 0.59 3.14 21.30 20.30 - 22.30 11.4
(2) 20.512 ± 0.14 0.7 21.30 20.30 - 22.30 3.7
(3) 18.588 ± 0.29 1.6 21.30 20.30 - 22.30 12.7

36
Tableau 40 : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
certifiées de l'échantillon de référence MA-A-l brut (AlEA - Homogénat de copépodes) pour
l'analyse des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et
analytique appliquée (test de réplicabilité et répétabilité). Les valeurs de concentration sont
exprimées en Ilg/g de poids sec (ppm); C. V. correspond au coefficient de variation ou précision de la
mesure et Val. Cert. à La valeur certifiée moyenne de l'élément considéré dans l'échantillon.
L'intervalle de confiance correspond aux gammes de valeurs à laquelle la donnée obtenue doit
appartenir afin de valider la méthode. Pour chaque élément métallique analysé, on distingue 3
protocoles différents, une digestion avec 5ml d'HN0 3 69%, (la) et (lb) qui correspondent à
"application du même protocole sur des séries d'analyse effetuées à des dates différentes, 4ml
d'HN0 3 6970 et Iml HzO z 30% (2), et 3ml d'HN0 3 6970 et 2ml d'HzO z 30% (3).
'" En raison de problèmes opératoires, l'expérience (la) comprend un seul échantillon.

MA-A-l (AIEA) C.V Val. Cert. Intervalle Justesse

ijlg/g) ('}'o) (~/g) De confiance (%)
(moy. ± écart-type) (J.l.9/g)
Co 238.892 (la) 0.097 / 0.12 0.11 - 0.13 19.2
(lb) 0.098 ± 0.002 1.9 0.12 0.11 - 0.13 18.1
(2) 0.151 ± 0.001 0.2 0.12 0.11 - 0.13 25.5
(3) 0.097 ± 0.001 5.8 0.12 0.11 - 0.13 18.8
Cr 267.716 (la) 0.825 / 1.10 0.90 - 1.30 25.0
(lb) 0.836 ± 0.09 10.3 1.10 0.90 -1.30 24.0
(2) 0.971 ± 0.03 3.0 1.10 0.90 - 1.30 11.8
(3) 0.844 ± 0.02 2.6 1.10 0.90 - 1.30 23.3
Cu 324.752 (la) 5.971 / 7.63 7.43 - 7.83 21.7
(lb) 6.910 ± 1.21 17.5 7.63 7.43 - 7.83 9.4
(2) 6.543 ± 0.31 4.8 7.63 7.43 - 7.83 14.2
(3) 6.150 ± 0.14 2.3 7.63 7.43 - 7.83 19.4
Fe 259.939 (la) 51.456 / 60 58 - 62 14.2
(lb) 36.192 ± 0.62 1.7 60 58 - 62 39.7
(2) 40.295 ± 0.90 2.2 60 58 - 62 32.8
(3) 40.911 ± 2.58 6.3 60 58 - 62 31.8
Mn 260.568 (la) 1.796 / 2.90 2.70 - 3.10 38.1
(lb) 1.670 ± 0.03 1.9 2.90 2.70 - 3.10 42.4
(2) 1.891 ± 0.03 1.7 2.90 2.70 - 3.10 34.8
(3) 1.799 ± 0.04 2.4 2.90 2.70 - 3.10 38.0
Ni 232.003 (la) 1.117 / 1.90 1.70 - 2.10 41.2
(lb) 1.203 ± 0.01 0.9 1.90 1.70 - 2.10 36.7
(2) 1.289 ± 0.03 2.4 1.90 1.70 - 2.10 32.2
(3) 1.152 ± 0.01 1.2 1.90 1.70 - 2.10 39.4
Zn 213.857 (la) 128.641 / 158 156 - 160 18.6
(lb) 126 ± 1.8 1.4 158 156 - 160 20.4
(2) 135 ± 2.41 1.8 158 156 - 160 14.5
(3) 128 ± 2.93 2.3 158 156 - 160 19.2

37
Tableau 4b : Comparaison entre les valeurs (moy ± écart-type) obtenues (n = 3) et les valeurs
certifiées de J'échantillon de référence MA-A-1 reconditionné (AIEA - Homogénat de copépodes)
pour l'analyse des métaux, et estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire
et analytique appliquée (test de réplicabilité et répétabilité). Les valeurs de concentration sont
exprimées en ~g/ g de poids sec (ppm); C. V. correspond au coefficient de variation ou précision de la
mesure et Val. Cert. à La valeur certifiée moyenne de l'élément considéré dans l'échantillon.
L'intervalle de confiance correspond aux gammes de valeurs à laquelle la donnée obtenue doit
appartenir afin de valider la méthode. Pour chaque élément métallique analysé, on distingue 3
protocoles différents, une digestion avec 5ml d'HN0 3 69':'0, (la) et (lb) qui correspondent à
l'application du même protocole sur des séries d'analyse effetuées à des dates différentes, 4ml
d'HN0 3 69':'0 et 1ml HzO z 30':'0 (2), et 3ml d'HN0 3 69':'0 et 2ml d'HzO z 30':'0 (3).
.. En raison de problèmes opératoires, l'expérience (la) comprend un seul échantillon.

MA-A-l (AlEA) C.V Val. Cert. Intervalle Justesse

Ûlg/g) (%) Ûlg/g) De confiance (%)
(moy. ± écart-type) Wg/q)
Co 238.892 (la) 0.112 / 0.12 0.11 - 0.13 6.7
(lb) 0.113 ± 0.002 1.9 0.12 0.11 - 0.13 5.9
(2) 0.173 ± 0.001 0.2 0.12 0.11 - 0.13 44.3
(3) 0.112 ± 0.001 5.8 0.12 0.11- 0.13 6.6
Cr 267.716 (la) 0.949 / 1.10 0.90 - 1.30 13.8
(lb) 0.961 ± 0.09 10.3 1.10 0.90 - 1.30 12.7
(2) 1.116 ± 0.03 3.0 1.10 0.90 - 1.30 1.4
(3) 0.970 ± 0.02 2.6 1.10 0.90 -1.30 11.8
Cu 324.752 (la) 6.863 / 7.63 7.43 - 7.83 10.1
(lb) 7.95 ± 1.39 17.5 7.63 7.43 -7.83 4.1
(2) 7.52 ± 0.36 4.8 7.63 7.43 - 7.83 1.4
(3) 7.07 ± 0.16 2.3 7.63 7.43 - 7.83 7.4
Fe 259.939 (10) 59.145 / 60 58 - 62 1.4
(lb) 41.601 ± 0.71 1.7 60 58 - 62 30.7
(2) 46.316 ± 1.03 2.2 60 58 - 62 22.8
(3) 47.024 ± 2.97 6.3 60 58 - 62 21.6
Mn 260.568 (la) 2.065 / 2.90 2.70 - 3.10 28.8
(lb) 1.920 ± 0.04 1.9 2.90 2.70 - 3.10 33.8
(2) 2.173 ± 0.04 1.7 2.90 2.70 - 3.10 25.1
(3) 2.068 ± 0.05 2.4 2.90 2.70 - 3.10 28.7
Ni 232.003 (la) 1.283 / 1.90 1.70 - 2.10 32.5
(lb) 1.383 ± 0.01 0.9 1.90 1.70 - 2.10 27.2
(2) 1.481 ± 0.04 2.4 1.90 1.70 - 2.10 22.0
(3) 1.324 ± 0.02 1.2 1.90 1.70 - 2.10 30.3
Zn 213.857 (la) 147.863 / 158 156 - 160 6.4
(lb) 145 ± 2.01 1.4 158 156 - 160 8.5
(2) 155 ± 2.77 1.8 158 156 -160 1.8
(3) 147 ± 3.37 2.3 158 156 - 160 7.2

38
 VII.2. Justesse ou exactitude de la mesure

Les données de justesse estimées sur les matériaux de référence DORM-1 et MA-
A-1 sont présentées dans les tableaux 3, 4a et 4b.

VIL2.1. Matériel standard DORM-J

Les données de justesse ou exactitude de la mesure apparaissent relativement

satisfaisantes à correctes (5 à 1570) pour l'ensemble des éléments analysés à l'exception
du cobalt et du manganèse (> 2070). Toutefois, l'ensemble des valeurs expérimentales
moyennes obtenues sont comprises dans les intervalles de confiance de chaque métal,
prédéfinis par les laboratoires responsables de l'élaboration de ces matériaux standards.
Ces données attestent de la faiblesse des erreurs systématiques imputables aux
différentes procédure du protocole. Seuls le manganèse et le zinc présentent des
résultats légèrement en deça des valeurs préconisées. Des problèmes de rétention
préférentielle de ces deux métaux au niveau du matériel employé, et plus précisément sur
les filtres, peuvent être à l'origine de ce constat. Il est envisagé, pour les
expérimentations ultérieures, d'appliquer la procédure analytique avec ou sans étape de
filtration, étant entendu que le matériel est entièrement digéré après attaque au four
micro-ondes, et donc que l'échantillon est entièrement solubilisé. Cette remarque est
actuellement valable pour le matériel de référence.
Les meilleurs résultats sont obtenus avec les triplicats digérés par la solution
d'attaque composée de 4 ml d'acide nitrique concentré et 1 ml de péroxyde d'hydrogène
3070.

VIL2.2. Matériel standard MA-A-J

Même en appliquant le facteur de correction cité précédemment (§ VII.1.3. Chap.

3), les résultats de justesse observés pour l'échantillon MA-A-1 sont généralement
médiocres par rapport au matériel de référence DORM-1. Les éléments Cr, Cu et Zn
présentent de bons résultats, généralement inférieurs à 1070. Mais les métaux comme le
Fe, Mn et Ni donnent des résultats beaucoup plus faibles que les valeurs certifiées
préconisées. Par analogie avec les données de précision, les teneurs en cobalt apparaissent
trop faibles pour prétendre à une analyse correcte et juste de cet élément. Les meilleurs
résultats sont encore obtenus avec les triplicats digérés par la solution d'attaque
composée de 4 ml d'acide nitrique concentré et 1 ml de péroxyde d'hydrogène 3070. Une
détérioration de ce matériel de référence, due en partie à des problèmes de conservation,
peut expliquer la médiocrité des résultats. Il sera donc nécessaire de valider la procédure
analytique à l'aide d'un matériel de référence annexe, en complément du matériel standard
DORM-1. L'échantillon MA-A-1 permet toutefois de montrer la réplicabilité et répétabilité
de la méthode, mais ne permet pas à lui seul de prouver l'exactitude ou justesse des
mesures effectuées.

VII.3. Choix de la solution d'attaque

Les résultats de rendement d'extraction des métaux, observés sur les matériaux
de référence, apparaissent sensiblement différents en fonction de la solution d'attaque

39
appliquée. Comme cité précédemment (§ VI!.l. & VII.2. Chap. 3), les données de précision
et justesse répertoriées avec l'application du mélange acide nitrique concentré (69'Yo) -
péroxyde d' hydrogène (30'Yo), selon la proportion 4/1, sont bien meilleures que celles
observées avec les deux autres cocktails.
Il semble donc, en premier lieu, que l'acide nitrique concentré, utilisé seul ne soit
pas suffisamment puissant pour digérer intégralement l'échantillon. L'addition de
péroxyde d' hydrogène en quantité réduite permettrait une meilleure attaque de la matrice
biologique. Cette constatation est en conformité avec les nombreuses études réalisées
depuis plusieurs décennies (§ II.2. Chap. 3). Par contre, il est constaté une baisse du
rendement d'extraction des métaux lorsque la proportion de péroxyde additionnée
augmente au détriment de l'acide nitrique, soit 3ml d'HN0 3 69'Yo pour 2ml d'HzO z 30'Yo. Un
tel résultat pourrait nous conforter dans l'idée que la quantité d'acide versée, par rapport
au mélange précédent, n'est pas suffisante pour permettre une digestion complète de
l'échantillon, et que le surplus de péroxyde d'hydrogène ne permet pas de pallier ce
manque.

Or, l'ensemble des échantillons, sans exception aucune, apparaît totalement

solubilisé, en apparence, après digestion en condition hyperbare, et ce, quelque soit le
mélange d'acides et/ou composé oxydant employés. Les différences observées dans les
mesures pourraient donc être attribuées à la présence potentielle de très fines particules,
peut-être du matériel colloïdal non apparent ou difficilement visible à l'œil nu, après
digestion et une déstructuration incomplète du matériel organique. Il convient de noter que
s'il subsistait une présence de matériel particulaire très fin après digestion, la quantité de
matière non digérée doit être relativement faible. Mais, en fonction de la sélectivité de la
solution d'attaque utilisée, cette quantité peut s'avérer suffisante pour engendrer des
différences notables dans les précisions et justesses, ainsi que des résultats médiocres
pour des mélanges non spécifiques. Cette remarque reste totalement hypothétique et il
serait nécessaire de procéder à des travaux annexes afin d'expliciter les différences
observées et le bien-fondé de cette hypothèse. Des problèmes de rétention des éléments
métalliques, après digestion de la matrice et donc relarguage, pourraient également
expliquer la faiblesse de certaines valeurs de justesse. Le problème reste alors le suivant:
pour quelles raisons des phénomènes de rétention ponctuelle au niveau du matériel utilisé
n'affecterait pas de manière homogène les éléments métalliques contenus dans les
différentes solutions d'attaque? Certains travaux montrent effectivement une rétention
préférentielle de certains métaux, comme le manganèse et le zinc, et par-là même une
perte de rendement pour ces derniers. Mais dans notre cas, les phénomènes de rétention
toucheraient l'ensemble des métaux étudiés, cette hypothèse paraissant difficilement
envisageable.

Force est donc de constater que le mélange acide nitrique concentré (69'Yo) -
péroxyde d'hydrogène (30'Yo) selon la proportion 4/1 semble le plus approprié pour la
digestion des matrices biologiques étudiées, soit les matériaux de référence DORM-l et
MA-A-l. Il faut également rappeler que cette remarque est valable pour des conditions
opératoires particulières, correspondant à la digestion de 500mg d'échantillons. Le
cocktail précédemment cité sera donc employé comme solution de digestion pour la suite
des expérimentations ainsi que les analyses de routine.

40
 VIlA. Analyses complémentaires

Il semble nécessaire de procéder à des analyses complémentaires avec d'autres

matériaux de référence d'origine biologique, tel que DOLT-1 (NRCC - foie de chien de
mer), en complément de DORM-1, et ce, afin d'assurer la validation et la rigueur de la
méthode utilisée

VIL4.1. RéplicabHité et répétabl1ité

Tableau 5 :Comparaison entre les valeurs (moy. ± écart-type) obtenues (n=3) et les valeurs certifiées
de l'échantillon de référence DOLT-1 (NRCC - foie de chien de mer) pour l'analyse des métaux, et
estimation de la précision et de la justesse de la procédure opératoire et analytique (test de
réplicabilité et répétabilité). Les valeurs de concentration sont exprimées en Ilg/g de poids sec
(ppm); C. V. correspond au coefficient de variation ou précision de la mesure et Val. Cert. à La valeur
certifiée moyenne de l'élément considéré dans l'échantillon. L' intervalle de confiance correspond aux
gammes de valeurs à laquelle la donnée obtenue doit appartenir afin de valider la méthode
(1) et (2) correspondent à l'application du même protocole sur des séries de triplicats effectuées à
des dates différentes. La solution de digestion utilisée, e conformité avec les résultats précédents,
est le mélange composé de 4ml d'HN03 69/0 et 1ml d'HzO z 30/0.

DOLT-1 (NRCC) CV Val. Cert. Intervalle de Justesse

(M/g) (%) (M/g) confiance (%)
(moy. ± écart-type) UIg/g)
Co 238.892 (1) 0.37 ± .000006 0 0.157 0.120 - 0.194 136
(2) 0.37 ± 0.031 8.2 0.157 136
Cr 267.716 (1) 0.92 ± 0.012 1.3 0.4 0.33 - 0.47 130
(2) 0.98 ± 0.064 6.6 0.4 145
Cu 324.752 (1) 19.6 ± 0.31 1.6 20.8 19.6 - 22.0 5.6
(2) 19.8 ± 0.25 1.3 20.8 4.9
Fe 238.204 (1) 675 ± 9 2.9 712 664 - 760 5.2
(2) 666 ± 8.5 1.3 712 6.4
Mn 259.372 (1) 8.73 ± 0.12 1.3 8.72 8.19 - 9.25 0.1
(2) 8.70 ± 0.17 1.9 8.72 0.2
Ni 232.003 (1) 0.59 ± 0.02 3.4 0.267 0.20 - 0.32 121
(2) 0.60 ± 0.02 3.8 0.267 125
Zn 213.857 (1) 86 ± 1.2 1.3 92.5 90.2 - 94.8 7
(2) 88 ± 91 1.1 92.5 3.9

Les coefficients de variation (tableau 5) apparaissent relativement satisfaisants

pour "ensemble des métaux analysés avec des valeurs inférieures à 5i'0. Ils attestent de la
faiblesse des erreurs aléatoires occurentes dans les différentes étapes du protocole. Ces
résultats sont en adéquation avec les valeurs de précision observées sur les matériaux de
référence DORM-1 et MA-A-1. En concordance avec les conclusions déduites des résultats
obtenus sur les échantillons standard cités précédemment, le protocole opératoire s'avère
réplicable et répétable, et ce, pour l'ensemble des éléments métalliques étudiés.

VIL 4. 2. Exactitude de la mesure

Les résultats de justesse observées pour l'échantillon de référence DOLT-1
apparaissent relativement médiocres dans leur ensemble par rapport au matériel standard

41
DORM-l. Les éléments cuivre, fer, manganèse et zinc présentent des résultats
relativement satisfaisants, largement inférieurs à 10':'0. Le manganèse, en particulier, donne
des données d'exactitudes excellentes sur deux séries de mesures, avec respectivement
0,1 et 0,2':'0. Les valeurs expérimentales moyennes obtenues pour le cuivre et le fer sont
comprises dans les intervalles de confiance, prédéfinis pour ces métaux par le NRCC. Le
zinc, avec des résultats de justesse estimés à 7 et 3,9':'0 sur les deux séries analysées,
montrent des valeurs légèrement inférieures au seuil minimal de l'intervalle de confiance
préconisé pour cet élément. Toutefois, le zinc, au même titre que le cuivre, le fer et le
manganèse attestent de l'exactitude de la mesure et de la faiblesse des erreurs
systématiques imputables aux différentes procédures du protocole. Par contre, les
éléments cobalt, chrome et nickel donnent des résultats trop médiocres pour prétendre à
une analyse juste et correcte de ces éléments. Les valeurs certifiées par le NRCC pour ces
trois éléments sont extrêmement faibles et correspondent, en terme analytique sur l'ICP-
OES (mg/I), à la détection d'éléments dans des teneurs de l'ordre du ppb. Ces valeurs sont
trop proches des limites de détection et quantification de l'appareil d'ou les teneurs
rencontrées et la médiocrité des résultats.
En définitif, l'échantillon DOLT-l permet de montrer la réplicabilité et répétabilité
de la méthode opératoire et analytique, mais ne permet pas à lui seul de prouver
l'exactitude des mesures effectuées.

