THESE

En vue de l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivré par l’INSA de Toulouse

Spécialité : Génie des Procédés de l’Environnement

Présentée et soutenue par

Maëlle DOUAIRE
Le 9 Décembre 2010

ETUDE EXPERIMENTALE ET NUMERIQUE DE LA REPONSE DE

LACTOCOCCUS LACTIS NCDO2118 AUX CONDITIONS
HYDRODYNAMIQUES LOCALES EN REACTEUR COUETTE

JURY

Jack LEGRAND Professeur, GEPEA, Nantes Rapporteur

Benoît HAUT Professeur, Université libre de Bruxelles, Brussels Rapporteur
Nic LINDLEY Directeur de recherche, CNRS, INSA, Toulouse Examinateur
Pascal LOUBIERE Directeur de recherche, INRA, Toulouse Co-directeur
Jérôme MORCHAIN Maître de Conférences, INSA, Toulouse Co-directeur

Ecole doctorale : Mécanique, Energétique, Génie Civil, Procédés

Unité de recherche : Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés

1
2
RESUME

Cette thèse présente les résultats de travaux visant à étudier les interactions entre les conditions
hydrodynamiques et le comportement bactérien en bioréacteur. En s'intéressant plus particulièrement
aux phénomènes agissant aux petites échelles, nous avons cherché à identifier, caractériser et quantifier
les couplages hydro-bio à l'échelle de la cellule. Ici, la souche Lactococcus lactis a été choisie comme
modèle microbiologique, alors qu’un réacteur de type Couette a été préféré afin d’engendrer des
contraintes hydrodynamiques connues et définies. Il a été démontré que dans des conditions spécifiques
d’écoulement (Modulated Wavy Vortex Flow), les bactéries lactiques s’agrègent au sein d’une matrice
riche en polysaccharides. Le lien entre ce phénotype atypique et les contraintes locales liées à
l’écoulement a été étudié { l’aide de simulation numérique directe de l’écoulement combiné { un suivi de
particule. Cette approche permet d’établir les profils temporels des contraintes subies et de comparer la
nature des forces disruptives subies au mécanisme d’agrégation séparation des cellules bactériennes au
sein de leur matrice. Ce travail de recherche donne ainsi d’autres exemples d’interactions cellule –
environement en bioreacteurs, mettant en exergue des effets mécaniques.

Mots clés : Réacteur Couette, Lactococcus lactis, hydrodynamique locale, dissipation d’énergie,
interaction.

ABSTRACT

The aim of this work is to reach a better understanding of environmental effects on bacterial behaviour in
bioreactors. Particular attention has been paid to hydrodynamically-induced stresses at the cell scale,
with a view to characterizing and quantifying these local interactions. As a “model experiment”,
Lactococcus lactis NCDO2118 has been cultivated in a Couette

Bioreactor, a device generating a known and defined flow field. Under specific flow regime (Modulated
Wavy Vortex Flow), the cells end up being entrapped in a polysaccharidic matrix. The phenotype of the
cells has been demonstrated to be strongly affected by the flow conditions. The stress signal encountered
by the cells has been characterized, through umerical simulation (Direct Numerical Simulation) and
lagrangian particle tracking, and linked to the phenotypic expression. These studies provide further
examples of bacterial response to local hydrodynamic conditions.

Key words: Couette bioreactor, Lactococcus lactis, local hydrodynamics, energy dissipation, interaction.

3
4
REMERCIEMENTS

J’ai réalisé ma thèse au sein du Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des
procédés, dont je tiens { remercier le directeur Nic Lindley pour m’y avoir accueillie. Je
voudrais également adresser un merci particulier à mes directeurs de thèse, Jérôme
Morchain et Pascal Loubière, ainsi qu’{ Alain Liné pour leurs conseils et
encouragements, et aussi pour toutes les discussions animées que ce projet de
recherche a entrainé.

Je tiens également à remercier les membres de mon jury, tout particulièrement Benoît
Haut et Jack Legrand pour avoir accepté de rapporter ma thèse. Merci aussi à Eric
Olmos, malheureusement victime de la neige (pas faute d’avoir essayé de se rendre {
Toulouse) pour le jour J, sans qui je n’aurais pas eu connaissance de cette opportunité.

Une pensée chaleureuse à tous ceux qui ont permis la réalisation de ce travail dans la
bonne humeur, tant chez les ‘bio’ qu’au ‘hall’. Un merci spécial { Valérie et Myriam pour
leur aide, leur disponibilité, leur rigueur et leurs conseils précieux.

Autre merci spécial { tous ceux qui m’ont aidé { démonter mon réacteur Couette quand
il se faisait capricieux. J’ai plus les chronos en tête mais il me semble que Jan et Jillian
avaient battu des records.

Je voudrai aussi remercier mes copines de gamelles, Marlène, Charlotte, Christelle,

Nathalie, Fanny et plus généralement tous ceux qui ont contribué à la bonne ambiance
de la cafèt’.

Une pensée affectueuse pour mes comparses du bureau, dans lequel il en est passé des
thésards, post docs, stagiaires… mention spéciale { Ben « double B », Séb, Charlotte, Flo,
Mallorie, JC, … et aussi pour l’équipe de Auch où j’ai effectué la totalité de mes vacations,
Babé, Géraldine, Cathy, Fred, Domi et les autres.

5
Une pensée spéciale à la « thésarde d’avant moi », Angélique, rencontrée en pleine
rédaction de sa thèse et néanmoins disponible pour accompagner mes 1ers pas dans ce
laboratoire et plus spécifiquement dans cette thématique de recherche.

Je ne voudrais pas oublier les copains et copines, ceux du labo, ceux des apéros d’après
le labo, et ceux d’ailleurs (Ben, Emeu, Voisin Pierrot et ses ‘tit punchs, Sam, et j’en
oublie)

Un merci tout spécial { Jan et Marlène (et leur futon) sans lesquels je n’aurais pas vécu
mes dernières soirées de thésarde de la même façon.

Autre merci spécial pour Françoise et son forfait illimité, qui nous a permis de partager
nos hauts et nos bas de thésardes, les petites et grandes joies, ainsi qu’{ Amélie pour
l’approche non scientifique.

Je ne voudrais par terminer sans remercier ma famille, qui a supporté sans broncher ma
soutenance – c’est bon, maintenant, vous pouvez m’avouer qui s’est endormi ! En
particulier Madé et ses conseils avisés pleins d’expérience, et surtout mes parents pour
leur soutien et leurs encouragements.

Finally, I am especially thankful to Jon who managed to bear me in “writing up” mode,
his lunch boxes (I never ate so many curries!), his nerdiness (Matlab...) and his constant
and loving care.

6
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................ 5

TABLE DES MATIERES .................................................................................................................................... 7

NOMENCLATURE ........................................................................................................................................... 13

ABRÉVIATIONS ............................................................................................................................................... 15

INTRODUCTION .............................................................................................................................................. 17

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................. 21

1 LES INTERACTIONS HYDRO – BIO............................................................................................................. 22

1.1. Introduction : les différents types de mécanismes et de réponse .................................................. 22
1.2. Le couplage mélange - réaction .................................................................................................... 24
1.2.1. Le mélange turbulent................................................................................................................................ 24
1.2.2. Modélisation du micromélange ................................................................................................................ 30
1.2.3. Outils de caractérisation du mélange ........................................................................................................ 30
1.2.4. Caractérisation des effets de mélange et conséquences sur la réaction biologique ................................... 31
1.2.5. Conclusion partielle ................................................................................................................................. 38
1.3. Effets des contraintes hydrodynamiques ....................................................................................... 40
1.3.1. Quelles sont les contraintes hydrodynamiques en bioréacteurs ................................................................ 41
[Link]. Expression des contraintes ............................................................................................................. 41
[Link]. Application aux bioréacteurs et lien avec la dissipation d’énergie ................................................ 46
[Link]. Notions de rhéomécanique et viscoélasticité ................................................................................. 48
[Link]. Propriétés des bioparticules et interactions avec l’écoulement ...................................................... 52
[Link]. Phénomènes d’agrégation et d’adhésion ........................................................................................ 54
1.3.2. Effets des contraintes hydrodynamiques sur des cellules en bioréacteurs ................................................ 56
[Link]. Effets des contraintes liées à l’écoulement sur des cellules en suspension .................................... 56
[Link]. Impact de la structure de l’écoulement et des contraintes sur les populations bactériennes .......... 61
1.4. Réponse biologique ....................................................................................................................... 64
1.4.1. Du phénotype au génotype ....................................................................................................................... 65
1.4.2. Influence de la biologie sur son environnement ....................................................................................... 69
1.5. Conclusion – transition : Quelles sont les contraintes imposées quant aux outils choisis pour
l’étude des interactions hydro - bio............................................................................................................. 69
2 ETUDE DES INTERACTIONS HYDRO – BIO A TRAVERS DES CULTURES DE LACTOCOCCUS LACTIS EN
REACTEUR COUETTE ......................................................................................................................................... 71

2.1. Réacteur couette ........................................................................................................................... 71

2.1.1. Présentation .............................................................................................................................................. 71
2.1.2. Hydrodynamique dans un réacteur Couette.............................................................................................. 72
[Link]. Ecoulement laminaire .................................................................................................................... 73
[Link]. Vortexde taylor : écoulement toubillonnaire.................................................................................. 73

7
 [Link]. Ecoulements tourbillonaires ondulants (Wavy Vortex flows) ....................................................... 74
[Link]. Ecoulements tourbillonnaires turbulents et écoulement turbulent ................................................. 74
2.1.3. Effets de mélange dans un réacteur Couette ............................................................................................. 75
2.1.4. Cultures bactériennes et cellulaires .......................................................................................................... 77
2.1.5. Agrégation et floculation .......................................................................................................................... 78
2.2. Lactococcus lactis NCDO 2118 .................................................................................................... 79
2.2.1. Présentation et quelques généralités ......................................................................................................... 79
2.2.2. Catabolisme des sucres et shift métabolique de L. lactis NCDO 2118 ..................................................... 80
[Link]. Devenir des sucres en amont du pyruvate ...................................................................................... 80
[Link]. Devenir du pyruvate ...................................................................................................................... 83
[Link]. Shift métabolique chez L. lactis NCDO 2118 ................................................................................ 85
2.2.3. Les mécanismes de réponses au stress chez L. lactis ............................................................................... 86
2.2.4. EPS et PS chez L. lactis ........................................................................................................................... 88
[Link]. Quelques définitions ...................................................................................................................... 88
[Link]. Rôle des EPS et intérêt .................................................................................................................. 89
[Link]. Structure et composition des exopolysaccharides. ......................................................................... 90
[Link]. Production d'EPS par les bactéries lactiques / voies de synthèse ................................................... 91
2.2.5. Propriétés d'adhésion................................................................................................................................ 94
[Link]. Composition de la paroi et état de surface, propriétés fonctionnelles ............................................ 94
[Link]. Facteurs favorisant l’adhésion chez L. lactis ................................................................................ 96
[Link]. Adhésion, biofilm, et croissance immobilisée ............................................................................... 97
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES D’ETUDE ........................................................................................ 98

ANALYSE DU COUPLAGE MELANGE – REACTION ET ETUDE DE CAS SUR DES CULTURES

DE L. LACTIS NCDO 2118 EN REACTEUR COUETTE ........................................................................... 101

1 ANALYSE PRELIMINAIRE ....................................................................................................................... 102

1.1. Comparaison des échelles spatio-temporelles et identification des phénomènes limitants ........ 102
1.2. Echelles de mélange dans le réacteur Couette et effet de la dissipation..................................... 105
2 RESULTATS EXPERIMENTAUX ............................................................................................................... 107
2.1. Cultures réalisées en microaérophilie ........................................................................................ 107
2.1.1. Croissance .............................................................................................................................................. 107
2.2. Métabolisme ................................................................................................................................ 109
2.3. Cultures anaérobies .................................................................................................................... 113
2.3.1. Croissance .............................................................................................................................................. 113
2.3.2. Métabolisme ........................................................................................................................................... 115
3 DISCUSSION .......................................................................................................................................... 118
3.1. Production de formiate et conditions de culture ......................................................................... 118
3.2. Effet du mélange au niveau de l’apport de glucose .................................................................... 119
3.3. Effet du mélange au niveau de l’apport d’oxygène ..................................................................... 121
3.4. Conditions d’écoulement et croissance de L. lactis NCDO 2118 ............................................... 122

8
 4 MODELISATION DES EFFETS DE MICROMELANGE................................................................................... 123
4.1. Présentation du modèle utilisé et de l’expérience de Dunlop ..................................................... 124
4.1.1. Expérience : mise en œuvre et résultats expérimentaux ......................................................................... 124
4.1.2. Modèle de micromélange ....................................................................................................................... 126
4.2. Simulation du couplage mélange – réaction biologique ............................................................. 128
4.3. Conclusion .................................................................................................................................. 131
5 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 134

CULTURE DE LACTOCOCCUS LACTIS NCDO 2118 DANS UN REACTEUR COUETTE.................. 151

1 APPARITION D’UN PHENOTYPE PARTICULIER ET NOUVEAU. .................................................................. 151

1.1. Introduction ................................................................................................................................ 152
1.2. Matériel et méthodes ................................................................................................................... 156
1.3. Résultats...................................................................................................................................... 163
1.4. Discussion ................................................................................................................................... 171
1.5. Conclusion .................................................................................................................................. 176
2 ANALYSES COMPLEMENTAIRES SUR LA MATRICE PRODUITE ................................................................. 182
2.1. Matériel et méthodes ................................................................................................................... 182
2.1.1. Extraction aux ultrasons ......................................................................................................................... 182
2.1.2. Dosages .................................................................................................................................................. 183
2.2. Résultats...................................................................................................................................... 184
2.2.1. Dosages et caractérisation biochimique ................................................................................................. 184
2.2.2. Microbial Adsorption To Solvents ......................................................................................................... 186
2.3. Discussion et conclusion ............................................................................................................. 188
3 CONCLUSION GENERALE ....................................................................................................................... 192

DESCRIPTION DES CONTRAINTES LOCALES PAR SIMULATION NUMERIQUE DE

L’ECOULEMENT ........................................................................................................................................... 195

1 DESCRIPTION DE L’ECOULEMENT DANS LE REACTEUR COUETTE .......................................................... 196

1.1. Caractérisation du régime d’écoulement .................................................................................... 196
1.2. Puissance dissipée et contraintes ................................................................................................ 198
1.3. Conséquences pour la mise en œuvre des simulations ................................................................ 199
2 DESCRIPTION DE L’ECOULEMENT A L’AIDE DE LA MECANIQUE DES FLUIDES NUMERIQUE ..................... 200
2.1. Mise en œuvre de la simulation numérique directe (DNS) ......................................................... 200
2.1.1. Description de la DNS............................................................................................................................ 201
2.1.2. Convergence des écoulements résolus en DNS ...................................................................................... 203
2.2. Description de l’écoulement grâce aux résultats obtenus en DNS ............................................. 208
2.2.1. Ecoulement à 20 RPM............................................................................................................................ 208
2.2.2. Comparaison des profils de vitesse pour différentes vitesses de rotation ............................................... 213
2.3. Confrontation avec les résultats expérimentaux ......................................................................... 215

9
 2.4. Conclusion .................................................................................................................................. 216
3 OBSERVATION DES CHAMPS INSTANTANES – APPROCHE PHENOMENOLOGIQUE .................................... 216
4 UTILISATION DE LA CFD POUR DECRIRE LES CONTRAINTES .................................................................. 220
4.1. Amplitude et distributions des contraintes – cartographie de l’écoulement ............................... 221
4.1.1. Représentativité des valeurs ................................................................................................................... 221
4.1.2. Dissipation ............................................................................................................................................. 223
4.1.3. Echelle de Kolmogorov .......................................................................................................................... 225
4.1.4. Contrainte de cisaillement ...................................................................................................................... 228
4.2. Suivi Lagrangien de particule : nature et fluctuation des contraintes ........................................ 229
4.2.1. Amplitude et fluctuation......................................................................................................................... 230
4.2.2. Nature des contraintes ............................................................................................................................ 233
5 APPLICATION AUX CULTURES DE LACTOCOCCUS LACTIS EN REACTEUR COUETTE ................................. 237
5.1. Effet des contraintes sur la taille des agrégats ........................................................................... 237
5.2. Contraintes, structure de l’écoulement et agrégation ................................................................. 240
5.2.1. Aspect quantitatif des contraintes ........................................................................................................... 240
5.2.2. Aspect qualitatif des contraintes............................................................................................................. 242
6 CONCLUSION ......................................................................................................................................... 243

CONCLUSION ................................................................................................................................................. 245

REFERENCES ................................................................................................................................................. 251

TABLE DES ILLUSTRATIONS .................................................................................................................... 267

LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................................... 267

LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................... 269
LISTE DES GRAPHES ........................................................................................................................................ 271

ANNEXE 1 : CULTURE DE LACTOCOCCUS LACTIS NCDO 2118......................................................... 277

1 SOUCHES ............................................................................................................................................... 277

2 CULTURES ............................................................................................................................................. 277
2.1. Milieux de cultures...................................................................................................................... 277
2.2. Techniques de culture ................................................................................................................. 279
2.2.1. Conservation des souches....................................................................................................................... 279
2.2.2. Précultures.............................................................................................................................................. 280
2.2.3. Cultures batch en réacteur ...................................................................................................................... 280
[Link]. Réacteurs Couette ........................................................................................................................ 280
[Link]. Réacteur Parfaitement Mélangé ................................................................................................... 281
2.2.4. Conditions de culture régulation du pH, température ............................................................................. 281
2.2.5. Echantillonnage et suivi de la croissance ............................................................................................... 282

ANNEXE 2 : CHIMIE ANALYTIQUE .......................................................................................................... 283

1 DOSAGES BIOCHIMIQUES....................................................................................................................... 283

10
 1.1. Dosage des polysaccharides par la méthode à l’anthrone ......................................................... 283
1.2. Dosage des sucres et acides en HPLC ........................................................................................ 283
1.3. Dosage des protéines .................................................................................................................. 284
1.4. Quantification des polysaccharides par précipitation à l’éthanol .............................................. 284

ANNEXE 3 : MESURES PHYSICOCHIMIQUES ....................................................................................... 287

1 QUANTIFICATION DE L’AFFINITE POUR LES SOLVANTS – MATS (MICROBIAL ADSORPTION TO SOLVENTS)

287
2 MESURES GRANULOMETRIQUES ............................................................................................................ 287
3 TRAITEMENTS D’EXTRACTION .............................................................................................................. 288
3.1. Séparation des cellules et de la matrice filamenteuse ................................................................ 288
3.1.1. Traitement aux ultrasons ........................................................................................................................ 288
3.1.2. Vérification de la lyse cellulaire par le dosage de l’activité LDH .......................................................... 288

ANNEXE 4 : FLUORESCENCE ET MICROSCOPIE ................................................................................ 291

1 ECHANTILLONNAGE ET PREPARATION ................................................................................................... 291

2 FISH (FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION) .................................................................................... 291
3 MARQUAGE PAR DES LECTINES ............................................................................................................. 292
4 MICROSCOPIE CONFOCALE ET EPIFLUORESCENTE, CFDA ET SYTO 61 .................................................. 293
4.1. Intérêt et principe de la microscopie confocale .......................................................................... 293
4.2. Epifluorescence........................................................................................................................... 293
4.3. Observation des échantillons hybridés et marqués par les lectines ............................................ 294

ANNEXE 5 : METHODOLOGIE D’IDENTIFICATION DES PARAMETRES DE MELANGE

CRITIQUE ........................................................................................................................................................ 295

11
12
NOMENCLATURE

Lettres latines

dp diamètre de particule, cellule (m)

E paramètre d’incorporation

Ec module de Young (Pa)

Gc module élastique de cisaillement (N.m-2 ou Pa)

H hauteur du réacteur Couette (m)

Ks constante d’affinité pour le substrat (mg.L-1)

Kla coefficient de transfert d’oxygène (s-1)

M* moment angulaire normalisé (m)

Np nombre de puissance (-)

P puissance (W)

q s, vitesse spécifique de consommation du substrat ([Link]-1.h-1)

qsmax vitesse maximale spécifique de consommation du substrat ([Link]-1.h-1)

r coordonnée radiale (m)

r* coordonnée radiale normalisée (-)

Re nombre de Reynolds (-)

Recrit nombre de Reynolds critique (-)

Ri rayon du cylindre interne (m)

13
Ro rayon externe (m)

<S> concentration moyenne en substrat dans le réacteur (mg.L-1)

Ta nombre de Taylor (-)

te constante élastique (s)

tC temps de circulation (s)

tk temps de mélange par incorporation (s)

tR temps de réaction (s)

ts temps de mésomélange (s)

u composante tangentielle de la vitesse (m.s-1)

ur composante radiale de la vitesse (m.s-1)

uz composante axiale de la vitesse (m.s-1)

V volume (L, m3)

Yxs rendement de conversion du substrat en biomasse ([Link]-1)

Lettres grecques

ε taux de dissipation de l’énergie cinétique turbulente ([Link]-1)

ρ masse volumique (kg.m-3)

µ viscosité (Pa.s), précisé dans le texte lorsque le symbole a cette signification

µ vitesse spécifique de croissance (h-1)

µmax vitesse spécifique maximale de croissance (h-1)

14
Ω vitesse de rotation (rad.s-1)

ν viscosité cinématique (

λ, λk microéchelle de Kolmogorov (µm)

η ratio des rayons des cylindres, dimension caractéristique (-)

Λ échelle intégrale de la turbulence (µm)

τ,  c contrainte visqueuse (Pa)

 taux de cisaillement (s-1)

ABREVIATIONS

AFM microscopie à force atomique

BCA acide bicinchronique

BSA sérum albumine bovine

CcpA Catabolite control protein A

CSPs Cold Shock Proteins

DO densité optique

DPWVF doubly periodic wavy vortex flow

EPS exopolysaccharides

FISH Fluorescent in situ hybridization

HSP Heat Shock Proteins

15
LDH lactate déshydrogénase

MATS microbial adsorption to solvents

PFL Pyruvate Formate Lyase

RPM rotation par minute

SPWVF singly periodic wavy vortex flow

16
INTRODUCTION

De l’échelle du laboratoire { l’échelle industrielle, l’hydrodynamique des bioréacteurs

varie considérablement et l’extrapolation de leurs performances révèle bien des
surprises si le comportement de la biomasse est considéré comme indépendant de ces
conditions. Le scale up des bioprocédés a pour inconvénient principal d’engendrer des
gradients de toutes sortes dans le bioréacteur : température, pH, concentration,
contraintes, etc. En effet, l’environnement hydrodynamique de cellules cultivées en
bioréacteur inclut de nombreux facteurs, allant des champs de concentration en
différents composés (qu’il s’agisse de substrats ou de produits du métabolisme) aux
contraintes mécaniques subies par les cellules. Les sources d’interaction, entre les
cellules elles-mêmes et entre les cellules et leur environnement, sont donc multiples.

De la mise en évidence du couplage entre conditions hydrodynamiques et réaction

biologique à la description de leurs effets délétères, les références aux interactions
entre microorganismes et leur environnement sont nombreuses dans la littérature
scientifique. Mais une meilleure compréhension de ces effets d’échelle passe par
l’analyse du couplage entre procédé et réaction biologique, un problème complexe en
raison de ses multiples dimensions. Qualitativement tout d’abord, deux domaines se
rejoignent ici : d’une part, le vivant (microbiologie au sens large, physiologie
microbienne) et d’autre part, le procédé et les aspects physico-chimiques associés. En
outre, cette problématique revêt aussi une dimension multi-échelles, de taille (de
l’échelle de la cellule, microscopique, { celle du réacteur, macroscopique) et de temps
(de la milliseconde, caractéristique du mouvement turbulent, au temps d’exploitation
du réacteur). Or ces interactions sont généralement envisagées dans la littérature à
l’échelle d’une culture ou d’un bioréacteur, et les données concernant la compréhension
des mécanismes d’interaction aux petites échelles manquent. Intégrer ces dimensions et
obtenir une cartographie complète des interactions microorganismes - procédé relève
du challenge.

L’objectif de ce travail doctoral consiste { apporter des éléments visant { dresser un

tableau plus précis des interactions locales entre des microorganismes et leur

17
environnement. L’approche pluri-disciplinaire procédé / microbiologie / mécanique des
fluides permet d’envisager ces interactions de la façon la plus globale possible.

La première partie de la revue bibliographique s’attache donc { décrire les différents

types d’interactions et leurs effets observés sur les cultures bactériennes. Cette partie
met en exergue la complexité de ces interactions et insiste sur la nécessité de s’appuyer
sur une expérience modèle pour simplifier au maximum les hypothèses. En
conséquence, un procédé et une souche bactérienne sont choisis comme outils d’étude.
Ces outils, un réacteur Couette et la souche Lactococcus lactis NCDO 2118, seront décrits
dans la seconde partie de la revue bibliographique. Le réacteur Couette est de longue
date utilisé par les mécaniciens des fluides pour décrire et étudier les instabilités
d’écoulement. De ce fait, l’hydrodynamique dans ce type de réacteur est très bien
décrite. La souche Lactococcus lactis NCDO 2118, quant à elle, permet de travailler sans
ajout gazeux et permet de visualiser un stress lié au flux de substrat reçu par un shift
métabolique.

Ainsi dotés d’une expérience modèle permettant d’éclaircir la problématique du

couplage entre conditions hydrodynamiques et réponse biologique, les chapitres
suivants apportent des éléments de réponse aux questions suivantes :

 qu’en est-il du mélange { l’échelle cellulaire, ou micromélange ?

 { l’exception des conditions de mélange au sens strict, quel est l’impact de

l’écoulement moyen en lui-même sur le comportement cellulaire ?

Le deuxième chapitre répond à la problématique de la compréhension des effets de

micromélange par une double approche. En premier lieu, cette problématique est
envisagée de façon plutôt théorique, via une analyse de l’interaction mélange-réaction
par comparaison des temps de mélange et de réaction. L’étude du métabolisme de
Lactococcus lactis NCDO 2118 cultivé dans un réacteur Couette sous deux conditions de
mélange différentes est complétée par la modélisation de résultats expérimentaux issus
de la littérature. Les premiers résultats de fermentation révèlent l’apparition d’un

18
phénotype unique et filamenteux dans certaines conditions d’écoulement : les cellules
s’agrègent et forment une matrice.

Exemple de réponse de la biomasse aux contraintes environnementales, le chapitre

suivant cherchera à définir ce qui, parmi les différentes contraintes imposées par le
procédé, conduit { l’apparition de ce phénomène. Il est pour l’essentiel constitué d’une
publication acceptée dans le journal Biotechnology & Bioengineering. Ce chapitre, après
avoir décrit ce phénotype, se conclura sur quelques hypothèses concernant son origine.

Ces hypothèses seront discutées dans le dernier chapitre qui abordera le procédé du
point de vue de la mécanique des fluides. L’écoulement au sein du réacteur Couette, est
résolu par Simulation Numérique Directe { l’aide du code de calcul de mécanique des
fluides numérique FLUENT. L’intensité et la distribution des stress mécaniques sont
identifiées dans les différentes configurations d’écoulement. Cartographie et approche
Lagrangienne sont alors combinées pour étudier la dimension temporelle des
contraintes subies par les cellules. Ce chapitre permet donc d’établir un lien entre les
distributions des contraintes et de la dissipation et l’apparition de ce phénotype. Une
approche comparative est enfin développée dans le but d’établir une relation entre les
tailles caractéristiques des agrégats et les différentes conditions d’agitation.

Pour terminer, et en guise de conclusion, les principaux résultats de ces travaux sont
résumés et nous proposons quelques perspectives à cette étude.

19
20
BIBLIOGRAPHIE

L’étude des interactions entre conditions hydrodynamiques et cellule vivante a pour

origine l’apparition de problèmes lors du changement d’échelle (scale up) de
bioréacteurs. Rendements, productivité et viabilité de la biomasse en réacteur industriel
sont bien souvent inférieurs aux prédictions issues d’essais préliminaires réalisés dans
des réacteurs de laboratoire. La performance globale est le résultat intégré des
perturbations, l’intégration ayant lieu { différents niveaux simultanément : { l’échelle de
la population, du volume ou de la durée de la culture. L’augmentation du volume utile
des réacteurs implique l’ajustement des paramètres de conduite de culture et des
modifications au niveau du design des bioréacteurs et de leurs systèmes d’agitation.
Bien qu’une certaine dose d’empirisme et de sens pratique soit indispensable { une
bonne extrapolation des procédés, la compréhension des mécanismes d’interactions
reste critique pour quiconque souhaite réaliser un scale up éclairé.

Au-delà des constatations réalisées sur des cultures à grande échelle, les interactions
hydro-bio sont également mises en évidence lors de l’opération de réacteurs de
laboratoire. Systèmes d’agitation, localisation de l’injection de substrat, aération des
bioréacteurs ont une influence reconnue sur les performances biologiques, même à
l’échelle des réacteurs de laboratoire. Pour preuve l’utilisation de différents designs en
fonction du type cellulaire (bactéries, cellules animales, …) cultivé. Cependant, l’étude
de ces interactions est très souvent centrée sur la réponse biologique en elle-même et
peu de travaux se concentrent sur les paramètres physiques mis en jeux, se contentant
bien souvent de détailler les caractéristiques du bioréacteur (design, système
d’agitation) ou d’approcher les contraintes subies { une échelle qualifiée de
macroscopique. Ainsi par exemple, en ce qui concerne la problématique du mélange, de
nombreuses références se rapportent aux gradients de concentrations dans les gros
bioréacteurs, présentant une photographie lointaine de l’environnement cellulaire. Le
mélange comme les contraintes mécaniques subies sont bien souvent reliés à la
puissance totale dissipée dans le réacteur, ne rendant compte que très grossièrement

21
des conditions locales rencontrées par les cellules. Cependant, l’hydrodynamique d’un
bioréacteur agité et aéré est complexe et bien souvent très hétérogène. Dans ces
conditions, il devient donc évident que le recours à des paramètres globaux ne permet
pas de caractériser précisément la nature, l’amplitude et la fréquence des contraintes
exercées { l’échelle cellulaire. De plus, si les phénomènes physiques tels que mélange ou
cisaillement sont des mécanismes distincts selon l’approche phénoménologique, ils
dépendent de l’hydrodynamique et sont de ce fait difficiles { découpler.

La première partie de ce chapitre consacré { l’étude bibliographique est de recenser

puis de détailler les mécanismes d’interactions hydro-bio en s’approchant le plus
possible de l’échelle cellulaire. Chaque mécanisme physique sera caractérisé
quantitativement et qualitativement avant d’être illustré { l’aide d’exemples tirés de la
littérature. L’étude de la nature des réponses biologiques, sera ensuite abordée. Elle
permettra de souligner le fait qu’il s’agit d’une interaction { part entière, la réponse
cellulaire étant capable elle aussi en retour de modifier son environnement en adaptant
son métabolisme par exemple (couplage direct inverse).

Cette première partie de la revue bibliographique permet donc de définir les bases
requises concernant le procédé (aspects physiques) et la biomasse (aspect biologique)
afin de formuler des recommandations en vue de la constitution d’une expérience
modèle pour éclairer l’étude de ces interactions.

La deuxième et dernière partie du chapitre consistera donc en la description des outils

choisis pour cette étude, à savoir un réacteur de type Couette et la souche bactérienne
Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118.

1 LES INTERACTIONS HYDRO – BIO

1.1. Introduction : les différents types de mécanismes et de réponse

La mise en culture de cellules animales ou bactériennes soulève de nombreux

problèmes. A l’échelle industrielle comme { celle du laboratoire, se pose la question du
mélange de substrat, du transfert d’oxygène et des dommages causés par les contraintes

22
mécaniques. Mélange, transfert, contrainte dépendent de l’hydrodynamique au sein du
bioréacteur qui conditionne les distributions de valeurs du taux de dissipation de
l’énergie cinétique. On recense ainsi de nombreux travaux traitant des effets induits par
l'écoulement, souvent négatifs, sur des matériaux biologiques divers : cellules en
suspension (cellules animales (Barbouche et al.; Haut et al. 2003), bactériennes (Arnaud
et al. 1993; Sahoo et al. 2003), hématies, algues (Cussatlegras and Le Gal 2004) ou
biopolymères (protéines, polysaccharides) (Ashton et al. 2009; Hackney et al. 1994).
L’opération de bioréacteurs conduit { des interactions à différentes échelles et de
différente nature entre l’hydrodynamique et la réponse biologique.

En effet, le mouvement du fluide est { l’origine de différents stress potentiels pour des
cellules cultivées en bioréacteur :

 Stress chimique : les conditions hydrodynamiques, via les effets de

mélange, déterminent la distribution spatiale des substrats et des
produits dans un bioréacteur, tant au niveau du flux de matière en lui-
même qu'au niveau des fluctuations possibles.

 Stress mécanique : il est issu des contraintes exercées par le fluide sur les
particules en suspension. Si les biomatériaux sensibles aux conditions
d'écoulement sont souvent qualifiés de sensibles au cisaillement, il
convient cependant de ne pas imputer les effets mécaniques au seul
cisaillement, mais aussi aux contraintes élongationnelles (Yim and
Shamlou 2000).

Néanmoins, il est très difficile dans la plupart des cas d'imputer la réponse biologique à
l'un ou l'autre de ces effets, ces deux stress étant couplés dans la plupart des
bioréacteurs. En effet, il est très difficile de concevoir des réacteurs pilotes dans lesquels
mélange et contraintes mécaniques sont clairement différenciés, puisque résultant du
même phénomène. Tout au mieux, il est possible de minimiser l’impact de l’un pour
étudier spécifiquement les effets de l’autre.

23
L'énergie dissipée lors de l'écoulement du fluide dans un bioréacteur constitue donc un
facteur de mélange et de contrainte pour les cellules (cisaillement, élongation), dans des
écoulements organisés ou non. Ces points seront développés dans la suite de ce premier
chapitre de bibliographie. L’interaction mélange - réaction sera illustrée après avoir
défini brièvement les mécanismes propres au mélange. Les concepts de base
nécessaires { la compréhension de l’aspect mécanique seront ensuite définis. Après
avoir mis en évidence les effets des contraintes d’origine mécanique sur des cellules,
celles-ci seront analysées { l’échelle de la population de cellules.

Il est important de souligner ici que ces effets sont fortement dépendant du temps
(fréquence et durée d'exposition au stress), ce qui fera l'objet d'une analyse plus fine
dans le second chapitre.

La réponse biologique quant à elle peut être observée à différents niveaux,

schématiquement, de la régulation génétique à sa manifestation phénotypique. Avec le
séquençage d'un nombre croissant de souches bactériennes, on dispose désormais du
chemin menant de l'information contenue dans le génome à l'expression de protéines et
à la synthèse des métabolites. La réponse apportée par une cellule à une contrainte
hydrodynamique peut en effet être observée au niveau des ARNm transcrits (induction
ou répression de la transcription d’un gène), de leurs conséquences sur les enzymes
synthétisées (protéomique) ou au niveau des modifications induites au niveau du
métabolisme ou du phénotype. Ce sujet sera donc traité à la fin de ce chapitre à partir
d’exemples tirés de la littérature afin de donner un éclairage sur les différents niveaux
d’expression de la réponse biologique.