VIII. CONCLUSION

L'ensemble des expérimentations réalisées sur les matériaux de référence DORM-

1, DOLT-l et MA-A-l montre la réplicabilité et la répétabilité de la méthode analytique,
ainsi que l'exactitude des mesures entreprises. Le protocole utilisé apparaît donc viable et
fiable.
L'échantillon de référence MA-A-l nous a permis de montrer la précision accrue de
la méthode, mais nous démontre surtout la nécessité de vérifier la fiabilité du matériel
employé, que ce soit matériel de référence ou autre.
De même, il conviendra au cours des expérimentations futures de valider également
le protocole avec l'analyse des mêmes échantillons au four graphite; les résultats
préliminaires montrant la nécessité d'employer cette méthode analytique pour certains
éléments métalliques dont les teneurs sont trop faibles pour être correctement, en terme
de fiabilité, détectées par l'ICP-OES.
Enfin, ces expérimentations nous ont permis de constater que sur l'ensemble des
cocktails d'acide ou produits oxydants employés pour la digestion des échantillon, le
meilleur rendement d'extraction est obtenu avec un mélange acide nitrique concentré
(69':'0) - péroxyde d'hydrogène (30':'0) selon une proportion 4/1; les deux autres mélanges
utilisés donnant des résultats plus faibles. Le cocktail précédemment cité sera donc
employé comme solution de digestion pour la suite des expérimentations ainsi que les
analyses de routine.

42
 CHAPITRE 4

METHODOLOGIE APPLIQUEE SUR LES

ECHANTILLONS BIOLOGIQUES

43
A la suite de la validation du protocole opératoire, de nouvelles expériences ont été menées
pour établir un ou plusieurs protocoles adaptés aux différentes matrices biologiques
étudiées dans le cadre de la sélection des espèces bioindicatrices.

I. ECHANTILLONS BIOLOGIQUES ETUDIEs.

I.1. Sélection des organismes.

Les organismes marins benthiques choisis pour les analyses en vue de l'étude des
processus de bioaccumulation sont sélectionnés à partir d'une base de données
d'inventaires de la biodiversité marine littorale de Nouvelle-Calédonie (RICHER de
fORGES & HOffSCHIR, 2000). Cette étude a été complétée par une phase de prospection
et d'observation in situ. Les organismes, susceptibles de présenter un intérêt potentiel en
tant que bioindicateur de contamination, doivent répondre en principe aux critères suivants

Les espèces sélectionnées doivent être benthiques et sédentaires, cosmopolites et

présentes en abondance, de tailles suffisantes pour pouvoir être analysées
individuellement, enclin à être récoltées simplement et appartenant à différents
embranchements animaux et végétaux de façon à prendre en compte la diversité des
modes de vie et de comportements alimentaires (BREAU, 1999). Les organismes choisis
regroupent des modes alimentaires divers, permettant de prendre en compte les
différentes sources d'apports possibles en ce qui concerne les éléments-traces
biodisponibles. Ils comportent à la fois les invertébrés benthiques filtreurs, les
invertébrés benthiques dépositivores ou encore les espèces dont l'alimentation est basée
sur le dissous (macro-algues ou phanérogames marines). Ces régimes alimentaires variés
devraient permettre de déterminer les "voies préférentielles d'entrée" des métaux dans
les organismes marins benthiques au niveau du lagon sud-ouest.
L'énumération des critères de sélection ci-dessus ont permis de sélectionner en
définitif 13 espèces et 2 genres:

- Algues : Halimeda macroloba, Halimeda incrassata, Caulerpa taxifolia, Caulerpa

sertularioides, Lobophora variegata

- Bivalves: Isognomon sp, Hyotissa hyotis, Gafrarium tumidum

- Echinodermes: Holothuria (Halodeima) edulis, Diadema setosum

- Alcyonaires : Sinularia leptoclados, Sarcophyton sp

-Eponge: Spheciospongia vagabunda

44
1.2. Site d'étude et prélèvements

L2.1. Site d'étude

Les lieux de prélèvements des espèces citées précédemment, correspondent à des

zones soumises à des apports métalliques d'origines variées.
On distingue d'abord les baies de Dumbéa et Boulari, respectivement au nord-ouest
et sud-est de la presqu'île de Nouméa, et pour lesquelles les influences sont principalement
terrigènes. Les baies de Ste-Marie et de la Grande rade en contact direct avec la capitale
calédonienne, sont respectivement sous forte influence urbaine et industrielle. Enfin, il
était nécessaire d'étudier les espèces sélectionnées dans un milieu exempt (ou
relativement limité) d'apports terrigènes et/ou anthropiques. Ce site, dit de référence,
correspond à la baie Maa, situé au nord-ouest de la baie de Dumbéa. Il faut noter que, bien
que les espèces sélectionnées ne soient pas toutes présentes dans cette baie, les résultats
obtenus sur les espèces présentes nous permettent de déterminer une "ligne de base" pour
des écosystèmes soumis à de faibles influences terrigènes et/ou anthropiques (figure 9).

Passe de
Dumbéa

Océan Pacifique

Figure 9: Carte de localisation des sites d'étude et de récolte dans le lagon sud-ouest de Nouvelle-
Calédonie.

45
 L2.2. Méthodes et période de récolte

En fonction de la position des espèces par rapport à la marée, les prélèvements

sont effectués soit à pied durant la marée basse (cas des grisettes ou Gafrarium
tumidum), soit en scaphandre. Toutes les précautions doivent être réunies pour éviter un
stress de l'organisme récolté.
Chaque site d'étude comprend plusieurs stations (généralement 3 ou 4) afin
d'évaluer la variabilité intra-site. En effet, chaque milieu peut être soumis à des conditions
environnementales variables, notamment en termes d'exposition aux apports: distance de
l'émissaire, localisation en fonction de la courantologie locale, nature des substrats et
caractéristiques des sédiments de surface (BREAU, 1999). Il se pose également le
problème du nombre d'individus à collecter par station, et par là-même par site, pour
chaque espèce étudiée. Il n'y a pas de "chiffres systématiques", mais il faut, dans la
mesure du possible, récolter une quantité suffisante d'individus pour permettre une étude
de la variabilité inter-individuell~ des concentrations de métaux chez une même espèce, en
un point donné (OXLEY, 1997).
Afin de s'affranchir également de problèmes de variabilités saisonnières, les
organismes ont été récoltés sur une période relativement courte, entre avril et juin.

L2.3. Prélèvements

Les espèces d'algues, d'échindormes, d'alcyonaires et de scléractiniaires sont

prélevées en plongée sous-marine et transférées, une fois à la surface, dans des sachets
plastiques fermés hermétiquement jusqu'au retour au laboratoire. Les bivalves (récolte à
pied, à marée basse) et les éponges (prélèvement en plongée sous-marine), sont récoltés
dans de grands bacs plastiques remplis avec de l'eau du site prélevée en surface, et
ramenés comme tels au laboratoire. Ces dernières espèces subissent effectivement une
procédure de traitement supplémentaire (étape de dépuration) à celles des autres espèces
récoltées, qui nécessite de garder vivants ces organismes.

T.3. Traitement préliminaire des échantillons.

Dès le retour au laboratoire, excepté les bivalves et les éponges, les espèces
récoltées sont directement sacrifiées par congélation, à -25°C. Elles restent congelées
jusqu'à application des procédures suivantes: dissection (sélection d'un organe particulier
ou prise en compte de l'organisme dans son ensemble), mesures biométriques, lyophilisation
et broyage. Toutes les espèces sont rincées à l'eau de mer du large filtrée (0,45 !lm) afin
de les débarrasser des particules ou épiphytes, avant d'être congelés.
Les bivalves et éponges sont soumis à une procédure de dépuration dont l'objectif
est la purge, au sein des organismes filtreurs, des éléments non digérés ainsi que des
sédiments retenus qui peuvent influer sur les analyses entreprises (BORDIN et al., 1992;
USERO etaI., 1996).

L3.1. Etape de dépuration

Les échantillons de bivalves et éponges sont individuellement et préalablement

nettoyés à ('aide de brosses (§ I.3. Chap.3), puis rincés avec l'eau de mer filtrée
(élimination du matériel particulaire), prélevée au large (absence de contamination sous

46
forme dissous). Dépourvus de leur épi faune originelle et du matériel particulaire associé,
les organismes sont déposés sur une grille en plastique rigide perforé (chute des particules
et fécès) dans un bac rempli d'eau de mer (site de prélèvement) filtrée, d'une contenance
de l'ordre de 200 - 250 litres (figure 10).

Figure 10: Bassin de dépuration utilisé dans le cadre de cette étude.

Un système de bullage permet l'aération permanente de l'eau durant le processus de

dépuration dont la durée est fixée à 48 heures. Au cours de cette procédure, les bivalves
et éponges rejettent d'importantes quantités de matériel sédimentaire, de matière
organique non digérée et de fécès qu'il faut aspirer fréquemment afin de ne pas saturer le
bassin. Un système de filtration continu de l'eau permet l'élimination d'une partie du
matériel rejeté et l'obtention par là-même d'un bassin aux eaux limpides, exemptes de
matériel en suspension, et dans lequel le processus de dépuration trouve sa pleine
efficacité. Les échantillons "lavés" sont ensuite stockés dans des sachets plastiques
hermétiques et sacrifiés par congélation à -25°C.

47
 I.3.2. Etape de dissection, lyophilisation et broyage

La procédure de dissection (figure 11) n'est pas appliquée systématiquement à

toutes les espèces étudiées. Le terme dissection est d'ailleurs relativement large, il s'agit
parfois simplement de séparer les corps mous des parties dures de l'organisme (ex: les
tests d'oursins et l'ensemble des viscères). Les dissections ou "séparations" opérées sur
les différents organismes prélevés sont récapitulées dans le tableau 6.

Figure 11 : table de dissection et réalisation des mesures biométriques sur les différentes espèces
biologiques étudiées.

Les multiples mesures biométriques (poids sec, longueur, épaisseur .. ) effectuées

sur certains organismes sont destinées à établir une corrélation entre les concentrations
en métaux observées au sein de l'individu considéré et ses caractéristiques physiologiques,
ou biologiques. Des tests statistiques seront effectivement réalisés. Le poids frais (après
retour à la température ambiante et égouttage) des différents organismes, organes, ou
tissus sélectionnés pour l'analyse est également mesuré.
Les différents tissus, organes ou organismes dans leur intégralité sont ensuite
lyophilisés, pesés (estimation des teneurs en eaux avec le poids frais) puis broyés
(homogénéisation) au moyen d'un broyeur mécanique (modèle RM 100 - RETSCH), avant
d'être stockés dans des sachets vynil (whirl-pak) hermétiques, à l'abri de la poussière
(annexe 3).

48
Tableau 6 : Récapitulatif des organismes, organes ou tissus étudiés et description des mesures
biométriques effectuées.

Groupe Organismes, organes Parties corporelles Mesures biométriques

Espèces et/ou tissus étudiés non étudiées
Algues & Phanérogames
Ha/imeda sp. Articles intermédiaires Articles basales Nombre total de frondes,
calcifiés et apicaux (non Nombre d'articles par fronde,
calcifiés) Nombre d'articles en
formation,
Hauteur maximale du
spécimen
Cau/erpa sp. Organisme entier Rhizoides Nombre totale de frondes
primaires,
Nombre de frondes
secondaires,
Longueur des frondes
primaires,
Longueur totale du stolon,
Nombre de ramifications du
stolon
Lophophora sp. Organisme entier

Bivalves
Gafrarium tumidum Ensemble des parties Valves Epaisseur, longueur et poids
molles sec des valves
Hyotissa hyotis Ensemble des parties Valves Epaisseur, longueur et poids
molles sec des valves
Isognomon sp. Ensemble des parties Valves Epaisseur, longueur et poids
molles sec des valves

Echinodermes
H%thuria edu/is Ensemble des viscères Tégument et tube Longueur totale en extension
diQestif
Diadema setosum Ensemble des parties Test calcaire
molles

Alcyonoires
Sinu/aria /eptoc/ados Organisme entier
Sarcophyton sp. Organisme entier

Eponges
Spheciospongia Organisme entier
vagabunda

49
II. EXPERIMENTATIONS

Les résultats satisfaisants obtenus sur les matériaux de référence, et la validation

des méthodes opératoires et analytiques qui en découlent, conduit à conserver « l'ossature
principale» des différentes procédures opératoires pour l'analyse des matrices biologiques
étudiées. Les expérimentations complémentaires, décrites dans ce chapitre, sont destinées
à préciser et adapter le protocole opératoire admis, pour chacun des groupes d'espèces
(bivalves, algues calcaires..). Ces expérimentations concernent donc la modification et/ou la
définition précise de certains paramètres, en fonction des espèces soumises à l'analyse et
en particulier:
• Masse d'échantillon,
• Solution de digestion et,
• Temps optimum de digestion au four micro-ondes.

II.l. Masse d'échantillon

La masse d'échantillon attaquée (500 mg) lors de la mise au point du protocole, ne

peut être conservée et appliquée pour l'ensemble des échantillons biologiques étudiés. La
raison est purement technique, à savoir que, en fonction des individus analysés pour une
espèce considérée, il n'est pas possible de fournir 500 mg de poudre d'échantillon à chaque
attaque. Par exemple, les espèces de bivalves donnent des masses sèches, après
lyophilisation, comprises entre 100 et 350 mg en moyenne. La masse digérée est donc
définie en fonction des espèces considérées, et de la réponse analytique de l'rCP-OES ou
du four graphite. Il faut assurément, que la diminution de la masse d'échantillons digérée,
soit en concordance avec la capacité analytique de l'appareil de mesure, et donc que l'on
reste dans des gammes de concentrations analysables. Dans certains cas, les résultats
obtenus nous incitent alors, à regrouper ou non les individus (formation de « pools »). pour
la suite des analyses.

II.2. Cocktail d'acides

Les expériences précédemment effectuées sur l'utilisation et le choix de la solution

de digestion, ont démontré l'efficacité du mélange composé de 4 ml d'acide nitrique
concentré (HN03 69i'o) et 1 ml de péroxyde d'hydrogène (HzOz 30i'o). Ce mélange est donc
conservé pour les nouvelles expérimentations. Toutefois, quelques problèmes rencontrés au
niveau de la solubilisation complète de l'échantillon nous ont occasionnellement conduit à
tester un nouveau mélange.

II.3. Temps de digestion au four micro-ondes

Outre la détermination d'une masse minimale d'échantillons à analyser, les nouvelles

expérimentations servent à déterminer un temps optimum de digestion au four micro-
ondes. 4 programmes différents ont été appliqués aux différentes matrices biologiques.
Ils se définissent comme suit:

Programme USER 013M 100 W ~ 1000 W en 5 mn ; puis 1000 W pendant 5 mn

Noté Prog.l o W pendant 10 mn (refroidissement des bombes)

50
Programme USER 014M 100 W ~ 1000 W en 5 mn ; puis 1000 W pendant 10 mn
Noté Prog.2 o W pendant 10 mn (refroidissement des bombes)
Programme USER 015M 100 W ~ 1000 W en 5 mn ; puis 1000 W pendant 15 mn
Noté Prog.3 o W Pendant 10 mn (refroidissement des bombes)
Programme USER 016M 100 W ~ 1000 W en 5 mn ; puis 1000 W pendant 20 mn
Noté Prog.4 o W Pendant 10 mn (refroidissement des bombes)
IIA. Expériences réalisées

IIA.1. Bivalves

Les nouvelles expérimentations appliquées sur les espèces de bivalves ont été
réalisées sur un ensemble d'échantillons regroupant les tissus mous d'individus de l'espèce
Gafrarium tumidum prélevé dans la baie de Dumbéa (station D65). Les individus de cette
station ont été rassemblés et homogénéisés en un échantillon unique (<< pool» GT D65),
afin d'obtenir un échantillon standard interne permettant la réalisation des
expérimentations sur une matrice identique de chair molle, par souci de cohérence. La
figure 12 récapitule les différents protocoles opératoires appliquées.
Les tissus mous des autres espèces de bivalves Isognomon sp. et Hyotissa hyotis
ont une texture et une composition sensiblement similaires à ceux de Gafrarium tumidum.
Le protocole finalement retenu à la suite du traitement des résultats obtenus au cours des
nouvelles expérimentations, est donc applicable à l'ensemble des échantillons de chairs
molles de bivalves. Les résultats obtenus ont conduit à abandonner le programme 4 dans les
expérimentations suivantes.

II. 4.2. Echinodermes (cas des holothuries)

Par analogie avec les individus de «grisettes», les tissus mous (viscères et
muscles), d'une part, et les téguments d'autre part, d'individus de l'espèce Holothuria
edulis prélevée dans la station N27 (sortie de la baie de Ste-Marie) sont rassemblés en
deux groupes d'échantillons distincts (HEN27 Vi sc. ; HEN27 Teg.). La figure 13 présente la
procédure appliquée. Il faut noter, que les masses individuelles d'échantillons de téguments
ne représentent pas un critère limitatif pour la suite des analyses, ce qui n'est pas le cas
des échantillons de tissus mous (§ II.1. ChapA).

IIA.2. Phanérogames

Les masses des échantillons de Caulerpa taxifolia, quelques soient les stations
étudiées, constituent un critère limitatif au niveau analytique. La masse digérée
d'échantillons de la station D43 (baie de Dumbéa), regroupés en un échantillon standard
interne (CT D43), est donc fixée à 200 mg. De plus, pour les expérimentations dont le
protocole est exposé sur la figure 14, seuls des duplicats ont pu être effectués.
L'espèce de phanérogame Caulerpa sertularioides présentant une texture et
composition similaires à la Caulerpa taxifolia, le protocole finalement retenu est donc
applicable à l'ensemble des échantillons de phanérogames.

51
 Expérience 10: 200 mg d'échantillon sec
L.. (CT D43) dans bombes téflon
application Prog.1 ...
(1000 W pendant 5mn) ......
......
~
/
Expérience 11 : Ajout 4ml HN03 69'Yo
application Prog.2 L.. et lml HzOz 30'Yo
1""1
(1000 W pendant lOmn) .....
.....
/'
Expérience 12 :
+
Agitation manuelle et
....... digestion au four
application Prog.3
(1000 W pendant l5mn) micro-ondes
...... "- ....4

/'
Experience 13 * : /'
+
application Prog. classique Séparation phase Liq/sol
(1000 W pendant 25mn) par filtration (0,45 microns)

* Cocktail utilisé:
....... ~

3ml HN03 69'Yo

+ 1 ml H202 30'Yo
+ lml HCI 6 'Yo ~ Elimination du résidu final
....
potentiel ....
(matériel réfractaire) ,

"- ......

, Stockage de la solutIon
, ..
contenant les éléments
Transfert dans flacon Récupération du surnageant
traces extraits dans le
nalgène 30 ml dans une fiole jaugée 25 ml
réfrigérateur 2-4°C jusqu'à
analyse

Figure 12: Récapitulatif des expérimentations effectuées sur "échantillon de standard interne GT
D65 (Gafrarium Tumidum).

52
 300 mg d'échantillon sec 300 mg d'échantillon sec
(HE N27 Visc) (HE N27 Teg)
dans bombes téflon dans bombes téflon

Expérience 5 : Expérience 8 :
application Prog.1
L..
1"'" r+ application Prog.1
(1000 W pendant5mn) (1000 W pendant5mn)
...oll ...oll
+
Expérience 6 : Agitation manuelle et Expérience 9 :
application Prog.2
.... digestion au four
......
1"'" application Prog.2
(1000 W pendant lOmn) micro-ondes (1000 W pendant lOmn)
-ooOlIIIII ...oll

/
Expérience 7 :
application Prog.3
(1000 W pendant 15mn)
...oll

/
Séparation phase Liq/sol Ellimination du résidu final
par filtration ~ potentiel
(0,45 microns) (matériel réfractaire)
...oll

/' Stockage de la solution -.. . .,

contenant les éléments
( Transfert dans flacon ~é~uPération du surnageont
traces extraits dans le
réfrigérateur 2-4°C jusqu' à
nalgène 30 ml l, dans une fiole jaugée 25 ml
analyse

Figure 13: Récapitulatif des expérimentations effectuées sur les échantillons standards internes
HE N27 Vise. & HE N27 Teg. (Holothuria edulis).

53
 /
/
Expérience 10: 200 mg d'échantillon sec
application Prog.1
....... (CT D43) dans bombes téflon
(1000 W pendant 5mn) .......
......
/
+
Expérience11 : Ajout 4ml HN03 69'Yo
application Prog.2 ....... et 1ml H202 30'Yo
(1000 W pendant 10mn) .....Il
......
-,r
Expérience 12 :
application Prog.3
....... ( Agitation manuelle et
digestion au four
(1000 W pendant 15mn) micro-ondes
~ ......

Experience 13 '" :
+
application Prog. classique Séparation phase Liq/sol
(1000 W pendant 25mn) par filtration (0,45 microns)
L.. ....oIIl
1""
* Cocktail utilise:
3ml HN03 69'Yo
+ 1 ml H202 30'Yo
+ 1ml HCI 6'Yo ~ Elimination du résidu final
L..
potentiel ""
(matériel réfractaire)
....oIIl

,.
Stockage de la solution "
contenant les éléments
Transfert dans flacon Récupération du surnageant
traces extraits dans le
nalgène 30 ml dans une fiole jaugée 25 ml
réfrigérateur 2-4°C jusqu'à
analyse

Figure 14: Récapitulatif des expérimentations effectués sur l'échantillons standard interne CT D43
(Caulerpa taxifo/ia).

III. IDENTIFICATION ET ORIGINE DES METAUX LOURDS ETUDIES

Dans le cadre de cette étude, neuf métaux lourds sont analysés dans les
échantillons d'origine biologique: l'aluminium (AI), le Calcium (Ca), le Cobalt (Co), le Cuivre
(Cu), le Chrome (Cr), le Fer (Fe), le Manganèse (Mn), le Nickel (Ni), et le Zinc (Zn). Ces
éléments regroupe diverses origines (marine, terrigène ou anthropique), parfois mixtes. Il
est nécessaire de rappeler succinctement quelles sont les différentes de chacun de ces
métaux, dans le lagon sud-ouest de Nouméa. Chacun de ces éléments peut avoir des

54
origines diverses en fonction des zones considérées. Toutefois, il peut s'avérer utile de
rappeler les grandes tendances de distribution de ces éléments dans le lagon sud-ouest de
Nouméa. Toutefois, l'identification des sources principales d'apports en métaux ne permet
pas pour autant d'identifier les voies préférentielles de contamination de la faune et de la
flore marines locales, et de pollution des sites d'étude. La forte teneur d'un élément
donné dans le milieu, en considérant ses concentrations sous forme particulaire et/ou
dissoute, n'est pas obligatoirement corrélée à une forte bioaccumulation ou
bioconcentration, tout dépend de la biodisponibilité de l'élément.

II!.l. Métaux d' origine terrigène

En considérant la nature des sols des bassins versants dans la zone d'étude, le fer,
le nickel, le cobalt, le chrome et le vanadium apparaissent comme un groupe d'éléments
d'origine principalement terrigène. L'altération des massifs péridotitiques et des couches
latéritiques libère des quantités importantes de ces éléments (DEBENAY, 1985) qui sont
transportés sous forme dissoutes et / ou particulaires avant d'être déversés dans le
domaine lagonaire. De nombreuses études estiment que les composés terrigènes sont
principalement transportés sous formes de particules fines et ultrafines, correspondant à
des gels silico-ferrugineux, auxquels sont associés, par adsorption, des oxydes de nickel «
1io), de chrome (lio), de manganèse (> O,3io), vanadium (> O,1io) (TRESCASES, 1975; Lj
NALOVIC et al, 1972). Des travaux récents, par le biais de l'étude des MES et des
sédiments, montrent également ces sources minéralogiques d'apports (MAGAND et al,
1998; MAGAND, 1999). Il convient de noter que ces apports terrigène peuvent être
naturels et "artificiels". Les phénomènes de lessivage et lixivation peuvent effectivement
être accélérés ou favorisés par les activités humaines et en particulier minières de la
région (conséquence indirecte), principalement avec les extractions des minerais d'oxyde
de nickel (latérite ou saprolite), dans les mines à ciel ouvert du territoire (SLN-B.
PELLETIER, 1990; ILTIS J., 1980 & 1986). Certains de ces métaux (fer, nickel et
vanadium), considérés comme des éléments de type nutritif, deviennent alors disponibles
pour la faune et flore locales et peuvent être remobilisés par des mécanismes biologiques
actifs (DEBENAY, 1985; CHESTER, 1990).

II!.2. Métaux d'origine marine

Le cuivre et le zinc apparaissent comme deux éléments de transition d'origine

principalement marine profonde (volcanisme sous-marin). Toutefois, il est dangereux de
"classer" ces deux métaux dans le seul compartiment source marine. Ils sont
effectivement libérés à l'état de traces lors de l'altération des massifs ultrabasiques
(TRESCASES J.J., 1975; DEBENAY, 1985). Le zinc, présent dans les peintures et les
revêtements métalliques, peut également, à une échelle locale, être déversé en quantité
importante, comme dans la baie Ste-Marie (BREAU, 1999) ou la Grande rade. Il revêt dans
ce cas une origine mixte, à la fois marine et anthropique. En terme de mixité des sources,
le manganèse présente également des origines diverses. En effet, le manganèse, présent
dans le milieu sous forme de composés oxydes, accompagne les apports terrigènes
(matériel silico-ferrugineux et alumineux..) (LAUNAY, 1970 & 1972; DUGAS, 1974;
DEBENAY, 1985) déversés dans le lagon, mais peut également être formé in situ avec des
origines marines (volcanisme sous-marin). L'absence actuelle de données précises sur les
partitions respectives entre les oxy-hydroxydes d'origine marine et terrigène empêche

55
toute généralisation. Enfin, le calcium apparaît, quant à lui, comme un élément d'origine
strictement marine, sans ambiguités aucunes.

111.3. Métaux d'origine anthropique

Dans le cadre de cette étude, et compte tenu des sites considérés, le plomb et le
cadmium apparaissent comme deux éléments traces d'origine strictement anthropique. Les
activités industrielles, qui pourraient être responsables du rejet de ces deux métaux, sont
quasi-inexistantes à Nouméa et la zone industrielle environnante, et à fortiori, sur
l'ensemble du territoire. Par contre, plomb et cadmium rentrent dans la composition de
nombreux produits manufacturés destinés à la consommation urbaine, et importés sur le
territoire, notamment sous la forme de produits semi-finis (tuyaux, etc ...), câbles
électriques, alliage ou encore toute autre forme de composés métallurgiques, mais les
quantités présentes à Nouméa restent relativement modeste et sont à mettre en rapport
avec l'échelle réduite de la population. Il faut noter que le plomb est employé en tant
qu'additif pour l'essence, mais la taille réduite du parc automobile calédonien doit
également être prise en compte. Il semble que les apports anthropiques, par voie liquide
(effluent) ou aérienne, de plomb et cadmium dans le domaine lagonaire soient donc faibles.
Les activités métallurgiques, en relation directe avec les potentialités minières de
la région, c'est à dire l'exploitation des minerais de nickel, rejettent par contre des
quantités non négligeables de métaux traces. Ces rejets industriels, sous forme liquide
(circuits d'eau pour le refroidissement des processus industriels) et solide (scories et
poussières atmosphériques), présentent une composition qualitative en éléments traces de
nature sensiblement analogue à celle rencontrée dans les sous-sols exploités. En
conséquence, les apports en nickel, fer, chrome, cobalt et vanadium, et dans une moindre
mesure nickel puisqu'il est extrait industriellement dans le domaine lagonaire ont une
origine double, à la fois terrigène et industrielle (§ III.!. ChapAl.

IV. RESULTATS ET DISCUSSION

IV.!. Analyse de l'échantillon standard interne des bivalves

IV.1.1. Précision
Les valeurs de précision ou coefficients de variation définis pour l'échantillon GT
D65 (tableau 7) sont relativement satisfaisants pour les éléments métalliques analysés (AI,
Ca, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni & Zn) et ce, pour la majorité des expérimentations réalisées.
Seule l'expérimentation n03, avec application du programme de digestion n03 (5 mn de
montée de puissance; 15 mn à 1000 W) sur des triplicats traités avec 5ml d'acide nitrique
concentré, montre de mauvaises précisions pour l'aluminium et le chrome (14':10). Mises à
part ces deux valeurs, les coefficients de variation sont généralement inférieurs à 5':10. On
observe également que les différents temps de digestion appliqués avec le four micro-
ondes n'ont aucune influence apparente sur la précision. Ce constat est cohérent avec les
résultats obtenus sur les teneurs dans les échantillons selon les expérimentations (§
IV.1.2. Chap. 4).
Ces résultats attestent de la faiblesse des erreurs aléatoires imputables à
l'ensemble des procédures opératoires appliquées, ainsi que de l'homogénéité de
l'échantillon standard interne GT D65 analysé.

56
Tableau 7 : Récapitulatif des valeurs de précisions ('j'a) de la procédure opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans les échantillons (n=3) de standard interne (GT
D65) du bivlalve Gafrarium tumidum (grisette).
(a) et (b) correspondent aux types de digestion appliqués pour un protocole défini:
a -Digestion avec 4ml d'HN0 3 69% + lml d'HzO z 30%; b -Digestion avec 5ml d'HN0 3 69':10.
Prog. 1 (5 mn de plateau à 1000 W), Prog. 2 (10 mn), Prog. 3 (15 mn) & Prog. 4 (20 mn) ; GT
correspond à l'espèce Gafrarium fumidum.

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.616 267.716 327.393 238 260.58 231.60 213.85
GT (a) 2,2 0,7 0,7 0,5 0,8 2,3 1,2 0,6 3,8
Prog. 1
GT (b) 6,7 2,9 2,4 2,9 1,3 7,3 6,2 2,7 3,8
Prog. 1
GT (a) 8,8 3,9 3,3 2,7 3,1 4,4 4,3 2,9 3,1
Prog. 2
GT (b) 2,1 0,8 1,7 0,7 1,4 2,6 7,1 1 1,1
Prog. 2
GT (a) 8,3 1,9 2,9 1 4,5 1,4 2 2 1,5
Prog. 3
GT (b) 14,1 0,8 1 14 3,8 2,1 2,1 4,9 5,7
Prog. 3
GT (a) 3,7 7 2 1,8 2 1,5 0,5 1,8 1,1
Prog. 4
GT (b) 2,1 0,5 0,9 7,8 2,1 1,4 0,8 3,3 1,4
Prog.4

NB: Au niveau de nCp-DES, chaque métal est analysé pour une gamme plus ou moins
importante de longueurs d'onde. Le traitement ultérieur des données obtenues se fait sur
une ou plusieurs longueurs d'onde sélectionnées en fonction de la sensibilité de chacune des
longueurs d'onde, des variations observées (Relative Standard Deviation) au cours de
l'analyse,...Les résultats cités dans ce document font apparaître une longueur d'onde
spécifique pour chaque métal, mais il convient de garder à "esprit qu'il peut subsister
d'autres longueurs d'onde pour lesquelles les données récoltées sont sensiblement
similaires. Il ne semble pas nécessaire de décrire l'ensemble des longueurs d'onde
analysées pour chacun des métaux étudiés dans le cadre de cette étude.

IV.l.2. Evolution des teneurs en métaux

Tous les éléments métalliques dosés sur "échantillon standard interne GT D65 sont
détectables et quantifiables par nCp-DES, et ce, malgré la faiblesse de certaines teneurs
observées (mg/I au niveau de ncp-DES) pour le cobalt, le chrome et le cuivre. Les
résultats, pour un élément considéré, apparaissent relativement similaires, quelques soient
la solution d'attaque ou le programme de digestion appliqués (tableau 8). Les rares
différences qui peuvent être observées ne sont pas significatives. Ce constat est en
adéquation avec les observations réalisées lors de la mise en œuvre des expérimentations,
à savoir la digestion complète des échantillons au terme de la programmation n0 1 établie
avec le four micro-ondes (5 mn de montée en puissance; 1000 W pendant 5 mn). li apparaît
O
que le programme n l est suffisant pour arriver à une digestion complète des tissus mous

57
de bivalves et donc une extraction totale des métaux. Les autres programmes de digestion,
dont "action est plus poussée, n'apportent pas d'informations supplémentaires.

Tableau 8 : Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (Jlg/g de poids sec ou ppm) pour
l'analyse des métaux dans l'échantillon standard interne (GT D65) du bivlalve Gafrarium tumidum
(grisette) (0 teneurs proches ou en deça des limites de détection et quantification). Les
concentrations sont estimées sur des triplicats d'échantillons.
(a) et (b) correspondent aux types de digestion appliqués pour un protocole défini:
a - Digestion avec 4 ml d'HN0 3 69% + 1 ml d'HzO z 30':10; b - Digestion avec 5 ml d'HN0 3 69':10.
Prog. 1 (5 mn de plateau), Prog. 2 (10 mn), Prog. 3 (15 mn) & Prog. 4 (20 mn) ; GT correspond à
l'espèce Gafrarium tumidum.

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.616 267.716 327.393 238 260.58 231.60 213.85
GT (a) 42 ± 0,9 2480 5,8 ± 6,6 ± 6,9 ± 1880 28 ± 0,3 34 ± 0,2 62 ± 2,3
Prog. 1 ± 18 0,04 0,06 0,06 ±43
GT (b) 43 ± 3 2514 5,8 ± 0,1 6,5 ± 0,2 6,7 ± 0,1 1852 28 ± 1,7 34 ± 0,9 61 ± 2,3
Prog. 1 ± 74 ± 136
GT (a) 48 ± 4,2 2499 6 ± 0,2 6,8 ±0,2 6,8 ± 0,2 1877 29 ± 1,2 35,3 ± 1 62 ± 1,9
Prog.2 ± 97 ± 82
GT (b) 42 ± 0,9 2441 5,9 ± 0,1 6,7 ± 0,01 6,6 ± 0,01 1850 29 ± 2,1 34 ± 0,3 60 ± 0,6
Proq.2 ± 21 ± 48
GT (a) 48 ± 4 2424 5,7 ± 0,2 6,6 ± 0,1 6,3 ± 0,3 1805 28 ± 0,6 34 ± 0,7 61 ± 0,9
Prog.3 ±47 ± 26
GT (b) 46 ± 6,5 2346 5,6 ± 0,1 7,2 ± 1 6,2 ± 0,2 1766 27 ± 0,6 33 ± 0,6 65 ± 0,7
Prog.3 ± 20 ± 38
GT (a) 41 ± 1,5 2370 5,5 ± 0,1 6,7 ± 0,1 6 ± 0,1 1771 27 ± 0,1 33 ± 0,6 65 ± 0,7
Prog.4 ± 17 ± 26
GT (b) 40 ± 0,8 2347 5,5 ± 0,01 7,4 ± 0,6 6 ± 0,1 1759 27 ± 0,2 33 ± 1,1 65 ± 0,9
Prog.4 ± 12 ± 24

Bien que le programme nO! suffise à la digestion complète des tissus mous, il a été
décidé, par sécurité analytique, d'appliquer le programme n02 pour la minéralisation totale
des échantillons individuels de bivalves. Ce choix garantit avec une certaine sécurité la
digestion complète d'un échantillon de bivalves de masse plus importante ou de composition
légèrement. Etant donné l'absence de différence, en terme de rendement d'extraction des
métaux, entre les deux solutions de digestion utilisées, il est décidé de conserver le
mélange bipartite (4 ml d'acide nitrique concentré 69% + 1 ml de péroxyde d'hydrogène
3070), comme défini préalablement (§ VII.3. Chap. 3). Enfin, force est de constater que la
masse d'échantillons digérée (200 - 300 mg) est suffisante pour donner un signal
analytique détectable à l'ICP-OES. Les analyses futures, effectuées sur des échantillons
de bivalve pouvant être moins « chargés» en métaux permettront de confirmer ce constat.