1.2. Le couplage mélange - réaction

1.2.1. Le mélange turbulent

Le phénomène de mélange est responsable de l’homogénéisation d’une solution via le

transport de composés. Dans un écoulement turbulent, on observe deux types de
fluctuations : des fluctuations de vitesse et des fluctuations de concentration,
d’amplitude différente selon l’échelle considérée. La dissipation de l’énergie cinétique

24
turbulente permet l’atténuation des fluctuations de vitesse, alors que le mélange
conduit lui { l’atténuation des fluctuations de concentration. La théorie de la turbulence
permet d’associer des tailles caractéristiques { chaque niveau de fluctuation. En ce qui
concerne les fluctuations d’énergie, on distingue alors la macro échelle de la turbulence,
constituée de gros tourbillons transportant une grande quantité d’énergie, qui sera
progressivement dissipée dans des structures tourbillonnaires de plus en plus petites,
jusqu’ à atteindre la micro échelle de Kolmogorov de taille caractéristique notée λk. Les
mécanismes de mélange dans les écoulements turbulents sont généralement
décomposés en trois étapes ayant lieu de manière simultanée (Baldyga and Bourne
2003). Les différents processus de mélange sont classés par leur niveau d’action (figure
I.2 reprise de Delafosse (2008) d'après Baldyga and Bourne (2003) et Baldyga et al.
(1997)). On distingue ainsi le macromélange, lié { l’écoulement moyen, le mésomélange
et le micromélange, liés aux fluctuations de l’écoulement turbulent.

Le macromélange ou mélange par convection fait référence au mélange { l’échelle du

réacteur. C’est le mécanisme responsable de la dispersion d'un paquet de fluide
(substrat) dans le volume considéré, transporté par la vitesse moyenne. Il détermine la
distribution des temps de séjour dans un réacteur opéré en continu et dépend de la
géométrie du réacteur et des caractéristiques de l’agitateur. L'échelle de taille
caractéristique du macromélange est la macro échelle de Taylor, ou échelle intégrale. Le
temps caractéristique quant à lui, est le temps de circulation dans le bioréacteur.

Le mésomélange ou mélange inertiel convectif est du aux structures tourbillonnaires,

et contribue { réduire les fluctuations spatiales de concentration. D’un point de vue
phénoménologique, il consiste en la désintégration des paquets de fluide introduits au
point d’alimentation. Ces paquets de substrat convectés par le mouvement moyen sont
étirés, déformés et cassés par les tourbillons , avec pour conséquence une réduction de
la taille de ces éléments. Le phénomène dépend de la géométrie du système considéré et
de la turbulence.

Le micromélange conduit { la formation d’une structure lamellaire, incorporant le

milieu environnant (micromélange par incorporation, ou visqueux convectif). Le

25
micromélange par incorporation (engulfment) dépend de la dissipation de l’énergie
cinétique turbulente et de la viscosité du fluide considéré. Puis l'homogénéisation des
scalaires (disparition des gradients de concentration) à l'échelle moléculaire se produit
sous l’effet de la diffusion moléculaire. La diffusion moléculaire a lieu entre les couches
de la structure lamellaire issues du micromélange par incorporation. C’est le
micromélange qui est responsable du mélange intime des constituants, et donc, dans le
cas des bioréacteurs, de l’apport de substrat aux cellules. Le micromélange dissipe les
fluctuations jusqu'à l'uniformisation des concentrations à toutes les échelles.

L'échelle de Batchelor représente l'échelle de longueur à partir de laquelle le transport

d'un scalaire passif est principalement effectué par diffusion moléculaire (il n’y a plus de
fluctuation d’énergie cinétique). L’échelle de Kolmogorov correspond { la taille des
tourbillons en deçà de laquelle les contraintes turbulentes sont négligeables devant les
contraintes de dissipation visqueuse.

La figure I.1 résume les échelles de tailles correspondant aux fluctuations d’énergie
cinétique et de concentration lors de phénomène de mélange turbulent.

Figure I.1 : Spectres de l’´energie cinétique E(σ) et des fluctuations de concentration G(σ), d’après
Delafosse (2008)

26
Figure I.2 : représentation schématique des mécanismes de mélange turbulent, d’après Baldyga et Bourne
repris de Delafosse (2008)

Les échelles de taille et de temps pour les différents mécanismes de mélange sont
résumées dans le tableau I.1. Ces formules s'appliquent pour des phénomènes de

27
turbulence homogène et isotrope. k représente l'énergie cinétique turbulente, ε la
dissipation de l'énergie cinétique turbulente. Dans le cas d'une turbulence homogène, la
dissipation de l’énergie est identique en tout point, on obtient donc P/ρV=ε et le temps
caractéristique devient tc= k/ε. L’échelle de taille caractéristique du mésomélange Lc est
difficile { prédire. Elle dépend de la turbulence et des caractéristiques de l’alimentation
(concentration, débit, localisation du point d’injection). Cependant, on l’assimile souvent
{ l’échelle intégrale de la turbulence Λ.

Mésomélange
Micromélange
Réduction de Micromélange par
Macromélange par
l’échelle diffusion
incorporation
intégrale

1
Echelle 1 1

tc 
V  LC 2 3   2   2   
de
NQc  N  d 3 t S  2  tk    t D  2  arcsin h 0.05 
        D
temps  

1 1
Echelle 3
1 k2  3  4  D 2 4
de  k    B   
taille 2     

Table I.1 : échelles caractéristiques du mélange dans un écoulement turbulent homogène

Ces différentes échelles sont directement liées aux propriétés de la turbulence. En effet,
l'écoulement turbulent est composé d'innombrables tourbillons, dont les échelles de
taille sont distribuées entre une taille maximale initiale (échelle intégrale) et une taille
minimale (échelle de Kolmogorov). Ils sont en interaction par la cascade de
Kolmogorov. Cette cascade suppose que les tourbillons les plus gros alimentent les
tailles inférieures en dissipant leur énergie cinétique (zone inertielle-convective),
jusqu’{ l’échelle de Kolmogorov au-del{ de laquelle l’énergie cinétique est entièrement
dissipée et convertie en chaleur par effets visqueux (zone visqueuse-convective).

La simultanéité de ces étapes, ainsi que leur interdépendance, rend délicate la mise en
cause de tel ou tel mécanisme pour expliquer un défaut de mélange. On remarque de

28
plus que le taux de dissipation de l’énergie cinétique ε est un paramètre permettant de
définir les échelles de taille et de temps du méso et du micro mélange.

Dans le cadre de l'étude des interactions mélange/réaction, on définit deux régimes :

 le régime chimique, dans lequel le temps de mélange est largement

inférieur au temps de réaction : l'avancement de la réaction est donc
contrôlé par la réaction elle même.

 le régime hydrodynamique, dans lequel le temps de mélange, très grand

devant le temps de réaction, contrôle l'avancement de cette dernière.

Comme nous allons l’évoquer par la suite, les défauts de mélange, que ce soit { l’échelle
macro ou micro sont souvent observés lors de l’opération de bioréacteurs, menant ainsi
à des réactions opérées en régime hydrodynamique. Ces défauts de mélange peuvent
avoir lieu à différentes échelles plus ou moins interdépendantes.

En effet, si un réacteur est mal macromélangé (apparition de gradient microscopique), il

sera forcément mal micro et méso mélangé. Cependant, on peut trouver des réacteurs
dans lesquels le défaut de mélange apparait à des échelles plus petites. Par exemple, un
réacteur bien macromélangé (dans lequel aucun gradient macroscopique n’apparait)
pourra être bien micromélangé (chaque micro élément de volume a la même
concentration) ou mal micromélangé ({ l’intérieur des éléments de volumes considérés,
il y a une distribution de concentration).

Pour pouvoir incriminer l’un ou l’autre de ces phénomènes de mélange, on peut par
exemple recourir { l’utilisation de plusieurs points d’injection (Baldyga et al. 1997;
Baldyga and Pohorecki 1995). De ce fait, on diminue la taille des paquets de fluide
incorporés, et on diminue le temps de mésomélange. Si une amélioration du procédé est
constatée, un défaut de mésomélange est à incriminer : celui ci ne permet pas la
création de structures suffisamment petites. Si, au contraire, aucune amélioration n’est
observée, le micromélange est en cause : la réduction de la taille des paquets de fluide et
l’amélioration de leur dispersion ne corrigent pas le fait que le micromélange reste le
mécanisme limitant la rencontre des réactifs entre eux.

29
1.2.2. Modélisation du micromélange

Différents modèles de micromélange ont été développés, parmi lesquels :

 Le modèle IEM (Interaction et Echange avec la Moyenne), proposé par

Villermaux et Devillon (1972) et Villermaux (1995) afin d’éviter
l’utilisation de modèles stochastiques qui demandent des temps de calcul
importants. Dans ce modèle, le changement de concentration d'une
espèce i en un point p est dû à la fois à la réaction chimique et à un
échange avec son environnement.

 Le modèle EDD pour Engulfment (incorporation), Deformation, Diffusion,

plus complexe et complet que le précédent car il prend mieux en compte
les phénomènes de l'érosion d'un élément de fluide marqué injecté dans
une turbulence donnée ainsi que l'aspect vorticité de l'écoulement
turbulent. Ce modèle a été développé par (Baldyga and Bourne 2003).

 Différents modèles statistiques, non détaillés ici (travaux de Fox entre

autres), pour lesquels on considère non plus une concentration de
scalaire mais une densité de probabilité (PDF) qui est transportée, ont été
également développés.

1.2.3. Outils de caractérisation du mélange

Dans un bioréacteur, le mélange a donc pour fonction d'assurer une bonne répartition
des microorganismes dans le milieu de culture, de dissiper les gradients de température
et d'assurer une répartition homogène du/des substrat(s) dans tout le volume du
réacteur (Bryant 1977), tout en permettant l’évacuation de métabolites potentiellement
toxiques à terme pour la cellule. C'est sur un défaut concernant la répartition du
substrat que nous allons focaliser ce paragraphe.

Nombreux sont les exemples que l'on peut tirer de la littérature mettant en évidence
des défauts de mélange dans des bioréacteurs. Ces défauts de mélange, quantifiés via la

30
distribution des temps de séjour (DTS) pour les réacteurs continus ou la distribution
des temps de circulation (réacteurs ouverts), peuvent être observés :

 directement, par la mesure de la concentration en différents points du

réacteur (George et al. 1998),

 par une mesure chimique du mélange (réactions compétitive) (Bourne

2003; Fournier et al. 1996), ces mesures s'attachant généralement à
évaluer l'intensité du micromélange,

 en utilisant des réactions colorées type indicateur coloré pour

visualisation du pH, ou des particules non miscibles + images (Dusting
and Balabani 2009), dispersion d'un colorant (Rudman et al. 2008),

 ou encore par une mesure de la DTS pour les réacteurs continus

(alimentés) : dans des cas extrêmes, on peut ainsi observer des courts
circuits.

Il existe aussi des moyens indirects, en constatant par exemple les conséquences d'un
mélange défectueux sur les performances d'un bioréacteur (apparition d'un
métabolisme « overflow » ou effet Crabtree ayant pour conséquence une diminution
significative des rendements de conversion). C'est le cas par exemple des travaux de
Bylund et ses collaborateurs sur la production de protéines recombinantes par E. coli
(Bylund et al. 1998; Enfors et al. 2001) ou des études sur des cultures fed-batch de
Saccharomyces cerevisiae (George et al. 1998; Larsson et al. 1996). Depuis les premiers
travaux mettant en cause des effets de mélange, de nombreuses études traitent de ce
sujet. L’objectif de la partie suivante n’est pas d’en faire une revue exhaustive mais de
montrer comment ces effets peuvent avoir lieu à différentes échelles.

1.2.4. Caractérisation des effets de mélange et conséquences sur la réaction biologique

De l’échelle industrielle…

Leib et al. (2001) fournissent à travers une revue une description assez complète des
différents challenges liés au mélange à l'échelle des bioréacteurs. Si, de manière

31
générale, le défaut de mélange n'est pas critique pour des fermentations à haute valeur
ajoutée et faible volume réactionnel, l'impact économique peut se révéler très
important pour des grosses productions à faible valeur ajoutée, comme pour la
production de levure de boulangerie par exemple. En effet, les défauts de mélange vont
en s'empirant avec le scale up des bioréacteurs : le temps de macromélange augmente
(maintien de la puissance dissipée par unité de volume et diminution de la vitesse
d’agitation) alors que celui de la réaction d’assimilation du substrat peut être considéré
comme constant.

Figure I.3 : Champs de concentration en glucose obtenu par simulation LES (Large Eddy Simulation) dans
un bioréacteur de 22 m3 alimenté en glucose { 500 g/L au taux de 180 L/h, d’après Enfors et al., 2000.

Comme expliqué précédemment, le défaut de mélange à l'échelle macroscopique

(échelle du bioréacteur) conduit à l'apparition de gradients de concentration dans le
réacteur, les concentrations locales en substrat pouvant varier d'un facteur 1 (loin du
point d'injection) à 100 (près de l'injection) (George et al. 1998), ou encore atteindre
localement des valeurs 400 fois supérieures à la valeur moyenne (Bylund et al. 1998).
Une illustration est donnée figure I.3.

32
Les cellules étant mises en circulation dans le bioréacteur, elles vont donc être
confrontées, au gré de leur cheminement, à des concentrations en substrat pouvant
varier considérablement, avec des conséquences potentiellement très négatives sur le
rendement de la bioréaction. Agger et al. (2001) ont étudié la production d'amylase par
un champignon filamenteux. Cette enzyme est produite lorsque la concentration en
glucose n'excède par 10 g/L, la quantité produite étant proportionnelle à la biomasse
présente. Lors du scale up du procédé, ils rapportent néanmoins que la production
d'enzyme lors de fermentations réalisées à forte concentration cellulaire dans un
réacteur continu est presque nulle : la très grande viscosité du milieu de culture à ces
concentrations cellulaires rend quasiment impossible le mélange rapide du substrat, de
ce fait, les cellules circulent dans une alternance de zones à forte concentration, au
voisinage de l’alimentation, et { faible concentration dans le reste du bioréacteur. Dans
ce cas précis, le temps de résidence dans des zones à forte concentration est suffisant
pour que la répression de l'enzyme puisse s'effectuer. Si les cellules circulent dans des
zones où la concentration locale en substrat est largement supérieure à la concentration
moyenne, elles peuvent également se retrouver dans des zones où ce dernier est
largement limitant, avec les mêmes effets délétères. Citons par exemple la perte
irréversible d'un plasmide, causée par une limitation en substrat dans le cas de la
production d'antibiotiques.

L'impact négatif de ce type de gradients est aussi déploré lors de la culture de levures
(Namdev et al. 1992), où le passage dans des zones très concentrées en substrat
entraîne une répression catabolique du métabolisme et de ce fait, diminue le rendement
de bioréaction (Dunlop and Ye 1990).

Outre une adaptation à un stress maintenu constant, les cellules peuvent aussi répondre
{ une contrainte fluctuante. C’est ce qu’ont montré Lin and Neubauer (2000) sur des
cultures semi continues de E. coli recombinantes. L’alimentation est constante ou
réalisée avec deux niveaux d’oscillation, faible (0,25/min) ou élevé (1/min). Dans le cas
d’une alimentation constante ou { faible fréquence de fluctuation, la croissance de
cellules sans plasmide est favorisée alors que des fluctuations plus rapprochées
conduisent à privilégier la croissance de cellules possédant le plasmide. Ces expériences

33
témoignent de la sensibilité des cellules à des perturbations répétées ayant pour temps
caractéristique la minute. Hewitt et al. (2000) ont obtenu des résultats similaires sur
des cultures fed-batch de E. coli : des perturbations fluctuantes ont pour effet une
production de biomasse plus faible mais de viabilité supérieure, indiquant que la cellule
fournit une réponse adaptative à une perturbation fluctuante.

Le problème se complexifie avec l'ajout de gaz. En effet, il va apparaître un double

problème de mélange : celui du substrat carboné et celui du gaz, le plus souvent de l’air,
responsable de l’apport en oxygène, ces deux composés n'étant généralement pas
injectés aux mêmes points. Ainsi, Bylund et al. (1998) ont observé une diminution du
rendement en biomasse de 20 % à laquelle s'ajoute la production de co-produits issus
du métabolisme « overflow » pour des cultures fed-batch d’E. coli dans un bioréacteur
de taille industrielle (12 m3) par rapport à l'échelle laboratoire. En effet, lors de la
circulation des cellules dans le bioréacteur, celles-ci vont être confrontées à des zones
de composition chimique très différentes. Dans la plus grande partie du volume
considéré, la concentration en sucre est moyenne et la quantité d’oxygène suffisante : le
métabolisme pourra donc être oxydatif. Cependant, dans les zones proches de
l'alimentation, où la concentration en sucre est bien plus élevée, la faible quantité
d'oxygène disponible ne permet pas l'oxydation de tout le glucose assimilé, entrainant
une dérivation de celui-ci vers les voies du métabolisme « overflow ». Outre le problème
de mélange des substrats, la présence de bulles de gaz dans le réacteur va elle aussi
modifier les paramètres intrinsèques du mélange (et rendre plus complexe la
simulation de l'écoulement dans un tel réacteur).

La présence d'un gradient de concentration à l'échelle du réacteur peut également

conduire à la division de la culture en deux sous-populations cellulaires d'état
physiologique différent. Il en est de même pour des populations exposées à de
régulières fluctuations de concentration, menant à un phénomène de ségrégation au
sein de la population bactérienne (Delvigne et al. 2009). Ces travaux ont permis de
conclure à une différenciation de la population bactérienne via le niveau d'expression
de certains gènes. La question de la réponse bactérienne sera traitée de manière plus
spécifique à la fin de ce chapitre consacré aux interactions hydro-bio, les points

34
concernant la physiologie cellulaire ne sont pas détaillés ici et nous nous contentons de
rapporter des observations.

De nombreux modèles, couplant réaction biologique et mécanique des fluides

numérique ont été établis. Ces modèles permettent de prédire le comportement d’une
population bactérienne cultivée dans un réacteur compartimenté du fait des effets de
macromélange. Cependant, si ces modèles sont encore assez éloignés de la réalité, de
nombreux efforts ont été fournis ces 10 dernières années, en incluant des paramètres
biologiques de plus en plus fins, ainsi que des modèles de réponse dynamique des
systèmes microbiens (Schmalzriedt et al. 2003).

… à l’échelle laboratoire

En revanche, le mélange dans les réacteurs de laboratoire, de petit volume, n'est

généralement pas considéré comme critique. En effet, l'énergie dissipée par unité de
volume dans ces réacteurs est bien souvent largement supérieure à celle rencontrée
dans les fermenteurs industriels, et les réacteurs de laboratoire sont souvent qualifiés
de parfaitement mélangés (Bailey and Ollis 1986). De ce fait, peu de travaux ont été
menés sur cette thématique. Cependant, on peut citer ici les travaux de Dunlop and Ye
(1990) qui ont montré sur des cultures fed-batch de Saccharomyces cerevisiae un impact
du point d'injection de substrat sur les performances globales des cultures. La qualité
du mélange pour les différentes localisations du point d'injection a été évaluée selon
une méthode chimique développée par Bourne et al. (1981). Ils ont notamment mis en
évidence que l'ajout de substrat dans une zone à forte dissipation d'énergie (donc, où la
micro-échelle de mélange est faible) permet une production plus importante de
biomasse, via une meilleure distribution du substrat. Dans le même temps et de façon
assez paradoxale, ils ont noté l'apparition de la répression par le substrat (effet
Crabtree) à des taux de dilution plus faibles lorsque l'injection est réalisée dans des
zones à forte dissipation, suggérant ainsi que l'apport de substrat aux cellules est plus
rapide. Ces travaux soulèvent donc la question du mélange à l'échelle même des cellules
(micro et méso mélange) et apportent une nouvelle dimension à la problématique du
mélange dans les bioréacteurs.

35
Al-Homoud and Hondzo (2008) et Hondzo and Al-Homoud (2007) dans un tout autre
domaine d'application (i.e. la description des écosystèmes marins, dans lesquels la
dissipation d’énergie est très faible, ε environ 10-7 m².s-3), se sont aussi penchés sur
l'influence des paramètres du micromélange sur des cultures bactériennes. Comme
expliqué précédemment dans la partie consacrée aux mécanismes de mélange, le taux
de dissipation de l'énergie cinétique turbulente (ε) est un paramètre clé définissant la
taille des plus petits tourbillons, conditionnant par conséquent l'épaisseur de la couche
au delà de laquelle seule la diffusion moléculaire permet l'apport du substrat à la cellule.
Afin d'étudier les effets du taux de dissipation de l'énergie cinétique turbulente sur les
performances biologiques, ces auteurs ont réalisé des cultures de E. coli dans un
réacteur avec une turbulence de grille, permettant une dissipation très homogène, dans
des conditions batch afin d’éviter l'apparition d'un quelconque gradient macroscopique.
Ils ont alors observé que la demande biologique en oxygène (soit l'oxygène requis pour
le bon fonctionnement du métabolisme microbien) est fonction de ε (varie entre 0,6.10-6
et 46,3.10-6 m².s-3). Autrement dit, plus la dissipation autour des cellules est importante,
plus celles-ci vont consommer rapidement leur substrat carboné, entrainant alors une
demande accrue en oxygène pour leur métabolisme oxydatif. Cette étude montre le lien
étroit entre mélange à l'échelle cellulaire et assimilation du substrat, bien qu'il soit
encore couramment considéré qu'une fois le macromélange réalisé, il n'y a plus aucun
frein à l'assimilation du substrat par les cellules. Ainsi, même une très faible dissipation
suffit à diminuer la diffusion de substrat vers les cellules. Le phénomène de mélange à
l’échelle cellulaire pourrait s’avérer plus critique qu’il n’y parait puisqu’en effet, (1999a;
Ferenci 1999b) a montré qu’une cellule adaptée { une limitation en substrat était
ponctuellement capable d’assimiler une sur-quantité de substrat pourvu que celui-ci lui
soit apporté.

Enfin, Garcia et al. (2009) ont montré, grâce à une construction plasmidique (insertion
d’un promoteur d'une enzyme sensible à une limitation sévère en O2 dans un plasmide
codant pour une protéine fluorescente, la GFP) capable de rapporter d'éventuelles
limitations en oxygène, qu'il existait une limitation en O2 même dans des réacteurs de
laboratoire aérés « parfaitement mélangés ». Pour cela, la bactérie E. coli a été cultivée à

36
très forte concentration dans des réacteurs de laboratoire (V. Utile 4 L) agités avec une
vitesse de rotation de 400 RPM avec des agitateurs munis de 1 ou 4 mobiles d’agitation.
Les résultats montrent, qu'à profils de croissance et tension en oxygène dissous
identiques, les cultures réalisées avec un seul agitateur sont bien plus fluorescentes que
celles réalisées avec les 4, témoignant ainsi d'une limitation en oxygène induite par le
micromélange à l'échelle de la cellule. Ces résultats corroborent ceux de Akiti (Akiti O.
and Armenante P. M. 2004) qui, par une méthode chimique, ont montré que l'efficacité
du micromélange peut varier de façon significative d'un réacteur de laboratoire à un
autre. Bien que macroscopiquement bien mélangés, ces réacteurs peuvent néanmoins
présenter des défauts de mélange aux échelles plus petites qu’il conviendra de prendre
en compte.

Cas général

Ainsi, les cellules circulant dans des bioréacteurs peuvent être confrontées à plusieurs
types de fluctuations :

 des fluctuations de forte amplitude et à « basse fréquence », avec une

période proche du temps de circulation,

 des fluctuations de plus faible amplitude et de fréquence élevée, liée à la

turbulence locale.

En fonction du mode d'opération du réacteur et de son volume, l'un ou l'autre type de

fluctuation sera prédominant. Un réacteur alimenté de taille industrielle pourra en effet
présenter des gradients macroscopiques de concentration, donc pour les cellules des
fluctuations de concentration de forte amplitude, et aussi des gradients locaux. Par
contre, dans des configurations batch ou pour des réacteurs parfaitement agités, seules
les fluctuations à l'échelle de la cellule pourront avoir lieu.

Les effets de grosses amplitudes de fluctuation sont relativement bien compris

désormais. En effet, de nombreux travaux dans des réacteurs de type scale down,
développés afin d'imiter à l'échelle du laboratoire l'alternance entre des zones à forte
concentration et des zones à concentration limitante, ont permis de relier pertes de

37
performances et comportement cellulaire à l'intensité de la perturbation en terme de
fréquence et d'amplitude. Citons par exemple ici les travaux de Schweder et al. (1999)
qui ont montré une réponse au niveau de la transcription des gènes liés au stress, à
l'échelle de la seconde, chez E. coli cultivé dans des réacteurs industriels et scale down. Il
faut noter ici que l'exposition à des fluctuations répétées peut, elle aussi, induire à terme
des modifications physiologiques, comme par exemple la capacité des cellules à
répondre plus ou moins rapidement à un stress (mécanismes d’adaptation cellulaire).
En revanche, si au vu des études citées précédemment, il semble y avoir un effet du
mélange à l'échelle de la cellule sur la réaction biologique, ces effets sont encore peu
étudiés et leur importance mal définie.

1.2.5. Conclusion partielle

Le mélange turbulent est un phénomène relativement complexe faisant intervenir en

parallèle des mécanismes opérants à des échelles de taille et de temps très variables.
Cependant ces mécanismes sont de mieux en mieux compris par la communauté
scientifique et les avancées technologiques permettent désormais son étude à des
échelles de taille et de temps de plus en plus petites. De nombreuses techniques
permettent d'évaluer la qualité du mélange et les études en génie des procédés –
biotechnologie s'attachent désormais à mieux comprendre les interactions qu'il peut y
avoir entre mélange et réaction biologique. La compréhension des mécanismes de
réponse bactérienne à un défaut de mélange est/a été largement étudiée via des
cultures dans des bioréacteurs de type scale down, visant à reproduire à l'échelle
laboratoire les gradients subis dans les bioréacteurs de taille industrielle. Il est ainsi
communément admis qu'un mauvais mélange entraine une baisse de performance des
bioréacteurs, via des modifications métaboliques des cellules cultivées, qu'il s'agisse
d'un défaut de mélange à l'échelle du réacteur ou à l'échelle de la cellule, ce dernier cas
étant cependant moins fréquent et ses effets peut-être sous estimés.

Dans de nombreux procédés (polymérisation, précipitation, compétition entre réactions

chimiques…) impliquant conjointement des étapes de mélange et de réaction,
l’importance du micromélange a été démontrée (Bourne 2003). La comparaison des

38
échelles de temps caractéristiques pour le mélange et la réaction permet généralement
de définir le régime du procédé : régime chimique contrôlé par la réaction ou régime
hydrodynamique contrôlé par le mélange. Si cette démarche a largement fait ses
preuves dans le domaine des réactions chimiques, elle est néanmoins plus difficile à
mettre en place pour des bioréactions. En effet, s’il est aisé de considérer un temps
caractéristique de réaction dans le domaine du génie chimique, quel temps considérer
pour une cellule microbienne ? La figure I.4 illustre { titre d’exemple les différents
niveaux de réponse bactérienne et les temps caractéristiques associés.

Figure I.4 – Ordre de grandeur des temps de relaxation des microorganismes (Bailey and Ollis 1986)

L'étude théorique de l'interaction mélange - réaction biologique requiert de s'intéresser

aux temps caractéristiques de chaque phénomène :

 celui du mélange, accessible grâce aux nombreux travaux s’attachant {

décrire le mélange,

 celui de la (bio)réaction, moins aisé à évaluer. Quelle réaction? La

consommation du substrat? Son assimilation? Ou bien considérer la

39
 croissance cellulaire dans son ensemble? Ou encore, comme pour le cas
de l'amylase produite par Aspergillus cité plus haut, les temps d'induction
(de la répression) et de relaxation? Si les temps de génération cellulaire et
de consommation de substrat sont faciles d'accès par des dosages
simples, il est bien plus compliqué d'évaluer proprement des temps
d'induction de phénomène ou d'assimilation de substrat, malgré les
avancées réalisées récemment dans le domaine de l'étude des voies
métaboliques. Il existe bien sûr des mécanismes biologiques dont les
temps caractéristiques sont bien plus petits que ceux de la consommation
de substrat ou encore de la croissance. L'étude de Schweder et al. (1999)
fait état par exemple de l'induction d'une réponse transcriptomique à un
stress à l'échelle de la seconde.

Ceci pose donc la question du choix du niveau d’observation de la réponse biologique,

traitée plus loin dans un paragraphe consacré à la réponse physiologique.

1.3. Effets des contraintes hydrodynamiques

Yim and Shamlou (2000) définissent ainsi les contraintes s'exerçant sur des particules
en suspension dans un bioréacteur :

 Collision particule-particule et particule-support (i)

 Contraintes élongationnelles et de cisaillement induites par un

écoulement, qu'il soit laminaire ou turbulent (ii)

 Interactions physiques et physico-chimiques aux interfaces gazeuses (iii)

La densité des particules biologiques étant généralement peu différente de celle du

fluide environnant, on peut s'attendre à ce que les effets des collisions soient très
négligeables dans le cas de cellules cultivées en bioréacteurs. De plus, la suite de notre
étude ne mettant en jeu aucun transfert gazeux, le point (iii) ne sera pas développé ici.
C'est pourquoi ce chapitre ne traitera que des contraintes d'origine purement liée au
fluide, exercées sur les cellules.

40
1.3.1. Quelles sont les contraintes hydrodynamiques en bioréacteurs

[Link]. Expression des contraintes

Les particules en suspension, à condition que leur densité ne soit pas très différente de
celle du fluide, suivent le mouvement de ce dernier. Elles sont alors soumises à des
contraintes résultant des efforts exercés par le fluide en mouvement. Ces contraintes
peuvent être définies de façon globale ou plus précisément en calculant leurs
composantes dans chacune des directions du repère. Pour comprendre comment ces
contraintes peuvent interagir avec les particules, il convient de considérer les
propriétés rhéomécaniques de ces dernières, l'échelle des contraintes « principale »
étant celles apparaissant à l'échelle locale, soit celle de la particule considérée.

Toutes les particules en suspension dans un écoulement sont en interaction avec le

milieu environnant et de ce fait subissent des contraintes hydrodynamiques liées à leur
déplacement et/ou leur déformation dans cet écoulement. Les différentes contraintes
subies peuvent se résumer ainsi :

 Contraintes de pression (cette dernière ne sera pas développée puisque

largement négligeable),

 Contraintes de déformation visqueuses (tenseur des contraintes qui

donne les contraintes de déformation, soit élongation ou compression et
cisaillement),

 Contraintes de Reynolds ou contraintes turbulentes, liées au déplacement

de la particule et aux fluctuations turbulentes.

La contrainte de déformation visqueuse peut être exprimée sous la forme de tenseur, ce

qui sera abordé plus loin dans ce chapitre de bibliographie. En effet, les composants des
tenseurs permettent de définir précisément les types de contraintes subies (élongation
ou compression, cisaillement) alors qu'en génie des procédés une approche plus globale
est généralement privilégiée et c'est ce que nous allons tout d'abord développer. Cette
approche se propose de déterminer quelle est la nature des contraintes dominantes,

41
leur intensité, leur niveau de fluctuation et la durée d'exposition des cellules à ces
contraintes.

Les contraintes hydrodynamiques sont le résultat de l'effet de forces hydrodynamiques

exercées sur une particule suite à une fluctuation de la vitesse du fluide. Le calcul de la
valeur de la contrainte locale est donc basé sur l'estimation de la fluctuation de vitesse à
l'échelle locale, celle de la cellule. On définit ainsi le gradient de vitesse local G (s-1)
(Barbouche 2008):

u dp '²
G Eq I.1
dp

Duquel on déduit la contrainte visqueuse τ (Pa) en fonction de la viscosité µ (Pa.s) :

   G Eq I.2

On peut également définir une contrainte turbulente locale :

 t    u dp '² Eq I.3

où u '² dp est la vitesse quadratique moyenne, dont l'expression dépend de la zone dans

laquelle se trouve la particule (zone inertielle ou zone de dissipation visqueuse).

Il faut pour cela revenir à la théorie de la turbulence, déjà abordée dans la partie
consacrée au mélange. La théorie de Kolmogorov concernant les écoulements
turbulents suppose toute une cascade de dissipation d'énergie, des grandes échelles
(zone inertielle) aux plus petites (zone de dissipation visqueuse). La micro échelle de
Kolmogorov détermine la nature des contraintes hydrodynamiques auxquelles sont
soumises les cellules de diamètre dp en fonction de leur taille.

42
Zone inertielle dp >> λ k

Pour des particules de taille supérieure { λK, les forces s'exerçant sur les particules
résultent de la dissipation d'énergie dans la zone inertielle. Les particules subissent
alors majoritairement des contraintes turbulentes : fluctuations rapides de pression sur
la surface, entraînant compression, élongation et étirement intenses. L'équation du
gradient de vitesse peut s'exprimer en fonction d'une constante C, du taux de
dissipation de l’énergie cinétique turbulente et du diamètre de la particule :

1
u dp '²   3
 C1   Eq I.4
dp d ²
 p 

C1 ≈ 1,9 (Kolmogorov, 1958)

De ce fait, la contrainte hydrodynamique (équation I.3) peut être exprimée ainsi

   1,9 d  
   u' 2dp
2
p
2
3 Eq I.5

Les contraintes visqueuses sont généralement négligées dans cette zone.

Zone de dissipation visqueuse dp << λk

Pour des particules de taille inférieure, ce sont les contraintes de déformation issues du
mouvement des plus petits tourbillons (zone de dissipation visqueuse) qui dominent. Le
gradient de vitesse devient :

1
u '2dp Cv    2
   Eq I.6
dp 2  

43
 4
avec Cv 
15

et la contrainte visqueuse peut être estimée d'après l'équation suivante (Barbouche

2008; Yim and Shamlou 2000):

u ' 2dp 
   0,365 Eq I.7
dp 

Cas général :

Ces définitions de la contrainte subie par une particule dans la zone de dissipation
visqueuse ne considèrent qu'une contrainte visqueuse. (Schügerl et al. 2000) suggère
qu'à cette échelle, une contrainte dynamique globale, incluant les effets de la turbulence
peut être aussi calculée, dont l'expression est donnée ici:


 t  0,0676   d p2 Eq I.8


Pour les particules situées dans la zone de dissipation inertielle convective, la contrainte
turbulente est ainsi exprimée :

 t  1,9  d p 3
2
Eq I.9

Cela permet de définir une expression adimensionnalisée de la contrainte turbulente,

quelle que soit la taille de la particule par rapport aux échelles turbulentes :

a
t dp 
 A  Eq I.10
   t 

44
Les constantes a et A dépendant de l'échelle turbulente considérée t et trois zones sont

ici considérées :

Zone dissipative : dp < 6 λk a=2 A = 0,0676

Zone de transition : 6 λk < dp < 25 λk a = 4/3 A = 0,22

Zone inertielle : dp > 25 λk a = 2/3 A = 1,9

La valeur de la contrainte adimensionalisée en fonction de l'échelle considérée est

représentée sur la figure suivante (Schügerl et al. 2000):

Figure I.5 Expression de la contrainte adimensionnalisée en fonction de la taille de la particule considérée

Ainsi, la comparaison entre la taille des particules considérées et celle des tourbillons
indique quelle zone est déterminante pour la définition des contraintes. Cette zone
dépend alors de la dissipation d'énergie et de la taille des particules. Ainsi, plus la
particule est grande devant l'échelle de la turbulence, plus les contraintes auxquelles
elles sont soumises seront importantes et intenses.