Le protocole retenu, pour la minéralisation totale des échantillons de tissus mous

de bivalves est récapitulé en annexe 1.

58
 IV.2. Analyse des échantillons standards internes d'holothuries

IV. 2.1. Précision

A l'exception du nickel, les coefficients de variation (tableau 9) apparaissent
corrects pour tous les métaux analysés dans les échantillons standards internes
d'holothurie HE N27 Visc. & teg., et ce, pour les différentes expérimentations effectuées.
Les concentrations en nickel dans les téguments sont extrêmement variables entre 43 et
20':10. Dans les échantillons de viscères, les précisions pour le nickel sont un peu élevées
tout en restant acceptables. Au niveau du tégument, les teneurs en nickel relativement
proches des limites de détection, et surtout de quantification de l'ICP-OE5, peuvent
expliquer les fortes variations observées. Bien que d'autres métaux soient présents à des
teneurs plus basses au niveau du tégument et ne présentent pas de coefficients de
variation aussi élevés, il faut rappeler que chaque métal se caractérise par des limites de
détection et quantification propres. L'homogénéité de l'échantillon ne semble pas remise en
cause, de par les résultats obtenus avec les autres métaux. Une source contaminante,
même minime (au vu des concentrations observées), au niveau de l'échantillon n'est pas à
exclure.

Tableau 9 : Récapitulatif des valeurs de précisions (io) des procédures opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour "analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (HE N27)
de j'échinoderme H%thuria edu/is (holothurie) (0 teneurs proches ou en deça des limites de
détection et quantification). Les précisions sont estimées Sur des triplicats d'échantillons.
Prog.l (5 mn de plateau), Prog.2 (10 mn), Prog.3 (15 mn) & Prog.4 (20 mn); HE Vise. Correspond à
H%thuria edu/isViscères, et HE Teg. à H%thuria edu/isTéguments.

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.616 205.560 224.700 238 260.58 231.60 213.85
HE Vise. 1.8 0.6 2.3 2.7 2.8 1.4 0.6 10.4 6.3
Prog.1
HE Vise. 0.3 0.5 0.7 13 0.5 2.4 1.2 5 1.5
Prog.2
HE Vise. 0.8 1 0.5 0.8 2.8 1.5 1.1 2.6 2
Prog.3
HE Teg. 3.5 1.3 0 14 4.6 1.6 1.5 43 18
Proq.1
HE Teg. 9.8 2 0 6.2 1.2 1.8 1.5 20 4.2
Prog.2

Par analogie avec l'étude des résultats obtenus pour les échantillons de bivalves, les
différents temps de digestion appliqués avec le four micro-ondes n'ont aucune influence
apparente sur la précision.
Outre le problème relatif à l'élément nickel, les résultats observés confirment
d'une part, la faiblesse des erreurs aléatoires, et d'autre part, l'homogénéité des deux
échantillons standards internes HE N27 Vise. et HE N27 Teg.

59
 IV.2.2. Evolution des teneurs en métaux

Les teneurs (Ilg/g de poids sec), pour chaque métal considéré individuellement, sont
relativement similaires, quelques soient la solution d'attaque ou le programme de digestion
appliqués. Ce constat est valable pour les deux types d'échantillons standards, viscères et
téguments (tableau 10). Dans les échantillons de viscères, l'aluminium et le calcium sont les
deux seuls éléments pour lesquels on observe une légère élévation des teneurs en fonction
du temps de digestion appliqué au four micro-ondes :
• De 99 à 116 J.l.g/g de poids sec pour "aluminium,
• De 5922 à 6185 J.l.g/g de poids sec pour le calcium.
Les variations faibles ne sont pas observées pour les autres métaux et les
différences observées sont considérées comme peu significatives.
ri faut également noter les faibles teneurs du cobalt « 1 ppm), quantifiables dans
les échantillons de viscères, mais pas dans les téguments. Ce résultat rappelle la nécessité
de l'emploi du four graphite (Spectrophotométrie d'Absorption Atomique) lors des analyses
d'éléments métalliques dont les quantités, trop faibles dans les différents types de
matrice biologique, ne sont pas analysables par rCp-OES.

Tableau 10; Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (Ilg/g de poids sec ou ppm) pour
l'analyse des métaux dans les viscères et téguments de l'espèce H%thuria édu/is (0 teneurs
proches ou en deça des limites de détection et quantification). Les concentrations sont estimées sur
des triplicats d'échantillon.
Prog.l (5 mn de plateau), Prog.2 (10 mn). Prog.3 (15 mn) & Prog.4 (20 mn) ; HE Vise. Correspond à
H%thuriaedu/isViscères, et HE Teg. à H%thuriaedu/isTéguments.

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.61 205.50 224.700 238 260.58 231.60 213.85
HE Vise. 99 ± 1.7 5922 ± 0.76± 3.4 ± 4 ± 0.1 276 ± 3.4 ± 5.8 ± 44 ±
Prog.1 36 0.02 0.09 4 0.02 0.6 2.8
HE Vise. 110 ± 0.3 6071 ± 0.8 ± 3.9 ± 3.8 ± 285 ± 3.5 ± 5.4 ± 44 ±
Prog.2 30 0.01 0.5 0.02 7 0.04 0.3 0.7
HE Vise. 116 ± 0.9 6185 ± 0.77± 3.8 ± 3.9 ± 0.1 286 ± 3.49± 5.3 ± 43 ±
Prog.3 64 0.01 0.03 4 0.04 0.1 0.9
HE Teg. 50 ± 1.7 19239 0 1.5 ± 1.9 ± 0.1 51 ± 2.8 ± 3.9 ± 20±
Prog.1 ± 245 0.2 0.8 0.04 1.6 3.7
HE Teg. 54 ± 5.3 19242 0 1.4 ± 1.7 ± 50± 2.8 ± 3.9 ± 16 ±
Prog.2 ±380 0.09 0.02 0.9 0.04 0.8 0.7

Enfin, les fortes teneurs en calcium (> 19 000 ppm) détectées dans les téguments
rappellent l'omniprésence des spicules calcaires dans le derme des holothuries (CONAND,
1988); une présence calcaire qui ne pose aucun problème (réactions violentes de
l'échantillon, effervescences... ) lors de l'ajout de la solution acidifiée de digestion.
Par analogie avec les processus de minéralisation réalisés sur les échantillons de
bivalves, la programmation n02 a été retenue, pour des raisons similaires (§ rV.1.2. Chap. 4)
pour la minéralisation des échantillons individuels d'holothuries. Le mélange bipartite de la
solution d'attaque est également conservé.
Le protocole général, finalement retenu, pour la digestion totale de échantillons
d'holothuries (viscères et téguments) est récapitulé en annexe 1.

60
 IV.3. Analyse des échantillons standards internes de phanérogames

rv.3.1. Précision
Les valeurs de précision (tableau 11) sont très satisfaisantes pour la majorité des
métaux analysés dans les échantillons standards internes de la phanérogame Cau/erpa
taxifo/ia CT D43, et ce, pour les différentes expérimentations. Les coefficients de
variation estimés pour les éléments aluminium, calcium, cobalt, fer et manganèse sont
meilleurs que ceux observés, pour les mêmes métaux, dans les échantillons standards
internes de tissus mous de bivalves, de viscères et téguments d'holothuries. La majorité
des valeurs est inférieure à 1%. Les éléments chrome et cuivre présentent toutefois des
précisions relativement correctes, inférieures à 10':10. Le niveau de l'erreur aléatoire est
également faible pour l'élément nickel avec des valeurs de l'ordre de 0,5, 0,5 et O,6'Yo pour
les duplicats d'échantillons soumis respectivement aux programmations (four micro-ondes)
de digestion nO l, 2 & 3.

Tableau Il : Récapitulatif des valeurs de précisions ('7'0) des procédures opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (CT D43)
de la phanérogame Caulerpa taxifolia. Les précisions sont estimées sur des duplicats d'échantillons,
excepté pour les échantillons sur lesquels le programme de four classique a été appliqué.
Prog.l (5 mn de plateau), Prog.2 (10 mn), Prog.3 (15 mn) & Prog. cio. (25 mn); CT correspond à
l'espèce Caulerpa taxifolia.
Ir Cette expérimentation concerne la digestion d'un triplicat d'échantillons avec une solution de

minéralisation tripartite (3ml HN0 3 6970 + 1ml HCI 36'7'0 + 1ml HzOz 30'7'0).

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.616 205.560 224.700 238 260.58 231.60 213.85
CT D43 3.4 0.2 0.1 9.4 2.6 1.6 0.4 0.5 22.1
Prog.l
CT D43 0.8 0.2 2.3 2.1 0.5 0.04 0.4 0.5 8.2
Prog.2
CT D43 0.2 0.4 0.7 0.2 5 0.3 0.1 0.6 6.7
Prog.3
CT D43* 0.7 0.9 1 1 5.3 0.4 0.8 24 15
Proq.Cla.

Par contre, la précision estimée, pour ce même élément, sur des triplicats
d'échantillons, minéralisés par une solution de digestion tripartite (HN0 3 + HCI + HzO z) et
soumis à la programmation classiquement utilisée sur les matériaux de référence, est
élevée (24'Yo). Les coefficients de variation sont également forts pour l'élément zinc (de
6,7 à 22'Yo), mais restent dans le domaine de l'acceptable, exceptées les valeurs
supérieures à 1O-15'Yo.

Les différents temps de digestion appliqués avec le four micro-ondes ne semblent

avoir aucune influence sur la variation des valeurs de précision. Par analogie avec les
échantillons standards internes cités précédemment, les résultats attestent de la
faiblesse des erreurs aléatoires et de l'homogénéité de l'échantillon CT D43.

61
 rv.3.2. Evolution des teneurs en métaux

A "instar des résultats observés pour les échantillons Gafrarium tumidum et

Holothuria edulis, la solution de digestion bipartite composée de 4 ml d'acide nitrique
concentré et 1 ml de péroxyde d'hydrogène 30i'0. au même titre que la solution tripartite,
ne sont pas suffisamment puissantes pour minéraliser complètement les échantillons de
Cau/erpa taxifo/ia. Au terme de chaque programmation micro-ondes, on constate
effectivement l'omniprésence, en quantité faible et régulière, de fines particules
blanchâtres résiduelles. Des composés cellulosiques, passablement réfractaires, présents
dans la composition des phanérogames peuvent être à l'origine de ces particules. Toutefois,
une étude précise des résultats analytiques, obtenus avec les différentes
expérimentations, laisse présager que cette digestion partielle ne suscite pas de
contraintes particulières pour l'extraction totale et l'analyse des métaux.

Tableau 12: Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus (Jlg/g de poids sec ou ppm) pour
l'analyse des métaux dans les échantillons de standard interne (CT D43) de la phanérogame Cau/erpa
faxifo/ia. Les concentrations sont estimées sur des duplicats d'échantillons, excepté pour les
échantillons sur lesquels le programme de four classique a été appliqué.
Prog.1 (5 mn de plateau), Prog.2 (10 mn). Prog.3 (15 mn) & Prog. cio. (25 mn); CT correspond à
l'espèce Cau/erpa faxifo/ia.
.. Cette expérimentation concerne la digestion d'un triplicat d'échantillons avec une solution de
minéralisation tripartite (3ml HN0 3 6970 + lml HCI 3670 + lml HzOz 3070).

AI Ca Co Cr Cu Fe Mn Ni Zn
396.153 317 228.61 205.56 224.70 238 260.58 231.60 213.85
CT D43 630 ± 21 20404 1.8 ± 11.7 ± 2.2 ± 1201 23 ± 26 ± lO±
Prog.1 ±40 0.001 1.1 0.06 ± 19 0.09 0.1 2.2 1

CT D43 686 ± 20705 1.8 ± 11.3 ± 2± 1220 23 ± 26.5± 7.7 ±

Prog.2 5.6 ±48 0.04 0.2 0.01 ±0.5 0.1 0.1 0.6
CT D43 688 ± 1 19870 1 ± 0.01 11.3 ± 1.45 ± 1178 22.5 ± 26 ± 9±0.6
Prog.3 ±77 0.02 0.07 ±4 0.03 0.1
CT D43* 722 ± 5 20057 1.1 ± 0.01 11.2 ± 1.3 ± 1184 23 ± 30 ± 9.7 ±
Prog.Cla. ±178 0.1 0.07 ±4 0.2 7.2 1.4

En effet, les teneurs observées pour chaque élément considéré individuellement,

apparaissent sensiblement analogues, quelques soient la solution d'attaque ou le programme
de digestion appliqués (tableau 12). Certaines concentrations sont même plus faibles (cas
du cobalt et du cuivre) alors que la durée de digestion par chauffage micro-ondes
augmente. La diminution des teneurs peut s'avérer importante, puisque de l'ordre de 40i'0
dans le cas du cobalt (1,8 à 1 ppm), et de 30 à 40i'0 pour le cuivre (2,1 à 1,4 ppm). Un
phénomène de recomplexation de ces métaux sur les particules observées non digérées
n'est pas à exclure, mais reste sujet à caution. De plus, il convient de garder à l'esprit que
l'ordre de grandeur des teneurs estimées pour ces deux éléments métalliques. Ces teneurs
sont relativement proches des limites de quantification de l'rCP-OES, ce qui laisse
supposer de fortes variabilités possibles.
Quoi qu'il en soit, la similitude des valeurs de concentrations observées pour les
autres éléments métalliques semblent impliquer:
• soit que le rendement d'extraction des métaux au niveau des échantillons est total,
• soit que les particules non digérées retiennent des quantités non définies et non
estimables de métaux fortement liés à cette matrice et qui ne peuvent être relargués avec

62
les solutions de digestion et les programmations micro-ondes appliqués. Ces métaux,
potentiellement fixés à ces particules, n'influencent donc en aucun cas les analyses
effectuées.
En conséquence, et par analogie avec les conclusions déduites des expérimentations
effectuées sur les échantillons de Gafrarium tumidum et h%turia edu/is, le mélange
bipartite de digestion est conservé, ainsi que l'application du programme de digestion n02,
pour la suite des analyses sur les espèces de caulerpales.

Le protocole général, finalement retenu, pour la minéralisation des échantillons de

caulerpales est récapitulé en annexe 1.

La validation du protocole opératoire de digestion des échantillons biologiques

permet désormais d'appliquer la méthode sur diverses matrices. Il faut évidemment
prendre en compte les modifications potentielles qui peuvent être apportées au protocole
en fonction de la complexité des matrices étudiées et des problèmes rencontrés au cours
du processus analytique. Les modifications appliquées, même d'ordre minime, ont été
soumises à de nouveaux tests de validation afin de s'assurer du bon fonctionnement et
rendement des manipulations. Ce travail est une étude préliminaire, basée sur l'analyse des
métaux dans des crevettes d'élevage. En fonction des résultats obtenus, elle pourra
conduire à la mise en place d'une collaboration entre l'IRD et l'IFREMER, sur un projet de
recherche concernant l'écotoxicologie et la bioaccumulation des métaux chez les
organismes marins.

63
64
 CHAPITRE 5

ANALYSE D'ECHANTILLONS

DE CREVETTES D'ELEVAGE

65
I.ELEVAGE DES CREVETTES EN NOUVELLE - CALEDONIE ET
PROBLEMATIQUE D' ETUDE

1.1. Aquaculture et crevettes: intérêts et développement

Les demandes croissantes sur le marché mondial de la crevette, à une période où

les captures de pêche tendent à stagner, sont à l'origine du développement continu de
l'élevage contrôlé des crevettes. Des conditions géographiques, géomorphologiques et
climatiques favorables couplées à une volonté territoriale de développer ce secteur
agricole , ont contribué à l'implantation d'une station expérimentale d'aquaculture en
Nouvelle-Calédonie au début des années 70. Actuellement, l'IFREMER contractualise, avec
le territoire et les provinces, des programmes de recherche dont l'objectif est
l'optimisation des procédures de développement d'activités privées d'aquaculture. En plus
de la station d'aquaculture de St-Vincent (nord de la baie de St-Vincent - 7 ha), géré par
l'IFREMER, il existe actuellement 450 ha de bassins de production répartis en 10 fermes
privées, pour lesquelles l'ensemble de la production s'élève à plus de 1900 tonnes pour
l'année 1999. Il faut noter que les exportations de crevettes (Australie, Japon et Europe
principalement) représentent 75'Yo du tonnage annuel, et 450 tonnes reviennent aux
marchés et à la consommation locales (IFREMER, com. Pers.).
Dans un contexte politique actuel visant le développement et la création d'activités
rurales et urbaines dans les différentes provinces, la production et la commercialisation
des crevettes revêt une importance économique et sociale non négligeable. Cette activité
permet de promouvoir l'économie calédonienne sur un plan international avec l'exportation
d'une grande partie de sa production, et s'inscrit de ce fait dans un contexte de marché
économique mondial. De plus, au niveau territorial, le développement de ce secteur reste à
la fois source d'emplois, et constitue un gage d'intégration pour l'ensemble des
communautés présentes sur le territoire.

1.2. Aquaculture et biomonitoring

En Nouvelle-Calédonie, les teneurs en certains métaux dans l'environnement sont

naturellement élevées. Les crevettes sont élevées dans des bassins en terre, et
potentiellement soumises à la présence de ces métaux dans l'eau ou le sédiment. Dans un
contexte général, les mortalités importantes de crevettes observées semblent être liées
aux changements de températures rencontrés pendant les intersaisons. Bien que les
métaux ne soient pas au premier abord la cause principale de ces mortalités, tous les
facteurs pouvant intervenir de manière directe ou indirecte dans ces mortalités sont à
prendre en compte, et c'est dans cette optique qu'une étude préliminaire sur les teneurs de
métaux dans les crevettes est faite.

Il a en effet été démontré chez plusieurs espèces de crustacés -dont certains

ayant une haute valeur commerciale comme les crevettes, les homards ou les crabes- qu'ils
sont très sensibles aux métaux (BARNBANG, 1995). L'accumulation de métaux chez les
invertébrés aquatiques est généralement plus importante que chez les poissons
(RAINBOW, 1995).

66
 L'exposition d'organismes aquatiques d'élevage à des métaux peut conduire à des
effets néfastes sur ces organismes, dus à leur toxicité, mais peut également, par le
phénomène de bioaccumulation, représenter un danger pour la santé des consommateurs.

Ce travail est une étude préliminaire visant à estimer les teneurs métalliques (AI,
Cd, Co, Cr, Fe, Mn, Ni, Sc, V, Zn) dans deux lots de crevettes. En parallèle, un dosage des
mêmes éléments a été effectué dans les granulés alimentaires distribués aux crevettes en
complément des apports de la productivité naturelle du bassin, ainsi que dans les sédiments
de surface prélevés dans les bassins d'élevage. Les résultats obtenus sur les sédiments de
surface feront l'objet d'un rapport ultérieur.
En fonction des résultats obtenus, un projet d'écotoxicologie pourrait être mis en
place dans le cadre d'une collaboration entre l'IRD et l'IFREMER.
Les aspects sur la santé humaine sont pris en considération. Par contre, les aspects
liés aux effets néfastes sur la physiologie des crevettes ou à leur toxicité ne sont pas
traités dans le cadre de cette étude préliminaire par manque de documentation.

II. LES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES ETUDIES

II.1. Espèce sélectionnée: Litopenaeus sty/irostris

Les travaux d'expérimentations préliminaires, destinés à déterminer les espèces

de crevettes exploitables dans le cadre des techniques d'élevage mises en place sur le
territoire calédonien, ont permis de sélectionner une espèce unique : Utopenaeus
sty/irostris. Importée d'Amérique latine, cette espèce supplante les espèces cosmopolites
du lagon néo-calédonien, en terme de performance de croissance (taille importante, bon
développement continu en saison froide et chaude...). Elle est, de plus, fortement appréciée
en terme alimentaire sur le plan international (IFREMER, com. Pers.).

II.2. Site d'étude et prélèvements

Les sites d'étude, lieux de prélèvement de l'espèce Utopenaeus sty/irostris, sont

respectivement localisés autour de la baie de St-Vincent, dans les bassins d'IFREMER et
d'une ferme aquacole privée (IFREMER, com. Pers.).
Les prélèvements de crevettes sont effectués dans les bassins de grossissement,
en terre, aménagés sur les marais environnants. Ces bassins sont alimentés en eau de mer
par pompage, et ont une superficie comprise entre 1 et 10 hectares. Leur profondeur est
comprise entre 0,8 à 1,2m.

11.3. Méthodes et périodes de récolte

Les crevettes ont été prélevées de manière aléatoire au sein des bassins
d'expérimentation et d'élevage. Lors de l'étude d'une zone définie, il est nécessaire
d'établir la liste des sources de variation (profondeur du site, période de l'année, type de
substrat, salinité, température, etc... ) qui peuvent affecter les organismes prélevés pour
sélectionner des échantillons représentatifs de la zone étudiée (OXLEY W.G., 1997). En
effet, plus le système est complexe, plus le nombre de réplicats d'échantillons récoltés

67
doit être important et dispersé afin d'obtenir un panel d'échantillons le plus représentatif
possible de l'ensemble des variables de la zone (OXLEY W.G., 1997). Dans le cadre de
cette étude, toutes les conditions environnementales sont contrôlées et homogènes sur
l'ensemble des bassins de prélèvements ce qui minimise l'hétérogénéité. Les crevettes
récoltées sont donc bien représentatives de la zone d'étude.

lIA. Traitement préliminaire des échantillons

IL 4.1. Description des traitements

Les échantillons de crevettes fraîchement récoltés sont abondamment rincés à

l'eau de mer filtrée. Le rinçage permet l'élimination du matériel colloïdal et particulaire
potentiellement adsorbé sur les cuticules des crustacés. La qualité du rinçage conditionne
donc la fiabilité et la validité des analyses de cuticules et de tissus mous, à partir du
moment ou la présence de matériel particulaire non éliminée sur les matrices traitées peut
considérablement influer sur les concentrations en éléments métalliques.
Les crevettes sont ensuite sacrifiées par congélation à -25°C. Elles restent
congelées jusqu'à application des procédures suivantes: dissection (sélection d'un organe
particulier ou prise en compte de l'organisme dans son ensemble), mesures biométriques
éventuelles, lyophilisation et broyage, ultime étape avant analyse.
Dans le cadre de cette étude, les cuticules ou carapaces des crustacés sont
systématiquement retirées de la queue (tissu mou ou chair) et du céphalothorax de
l'animal; ces deux parties du corps étant préalablement séparées. Seul un groupe de
crevettes prélevé dans les bassins d'IFREMER a conservé la queue recouverte de la
cuticule, et ce, pour des raisons pratiques de dissection (taille faible des individus).
Différents groupes ou "pools" d'échantillons ont été préparés et peuvent être distingués
comme suit:

Echantillons du bassin d'élevage (Poids frais moyen des crevettes entières: 35g):

• Les cuticules des crevettes (exceptées les cuticules du céphalothorax).

Pour des raisons analytiques, la masse de chaque cuticule est trop faible pour
envisager une quelconque analyse individuelle. Les cuticules ont donc été regroupées,
broyées et par là-même homogénéisées. Les quantités recueillies apparaissent alors
suffisantes pour des réplications analytiques.

• Les échantillons de tissus mous (chair et viscères de la queue).

Par souci de cohérence avec les cuticules, qui par nécessité ont été rassemblées en
un échantillon unique, il a semblé logique de regrouper également les tissus mous bien que la
masse ne représente pas un critère limitatif au niveau analytique.

Echantillons du bassin dTFREMER (Poids frais moyen des crevettes entières: 7, 7g) :

• Les corps des crevettes.

Contrairement aux pénéides récoltées dans les bassins d'élevage de la ferme, les
cuticules n'ont pas été séparées des tissus mous. La taille des crevettes est en effet trop
réduite pour pratiquer une dissection propre, et séparer les tissus mous de l'exosquelette.
Le regroupement des échantillons suit la même logique de cohérence citée précédemment.

68
• Les céphalothorax (exemptes de cuticules).
Pour des raisons analytiques, la masse des céphalothorax est trop faible pour
envisager des analyses individuelles. Ils ont donc été regroupées, broyées et
homogénéisées. Toutefois, Il faut noter que les masses de céphalothorax lyophilisées
restent trop faibles, même après regroupement, et nous limitent à des analyses de
duplicats.

• Les cuticules des céphalothorax.

Par analogie avec les céphalothorax dont sont extraits ces cuticules, la quantité de
matériel analysable est faible d'ou la nécessité de tout regrouper en échantillon unique.

Compléments alimentaires:

• Les granulés nutritionnels (provendier local) distribués dans les bassins d'élevage en
complément des apports de la productivité naturelle du bassin.

IL4.2. Précision sur l'étape de broyage

Après lyophilisation, les tissus mous (chair et viscères des queues), et

essentiellement les céphalothorax de crevettes présentent une texture fibreuse riche en
lipides. Les fortes compositions lipidiques du cortège cérébral sont également responsables
de l'aspect graisseux observé. Ceci pose des difficultés pour le broyage avec le broyeur
automatique Retsch RM100 (Fisher Bioblock), et a nécessité un pré-broyage manuel avec
l'aide d'un mortier et d'un pilon en agathe. Il existe plusieurs méthodes pour limiter les
problèmes dus aux composés lipidiques. Certains auteurs, dont l'équipe d'écotoxicologie de
l'université de la Rochelle, préconisent un mixage préalable et un broyage des organismes
frais, puis un séchage des échantillons au four (BUSTAMENTE P., com. pers.). Un dernier
broyage sec est appliqué afin de réduire définitivement en poudre le matériel étudié.
L'emploi d'un tel procédé peut permettre de diminuer les difficultés de broyage
rencontrés sur un matériel lyophilisé entier. Il est également possible de s'affranchir
totalement des composés lipidiques par extraction, au niveau du matériel frais, en milieu
aqueux avec du chlorure de méthylène, de l'éther de pétrole ou encore de l' hexane, ce
dernier produit étant le plus couramment employé (LAURENT, com. pers.). L'échantillon
dégraissé est ensuite mis à évaporation, puis séché ou lyophilisé. Cette procédure implique
bien évidemment d'autres problèmes concernant notamment les pertes potentielles des
éléments métalliques liés aux lipides, au cours du dégraissage. Dans le cadre de cette
étude, aucun de ces deux procédés précédemment cités n'a été utilisé. Ces compositions
lipidiques ont également posé des problèmes au niveau du protocole opératoire de digestion
des échantillons (§ II.5.1. Chap. 5).

II.5. Procédure d'extractions chimiques des métaux et analyse

IL5.1. Protocole opératoire

Le protocole opératoire de digestion des échantillons de crevettes et d'extraction

des métaux associés est analogue à celui développé et validé dans le cadre des
expérimentations portées sur les matériaux de référence (§ V, Chap. 3). Les différentes

69
analyses, validées en parallèle par le dosage des échantillons certifiés, ont été réalisées
par l'ICP-OES (§ VI, Chap.3).

IL 5. 2. Problèmes opératoires rencontrés

Les cuticules de crevettes, composées œ chitine comme la majorité des

exosquelettes de crustacés (UBES S.M., 1992), sont facilement digérés par la solution
d' attaque d'acide nitrique concentré (6570). Les lipides complexes (haut poids moléculaire),
présents en très forte quantité dans le cortège cérébral du céphalothorax, montrent un
comportement beaucoup plus réfractaire par rapport au processus de digestion appliqué.
L'ajout supplémentaire de péroxyde d' hydrogène, en complément de l'acide nitrique
concentré, ne semblent pas suffisant pour solubiliser l'ensemble des composés lipidiques
concentrés dans les céphalothorax. Les lipides présents dans les queues semblent moins
complexes et sont totalement digérés au simple contact de l'acide nitrique concentré.
Pour l'ensemble des groupes d' échantillons cités précédemment (§ IrA.1. Chap.5),
la digestion est totale. Seuls les échantillons de céphalothorax révèlent, après attaque, la
présence de fines particules résiduelles dans la solution. Ces particules ont bien
évidemment été éliminés par filtration, avant analyse de la solution d'attaque par l'ICP-
OES. Au cours de travaux et expérimentations ultérieures, il serait souhaitable d'appliquer
une méthode de digestion plus poussée pour les échantillons de céphalothorax, et
éventuellement de déterminer la nature exacte des composés lipidiques réfractaires non
digérés.

III . RESULTATS

III.!. Validité de la méthode

III 1.1. Analyse du matériel certifié

Les valeurs de précision et justesse estimées sur les matériaux de référence

DORM-l (muscles de chien de mer - NRCC), DOLT-l (foie de chien de mer - NRCC) et MA-
A-l (homogénat de copépodes - AIEA) présentées dans les tableaux 3, 4a, 4b et 5 (§ VII
Chap.3) s'appliquent directement au protocole utilisé pour les crevettes.

III1.2. Analyse de la crevette Litopenaeus stylirostris.

Les coefficients de variation ou précision définis pour les échantillons de crevettes

(tableau 13) apparaissent satisfaisants pour les éléments métalliques suivants, AI,Cu, Fe,
Mn, Ni, Sc, V et Zn, et ceci quelques soient les parties anatomiques étudiées. En revanche,
le cobalt et le chrome présentent des teneurs extrêmement proches ou en deçà des limites
de détection et quantification de l'ICP-OES et le protocole utilisé ne permet donc pas leur
quantification. Pour le scandium et le vanadium, seuls les échantillons de céphalothorax,
exempts de cuticules, donnent des valeurs suffisamment élevées pour être utilisables. La
majorité des valeurs de précision sont largement inférieures à 570. Les coefficients de
variation les plus élevés sont à mettre à l'actif de J'élément nickel. La faiblesse des

70
 teneurs, proches de la limite de quantification de l'appareillage, dans les différents
échantillons expliquent les fortes variations observées. De même que pour les matériaux de
référence, ces résultats attestent de la faiblesse des erreurs aléatoires imputables à
l'ensemble de la procédure opératoire, ainsi que de l'homogénéité des échantillons analysés.

Tableau 13: Récapitulatif des valeurs de précisions ('ro) de la procédure opératoire et analytique
appliquées, obtenues pour l'analyse des métaux dans différentes parties corporelles de la crevette
«Litopenaeus sty/irostris» (0 teneurs proches ou en deçà des limites de détection et
quantification). Les précisions sont estimées sur des triplicats d'échantillons, exceptés pour les
cuticules de queues de crevettes (n =4), et les céphalothorax (n = 2).
(a), (b)... correspondent à des groupes d'échantillons distincts.
,. B.E. est le sigle correspondant aux espèces de crevettes collectées dans les Bassins d'Elevage de la
ferme privée.

AI Co Cr Cu Fe Mn Ni Sc V Zn
Queue de crevettes 7.9 (2) 0 3.1 6.5 2.9 17 0 (2) 1.9
sans cuticules (a)
BE --
Queue de crevettes 2.8 0 0 2 3.1 2.4 2.5 0 0 1.4
sans cuticules (b)
BE --
Queue de crevettes 3.6 0 0 1.6 1.6 2.5 6.1 0 0 2.3
sans cuticules (c)
BE --
Cuticules de queues 3.1 0 (2) 3.7 3 1.5 10 0 0 4.4
de crevettes
1 BE--
Queue de crevettes 2.8 0 0 4.7 2.5 1.6 1.4 (2) 0 2.3
avec cuticules
(Ifremer)
Cephalothorax crev. 3.3 0 0 1.6 1.9 2.4 2.2 0.3 4.7 1.7
Sans cuticules (d)
(Ifremer)
Cephalothorax crev. 0.6 0 0 1.1 0.6 0.9 1.4 0.3 2.3 0.5
Sans cuticules (e)
(Ifremer)
Cuticules de 1.8 (2) 0 1.5 3.6 0.9 0.3 0 (2) 1.1
céphalothorax (f)
(Ifremer)
Cuticules de 2.2 0 0 0.8 3.9 3.9 3.3 0 0 1
céphalothorax (g)
(Ifremer
Granulés alimentaires 0.4 0 0 1.3 4.2 8.6 44 0 0 1.3

71
Tableau 14 : Récapitulatif des résultats (moy. ± écart-type) obtenus ÛJ.g/g de poids sec) pour l'analyse des métaux dans différentes parties corporelles de la
crevette "Litopenaeus stylirostris' (0 teneurs proches ou en deçà des limites de détection et quantification). Les précisions sont estimées sur destriplicats
d'échantillons, exceptés pour les cuticules de queues, les granulés (n::4), et les céphalothorax (n::2).
• * Métaux pour lesquels toutes les longueurs d'onde d'analyse donnent des résultats corrects, similaires et exploitables.
• ** B.E. est le sigle correspondant aux espèces de crevettes collectées dans les Bassins d'Elevage.

AI 396.153 Co * Cr * Cu 327.391 Fe * Mn* Ni 232.003 Sc * v* Zn 213.857

~ueue de crevettes 34 ± 2.7 0 0 29 ± 0.9 21.5 ± 1.4 0.7± 0.02 0.3± 0.05 0 0 58 ± 1.1
~nn~ _. . ln\ RI= **
~ueue de crevettes
181 ± 5 0 0 44 ± 0.9 65 ± 2 2.1 ± 0.05 1.2 ± 0.03 0 0 64 ± 0.9
sans cuticules (b) BE **
~ueue de crevettes
132 ± 4.7 0 0 44 ± 0.7 49 ± 0.8 2 ± 0.05 0.65 ± 0.04 0 0 61 ± 1.4
sans cuticules (c) BE **
Cuticules de queue de
113 ± 3.5 0 0 46 ± 1.7 96 ± 2.9 13.4 ± 0.2 0.3 ± 0.03 0 0 25 ± 1.1
crevettes BE **
~ueue de crevettes
370 ± 10.5 0 0 93 ± 4.4 265 ± 6.7 2 ± 0.03 52 ± 1.2 0 0 17 ± 0.3
avec cuticules (Ifremer)
Cephalothorax crev.
0.3 ± 1.27 ±
sans cuticules (a) 1328 ± 44 0 0 201 ± 3.2 997 ± 19 79 ± 1.9 13.3 ± 0.3 109 ± 1.9
0.001 0.06
(Ifremer)
Cephalothorax crev.
0.3 ± 1.33 ±
sans cuticules (b) 1401 ± 8 0 0 193 ± 2.2 999 ± 6 54 ± 0.5 14.7 ± 0.2 109 ± 0.6
0.001 0.03
(Ifremer)
Cuticules de
céphalothorax (a) 191 ± 3.4 0 0 84 ± 1.3 136 ± 5 23 ± 0.2 1.8 ± 0.005 0 0 36 ± 0.4
(Ifremer)
Cuticules de
céphalothorax (b) 383 ± 8.4 0 0 133 ± 1 230 ± 9 33 ± 1.3 2.4 ± 0.08 0 0 57 ± 0.6
(Ifremer)
Granules alimentaires 1015 ± 4 0 0 38 ± 0.5 288 ± 12 58 ± 5 1.8 ± 08 0 0 218 ± 3
 III.2. Distribution et évolution des métaux

Le tableau 14 regroupe l'ensemble des résultats analytiques des métaux contenus

dans les différentes parties anatomiques de la crevette Litopenaeus stylirostris.

III.2.1. Introduction et rappels

Il convient de rappeler la prudence à accorder quant au traitement des données

obtenues et l'interprétation qui peut en découler. En effet, les queues de crevettes et les
cuticules associés d'une part, ainsi que les céphalothorax et l'exosquelette correspondant
d'autre part, proviennent d'échantillons de crevettes collectées dans deux bassins
distincts: un bassin de ferme d'élevage et un bassin de la station IFREMER.

Malgré les similitudes de milieux et de conditions de traitement, il est difficile de

réellement comparer les résultats des différentes parties anatomiques. Toutefois, ces
teneurs donnent une vision préalable de ce qui peut être observé chez cette espèce en
fonction des conditions environnementales rencontrées et des traitements auxquels elles
sont confrontées, et reflètent une tendance générale pouvant servir de base à des travaux
ultérieurs.