45
Quelle que soit l'approche adoptée (contraintes turbulentes ou contraintes visqueuses),
la contrainte hydrodynamique subie par les particules en suspension dans un
écoulement est proportionnelle au taux de dissipation de l'énergie cinétique ε.

[Link]. Application aux bioréacteurs et lien avec la dissipation d’énergie

L'approche développée précédemment permet de décrire la nature des contraintes

dominantes (visqueuses ou turbulentes) et leur intensité en comparant l’échelle de
taille de la cellule par rapport à celle de la turbulence.

Si la contrainte est proportionnelle au taux de dissipation, celui-ci est rarement réparti

de manière homogène dans les bioréacteurs et une cellule transportée dans ce type
d’écoulement subit donc des contraintes fluctuantes. Une valeur moyenne de la
dissipation, même calculée { l’échelle cellulaire, ne reflète pas l’amplitude des
contraintes ni la durée d’exposition au stress.

Deux approches permettent d’appréhender ces fluctuations.

 L’approche Eulérienne consiste { considérer un réacteur compartimenté

dans lequel on considère non plus une valeur moyenne de dissipation
mais une densité de probabilité pour une plage de valeurs de dissipation
(on associe un pourcentage du volume { une plage d’intensité). Wray and
Hunt (rapporté par Boller and Blaser (1998)) résument ainsi les
contraintes induites par un écoulement turbulent : ils considèrent
l'écoulement comme la superposition de 4 zones (type d'écoulement) :
écoulement convergent, rotation dans les tourbillons, écoulement de
cisaillement, « streams » pour lesquels ils déterminent un volume et une
dissipation d'énergie relative et le type de stress dominant.

 Il peut être également intéressant d'accéder à l'histoire des contraintes

subies par les cellules (par un suivi de la particule le long de sa
trajectoire), c'est l'approche Lagrangienne. A la différence de l’approche
Eulérienne, qui considère une répartition des contraintes à un instant
donné, l’approche lagrangienne considère des cellules se déplaçant dans

46
 un écoulement hétérogène et enregistrant les fluctuations vues. C’est
l’approche qui permet d’intégrer les effets d’histoire, et qui est
développée lors du suivi de particules lancées dans un écoulement.

Ces deux approches permettent d’accéder { la dissipation d'énergie { l'échelle locale et

d’appréhender leur niveau de fluctuation. Ici, ce n’est plus une valeur moyenne de
dissipation qui est considérée mais plutôt une probabilité de se trouver dans une zone
d’intensité donnée via une cartographie du réacteur (Eulérien) ou un enregistrement
des contraintes subies le long de la trajectoire (Lagrangien).

Les valeurs locales de la dissipation d’énergie peuvent être approchées en résolvant

l’écoulement { l’aide de codes de mécanique des fluides numériques ou de façon
expérimentale, par PIV par exemple, dont le principe et de mesurer les vitesses de
particules fluorescentes dans l’écoulement considéré (Ducci and Yianneskis 2005;
Huchet et al. 2009).

Les avancées dans le domaine de la mécanique des fluides numérique (Computational

Fluid Dynamic, CFD) (codes et capacité de calcul des machines) permettent de calculer
ces valeurs à des échelles de plus en plus proches des cellules. La résolution des
écoulements par cette méthode permet d'extraire le tenseur des contraintes turbulentes
et le tenseur des contraintes de déformations. Dans le cas de fluides newtoniens, celui ci
est proportionnel au tenseur des contraintes visqueuses :

µ (tenseur des déformations) = (tenseur des contraintes visqueuses)

Le tenseur des contraintes visqueuses est ainsi exprimé :

 du  du dv   du dw  
  p  2        
 dx  dy dy   dz dx  
  dv du  dv  dv dw  
S vij        p  2     
  dx dy  dy  dx dy  
  du dw   dv dw  dw 
          p  2 
  dz dx   dz dy  dz 

47
Le tenseur des contraintes turbulentes contient les termes liés aux fluctuations de
vitesses. Il a la dimension d’une contrainte et, bien qu’il représente l’accélération
convective, il est couramment nommé ‘contrainte’ (White 2002).

  u '²  u ' v '  u ' w ' 

 
S tij    u ' v '  v '² v ' w ' 
  u ' w '  v ' w '  w '² 
 

Ces tenseurs sont des matrices symétriques, l'extraction des termes de la matrice
permet de définir les contraintes s'exerçant sur une surface. On distingue alors :

 Contraintes normales (diagonale de la matrice), compression ou

élongation : elles s’exercent perpendiculairement { la surface considérée.

 Contraintes tangentielles ou cisaillement (termes non diagonaux).

On retrouve ici la définition de la contrainte pour un fluide newtonien : G  

Dans les bioréacteurs de type cuve agitée, le cisaillement est bien entendu bien plus
intense à proximité de l'agitateur. Pour le cas de réacteurs aérés, outre les contraintes
liées à l'écoulement turbulent ou aux déformations visqueuses, les auteurs ont proposé
que les contraintes liées à l'éclatement des bulles est lui aussi très important et devient
la cause majeure de stress pour les cellules (Yim and Shamlou)

[Link]. Notions de rhéomécanique et viscoélasticité

Le terme rhéomécanique concerne l’étude des déformations et contraintes appliquées à

un solide. Toute contrainte appliquée à un corps solide a pour conséquence une
réponse: déformation, rupture. La rhéomécanique va s’attacher { décrire l'amplitude de
la déformation en fonction des forces mises en jeu, ainsi que l'éventuelle rupture. On
définit ainsi différents types de solides : élastique, visqueux et viscoélastique. Ces
notions seront rapidement définies dans les paragraphes suivants.

48
Pour toute déformation appliquée à un corps solide élastique, la réponse (contrainte)
sera proportionnelle à la déformation qui est réversible, linéaire et immédiate.

Si la déformation est assimilable à un allongement relatif  , on définit Ec, la constante

élastique ou module de Young (Pa, soit la dimension d'une contrainte). Les
déformations sont alors réversibles, linéaires et immédiates.

 a  Ec   Eq I.11

Pour une déformation de cisaillement on considère un module élastique de cisaillement

Gc [N.m-2 ou Pa] et la contrainte  c s'exprime :

 c  Gc   Eq I.12

Le comportement visqueux est lui dépendant du temps et permet la dissipation d'une

partie de l'énergie sous forme de chaleur. La contrainte est donc définie :

d
    Eq I.13
dt

La plupart des matériaux biologiques sont en réalité viscoélastiques (Yim and Shamlou
2000): la relation contrainte-déformation dépend du temps et l'objet, de part ses
propriétés élastiques, peut se relaxer c'est à dire retourner à l'état natif. Ainsi, au cours
du temps, chaque déformation induit une contrainte sur le solide, pouvant s'additionner
entre elles si leur fréquence (1/t) d'apparition est telle que l'objet n'a pas le temps de
relaxer.

Il existe de nombreux modèles décrivant le comportant viscoélastique des cellules, nous

allons ici résumer le modèle de Maxwell décrit par Yim and Shamlou (2000).

Pour un solide de Maxwell, on peut écrire

49
 du x d 
   Eq I.14
dy dt Gc

du x
représente la déformation globale [s-1] causée par une contrainte  [Pa] et  [Pa.s]
dy
correspond à la viscosité.


La constante élastique t e [s] est donc : t e 
Gc

Afin de définir laquelle des contraintes, visqueuse ou élastique, va dominer, il convient

de comparer le temps caractéristique de la réponse élastique te et celui de la contrainte
imposée tp. On considère alors le nombre de Debora (De), tel que :

te
De 
tp

Si le temps de la contrainte est très petit, donc De élevé, ce sont les contraintes
élastiques qui vont dominer, résultant en des contraintes élongationnelles (allongement
du solide).

Si au contraire, la durée de la contrainte est élevée, ce sont les propriétés visqueuses qui
vont dominer, et donc un stress lié à du cisaillement, résultant en la réécriture de
l'équation I.14 :

du x
  Eq I.15
dy

Force est de constater que dans la plupart des bioréacteurs, l'écoulement est tellement
hétérogène que bien souvent, les termes élastiques et visqueux sont à considérer.

Outre la déformation, tout solide soumis à une contrainte peut également se rompre. La
figure I.6 issue de (Yim and Shamlou 2000) résume les valeurs estimées d'efforts

50
nécessaires à la rupture d'une particule biologique (ce terme a la dimension d'un couple
exercé sur une surface).

Figure I.6 d’après (Yim and Shamlou 2000): estimation de la contrainte minimum nécessaire à la rupture
de la bioparticule considérée

En conclusion, toute particule ou ensemble de particules soumis à une contrainte

pourra donc répondre à cette contrainte par

 une rupture (si cette force est supérieure aux forces cohésives)

 une déformation (si la force exercée par la contrainte est inférieure à la

force qui maintient la cohésion de la structure). Pour des structures
viscoélastiques, la déformation sera plus ou moins amplifiée selon le
rapport fréquence d'exposition / temps de relaxation. Si la fréquence

51
 d'exposition est grande devant le temps de relaxation, la structure
reprendra sa forme initiale. Dans le cas contraire, si la fréquence
d'exposition est petite devant le temps de relaxation (i.e. la structure n'a
pas le temps de reprendre sa forme initiale), la contrainte peut conduire à
une déformation permanente ou à une rupture.

La prédiction du comportement d'une particule dans un écoulement vis à vis des

contraintes qu'il exerce nécessite :

 La bonne connaissance des contraintes hydrodynamiques, qui dépendent

de l'écoulement et de son organisation, et de la taille et la forme de la
particule sur laquelle elles s'exercent.

 La connaissance des propriétés biomécaniques de la cellule et une

évaluation correcte des constantes rhéomécaniques et des forces de
cohésion de la particule considérée. Dans le cas de cellules (bactéries,
levures, cellules animales...), ces constantes restent bien difficiles à
évaluer. Elles dépendent des propriétés physico-chimiques de la
membrane, ces dernières pouvant être grandement affectées par l'état
physiologique et l'histoire de la cellule.

[Link]. Propriétés des bioparticules et interactions avec l’écoulement

Des propriétés des composants...

Les cellules, tout comme leurs constituants, présentent des propriétés élastiques et
viscoélastiques, c’est pourquoi nous allons tout d’abord nous intéresser ici aux
propriétés rhéologiques et biomécaniques des membranes et des bio-polymères. De
manière générale, la biophysique s'intéresse beaucoup aux propriétés mécaniques des
tissus et membranes biologiques, ainsi que des constituants cellulaires tels le
cytoplasme, dont nous ne citerons que quelques exemples ici. Le peptidoglycane,
constituant majoritaire de la paroi bactérienne, possède de fortes capacités d'étirement,
allant jusqu'à 400 % lorsqu'il est soumis à un stress (Needham et al, 1991, rapporté par
(Yim and Shamlou 2000). Les propriétés mécaniques des bi-couches phospholipidiques

52
ont elles aussi été largement étudiées (Janmey and Kinnunen 2006). Dans un tout autre
registre, les brins d'ADN soumis à une contrainte élongationnelle peuvent doubler leur
longueur avant de rompre (Odell and Taylor 1994).

En conséquence et d'un point de vue purement physique, les cellules, au sens large,
(membrane et composés intracellulaires) peuvent se déformer ou rompre selon le
niveau de contrainte exercée. Le cas des hématies, dont les propriétés élastiques leur
permettent de se déformer suite à des contraintes induites par des fluides, peut être
rapporté ici. De nombreuses études s'attachent en effet à décrire leur comportement
dans les écoulements sanguins : leur déformation permet le passage dans de petits
capillaires sanguins et leur agrégation sous les effets des contraintes mécaniques, est
critique pour la santé.

Cependant, la membrane externe des cellules, sensible aux contraintes mécaniques, est
constituée d'un réseau organisé de polymères : peptidoglycane, double couche
phospholipidique... Etant donné que l'activité physiologique réalisée à la paroi est très
variée, les composés de la membrane et leurs propriétés mécaniques sont très
hétérogènes et cette dernière est loin de constituer une surface uniforme, complexifiant
de ce fait un peu plus l'étude des interactions milieu environnant – membrane et
rendant encore un peu plus compliquée la prédiction des propriétés mécaniques de la
paroi extérieure. De plus, des changements dans la structure de ce réseau peuvent être
induits par des contraintes extérieures, telles celles exercées par l'écoulement du fluide.

... à celles des cellules

Si les effets de l'écoulement sur la conformation de cellules biologiques sont largement

rapportés, la prédiction de la déformation ou de la rupture est difficile à prévoir. En
effet, les constantes rhéomécaniques caractéristiques nécessaires à la modélisation sont
relativement difficile d'accès et ne sont pas prédictibles, comme évoqué précédemment.
La caractérisation du comportement rhéologique d'une cellule ou d'une population
cellulaire peut être réalisée via des études en Microscopie à Force Atomique (AFM) ou
plus simplement, à l'aide d'un rhéomètre. Ces deux méthodes ne vont pas sans la
présence de biais dans la mesure : méthode de fixation de la cellule pour l'AFM,

53
interaction avec le milieu de culture et effet de la concentration cellulaire pour le
rhéomètre. Cependant, quelques articles font état de propriétés rhéologiques pour des
cellules bactériennes : on trouve dans la littérature (Rotsch et al, Investigating living
cells) par exemple une valeur du module de Young allant de 0,5 à 200 kPa pour des
bactéries. Des études similaires ont été menées pour des bactéries organisées en
biofilms. De plus, la surface des cellules bactériennes est décorée de nombreux
polymères, protéines, polysaccharides, lipopolysaccharides… qui interfèrent également
avec les propriétés mécaniques et d’adhésion des cellules.

Les cellules peuvent également présenter une élasticité anisotrope, c'est à dire que la
résistance aux stress tels l'étirement est variable en fonction de la direction.
L'anelasticité est induite par le stress et requiert de l'énergie dissipée sous forme de
chaleur. La membrane est ainsi localement fragilisée, entraînant une modification de ses
propriétés élastiques. De plus, la modification de la forme des cellules sous l'effet des
contraintes liées à l'écoulement (principalement l'élongation) rend cette étude encore
plus difficile puisque la surface cellulaire exposée au stress s'en trouve modifiée, sans
compter que la dissipation de l'énergie sous forme de chaleur, peut modifier et fragiliser
la structure des cellules. Du fait de l'anelasticité, les cellules cultivées dans un
bioréacteur, qui n'ont par conséquent pas toutes la même orientation par rapport à
l'écoulement, peuvent présenter une réponse au stress faussement dépendante du
temps, le temps justement que toutes les cellules soient passées par l'orientation les
rendant les plus sensibles.

Cependant, on relève dans la littérature d’autres exemples d'effet de contraintes sur un

matériau biologique, le mécanisme de réponse étant encore mal compris. Dans la
section suivante, nous proposerons une brève revue des interactions cellule –
contrainte relevées dans la littérature. La compréhension des mécanismes moléculaires
mis en œuvre pour fournir une telle réponse est du registre de la biophysique et ce
point ne sera pas, ou très peu, abordé ici.

[Link]. Phénomènes d’agrégation et d’adhésion

54
N’oublions pas que dans un ensemble de particules dans un écoulement, elles peuvent
interagir aussi entre elles : suite aux rencontres et autres collisions provoquées par
l’écoulement, certaines cellules ont la possibilité d’adhérer entre elles et de former un
agrégat.

Selon l’approche physico-chimique, tout processus d’adhésion ou d’agrégation est le

résultat d’interactions intermoléculaires s’établissant entre particules ou entre une
particule et une surface. On cite alors :

 les interactions de type électrostatique ;

 les interactions liées aux forces de van der Waals (apolaires);

 et enfin les interactions polaires (hydrophiles/hydrophobes, liaisons

hydrogène).

Les théories DLVO (initialement formulée par Derjaguine, Landau, Verwey, Overbeek
dans les années 1940) et DVLO étendue par van Oss et ses collaborateurs (prenant en
compte les interactions électrostatiques), issues de la physico-chimie des colloïdes,
permettent de décrire le comportement de particules en suspension et leurs
interactions. Dans le cas d’interactions entre deux bioparticules, il convient de
considérer également les interactions stériques, type d’interaction intervenant en la
présence de macromolécules. Adsorbées ou fixées à la surface des particules, ces
macromolécules peuvent modifier charge de surface et affinité desdites particules ou
conduire { un encombrement stérique, empêchant le rapprochement. L’interaction, {
priori répulsive, peut être attractive si les polymères parviennent { s’accrocher entre
eux, c’est le phénomène de pontage.

Ces considérations sont résumées dans la théorie DLVO mais la réalité est plus
complexe. Les deux particules en interaction peuvent se déformer et entrent alors en
jeu les effets plastiques et élastiques, de plus, dans le cas d’interaction dans un
écoulement, il convient de tenir compte des forces liées à cet écoulement.

55
Les flocs résultant de processus d’agrégation ont généralement une dimension fractale,
la croissance des agrégats donnant lieu à des courbes de distribution de taille
caractéristique présentant plusieurs pics : distributions modales.

La formation d’agrégats dans un écoulement requiert donc ;

 Une fréquence de collision correcte pour permettre l’interaction

 Une bonne efficacité de collision, qui dépend des propriétés d’adhésion

des particules

La taille finale des agrégats dépend de l’équilibre entre forces hydrodynamiques

exercées sur l’agrégat et forces de cohésion.

1.3.2. Effets des contraintes hydrodynamiques sur des cellules en bioréacteurs

[Link]. Effets des contraintes liées à l’écoulement sur des cellules en suspension

La théorie suppose que les cellules subissent les contraintes hydrodynamiques les plus
importantes si leur taille est similaire à celle de la taille des tourbillons du domaine de
dissipation inertielle convective. Cela implique que les cellules concernées soient de
taille supérieure { l'échelle de Kolmogorov (λk) précédemment définie. Cependant, il
existe bel et bien des contraintes qui s'exercent sur des cellules de taille inférieure { λ k
(Nienow 2006) : celles-ci, sans être immédiatement détruites sous l'effet des
contraintes turbulentes (cas de particules de taille supérieure à l'échelle de Kolmogorov
et donc subissant un phénomène de rupture instantané si les forces rencontrées sont
supérieures à leur force de cohésion), peuvent fournir une réponse physiologique plus
subtile que la simple et immédiate destruction sous l'effet des contraintes (zone
inertielle : déformation ou rupture). Ainsi, les cellules peuvent fournir une réponse plus
modérée lorsqu’elles sont dans la zone de dissipation visqueuse.

Très peu d'études concernent les effets des contraintes hydrodynamiques (de l'ordre de
celles rencontrées habituellement dans les bioréacteurs) sur des cellules bactériennes,
et le peu qui le font ne relèvent que peu d'effet sur la physiologie. Cela s'explique

56
probablement par le fait que, contrairement aux cellules animales, celles ci sont bien
plus résistantes aux contraintes subies dans les gammes habituelles et les hécatombes
liées à de trop fortes contraintes mécaniques ne sont généralement pas à déplorer dans
le cas de cultures bactériennes. Néanmoins, sans être soumises à des stress létaux, la
physiologie de la cellule comme la structure de ses composants peuvent être affectés.

Réponse cellulaire macroscopique et génétique

Sahoo et al. (2003) ont étudié l’influence du cisaillement sur des cultures de Bacillus
subtilis en réacteur Couette alimenté en oxygène via le cylindre interne (membrane
perméable { l’oxygène). Ils ont noté une diminution de la taille des cellules, une
augmentation du taux de croissance et de la concentration cellulaire finale pour des
cultures réalisées avec un taux de cisaillement de 1480 s-1 comparé à une culture
témoin, réalisée en fiole agitée pour lesquelles le cisaillement est estimé à 0,028 s -1 (soit
une contrainte de cisaillement exercée sur la cellule de 2,8 x10-5 N.m-2). Ces
observations sont complétées par des mesures de l’activité spécifique de deux enzymes,
catalase intracellulaire et protéase, qui témoignent de l’intensification de l’activité
cellulaire. Une réponse génétique a aussi été remarquée au niveau de la transcription
d’un facteur de stress : le facteur sigma B dont l’expression est contrôlée par la présence
d’espèces oxydantes { l’intérieur de la cellule. La réponse au stress de cisaillement au
niveau génétique est donc exprimée via le niveau de stress oxydatif. Il est nécessaire de
faire remarquer ici que le kla peut lui aussi être modifié par ces mêmes paramètres qui
font varier le cisaillement, ainsi, une augmentation de la vitesse de rotation aura aussi
pour conséquence une amélioration du transfert d’oxygène dans le milieu et sera donc
potentiellement source de stress oxydatif.

Les observations de Sahoo et al. (2003) sont partiellement contraires aux conclusions
de Arnaud et al. (1993), pour qui le cisaillement plus élevé entraîne une augmentation
de la taille des cellules. Cependant, elles démontrent clairement une réponse
bactérienne à la contrainte hydrodynamique imposée.

Hewitt et al. (2000; 1999) ont travaillé sur des cultures de Escherichia coli soumises à
des niveaux d'agitation et d'aération largement supérieurs à ceux habituellement

57
pratiqués dans les bioréacteurs, exposant donc les cellules à de fortes contraintes. A la
différence des conclusions de Wase and Patel (1985) pour qui une forte agitation
entraîne l'augmentation du volume intracellulaire pour équilibrer les pressions
osmotiques, leurs résultats vont dans le sens de l'indifférence des bactéries vis à vis des
contraintes mécaniques. Pour la plupart des conditions d'aération et d'agitation, les
paramètres intrinsèques de la cellule, observés par cytométrie en flux, ne sont pas
affectés : taille, potentiel membranaire et structure cellulaire. Ils remarquent cependant
que pour de fortes agitations, la couche de polysaccharide est arrachée (visualisation au
Microscope à Transmission Electronique TEM).

Smith et Greenfield (Barbouche 2008) ont noté une augmentation du flux glycolytique
parallèlement { l’augmentation des contraintes hydrodynamiques sur des hybridomes
(cellule animale). De même, Confer and Logan (1991) remarquent que l’assimilation de
macromolécules comme le dextrane ou la BSA (Bovine Serum Albumin) est favorisée
par le cisaillement (taux de cisaillement de l’ordre de 200 s-1) chez E. coli et Zoogloea
ramigera. En effet, l’agitation conduit { une augmentation de l’assimilation bien
supérieure { celle liée { l’amélioration du transfert de matière résultant de
l’amélioration du mélange par l’agitation.

Rikmanis et al. (2007) font état du concept de « turbohypobiosis » pour décrire

l'interaction entre une cellule et son environnement turbulent. Ce terme fait sa
première apparition dans la littérature dès 1986 et fait référence au fait que sous l'effet
de contraintes turbulentes, les mécanismes cellulaires sont altérés, la rupture de la
cellule étant un cas extrême de turbohypobiosis. Dans une revue parue en 2007, ils
interprètent les résultats obtenus dans des réacteurs scale down (perturbation du
métabolisme), non plus comme des conséquences en termes de transfert de matière,
mais comme une réponse à un stress turbulent. Au delà du fait qu'ils remettent en cause
bon nombre de conclusions avec une théorie basée sur des arguments très fragiles, ils
ont le mérite de recenser de nombreux travaux. Par exemple, les travaux de Namdev et
Dunlop, sur des cellules végétales, ont montré que l’application de contraintes sur des
cellules entrainait une accumulation de Ca2+ dans le cytoplasme ainsi que l’activation de
protéines de stress. De la même façon, Berzins et al. (2001) font état de modification de

58
l’agrégation et de l’arrangement entre cellules (Trichoderma viride, Sphaerotilus natans),
modifications morphologiques (Penicillinum chrysogenum) et diminution de l’activité
biologique (Brevibacterium flavum) suite à l’augmentation de la turbulence
(turbohypobiosis).

Gao et al. (2001) montrent que la contrainte de cisaillement permet d'améliorer la

production de microcin B17 chez E. coli.

Enfin, les travaux de Cussatlegras and Le Gal (2004) montrent que les cellules du
dinoflagellé Pyrocystis noctiluca, sont elles aussi sensibles à la turbulence. Cultivées
dans un réacteur Couette dans des régimes transitoires et laminaires, leur fluorescence
est bien moins importante que lorsqu’elles sont dans des conditions turbulentes ou
suite { un changement brusque de l’écoulement dans lequel elles sont placées.

Modifications locales : effet des contraintes sur les membranes cellulaires

En ce qui concerne les membranes, on peut trouver dans la littérature plusieurs

exemples de modification de structure au cours de la croissance induite par des
contraintes hydrodynamiques. C'est le cas par exemple de la paroi de Egregia menziesii
(Hackney et al. 1994) dont l'organisation des polysaccharides constitutifs est
dépendante des stress rencontrés au cours de la croissance. Il en est de même pour la
croissance hyphale de Neurospora crassa pour laquelle des études ont précédemment
fait état d'une biopolymérisation des précurseurs et des enzymes excrétées contrôlée et
induite par les contraintes liées à l'écoulement. Cependant, les phénomènes
biophysiques conduisant à l'augmentation de la résistance mécanique des parois ne
sont pas encore complètement compris. D'autre part de récents travaux font état de
réponse physiologique non négligeable de la part de cellules eucaryotes soumises à un
stress mécanique (Janmey and Weitz 2004; Vogel and Sheetz 2006) et les contraintes
exercées sur les membranes externes peuvent provoquer une réponse chez les bactéries
(induction de la production de polymères, Schwab and Ganzle, 2006). Janmey and
Kinnunen (2006) suggèrent ainsi que pour des cellules entourées d'une bicouche
phospholipidique, celle ci peut détecter des stress et y répondre, en association avec les
protéines transmembranaires ou des protéines de surface. De manière générale, on

59
trouve de nombreuses études de l'interaction entre fluide et structure biologique
déformable (Alpkvist and Klapper 2007) ; Duddu et al., 2008; Zhang et al., 2000; Zhu
and Peskin, 2007). (Janmey and Kinnunen 2006) proposent une revue de travaux sur
des membranes phospholipidiques. Les propriétés biophysiques des membranes leur
permettent des déformations, qui seront 'vues' par les protéines transmembranaires. La
tension exercée sur une membrane peut induire une réponse enzymatique au stress, et
affecter les propriétés de transport des canaux transmembranaires. Ainsi, l’induction de
la synthèse de fructanes (EPS) peut être liée à une pression sur la membrane chez
certains lactobacilles (Schwab and Ganzle 2006), ces molécules constituant une
protection pour la membrane.

A la frontière entre biologie et biophysique, Lau et ses collaborateurs (Lau et al. 2009)
ont montré que des modifications dans la structure de la capsule polysaccharidique de
Pseudomonas aeruginosa affecte de façon significative les propriétés d'adhésion de la
cellule, ainsi que les propriétés de cohésion et viscoélastiques du biofilm. Ainsi, une
modification dans la composition du lipopolysaccharide (qui, dans cette étude avait une
origine génétique) entraîne des modifications conséquentes des propriétés mécaniques
de la cellule.

Ainsi, des mécanismes d’ordre biophysique peuvent être { l’origine de la détection du

stress par les cellules bactériennes. Une enzyme transmembranaire déformée sous
l’effet d’une tension exercée sur la membrane verra peut-être sa structure
tridimensionnelle modifiée et par voie de conséquence, son activité et sa spécificité. De
plus, comme mentionné plus haut, les contraintes hydrodynamiques, via de subtiles
modifications à la surface de bio-particules, peuvent considérablement en modifier les
propriétés.

A titre d’exemple d’interactions entre contraintes turbulentes et activité enzymatique,

Ghadge et al. (2005) ont fait état de la désactivation d’une enzyme, la cellulase, sous
l’effet des contraintes normales dans des bioréacteurs assez fortement agités (taux de
dissipation allant de 0,02 à 12,56 kW/m3). Ces résultats sont à mettre en parallèle avec

60
des travaux mettant en avant des modifications structurelles des biopolymères dans des
écoulements (Pelletier et al. 2001; Priebe et al. 2010).

[Link]. Impact de la structure de l’écoulement et des contraintes sur les populations

bactériennes

Cas des biofilms et des flocs

Le comportement des biofilms (population bactérienne, le plus souvent mixte,

adhérée à une surface et emprisonnée dans une matrice) en fonction des contraintes
hydrodynamiques a été largement étudié. L’analyse du comportement des biofilms dans
un écoulement n’est pas l’objet de cette étude et trouve sa place ici { titre d’illustration
des effets de l’hydrodynamique sur la structure d’associations de cellules agrégées et
emprisonnées dans une matrice.

Il en résulte que l’écoulement peut influencer la composition et la structure du biofilm

(densité et organisation interne) de part les contraintes apportées qui érodent le biofilm
et lui soutirent les éléments les moins liés et de part les contraintes d’ordre chimique
qu’il implique (apport de substrat, oxygène…)

D’autre part, leur forme peut être modelée par l’écoulement. Besemer et al. (2007) ont
étudié la croissance de biofilms sous différents régimes d'écoulement. Ils ont montré
que le biofilm était ainsi sculpté et modelé au cours de sa croissance par le flux. La
croissance d'un biofilm dans un écoulement laminaire ne privilégie aucune direction. En
régimes transitoires et turbulents apparaissent des fils (streamers) et la surface
présente des arêtes, orientées par le courant (Puervforj 2002). Dans des écoulements
réguliers (contrainte unidirectionnelle), les biofilms tendent à s'allonger. En effet, les
cellules tendent à s'orienter dans l'écoulement de façon à minimiser les contraintes
subies. Ainsi, la sculpture de la forme du biofilm par l'écoulement permettrait aux
cellules agrégées une organisation réduisant les efforts et contraintes auxquelles elles
sont soumises (Taherzadeh et al. 2010). Un biofilm cultivé sous des contraintes fortes
sera par conséquent moins épais que celui développé en régime laminaire (Battin et al.
2003).

61
Les propriétés rhéomécaniques des biofilms ont elles aussi été l’objet de beaucoup
d’attention. Les travaux de Stoodley et al. (2002) par exemple, visent à étudier les
propriétés viscoélastiques des biofilms de Pseudomonas aeruginosa, par le suivi de la
déformation du biofilm en fonction des contraintes de cisaillement appliquées. On
observe un comportement élastique pour des stress de quelques secondes, et au delà,
un comportement visqueux (et linéaire...). C'est la matrice polymérique qui contrôle les
forces de cohésion. Par analogie avec les observations en couette, en écoulement
tourbillonnaire, les agrégats restent dans la structure un temps suffisamment long pour
que les propriétés visqueuses dominent, d'où la déformation – ici allongement -, alors
que dans le régime turbulent, la contrainte n'est pas assez longue et donc, les propriétés
élastiques dominent, avec retour à l'état initial rapidement. De plus, de fortes
contraintes turbulentes provoquent rupture et petits agrégats. En ce qui concerne l'effet
de l'intensité de la contrainte sur la forme du biofilm, celle ci doit être suffisamment
importante pour induire une déformation, les biofilms cultivés sous de faibles
contraintes ne forment pas de filaments mais de petits monticules. Ces observations
sont à rapprocher du comportement d'un fluide à seuil d'écoulement. Dans des cas de
contraintes extrêmes, on observe un détachement et la rupture du biofilm.

Cas des « bacterial streamers »

Si, comme nous l’avons précédemment évoqué, le terme de biofilm se réfère { des
populations de cellules adhérées à une surface, le terme de « streamers » ou « bacterial
streamers » est utilisé pour décrire une structure filamenteuse en suspension dans un
écoulement. Il s’agit de populations mixtes ou pures, observées { l’origine dans les
écosystèmes naturels (lit des rivières ou des torrents), et rapportées dans des
écoulements turbulents en laboratoire (Stoodley et al. 1998). L’équipe de Howard Stone
(Rusconi et al. 2009) a reproduit ce phénotype dans des micro-canaux en conditions
laminaires, à des vitesses de fluides allant de 0,2 à 1 mm/s, soit très lent par rapport aux
vitesses instantanées observées en bioréacteurs. Néanmoins, leurs travaux fournissent
d’importants renseignements concernant la formation et l’organisation de telles
structures en rapport avec l’écoulement. Tout d’abord, ces streamers se situent au
centre des canaux, se rattachant aux seules arêtes internes qu’ils rencontrent (figure

62
I.7), et n’apparaissent jamais dans des écoulements rectilignes. La localisation
particulière est liée à une accumulation de la biomasse à cet endroit précis.

Figure I.7 (Rusconi et al.) : observation de streamer dans un écoulement laminaire

Le filament (apparition après 6 à 7 h), d’abord constitué d’un petit nombre de cellules
emprisonnées dans une matrice polymérique, croit ensuite très rapidement (environ
1h) avec l’adhésion de cellules sur la matrice déj{ formée. La matrice constitue un
élément essentiel à la formation du streamer, formation d’autant plus rapide que la
concentration cellulaire est importante.

L’apparition de streamer semble être également liée à la configuration particulière de

l’écoulement. Si dans ce cas précis l’écoulement est laminaire, des simulations
numériques de l’écoulement ont montré qu’{ proximité des angles, un léger écoulement
secondaire était superposé { l’écoulement principal suivant le courant. Cet écoulement
secondaire consiste en tourbillons contrarotatifs allant du centre des canaux vers
l’extérieur, entraînant une accumulation de biomasse au centre. Les auteurs supposent
que ces tourbillons favorisent le détachement des substances polymériques produites
par la biomasse adhérée aux parois et les transportent ensuite vers le centre.

Dans les écoulements turbulents, le streamer est lui aussi { l’origine de perturbations de
l’écoulement avec la formation de vortex de Karman, engendrant la cause même de son
mouvement oscillatoire (Taherzadeh et al. 2010) (figure I.8).

63
 Figure I.8 d’après Taherzadeh et al. (2010) : perturbation de l’écoulement par un streamer

1.4. Réponse biologique

L’objectif de ce chapitre est d’expliciter les étapes menant { la manifestation

phénotypique de la réponse bactérienne et d’identifier les possibles moyens de
détection de la réponse biologique pour l’expérimentateur.

64
1.4.1. Du phénotype au génotype

Les nombreux exemples cités précédemment tendent à démontrer que de nombreuses

cellules et bioparticules répondent aux stress causés par les contraintes
hydrodynamiques auxquelles elles sont soumises. Une des manifestations les plus
claires de la réponse biologique est une modification de l’aspect phénotypique et de ses
caractéristiques :

 Croissance ralentie ou retardée

 Changements morphologiques : taille, forme, organisation entre cellules

 Modification de l’activité biologique : activité enzymatique, activité

spécifique, de l’état énergétique, des constituants cellulaires...

 Perturbation de la viabilité cellulaire (Barbouche 2008; Barbouche et al.;

Hewitt et al. 1999)

 Métabolisme : modification du catabolisme, de l’anabolisme

Tous ces mécanismes sont fortement imbriqués et le chemin menant d’une contrainte {
sa manifestation phénotypique est parfois compliqué, la réponse globale de la cellule
étant très certainement le résultat de la combinaison entre des facteurs physiques et
biologiques.

Toute cellule soumise { un stress va tenter de diminuer l’intensité de ce stress, par

exemple en utilisant une autre source de nutriment lorsqu’elle est épuisée. Lorsque le
stress est persistant et/ou dommageable pour les constituants cellulaires, la résistance
devient nécessaire. Elle peut être acquise par une modification irréversible du matériel
génétique (mutation, remaniement), conduisant à une meilleure tolérance aux
conditions environnementales, ou par l’induction de systèmes de protection et de lutte
contre le stress ou de réparation contre les dommages causés. Ces réponses impliquent
donc :

 Une régulation biochimique : inhibition ou au contraire activation de

certaines enzymes du métabolisme. C’est le cas par exemple du shift

65
 métabolique de L. lactis qui sera évoqué par la suite ou du métabolisme
overflow chez E. coli : un déséquilibre dans la concentration cellulaire de
certains métabolites oriente les flux métaboliques, inhibant ou au
contraire activant l’activité d’enzymes déj{ présentes et actives.