III.2.2. Distribution des métaux dans les crevettes

Les teneurs (Ilg/g de poids sec ou ppm) apparaissent extrêmement variables d'un
élément métallique à un autre et présentent de grandes fluctuations selon les parties
corporelles considérées. Quelque soit la partie anatomique analysée, les métaux se
répartissent généralement, par ordre croissant d' abondance, comme suit: Ni < Mn < Zn <
Cu < Fe < AI. On distingue également des variations de concentrations au sein d'une partie
anatomique spécifique, en fonction des groupes d'échantillons, pourtant collectés dans la
même zone d'étude (cas des queues, exemptes de cuticules, des crevettes prélevées dans
un bassin d'élevage).

L'évolution des teneurs en métaux dans les différentes parties des organismes
présente toutefois une certaine organisation générale (figure 15 à 20). Par ordre croissant
d'augmentation des teneurs en métaux, se succèdent les queues (exemptes de cuticules) ou
tissus mous, les cuticules de ces mêmes queues, les cuticules de céphalothorax et enfin les
céphalothorax (exemptes de la cuticule ). Les échantillons de queues de crevettes,
pourvues de la carapace, donnent des résultats intermédiaires. Les granulés alimentaires
représentent un cas à part, traité ultérieurement.

Le céphalothorax, partie molle à forte composition lipidique, contient des quantités

élevées en métaux, jusqu'à plusieurs dizaines de fois supérieures (30 à 40 fois pour le
manganèse) aux teneurs estimées dans les autres parties corporelles. Cette tendance est
d'autant plus accentuée que la digestion du céphalothorax ne semblent pas complète.
Cependant, l'attaque opérée sur les échanti lions peut être suffisante pour extraire
l'ensemble de métaux.

73
 1600
1400
AI (396.153)

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Figures 15, 16 & 17: Evolution et distribution des concentrations en

aluminium, cuivre et fer dans les différentes parties anatomiques de
l'espèce de crevettes Litopenaeus stylirostris .
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Figures 18, 19 & 20: Evolution et distribution des concenrations en

manganèse, nickel et zinc dans les différentes parties anatomiques de
l'espèce de crevettes Litopenaeus stylirostris.
 La cuticule assoclee au céphalothorax concentre également des quantités non
négligeables de métaux, mais dans une moindre mesure par rapport à la structure molle
qu'il recouvre, soit des teneurs de 3 à 7 plus faibles.
Les queues de crevettes, ou tissus mous, ainsi que leur cuticule , montrent des
valeurs sensiblement analogues, bien que les cuticules révèlent des concentrations
globalement plus élevées mais dans une même gamme de magnitude.

III.2.3. Cas particulier des granulés alimentaires

Les granulés alimentaires ont des concentrations extrêmement variables en

fonction du métal considéré. L'aluminium, le fer, le zinc et le manganèse présentent les
plus fortes teneurs avec respectivement 1015, 288, 218 et 58 ppm. Ces valeurs se
rapprochent des plus fortes concentrations observées chez la crevette (1300-1400 ppm
d'aluminium, 998 ppm de fer et 50-80 ppm de manganèse dans le céphalothorax), et sont
même deux fois plus élevées dans le cas du zinc (218 ppm dans les granulés contre 109 ppm
dans le céphalothorax). Ces quatre éléments sont dans tous les cas plus concentrés dans
les granulés que dans n'importe quelle partie anatomique de la crevette. Les concentrations
en cuivre et nickel (38 et 1,8 ppm) du granulé sont plus proches des valeurs observées dans
les tissus mous de la queue des crevette.

III.3. Constats et hypothèses

Ces résultats nous permettent d'établir clairement une distinction, en terme

d'accumulation métallique, entre le céphalotorax et la queue des crevettes. Il semble
effectivement que le céphalothorax ait un potentiel d'accumulation relativement élevé par
rapport à la queue.
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour tenter d'expliquer les fortes
concentrations observées au niveau du céphalothorax :

• La composition lipidique des différents organes contenus dans le céphalothorax.

Les acides gras présents dans cette partie anatomique (les phospholipides comme la
lécithine ou céphaline, les lipoprotéines...) constituent autant de longues chaînes carbonées
linéaires, sites potentiels de fixation et de stockage des composés métalliques. Le
composé organo-métallique méthyl-mercure, hautement toxique et source de problèmes de
coordinations neuromusculaires irréversibles, s'accumule préférentiellement dans les
tissus nerveux et notamment dans le cerveau (CLARK, 1997). Le cuivre est également connu
pour des processus d'accumulation au niveau du cerveau. Toutefois, les processus
d'absorption des métaux, le devenir (relarguage, accumulation ou stockage), le
comportement et les conséquences de ces éléments dans les différents organes, c'est à
dire globalement la réponse biologique des organismes exposés à des sources polluantes,
nécessite des études spécifiques de bioaccumulation pour chaque métal donné, pour une
espèce considérée.

• L'alimentation des pénéides

La présence éventuelle d'aliments ( granulés, benthos) dans l'appareil digestif des
crevettes peut également être à l'origine des fortes concentrations observées pour
l'aluminium, le fer, le zinc et le manganèse.

76
• L'apport des sédiments
Le rinçage abondant des crevettes, après collecte et avant traitement, ainsi que
l' hétérogénéité de la distribution des métaux en fonction des parties anatomiques
considérées, excluent pratiquement l' hypothèse d'une contamination métallique par la
présence directe de fines particules sédimentaires déposées sur les parois externes des
échantillons. Toutefois, il n'est pas exclu que les sédiments de surface soient une source
potentielle de métaux biodisponibles, par relarguage des éléments (action de la diagénèse
précoce) dans la colonne d'eau. RAINBOW (1995) considère effectivement que les formes
ioniques libres (hydratées) des métaux constituent les formes disponibles sous lesquelles
s'effectue principalement le transfert de ces éléments chez les crustacés. Il existe, bien
évidemment, d'autres voies de transfert. L'analyse des sédiments doit fournir de plus
amples informations quant aux métaux présents dans les bassins, et leur rôle potentiel sur
les populations de crevettes.

IlIA. Notion de toxicité et contamination

IIL4.1. Introduction

Au niveau de la santé des organismes, toxicité et contamination peuvent également avoir

des effets négatifs sur la physiologie des animaux aquatiques (reproduction,
osmorégulation, processus enzymatiques, croissance, développement larvaire). Sur des
espèces d'intérêt commercial comme la crevette, très peu de travaux ont été menés.
La mise en place de normes et méthodes standards concernant la détermination de
la toxicité ou du degré de contamination d'un produit destiné à la consommation
représente un des créneaux majeurs du domaine de la santé publique. Or, les études
nécessaires s'avèrent parfois relativement complexes, en particulier dans des régions où
peu de travaux concernant les problèmes de santé publique ont été effectués. Le
territoire de Nouvelle-Calédonie accuse, en terme de normalisation environnementale, un
certain retard par rapport aux pays industrialisés. La prise de conscience des pouvoirs
politiques locaux ces dernières années permet progressivement de combler ce retard,
notamment par l'application de méthodes standards et normes utilisées en métropole.
Concernant l'élevage des crevettes, l'application et le respect de normes sanitaires
seraient aussi des atouts pour compléter le label de qualité actuel sur le marché
international. L'environnement "sain" de la Nouvelle-Calédonie, par rapport à de nombreux
pays qui exportent également des crevettes, contribue amplement à l'instauration d'un tel
label et permet à l'aquaculture calédonienne de bénéficier d'une spécificité dans le marché
mondial de la crevette.

Dans le cadre de cette étude, il est apparu nécessaire de comparer les résultats
obtenus au niveau des tissus mous de la queue (partie "consommable") avec des valeurs
limites de concentrations en métaux admises par des organismes de santé publique
extérieures. Les normes considérées dans ce rapport sont issues de travaux effectués
dans la province Est de l'Arabie Saoudite sur les concentrations en métaux de crevettes
locales destinées à la consommation (SADIQ, 1995). Ce sont les seules références que nous
avons à notre disposition actuellement, mais il existe également des normes européennes et
américaines. Les valeurs de concentrations limites admissibles utilisées sont proposées par
la SASO (Saudi Arabian Standards Organization), organisation responsable de

77
l'établissement de normes pour les produits de consommation dérivés des poissons et les
crevettes.

IIL4.2. Rappels sur les notions de toxicité et contamination

Toxicité d'une substance: Apparition d'effets néfastes chez un organisme exposé à un

altéragène (ou élément xénobiotique) et pouvant se manifester au niveau moléculaire,
physiologique, voire comportementale (BREAU, com. pers.).

Contamination: "Augmentation des concentrations d'une substance ou d'un ensemble de

substances introduites dans le milieu naturel par l'activité humaine, sans que des effets
néfastes, résultant de cette augmentation, n'aient été observées" (d'après PRESTON,
1989, dans CHAPMAN, 1995).

Pollution marine : "Introduction par l' homme directement ou non, de substances ou

d'énergie dont résultent des effets néfastes tels des torts aux ressources vivantes, des
risques pour la santé humaine, des gênes aux activités marines, des altérations de la qualité
des eaux" (G.E.S.A.M.P. - Groupe d'Experts Scientifiques d'Evaluation de la Pollution
Marine & I.C.E.S. - International Commission for the Exploration of the Sea, dans CLARK,
1997).

IIL4.3. Normes et santé humaine

Relation santé humaine - métaux

Tous les métaux ne sont pas toxiques pour les organismes vivants, et notamment
pour l' homme, certains apparaissent même essentiels à l'activité métabolique:

• L'hémoglobine, pigments respiratoires des vertébrés et invertébrés, est relativement

riche en fer.
• L' hémocyanine, pigments respiratoires de nombreux mollusques et crustacés, contient
des quantités importantes de cuivre.

La liste des métaux, indispensables à certaines fonctions physiologiques et

mécanismes biochimiques, n'est pas exhaustive, mais rappelle à juste titre, la nécessité de
faire des distinctions entre différents groupes de métaux dont les conséquences sur
l'être humain sont fortement variables. Les éléments métalliques, en rapport direct avec
les organismes, peuvent être divisés en trois groupes :

• Les métaux "légers" (Na, K, Ca, AL). Ces éléments ne représentent aucun danger pour la
santé humaine, et sont omniprésents dans la majorité des êtres vivants.
• Les métaux de transition (Fe, Cu, Co, Mn..) sont essentiels au métabolisme, mais
potentiellement toxiques à fortes concentrations.
• Les métaux lourds ou métalloïdes (Hg, Pb, Sn, Se, As, Ni...), ne sont pas utilisés en tant
qu'agents métaboliques chez l'homme, et qui plus est, représentent un véritable danger à
de très faibles teneurs.

78
 Normes SA 50

Les normes de qualité, proposées par la SASO, concernant les concentrations

limites admissibles pour la santé humaine dans les chairs consommables de crevettes sont
répertoriées dans le tableau 15. De nombreux pays établissent et instaurent
progressivement des normes similaires, en vue de la commercialisation et consommation
des crevettes mais également d'autres espèces de crustacés (langoustes, crabes ...)
réputées pour leur sensibilité particulière aux composés métalliques (BARNBANG et al.,
1995; CARBONEL et al., 1998).

Tableau 15 : Répertoire de quelques teneurs maximales admissibles pour la consommation humaine

(mg/kg de poids frais & poids sec"') établies par la SASO, dans les tissus mous (queues décortiquées)
de crevettes (source: SASO, 19770, 1977b, 19800, 1980b; dans SADIQ, 1995).
... On considère un rapport poids frais/poids sec de l'ordre de 4,5.

Co Cu Fe Mn Ni V Zn
1 20 Considérés non dangereux pour la santé 50
humaine à faible concentration.
4,!J< 9cr 225'<
Elément Eléments essentiels Elément essentiel
essentiel (croissance du corps humain) (croissance du corps
1
humain)

Ces valeurs limites admissibles correspondent à des teneurs au de-là desquelles il

existe des risques potentielles de toxicité, soit des implications possibles en terme de
santé. Mais en aucun cas, ces chiffres sont le reflet de niveaux de concentrations léthales
ou subléthaJes vis-à-vis des populations.

La SASO ne propose pas de concentrations limites pour les éléments manganèse et

nickel, dont les teneurs dans les échantillons de crevettes analysées sont extrêmement
faibles (0,3 - 1,2 ppm pour le Ni; 0,7 - 2,1 ppm pour le Mn) et ne présentent aucun danger
pour la santé. Cependant, à haute dose, le nickel est un cancérogène humain, provoquant
des cancers des voies nasales, des poumons, du larynx, de l'estomac et peut-être aussi du
rein. Quant au manganèse, son abondance dans l'alimentation humaine est telle qu'il
n'existe pas de syndromes spécifiques de déficience ou d'excès connus.
Les concentrations en fer (21,5 - 65 I1g/g de poids sec) observées dans les tissus
mous de l'espèce Litopenaeus sty/irostris sont dans des gammes de valeurs et des ordres
de grandeur similaires voire inférieures, aux valeurs observées dans différentes espèces
de crevettes aquacoles (SADIQ et al., 1995; CARBONELL et al., 1998) (tableau 16). Les
crevettes cultivées dans le Golfe de Fonseca (Amérique Centrale) ont des teneurs en fer,
au niveau des chairs, comprises entre 17 et 64 J,1g/g de poids frais (entre 76 et 288 J,1g/g
de poids sec) (CARBONELL et al., 1998). Les multiples échantillons de crevettes,
collectées dans des fermes aquacoles arabes et asiatiques (SADIQ et al., 1995) montrent
une gamme de valeurs plus large, avec des teneurs comprises entre 1,4 et 78 J,1g/g de poids
frais (6.3 et 351 J,1g/g de poids sec). Dans un cas comme dans l'autre, les niveaux de
concentrations observés apparaissent relativement faibles, et suggèrent ces valeurs
comme représentatives d'une concentration en fer "normale" dans les tissus mous (partie
consommable) des crevettes, dans un environnement exempt de problèmes de
contamination (CARBONELL et al., 1998).

79
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Cnutl\cc:a.n!l Spain
-S ~ ~ 002·0.18 0.05.0.79 rUIO'" d. 1994
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~ Mus."el"l Spain
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C -+=: n 0.001·0.07 1.6·42 24\·1833 64·20.9 5.2·34.7 C.ld...11 .n<! Duhler 1983
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d'échantillons analysés présentent des concentrations en zinc comprises entre 58 et 64
Ilg/g de poids sec. Ces valeurs sont largement inférieures à la norme proposée par la SASO
qui est de 50 Ilg/g de poids frais (225 Ilg/g de poids sec). La SASO rappelle elle-même que
cet élément est essentiel pour la croissance du corps humain, et qu'un manque substantiel
de ce métal est plus néfaste pour la santé humaine qu'une concentration extrêmement
élevée, ce qui n'est pas le cas des échantillons de crevettes Litopenaeus sty/irostris. Les
concentrations observées pour l'élément cuivre apparaissent également inférieures à la
norme envisagée par la SASO, de même que pour les crevettes cultivées dans le Golfe de
Fonseca (Amérique Centrale) ou dans les fermes aquacoles arabes et asiatiques (SADIQ et
al.,1995). Le cuivre apparaît comme un élément essentiel pour le corps humain, facilitant
notamment l'incorporation et l'utilisation de l'élément fer dans la synthèse de
l' hémoglobine.

III. 4.4. Toxicologie et physiologie des crevettes

En ce qui concerne les effets possibles des différents métaux sur la physiologie
des crevettes, nous ne disposons pas de données bibliographiques suffisantes actuellement.
Le premier travail consistera, avec les résultats de cette étude préliminaire, à établir une
comparaison des valeurs obtenues avec celles d'autres études où la toxicité des métaux
aurait éventuellement été testée. Les données obtenues sur les sédiments seront
également nécessaires en complément des résultats décrits dans cette étude. Ces
résultats sont une indication des teneurs en métaux présents dans des crevettes d'élevage
à une période précise de l'année. Il faut donc les considérer avec prudence et éviter
d'extrapoler sur l'ensemble du cycle biologique.

81
 CHAPITRE 6

CONCLUSION GENERALE

83
 La multiplication des expérimentations et essais effectués dans le cadre du
présent travail a contribué à la conception d'un protocole opératoire général simple,
rapide et efficace pour la minéralisation d'échantillons biologiques (organismes animaux et
végétaux d'origine lagonaire) en vue de mesurer les teneurs en éléments métalliques au sein
de ces matrices. Ce protocole comporte un nombre restreint de procédures opératoires, à
la différence de l'ancienne méthodologie appliquée lors d'une étude préliminaire sur la
bioaccumulation du nickel, chrome et cobalt chez trois espèceslagonaires (BREAU, 1999).

La suppression de l'étape d'évaporation, originellement appliquée après

minéralisation de la matrice biologique (§ V.1. Chap. 3 et annexe 1), conjuguée à l'emploi d'un
système de filtration (préalable au stockage des échantillons) moins contraignant (filtre-
seringue en esters de cellulose) constituent deux modifications majeures à l'origine de la
simplification des procédures opératoires. Ces deux changements opérationnels diminuent
d'autant les étapes de transvasement d'échantillons de récipient en récipient (bombes
téflon type PFA 120 ml, flaconnage en polysulfone du stand de filtration marque
NALGENE...), par rapport à "ancien protocole et réduisent donc les sources potentielles
d'erreurs et de contaminations.

Le gain de temps est également loin d'être négligeable, puisque la réduction de la

durée de l'ensemble des manipulations appliquées sur une série d'échantillons donnée est de
l'ordre de 3 à 4 heures. Cette diminution est essentiellement attribuable à l'élimination de
l'étape d'évaporation. Dans le cas du traitement d'une série de six échantillons, le nouveau
protocole permet d'envisager la réalisation de l'ensemble des procédures opératoires
(pesée, digestion, filtration et stockage avant analyse) en 2 heures maximum, contre 5 à 6
heures avec l'ancienne méthode. Nettoyage et réutilisation du matériel de laboratoire
inclus, la durée de réalisation du protocole opératoire est telle qu'il est désormais
raisonnable de procéder aux traitements et stockage de 24 échantillons par jour (soit 4
séries), contre 12 précédemment. Il convient toutefois de rappeler que l'emploi du procédé
de chauffage micro-ondes sous conditions hyperbares pour la digestion des différentes
matrices reste l'élément essentiel et majeur dans la minimisation de la durée opératoire.
Ce procédé occupe dorénavant une place de choix dans les laboratoires d'analyse et
impliquent progressivement la mise en retrait du mode de chauffage classique sur plaque,
bien que ce dernier soit encore largement appliqué.

La minéralisation totale des échantillons testés démontre également l'efficacité du

protocole par un rendement optimal d'extraction des métaux ultérieurement analysés à
l'ICP-OES (Optima 3300 DV PERKIN-ELMER) ou au four graphite (PERKIN-ELMER). Les
différentes expérimentations effectuées ont permis de sélectionner une solution de
digestion bipartite, composée d'acide nitrique concentré 69':10 et de péroxyde d'hydrogène
30':10, selon une proportion 4 : 1. Cette solution d'attaque montre des compromis avantageux
en comparaison avec les autres mélanges utilisés pour la minéralisation. Elle utilise des
produits relativement peu dangereux à manipuler en laboratoire (pas de réactions
explosives..), peu coûteux, et suffisamment puissants pour digérer complètement les
matrices étudiées et ce, avec un volume d'attaque restreint (5 ml).

Il convient de rappeler également que l'ancien protocole avait été établi sur des
bases empiriques et n'avait pas fait l'objet d'expériences systématiques. Dans le cadre de
cette étude, la rigueur méthodologique appliquée, notamment par l'emploi de matériaux de
référence, permet d'attester de la précision et de la justesse de l'ensemble des

84
procédures opératoires définies et rend compte de la fiabilité et validité des données
extraites par l'application de ce protocole.

L'adaptation de ce protocole général sur des échantillons biologiques marins de

nature très diversifiée s'est avérée concluante. Malgré la diversité des textures et
compositions de chacune de ces matrices, l'ensemble des procédures opératoires assurent
une minéralisation complète des échantillons testés (tissus mous de bivalves, viscères et
téguments d'holothuries, phanérogames et crevettes). Dans le cas ou il subsiste de fines
particules réfractaires à la suite du processus de digestion (minéralisation partielle), des
expérimentations complémentaires ont toutefois prouvé l'efficacité de la procédure par la
confirmation d'un rendement d'extraction optimum des métaux liés à la matrice.

85
86
R~FERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

87
Ayas Z. & Kolankaya D., 1996. "Accumulation of some heavy metals in various environments and
organisms at Gëksu Delta, Turkiye, 1991 - 1993". Bull. Environ. Contam. Toxic., Vol. 56:
65 -72.

Bat l., Raffaelli D. & Marr l.l., 1998. "The accumulation of copper, zinc and cadmium by the
amphipod Corophium volutator(Pallas)". Journ. Of Experimental Mar. Biol. Ecol., Vol. 223:
167 - 184.

Barnbang Y. Thuet P., Charmantier-Daures M., Trilles J.P. & Charmantier G., 1995. "Effect of
copper on survival and osmoregulation of various developmental stages of the shrimp
PenaeusjaponicusBate (Crustacea, Decapoda)". Aquatic Toxicol., Vol. 33: 125 - 139.

Beaud M., 1993. "l'engrenage de la croissance - Etat des lieux des pays industrialisés capitalistes"
dans "l'état de l'environnement dans le monde" : 161 - 165.

Beefting W.G. & Neiuweshuize J., 1986. "Monitoring trace metal contamination in salt marshes of
the westerschelde". Estuary Environ. Monitoring and Assess, Vol. 7: 233 - 240.

Bebbington G.N., Mc Kay N.J., Chvojka R. & Williams R.J. 19n." Heavy metals, selenium and
arsenic in nine species of Australian commercial fish ('. Austr. J Mar. Freswater Res., Vol.
28: 277 - 286.
Bellet 5., 1997. "Mise au point d'une méthode d'extraction du 21OPo par chauffage aux micro-
ondes. Applications à la datation des archives sédimentaires". Rapport de DEA, Univ. De
Pau et des Pays de l'Adour: 50 p.
Besecker K.D' Rhoades C.B. & Jones B.T., 1998. "Closed-vessel Nitric Acid microwave digestion
of polymers". Atomic Spectroscopy, Vol. 19(2): 55 - 59
Binet D. & Boely T' 1981. "Etude de l'impact du projet NORCAl sur l'environnement marin de
Nouvelle-Ca rédonie : phase II-A étude préliminaire". Document ORSTOM.
Bordin G., McCourt J. & Rodr!guez A.( 1992. "Trace metals in the marine bivalve Macoma balthica
in the Westerchelde Estuary the netherlands). Part I : analysis of total copper, cadmium,
zinc and iron concetrations-Iocational and seasonal variations". The science of the Total
Environment, Vol. 127: 255 - 280.
Breau l., 1998. "Extractions séquentielles et analyses des métaux dans une carotte de sédiment
lagonaire datée : mise en évidence de l'évolution des apports terrigènes liés aux activités
humaines'au cours du dernier siècle". Rapport de DEA, Univ. Aix-Marseille II: 60 p.
Breau l., 1999. "Etude préliminaire sur la bioaccumulation du nickel, du chrome et du cobalt chez
trois espèces lagonaires : Gafrarium tumidum, Hyrtios reticulata et Chaetodon speculum'.
Rapport d'activités, programme ECO TROPE 1999: 40 p.
Burgeot T., Bocquéné G., Pi~ray G., Godefroy D., le Grand J., Dimeet J., Marco F., Vincent
F., Hénocque Y., uger-Jeanner H. & Galgani F., 1994. "Monitoring biological effects
of contamination in marine fish along French coasts by measurements of ethoxyresorufin-
O-deethylase activity". Ecotoxicol. And Env. Safety. Sous presse.
Cabon M., Breau l., Fernandez J.M., Badie C. & Fichez R., 1998. "Optimisation of a sequential
extraction scheme for heavy metals in lagoon sediments". ISRS European Meeting,
Perpignan, poster.
Carbonell G., Ramos C. & Tarazona J.V., 1998. "Heavy metals in shrimp culture areas from the
Gulf of Fonseca, Central America. II. Cultured shrimps". Bull. Environ. Contam. Toxicol.,
Vol. 60: 260 - 265.
Chapman P.M., 1995. "Ecotoxicology and pollution - Key issues". Mar. PoIl. Bull., Vol. 31, N° 4 - 12:
167 - 177.
Chave K.E. & Buddemeier R.W., 19n. "A comparative investigation involving coral reef
ecosystems in Hawaii and New Caledonia". Report to the NatIonal Science Foundation U.S.
-France Programme: 21 p.
Clark R.B., 1997. "Marine Pollution". 4 h Edit., Clarendon Press - Oxford: 161 p.
Clavier & Fichez, 1996. "Programme ECOTROPE - Ecosystèmes côtiers du pacifique - Influence
terrigène et anthropique". Ed ORSTOM, Paris: 37p.
Conand C., 1988. "les holothuries aspidochirotes du lagon de Nouvelle-Calédonie. Biologie, ecologie
et exploitation". Thèse doct. Univer. De Bretagne occidentale: 388 p.

88
Cossa D., Bourget E., Pouliot D., Piuze J. & Chanut J.P., 1980. "Geographical and seasonal
variations in the relationship between trace metal content and Dody weight in MytJlus
edulis'. Marine Biology, Vol. 58 : 7 - 14.
Debenay J.P., 1985. "Recherches sur la sédimentation actuelle et les thanatocoenoses des
foraminifères de ~rande taille dans le lagon sud-ouest et sur la marge insulaire de
Nouvelle-Calédonie . Thèse de doctorat, Univ. Aix-Marse/1/e II, Marseille: 200 p.
Denton G.R.W. & Burdon-Jones C., 1986. "Trace metals in fish from the Great Barrier Reef".
Mar. PoIl. Bull., Vol. 17, N°5: 201 - 209.
Denton G.R.W. & Burdon-Jones C., 1986. "Trace metals in corals from the Great Barrier Reef".
Mar. PoIl. Bull., Vol. 17, N°5: 209 - 215.

Depledge M.H. & Rainbow P.S., 1990. "Models of regulation and accumulation of tracemetals in
marine invertebrates". Mini-review, Comp. Biochem. Physiol., Vol. 97: 1 - 7.
De Nordi J.L., 1989. "Etude sur la pollution des eaux côtières dans la zone urbaine de Tahiti".
Rapport CEA-R-5488: 17 p.
Dugas F., 1974. "La sédimentation en baie de St-Vincent". Cahiers ORSTOM, Sér. géol., Vol. IV:
41-62.

Eakins J. D. & Morisson R. T., 1978."A new procedure for the determination of lead-21O in lake
and marine sediments". Int. J Appl. Radiat. Isot., Vol. 29: 531 - 536.
Fichez R., Harris P., Jouen R., Badie C. & Fernandez J.M., 1997. "Sedimentary records
human induced environmental changes in the Tahiti /agoon". In Proceedings of the lf
ot
International Coral Reef Symposium, Panama, Vol. 2: 1833 - 1838.
Flammang P., Warnau M., Temara A., Lane D.J.W. & Jangoux M., 1997. "Heavy metals in
Diadema setosum (Echinodermata, Echinoidea) from Singapore coral reefs". Journal of Sea
Research, Vol. 38: 35 - 45.
Fowler S.W., 1985. "Heavy metal and radionuclide transfer and transport by marine organisms".
Symposia Biologica Hungarica, Vol. 29: 191 - 206.
Fraizier A., Franck D., Benete P., Jouen R. & Debiard J.P., 1985b. "Observations sur diverse~
formes de pol ution du 'agon de Tahiti'~ Proceedings, International Coral Reef Congress, 5'
, InternatIonal Society for Reef Studies, papeete, Tahiti, Vol. 6 : 445 - 451
Gupta S.K. & Chen K.Y., 1975. "Partioning of trace metals in selective chemical. Fractions of near
shore sediments". Environmental7etters, Vol. 10(2) : 129 - 158.
Harris P., 1998."Modifications des caractéristiques chimiques du lagon de Papeete liées à l'activité
humaine : intérêt des traceurs sédimentaires géochimiques et biogéochimiques dans la
reconstitution de J'évolution de l'environnement au cours des 150 dernières années". Thèse
Doct., Univ. Fran. Pac., Papeete: 281 p.
Hutchings P., 1994. "The pacific reefs : A paradise lost ?". Mar. PoIl. Bull. Special issue, Vol. 29:
140p.
KFUPMlRI, 1988. " Final report - assessment of toxicants in selected commercial species of fishes
from the Arabian Gulf ". Water resources and environment div., Research Institute, King
Fahd University of Petroleum andmineraIs, Dhahran, project N° 24109.
Kingston H.M.S. & Jassie L.B., 1988." Introduction to microwave sample preparation ". American
Chemical Society, Washington D.C. : 33 - 51.
Kingston H.M.S., 1998. "Standardization of sample preparation for trace element determination
through microwave-enhanced chemistry". Atomic Spectroscopy, Vol. 19 (2): 27 - 30.
Kumar A., 1988. "The suitability of tropical marine bivalves and corals as indicators of heavy
metals". M. Sc. University of Newcastle upon Tyne.
Launay J., 1970. "Etude des sédiments de la baie de Dumbéa - Résultats préliminaires". Nouméa,
rapport centre ORSTOM: 7 p.
Launoy J., 1972. "La sédimentation en baie de Dumbéa". Cahiers ORSTOM, sér. Géol., V. IV, 1: 25-
51.
Lonzomazino N., Spuig J.C., Suchard T. & Tavanae M., 1993. "Surveillance de la qualité du
milieu marin de la rade et du port de Papeete". Rapport RT DPHD/LESE 92-5: 110 p.
Loring D.H. & Rantala R.T.T., 1977." Geochemical analyses of marine sediments and suspended
~articulate matter ". Fisheries and Marine service, Environment Canada, technicaf report
700: 58p.

89
Libes S.M., 1992. "Marine biogeochemistry : An overview". In "An introduction to marine
biogeochemistry': ed John wiley& Sons: 367 - 394.
Lim P.E., Lee C.I(. & Din Z., 1995. "Accumulation of heayy metals by cultured oysters from
Merbok Estuary. Malaysia". Mar. Poil. Bull., Vol. 31, N° 4-12: 420 - 423.
Magand O., Courp T., Douillet P., Fernandez JM & Fichez R., 1998. «transfer of suspended
particulate matter of continental and lagoon in New-Caledonia : preliminary qualitative and
quantitative results». IsRs European meeting Perpignan, poster.
Ma9and O., 1999. «Recherche et définition des signatures géochimiques {métaux lourds et terres
rares) des sources terrigènes du lagon sua-ouest de Nouvelle-Caledonie».Rapport de DEA,
Univ. Aix-Marseille II: 00 p.
McCarthy J.F., 1990. "Concluding remarks : Implementation of a biomarker-based environmental
monitorin9.- program". Chap. XXIII, In "Biomarkers of environmental contamination". Mc
Carthy J.F. & Shugart L.R., 1990, Lewis Publishers: 429 - 439.
Miramand P. & Guary J.C., 1980. "High concentrations of some heavy metals in tissue of the
mediterranean octopus". Bull. envir. Contam. Toxic., Vol. 24: 783 - 788.

Miramand P. & Bentley D., 1992. "Concentration and distribution of heavy metals in tissues of two
cephalopods, Eledone cirrhosa and Sepia officinalis, from the french coast of the English
channel". Mar. Bio/., Vol. 114: 407 - 414.
Nalovic Lj. & Segalen P., 1973. "Relations entre le fer et les éléments traces de transition dans un
certain nombre de minéraux ferrifères". cahiers ORsTOM, série pédologie, V. XI, 2: 181-
191.
OCDE, 1991. "L'état de l'environnement". rapport, Paris.
Oxley W.G., 1997. "$.gmpli'!9 design and monitoring". In "survey manual for tropical marine
ressources': Z'" ed. English S., Wilkinson C & Baker v., AIMs, Townsville: 307 -321.
Poli G., Delesalle B., Gabrie C., Montag9ioni L., Monteforte M., Naim O., Payri C., Richard G.
& Trondle J., 1984. "Etude ce l' environnement la~onaire et secteur urbain - Evolution
des pollutions et des dégradations". Convention 81525 Territoire de la Polynésie Française,
Naturalia et Biologia : 110p.
Rainbow P.S., 1995. "Physiology, physicochemistry and metal uptake - A crustacean perspective".
Mar. Poil. Bul/., Vol. 28: 55 - 59.

Rainbow P.S., 1996. "Heavy metals in auqatic invertebrates". In" Environmental contaminants in
wildlife" Beyer WN, Heinz GH, Redmon-Norwood K (eds), Chal'. 18, Lewis Publishers, Boca
Raton, Florida : 405 - 425.

Richer de Forges B. & Hoffschir C., 2000.« Base de données sur la biodiversité marine littorale
de Nouvelle-Calédonie ». Catalogues Sciences de la mer, Biologie Marine, Centre IRD de
Nouméa, n02: 56 p.
Rooney, Price & Judell, 1989. "Investigations into marine sediments, water column and biota in
New-Caledonia exposure". Rapport non publtë transmis à l'ORS TOM, Nouméa.
Sadiq M., Zaidi T.H. & Sheikheldin S., 1995." Concentrations of metals of health significiance in
commonly consumed shrimps in the eastern province of Saudi Arabia". J. environ. Sei.
Health, A30(l): 15 - 30.
Salvat B., 1997. "Human impacts on coral reefs : facts and recommendations". Pub EPHE, Moorea:
253p.
SASO, 19na. "Canned Tuna" saudi Arabian Standards ssA 47/1397 H, U.D.C 664.951.6, saudi
Arabian Standards Organization, Kingdom of Arabia.
SASO, 19nb. "Canned shrimps (prawns)" saudi Arabian Standards ssA 46/1397 H, U.D.C
664.951.7, Saudi Arabian standardsOrganization, Kingdom of Arabia.
SASO, 1980a. "Canned mackerel". saudi Arabian Standards ssA 161/1980 H, U.D.C 664.951.227.2,
saudi Arabian Standards Organization, Kingdom of Arabia.
SASO, 1980b. "Canned sardines". saudi Arabian Standards ssA 162/1980 H, U.D.C 664.951.622.5-
saudi Arabian Standards Organization, Kingdom of Arabia.
Sharif A.I(.M., Mustafa A.l., Mirza A.H. & Safiullah S;J 1991. "Trace metals in tropical fish
from one bay of Bengal". The Science of the Total environment, Vol. 107: 135 - 142.

90
Silva C.D. & Qasim S.Z., 1979. "Bioaccumulation and Elimination of copper in the Rock oyster
Crassostrea cucul/atd'. Marine Bi%gy, Vol. 52: 343 - 346.
Skerfving S .• 1972." Mercury in fish - some toxicological considerations". Fed Cosmet. Toxicol.,
Vol. la : 545 - 566.
Tariq J .• Jaftar M. & MOGZzam M., 1991. "Concentration correlations between major cations and
heavy metals in fish from the Arabian Seo". Mar. Poil. Bull., Vol. 22, N° 11 : 5b2 - 565.
Tessier A.• Campbell P.G.C .. & Bisson M' 1979. "Sequential procedure for the speciation of
particulate trace meta/s". Ana/yticaI Chemistry, Vol. 51: 844 - 851.
UNEP. 1991. "Environnmental data report 1991 - 1992". BasIl B/akwe/I, Oxford
Usera J .• Gonzalez-Regalado E. & Gracia I .• 1996. "Trace metals in the bivalve mollusc chamelea
gallina from tne Atlantic coast of southern spain". Mar. Po/1. Bu/l., Vol. 32: 305 - 310.
Vandecasteele C. & BLOC C.B .• 1993. "Modern methods for trace elements determination". John
WlÏey and Sons.