 Une régulation génétique dans le cas de la résistance permet,

contrairement au contrôle biochimique, une adaptation de la cellule en
réponse à des changements environnementaux sur du long terme.
L’expression des gènes et des opérons codant pour des enzymes
cataboliques est induite par la présence d’un substrat approprié. Une telle
induction peut être réalisée à un niveau transcriptionnel en activant ou
réprimant l’expression des gènes (cas de l’opéron lactose dont le
fonctionnement est rappelé brièvement ici : la transcription du gène
codant pour la dégradation du lactose est empêchée par la fixation d’un
répresseur en amont de ce gène en l’absence de lactose. La présence de
lactose dans l’environnement va empêcher la fixation du répresseur et
ainsi permettre la transcription du gène codant pour la beta
galactosidase), ou en jouant sur l’antiterminaison et l’élongation des
transcrits.

Dunlop et ses collaborateurs (Dunlop et al. 1994; Namdev and Dunlop 1995),
pressentent l'existence de protéines de stress, qui sont exprimées par des cellules à des
fins de protection vis-à-vis des stress subis (conditions environnementales non
optimales).

Le cas de la répression catabolique fait partie des réponses génétiques. Elle implique
des protéines régulatrices CcpA (Catabolite control protein A) faisant office de
régulateur transcriptionnel et se liant sur des sites (cre) localisés en amont, { l’intérieur
ou en aval des promoteurs des gènes cataboliques, entraînant ainsi soit l’activation, la
répression ou l’avortement de la transcription. Si CcpA est le régulateur principal
impliqué dans la répression catabolique, d’autres régulateurs transcriptionnels jouent
également un rôle important dans le contrôle de l’expression des gènes cataboliques.

66
Tout comme CcpA, ils peuvent agir sur la transcription de façon différente en la
réprimant, en l’activant ou en empêchant la terminaison de la transcription.

Quelques exemples de réponse adaptative

L. lactis ssp. cremoris MG 1363, prélevé en phase exponentielle de croissance et incubé

au pH non létal de 4,5 pendant 15 min, présente un taux de survie de 100 % après 3 h
d’incubation { pH 4 alors que ce taux était 10 000 fois plus faible sans préadaptation des
cellules (Rallu et al. 1996) De même, L. lactis ssp. lactis IL 1403 voit son taux de survie
augmenter lors d’un stress acide sévère (pH 3,9) après une incubation de 30 min à pH
5,5 (Hartke et al. 1996).

L’induction de la réponse adaptative chez L. lactis ssp. cremoris NCDO 712 augmente le
taux de survie de la bactérie lorsqu’elle est soumise { un stress acide sévère mais la
protège également contre d’autres stress, thermique, oxydatif, osmotique (O'Sullivan
and Condon 1997). La réciproque n’est pas vraie sauf pour le choc thermique qui
confère la résistance au stress acide. D’autre part, l’entrée des bactéries en phase
stationnaire confère également une grande résistance au stress acide mais également à
d’autres stress physico-chimiques (Hartke et al. 1996; Kim et al. 1999).

La réponse adaptative à des conditions non optimales de température implique

également la synthèse de protéines, CSPs (Cold Shock Proteins) ou HSP (Heat Shock
Proteins) pour la réponse adaptative au froid ou au chaud respectivement. L’induction
des CSPs par le froid est complexe mais malgré tout probablement essentiellement
contrôlée à un niveau post-transcriptionnel (Goldenberg et al. 1996; Kaan et al. 1999).
L’induction de la résistance nécessite généralement une adaptation des cellules pendant
une durée de 30 min à 1 heure.

Outils d’investigation

L’investigation de la réponse bactérienne peut être réalisée selon les approches

transcriptomiques, protéomiques et métabolomiques (voir figure I.9) ou grâce à
l’utilisation de la cytométrie en flux (viabilité cellulaire) ou de marqueurs fluorescents
témoins de l’activité transcriptomique (Lara et al. 2008; Lara et al. 2006). La sensibilité

67
de ces méthodes s'améliorant, il devient possible d'observer une réponse cellulaire à
des temps et fluctuations très courts.

Figure I.9 : schéma simplifié des niveaux de régulation et d’observation de la réponse biologique

Ainsi, Schweder et al. (1999) proposent de suivre les perturbations subies par E. coli
dans un bioréacteur (en termes de fluctuations de la concentration en substrat) en
suivant le niveau d’expression des gènes liés au stress (excès ou limitation en glucose,
stress osmotique ou limitation en oxygène). Les niveaux d’ARN messagers (ARNm) liés
à ces gènes sont en effet bien plus élevés dans les zones du bioréacteur dans lesquelles
la cellule est effectivement soumise { un stress (zone d’alimentation riche en substrat).
Ils ont montré que la réponse au niveau des ARNm apparait { l’échelle de la seconde et
constitue de ce fait un outil correct de suivi des modifications induites par la conduite
du procédé. Les progrès réalisés dans le domaine de l’analyse des flux métabolomiques
permettent de détecter une réponse cellulaire au plus tôt via le suivi des métabolites

68
transitoires. Cela ouvre la possibilité de créer des modèles métaboliques plus précis
(Chassagnole Christophe et al. 2002; Rizzi et al. 1997; Rizzi et al. 1996), et d’inclure une
réponse adaptative dans les modèles biologiques.

1.4.2. Influence de la biologie sur son environnement

Les paragraphes précédents ont permis de montrer que les cellules ont la capacité de
répondre aux contraintes imposées par leur environnement, et, le cas échéant, de
s’adapter { ce dernier. La manière avec laquelle un microorganisme s’adapte et répond
peut également constituer un facteur de modification de l’environnement : l’excrétion
de métabolites et la production de biomasse peuvent par exemple modifier les
propriétés physico-chimiques du milieu de culture telle la viscosité. La composition
chimique du milieu est également influencée par le comportement de la biomasse. La
baisse du pH conséquente à la production de métabolites acides peut conduire à une
modification des propriétés rhéologiques de l’ensemble. Plus critique, l’adaptation de
cellules à des concentrations limitantes en substrat peut conduire à une augmentation
de leur capacité d’assimilation (Ferenci 1996; 1999a; 1999b; Ferenci and Robert 2007;
Lara et al. 2006). Ces cellules, placées dans des conditions plus favorables, pourront
donc consommer ce substrat de façon plus rapide, et être elles même { l’origine de
gradients de concentration.

La présence de gradient d'un des paramètres de culture peut entrainer la formation de

gradients pour d'autres paramètres (Lara et al. 2006). Biomasse et environnement sont
en équilibre très instable et la moindre perturbation peut causer une cascade de
modifications, pouvant à terme remettre en cause tous les paramètres de conduite et de
design du procédé.

1.5. Conclusion – transition : Quelles sont les contraintes imposées quant aux
outils choisis pour l’étude des interactions hydro - bio

Les interactions entre conditions hydrodynamiques et réponse biologique sont d’une

importance critique dans le domaine du design et de l’opération des bioréacteurs, se
faisant ressentir à toutes les échelles (de la micro échelle à la macro échelle) et peuvent

69
conduire à des stress chimiques (mélange) ou mécaniques (contraintes de cisaillement),
ou encore conduire à une organisation de la population cellulaire gouvernée par la
structure de l’écoulement (streamers, agrégats). La compréhension de ces interactions
est rendue délicate par la multitude de paramètres interdépendants en ce qui concerne
l’aspect purement procédé et par le fait que la réponse biologique, qui peut apparaitre {
de multiples niveaux, est difficilement imputable { l’effet d’une contrainte précisément
identifiée. Cette première partie de l’étude bibliographique conduit { plusieurs
constatations qu’il faudra considérer lors du choix des outils utilisés lors de l’expérience
modèle :

 Si l’on considère le procédé, la modification d’un paramètre d’agitation

par exemple, entrainera toute une cascade d’effets sur l’organisation de
l’écoulement, dont dépendent les qualités de mélange et le niveau de
contrainte subie. S’il est relativement impossible de dissocier ces effets, il
convient pour l’étude des interactions { l’échelle locale de choisir un
réacteur avec peu d’hétérogénéité macroscopique, d’où le choix du
réacteur de type Couette qui sera détaillé dans le chapitre suivant.

 L’outil biologique doit permettre d’obtenir une réponse appréciable

(qualitativement et quantitativement) à une contrainte identifiée. Cette
problématique se résume en trois questions ; quel type de réponse ? A quel
niveau choisit-on de l’observer ? Pour quel type de contrainte ? En termes
de stress chimique par exemple, l’outil doit être capable de témoigner des
fluctuations de concentration ou du flux de substrat.

 Le temps caractéristique de la réponse doit être comparable au temps

caractéristique de l’exposition au stress.

 L’ajout de gaz complexifie grandement la mise en œuvre des simulations

numériques, impliquant la prise en compte de la phase gazeuse et
constitue une source supplémentaire de contrainte pour les cellules. Dans
l’objectif de simplifier au maximum les conditions expérimentales afin
d’avoir une analyse la moins bruitée possible, il conviendra donc de

70
 choisir un microorganisme qui peut être cultivé en anaérobiose.

Ces constatations nous ont amené à choisir la souche Lactococcus lactis NCDO 2118,
largement étudiée par le passé au laboratoire. La réponse biologique pouvant être très
variable, la dernière partie de ce chapitre traitera du métabolisme, de la production de
polysaccharides et des propriétés d’adhésion de cette espèce.

2 ETUDE DES INTERACTIONS HYDRO – BIO A TRAVERS DES CULTURES DE LACTOCOCCUS LACTIS
EN REACTEUR COUETTE

2.1. Réacteur couette

2.1.1. Présentation

Le réacteur Taylor-Couette (figure I.10) est constitué de deux cylindres concentriques.

Le liquide présent dans l'espace inter-annulaire (ou entrefer) est mis en mouvement par
la rotation du cylindre interne.

Figure I.10: représentation schématique du réacteur Couette

L'entrefer est noté e, les rayons internes (Ri) et externes (Ro) R1 et R2, leur rapport
étant η=Ri/Ro. η, le rapport H/e constituent les dimensions caractéristiques des
réacteurs de type Couette.

71
Ce type de réacteur, parce que doté de conditions hydrodynamiques particulières, est
couramment utilisé lors de travaux allant de l’étude du processus de floculation de
particules à la production de cellules animales (Barbouche et al.; Haut et al. 2003).

2.1.2. Hydrodynamique dans un réacteur Couette

Dans un écoulement quel qu'il soit, deux mécanismes sont responsables du transport de
la quantité de mouvement : les forces inertielles et les forces visqueuses. Pour une
géométrie quelconque, le nombre de Reynolds (Re) caractérise le rapport des forces
inertielles et visqueuses et permet alors de définir le régime d'écoulement considéré. Un
écoulement turbulent sera donc dominé par des forces inertielles ; un écoulement
laminaire le sera par les contraintes visqueuses.

Dans un réacteur Couette, l’équivalent du nombre de Reynolds est le nombre de Taylor.

De nombreuses études se sont attachées à caractériser les écoulements dans des
cellules de couette et on peut trouver dans la littérature différentes expressions du
nombre de Taylor donc voici un exemple :

R2  R1 3 R1
Ta  2
 2

Avec :

R1 Rayon du cylindre interne (mm)

R2 Rayon du cylindre externe (mm)

Ω Vitesse de rotation du cylindre interne (s-1)

ν Viscosité cinématique du fluide (m2. s-1)

Le nombre de Taylor, adimensionnel comme le Re, est caractéristique du régime

d’écoulement dans des conditions données. Pour un réacteur de Couette, l'écoulement
présente différents régimes, largement étudiés par le passé. Ces régimes et leurs

72
transitions sont résumés par Coufort (2004) pour une vitesse de rotation du cylindre
interne croissante. La figure I.11 illustre ces différentes transitions.

Figure I.11 : transitions dans un réacteur Couette, d’après Andereck, 1986 (Coufort 2004)

Notons que cette synthèse ne considère que les écoulements induits par le mouvement
du cylindre interne, dans des réacteurs non alimentés (sans flux axial de fluide) :
réacteurs Couette et Taylor Couette.

[Link]. Ecoulement laminaire

L’écoulement engendré par de faibles vitesses de rotation du cylindre interne est stable
et axisymétrique, pour lequel il est possible de donner une solution analytique pour sa
résolution. La forme du champ de vitesse obtenu à ces faibles vitesses de rotation
correspond à un écoulement purement tangentiel appelé écoulement de Couette.

[Link]. Vortexde taylor : écoulement toubillonnaire

Avec l'augmentation de la vitesse de rotation, et donc de l'apport d'énergie au système,

l’écoulement devient instable et apparaissent des structures appelées rouleaux ou
vortex de Taylor. Ce sont des structures toroïdales qui viennent se superposer à
l’écoulement laminaire lorsque le nombre de Taylor atteint ou dépasse une valeur
critique Tac =1712. Des vortex toroïdaux se forment tout d’abord aux extrémités du

73
réacteur. Ensuite, l’entrefer se remplit de vortex de section carrée correspondant { la
taille de l’entrefer. Les vortex adjacents sont { contre courant. Cet écoulement est connu
sous le nom d’écoulement tourbillonnaire ou vortex flow. Cet écoulement, stable, est
constitué de la superposition de l’écoulement de Couette et d’un écoulement hélicoïdal
tournant autour de l’axe des tourbillons (figure I.12).

Figure I.12- Schématisation des tourbillons de l’écoulement Taylor vortex flow, d’après Ohmura et al.,
(1997)

[Link]. Ecoulements tourbillonaires ondulants (Wavy Vortex flows)

Il s'agit d'écoulements périodiques, présentant une structure organisée. Lorsque Ta =

1,27 Tac , un mouvement ondulatoire se superposant aux vortex de Taylor apparaît. Lors
de ce mouvement, l’ensemble des vortex ondule suivant la direction axiale avec une
phase identique. Ce type d’écoulement appelé wavy vortex flow comprend deux régimes
d’écoulement : le singly periodic wavy vortex flow (SPWVF) et le doubly periodic wavy
vortex flow (DPWVF).

Le premier régime d’écoulement SPWVF est caractérisé par un certain nombre de

vortex et de vagues conditionné par le nombre Ta. Lorsqu’on augmente la vitesse de
rotation du cylindre interne, l’écoulement devient plus complexe et l’amplitude des
vagues varie périodiquement. Cet écoulement correspond { l’écoulement DPWVF.

[Link]. Ecoulements tourbillonnaires turbulents et écoulement turbulent

74
Lorsque Ta = 40 Tac , les vagues disparaissent mais les structures tourbillonnaires sont
conservées. Cet écoulement est appelé écoulement de Taylor turbulent ou turbulent
vortex flow.

Pour un Ta = 700 Tac , un écoulement axisymétrique commence { s’établir. Au delà, la

turbulence casse les tourbillons, l’écoulement est alors turbulent et purement tangentiel
(turbulent flow).

Remarquons que si le nombre de Taylor représente toujours un rapport entre les forces
inertielles et visqueuses, différentes expressions littérales ont été relevées dans la
littérature conduisant à différentes valeurs critiques en ce qui concerne les transitions.

L'intérêt principal du réacteur de type Taylor-Couette pour notre étude est qu'il
présente une répartition volumique relativement homogène de taux de dissipation de
l'énergie cinétique turbulente. Contrairement aux bioréacteurs traditionnels (cuve
agitée) dans lesquels de grandes différences du taux de dissipation sont observées selon
la géométrie du réacteur et la position par rapport aux modules d’agitation, le taux de
dissipation de l’énergie cinétique présente une distribution étroite.

2.1.3. Effets de mélange dans un réacteur Couette

La qualité du mélange dépend évidemment du régime d’écoulement.

En régime laminaire, seule la diffusion moléculaire permet le transfert de matière et le

mélange est donc de faible qualité. (Liu and Lee 1999) ont montré que l’indice de
ségrégation (qui permet d’évaluer la qualité du mélange intime des constituants) reste
proche de 1 pour des réacteurs opérés en régime laminaire, témoin d’un micromélange
de mauvaise qualité. Dans ce régime d’écoulement, l’augmentation de la vitesse de
rotation du cylindre ne permet qu’une très faible amélioration du mélange.

En revanche, les performances du système en matière de mélange s’améliorent dans les

autres régimes d’écoulement. Racina and Kind (2006a; 2006b) par des techniques PIV,
ou Liu et Lee (1999) grâce à une technique de réactions parallèles et compétitives
développée par Villermaux, ont relié la qualité du micromélange au Ta.

75
Ainsi, le passage d’un régime tourbillonnaire { un régime tourbillonnaire ondulant
permet d’améliorer encore le mélange grâce { l’onde azimutale qui transporte la
matière verticalement. Cependant, en fonction de la position par rapport au vortex, les
temps de mélange sont encore très variables à ce régime. Racina and Kind (2006a;
2006b) montrent que les temps de mélange sont nettement plus homogènes en régime
turbulent

Une approche phénoménologique du mélange dans un réacteur Couette en régime

tourbillonnaire a longtemps constitué à considérer chaque vortex comme un réacteur
parfaitement agité (Katakoa and Takigawa 1981 et Ito et al 1989 rapporté par Ohmura
(Ohmura et al. 1997), l’ensemble du réacteur présentant donc trois niveaux de mélange
usuellement considérés (macro-, méso- et micro- mélange). Il en résulte que dans un
réacteur de type Couette, le macromélange est assimilable { l’échange de matière entre
les vortex. Chaque vortex étant considéré comme un réacteur parfaitement agité, le
réacteur est assimilé à une cascade de RPA. Le mésomélange est quant à lui relié au
mélange { l’intérieur des vortex. Si l’ordre de grandeur du temps de mésomélange est
bien inférieur au temps de macromélange (0.2 – 2 s contre 2 - 60s), ce dernier est
cependant limitant vis-à-vis du mésomélange. Le micromélange est lui entièrement
dépendant des caractéristiques locales de l’écoulement, les échelles de micromélange
devenant plus homogènes avec l’augmentation de la turbulence au sein du réacteur
(Racina and Kind 2006b).

Cette approche a été démentie entre autre par Desmet (Desmet et al. 1996; 1997) et
Haut et al. (2003) puis plus récemment Rudman et al. (2008). La figure I.13 permet de
visualiser le mélange de lait dans un réacteur couette en régime tourbillonnaire : on
observe que le transfert de matière entre les vortex est plus rapide que le mélange à
l'intérieur même du vortex.

76
 Figure I.13 (Haut et al., 2003) : visualisation du mélange dans un écoulement tourbillonnaire

Si l’empilement de vortex a longtemps été considéré comme une cascade de réacteurs

parfaitement agités, les progrès dans les techniques de visualisation locale (réaction
colorée, dispersion de traceur) ont permis, outre d’acquérir de jolies images, d’émettre
quelques réserves. En effet :

 Le mélange intra vortex n’est pas aussi rapide qu’on le croit.

 Il existe des zones ou il n’y a pas de mélange { l’intérieur des vortex (Dusting and
Balabani 2009). C’est le cas des travaux de Rudman et al. (2008) qui montrent
que le cœur des vortex ondulant présente des zones où le faible mélange
empêche la neutralisation de la base, laissant apercevoir des filets bleus dans la
zone préalablement neutralisée (jaune) (Figure I.14).

Figure I.14d’après Rudman et al. (2008) : non mixing vortex cores

Un réacteur Couette est le siège d’un écoulement particulier permettant l’étude de

l’interaction hydro - bio et les deux paragraphes suivants évoquent deux des
applications possibles du réacteur Couette.

2.1.4. Cultures bactériennes et cellulaires

Les travaux faisant état de cultures cellulaire et bactérienne en réacteur couette sont
référencés et détaillés dans le chapitre consacré aux interactions hydro-bio. Ce ne sera
donc pas répété ici.

77
2.1.5. Agrégation et floculation

Comme évoqué précédemment, la taille d’un floc résulte d’un équilibre :

 Entre les forces hydrodynamiques mises en jeu et les forces de cohésion

du floc ou de l’agrégat considéré, ou en d’autres termes,

 Entre les phénomènes d’agrégation et de rupture

La géométrie du réacteur couette se prête très bien { l’étude de cet équilibre puisque les
forces hydrodynamiques mises en jeu sont relativement homogènes en termes
d’intensité. En effet, la dissipation de l’énergie cinétique, principal paramètre
déterminant l’intensité des contraintes hydrodynamiques, est distribuée équitablement
dans tout le volume du réacteur (voir figure I.15)

Figure I.15 : d’après Coufort, (2004) : profil de répartition de la dissipation ε et du cisaillement G dans un
réacteur Couette

Lors de l’étude de la floculation dans un réacteur de Taylor Couette, Coufort (2004) a

montré que :

 Malgré la relative homogénéité du réacteur en termes de dissipation

d’énergie, la distribution de la taille de l’échelle de Kolmogorov présente
plusieurs pics : un pic correspondant à la valeur la plus probable, de taille

78
 λk, un pic de taille supérieure, correspondant à des zones de faible
écoulement, { l’intérieur des vortex par exemple, et un pic de taille
inférieure, correspondant { des zones de forte dissipation d’énergie, aux
parois.

 En termes de taille de flocs minéraux, celle ci semble être contrôlée par

l’échelle de Kolmogorov, avec des tailles comprises entre λk et 2 λk .

 L’hydrodynamique joue un rôle important dans la rupture des agrégats,

celle-ci ayant lieu dans des zones à forte dissipation, menant à des
agrégats transitoires de petite taille.

2.2. Lactococcus lactis NCDO 2118

2.2.1. Présentation et quelques généralités

Lactococcus lactis est une espèce appartenant à la famille des bactéries lactiques,
nommée ainsi en référence à leur capacité à produire de l'acide lactique lors du
catabolisme des sucres. Cette propriété en fait la famille bactérienne la plus utilisée par
l'industrie agroalimentaire. Les bactéries lactiques, connues pour le rôle qu'elles jouent
dans la préparation des laits fermentés ou du fromage, participent également { d’autres
préparations alimentaires telles que la fermentation de viandes et poissons, la
production de boissons alcoolisées, pain au levain ainsi que de sauce soja. De part les
métabolites produits, elles participent à la flaveur (formiate, diacétyle, ou amines
biogènes en ce qui concerne les arômes indésirables), la conservation (acide lactique) et
à la texture des produits (production d’exopolysaccharides). De plus, certaines bactéries
lactiques, de par leurs vertus probiotiques (du grec pro bios : en faveur de la vie), ont un
rôle bénéfique pour la santé du consommateur.

Leur classification parmi les microorganismes GRAS (Generally Regarded As Safe), leurs
nombreuses applications alimentaires et le classement de certaines d’entre elles parmi
les microorganismes probiotiques, expliquent l’intérêt porté { ce genre bactérien et ses
propriétés : métabolisme, voies de synthèse des polysaccharides, capacités d’adhésion…

79
La famille des bactéries lactiques comprend de nombreuses espèces classées en six
genres : Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus et
Bifidibacterium. Le genre Lactococcus est constitué de plusieurs espèces, garviae, lactis,
plantarum et raffinolactis. L’espèce lactis regroupe elle-même trois sous-espèces,
cremoris, lactis et hordniae.

Lactococcus lactis est une espèce à Gram +, anaérobie mais aérotolérante, catalase
négative, non sporulante, non mobile, formant des cellules sphériques ou ovoïdes,
isolées ou en courtes chaînettes.

Si l’habitat courant des lactocoques demeure le lait, on peut cependant les isoler, comme
c’est le cas pour L. lactis ssp lactis NCDO2118, des plantes, qui constituent
vraisemblablement leur habitat d’origine.

2.2.2. Catabolisme des sucres et shift métabolique de L. lactis NCDO 2118

L. lactis est une bactérie homo-fermentaire, c'est-à-dire qu’elle utilise la voie homo-
fermentaire (glycolyse ou voie de Embden-Meyerhoff-Parnas, EMP) pour la dégradation
des sucres. Cette voie conduit dans des conditions optimales de croissance à la
production de deux molécules de lactate et deux molécules d’ATP par molécule de
glucose consommée (Thompson et Gentry-Weeks, 1994). Des sucres autres que le
glucose peuvent également être fermentés via cette voie : monosaccharides,
disaccharides, hexitols. Ces microorganismes présentent un métabolisme de type
homolactique lorsque le lactate représente plus de 90 % des produits de fermentation.
Dans certaines conditions de croissance (certains sucres, limitation carbone …), le
métabolisme de ces bactéries se diversifie vers un métabolisme mixte avec production
en plus du lactate, de formiate ou de CO2, d’acétate et d’éthanol (Cocaign-Bousquet et al.
1996).

[Link]. Devenir des sucres en amont du pyruvate

Le transport du sucre { l’intérieur de la cellule se fait par le biais de deux systèmes chez
L. lactis : le système phosphotransférase phosphoénolpyruvate dépendant (PTS), qui

80
couple le transport et la phosphorylation du glucide (Postma et al. 1993), et le système
perméase énergie-dépendant, qui fait pénétrer les sucres sous forme libre.

Le système PTS (phosphotransférase PEP-dépendant) est impliqué dans le transport de

divers hydrates de carbone chez les bactéries (Postma et al. 1993), Il s’agit d’un groupe
de translocation qui catalyse de façon concomitante l’entrée du sucre dans la cellule
ainsi que sa phosphorylation. Différentes protéines sont impliquées dans ce système, les
deux protéines de couplage énergétique, l’enzyme I (EI) et HPr, sont communes { tous
les systèmes alors que les complexes « enzyme II » (EII) sont spécifiques du sucre et
impliqués dans son transport (Postma et al. 1993) (Fig. I.16). Le système PTS semble
énergétiquement plus favorable que les systèmes perméase, en effet il couple entrée et
phosphorylation du sucre avec la dépense d’une molécule de PEP, tandis que
l’accumulation du sucre par un système non-PTS nécessite la dépense de plus d’un
équivalent ATP car transport et phosphorylation ATP-dépendante sont physiquement
séparés.

81
 Figure I.16 : schéma succinct du système PTS (Görke and Stülke 2008 )

Le système perméase permet de transporter le sucre { l’intérieur de la cellule contre

son gradient de concentration, { l’aide d’une enzyme transmembranaire consommant
une molécule d’ATP. Une fois { l’intérieur de la cellule, le substrat carboné est
phosphorylé grâce à une kinase ATP-dépendante puis va être dégradé. Le transport par
les perméases est beaucoup moins étudié puisque l’affinité de ce système pour le
glucose est plus faible que celle du PTS. Cependant l’étude de mutants du PTSman a
révélé l’importance de ces transporteurs qui dans de telles conditions sont capables
d’assurer la croissance sur glucose avec un flux d’entrée allant jusqu’{ 80 % de ce qu’il
aurait été avec un système PTS fonctionnel (Garrigues et al. 1997).

Une fois { l’intérieur de la cellule le glucose rejoint la glycolyse au niveau du glucose-6-

phosphate (G6P), soit directement s’il entre grâce au PTS, soit après phosphorylation
par la glucokinase (GLK) s’il a emprunté une perméase (Fig. I.17). Le sucre ainsi

82
phosphorylé suit la glycolyse jusqu’au phosphoénolpyruvate (PEP) lui-même
transformé en pyruvate par le biais de la pyruvate kinase (PK) ou du système PTS.

Figure I.17 : voie de la glycolyse (et bilan carbonne)

[Link]. Devenir du pyruvate

Métabolisme homolactique

Les lactocoques sont considérés comme des microorganismes homolactiques puisque

généralement ils convertissent plus de 90 % du pyruvate produit en acide lactique. Le
pyruvate est un intermédiaire métabolique clé chez les bactéries lactiques et d’ailleurs
sa production ainsi que sa conversion sont l’objet d’une régulation fine. La glycolyse
génère de l’ATP qui est indispensable aux voies de biosynthèse, mais aussi du NADH.
Chez les organismes « respirant », le recyclage de ce coenzyme est réalisé grâce à

83
l’activité respiratoire. Les lactocoques sont anaérobies et dépourvus de chaîne
respiratoire, la réduction du NADH pourra donc être effectuée par la lactate
déshydrogénase (LDH) qui transforme le pyruvate en acide lactique (Figure I.18 ).

Figure I.18 : Métabolisme du pyruvate. LDH : lactate deshydrogénase, PFL : pyruvate formiate lyase,
PDH : pyruvate deshydrogénase, PTA : phosphotransacétylase, ACK : acétate kinase, ADHE : alcool
deshydrogénase.

Métabolisme mixte

Dans certaines conditions (certaines sources de carbone, limitation carbone, milieux

appauvris …) le métabolisme de Lactococcus lactis dévie vers la production de produits
dérivés du pyruvate autres que le lactate : acide acétique, éthanol, acide formique et/ou
CO2 selon l’environnement gazeux (Cocaign-Bousquet et al. 1996). Au cours du
métabolisme mixte, les sucres qui empruntent la glycolyse continuent à générer du
pyruvate mais le flux à travers la LDH est fortement diminué. Le pyruvate est alors
métabolisé par la pyruvate formiate lyase (PFL) ou la pyruvate déshydrogénase (PDH)
en acétyl-CoA avec formation respectivement de formiate ou de CO2 (Fig. I.18). En

84
condition anaérobie l’activité PFL est détectée ce qui n’est pas le cas en condition
d’aérobiose car cette enzyme est très sensible { l’oxygène (Abbe et al. 1982; Takahashi
et al. 1982). Cette enzyme qui transforme le pyruvate en formiate et acétyl-CoA est
également inhibée par le glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) et le dihydroxyacetone-
phosphate (DHAP), intermédiaires glycolytiques (Takahashi et al. 1982). La réaction de
décarboxylation du pyruvate est réalisée par la PDH qui permet de générer outre du CO2
et de l’acétyl-CoA, un autre coenzyme réduit. Chez Lactococcus lactis cette enzyme est
faiblement exprimée et rapidement inactivée en anaérobiose et semble sensible au
potentiel redox ainsi qu’au ratio NADH/NAD (Snoep et al. 1992).

La métabolisation de l’acétyl-CoA implique soit la phosphotransacétylase (PTA) et

l’acétate kinase (ACK) avec formation d’acétate, soit l’alcool déshydrogénase (ADHE)
avec production d’éthanol. Si la voie de l’acétate permet la synthèse d’une molécule
supplémentaire d’ATP, celle de l’éthanol permet le recyclage de deux molécules de
NADH. Ainsi lorsque la PFL est employée, un équilibre réducteur peut être obtenu par la
répartition équimolaire entre la production d’acétate et d’éthanol permettant ainsi
également un gain net en ATP de 50 % par rapport au métabolisme homofermentaire.

[Link]. Shift métabolique chez L. lactis NCDO 2118

Le passage ou le « shift » d’un métabolisme homolactique vers un métabolisme mixte est

causé par une diminution du flux glycolytique, c’est-à-dire par une diminution de la
vitesse de consommation du sucre. En effet, il a été constaté qu’en condition d’excès de
substrat carboné, le métabolisme de L. lactis est généralement homolactique. Si les
bactéries sont placées dans des conditions de limitation, par exemple en chemostat, leur
métabolisme dérive alors vers un métabolisme mixte lorsque le taux de dilution
diminue. Les travaux effectués par (Thomas et al. 1979) rapportent que le métabolisme
de Streptococcus lactis (ancien nom de L. lactis) est strictement homolactique à fort taux
de dilution (95 % du pyruvate est converti en lactate à 0.8 h-1). A faible taux (0.1 h-1)
moins de 1 % du pyruvate est converti en lactate.

Le métabolisme mixte ne dépend pas uniquement du taux de substrat dans le milieu,

mais aussi de la nature du substrat. Ainsi, il a été constaté que la souche L. lactis NCDO

85
2118 cultivée en culture discontinue sur milieu synthétique présente un métabolisme
homolactique pour des substrats permettant une croissance rapide tels que le glucose.
En présence de sucres à croissance faible (lactose, galactose, maltose), le métabolisme
de L. lactis NCDO 2118 se révèle être mixte. Cette diversité de métabolisme semble être
liée à la valeur du flux glycolytique (Garrigues et al. 1996).

En effet, la valeur du flux glycolytique conditionne le ratio NADH/NAD qui constitue

l’élément premier d’un enchainement de régulations subtiles. Un fort ratio NADH/NAD
va favoriser l’activité de la LDH. De plus, un fort flux glycolytique entraîne une
concentration élevée de GAP et DHAP inhibiteurs de la PFL, et de pyruvate. La
conjugaison de ces éléments résulte en une orientation du pyruvate vers la formation de
lactate. En cas de diminution du flux glycolytique, la concentration de GAP et DHAP
diminue, levant ainsi l’inhibition de la PFL. Il en est de même du ratio NADH/NAD, qui
active moins la LDH. De plus, la concentration en pyruvate étant plus faible, l’activité
LDH diminue, ayant pour conséquence un métabolisme mixte.

La capacité de ces bactéries à orienter leur métabolisme selon les flux glycolytiques
perçus les rend particulièrement adaptées { l’étude de l’effet du mélange sur le
métabolisme microbien. En effet, un shift métabolique sur glucose est la preuve
concrète d’une limitation en substrat. De plus, contrairement { des bactéries telles que
E. coli très utilisée dans ce type d’études, { cause de leur métabolisme d’over flow, les
bactéries lactiques ne consomment pas les produits issus de leur fermentation. Ceci
permet donc de connaître avec plus de précision à quel moment ces bactéries se sont
retrouvées en limitation de substrat.

2.2.3. Les mécanismes de réponses au stress chez L. lactis

Lactococcus lactis, que ce soit dans son habitat naturel (plantes) ou lors de sa mise en
œuvre dans les processus industriels, doit faire face { de multiples stress nutritionnels
ou physico-chimiques (thermique, oxydatif, acide, osmotique) parfois concomitants
(Sanders et al. 1999; Stuart et al. 1999).

86
Les mécanismes de perception du stress, essentiels pour que la cellule puisse se
protéger avant que les effets de ce stress ne soient irréversibles, sont encore peu connus
chez Lactococcus lactis, mais semblent se faire chez les autres bactéries, soit au niveau
membranaire soit au niveau du cytoplasme (Rallu et al. 2000).

Face aux différents effets du stress, les bactéries disposent de plusieurs types de
réaction qui se répartissent en trois catégories (Rallu, 2000). La fuite consiste, pour les
bactéries capables de motilité, à rechercher des conditions plus favorables à la
croissance, mais Lactococcus lactis qui est dépourvu de flagelle ne peut pas utiliser cette
tactique. Le refus a pour but de diminuer l’intensité du stress, par exemple en utilisant
une autre source de nutriment lorsqu’elle est épuisée. Enfin la résistance devient
nécessaire lorsque le stress est persistant et/ou dommageable pour les constituants
cellulaires. Elle peut être acquise par une modification irréversible du matériel
génétique (mutation, remaniement), conduisant à une meilleure tolérance aux
conditions environnementales, ou par l’induction de systèmes de protection et de lutte
contre le stress ou de réparation contre les dommages causés.