91
 ANNEXE 1

DESCRIPTIF DES PROTOCOLES OPERATOIRES

• Ancien protocole général utilisé pour les études préliminaires (1999)

• Nouveau protocole général utilisé pour les matrices biologiques

(2000)

• Protocole général employé pour les tissus mous de bivalves

• Protocole général employé pour les viscères et téguments

d' holothuries

• Protocole général employé pour les caulerpales

•
 [ Peser environ 500 mg d'échantillons, à l'aide d'une spatule en téflon, dans une bombe en
téflon de type MF (100 ml) préalablement référencée (dates, n°...) J

~
[ Verser progressivement X mil d'acide ou de cocktail d'acides
(PROLABO - qualité NORMA TOM 1) dans la bombe J
~
Laisser reposer l'échantillon le temps de l'émulsion

~
Après agitation manuelle, fermer les bombes avec un bouchon muni d'une valve de
sécurité et les placer dans un cylindre en céramique

~
[
Placer les cylindres en céramique sur un carroussel 6 places du four micro-ondes de
modèle ANTON-PAAR B30MC09A - PERKIN ELMER l
~
[ Appliquer le programme de digestion correspondant à la matrice étudiée

~
Une fois le programme terminé, sortir et déboucher précautionneusement les bombes
[ sous un système de forte ventilation ( !! relarguage de vapeurs acides importantes ,!! ) 1

~
tran""""erla solution d'attaque et le résidu potentiel dans une bombe téflon de type PFA )
(marque CEM - volume 120 ml)

~
Evaporer à 90-95'Y0 la solution d'attaque au bain-marie à 95°C, et reprendre (dissolution)
l'échantillon avec 5 -10 ml HCI 0,5 M (PROLABO - qualité NORMATOM 1)

r'--
Séparer les phases liq/sol avec un stand de filtration (flaconnage en polysulfone -
marque Nalgène) pourvu de filtres Millipore (0,45 microns) de 47mm de diamètre
J
Récupérer le surnageant dans une fiole jaugée 25 ml, compléter avec HCI (PROLABO -
qualité NORA TOM 1) 0,5 M et transférer la solution dans un flacon Nalgène 30 ml

C
Stocker la solution contenant les métaux extraits dans le réfrigérateur à 2 - 4°C
jusqu'à analyse à l'ICP-OES Optima 3300 DV PERKIN ELMER
l
.-/

•
Ancien protocole général utilisé pour les études préliminaires (1999)
 [ Peser environ 500 mg d'échantillons, à l'aide d'une spatule en téflon, dans une bombe en
téflon de type MF (100 ml / 35 bars) préalablement référencée (dates, n°...) 1

i
Verser progressivement X ml d'acide ou de cocktail d'acides
(PROLABO - qualité NORMATOM 1) dans la bombe )
i
Laisser reposer l'échantillon le temps de l'émulsion

.
Après agitation manuelle, fermer les bombes avec un bouchon muni d'une valve de
( sécurité et les placer dans un cylindre en céramique

Placer les cylindres en céramique sur un carroussel 6 places du four micro-ondes de

[ modèle ANTON-PA AR B30MC09A - PERKIN ELMER

1
1 Appliquer le programme de digestion correspondant à la matrice étudiée 1

i
Une fois le programme terminé, sortir et déboucher précautionneusement les bombes
r sous un système de forte ventilation ( !i relarguage de vapeurs acides importantes !i ) 1

,- "
~ Séparer les phases liq/sol par filtration avec des filtres-seringues (cartouche stérile
jetable - Diam. 25mm) en PVC et des filtres Millipore d'esters de cellulose (0,45 microns)
l
- ~.-

"
Récupérer le surnageant dans une fiole jaugée 25 ml, compléter avec de l'eau
déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 Mohm.cm-1).
Transférer la solution dans un flacon Nalgène (HDPE) 30 ml
]
[
Stocker la solution contenant les métaux extraits dans le réfrigérateur à 2 - 4°C
jusqu'à analyse à l'ICP-OEs Optima 3300 DV PERKIN ELMER
J
Nouveau protocole général utilisé pour les matrices biologiques (2000)
 Peser environ 200-300 mg d'échantillons de bivalves *, à l'aide d'une spatule en téflon,
dans une bombe en téflon de type MF (100 ml / 35 bars) préalablement référencée

* Dans le cas ou la quantité d'échantillons à digérer ne peut atteindre 200 mg,

mettre l'échantillon individuel de bivalves en tièrement dans la bombe.

•
Verser progressivement 4ml d'acide nitrique concentré 69~o (PROLABO - qualité
NORMATOM 1) + 1ml de péroxyde d'hydrogène 30~o dans la bombe

Laisser reposer l' échanti lion le temps de l'émulsion

Après agitation manuelle, fermer les bombes avec un bouchon muni d'une valve de
[ sécurité et les placer dans un cylindre en céramique

,Ir
Placer les cylindres en céramique sur un carroussel 6 places du four micro-ondes de
r modèle A'NTON-PAAR B30MC09A - PERKIN ELMER 1

,Ir
Appliquer le programme de digestion UsER 018M
(100 - 1000 W en 5mn; 1000 W pendant lOmn; lOmn de refroidissement des bombes)

Une fois le programme terminé, sortir et déboucher précautionneusement les bombes

sous un système de forte ventilation ( !! relarguage de vapeurs acides importantes!! )

Séparer Iles phases liq/sol par filtration avec des filtres-seringues (cartouche stérile 1
jetable - Diam. 25mm) en PVC et des filtres Millipore d'ester de cellulose (0,45 micronsl)

l ' -.
Récupérer le surnageant dans une fiole jaugée 25 ml, compléter avec de l'eau
déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 Mohm.cm-1).
Transférer la solution dans un flacon Nalgène (HDPE) 30 ml J
(
Stocker la solution contenant les métaux extraits dans le réfrigérateur à 2 - 4°C
jusqu'à analyse à l'ICP-OEs Optima 3300 DV PERKIN ELMER ou au four graphite
J
Protocole général employé pour les tissus mous de bivalves
 Peser environ 200-300 mg d'échantillons d' holothuries (viscères ou téguments) *,
à l'aide d'une spatule en téflon, dans une bombe en téflon de type MF (100 ml / 35 bars)
préalablement référencée

* Dans le cas ou la quantité d'échantiUons à digérer ne peut atteindre 200 mg,

mettre l'échantillon individuel de bivalves en tièrement dans l'a bombe.

•
Verser progressivement 4ml d'acide nitrique concentré 69/0 (PROLABO - qualité
NORMATOM 1) + Iml de péroxyde d'hydrogène 30% dans la bombe

~
Laisser reposer l' échanti lion le temps de l'émulsion

'F
Après agitation manuelle, fermer les bombes avec un bouchon muni d'une valve de
[ sécurité et les placer dans un cylindre en céramique 1

Placer les cylindres en céramique sur un carroussel 6 places du four micro-ondes de

1 modèle ANTON-PAAR B30Me09A - PE,RKIN ELMER ]

i Appliquer le programme de digestion USER 018M

(100 - 1000 Wen 5mn; 1000 W pendant lOmn; lOmn de refroidissement des bombes)

Une fois le programme terminé, sortir et déboucher précautionneusement les bombes

sous un système de forte ventilation ( !! relarguage de vapeurs acides importantes Il ) )
~ .. _-

( Séparer les phases Iiq/sol par filtration avec des filtres-seringues (cartouche stérile î
lletable - Diam. 25mm) en pve et des filtres MjUlipore d'ester de cellulose (0,45 microns~

[ Récupérer l'e surnageant dans une fiole jaugée 25 ml, compléter avec de Il' eau
déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 Mohm.cm-l).
Transférer la solution dans un flacon Nalgène (HDPE) 30 ml J
l
Stocker la solut,ion contenant les métaux extraits dans le réfrigérateur à 2 - 4°e J
[ jusqu'à analyse à l'Iep-oES Optima 3300 DV PERKIN ELMER ou au four graphite

Protocole général employé pour les viscères

et téguments d'holothuries
 Peser environ 200-250 mg d'échantillons de Caulerpales *, à l'aide d'une spatule en
téflon, dans une bombe en téflon de type MF (100 ml / 35 bars)
préalablement référencée

* Dans le cas ou la quantité d'échantillons à digérer ne peut atteindre 200 mg,

mettre l'échantillon individuel de bivalves en tièrement dans la bombe.

•
Verser progressivement 4ml d'acide nitrique concentré 69/0 (PROLABO - qualité
NORMATOM 1) + 1ml de péroxyde d'hydrogène 30/0 dans la bombe

Laisser reposer l' échanti lion le temps de l'émulsion

Après agitation manuelle, fermer les bombes avec un bouchon muni d'une valve de
( sécurité et les placer dans un cylindre en céramique

Placer les cylindres en céramique sur un carroussel' 6 places du four micro-ondes de

modèle ANTON-PAAR B30MC09A - PERKIN ELMER 1

"
r Appliquer le programme de digestion USER 018M
1 (100 - 1000 Wen 5mn; 1000 W pendant 10mn; lOmn de refroidissement des bombes) 1

"
Une fois le programme terminé, sortir et déboucher précautionneusement les bombes
[ sous un système de forte ventilation ( !! relarguage de vapeurs acides importantes !! ) J

~
G
Séparer les phases liq/sol par filtration avec des filtres-seringues (cartouche stérde
jetable - Diam. 25mm) en PVC et des filtres Millipore d'ester de cellulose (0,45 microns)
J
[ Récupérer le surnageant dans une fiole jaugée 25 m'l. compléter avec de l'eau
déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 Mohm.cm-1).
Transférer la solution dans un flacon Nalgène (HDPE) 30 ml

~
J
(
Stocker la solution contenant les métaux extraits dans le réfrigérateur à 2 - 4°C
jusqu'à analyse à l'ICP-OES Optima 3300 DV PERKIN ELMER ou au four graphite
J
Protocole général employé pour les Caulerpales
 ANNEXE 2

DESCRIPTIF DE PRECAUTIONS A PRENDRE

LORS DES PROCEDURES OPERATOIRES

 Etape de collecte des échantillons

- bacs de récolte:
• Nettoyer à j'eau de Javel après chaque récolte puis rincer soigneusement.
• Rincer avec de l'eau de mer du site juste avant d'y placer les organismes récoltés.

- bidons servant au prélèvement d'eau de mer du site:

• Décontaminer avec HCI 5 'Yo pendant plusieurs heures avant la première utilisation puis
rincer avec de l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1).
• Rincer avec de l'eau du robinet, puis de l'eau déminéralisée(Barnstead, résistivité 17.7
MQ.cm-1) après chaque récolte.
• Rincer avec de l'eau de mer du site juste avant le prélèvement.

- sachets servant au stockage des organismes pendant la récolte:

• Rincer avec HCI 5 'Yo avant la première utilisation puis à l'eau déminéralisée (Barnstead,
résistivité 17.7 MQ.cm-1).
• Rincer avec de l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1) après chaque
récolte.

Etape de rinçage des organismes

• Dès l'arrivée au laboratoire, chaque spécimen est débarrassé de son éventuelle épibiose
puis rincé soigneusement dans différents bains d'eau de mer du site, puis d'eau de mer
prélevée hors du lagon (sur la pente externe du récif barrière, à 7 m de profondeur grâce
à une pompe à membrane) et précédemment filtrée à 0,45 J,Jm. Ce rinçage est destiné à
: éliminer les particules sédimentaires adhérentes, principales sources de contamination de
l'échantillon.

Etape de dépuration des bivalves et gastéropodes

• Pendant toute la durée de cette dépuration, l'eau du bac est filtrée en continu (filtre
EHEIM Professionnel), mécaniquement (filtres en ouate et mousse synthétique) et
chimiquement (sur une couche de charbon actif en granules) afin d'empêcher les mollusques
de se nourrir tout en conservant une qualité d'eau acceptable.
• Avant la première utilisation, décontaminer tout le matériel avec une solution d'HCI à 5 'Yo
(VIV), puis rincer avec de l'eau déminéralisée station.
• Entre chaque opération, nettoyer l'aquarium et le matériel avec HCI 5 'Yo puis rincer à "eau
déminéralisée station.

Etape de conditionnement des échantillons

Selon l'espèce, le conditionnement des échantillons immédiatement après l'étape de

rinçage diffère:
• Les algues entières ainsi que les morceaux d'éponges et d'alcyonnaires après dissection
sont transférés directement dans un sachet en plastique individuel, de type Whirl-Pak ou
Fisherbrand, précédemment référencé (code incluant l'espèce, l'identification individuelle
et la station de prélèvement).
• Les holothuries sont placés individuellement dans des sachets en plastique à usage
alimentaire pourvus d'une ouverture zip et précédemment rincés avec HCI 5'Yo puis à "eau
 déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1), afin d'être sacrifiés par congélation à
-25°C avant leur dissection
• Les mollusques sont placés en commun dans des sacs en polyéthylène précédemment
référencés afin d'être sacrifiés par congélation à -25°C avant leur dissection. Les oursins
débarrassés de leurs piquants (pointes cassées lors de la récolte, puis partie restante
découpée avec une paire de ciseaux dès le retour au laboratoire) sont traités de façon
identique.
• Après décongélation à température ambiante puis dissection, les échantillons de
mollusques, d'holothuries et d'oursins sont transférés dans un sachet en plastique
individuel, de type Whirl-Pak ou Fisherbrand, référencé selon le code décrit
précédemment, puis à nouveau stockés en chambre froide à -25°C.

Etape de dissection

• Rincer les pinces de dissection (acier inoxydable recouvert d'une couche de téflon) à l'eau
déminéralisée entre chaque échantillon, puis décontaminer dans une solution à 2'Yo de
détergent (marque Count-Off, NEN), rincer à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité
17.7 MQ.cm-1) puis sécher à l'étuve (idem pour le büchner).
• Changer fréquemment les lames de scalpel en acier inoxydable lors des dissections.

Etape de pesée des échantillons après lyophilisation

• Utiliser des pinces en acier inoxydable recouvert d'une couche de téflon.

• Effectuer les pesées dans une coupelle en téflon précédemment décontaminée dans un
bain d'acide nitrique 10'Yo pendant plusieurs heures puis rincée à l'eau déminéralisée
(Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1).
• Rinçer à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1) et sécher au papier le
matériel entre chaque pesée
• Limiter le temps de pesée afin d'éviter une éventuelle contamination atmosphérique

Etape de broyage des échantillons lyophilisés

• Décontaminer le bol et le mortier avant la première utilisation dans un bain de Count-Off

2'Yo pendant 24 h
• Rinçage du bol et du mortier à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1)
puis à l'éthanol absolu (P.A, Merck) entre chaque broyage, puis sécher le bol à l'étuve
(Memmert) à 65°C
• Pour la récupération de l'échantillon après broyage, utiliser un pinceau pour décoller la
poudre du bol vers un entonnoir en téflon préalablement rincé à "eau déminéralisée
(Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1) et décontaminé à l'éthanol absolu P.A.

Etape de pesée des échantillons lyophilisés, broyés et homogénéisés

• Lors du transfert des bombes et des échantillons pour la pesée, ne pas oublier de fermer
les bombes avec les bouchons (valve de sécurité) pour éviter toute contamination
extérieure.
• Rincer abondamment à l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-1) la
spatule en téflon entre chaque groupe d'échantillons différents, et sécher.
•
• Nettoyer la balance (acétone..) après les pesées, afin d'éviter toute source de
contamination potentielle pour de futures pesées, ainsi que les reproches de vos collègues
de travail.
• Refermer hermétiquement et rapidement les sachets contenant la poudre d'échantillons
lyophilisés afin d'éviter toute réhydratation.

Etape de digestion

III Les procédures suivantes s'effectuent toujours sous les hottes III
• Ajouter les acides ou produits oxydants dans les bombes, ml par ml, en cas de réactions
violentes (effervescences) et laisser reposer quelques minutes l'échantillon le temps de
l'émulsion.
• Une fois le programme de digestion terminé au four micro-ondes, attendre que la
température des bombes soient inférieures à 60°C, pour des raisons évidentes de sécurité.
• Une fois revenues à des températures correctes, déboucher précautionneusement les
bombes sous un système de forte ventilation, avec la hotte baissée (relarguage important
de vapeurs acides).
• Avant toute autre manipulation, laisser reposer l'échantillon sous la hotte, afin d'éliminer
la majorité des vapeurs libérées.

Etape de filtration

• Utiliser 1 filtre-seringue (usage unique) par échantillon, 1 seringue et 1 coupelle en téflon

pour 6 échantillons (par série ou « RUN »).
• Rincer les bombes en téflon avec de l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7
MQ.cm-l) et filtrée l'eau de rinçage en 3 fois, afin de limiter les pertes d'échantillons sur
les parois des bombes.

Rappel: Il vaut mieux rincer en 3 fois qu'en 1 fois avec une quantité plus importante d'eau
déminéralisée; le rinçage des bombes, de la coupelle en téflon et de la seringue est plus
efficace.

• Entre chaque échantillon, rincer abondamment 3 fois la seringue et son embout en téflon
avec de l'eau déminéralisée (Barnstead, résistivité 17.7 MQ.cm-l), ainsi que la coupelle en
téflon dans laquelle les échantillons sont versés avant d'être filtrés.
 ANNEXE 3

ILLUSTRA TION DE QUELQUES PROCEDURES

OPERATOIRES ET APPAREILLAGES
 Photo 1

.......

Photo 2

Photo 1 : Découpage des épines d'un individu de l'espèce « Diadema setosum» (échinoderme)
fraichement prélevé, avant sacrifice de l'animal par congélation. Ce prétraitement facilite la
procédure ultérieure de dissection.

Photo 2 : Séparation des viscères et du tégument d'un individu de l'espèce « Holothuria edulis»
(échinoderme) lors de l'étape de dissection.
+
 Photo 3

Photo 4

Photo 3: Présentation du lyophilisateur BIOBLOCK. Les sachets vynil (Whirl-pak) légèrement

entrouverts, dans lequels sont placés les échantillons congelés, sont disposés sur des plateaux en
aluminium (4 plateaux au maximum dans le lyophilisateur).

Photo 4 : Présentation du broyeur mécanique RM 100 RETSCH.

 Photo 5

Photo 6

Photo 5: Présentation des bombes en téflon 100 ml de type MF (à droite de la photo) (digestion
des échantillons), et des compartiments en céramique (à gauche de la photo) dans lesquelles sont
logées les bombes lors du passage au four micro-ondes ANTON-PAAR PERKIN-ELMER.

Photo 6 : Etape de pesée des échantj lions.

 Photo 7

Photo 8 &9

Photo 7: Présentation du four micro-ondes ANTON-PAAR PERKIN-ELMER.

Photo 8 & 9 : Etape de filtration, avec aspiration de la solution (coupelle en téflon) issue du
processus de digestion (à gauche de la photo) à l'aide d'une seringue en polyéthylène, et filtration
« proprement dite» de la solution avec un filtre-seringue (à droite de la photo).
•

Photo 10

Photo 10: Présentation de nep-OES Optima 3300 DV.

•
Centre IRD de Nouméa
B.P. A5 Nouméa Cédex, 98848, Nouvelle-Calédonie
© IRD 2000