L’enveloppe cellulaire est la première cible des stress physicochimiques. Il semble que
ce soit également le cas pour le stress acide puisque chez S. mutans l’adaptation {
l’acidification du milieu implique un enrichissement de la membrane en acides gras
mono-insaturés à longue chaîne (Quivey et al. 2000). Parmi les autres réponses au
stress acide, on peut citer l’activation des voies d’expulsion de protons, la production de
composés basiques ou la décarboxylation des fonctions acides. Les cellules peuvent
également présenter une réponse adaptative : la capacité de répondre à un stress est
alors acquise au cours d’un conditionnement cellulaire. La réponse adaptative se
caractérise en général par l’induction de certaines protéines nécessaires { l’acquisition
de la résistance au stress. Hartke et al. (1996) ont identifié 33 polypeptides induits par
un stress acide dont 9 protéines de choc thermique (HSP), 4 communes avec le stress
UV et 2 communes avec le stress oxydatif.

Lactococcus lactis semble répondre au stress causé par une diminution de la quantité de
substrat carboné disponible par un shift métabolique comme détaillé précédemment. Il

87
ne semble pas qu’une limitation en substrat induise la production de transporteur
spécifique ou l’augmentation de l’activité du système PTS. En effet, (Christian
Vadeboncoeur and Lortie 2000; Vadeboncoeur et al. 2000) ne rapportent que des
exemples de diminution de l’activité et de la quantité d’enzymes du système PTS
conséquente { l’appauvrissement du milieu. Cependant, il s’agit majoritairement
d’expériences issues de cultures batch, au cours desquelles la diminution de la quantité
de substrat disponible s’accompagne de l’apparition de conditions environnementales
différentes (pH, accumulation de métabolites). La disparition du glucose lève la
répression catabolique, ce qui autorise la synthèse d’enzymes spécifiques au transport
d’autres sucres s’ils sont disponibles (Redon et al. 2005a; 2005b).

2.2.4. EPS et PS chez L. lactis

[Link]. Quelques définitions

Chez les bactéries lactiques, les polysaccharides peuvent être classés selon leur
localisation par rapport à la cellule (Cerning et al. 1992). On distingue ainsi :

 les polysaccharides intracellulaires, dans le cytosol, qui constituent une

source d'énergie,

 les polysaccharides de la paroi, tels les peptidoglycanes et les acides

teichoïques,

 les exopolysaccharides, synthétisés et excrétés hors de la cellule. Parmi

ceux-ci, on peut distinguer les polysaccharides extracellulaires, qui ne
restent pas liés à la cellule mais sont excrétés dans le milieu et les
polysaccharides constitutifs d’une capsule épaisse ou d’une pellicule
autour de la paroi bactérienne.

Techniquement, cette différenciation par la localisation entre polysaccharides (PS) et

exopolysaccharides (EPS) peut s’avérer délicate : lors du prélèvement et du traitement
des échantillons, les EPS de la capsule, ou les EPS faiblement liés peuvent être séparés
de la cellule et être ainsi assimilés à tord à des EPS excrétés. Certaines bactéries

88
lactiques sont capables de synthétiser deux formes de polysaccharides extracellulaires
et là encore, la distinction entre les capsules et les polysaccharides libérés dans le milieu
est difficile (Cerning 1995; Cerning et al. 1992). De plus, l’extraction et la quantification
des PS et EPS restent délicates ; si différents protocoles d’extraction sont présentés dans
la littérature, la quantification ultérieure dépend fortement de la méthode choisie. La
quantification est réalisée selon des méthodes indirectes, souvent colorimétriques, et
les résultats, exprimés en équivalent glucose, sont fortement dépendants de la bonne
mise en œuvre de l’extraction (pour une revue des protocoles d’extraction, voir (Ruas-
Madiedo and de los Reyes-Gavilan 2005). La mesure de la masse sèche est une
alternative prometteuse quoique non dénuée d’aléas (nécessité de laver et de dé-
protéiniser l’échantillon).

Si la synthèse de polysaccharide sous forme de capsule est très répandue chez les
bactéries pathogènes (propriétés d'adhérence, facteur de virulence, protection contre la
réponse immunitaire) et chez les bactéries Gram-, certaines bactéries lactiques
semblent être pourvues d'une pellicule polysaccharidique (Chapot-Chartier et al. 2010).
Cette pellicule, dont la production est codée par des gènes chromosomiques, n’est pas
une capsule et se différencie des PS de paroi. Il s’agit d’une fine couche externe,
constituée de PS contenant des résidus glucose, N-acétyl-glucosamine, rhamnose et
galactose liés par des ponts phospho-diesters. Cette pellicule, observable en
microscopie à transmission électronique, confère aux cellules une surface plus lisse que
celle des mutants non pelliculés. De plus, ces mutants apparaissent sous forme de
longues chaines. Ce défaut de séparation pourrait être directement lié { l’absence de
pellicule, ou en être une conséquence : l’absence de pellicule permettant la fuite des
enzymes responsables de la séparation des cellules filles.

[Link]. Rôle des EPS et intérêt

Comme chez les autres bactéries, les EPS ont un rôle protecteur pour le microorganisme
vis à vis de la dessiccation, de la phagocytose, des antibiotiques et des molécules
toxiques (Kleerebezem et al. 1999), et protègent de l'attaque phagique en limitant
l'adhésion des phages à la surface des cellules. Cependant, ce dernier point semble

89
controversé, certains auteurs arguant du fait que les EPS pourraient fournir des sites de
reconnaissance et d'attache spécifiques pour les phages.

D'un point de vue technologique, la production d'EPS par les bactéries lactiques
présente un intérêt industriel car elle confère au produit ses propriétés rhéologiques
(texturation, épaississement, stabilisation) et permet la production de produits
« innovants » (Doublier et al. (2000) interaction protéines – polysaccharides).

Enfin, les EPS bactériens, en particulier ceux des bactéries lactiques, ont récemment été
l’objet d’une attention particulière en raison de leurs vertus prébiotiques (Ruas-
Madiedo et al. 2002).

[Link]. Structure et composition des exopolysaccharides.

Les exopolysaccharides des bactéries lactiques peuvent être subdivisés en deux

groupes : homo-polysaccharides ou hétéro-polysaccharides (Degeest and de Vuyst
1999). La masse moléculaire apparente des EPS produits par les bactéries lactiques est
comprise entre 4.0 x 104 et 6.0 x 106 Da.

 Parmi les homo-polysaccharides, on distingue deux principaux groupes ;

Le premier groupe consiste en alpha-glucanes, composés de résidus de
glucose liés en α-1,6 et α-1,3. Parmi ceux-ci, on peut citer les dextranes,
produits à partir de saccharose par Leuconostoc mesenteroides, et les
mutanes, synthétisés par Streptococcus mutans par exemple. Les
fructanes, formant le second groupe, sont généralement composés de
molécules de fructose, comme les levanes synthétisés par S. salivarius
(Cerning 1990; De Vuyst et al. 1998).

 Les hétéro-polysaccharides du troisième groupe sont synthétisés par

plusieurs bactéries lactiques thermophiles (S. thermophilus, Lb.
delbrueckii ssp bulgaricus) et mésophiles (L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp
cremoris). Comme leur nom l'indique, ces macromolécules sont
composées de différents résidus osidiques parmi lesquels sont présents
en majorité (80 – 90 %) glucose et galactose.

90
D'autres monomères, bien qu'en faible quantité, sont fréquemment rencontrés dans les
hétéro-polysaccharides : le rhamnose (Cerning et al. 1986; Grobben et al. 1995;
Nakajima et al. 1992), le mannose (Petit et al. 1991), le fructose (Manca de Nadra et al.,
1985 rapporté par Cerning), l'arabinose et le xylose, ainsi que des dérivés de sucres tels
que la N-acétyl-galactosamine (Doco et al. 1990; Petit et al. 1991) et la N-acétyl-
glucosamine (Cerning 1995).

En quantités infimes, sont également présents des composés non glucidiques comme
des galactosamines, des acides neuraminiques et des protéines. Nakajima et al., 1990
mentionnent également des phospho-polysaccharides. Leur présence explique pourquoi
certaines souches peuvent synthétiser de façon simultanée deux types d'EPS de charges
différentes : l'un est neutre alors que l'autre est chargé négativement car possédant un
groupement phosphate (Kitazawa et al. 1998; Laws et al. 2001; Marshall et al. 1995).

Les propriétés fonctionnelles des EPS, notamment en terme de rhéologie et de pouvoir

stabilisant, sont dépendantes de la structure tridimensionnelle de la molécule. De cette
conformation va dépendre la capacité à former des liaisons ou à entrer en interaction
avec d’autres molécules en découvrant ou masquant certaines fonctions ou
groupements chimiques. Cette conformation secondaire est néanmoins très dépendante
de la structure primaire, et donc de la composition de la macromolécule. La présence de
groupement chargés (groupements phosphates) peut conférer aux EPS des propriétés
fonctionnelles et donc une structure secondaire dépendantes du pH.

[Link]. Production d'EPS par les bactéries lactiques / voies de synthèse

La production d’EPS par les bactéries lactiques peut être codée au niveau du
chromosome ou être apportée par un plasmide (cas de L. lactis ssp lactis et des bactéries
lactiques mésophiles de manière générale) (vanKranenburg et al. 1997). Quoi qu’il en
soit, l’apparition de phénotypes mucoïde (ropy, slime) est très aléatoire (mutation,
nombreux repiquage, conditions de culture).

Si la synthèse de certains homo-polysaccharides peut s'effectuer à l'extérieur de la

cellule (Cerning 1994), les EPS sont généralement élaborés au niveau de la membrane

91
plasmique. Les hétéro-polysaccharides sont synthétisés par la polymérisation d’unités
répétitives produites dans le cytoplasme. Ces unités répétitives sont constituées d’un
hexose phosphorylé (hexose-1-P) et activé par association avec un nucléotide. C’est
l’activation qui permet la polymérisation du motif.

Quelle que soit la composition finale du polysaccharide en unités osidiques, il semble

que le glucose-1-P soit le précurseur de toutes les unités osidiques (Figure I.19). La
composition en monomères dépend donc des sucres nucléotidiques présents et
disponibles et de l’activité des glycosyl transférases, responsables de l’allongement de
la chaine polymérisée.

Le polysaccharide est ensuite exporté hors de la cellule par translocation où il est alors
séparé du transporteur, puis relargué dans le milieu (EPS) ou ancré à la membrane
(capsules).

La synthèse d’EPS est coûteuse en énergie (phosphorylation des hexoses puis

transport) ; les bactéries lactiques ne produisant que peu d’énergie par comparaison {
d’autres bactéries aérobies, on peut de manière générale s’attendre { une production
plus faible d’EPS. De plus, on note une compétition entre la synthèse d’EPS et la
croissance (Ramos et al. 2001). Cependant, la synthèse d’EPS n’est pas dépendante de la
croissance, une production d’EPS pouvant être observée pour des cultures en phase
stationnaire (Looijesteijn and Hugenholtz 1999).

92
 Figure I.19, d’après de Vuyst and Degeest, 1999 : représentation schématique des voies métaboliques
mettant en jeu catabolisme du lactose et synthèse d’EPS chez Lactococcus lactis fermentant le lactose
(transport du lactose via un système spécifique de phosphotransférase) et les souches Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus, galactose-negative (transport du lactose via
un système d’antiport lactose/galactose). Chez les souches fermentant le glucose, celui ci est transporté {
l’intérieur de la cellule par le système PTS et entre dans les voies métaboliques sous forme phosphorylée.
Les enzymes impliquées sont numérotées comme suit : 1, phospho-L-galactosidase; 2, L-galactosidase; 3,
glucokinase; 4, phosphoglucomutase; 5, UDP-glucose pyrophosphorylase; 6, UDP-galactose-4-epimerase;
7, dTDP-glucose pyrophosphorylase; 8, dehydratase; 9, epimerase reductase; 10, phosphoglucose
isomerase; 11, 6-phosphofructokinase; 12, fructose-1,6-bisphosphatase; 13, fructose-1,6-diphosphate
aldolase; 14, galactose 6- phosphate isomerase; 15, tagatose 6-phosphate kinase; 16, tagatose-1,6-
diphosphatealdolase.

Parmi les facteurs influençant la synthèse d'EPS par les bactéries lactiques, on peut citer
bien sûr la composition chimique du milieu de culture, mais aussi le pH (valeur optimale
autour de 6.0, (De Vuyst et al. 1998; Mozzi et al. 1996 ; Cerning 1995), la température, la
pression partielle d'oxygène et la durée d'incubation (Gancel et Novel, 1994a, b). Ces
paramètres influencent la production d'EPS de manière qualitative et quantitative, mais

93
aussi sa dégradation ultérieure. Outre les paramètres liés au contrôle du procédé
comme décrits ci-dessus, le substrat a une importance cruciale.

Looijesteijn et al. (2000) ont étudié l’influence de la limitation en substrat sur la

production d’EPS : si la culture est limitée en glucose, on observe une diminution de la
masse molaire et de la viscosité intrinsèque des EPS produits par L. lactis ssp cremoris.
Le ratio azote/carbone est lui aussi critique pour la production d’EPS. Si certaines
souches voient leur rendement EPS augmenter dans le cas d’une limitation en substrat
azoté, il est dans la plupart des cas essentiel de contrôler ce ratio pour une production
optimale (De Vuyst et al. 1998).

Les caractéristiques quantitatives et qualitatives des EPS produits dépendent bien

évidemment de la souche utilisée. Le rendement en EPS (généralement autour de 0,6
g/L pour les souches productrices, pouvant dans certains cas aller jusqu’{ 1,2 g/L) et
leur composition est fortement dépendante de la composition du milieu de culture pour
une souche donnée. Si les premières constatations liées { la production d’EPS ont eu lieu
sur des cultures utilisant du lait comme substrat, il a été constaté que l’ajout de glucose
dans le milieu résultait en une augmentation du nombre de résidus glucose dans les EPS
produits et la disparition de résidus mannose par comparaison avec une production sur
milieu synthétique.

La production d’EPS par des bactéries lactiques dépend de la phase de croissance et des
conditions de culture de manière générale. Ainsi, les souches mésophiles verront leur
rendement s’améliorer dans des conditions non optimales de croissance (température,
pH) et en fin de phase exponentielle de croissance.

2.2.5. Propriétés d'adhésion

[Link]. Composition de la paroi et état de surface, propriétés fonctionnelles

Comme évoqué précédemment, L. lactis appartient au groupe des Gram +. Pour cette
catégorie bactérienne, le contenu cellulaire est contenu dans une enveloppe (membrane
plasmique et paroi). La paroi est constituée de peptidoglycane, principalement composé

94
de N-acétyl-glucosamine β (1→4)-N-acétyl-muramic acide sur lequel sont insérés
protéines, acides teichoïques, polysaccharides et éventuellement une couche S
(empilement de protéines/ voir la figues I.20). Cette enveloppe constitue un réseau très
ramifié. Le peptidoglycane est d’abord formé { l’intérieur, avant d’être repoussé vers
l’extérieur par le peptidoglycane nouvellement formé.

Figure I.20 : schéma de la paroi des Gram + , membrane plasmique et peptidoglycane, d’après Delcour et
al. 1999.

Les acides teichoïques peuvent représenter jusqu’{ 50 % (W/W) de la paroi

bactérienne. Ils sont généralement imbriqués dans le peptidoglycane et confèrent à la
paroi une bonne partie de sa fonctionnalité. Entre autres, le caractère hydrophobe de
l’enveloppe cellulaire est apporté par les acides lipotéichoïques, ce caractère étant
étroitement lié avec les propriétés d’adhésion de la cellule.

Les polysaccharides sont des composés ubiquitaires de la paroi cellulaire. Ils sont
parfois appelés polysaccharides neutres, en opposition aux polysaccharides des acides
teichoïques, chargés négativement, bien qu’en réalité, leur association avec des
composés anioniques comme le glycérol-phosphate peuvent les rendre chargés (Coyette
& Ghuysen 1970; Kojima et al. 1985b, 1986 rapportés par Delcour et al. (1999).

95
Il convient de distinguer les polysaccharides de la capsule, qui forment une couche
extérieure épaisse, associée ou liée de façon covalente à la paroi et les polysaccharides
inclus ou associés au peptidoglycane. Ce sont des structures compliquées, impliquant
des monomères de nature différentes, de nombreux types de liaisons ou ramifications et
le plus souvent, la seule information disponible est le ratio entre les différents
monomères, dans lesquels le rhamnose est très souvent présent.

[Link]. Facteurs favorisant l’adhésion chez L. lactis

L’organisation structurelle de la paroi cellulaire et les propriétés physico-chimiques des

constituants de la surface (conformation des macromolécules en particulier)
déterminent les propriétés générales de la surface des cellules vis-à-vis de l’agrégation
et de l’adhésion (Schär-Zammaretti and Ubbink 2003).

Par exemple, la co-agrégation entre des polysaccharides de paroi est responsable de la

formation de la plaque dentaire par des streptocoques oraux (Whittaker et al. 1996).
Des structures permettant une co-agrégation ont été aussi révélées chez Lactobacillus
casei, Bifidobacterium longum et Bifidobacterium catenulatum (Nagaoka et al. 1990,
1995 et 1996 rapporté par (Schär-Zammaretti and Ubbink 2003).

Comme mentionné précédemment, le peptidoglycane est d’abord formé { l’intérieur,

avant d’être repoussé vers l’extérieur. La paroi cellulaire des Gram + augmente donc en
surface et en épaisseur au cours de la croissance. L’ augmentation de la surface est
limitée par la division cellulaire, alors que le maintien d’une épaisseur correcte est
assuré par un subtil équilibre entre formation de peptidoglycane neuf et un processus
ressemblant à la desquamation (Delcour et al. 1999) permettant sa dégradation, rôle
assuré par les autolysines. De ce fait, les bactéries lactiques sont très sensibles à
l’autolyse, qui peut résulter d’une rupture de cet équilibre. Le peptidoglycane est
dégradé par les autolysines (AcmA muramidase pour L. lactis ssp cremoris) pour
permettre la division cellulaire. Ainsi, une souche dépourvue d’autolysine se présentera
plutôt sous la forme de longues chaînes. D’autre part, la rupture du peptidoglycane est
un facteur favorisant l’adhésion bactérienne aux surfaces (Mercier et al. 2002).

96
Giaouris et al. (2009), { travers l’étude de l’hydrophobicité de surface, de la charge de
Lewis et de la charge globale, ont montré que pour 50 souches de L. lactis de différentes
origines, l’adhésion est fortement corrélée { l’hydrophobicité de surface et { la charge
globale. Les souches au caractère hydrophobe prononcé ou de charge globale faible ont
ainsi la plus forte propension à adhérer aux surfaces. Il convient ici de remarquer que la
faible charge apparente de certaines cellules peut en réalité être la conséquence du
masquage de ces charges par d’autres biomolécules (Mozes and Rouxhet 1987).
Giaouris et al. ont, en outre, montré une très forte variabilité en ce qui concerne les
propriétés de surface des souches étudiées, variabilité apparemment sans aucun lien
avec l’origine ou la phylogénie de la souche étudiée. D’après ces mêmes auteurs, les 2
souches utilisées dans notre étude (L. lactis ssp lactis NCDO 2118 et L. lactis ssp lactis
IL1403) possèdent un caractère hydrophile marqué.

[Link]. Adhésion, biofilm, et croissance immobilisée

Il existe différents exemples de croissance immobilisée pour les lactocoques : outre la

culture en boite de Pétri, les bactéries peuvent être emprisonnées dans une matrice
fromagère ou encore adopter une mode de croissance en biofilm.

La croissance non planctonique des lactocoques a été étudiée par Ibrahim et al., (2004).
Ces auteurs déduisent que la distribution limitée dans le milieu, la croissance lente,
associés à un mélange entre cellules en phases stationnaire et exponentielle, constituent
des éléments caractéristiques de la croissance sessile. Ils notent au passage que
l’immobilisation peut être { l’origine de l’instabilité génétique de la culture (les
bactéries croissant en biofilm expriment des gènes que les bactéries planctoniques ne
transcrivent pas). Les caractéristiques de l’association immobile dépendent de la
composition moléculaire de la paroi cellulaire :

 La rupture du peptidoglycane, qui peut être induite non seulement par

des peptidoglycane hydrolases, mais aussi suite à des défauts de la
machinerie de synthèse du peptidoglycane (mutation du gène ponA), est
importante dans la croissance sous forme immobilisée des lactocoques
(adhésion, sédimentation, formation de chaînes).

97
  les protéines ancrées à la paroi cellulaire jouent un rôle positif dans
l’adhésion de L. lactis.

Le plus souvent, le polymère qui lie les cellules au sein d’un biofilm est un
polysaccharide, parfois le peptidoglycane. Le terme biofilm se réfère à des cellules
adhérées { une surface, cependant, les agrégats, ne nécessitant pas d’adhésion en
premier lieu, présentent des caractéristiques similaires aux biofilms dans leur
composition. L’adhésion est une première étape { la formation de biofilm, nécessaire
mais non suffisante pour créer un biofilm. Deux molécules de la paroi sont reconnues
impliquées dans le phénomène d’adhésion chez Lactococcus : PrtP et AcmA, cette
dernière hydrolysant le peptidoglycane et possédant des propriétés adhésives
intrinsèques.

Park et al. (1999) ont remarqué la formation d’agrégats filamenteux et floculant pour
des cultures de L. lactis ssp. lactis (phénotype non défini) cultivées sans agitation, dans
un bouillon MRS ou bouillon tryptone soja additionné de Tween 80, un surfactant.
L’observation de ces agrégats révèle une structure filamenteuse au microscope.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES D’ETUDE

Les conditions hydrodynamiques au sein d’un bioréacteur sont la source de multiples

contraintes. Outre les stress mécaniques et chimiques, la structure même de
l’écoulement peut déclencher une réponse chez les microorganismes. En ce qui
concerne l’aspect chimique, la théorie de la turbulence permet d’associer { chaque
mécanisme de mélange une échelle caractéristique de temps et de taille. Il en est de
même pour les niveaux d’efforts exercés sur les cellules par les contraintes mécaniques.
Cependant, si la plupart des auteurs s’accordent { imputer la dégradation du
comportement de la biomasse à un effet de la turbulence au sens large, il reste difficile
d’identifier le mécanisme critique.

98
La réponse bactérienne quant à elle est complexe et intervient à différents niveaux : du
génome { la manifestation phénotypique. Cette réponse n’est toutefois pas toujours
instantanée et fait appel { des mécanismes d’adaptation dont les temps caractéristiques
sont très variables. Aussi, l’apparition d’une réponse { un stress donné dépend du
rapport entre le temps caractéristique d’exposition { une contrainte (incluant durée et
fréquence) et le temps de relaxation de la réponse biologique, qui peut être immédiate
ou au contraire, induite.

Si les progrès de la CFD permettent de calculer quelles sont ces contraintes au plus près
des cellules, il reste difficile d’établir des modèles fiables couplant réponse biologique et
modèle hydrodynamique, indiquant probablement un défaut de compréhension des
mécanismes locaux d’interaction. Une analyse par comparaison des échelles de temps et
de taille reste néanmoins un outil d’analyse intéressant pour la prédiction de ces
interactions et fera l’objet du chapitre II suivant.

En termes d’interactions entre contraintes hydrodynamiques et cultures bactériennes,

de multiples références au mélange sont disponibles dans la littérature, les contraintes
d’origine mécanique semblant moins critiques. C’est donc en privilégiant l’approche
‘mélange’ que le choix des outils a été réalisé. Ainsi, L. lactis a-t’il été choisi comme outil
biologique pour sa capacité à présenter un shift métabolique en fonction du flux de
substrat reçu, pour sa croissance rapide et pour le fait qu’il n’est pas nécessaire
d’injecter un débit gazeux lors des cultures, simplifiant ainsi l’étude de l’écoulement.

L’étude des effets des contraintes hydrodynamiques { l’échelle cellulaire requiert

également de s’affranchir de tout effet de mélange { l’échelle macroscopique. Ce dernier,
généralement limitant, masque les effets de micromélange. Cette condition est satisfaite
lors de cultures de type batch, non alimentées, où la dispersion de substrat { l’échelle du
réacteur est réalisée avant l’inoculation.

Enfin, dans un objectif de simplification du problème, il convient d’éviter de travailler

avec des contraintes trop fluctuantes, pour se concentrer sur l’effet de l’intensité des
stress sur le comportement bactérien. D’où le choix du réacteur Couette qui présente le
double avantage de présenter un écoulement homogène en terme de dissipation, et, en

99
fonction de son mode d’opération, organisé. En effet, s’il semble que les cellules
bactériennes ne soient que très peu affectées par les contraintes mécaniques,
l’apparition de streamers dans certains écoulements organisés mérite qu’on s’attache {
ce point dans notre étude.

Le chapitre III présentera des résultats de culture de Lactococcus lactis dans un réacteur
Couette et fera état de l’apparition d’un phénotype atypique. Le lien entre les conditions
particulières d’écoulement dans le réacteur Couette, appuyé par des résultats de
simulations numériques permettant de mieux caractériser les stress locaux, et cette
manifestation du phénotype, sera discuté dans le chapitre IV.

100
ANALYSE DU COUPLAGE MELANGE – REACTION ET ETUDE DE CAS SUR DES
CULTURES DE L. LACTIS NCDO 2118 EN REACTEUR COUETTE

Ce chapitre s’intéresse aux effets du mélange aux petites échelles sur des cultures de
Lactococcus lactis NCDO 2118 réalisées en batch. Afin de construire une expérience
modèle, les cellules sont cultivées dans un réacteur Couette dans lequel deux vitesses de
rotation permettent d’obtenir deux conditions de mélange différentes. En ce qui
concerne l’outil biologique de caractérisation des effets de mélange, c’est l’apparition
d’un shift métabolique qui est testée. Ce shift est caractérisé par la production de
formiate au détriment de la production de lactate. Il est observé en cas de diminution du
flux glycolytique, notamment dans le cas d’une limitation de la vitesse de consommation
du substrat carboné. Cette production est en revanche inhibée en présence d’oxygène.

Les résultats sont analysés via la production de formiate (vitesse spécifique de

production, rendement de conversion du glucose en formiate) qui renseigne sur le flux
de glucose assimilé et l’apport d’oxygène. On montre que si les différentes conditions de
mélange n’entrainent pas de modification significative du point de vue de la cellule en
termes de flux de substrat, il n’en est pas de même pour l’apport d’oxygène. En effet, nos
résultats indiquent que les meilleures conditions de micromélange conduisent à une
diminution significative de la production de formiate. Cette problématique de
l’incorporation rapide de l’oxygène est reliée aux expériences conduites par Dunlop et
al. dans des réacteurs de type scale-down. Un mélange rapide conduit à une plus grande
proportion de cellules subissant des concentrations critiques (entrainant un
métabolisme overflow pour Dunlop et ses collaborateurs ou une inhibition de la
production de formiate dans cette présente étude). La dernière partie de ce chapitre
propose une modélisation de ce phénomène, illustrant ainsi nos expériences, en
s’appuyant sur les résultats de Dunlop (Dunlop and Ye 1990).

101
1 ANALYSE PRELIMINAIRE

1.1. Comparaison des échelles spatio-temporelles et identification des

phénomènes limitants

Une méthodologie consistant à comparer les temps de mélange et de réaction, qui

permet d’identifier un phénomène limitant, est mise en oeuvre. En ce qui concerne les
contraintes d’ordre chimique, il s’agit de comparer les temps caractéristiques du
mélange (tC macromélange ; ts mésomélange ; tK micromélange par incorporation et tD
micromélange par diffusion) et de la réaction (tR). Plusieurs cas de figure sont donc à
considérer. L’analyse ci-dessous considère le cas général d’un bioréacteur alimenté.

(i) le temps de macromélange est inférieur à celui de la réaction : tC << tR.

La réaction biologique est lente par rapport aux mécanismes de mélange. Le réacteur
est alors en tout point homogène et l’avancement de la réaction est contrôlé par les
constantes de réaction uniquement.

(ii) le temps de réaction est compris entre le temps de macromélange et le temps

de mésomélange : tC > tR > tS

La réaction biologique est rapide par rapport au macromélange. C’est dans ces
conditions que des gradients macroscopiques apparaissent { l’échelle du réacteur.
Cependant, le mélange { l’échelle moléculaire est réalisé. On est alors en présence d’un
réacteur mal macromélangé et bien micromélangé. Au cours de la circulation dans le
réacteur, les cellules sont soumises à des fluctuations de concentrations dont la période
est de l’ordre du temps de circulation. A l’échelle du réacteur, il y a compétition entre
mélange et réaction, la vitesse de réaction résultante est le résultat du couplage entre
les opérations de mélange et de réaction.

(iii) le temps de réaction est compris entre le temps de micromélange et le temps

de mésomélange : tC >> ts > tR > tK.

102
La réaction biologique est rapide face au temps nécessaire pour réduire l’échelle
intégrale de concentration. Le temps de macromélange est dans ce cas également
supérieur, conduisant à une compartimentation macroscopique du réacteur : zone
autour du point d’alimentation concentrée en substrat alors que le reste du réacteur a
une concentration tendant vers zéro. Cependant, le temps de réaction étant supérieur
au temps de micromélange, il y a une distribution locale de concentration entre les
structures tourbillonnaires. Outre les fluctuations de concentration basse fréquence
rencontrées lors de la circulation dans le réacteur, les cellules sont soumises à des
fluctuations de fréquence plus élevées dans les tourbillons.

(iv) le temps de réaction est inférieur au temps de micromélange par

incorporation : tC >> tK > tR .

L’intensité de la réaction biologique peut conduire { l’épuisement en substrat pendant

la durée de vie d’un tourbillon. Dans ces conditions, les cellules subissent des
fluctuations de concentration dont la période est de l’ordre du temps de micromélange.

Des d’informations complémentaires concernant les méthodologies d’identification et

de résolution des problèmes liés au mélange dans ces réacteurs sont disponibles en
annexe 5 d’après les travaux de Bourne. Dans le cas d’un bioréacteur alimenté
présentant une limitation par le mélange, les cellules sont confrontées à un signal de
concentration d’amplitude et d’intensité variable selon le phénomène de mélange
limitant considéré. Dans le cas des bioréacteurs industriels, les autres mécanismes de
mélange étant rapides par rapport au macromélange, ce dernier est souvent considéré
comme le phénomène limitant. L’étude de la compétition mélange-bioréaction est
particulièrement complexe car elle nécessite la bonne description de la dynamique du
mélange, de la consommation des réactifs par les cellules et de la dynamique
d’adaptation des cellules aux fluctuations de concentrations.

Si la définition d’un temps de mélange est relativement aisée une fois les
caractéristiques du bioréacteur définies, le temps de la réaction biologique, lui, est plus
difficile { identifier. Comme nous l’avons évoqué, celle ci est loin d’être constituée d’une
réaction unique, et les temps caractéristiques à considérer sont donc multiples. Si on

103
considère par exemple le temps de la croissance (de l’ordre de la dizaine de minutes),
celui-ci est bien supérieur aux temps de mélange usuellement rencontrés en
bioréacteurs. L’application de la méthodologie décrite ci-dessus conduirait donc à
affirmer que la croissance est insensible { la qualité du mélange, conclusion { l’opposé
de plusieurs exemples tirés de la littérature. En effet, la croissance est le résultat de
nombreuses réactions biologiques de temps caractéristique inférieur et donc
susceptibles d’interagir avec le mélange. Cet exemple sert { souligner l’importance du
choix de la réaction biologique considérée, qui doit être pertinente.

Considérer l’assimilation du substrat comme réaction caractéristique semble une

démarche plus prometteuse. Cette étape d’assimilation précède en effet toutes les
autres, elle est le lieu du couplage entre la phase liquide et la phase biologique.

Dans le cas d’un réacteur fermé, le problème de la dispersion des substrats n’a plus lieu
d’être. De ce fait, il est possible d’étudier les effets de l’hydrodynamique aux petites
échelles sur le comportement des cellules. En particulier on peut penser que dans les
conditions de culture batch, le réacteur est et restera macroscopiquement homogène
cependant que l’agitation { l’échelle locale va conditionner le transport du substrat
jusqu’aux cellules.

Afin d’étudier les effets de l’hydrodynamique aux petites échelles, des cultures batch
sont réalisées dans un réacteur Couette. Des conditions de micromélange différentes
sont obtenues en modulant la puissance dissipée (ε) qui dépend de la vitesse de rotation
du cylindre interne. Le choix du microorganisme s’est porté sur la souche bactérienne
Lactococcus lactis dont la sensibilité aux conditions de mélange peut s’exprimer via un
shift métabolique. En présence d’un flux glycolytique faible, le métabolisme devient
hétérolactique et conduit { la production d’un composé excrété le formiate. La présence
de formiate témoigne de ce shift, et constitue un marqueur de la sensibilité aux
conditions de mélange à la microéchelle.

104
1.2. Echelles de mélange dans le réacteur Couette et effet de la dissipation

Les échelles caractéristiques du mélange { l’échelle cellulaire sont indiquées dans le

tableau II.1 ci-dessous. Puisque nous nous plaçons dans une configuration batch afin de
nous affranchir des effets de macromélange, les échelles caractéristiques de ce dernier
ne sont pas calculées ici. Le régime n’étant pas pleinement turbulent { 20 RPM, le terme
d’échelle de Kolmogorov n’est pas rigoureusement exact dans ce cas, mais donné { titre
indicatif pour faciliter l’analyse.

On considère une viscosité cinématique ν= 10-6 m2.s-1 et une constante de diffusion du

glucose D=6.10-10 m2.s-1

1
 3  4
Echelle de Kolmogorov : k   
 

Temps de micromélange :

 Par incorporation   2
t k  17 
 

1
 2 
 Par diffusion t D  2  arcsin h 0.05  formule du
   D
tableau)

Vitesse de ε moyen Echelle de Temps de Temps de

rotation Ω Kolmogorov micromélange par micromélange par
(m2.s-3)
(RPM) λk (µm) incorporation (ms) diffusion (ms)

20 0.015 160 435 262

114 0.13 50 47 28

Tableau II.1 : Echelles spatiotemporelles caractéristiques du réacteur Couette utilisé pour le mélange de
glucose.

105
L’échelle de Kolmogorov est, dans les deux cas de figure considérés dans cette étude,
supérieure { la taille de la cellule. Deux conclusions s’imposent alors :

 Du point de vue du mélange, il apparait évident que l’apport de substrat

aux cellules est contrôlé par le micromélange.

 Du point de vue des contraintes mécaniques : les cellules seront

principalement soumises à des contraintes de dissipation visqueuse
puisque de taille inférieure aux plus petites fluctuations turbulentes. (Ceci
sera abordé plus en détail dans le chapitre 4).

L’environnement immédiat des cellules est donc renouvelé grâce au micromélange.

Dans le cas d’une réaction batch, l’incorporation permet d’engouffrer les cellules dans
du milieu « frais » alors que l’apport final se fait par diffusion. Les lois de la diffusion
indiquent que celle-ci est fonction du gradient de concentration, soit :

 de l’épaisseur de la couche limite (contrôlée par le micromélange par

incorporation)

 de la différence de concentration entre la concentration à la paroi,

(dépendante du rapport entre le flux d’assimilation et le flux apporté) et
la concentration loin des cellules (c'est-à-dire la concentration moyenne
volumique).

A dissipation fixée et constante, le flux transféré aux cellules dépend donc de la

concentration moyenne, aussi dans certains cas, les résultats expérimentaux seront
présentés en fonction de la concentration en glucose.

Le taux de dissipation de l’énergie cinétique revêt ici une double importance : en

contrôlant la taille de l’échelle de Kolmogorov, il conditionne l’épaisseur de la couche
limite de diffusion autour des cellules. De plus, il contrôle le temps de mélange par
incorporation qui est inversement proportionnel à sa racine carrée.

106
2 RESULTATS EXPERIMENTAUX

Cette section présente les résultats pour l’évaluation de la croissance par mesure de la
DO et du métabolisme. L’objectif de notre étude est d’évaluer si les différentes
conditions de micromélange conduisent à un shift métabolique, c'est-à-dire, si, à
concentration en glucose égale, le flux apporté aux cellules (fonction de la vitesse
d’agitation) diffère suffisamment pour induire un shift métabolique. Aussi, les résultats
sont présentés ici en fonction de la concentration en glucose et ne concernent que les
métabolites se rapportant au shift métabolique de Lactococcus lactis NCDO 2118 (donc
les concentrations en lactate et formiate).

2.1. Cultures réalisées en microaérophilie

Ces cultures sont réalisées sans balayage d’azote ni aération du milieu, et sont donc
représentatives de conditions de microaérophilie. Dans ces conditions, l’oxygène
initialement présent dans le milieu est rapidement consommé au cours de la croissance
bactérienne pour atteindre des conditions de limitation en oxygène, le seul apport étant
constitué par le transfert de la phase gazeuse vers la phase liquide au niveau de la
surface libre.

2.1.1. Croissance

L’évolution de la concentration en biomasse est ici évaluée par mesure de la densité

optique à 580 nm. Les résultats sont présentés sur le graphe II.1 ci-dessous. Pour les
cultures à 20 RPM, la croissance apparait légèrement retardée par rapport aux cultures
réalisées à 114 RPM, ce malgré le fait que toutes les cultures soient ensemencées avec
des cellules dans le même état physiologique. Cependant, il semble que le taux de
croissance ne soit pas, ou très peu, affecté comme le montre le graphe II.2 qui présente
l’évolution du taux de croissance en fonction de la biomasse. Le taux de croissance,
maximal en début de culture, diminue au fur et à mesure de la production de biomasse.

107
 4

3,5

3
DO 580 nm

2,5

1,5

0,5

0
0 1 2 3 4 5
temps (h)
Graphes II.1 : croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction du temps pour des cultures à 20
RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

1
0,9
taux de croissance (1/h)

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 1 2 3 4
DO 580 nm

Graphes II.2 : taux de croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction de la biomasse (évaluée en
termes de densité optique à 580 nm) pour des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

108
En outre, un phénotype remarquable et inattendu est apparu spécifiquement lors des
cultures à 20 RPM. En effet, au fur et à mesure de la croissance, des filaments résultant
d’une agrégation cellulaire se développent dans le milieu de culture, alors que les
cultures à 114 RPM restent totalement planctoniques. Ce phénotype particulier est
analysé en détail dans le chapitre 3.

2.2. Métabolisme

Les graphes II.3 et II.4 ci-dessous présentent l’évolution de la concentration en glucose

et en lactate respectivement dans le réacteur au cours de la fermentation.

En ce qui concerne la consommation de glucose et la production de lactate, on retrouve

un « retard » équivalent à celui observé sur les courbes de croissance. Les résultats en
termes de croissance et de production de métabolites sont donc concordants.

30

25
[glucose] (mM )

20

15

10

0
0 1 2 3 4 5
temps (h)

Graphe II.3 : évolution de la concentration en glucose pour des cultures à

20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

109
 70

60
[lactate] (mM )

50

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5
temps (h)
Graphe II.4 : concentration en lactate en fonction du temps pour des cultures à
20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

Le graphe II.5 présente les résultats concernant la production de formiate ; on remarque

que les cultures réalisées à 20 RPM conduisent à une concentration finale en formiate
plus importante. Afin de s’affranchir du décalage lié au retard et de comparer les deux
conditions à concentration en glucose égale, la concentration en formiate est également
visualisée en fonction de la concentration en glucose résiduel (graphe II.6).

110
 3,5

3
[formiate] (mM )

2,5

1,5

0,5

0
0 1 2 3 4 5
temps (h)
Graphe II.5 : concentration en formiate en fonction du temps pour des cultures à
20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

La pente de la droite (d(formiate)/d(glucose)) représente le rendement de conversion

du glucose en formiate. On calcule ainsi les rendements de conversion : la production
est de 0,085 mole de formiate par mole de glucose consommé à 20 RPM contre
seulement 0,049 mole de formiate par mole de glucose consommé à 114 RPM. Les
rendements de conversion du glucose en lactate sont en revanche similaires dans les
deux conditions (1,84 ± 0.06 mol de lactate/mol de glucose à 114 RPM et 1,87 ± 0.12
mol de lactate/mol de glucose à 20 RPM).

111
 4

3,5

3
[formiate] (mM )

2,5 y = -0,0874x + 3,3246

y = -0,0875x + 3,407
2

1,5

1
y = -0,0472x + 2,0099
y = -0,0512x + 1,8932
0,5

0
0 5 10 15 20 25 30
[glucose] (mM)
Graphes II.6 : concentration en formiate en fonction de la concentration en glucose résiduel pour des
cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

10
9
ν formiate (mmol /g/h )

8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
[glucose] (mM)
Graphe II.7 : vitesse spécifique de production de formiate en fonction de la concentration en glucose
résiduelle pour des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○). Les vitesses spécifiques moyennes à 20
RPM (-) et 114 RPM (--) sont également indiquées.

112
Cette différence au niveau de la production de formiate est aussi visible sur le graphe
II.7 où est représentée la vitesse spécifique de production de formiate en fonction de la
concentration en glucose. Celle ci est constante, autour de 2,4 mmol de formiate.g-1.h-1
pour les cultures à 20 RPM et 1,4 mmol de formiate.g-1.h-1 pour les cultures à 114 RPM,
tout au long du processus de croissance et quelle que soit la concentration résiduelle en
glucose. Ainsi, les cellules cultivées à 20 RPM produisent plus de formiate (vitesse
spécifique de production et taux de conversion du formiate en glucose plus élevés) qu’{
114 RPM, sans pour autant que les effets de cette orientation du métabolisme vers la
production de formiate à 20 RPM soit visible sur les rendements de conversion du
glucose en lactate.

2.3. Cultures anaérobies

Les mêmes fermentations ont été répétées cette fois sous balayage d’azote et avec un
milieu de culture préalablement dégazé, donc en condition anaérobie.

2.3.1. Croissance

Les courbes de croissance sont présentées ci-dessous (graphe II.8). Si on observe une
bonne reproductibilité des expériences réalisées { 114 RPM, ce n’est pas le cas pour les
cultures { 20 RPM. Le même phénotype qu’en conditions microaérophiles, caractérisé
par la constitution de filaments résultant d’une agrégation cellulaire, est
systématiquement observé en anaérobiose à 20 RPM, quel que soit le profil de
croissance.

L’évolution du taux de croissance en fonction de la biomasse (graphe II.9) présente un

caractère erratique pour les cultures à 20 RPM. Néanmoins, l’évolution des taux de
croissance à 114 RPM semble reproductible, et incluse dans la gamme de taux de
croissance observés pour les cultures à 20 RPM.

113
 4,0

3,5

3,0
DO 580 nm

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
0 1 2 3 4 5 6 7

temps (h)
Graphe II.8 : évolution de la densité optique pour des cultures à 20 RPM (□, différentes nuances de
gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris).

1,0
0,9
taux de croissance (1/h)

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

DO 580 nm
Graphe II.9 : taux de croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction de la biomasse (évaluée en
termes de densité optique à 580 nm) pour des cultures à 20 RPM (□, différentes nuances de gris) et 114
RPM (○, différentes nuances de gris).

114
2.3.2. Métabolisme

Comme en témoignent les courbes de croissance, les évolutions des concentrations de

métabolites en fonction du temps sont peu reproductibles à 20 RPM. Les résultats
montrent cependant que tout « retard » dans la croissance se traduit par le même retard
en termes de consommation de glucose (graphe II.10) de production de lactate (graphe
II.11) ou de formiate (graphe II.12).

30,0

25,0
[glucose] (mM)

20,0

15,0

10,0

5,0

0,0
0 1 2 3 4 5 6 7

temps (h)
Graphe II.10 : évolution de la concentration en glucose pour des cultures à 20 RPM (□, différentes
nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris).

Le rendement de conversion du glucose en formiate est visualisé sur le graphique

représentant l’évolution de la concentration en formiate en fonction de celle du glucose
(graphe II.13). Malgré le léger bruit au niveau des résultats, on observe que les pentes
des droites de régression, (dformiate/dglucose), présentées sur le graphe sont
similaires à 20 et 114 RPM. Ce résultat suggère un même comportement métabolique,
avec un rendement moyen de 0,085 ± 0,05 mole de formiate par mole de glucose. En
effet, les vitesses spécifiques de production de formiate sont semblables quelle que soit
la vitesse de rotation, autour de 2 mmol de formiate.g-1.h-1 (graphe II.14). De même, les

115
rendements lactate/glucose sont semblables : 1,88 ± 0,06 mol lactate/mol glucose à 114
RPM et 1,84 ± 0,07 mol lactate/mol glucose à 20 RPM.

60,0

50,0
[lactate] (mM)

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0
0 1 2 3 4 5 6 7
temps (h)
Graphe II.11: évolution de la concentration en lactate pour des cultures à 20 RPM (□, différentes nuances
de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris).

116
 3,0

2,5
[formiate] (mM)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
0 1 2 3 4 5 6 7
temps (h)
Graphe II.12 : évolution de la concentration en formiate pour des cultures à 20 RPM (□, différentes
nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris).

3,0

2,5
y = -0,0873x + 2,6737
[formaite] (mM)

y = -0,0778x + 2,1301
2,0 y = -0,0897x + 1,9864
y = -0,0877x + 1,9099

1,5

1,0

0,5
y = -0,0837x + 2,3184
y = -0,0782x + 2,3632
0,0
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
[glucose] (mM)
Graphe II.13 : évolution de la concentration en formiate en fonction de la concentration en glucose
résiduelle pour des cultures à 20 RPM (□, différentes nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes
nuances de gris) et courbes de régression linéaire 20 RPM (-) et 114 RPM (--).

117
 10,0
ν formiate (mmol /g/h ) 9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
[glucose] (mM)
Graphe II.14 : vitesse spécifique de production de formiate en fonction de la concentration en glucose
résiduelle pour des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○).

3 DISCUSSION

3.1. Production de formiate et conditions de culture

Les rendements moyens de conversion de glucose en formiate sont comparés dans les
différentes conditions de culture de L. lactis NCDO 2118 en réacteur Couette (tableau
II.2).

Rendement moyen
Vitesse de
formiate/glucose Ecart type
rotation
(mol/mol x100)

20 RPM 8,56 0,53

anaérobiose
114 RPM 8,09 0,39

20 RPM 8,51 0,33

microaérophilie
114 RPM 4,92 0,28

118
 Tableau II.2 : valeur moyenne du rendement formiate/glucose et écart type pour des cultures à 20 RPM
(■ □) et 114 RPM (● ○)

Pour déterminer si le comportement métabolique dans les deux conditions est affecté,
les moyennes pour chaque condition de culture sont comparées grâce au test de Student
de comparaison de moyennes. La valeur du coefficient t de Student permet d’évaluer si
les deux populations sont significativement différentes en renvoyant la probabilité que
deux moyennes appartiennent { une même population : on considère qu’une différence
est significative si t est inférieur à 5 %. Pour la comparaison des séries à 20 et 114 RPM
réalisées en anaérobiose, t = 24 %, indiquant que la production de formiate n’est pas
significativement différente entre ces deux conditions. En revanche, les séries réalisées
en microaérophilie à 20 et 114 RPM sont significativement différentes (t = 0,3 %). Les
cultures réalisées en microaérophilie à 114 RPM se distinguent des autres par le
rendement formiate sur glucose plus bas, alors que les rendements obtenus dans les
cultures sans balayage d’azote { 20 RPM sont semblables à ceux obtenus en anaérobie.

En condition anaérobie, la vitesse spécifique de production de formiate se situe autour

de 2 mmol.g-1.h-1, soit des valeurs de vitesse standard pour un métabolisme
homolactique (Garrigues et al. 1997), indiquant qu’il n’y a pas de shift métabolique
entre les deux conditions d’agitation. Lorsque les cultures sont réalisées en
microaérophilie, la vitesse de production de formiate est inchangée à 20 RPM par
rapport { l’anaérobiose, mais elle est plus faible, autour de 1 mmol.g-1.h-1, à 114 RPM.
Ce profil de production de formiate peut être discuté en regard, soit de l’apport de
glucose qui peut augmenter la synthèse de formiate s’il est limitant, soit de l’apport
d’oxygène qui inhibe la synthèse de formiate. Ces deux hypothèses sont discutées
respectivement en 3.2. et 3.3.

3.2. Effet du mélange au niveau de l’apport de glucose

Comme cela a été expliqué précédemment, L. lactis NCDO 2118 répond à une
diminution du flux de substrat reçu par un shift entre les métabolismes homolactique et
mixte. Parmi les métabolites produits dans le cas d’un métabolisme mixte, l’évolution de
la concentration en formiate a été suivie comme indicateur de ce shift. Les résultats

119
indiquent que, pour des cultures réalisées en anaérobiose, les deux conditions
d’agitation conduisent { des taux de conversion du glucose en formiate similaires, en
d’autres termes, aucun shift n’est observé dans ces conditions (les conditions
microaérophiles sont discutées ci-dessous, en 3.3). L’absence de shift métabolique
indique que, du point de vue de la cellule, le flux de substrat reçu n’est pas affecté par la
vitesse de rotation du cylindre. En considérant l’analyse décrite dans l’introduction, cela
montre que sur la durée de la culture batch, nous sommes dans les conditions décrites
en (iii) : le temps de réaction d’assimilation du substrat est supérieur aux temps de
mélange réalisés dans le réacteur.

Le temps caractéristique de l’assimilation du substrat (tR,S) peut être évalué selon

l’équation II.1 (Delafosse 2008) :

S S
tR, S   Eq II.1
qS X YS / X X

Ce temps dépend de la quantité de substrat disponible et de la concentration cellulaire

(en plus de l’état physiologique des cellules considérées dont vont dépendre les termes
µ et qS). En début de fermentation, la concentration en glucose est importante alors que
la biomasse est faible, alors qu’en fin de culture, c’est l’opposé. Le temps caractéristique
de l’assimilation de substrat est donc inférieur en fin de culture si on considère les
concentrations moyennes. Par conséquent, la compétition mélange – réaction est bien
plus critique en fin de fermentation de ce point de vue. Donc, les effets sont
normalement plus sensibles en fin de culture (la concentration en substrat moyennée
est plus faible, ayant pour conséquence une diminution du flux de substrat apporté aux
cellules par la diffusion, figure II.1). Malheureusement, les données récoltées ne nous
permettent pas de conclure sur ce point. Le dosage des faibles concentrations en
glucose en fin de culture est peu précis et il est fort probable que ces effets se
manifestent sur une plage de temps restreinte (les derniers instants de la culture)
durant laquelle il est délicat d’observer une quelconque modification du métabolisme.

120
Nos résultats n’illustrent que les effets du couplage mélange-réaction { l’échelle de la
fermentation.

Figure II.1 : Illustration du transfert de matière par diffusion vers les cellules et influence de la
concentration moyenne sur le flux transféré.

3.3. Effet du mélange au niveau de l’apport d’oxygène

Les résultats en termes de production de formiate sont comparés pour chaque vitesse
de rotation en fonction des conditions d’oxygénation du milieu. Si les rendements
formiate/glucose sont identiques pour les cultures à 20 RPM quelles que soient les
conditions vis-à-vis de l’oxygène, les cultures { 114 RPM présentent une différence
significative :

 En anaérobiose, les cultures aboutissent à une concentration en formiate

semblable à celle obtenue avec des cultures à 20 RPM dans les mêmes
conditions.

 En microaérophilie les quantités produites sont significativement moindres.

La présence d’oxygène explique ces résultats. En effet, l’enzyme responsable de la

production de formiate, la pyruvate formiate lyase (PFL), est inhibée en présence
d’oxygène. Le fait de travailler sous une atmosphère non inerte autorise le transfert
d’oxygène dans le milieu de culture. La vitesse de ce transfert dépend de la vitesse du
fluide sous l’interface. Elle est donc significativement plus importante { 114 RPM qu’{
20 RPM. De plus, l’oxygène transféré est alors rapidement mélangé, ce qui expose

121
l’ensemble de la population cellulaire { une quantité d’oxygène suffisante pour inhiber
la PFL.

En revanche, la production de formiate à 20 RPM dans les conditions de microaérophile

est équivalente { celle obtenue en condition anaérobie. Pourtant le transfert d’oxygène a
également lieu mais la production de formiate n’est pas affectée. Ici que le transport
axial ‘macromélange’ et l’homogénéisation { l’échelle cellulaire ‘micromélange’ sont
tous deux moins efficaces qu’{ 114 RPM.

Dans le cas des cultures à 114 RPM, il est délicat d’évaluer le poids relatifs de la vitesse
de transfset d’oxygène et de la vitesse de micromélange vis à vis du phénomène décrit
car l’augmentation de la vitesse de rotation modifie ces deux paramètres. Une étude
poussée du transfert d’oxygène du ciel gazeux { la phase liquide dans ces conditions est
nécessaire, afin de pouvoir ensuite comparer les temps de transfert, de mélange et de
réaction. Le choix de ne pas pousser cette analyse mais de privilégier la simplification
du problème en travaillant dans des conditions s’affranchissant du transfert gazeux a
été fait pour la suite de ce travail.

Néanmoins, il nous est apparu intéressant de rapprocher ces observations des

expériences de Dunlop (Dunlop and Ye 1990), dans lesquelles des cellules circulent
dans un réacteur scale-down constitué d’un réacteur piston dans lequel a lieu
l’alimentation en glucose, et d’un réacteur parfaitement agité représentant le volume
réactionnel. Le comportement métabolique des cellules est modifié par l’intensité de
mélange dans le réacteur piston ; tout comme le mélange rapide de l’oxygène transféré à
114 RPM fait en sorte que ce dernier affecte une plus grande partie de la population
cellulaire dans nos conditions expérimentales. Le paragraphe 4 reprend ces résultats et
propose une modélisation de ce phénomène en couplant un modèle de mélange par
incorporation et la réaction biologique.

3.4. Conditions d’écoulement et croissance de L. lactis NCDO 2118

L’analyse d’un éventuel shift métabolique de L. lactis NCDO 2118 en fonction de la

vitesse d’agitation dans le réacteur Couette a révélé qu’aucune limitation de glucose

122
n’était ressentie par les cellules, mais qu’elles étaient sensibles au transfert d’oxygène
dans le milieu. Par ailleurs, un phénotype remarquable a été observé au cours de ces
différentes cultures, caractérisé par un retard de croissance et par l’apparition
d’agrégats cellulaires (cet aspect est décrit et discuté au chapitre 3) { 20 RPM par
rapport à 114 RPM. Il semble cependant que ces deux phénomènes soient dissociés
puisque l’agrégation { 20 RPM est systématique alors qu’en anaérobiose, le retard de
croissance est variable, et que même sans retard de croissance (l’une des cultures { 20
RPM en anaérobiose) par rapport { 114 RPM, l’agrégation a lieu néanmoins.

Ce retard de croissance témoigne du fait que les conditions de croissance à 20 RPM sont
non optimales. De ce fait, le temps de réponse des cellules au stress (adaptation aux
conditions particulières de l’écoulement) peut expliquer le retard dans la croissance.
Néanmoins, le manque de reproductibilité des courbes obtenues en conditions
d’anaérobiose à 5 g/L soulève quelques interrogations. Ces résultats suggèrent une
forte variation apparente du temps de réponse au stress, ce qui est peu probable étant
donné qu’initialement, les cellules sont toutes dans le même état physiologique. En
revanche, l’écoulement qui s’établit { 20 RPM (Modulated Wavy vortex flow) peut
varier selon les conditions de mise en régime du réacteur et il convient d’y accorder une
importance particulière. De ce fait, les conditions hydrodynamiques rencontrées
peuvent varier pour une même vitesse de rotation, modifiant ainsi le niveau de stress
rencontré par les cellules. A l’heure actuelle notre hypothèse est donc que la variabilité
observée est liée { un manque de reproductibilité de l’écoulement.

4 MODELISATION DES EFFETS DE MICROMELANGE

Ce paragraphe se propose de présenter le couplage d’un modèle de micromélange et

d’une réaction d’assimilation de substrat. A la suite de ce chapitre, le lecteur pourra
trouver le texte complet d’un article traitant de cette problématique, publié dans les
proceedings of the 13th European Conference on Mixing, London 2009. Dans cette
section, la partie traitant de la revue bibliographique mettant en exergue la
problématique des effets de mélange dans les bioréacteurs ne sera pas présentée car
redondante avec le chapitre de bibliographie précédent. Nous nous contenterons donc

123
ici d’expliquer les résultats expérimentaux de Dunlop { l’aide d’un modèle couplant
micromélange et réaction, et de mettre en perspective ces données avec les résultats de
nos expériences.

4.1. Présentation du modèle utilisé et de l’expérience de Dunlop

4.1.1. Expérience : mise en œuvre et résultats expérimentaux

L’expérience de Dunlop que nous nous proposons d’expliquer { l’aide de ce modèle est
réalisée dans un réacteur de type scale down (figure II.2). La levure Saccharomyces
cerevisiae est cultivée dans ce réacteur dans lequel l’injection est réalisée en différents
points du réacteur :

 Cuve agitée (cas 1)

 Entrée du réacteur tubulaire (cas 2)

 Entrée du réacteur tubulaire munie d’une grille, ce qui a pour

conséquence d’améliorer le mélange (cas 3).

En fonction de la qualité du mélange { l’injection, différents comportements

métaboliques sont observés au niveau de la population, reliés à la concentration en
substrat à laquelle sont soumises les cellules. En effet, les levures répondent à une
concentration en substrat dans leur environnement immédiat supérieure à une
concentration critique par un métabolisme overflow. Les résultats expérimentaux sont
résumés dans le tableau suivant (tableau II.3).

124
 Figure II.2 : représentation schématique du réacteur scale down utilisé par Dunlop.

Cette expérience montre l’importance de la qualité du mélange { l’injection sur les

performances biologiques (méso et micro mélange). C’est en effet ce dernier qui va
contrôler le couple quantité de cellule - concentration en substrat à laquelle ces
dernières sont exposées.

Peu de cellules subissant une concentration largement supérieure à la concentration

critique renvoient des résultats similaires (en termes de comportement global de la
population) à ceux obtenus dans le cas 1 où le substrat est mélangé rapidement. Au
contraire, si le mélange est rapide et efficace (cas 3), une proportion plus importante de
cellules sera exposée à une concentration légèrement supérieure à la concentration
critique entrainant un métabolisme overflow. Les conséquences sur le comportement
global seront alors sensibles.

125
 Résultat en
Position de
Conséquence sur le mélange terme de
l’alimentation
métabolisme

Mélange rapide, les cellules voient la

Cas 1 : concentration moyenne résultante de la Pas
cuve agitée dispersion du substrat dans le volume de la d’overflow
cuve agitée

Cas 2 :
Mélange lent (peu d’incorporation de milieu Pas/peu
entrée du réacteur
contenant des cellules dans le substrat). d’overflow
tubulaire

Cas 3 : Mélange rapide, amélioré par la présence de la

entrée du réacteur grille : les cellules voient une concentration
overflow
tubulaire avec contrôlée par le rapport entre les débits
grille d’alimentation et de recirculation

Tableau II.3 : synthèse des résultats de l’expérience de Dunlop.

4.1.2. Modèle de micromélange

Le modèle utilisé ici est un modèle de micromélange par incorporation (ou engulfment)
développé par Baldyga. Comme son nom l’indique, il prend en compte le mécanisme de
micromélange par diffusion { l’intérieur des tourbillons responsables de
l’incorporation. Une représentation schématique de ce modèle est proposée sur la figure
II.3 ; Le mélange d’un volume V1 de fluide frais ajouté au volume initial V2 est décrit. Au
cours du mélange, le volume total est conservé. Le mécanisme d’incorporation conduit {
l’accroissement du volume V1 au détriment du volume V2. Le volume V1 augmente
alors que sa concentration diminue au fur et { mesure de l’incorporation. Par ailleurs, la
réaction ne se produit que dans le volume V1. Il permet de décrire en particulier la cas
où un petit volume fortement concentré en réactif est ajouté à un gros volume
contenant l’autre réactif.

126
 V1 V2 Incorporation Homogénéisation Réaction

Figure II.3 : représentation schématique du modèle de micromélange par incorporation.

L’évolution du volume de la zone de réaction est décrite par la relation suivante

(équation II.2) :

dV 1
 EPV 1 Eq II.2
dt

V1
P représente la probabilité d’auto incorporation P  1
Vtot

E est le paramètre d’incorporation. Il est lié au temps de mélange par incorporation

(noté tk dans ce travail) et décrit comme suit (équation II.3):

1
1   2
E  0,058 

Eq II.3
tK  

tk est le temps de mélange par incorporation

Le bilan matière sur un composé α mélangé puis consommé par une réaction s’écrit
alors ainsi (équation II.4):

d V 1  c 
 EPV 1 c  rV 1 Eq II.4
dt

<cα> est la concentration moyenne { l’échelle du volume total

127
 C1.V 1  C 2V 2
 c 
V1  V 2

cα représente la concentration du composé α dans la zone de réaction V1

rα est le terme de réaction. Il s’exprime { partir des concentrations des réactifs

dans le volume V1.

On considère par la suite une réaction biologique suivant une loi de Monod pour la
croissance et la consommation de substrat (équation II.5).

S S
q S  Y XS1    Y XS1   max  q S max Eq II.5
KS  S KS  S

qs, qsmax représentent la vitesse spécifique de consommation du substrat et la

vitesse spécifiique ([Link]-1.h-1)

Yxs est le rendement de conversion du substrat en biomasse ([Link]-1)

µ, µmax sont les vitesses spécifique et maximales de croissance (h-1)

<S> représente la concentration moyenne en substrat dans le réacteur (g.L-1)

Ks est la constante d’affinité pour le substrat (mg.L-1)

4.2. Simulation du couplage mélange – réaction biologique

Ce modèle est tout d’abord utilisé pour représenter l’effet de la ségrégation sur la
vitesse apparente d’assimilation de substrat lorsque la concentration du substrat ajouté
est élevée. Pour cette modélisation, nous avons utilisé une concentration en substrat
(0,2 g.L-1) très largement supérieure au Ks.

Le modèle utilisé pour la réaction d’assimilation considère ladite assimilation comme

une fonction de la concentration en substrat. Ainsi, si la concentration vue par les

128
cellules est différente de la concentration moyenne résultant d’un processus de mélange
complet, ce qui est le cas si le réacteur est ségrégué, les vitesses d’assimilation s’en
ressentiront. Pour visualiser les effets de la ségrégation sur l’assimilation de substrat,
celle-ci est représentée sous la forme du ratio entre la vitesse d’assimilation moyenne
(<qs>) et la vitesse d’assimilation calculée sous l’hypothèse d’un mélange instantané
(graphe II.15). Les différentes courbes sont obtenues pour des temps caractéristiques
de micromélange allant de 50 à 500 ms.

0,9

0,8

0,7

0,6
<qS>/qS(<S>)

0,5

0,4

0,3

0,2 50ms
250ms
0,1 500ms

0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
t (s)

Graphe II.15 : Effet de la ségrégation sur l’assimilation de substrat { concentration en substrat élevée

Si le micromélange est rapide (50 ms), les cellules sont rapidement confrontées à des
concentrations élevées. De ce fait, la vitesse consommation du substrat de l’ensemble
des cellules (<qs>) atteint rapidement la vitesse qs(<S>) prédite sous l’hypothèse d’un
mélange parfait. Dans le cas de l’expérience menée par Dunlop, ces conditions
conduisent { l’expression d’un métabolisme overflow (réacteur tubulaire muni d’une
grille). Au contraire, si le micromélange est lent (constante arbitrairement choisie ici à
500ms), la vitesse d’assimilation de l’ensemble des cellules est inférieure { la vitesse
atteinte dans le cas d’un mélange rapide. Dans ce cas, la consommation de substrat est
inférieure à la vitesse qs(<S>) prédite sous l’hypothèse d’un mélange parfait, expliquant

129
l’absence de métabolisme overflow. Elle augmente progressivement et n’atteint cette
vitesse qu’après 5s, soit en sortie du réacteur. Notons que le retour dans la cuve agitée a
pour effet de diluer l’excès de substrat dans l’ensemble de la cuve et donc de mettre fin
{ l’exposition { de fortes concentrations.

Le graphe II.16 présente des résultats de modélisation lorsque la concentration

moyenne est faible (0.02 g.L-1), soit seulement le double de la valeur de KS, et le temps
de micromélange relativement lent. En supposant un mélange instantané, la vitesse
spécifique d’assimilation du substrat représenterait seulement 2/3 de la vitesse
maximale (équation II.6). Cette information est représentée par la courbe en trait
pointillé.

q S  S   0.66q S max Eq II.6

Sur ce graphique est également présenté la vitesse d’assimilation dans la zone de

réaction normalisée par la vitesse maximale d’assimilation. Pour les cellules présentes
dans un environnement riche en substrat, on observe ainsi que la vitesse d’assimilation
est supérieure { celle attendue si l’on considère le volume de réaction parfaitement
mélangé.

Ce graphe présente également la fraction massique des cellules dans la zone de réaction
(notée p(X|S>0)). Rappelons que seules ces dernières sont exposées au substrat. La
proportion de la population cellulaire concernée atteint 70% de la population totale à la
sortie du réacteur tubulaire. Au fur et { mesure que le mélange s’opère, la concentration
vue par les cellules diminue alors que de plus en plus de cellules se trouvent en
présence de substrat, et la vitesse d’assimilation normalisée se rapproche de la vitesse
attendue.

Cette représentation met en exergue le fait que, même dans le cas d’une concentration
moyenne en substrat trop faible pour entraîner un quelconque overflow, les effets de la
ségrégation dans le réacteur ont pour conséquence de confronter une partie de la
population à des concentrations bien supérieures, entrainant de fait l’expression de

130
l’overflow. Négliger la ségrégation dans le réacteur conduit alors à une erreur
d’interprétation en considérant que toutes les cellules voient la concentration moyenne
résultante. Pour des mêmes conditions de concentration moyenne, la diminution de la
vitesse de micromélange aura pour effet de réduire la proportion de cellules présentes
dans un environnement riche en substrat. Le réacteur sera plus ségrégué et la différence
entre les niveaux de concentration sera plus importante.

1 1

0,9 0,9

0,8 0,8
normalized uptake rates (-)

0,7 0,7

cell mass fraction (-)

0,6 0,6

0,5 0,5

0,4 0,4

0,3 0,3
qS/qSmax
0,2 q(<S>)/qSmax 0,2
p(X|S>0)
0,1 0,1

0 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
t (s)

Graphe II.16 : effet de la ségrégation lorsque la concentration moyenne en substrat est faible (tk=500ms)

4.3. Conclusion

De part son mécanisme, le micromélange peut interagir avec la réaction biologique à

différents niveaux.

Dans le cas de réacteurs non alimentés, le flux de substrat apporté aux cellules est
contrôlé par le niveau de micromélange (figure II.1). Si ces faits sont bien établis dans la
théorie du mélange, leur effet sur le comportement bactérien n’a pas été démontré au
cours de cette étude.

131
Si au contraire, le réacteur est alimenté (alimentation en glucose dans les expériences
de Dunlop ou en oxygène dans notre cas), la vitesse d’incorporation de fluide « frais »
dans le milieu de culture va influencer la concentration de l’environnement proche des
cellules et ainsi affecter les vitesses moyennes de réaction. C’est ce qu’illustre la
modélisation du couplage entre réaction biologique et micromélange. Les résultats
montrent comment la qualité de ce dernier peut conduire à différents états de
ségrégation au sein d’une population cellulaire. Nous avons entre autre montré, grâce {
ce modèle, comment la concentration vue et la proportion de la population bactérienne
concernée peut varier en fonction de la qualité du micromélange, et ainsi expliqué les
résultats obtenus par Dunlop. Lorsque le micromélange est efficace (temps de
micromélange court), le substrat apporté est distribué de façon plus homogène. Si la
concentration en substrat résultante est supérieure à la concentration critique, toutes
les cellules présenteront un métabolisme overflow. Au contraire, pour des quantités de
substrat ajoutées identiques, un temps caractéristique d’incorporation plus lent
entraine que la sous-proportion de cellules ayant du substrat dans leur environnement
diminue, la concentration vue par les cellules étant bien plus importante (figure II.3). Au
niveau de la population, les effets du métabolisme overflow ne sont pas visibles car ne
sont le fait que d’une faible proportion de cellules.

132
 Figure II.3 : Illustration du micromélange par incorporation et de son effet sur le couple
concentration/proportion de la population concernée.

L’importance de la prise en compte des effets de micromélange est ainsi mise en

exergue, en particulier si la vitesse d’assimilation du substrat est directement
proportionnelle à la concentration à la surface de la cellule, comme le suggèrent les
travaux de Ferenci (1999a;1999b).

Ces résultats illustrent également en partie nos observations quant aux concentrations
en oxygène subies par les cellules. Si une vitesse de rotation élevée permet de transférer
une plus grande quantité d’oxygène dans le réacteur et donc d’inhiber la pyruvate
formiate lyase (responsable de la synthèse de formiate), elle permet également un
meilleur mélange de l’oxygène dissout. Ainsi, la proportion de cellules affectée par
l’exposition { l’oxygène est plus importante lors d’une culture { vitesse de rotation
élevée de part un meilleur transfert, mais aussi un meilleur mélange de l’oxygène. Ces

133
conclusions quant { la répartition de l’oxygène rejoignent les résultats de Dunlop en
matière d’exposition { des concentrations en substrat sub-critiques. Un mélange plus
efficace conduit { faire subir { l’ensemble de la population des concentrations sub-
critiques, entrainant un métabolisme overflow.

5 CONCLUSION

Ce chapitre consacré { l’analyse du mécanisme d’interaction entre mélange et réaction

biologique et { l’étude des effets de mélange sur des cultures de L. lactis NCDO 2118
nous a permis de montrer que le phénomène de mélange { l’échelle locale a peu
d’influence sur le métabolisme cellulaire via le contrôle du flux de substrat reçu dans les
conditions batch. En effet, quelles que soient les conditions de mélange (taux de
dissipation de l’énergie) imposées via la vitesse de rotation du cylindre interne, les
cellules présentent un métabolisme homolactique. Cela signifie que du point de vue des
cellules, le flux de substrat reçu ne varie pas de façon significative avec la vitesse de
rotation. Au contraire, les deux vitesses de rotation permettent le transfert de quantités
d’oxygène significativement différentes conduisant { l’inhibition partielle de la PFL dans
le cas où mélange et transfert sont les plus efficaces. Cette problématique du couplage
transfert-mélange-réaction nécessiterait de plus amples investigations, mais le choix a
été fait de s’affranchir des effets de transferts et donc d’inerter le réacteur pour la suite
de ce travail.

A l’aide d’un modèle de micromélange, nous avons modélisé le couplage entre réaction
biologique et micromélange. Les résultats montrent comment la qualité de ce dernier
peut conduire { différents états de ségrégation au sein d’une population cellulaire. Nous
avons entre autre expliqué, grâce à ce modèle, comment la concentration vue et la
proportion de la population bactérienne concernée peuvent varier en fonction de la
qualité du micromélange. Cette approche associant intensité du stress et fraction de la
population exposée fournit une base théorique permettant d’expliquer les résultats
obtenus par Dunlop. Un temps de mélange long a pour conséquence, pour les cellules
incorporées, un temps de séjour dans des concentrations élevées relativement long,
alors qu’au contraire, une autre population cellulaire issue de la même culture sera dans

134
des conditions limitantes en substrat. La prise en compte des effets de mélange aux
petites échelles permet de considérer les effets de ségrégation et le fait que toutes les
cellules cultivées au sein d’un bioréacteur ne font pas face aux mêmes niveaux de
concentration. L’importance de la prise en compte des concentrations locales plutôt
qu’une concentration moyenne lors de la prédiction du comportement cellulaire est
alors mise en exergue.

Si ces premiers résultats montrent qu’en anaérobiose, la variation du taux de

dissipation de l’énergie cinétique turbulente ne modifie pas de manière significative le
métabolisme du glucose chez L. lactis NCDO 2118, il semble que ces variations en
affectent le phénotype. D’une part, un défaut de reproductibilité, non clairement
expliqué à ce stade, dans la croissance et le métabolisme de la souche est observé
spécifiquement lors des cultures à 20 RPM en anaérobiose. De plus, les cultures à 20
RPM présentent un retard de croissance par rapport à celles à 114 RPM, ainsi que
l’apparition de minces fils traduisant des agrégats cellulaires lors de la culture. Le
chapitre suivant s’attache { statuer sur ce phénotype et { éclaircir son origine.

135
MINI REWIEW : RELATIONSHIP BETWEEN HYDRODYNAMIC CONDITIONS AND
SUBSTRATE INFLUX TOWARD CELLS.

M. Douaire, J. Morchain*, A. Liné

Université de Toulouse; INSA,UPS,INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France

INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France

CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

e-mail: [Link]@[Link]

Abstract. This paper proposes a review of studies investigating the coupling of

hydrodynamics and bioreaction and highlights the complex relationship between
energy dissipation, substrates uptake rate and cell physiology. Many lab-scale studies
were conducted to understand the effect of substrate heterogeneities on the cell
metabolism caused by insufficient mixing. Beyond large scale heterogeneities, small
scale turbulent motion which controls the substrate distribution at the microscale also
seriously modifies the behaviour of the population. Since these studies tend to
demonstrate that mixing at small scales plays an important role, segregation (especially
in the feed zone) should be therefore taken into consideration in models used for the
scale up of bioprocesses. As an illustration of this, the Engulfment mixing model coupled
with a model for bioreaction is used to study the effects of imperfect mixing. Results are
in good agreement with the experimental observations from the literature.

Key words: Bioreactors; Substrate transfer; Biological reaction; Micromixing; local

hydrodynamic.

1. INTRODUCTION

The modelling of biological reaction at different scales is a real challenge for the
research community. Despite many efforts, numerous questions among which the

136
integration of micromixing in turbulent flow with biokinetics and the dynamics of the
metabolism triggered by concentration fluctuations are still opened [1]. The study of the
interaction between mixing and biological reactions is complicated by the fact that cells
adapt their behaviour to the environmental condition they encounter. In particular for
fed-batch cultivations the residence time of cells is sufficiently important for
physiological adaptation to take place. As noted by Bailey and Ollis, [2] “effects imposed
at a certain length scale can influence the observed kinetics of cell population in
different ways”. It is important to recognize this connection so that kinetic
measurements and models can be developed under conditions which will resemble in
some senses those encountered in the large scale reactor.” Recent investigations in this
domain include on the one hand the understanding of the mechanisms provoking
reduced yields and on the other hand, the possibilities to obtain a better modelling of
such large scale processes and heterogeneities. In this paper we will focus on the latter
aspects.

1.1. Experimental evidence of mixing issue in bioreactors

Large scale bioreactors have been shown to exhibit heterogeneous concentration fields :
cells circulating through such reactors are submitted to an extracellular fluctuating
environment [3, 4]. As a result, large scale cultivations exhibit lower carbon conversion
yields on biomass than expected from lab-scale experiments : Bylund et al. [3] observed
a reduced yield of 20% for cultures of Escherichia coli; same results were reported by
Enfors et al. [5] for the production a Baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. Generally,
substrate is fed at the top of the reactor and air is injected at the bottom. Because of
imperfect macromixing both oxygen and substrate gradients are formed (low oxygen
and high substrate concentrations at the top and low substrate and high oxygen
concentration at the bottom). The effects of such heterogeneities on microbial
metabolism were studied in scale down reactors, composed of a continuous stirred tank
and a plug flow reactor with a view of periodically exposing cells to sudden variation of
the substrate concentration in their environment [3-8]. Insufficient macromixing
represented as periodic exposure to excessive substrate concentration induces some
modifications on the cell metabolism, leading to the formation of by-products and

137
decreasing the overall reactor performance. Dunlop and co workers pointed out the
influence of intermediate mixing scales (i.e. mesomixing) on continuous cultures of S.
cerevisiae [9, 10]. The conversion yield of substrate into biomass is found to be
dependent on the number and position of injection point in a 3L aerated bioreactor.

1.2. The coupling between hydrodynamic and bioréaction

Bioreactors are characterized by a complex three phase flow (liquid, gas, biomass). The
modelling of a bioreactor requires a model for the flow field, a model for the reactions
taking place in the biomass and a model for the mass transfer between phases (from gas
to liquid and from liquid to biomass). Despite the fact that biological reactions are
conditioned by the mass transfer between the liquid and the biomass, hydrodynamics
and bioreactions are generally coupled through conservation equations for the
dissolved species. Only a few examples exist where the population of microorganisms is
treated with a Lagrangian approach [7, 11, 12]. The conservation equation for the scalar
, written over a control volume, accounts for convective, diffusive, turbulent transport
and reaction:

C C   C 

uj   D  u ' C   R
'
t x j x j 
j
 x j 

The scalar transport can be described using compartment models or Computational

Fluid Dynamics (CFD) codes. Compartment models are very popular in the domain of
bioreactor simulation because multiphase aspects and metabolic models can be easily
implemented in the overall model for the bioreactor [13-15]. However, when a
compartment model is used for the hydrodynamics, all transport terms in equation (1)
have to be modelled. Recent progress in computer power now allows for the
computation of the 3D turbulent, multiphase flow by CFD calculations [1, 4, 5, 16].
Whatever the approach (Eulerian or Lagrangian) two assumptions are made: - the
control volume is homogeneous; a possible occurrence of segregation under the
resolved scale is not considered. - the reaction rate is computed from kinetic laws that

138
are strictly valid for steady state conditions with a high degree of mixing (small scale
reactor). More details are presented in the next section.

Yet, it is well established that the applicability of the biokinetic models to temporally
changing conditions experienced by microorganisms in large scale bioreactors is not
guaranteed [15]. Frequently, the parameters of the biokinetic model (including
metabolic model) obtained at the lab scale have to be adapted in order to fit the results
in large scale bioreactors [14]. It has already been pointed out that the interaction
between mixing and biological reaction (physiological response to imperfect mixing)
has to be taken into account in order to improve the predictive capabilities of the
models [1]. To begin with, recent progresses in the description of the substrate
assimilation capacity of the microorganisms are presented. This brief presentation is
important since the substrate assimilation is not characterized by a constant rate but
depend on the cell physiology which is conditioned by the encountered fluctuating
concentrations. This is a significant increase in complexity by comparison to turbulent
reacting flows.

2. THE IMPACT OF MIXING ON BIOREACTION

2.1 Consequences of imperfect mixing on the metabolism

Considering that cells growing in bioreactors are exposed to two kinds of fluctuating
concentrations, rapidly changing concentration due to small mixing scales and low
frequency fluctuation inhering in the circulation time in the bioreactor, the aim of this
paragraph is to highlight the impact of periodic fluctuations on bacterial metabolism.
Microbiologists all agree with the fact that starvation and suboptimal levels of substrate
induce non negligible consequences on bacterial metabolism [17]. Among them, one can
note the fact that bacterial cells adapt their substrate uptake capacities to the
concentration fields they undergo [18]. In other words when the substrate
concentration changes abruptly in time, or equivalently when cells are transported
through a gradient of substrate, relation (2) is not applicable locally because it is a law
of equilibrium. Neubauer et al. [6, 8] showed that heterogeneous conditions caused by
insufficient mixing influences cell physiology. They noticed that cells cultivated under

139
limiting conditions (starvation period during 27 minutes) but regularly exposed to
substrate excess (for 2 minutes) respond by an increase of their substrate uptake
capacity. As a result the instantaneous uptake rate measured after the limitation relief is
up to six times higher than the maximum uptake rate measured in a batch culture. This
faculty to exhibit instantaneous uptake rate that are not correlated to the growth rate
was also reported by Leegwater et al.[19]. Natarajan and Srienc [20, 21] confirmed by
recent techniques that growth rate and substrate uptake rate were decoupled in the
range of growth rates studied. Ferenci explains that when exposed to limiting
concentration cells develop additional systems for the transport of glucose
characterized by a high affinity for the substrate (very low KS value) [17, 18, 22]. From
these experimental results, it is possible to conclude that cells can develop an extra
assimilation capacity, suggesting that they assimilate a certain amount of excess
substrate when suddenly exposed to high substrate concentration. The actual
instantaneous uptake rate of the cell population is therefore a consequence of the
culture history [8]. Thus, the maximum uptake rate cannot be readily set to a constant
independently from the scale of the reactor if imperfect mixing conditions occur. Then,
the instantaneous uptake rate in heterogeneous concentration field cannot be
calculated from the average growth rate. However in most papers the evaluation of R in
equation (1) is obtained from a Monod type law described in all microbiology textbook,
which relates bacterial growth rate μ to the substrate concentration S. This relationship
is obtained from steady state experiments and perfect mixing is assumed. Therefore the
local value S(x,t) around each cell, the temporal average S t  and the volume average
<S> are all equal. The substrate uptake rate qS is defined by equation (2) where KS is
defined as the affinity constant for the substrate (a few mg.l-1), YXS the conversion yield
of substrate into biomass (around 0.5 [Link]-1) and μmax the maximal growth rate.

S S
q S  Y XS1    Y XS1   max  q S max (2)
KS  S KS  S

By definition this relation is valid for cells that are adapted to their environment, i.e.
that have been facing a constant concentration S(t) for a long time. At steady state, the

140
uptake rate is found to be proportional to the growth rate, which is itself related to the
averaged volume concentration in the bioreactor. Because it is related to growth, the
substrate assimilation rate as defined in (2) is indeed an averaged value over the time
scale for growth. Yet, the literature reported above clearly indicates that the maximum
uptake rate is not constant but is a function of the culture history. Therefore, equation
(3) should be preferred.

1 t 
q S max t   f   q S u du  (3)
  t  

In order to account for such a memory effect, the most natural approach is to treat the
biomass as a dispersed phase. Recently, Lapin et al. [11, 12] have integrated a dynamic
metabolic model for the glucose uptake (adapted from Chassagnole et al. [23]) in an
Euler- Lagrange simulation of a bioreactor in order to compute the local substrate
uptake rate as a function of the cell composition. This modelling approach allows for the
decoupling of the substrate uptake rate from the local concentration. It must be noted
however that the local concentration here is still an averaged value over the control
volume which size is determined by the spatial resolution of the hydrodynamic model.

2.2. Turbulent mixing and substrate influx

The mixing phenomena in turbulent flows can be decomposed into three steps (macro-,
mesoand micromixing) occurring simultaneously, whose characteristic time and length
scales are summarized in table 1 [24, 25]. For usual reactor configurations, the
Kolmogorov scale varies from 50 to 300μm, thus being far larger than bacterial cell
(2μm) or yeast (10μm) [9]. Microbial cells are placed in molecular diffusion controlled
environment and the phenomenon responsible for providing substrate to the cell
remains the molecular diffusivity. However the concentration in the environment of
cells is controlled by mesomixing. Al Homoud and Hondzo studied the effect of very low
turbulent dissipation rate on the rate of assimilation of oxygen and glucose [26, 27].
They described an experimental device which consisted in a batch reactor with an
oscillating grid, whose frequency varied from 0 to 6Hz resulting in an averaged

141
ranging from 0 to 4.6 10-5 m2.s-3. The measured assimilation rates are always below
the maximum uptake rate which means that the uptake is limited by the transport
towards the cell. In such conditions, i.e. no segregation at the macroscopic scale, very
low limiting substrate concentration, they found that the Sherwood number was
correlated to . However, such low values are not encountered in industrial bioreactors
and therefore, diffusion is not the limiting step for assimilation in stirred bioreactors.
Merchuk and Asenjo [28] proposed a reinterpretation of the Monod’s law as the result
of the competition between fast reaction at the cell interface and limiting transport. The
showed that the KS value is indeed an apparent constant that depends on the rate of
mass transport. As a consequence, the parameter KS also should not be set
independently from mixing conditions.

3. INFLUENCE OF ENERGY DISSIPATION RATE, LOCAL HYDRODYNAMIC

CONDITION ON SUBSTRATE INFLUX: BIBLIOGRAPHICAL ELEMENTS

3.2. Influx controlled by mixing effects

Mesomixing
Reduction of Micromixing
Macromixing integral by Micromixing by diffusion
length scale engulfment

1
1 1
Time tc 
V L 2 3   2   2   
NQc  N  d 3 t S  2 C  tk    t D  2  arcsin h 0.05 
scales         D
 

3
1 1
Length 1k  3  4  D 2 4
k    B   
2
scales 
2     

Table 1 : time and length scales of mixing in homogeneous turbulent flow

In fed reactors, substrate is transported from the feeding zone through macro and
mesomixing down to the Kolmogorov scale. Besides macromixing, which is correlated to

142
circulation time in the reactor and the averaged dissipated energy, the local energy
dissipation rate is a key element for determining the substrate influx to cells. Indeed,
local segregation can occur whereas the reactor is perfectly macro mixed. Dunlop and
co-workers [29] have shown that feeding substrate from zones with high energy
dissipation rate causes an increase of substrate flux towards cells. Some of their
experiments were conducted using a stirred tank reactor with a recirculation loop
through a static mixer with a removable grid. Substrate is fed either in the stirred or
plug flow zone to [Link]. This yeast presents the capacity to develop overflow
metabolism when exposed to substrate concentration above a critical value (growth
repression). When the substrate is fed into the well mixed stirred tank bioreactor no
overflow is observed, indicating that most of the cells experiment a concentration that
remains below the critical value. But, when the substrate is fed through the static mixer
the averaged concentration in the PFR zone controlled by the relative mass flow rates of
the feed and the recirculation, exceeds the critical value. When the grid is removed,
mixing in the mixer body is poor (Re=940) and only few cells face a high concentration
and are consequently repressed. In the grid-equipped static mixer (=1kW.m-3) all cells
experience the sub critical substrate concentration which causes overflow and a
significant decrease in the reactor performance. This study clearly shows the impact of
mixing intensity at the feed point, in a way that it conditions the cell population for
further cultivation in the stirred tank. In another lab scale study [9], conducted in well
agitated continuous fermentor, overflow metabolism was observed when the feed point
is located in a zone of low . According to the methodology proposed by Bourne [25] for
the investigation of mixing effects in chemical reactors, this suggests an effect of
mesomixing. These studies show the importance of considering both the local and
substrate concentration values to calculate the substrate flux to cells.

3.2. Micromixing model for the investigation of substrate concentration

distribution during first mixing times

We will now examine the source of errors using equation (2) to compute the source
term in equation (1) when some segregation in the control volume exists. This was done
by using the E model with self engulfment [30]. This model distinguishes two zones in

143
the mixture, reaction only takes place in the substrate rich zone in which cells are
incorporated at a rate defined by the parameter E=1/tk. The PFR zone from Dunlop’s
experiments is studied [29]. In figure 1, the averaged concentration in the mixture (0.2
g.L-1) is far above KS, and results are examined in terms of the ratio between the
averaged assimilation rate and the assimilation rate based on the averaged
concentration (perfectly mixed hypothesis). When mixing is slow, the ratio smoothly
increases with time. In such case the fraction of cells in the glucose rich zone, where
they assimilate the substrate at the maximum rate, is small. When mixing is fast, the
fraction of cells facing high concentration reaches 1 after 0.5 s.

Then, the entire population assimilates the substrate at the maximum rate for the time
remaining in the PFR zone (set to 5 s in the simulations as in [29]). In case of q(<S>)
causing overflow, a perfect mixing will be prejudicial to the overall performance of the
bioreactor as reported by Dunlop.

0,9

0,8

0,7

0,6
<qS>/qS(<S>)

0,5

0,4

0,3

0,2 50ms
250ms
0,1 500ms

0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
t (s)

Figure 1: Effect of segregation on the substrate assimilation rate at high <S> value

144
 1 1

0,9 0,9

0,8 0,8
normalized uptake rates (-)

0,7 0,7

cell mass fraction (-)

0,6 0,6

0,5 0,5

0,4 0,4

0,3 0,3
qS/qSmax
0,2 q(<S>)/qSmax 0,2
p(X|S>0)
0,1 0,1

0 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
t (s)

Figure 2: Effect of segregation at low <S> value. tk=500ms

In figure 2 (graphe II.13), the average concentration (0.02 g.L-1) is only twice the value
of KS, resulting in q S  S   0.66q S max . The normalised uptake rate for the fraction of cells

in the glucose rich environment (solid line) exceeds the normalized uptake rate based
on the average value (dashed line). The fraction of cells in the glucose rich zone (line
with symbols), increases as mixing proceeds and finally reaches 70% of the whole
population at the end of the mixer. From this it is clear that using equation (2) instead of
considering segregation would over estimate the fraction of reacting cells and
underestimate the actual uptake rate of cells that assimilate the substrate. In case of
q(<S>) under the overflow threshold, the model accounting for segregation is the only
one to predict that a subpopulation of cells actually facing high concentrations may shift
to an overflow metabolism.

4. CONCLUSION

Cells cultivated in large scale bioreactors are transported through a heterogeneous

environment. Their behaviour is an integrated consequence of all the fluctuations they
encounter. The impact of these fluctuations on microbial metabolism and therefore the

145
prediction of microbial comportment remains a crucial issue for microbiologists and
engineers. Experiments reviewed clearly establish connections between mixing and
biological reaction but the effects of sub-grid segregation are ignored in the modelling of
bioreactors. Coupling biological reaction to a mixing model gave a sound explanation of
experimental observations. This review points out the need to consider mesomixing for
the prediction of local biological reaction rates in models used for the scale up of
bioprocesses.

NOMENCLATURE

KS affinity constant for the substrate (mg.l-1)

qS substrate uptake rate (gS . gX . h-1)

qSmax maximum substrate uptake rate (gS . gX . h-1)

S substrate concentration

YXS biomass yield on substrate ([Link]-1)

μ specific growth rate (h-1)

μmax maximal specific growth rate (h-1)

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149
150
CULTURE DE LACTOCOCCUS LACTIS NCDO 2118 DANS UN REACTEUR COUETTE

Les résultats du chapitre précédent montrent l’apparition d’un phénotype jamais

rapporté { notre connaissance, caractérisé par l’apparition, spécifiquement en réacteur
Couette { 20 RPM, d’agrégats de cellules de L. lactis. Afin d’approfondir ce point, nous
avons réalisé les mêmes cultures avec une concentration initiale en glucose de 25 g/L
au lieu de 5 g/L afin d’obtenir plus de biomasse et d’amplifier ce phénomène. Les
fermentations conduisent à la création de filaments macroscopiques que nous avons
identifiés comme étant constitués de cellules emprisonnées dans une matrice
polymérique. Nos travaux montrent que si ce phénotype est indépendant des conditions
de mélange, il est induit par les conditions hydrodynamiques autour des cellules.

Les résultats ainsi que la discussion s’y apparentant sont présentés sous forme d’un
article accepté dans Biotechnology and Bioengineering dans une première partie. La
seconde partie présente une analyse complémentaire de la composition de la matrice
obtenue et offre quelques hypothèses quant aux mécanismes biochimiques de
structuration de la matrice.

1 APPARITION D’UN PHENOTYPE PARTICULIER ET NOUVEAU.

A unique phenotypic modification of Lactococcus lactis cultivated in a

Couette bioreactor

Maëlle Douaire, Myriam Mercade, Jérôme Morchain*, Pascal Loubière

Université de Toulouse; INSA, UPS, INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France;

INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
France;

CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

*corresponding author: e-mail: [Link]@[Link]

151
Abstract

Batch cultures of Lactococcus lactis NCDO 2118 and IL 1403 were performed in a
Couette bioreactor operated in the Modulated Wavy Vortex flow and the turbulent
regimes. This study provides an overall analysis taking into account both mechanical
stress and mixing in a Couette bioreactor. A unique phenotypic aspect has been proved
to occur only in the Modulated Wavy Vortex flow regime for the two studied strains,
namely that the cells become entrapped in a filamentous form. No change in the
metabolic behaviour of the cells has been observed. The polymeric matrix has been
microscopically observed through FISH and fluorescent lectin binding, showing cells
entrapped in a glycoconjugate matrix. All hypotheses regarding insufficient mixing as a
cause of this phenotype have been discarded, leading to the conclusion that this
particular phenotypic feature is essentially due a combined effect of mechanical stress
and flow structure. Particle size measurement during the fermentation course indicates
that formation of filamentous form results from a continuous aggregation started in the
early stages of the cultivation. According to our results a minimum shear is required to
induce the ability for cells to aggregate. Then, it appears that both flow structure and
mechanical stress (shear) are responsible for the appearance of such a filamentous
form. As far as the authors know, this is the first experimental evidence of a bio
polymerisation induced by the flow structure.

1.1. Introduction

(Introduction)

Biological response to hydrodynamic stresses has been widely investigated during the
past decades. From a theoretical point of view, one can distinguish between two kinds
of stresses induced by hydrodynamic conditions: mechanical stress and chemical stress,
which are both associated with mixing. Substantial evidence of the interactions between
mixing and/or mechanical stress and bioreactions is available (Lara et al. 2006). While
mechanical stress is a critical issue regarding cell damage (e.g. for animal cells
(O'Connor et al. 2002), (Curran and Black 2004) and filamentous fungi (Amanullah et al.
2000; Jüsten et al. 1996)), insufficient mixing also impacts cell metabolism because it

152
exposes cells to nutrient concentration fluctuations in their environment. Mixing issues
can lead to lower (bioreactions) yields in large scale bioreactors (Bylund et al. 1998;
Enfors et al. 2001; George et al. 1998; Larsson et al. 1996) and also in scaled-down
bioreactors (Amanullah et al. 2001; Delvigne et al. 2006; Hewitt et al. 2000; Lara et al.
2006; Namdev et al. 1992; Oosterhuis et al. 1983). The influence of insufficient mixing at
very low agitation levels has also been studied, mainly in the environmental biology
field (Al-Homoud et al. 2007; Bergstedt et al. 2004; Hondzo and Al-Homoud 2007). In
the range of power input studied [0.6 – 46.3].10-6 [Link]-1 the oxygen uptake rate was
shown to be facilitated by small-scale fluid motion (Al-Homoud et al. 2007). Whatever
flow-related phenomenon is considered (mixing or mechanical stress), one key
parameter is the power input: both total value and the spatial distribution of the local
energy dissipation rate.

In stirred bioreactors, the power input is generally high (1 [Link]-1), the flow field is
highly heterogeneous in terms of local energy dissipation rate (Delafosse 2008;
Delafosse et al. 2009) and the 3D flow structure is very complex. So, it is likely that both
mechanical and chemical stresses are present and the analysis of the biological
response to environmental fluctuations is therefore rather complicated. The situation is
exacerbated when some gas sparging must be incorporated into the bioreactor, as
highlighted by a study which revealed that local oxygen limitations occurred in a
presumably perfectly mixed gas-liquid bioreactor (Garcia et al. 2009).

As alternatives to the stirred vessels, bioreactors have been developed which utilise
simpler flow configurations. In this study, the axisymmetric flow in the annular gap
between two coaxial cylinders is considered. When the inner cylinder rotates and the
outer one is immobile a laminar flow, known as Couette flow, is first observed. Above a
critical rotational speed, the flow becomes unstable and axially-stacked vortices appear
in the annulus, a phenomenon known as Taylor vortex flow (Kataoka 1986). Since the
original work of Taylor to those of Kataoka, Rudman (Rudman 1998; Rudman et al.
2008) or Climent (Climent et al. 2007) this type of flow has received a lot of attention
from the fluid mechanics community as it represents a fundamental problem for
studying flow instability. This is also true in the chemical engineering field, where this

153
flow was mainly used in the frame of mixing and precipitation studies (Desmet et al.
1996; Desmet et al. 1996; Liu and Lee D.J. 1999; Marchisio et al. 2001; Ohmura et al.
1997; Ohmura et al. 1998; Wang et al. 2005). Couette reactors are of particular interest
for such studies because the flow field can be either laminar or fully turbulent whilst
maintaining coherent structures named Taylor vortices. In the turbulent regime, the
flow structure is stable, spatially homogeneous and exhibits a narrow range of mixing
control parameters (narrow distribution of local energy dissipation) (Racina and Kind
2006). Between the laminar and turbulent regimes, a complex transition sequence
occurs, including the development of so called Modulated Wavy Vortex flow. A complete
characterisation of these regimes as well as transition limits in terms of Reynolds and
Taylor number can be found in Kataoka (Kataoka 1986).

As far as biological applications are concerned, the classification and analysis of the
previously published works is quite complex because of the diversity of strains,
operating conditions and flow regimes studied. Arnaud and co-workers (Arnaud et al.
1993) studied the effect of a controlled shear between 0 and 72 Pa, on the bacteria
Lactobacillus bulgaricus in a laminar Couette flow. In order to maintain the laminar flow
whilst increasing the rotation speed, CMC (carboxymethyl cellulose) was added to
increase the viscosity. Growth rate, lactose consumption and lactic acid production were
improved by intermediate shear stress levels (between 30 and 50 Pa). However the
observed cell lengthening might have introduced a bias in the biomass concentration
measurement, which was undertaken using an optical density technique. The authors
also pointed out that besides the reduced mass transfer due to the increased viscosity,
the CMC itself has a chemical effect on the biological activity. Cussatlegras and Le Gal
studied the effect of mechanical stresses on the bioluminescence of the dinoflagellate
Pyrocystis noctiluca in a laminar Couette reactor (Cussatlegras and Le Gal 2004). They
showed that a constant shear (in laminar conditions) only induces a weak response
whereas rapid changes in the shear produce a strong light emission. Sahoo et al. (Sahoo
et al. 2003) reported cells size modification, enzymatic activity and transcriptomic
response to shear stress of B. subtilis cultivated under laminar flow conditions.

154
Recently, Patel and co-workers presented experimental evidence of a relationship
between the shear rate, the growth rate, the protein production and the morphology of
Trichoderma reesei (Patel et al. 2010). The 5 L Couette reactor was equipped with a
membrane on the inner cylinder for oxygen supply and was operated either in batch or
continuous mode. The cultivations were performed under laminar conditions with a
shear rate ranging from 78,2 to 326 s-1. Unfortunately, both mixing and oxygen mass
transfer varied with the rotation speed, hence the biological response was probably due
to multiple effects.

Barbouche studied the effect of mechanical stress on mammalian cells in an oxygen

perfused Taylor-Couette reactor (Barbouche 2008). In order to alleviate the
interactions between agitation and gas-liquid mass transfer, oxygen was provided
through a membrane covering the inner cylinder. Since the oxygen demand by
mammalian cells is much lower than that of bacteria or yeasts, changing the rotation
speed had little influence on the dissolved oxygen concentration and a better
correlation was obtained between the magnitude of the stresses and the fraction of
damaged cells (apoptosis).

If one excludes the works of Curran and Black (Curran and Black 2004; Curran and
Black 2005), and that of Dunlop et al. dedicated to plant cells (Dunlop et al. 1994), then
very few experimental studies on the relationship between the flow structure in a
Couette reactor and the cell physiology are available. Curran and Black demonstrated
the impact of shear stresses on mammalian cells, in terms of metabolism enhancement
and phenotypic properties. Dunlop et al. showed that a correlation exists between the
total energy dissipation and the biological activities (e.g. regrowth ability after an
exposure to mechanical stress, membrane integrity, mitochondrial activity, aggregate
break-up and lysis) in both laminar and turbulent flow regime. In particular, the ability
for cells to grow is restricted well below the critical limit required to lyse the cells. Plant
cells (20-100 µm) spontaneously grow in suspension culture as aggregates of hundreds
of cells. The size of the plant cell aggregates formed decreases with an increase in the
total energy dissipation.

155
This paper describes the results obtained in anaerobic batch culture of Lactococcus
lactis ssp. lactis performed in a Couette reactor at two rotation speeds corresponding to
the modulated wavy and the turbulent flow regimes. Lactococcus lactis is chosen
because it exhibits a sensitivity toward substrate influx (Garrigues et al. 2001).
Depending on substrate flux through the glycolytic pathway, homolactic or mixed-acid
metabolism can occur. The analysis of the produced metabolites represents an
interesting biological approach for observing the impact of mixing at the cell scale
(which governs the external mass transfer toward cells) and provides valuable
information on whether the cells’ metabolism is influenced by the features of the flow.
All cultures have been performed under anaerobic conditions so as to avoid
complicating issues due to gas-liquid two phases flow or oxygen transfer through a
membrane. Cultures have been repeated in two different Couette reactors using either
commercial M17 medium or a chemically defined medium. It is found that a specific
behaviour is triggered by the modulated wavy flow structure: whenever a culture is
performed under this flow condition, a filamentous form is induced by an aggregation of
cells entrapped in a polymeric substance. However the overall metabolism is not
seriously affected. As far as the authors know, this is the first experimental evidence of a
bio polymerisation induced by the flow structure. No such evidence of macroscopic
phenotypic difference has even been demonstrated in a Couette bioreactor for bacteria.
The possible links between these observations and the recent work of Chapot-Chartier
et al. (2010) are discussed in the final part of the paper.

1.2. Matériel et méthodes

(Experimental set-up and methods)

1. Couette reactor characterisation

Most cultures are performed in a 2 L Couette reactor composed of two concentric

cylinders (Height H = 0.2 m, inner radius Ri = 0.100 m and outer radius Ro = 0.115 m).
Complementary cultures were performed in a slightly different Couette reactor (Height
H = 0.2 m, inner radius Ri = 0.10 m and outer radius Ro = 0.12 m) with a view to

156
eliminate the possibility of bias due to other properties of the reactor, e.g. construction
material.

For the main reactor, the resulting radius ratio, = RR is 0.87. The inner cylinder is
rotating, the outer one is immobile. The rotation speed,  can be varied from 2.1 to 12
rad.s-1 (N = 20 to 114 Revolutions Per Minute RPM). The flow field in this device was
measured experimentally and simulated numerically by Coufort (Coufort 2004). In the
velocity range studied by Coufort (N[30-90] RPM), the flow was shown to be fully
turbulent. A mean value of the specific power input, ([Link]-1) was obtained from a
volumetric integration of the local turbulent energy dissipation rate derived from 2D, 3
components, axisymmetric, RANS- k- RSM numerical simulations (Coufort, 2004). It
was found that these values were in good agreement with the energy dissipation
estimated from the torque on the inner cylinder as well as with the experimental
correlation of Wendt, reported by. (Lathrop et al. 1992).

T  3/ 2
 1.45 Re1, 445 400  Re  10.000
 2 H (1   ) 7/4

(1)
T  3/ 2
 0.23 Re1,7 10.000  Re  100.000
 H
2
(1   ) 7/4

In this equation, T is the torque on the inner cylinder, (N.m),  is the cinematic viscosity
of the liquid phase (water properties are used) and Re is the Reynolds number defined
as

Ri Ro  Ri 
Re  (2)


In the present study, experiments were carried out at the maximum (114 RPM) and
minimum (20 RPM) stable rotation speeds with a view to maximising the difference in
specific power input. At the lowest rotation speed, the reduced Reynolds number
(Re/Recrit) is 27 which is slightly above the critical value above which instabilities occur
(Re/Recrit =20) as explained by Esser and Grossmann (Esser and Grossmann 1995). The
critical Reynolds number, Recrit, is defined by these authors as:

157
Re c 
1 1   2 with characteristic constant α being equal to 0.1556
 2 2 1   3   

In our case its value is 117. It should be stressed that the flow structure differs notably
between these two extreme conditions: at 20 RPM the flow structure corresponds to the
Modulated Wavy Vortex Flow whereas it is Turbulent Vortex Flow at 114 RPM. In the
latter case, the flow structure consists in a stack of stable counter-rotating toroïdal
vortices, called Taylor vortices. Visualisations of the corresponding flow structures can
be found in Kataoka (1986) and Rudman (Rudman et al. 2008). In any case however, the
specific power input, in[Link]-1, can be estimated from the experimental correlation
due to Wendt.

P T
  (3)
V V

In its non dimensional form, the specific power input corresponds to a power number,
Np, given by :

PRo  Ri 
Np  (4)
VRi3  3

Figure 1 presents the power number and the specific power input dependence on the
Reynolds number of the flow. This type of representation, Np=f(Re), is common in the
field of mechanical agitation. In the laminar regime the power number is proportional to
Re-1, it is constant in the fully turbulent regime and varies continuously in the
transitional regimes (Harnby et al. 1997). It can be seen that our experiments were
conducted in this transition zone between strictly laminar and fully turbulent flow. The
experiment at 20 RPM is close to the laminar regime (Re < 2300). The experiment at
114 RPM approaches the region of constant power number associated with fully
turbulent flow.

158
 0,005 1

0,004 0,1

Specific Power Input ([Link]-1)

Power Number (-)

0,003 0,01

114 rpm
0,002 0,001

0,001 20 rpm 0,0001

0,000 0,00001
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Re

Figure 1: Power number (∆) and specific power input (□) as a function of the Reynolds number.
Estimated values from eq. (4)

The experimental points are marked by symbols and the corresponding values are
reported in Table 1. The specific power input is a hundred times greater at 114 RPM
than at 20 RPM.

N (rpm) 20 114

Ri ( Ro  Ri ) 3140 17900
Re 


Np 2,47 10-3 1,16 10-3

 ([Link]-1) 1,51 10-3 0,1318

Table 1: quantities of relevance for the Couette reactor used

2. Microorganisms and media

Batch cultures of Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO 2118, or of L. lactis IL 1403 for
control experiments, were produced in the 2-liter Couette reactor described above, in

159
cylindrical 60mL shaken flasks, and in 2-L fermentor (Setric Génie Industriel, Toulouse,
France) for comparison. Cultures were made under anaerobic conditions, at 30 °C, in
M17 medium (Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) or in a chemically defined
medium designed for Lactococcus lactis cultures as described previously (Poolman and
Konings 1988). The initial glucose concentration was 5 or 25 g.L-1, as stated in the text,
and some experiments were performed with yeast extract enriched media (12.5 g.L-1
added to M17 media). Potassium hydroxide (5 M) was automatically added through a
needle in order to maintain the cultures at pH 6.6. A single point injection was used at
114 RPM whereas two injection points were used at 20 RPM. This strategy was adopted
in order to reduce potential mixing issues arising from the pulse addition of KOH
(Baldyga and Bourne 2003). Inoculation was at 2.5 % with exponential phase cells, from
pre-cultures grown in the same medium and conditions (with the exception of pH
regulation).

3. Analytical methods

Bacterial growth was monitored by measuring the optical density at 580 nm (1 OD unit
is equivalent to 0.3 g.L-1 of dried biomass). Glucose and fermentation products were
determined by HPLC analysis (Agilent Technologies 1200 Series, Waldbronn, Germany)
using a HPX87H+ Biorad column and the following conditions: a temperature of 50 °C, a
solvent (H2SO4 5 mM) flow rate of 0.5 [Link]-1, and dual refractometer and UV
detection. The exopolysaccharides (EPS) isolation and quantification protocol was
adapted from (Jung et al. 2008) and applied to stationary phase cells (at the end of broth
acidification). Trichloroacetic acid (TCA) was added to fermented cultures (4 % W/V)
which were then heated (100 °C / 20 min) to denature proteins and improve
detachment of EPS from the bacterial cell walls. Samples were then centrifuged (4000
RPM / 4 °C / 15 min) to remove precipitated proteins and dead cells. Ethanol was added
to the supernatants (50 % V/V) and the samples were gently agitated at 4 °C for 48 h.
The precipitated EPS were then filtrated (0.45 µm), dried (24 h / 60 °C / 0.2 atm), and
weighed.

4. FISH and lectin binding

160
At the end of the fermentation, once media acidification stopped, a needle was placed in
the bioreactor in order to collect the filamentous aggregates. After a few seconds the
needle was carefully removed and the material wrapped around it transferred into a
sampling tube.

4.1. Sample preparation

An appropriate sampling protocol was chosen to avoid the presence of residual glucose.
Samples treatment was adapted from Böckelmann et al. (2002). Once collected, cells
were fixed with 200 µL of paraformaldehyde (PFA) solution (4 % in PBS) for 2 h at 4 °C,
then washed 3 times with PBS buffer 1X before dehydratation with increasing ethanol
concentration (50 %; 80 % and 96 % V/V) and oven-dried to eliminate residual ethanol.

4.2. Fluorescent in situ hybridization

Fixed samples were hybridized with 100 µl of hybridizing mixture (0.9 M NaCl, 20 mM
Tris-HCl pH 8, 25 % formamide, 0.02 % SDS) and 10 µL of probe solution (EUB338-cy3
50 ng/µl, Aman et al. 1990) for 1.5 h, at 46 °C in the dark. After hybridization the sample
was immersed for 10 min at 48 °C in washing mixture (0.15 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH
8.5 mM EDTA, 0.01 % SDS – kept at 46 °C) and rinsed twice with pre-warmed washing
buffer (20 mM tTris / HCl, 0.01 % SDS, 88 mM NaCl) prior to lectin binding assays.

4.3. Lectin-binding assays

Each lectin (Sigma Aldrich inc.) used in this study was commercially labelled with FITC.
Source, common name, sugar specificity (according to the manufacturer specification)
and concentration of the lectins used are summarized in table 2. The hybridized
samples were stained with 100 µL fluorescently labelled lectins for 30 min, at room
temperature, in the dark and washed 5 times with the washing buffer to remove
unbound lectins. The so-treated samples were then carefully applied on multi-well glass
slides and oven-dried prior to confocal epifluorescent microscopy observation.

Common name Taxonomic Sugar specificity Concentration

name used

161
Carnivalia Concanavalin A -glucose, -mannose 0.12 mg/ml
ensiformis

Lentil Lens culinaris -D-mannosyl and -D- not specified

glucosyl residues

Griffonia Bandeiraea -D-galactosyl residues not specified

simplicifolia simplicifolia and
N-acetyl--D-
galactosaminyl residues

Coral tree Erythina D-galactose and D- 0.04 mg/ml

cristagalli galactosides

Table 2: characteristics of the lectins used in the lectin-binding assays of L. lactis NCDO 2118

5. Microscopy

The sample was mounted with cytifluor for the visualisation and viewed under oil
immersion with a confocal laser scanning microscope (Leica TCS SP2 with argon, GreNe
and HeNe laser). Pictures and three-dimensional reconstruction of images were then
created together using Volocity software (PerkinElmer).

6. Granulometry

Volumetric particle distributions were obtained with a Mastersizer (Malvern

Instruments) based on laser light dispersion. The signal was analysed assuming a
spherical shape for the aggregates and a single mode distribution. At the initiation of the
aggregation process, the particle sizes are rather small and the hypothesis regarding the
shape has no significant impact on the results. The filamentous form only occurs at the
end of the cultures. Different post processing options were tested (multimodal analysis)
with minor changes on the general observations. Moreover the main objective is to
compare the changes in the agglomerate size under different flow conditions. Therefore,
the unavoidable bias introduced by the post processing of the raw signal does not affect
the conclusion of this comparative study. The size characterisation itself is qualitative
and must be considered as such

162
1.3. Résultats

(Results)

Kinetic analyses of fermentations at constant rotation speed in the Couette reactor

Cultures of Lactococcus lactis NCDO 2118 were performed in a Couette reactor at two
rotation speeds in M17 medium with initial glucose concentration set at 5 g.L-1.
Surprisingly, cultures exhibited filamentous forms composed of cell aggregates at 20
RPM but not at 114 RPM. The hypothesis of a local glucose limitation due to insufficient
mixing, i. e. very low glucose concentration around the cells at low agitation level, was
analysed in similar cultures containing 25 g.L-1 glucose. As previously, a ropy phenotype
was clearly identified at 20 RPM in these conditions, as illustrated in Figure 2. Similar
batch experiments were conducted with 25 g.L-1 glucose with yeast extract
supplementation (12.5 g.L-1) to prevent any local nitrogen limitation. Those cultures
exhibited the same mucoïd phenotype at 20 RPM while the 114 RPM fermentation
remained planktonic.

Figure 2: Picture of the Couette reactor taken at 6h30min of culture of L. lactis NCDO 2118 performed at
20 RPM in M17 medium containing 25 g.L-1 glucose

In order to investigate the possibility of an insufficient mixing of the added KOH,

inducing local pH gradients as an origin of the cell aggregation, fermentation was
repeated with buffer enriched media. With the buffered medium, no addition of KOH
was necessary during the first four hours of culture. The appearance of a filamentous
form occurred three hours after bioreactor inoculation, i.e. before KOH addition, and

163
only at 20 RPM, proving that such a phenotype is not a consequence of local pH
gradients due to insufficient mixing.

Duplicate growth and metabolic profiles were analysed in fermentations conducted at

20 and 114 RPM with initial glucose concentration set at 25 g.L-1. A good reproducibility
of biomass formation was obtained (Figure 3) and the maximum growth rate was
roughly the same (Figure 4). However, it seems that maximal exponential growth was
slightly delayed at 20 RPM (Figure 3). The same trend is also observable in the glucose
and fermentation products curves (Figure 5), so one can conclude that the observed
delay is not due to an artefact in the optical density measurement.

10,0

9,0

8,0

7,0
Optical Density 580 nm.

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
time (h)

Figure 3: Fermentation time course for L. lactis NCDO 2118 growing on glucose-containing M17 medium.
Data points represent biomass evaluated as optical density (○, ● : 114, □, ■ : 20 RPM)

Whatever the rotating condition, lactate represented 90 to 95 % of the converted

carbon from glucose, whereas formate, acetate and ethanol accounted for only 2.4 to 2.9
%, indicating a homolactic metabolism and no significant metabolic differences in both

164
conditions. The total catabolic carbon recovery ranged between 93 and 97 %, as
expected for lactic acid bacteria cultures. Total polysaccharide content after
polysaccharide extraction and quantification (according to Jung et al.) was not
significantly different : 509 mg/L +/- 102 mg/L and 563 mg/L +/- 103 mg/L for 114
RPM and 20 RPM fermentations respectively. . In order to investigate the strain
dependent character of the phenotype, L. lactis IL 1403 was cultivated in the Couette
reactor using M17 medium containing 25 g.L-1 glucose. As occurred for the NCDO 2118
strain aggregates were formed at 20 RPM but not at 114 RPM.

0,9

0,8

0,7

0,6
Growth rate (h-1)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00
Biomass (in terms of optical density units)

Figure 4: Evolution of specific growth rate as a function of biomass (evaluated as OD units), for 114 RPM
(○) and 20 RPM (□) cultures of L. lactis NCDO 2118

Investigation of the power input effect

All fermentations conducted at 114 RPM remained in a planktonic form until the end of
bacterial growth. The same observation was made for the so called “static cultures”
performed in flasks without agitation at a pH=6.6, which was kept constant by the

165
buffered enriched medium until the 4th hour of growth. Hence the observed mucoid
form is not caused by the total power input solely. Indeed, it was observed that
changing the rotation speed from 114 to 20 RPM, either during exponential growth or
stationary phase, led to the formation of ropy aggregates within 40 min. This indicates
that not only the amount of energy, but also the flow structure, are involved in the
occurrence of the filamentous form.

30

25
glucose, lactate concentration (g/L)

20

15

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
time (h)

Figure 5: Fermentation time course for L. lactis growing on glucose-containing M17 medium. Data points
represent glucose (○ : 114 RPM, □ : 20 RPM) and lactate (● : 114 RPM, ■ : 20 RPM)

Particle size distributions

In order to add more insight into quantitative aspects of aggregate formation, an

analysis of changes in the particle size distribution (PSD) was performed following
fermentations processed at 20 and 114 RPM. The results obtained are presented in
terms of volumetric distribution. This type of representation gives a higher weight to

166
the biggest particles and the presence of only a few big inclusions (aggregate or bubble)
results in a peak in the range of large particles size. This kind of event also produces an
apparent flattening of the distribution in the range of small particle size. Oppositely,
since the large majority of particles are constituted by isolated cells, a number
distribution would mask the presence of big agglomerates.

A comparison of the PSD obtained after 4h45min of cultivation at 20 and 114 RPM is
shown in Figure 6. The behaviour is markedly different for the two cultures: the particle
size distribution at 114 RPM is monomodal and remains centred around a micrometer
which is approximately the cell size, whereas a bimodal distribution appears at 20 RPM,
with the highest volumetric percentage of particles in the range 10-20 µm.

16

14

12

10
% volume

0
0,1 1 10 100 1000
particle diameter (µm)

Figure 6: Comparison of volume particle distribution between cultures conducted at 114 RPM (○) and at
20 RPM (□). The x symbols represent distribution at t=0, identical for 114 and 20 RPM

167
The changes with time in the particle size distributions at 20 RPM are presented in
Figure 7. The initial distribution is centred around 1 µm which corresponds to a
planktonic state of the dispersion. As the fermentation proceeds, a bi-modal distribution
[1-10µm] clearly appears and finally turns into a three mode distribution [1-10-100µm]
at 6h15min of cultivation. From that point in time, it is no longer possible to perform
reliable measurements of the particle size distribution because the suspension becomes
heterogeneous due to the formation of millimetric aggregates. However, these
measurements in the early stages of the cultivation provide insight into the dynamic
aggregation that precedes the formation of macroscopic aggregates. It is noteworthy
that the first stages of the aggregation, leading to particles of about 10 µm in size, had
already commenced after 2 hour of cultivation.

16

14

12

10
% volume

0
0,1 1 10 100 1000
particle diameter (µm)

Figure 7: Volumetric particle distribution as a function of diameter during 20 RPM culture (visible
filamentous form occurred 5 hours and 30 min after inoculation). Time – dependant evolution (data
shown for x t=0 ; ∆ t=1h50 ; ▲-gray 25% t=2h40 ; ▲ gray 50% t=4h45 ; ▲ t=6h15)

Microscopic visualizations

168
Qualitative analyses of the filamentous form have been undertaken through FISH and
lectin binding experiments. FISH method allows specific visualisation of bacterial cells
while lectin binding of glycoconjugate residues facilitates analysis. Results show cells
entrapped in a glycoconjugate matrix. Concanavalin A (Figure 8A) and lectin from Lens
culinaris stained the overall matrix area, while coral tree lectin stained only small
regions of the samples (Figure 6B). In contrast, no staining was obtained with Griffonia
simplicifolia (Figure 6C). These data suggest that glucose (or glucosyl residues) and/or
mannose (or mannosyl residues), and to a lesser extent galactose, are constitutive of the
matrix linking the cells, but not -D-galactosyl residues and N-acetyl--D-
galactosaminyl residues. It is remarkable that the inter-cell distance is about a cell
diameter or more. This indicates that the matrix is an assembly of cells that could
disperse after division.

A C

169
 B

Figure 8: Pictures of L. lactis NCDO 2118 aggregates collected during a culture in Couette reactor at 20
RPM, stained in red by FISH and in green by A) concanavalin A, or B) coral tree lectin, or C) Griffonia
simplicifolia.

The same staining experiment conducted on a sample issued from the 114 RPM culture
revealed isolated cells visualized by FISH but no staining by lectin, regardless of the type
of lectin (data not shown).

Ruthenium Red stained cells

Figure 9 shows an isolated cell from a 20 RPM culture stained with ruthenium red,
which binds surface glycoproteins (Waller et al. 2004), observed with TEM. coarse
whereas static cells’surface remains dense and smooth.

170
 Figure 9 : Picture of L. lactis NCDO 2118 cell isolated from a 20 RPM (left) and shake flask (right)
fermentation, stained with ruthenium red and observed with TEM (gr. x 170 000)

1.4. Discussion

(Discussion)

The results are discussed here in terms of specific power input which determines (i) the
local mixing conditions, i. e. external mass transfer rates for the substrate, (ii)
mechanical stresses, and (iii) flow field structure.

These three parameters are discussed below in relation to the observations.

At low rotation speed, the Lactococcus lactis cultures exhibited an unexpected and
impressive phenotype characterized by macroscopic aggregates. To our knowledge, this
particular phenotype has never been observed before for L. lactis cultures.

(i) Mixing issue.

The first hypothesis proposed to explain this behaviour was associated with mixing
issue. Specifically, at low agitation speed, local nutrient limitations around the cells
could provoke a limited substrate intake, which possibly reduces the growth rate.

L. lactis is known to be sensitive to the glucose flux through its metabolic pathway, since
it can achieve a mixed acid metabolism when the sugar uptake is limited, i. e. when the

171
central catabolic flux is limited at the level of substrate transport into the cell (Garrigues
et al. 1997; 2001),. In our two mixing conditions, the mixed acid yield on glucose shows
that metabolism remains homolactic, indicating that no glucose limitation occurred at
the cell scale. This conclusion was reinforced by the observation that the cultures
harboured an identical phenotype with five times more glucose in the medium.

The qualitative analysis of the matrix clearly indicated the presence of surface and
inter-cell polysaccharides, visualized by ruthenium red and lectin staining respectively.
A limitation in nitrogen, i.e. a high C/N ratio, is often considered as a stimulus for
polysaccharide production by bacteria but the increase in nitrogen supply through yeast
extract - supplemented media did not inhibit the cell aggregation, so the hypothesis of
N-source limitation toward cells was also rejected.

An eventual pH gradient linked to KOH addition was considered but, since such
phenotype was also reported for non regulated cultures performed in a buffered
medium, this hypothesis could be discarded. Therefore, through those experiments,
every hypothesis regarding substrate limitation or insufficient mixing as the origin of
such a phenotype has been eliminated. Similarly, while the evacuation of cell products
(e.g. metabolites) could be theoretically considered as an issue, it is unlikely to be
involved in the primary steps leading to the phenotype as no mixing problems were
demonstrated. Indeed, if the accumulation of excreted products in the vicinity of the cell
was the key phenomenon, one would expect to observe quantitative aggregation in
static culture because the power input is minimal. However, these cultures always
remained planktonic. From these observations, it is considered that insufficient mixing
is not the original cause of aggregation.

(ii) Mechanical stresses.

For the aggregation to proceed, two conditions must be satisfied: (i) cells must be able
to attach to each other, and (ii) cells must encounter one another.

No aggregation took place when cultures were performed in the Couette reactor
without agitation or in shaken flasks. On the contrary, all cultures performed at 20 RPM

172
produced aggregates. Cells which were initially cultivated in shaken flasks (until the
stationary phase) did not agglomerate when transferred into the Couette reactor
rotating at 20 RPM. Furthermore cells that were cultivated first at 114 RPM in the
Couette reactor or in a stirred bioreactor, and then placed at 20 RPM in the Couette
reactor also flocculated. Whether this adhesion property is due to a minimum amount of
extracellular matrix or to a modification of the cell surface polysaccharides is discussed
in the next paragraph. Nevertheless, it seems that there is a minimum level of
mechanical stress necessary to induce the cell’s ability to agglomerate. A quantification
of the mechanical stresses acting on the cells can be obtained from fluid mechanical
considerations. The force acting on a spherical particle subject to a pure shear has been
numerically calculated by Coufort and Liné (Coufort and Line 2003). Integrating the
force distribution on the particle leads to the stress acting on the particle, in N.m-2,
due to the shear rate G.

5
  G (5)
2

The shear rate in the viscous sub-range is given by Camp and Stein (Camp and Stein
1943).


G (6)


At 20 RPM and 114 RPM, the specific power input, , was calculated from equations (1)
and (3) (values are given in Table1). The corresponding shear rates from equation (6)
are equal to 39 and 363 s-1 respectively. Considering the fluid viscosity =10-3 Pa.s, the
stress experienced by the cells can be evaluated as 0.097 and 0.908 N.m-2 at 20 and 114
RPM respectively.

These calculation are based on the assumption that the particle size is much smaller
than the the size of the smallest energy dissipating eddies (, the Kolmogorov length
scale)

173
 1/ 4
 3 
    (7)
 

At the highest rotation speed, the Kolmogorov length scale based on the specific power
input calculated in Table 1 is 56 µm. Thus it can be concluded that individual cells are
subject to a viscous “laminar stress” whatever the flow regime, because they are much
smaller in size than the energy dissipating eddies.

At 114 RPM the flow is turbulent, and the energy is dissipated locally at much finer
length scale than at 20 RPM. A higher total power input increases the stresses on
aggregates in turbulent flow and causes the break-up of aggregates larger than the
smallest turbulent eddies. In the particular device studied, Coufort et al. showed that the
mean size of mineral flocs is calibrated by the Kolmogorov length scale (Coufort et al.
2005). The same phenomenon might explain the absence of filamentous form at 114
RPM. It could be suggested that agitation is so low in static culture that cells rarely
encounter each other and therefore can not form agglomerates. However, in the
mechanism of cell division, mother and daughter cells are initially contacting each
other. Therefore, they would tend to aggregate if they were able to. Besides, this kind of
constitutive agglomeration (or growth related aggregation) has been described by
Dunlop et al. for plant cells. Millimetric aggregates of hundreds of cells are formed in
suspension culture and share cytoplasmic fluid due to incomplete separation of cells
(Dunlop et al. 1994). Our conclusions are therefore that (i) the absence of
agglomeration in static cultures can be related to an insufficient mechanical stress, (ii) a
shear stress on the particle of 0.097 N.m-2 is sufficient to induce a significant change in
the collision efficiency.

(iii) Flow field structure.

Since cells transferred from 114 RPM to 20 RPM flow conditions led to aggregates in a
few minutes, it can be assumed that the different initial conditions produced cells with
similar aggregation potentiality. In other words, it’s not a particular physiological or
biochemical state of the cells cultivated at 20 RPM which provokes aggregation.

174
Moreover, the aggregation process does not depend on whether the cells come from
growth or stationary phase. This indicates that neither growth, nor cell division, nor de
novo synthesis of cell components are required for aggregation. The total amount of
polysaccharides (PS) produced was not significantly different in the cultures at 20 and
114 RPM. Hence, it seems that the particular flow structure in the Couette bioreactor at
20 RPM, characterized by non turbulent, organized vortices favours aggregation.
However, it is first necessary that cells are exposed to a minimal level of mechanical
stresses.

Since the matrix was made of sugars, at least in part, it is tempting to consider that these
sugars are EPS produced by the bacteria. The genome of L. lactis NCDO 2118 is not
sequenced, so its ability to produce EPS is undetermined, albeit there is no strict
correlation between the presence or absence of eps genes and of PS (Van der Meulen et
al. 2007). However, the culture of the IL1403 strain, which is devoted to the eps
plasmidic locus and thus unable to produce EPS, harboured a similar filamentous
phenotype, so it can be assumed that no EPS stricto sensu are involved. This is
surprising because the cells in the aggregate seemed to be entrapped in a filamentous
form rather than stuck together. Hence, one can consider that a PS, but not an EPS,
produced by L. lactis NCDO 2118 as well as IL 1403, is involved in the cell aggregation,
regardless of mixing conditions.

The qualitative analysis of the polysaccharidic matrix using lectin binding revealed that
galactose (Gal) was rarely present in the aggregates. On the contrary, glucose (Glc)
and/or mannose appeared to be the major constituents of the matrix. In general, a
glucose to galactose molar ratio of 2:1 is found in the repeating units of EPS produced
by LAB, with other sugars like rhamnose (Rha) also being possibly involved in the
structure (Kleerebezem et al. 1999; Dabour et al. 2005). A quite similar ratio has
recently been determined for the novel cell wall PS pellicle on the surface of L. lactis IL
1403 (Chapot- (Chapot-Chartier et al. 2010). Monosaccharide analysis of this pellicle
revealed the presence of Rha, Glc, Gal and GlcN, in an approximate molar ratio of 0.8: 2:
1.4: 2. Due to this similarity, the lectin binding approach could not discriminate between

175
EPS and cell wall PS. Nevertheless, this pellicle has been proposed as a new cell
envelope structural component of Gram-positive bacteria.

Taking into account these new data, we postulate that the pellicle-like layer of L. lactis,
in the particular flow conditions of the Couette reactor at 20 RPM, could be structurally
modified or re-organised in such a way that leads to the creation of a filamentous form-
like matrix confining the cell. Structural changes in cell wall polysaccharides due to
shear stresses have been previously demonstrated for algae (Hackney et al. 1994). To
date, however, the possible involvement of cell-wall or extracellular molecules other
than PS cannot be discarded.

1.5. Conclusion

(Conclusion)

Batch cultures of L. lactis NCDO 2118 and L. lactis IL 1403 performed in two different
Couette bioreactors operated in the Modulated Wavy Flow regime systematically led to
the formation of filamentous aggregates, although the overall metabolism remained
unchanged. The phenotype was never observed in cultures performed in shaken flasks.
In contrast, cells initially cultivated in a turbulent flow turn out to form aggregates in
the Couette reactor. It is concluded that a minimum level of mechanical stress is
necessary to induce the adhesion property at the cell level but that higher values of local
energy dissipation are detrimental to the aggregation process itself. Observations with a
confocal microscope reveal individual cells entrapped in a polymeric matrix. The
biochemical analysis of the matrix shows that it contains polysaccharides. Their origin,
either EPS or PS, is not elucidated at the moment but the recent works regarding the cell
wall pellicle of L. lactis offer an interesting explanation for the fact that both the IL 1403,
which does not produce EPS, and NCDO 2118, are able to agglomerate in appropriate
flow conditions.

176
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181
2 ANALYSES COMPLEMENTAIRES SUR LA MATRICE PRODUITE

Pour aller un peu plus loin dans l’analyse et la compréhension de ce phénotype, nous
avons tenté de caractériser plus précisément la matrice entourant les cellules.
L’hétérogénéité du milieu en fin de culture et les difficultés { procéder { un
échantillonnage représentatif, la difficulté à séparer la matrice et les cellules et à
évaluer cette séparation, entre autres, rendent les résultats de cette analyse
essentiellement qualitatifs et semi quantitatifs. Cependant, l’analyse biochimique des
composés de la matrice fournit des indications précieuses. Un traitement aux ultrasons
a donc été mis au point afin d’extraire grossièrement des composés de la matrice et
quelques dosages simples ont été pratiqués pour une évaluation semi quantitative. Afin
d’éviter toute interférence entre les dosages des composés extraits et les constituants
du milieu de culture M17, cette analyse a été réalisée sur des cellules cultivées sur un
milieu chimiquement défini (MDC) dont la composition est résumée en annexe 1.
Croissance, métabolisme et phénotype des cultures réalisées sur milieu MCD sont
similaires avec les descriptions précédentes.

2.1. Matériel et méthodes

Les protocoles d’extraction et de chaque dosage sont détaillés en annexe, dans cette
partie ne sont indiqués que les principes pour chaque méthode.

2.1.1. Extraction aux ultrasons

Un traitement aux ultrasons a été choisi afin d’extraire les composés de la matrice
enveloppant les cellules. Ce traitement inclut les étapes suivantes résumées ici (le
protocole complet est détaillé en annexe 3):

 Echantillonnage :

Du fait de la très forte hétérogénéité du milieu de culture en fin de fermentation, il

convient de collecter un gros volume d’échantillon afin de limiter les erreurs liées { une

182
mauvaise représentativité de l’échantillon. A l’issue de chaque culture, 2 x 800 ml ont
été récoltés.

 Lavage des cellules :

Afin d’éviter toute interaction entre les composés du milieu de culture et les cellules, il
est nécessaire de laver l’ensemble cellules + matrice dans un tampon PBS. Pour cela, les
échantillons, répartis dans des flacons, sont centrifugés 20 min à 4000 RPM et à 4 °C
afin de limiter les réactions. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du
tampon PBS. L’opération est réalisée 3 fois.

 Concentration :

Les échantillons d’agrégats cellulaires sont ensuite concentrés 8 fois { l’issue de la

dernière centrifugation, afin d’obtenir une masse suffisante.

 Traitement aux ultrasons :

Chaque cycle comprend une phase de traitement (20 s, 2,4 W/ml dans de la glace) et
une phase de refroidissement de 1 min. Après 4 cycles, l’échantillon est centrifugé et le
surnageant conservé à -18 °C.

Lors de la mise au point de ce protocole, l’absence de lyse cellulaire a été vérifiée { l’aide
du dosage de l’activité Lactate déshydrogénase (LDH) après un traitement de 1 à 6
cycles. Les résultats montrent qu’il n’y a pas de lyse cellulaire significative jusqu’{ 4
cycles (voir annexe 3).

2.1.2. Dosages

Les polysaccharides ont été dosés par la méthode { l’anthrone. Après hydrolyse des
polymères, les sucres réducteurs forment un complexe coloré avec le réactif à
l’anthrone (cf annexe 2).

La quantité de protéines présente a été évaluée par un dosage { l’acide bicinchonique

(BCA). Le BCA forme un complexe avec les liaisons peptidiques en présence de cuivre.

183
En formant de tels complexes, il prend une couleur pourpre dont l’intensité peut être
évaluée par dosage spectrophotométrique contre une gamme étalon en sérumalbumine
bovine (BSA, Bovin Serum Albumin). Les résultats sont donc exprimés en équivalents
BSA.

Pour des raisons de commodité, ces dosages (anthrone et BCA), utilisés en routine au
laboratoire, ont été réalisés en microplaques.

La masse sèche totale est grossièrement estimée par pesée d’un culot de centrifugation
préalablement séché { l’étude { vide.

L’évaluation de l’hydrophobicité de surface a été réalisée via un test d’affinité pour les
solvants (MATS, voir annexe3).

2.2. Résultats

Tout d’abord, commençons par des remarques d’ordre général. Tous les culots de
centrifugation présentent deux phases, qu’il s’agisse de cultures de L. lactis NCDO 2118
à 20 ou 114 RPM ou de L. lactis IL1403 { 20 RPM. Les différences résident dans l’aspect
et le volume de ces phases. La phase supérieure des culots de centrifugation des
cultures de L. lactis NCDO 2118 est constituée d’une masse gluante formant un gel peu
resserré autour de cellules alors que la phase inférieure est principalement constituée
de cellules. Si cette phase représente environ la moitié du culot (en volume) pour les
cultures à 20 RPM, elle est beaucoup plus fine pour les cultures à 114 RPM. Quant aux
culots de L. lactis IL1403, leur phase supérieure a un aspect plus solide et dense,
ressemblant plus { un amas cotonneux qu’{ un gel.

Malheureusement, du fait du faible volume récolté et de la difficulté à séparer ces deux

phases, aucune caractérisation rhéologique n’a pu être effectuée.

2.2.1. Dosages et caractérisation biochimique

Les résultats des dosages de polysaccharides et de protéines sont présentés dans les
tableaux III.1 et III.2. Pour chaque souche et condition de culture, les concentrations en

184
polysaccharides (exprimées en équivalent glucose) et protéines (en équivalent BSA)
extraits sont indiquées pour des échantillons concentrés 8 fois. Les valeurs entre
parenthèses sont les concentrations équivalentes pour un échantillon non concentré. Si
les dosages sont répétables, l’échantillonnage et les étapes préliminaires sont source
d’une plus grande variabilité, avec pour conséquence des écarts types importants sur
les mesures.

La quantité de matière extraite par ce traitement dépend des conditions de culture et de

la souche considérée. Pour la souche NCDO 2118, la concentration (en polysaccharides
et protéines) des extraits issus de la matrice filamenteuse (20 RPM) est plus importante
que de ceux issus d’une suspension cellulaire planctonique (114 RPM). Cependant, ce
même traitement d’extraction appliqué { la matrice obtenue avec la souche IL 1403
permet l’extraction d’une quantité moindre de composés.

Equivalent glucose Nombre de

Echantillon Ecart type
moyen (g/L) répétition

NCDO 2118 0,242 2 cultures x 3

0,043
20 RPM (0.030) dosages

NCDO 2118 0,199

0,048 Idem
114RPM (0,025)

IL 1403 0,104
0,038 Idem
20 RPM (0,013)

Tableau III.1 : résultats du dosage des polysaccharides liés aux cellules par la méthode { l’anthrone

D’un point de vue semi quantitatif, on remarque que quel que soit l’état de l’échantillon
initial (matrice filamenteuse ou cellules libres), les extraits contiennent plus de
protéines que de polysaccharides. Ces derniers, en équivalent glucose, ne représentent
que 0.1% du glucose initialement présent dans le milieu de culture.

Equivalent BSA Nombre de

Echantillon Ecart type
moyen (g/L) répétition

NCDO 2118 2,07 0,33 2 cultures x 2

185
 20 RPM (0,259) dosages

NCDO 2118 1,34

0,13 Idem
114RPM (0,167)

IL 1403 0,82 2 cultures x 3

0,13
20 RPM (0,102) dosages

Tableau III.2 : résultats du dosage des protéines liées aux cellules par la méthode BCA

Matières extraites

L’analyse des composés extraits permet une description qualitative de la matrice,

cependant, l’estimation du rendement d’extraction des polymères est nécessaire pour
obtenir une information sur la quantité de matrice produite, notamment à 20 RPM.
Expérimentalement, on observe qu’une grande proportion de la matrice reste en l’état
et n’est pas dispersée, ni dissoute par le traitement aux ultrasons. Malheureusement, il
est impossible actuellement d’estimer ce rendement, l’estimation nécessitant de
connaitre précisément le ratio massique cellule/matrice dans le filament.

2.2.2. Microbial Adsorption To Solvents

Des essais selon la méthode MATS (« Microbial Adsorption To Solvents »), décrite par
Bellon-Fontaine et al. (1996), ont été réalisés selon le protocole décrit en annexe 3.
L’objectif d’une telle mise en œuvre est de déterminer si l’agrégation des cellules est
d’une façon ou d’une autre corrélée { des différences quantifiables des propriétés de
surface (caractère hydrophile/hydrophobe) des cellules provenant des différentes
conditions de culture. Les résultats concernant l’affinité des cellules pour les solvants
testés sont présentés dans le tableau III.3 ci-dessous. Le caractère hydrophobe ou
hydrophile de la surface bactérienne est évalué via l’affinité des cellules pour les
différents solvants. L’affinité pour les solvants polaires comme le chloroforme
(accepteur d’électrons) et l’acétate d’éthyle (donneur d’électrons) indique un caractère
hydrophile (soit donneur soit accepteur d’électrons, respectivement) de la surface, alors
que l’affinité pour l’hexadécane ou le décane (solvants apolaires) reflète un caractère
hydrophobe.

186
On constate que, quelles que soient les souches et les conditions de culture, les cellules
présentent toutes des propriétés de surface plutôt hydrophiles (affinité maximale pour
les solvants polaires et adhésion minime aux solvants apolaires). L’affinité plus
importante pour le chloroforme indique de plus un caractère majoritairement donneur
d’électrons (base au sens de Lewis). Giaouris et al. (2009) ont testé l’affinité des souches
NCDO 2118 et IL 1403 pour le chloroforme et l’hexadécane. L’affinité des souches est
inférieure à 10% quel que soit le solvant. Cette différence pourrait venir du fait que,
contrairement à Giaouris et al., nous avons testé des cellules en phase exponentielle de
croissance.

Acétate
Solvant : Chloroforme Hexadécane Décane
d'éthyle

NCDO 2118 moyenne 69% 0 19% 27%

114 RPM Ecart
1% 1% 13%
type
(n=2)
NCDO 2118 moyenne 30% 0 11% 13%
20 RPM Ecart
17% 9% 1%
(n=3) type
IL 1403
20 RPM moyenne 35% 0 2% 0

Tableau III.3 : affinité pour les solvants selon la méthode MATS .

Les résultats entre souches et/ou conditions de culture ne sont pas significativement
différents au sens du test statistique de Student.

Quoi qu’il en soit, les cellules sont plutôt hydrophiles (affinité pour le chloroforme) et
l’agrégation ne semble pas pouvoir être expliquée par une augmentation de
l’hydrophobicité de surface.

De ce fait, il est difficile de tirer une conclusion définitive quant à une modification nette
des propriétés physico-chimiques de la surface bactérienne et son éventuelle
implication dans le processus d’agrégation observé à 114 RPM.

187
2.3. Discussion et conclusion

Effet de la vitesse de rotation

Les résultats de dosage des polysaccharides sur les cultures de L. lactis NCDO 2118 à 20
et 114 RPM sont très surprenants au regard des marquages précédemment réalisés.
Alors que des cellules cultivées à 114 RPM ne fixent aucune des lectines testées, elles
semblent néanmoins être pourvues de polysaccharides liés à leur paroi. Les quantités
extraites par le traitement aux ultrasons sont peu différentes dans les deux conditions
de culture. Différentes hypothèses peuvent expliquer ce comportement.

 Les polysaccharides présents peuvent être qualitativement différents de

ceux produits par des cellules cultivées à 20 RPM. En ce cas, cela témoigne
d’une modification importante au niveau du métabolisme et de la
synthèse des polysaccharides excrétés et/ou de la synthèse de la paroi.
Cependant, les lectines testées permettent de scanner les unités osidiques
les plus communes chez Lactococcus lactis et il est donc relativement peu
probable que les polysaccharides extraits à 114 RPM soient composés de
monomères non spécifiques des lectines utilisées.

 On peut également avancer que la matrice présente autour des cellules

cultivées à 20 RPM joue un rôle protecteur envers les polysaccharides vis-
à-vis d’un éventuel arrachement au cours des différentes étapes du
marquage. Cette hypothèse est cependant exclue ici car si c’était le cas, les
polysaccharides seraient également dispersés et éliminés par les étapes
de lavage préliminaires au traitement par les ultrasons.

 Enfin, et c’est l’hypothèse la plus probable, il est possible que la

concentration en polysaccharide autour des cellules cultivées à 114 RPM
ne soit pas suffisante pour obtenir un signal visible en épifluorescence. En
effet, si les quantités extraites sont similaires, elles ne représentent
qu’une partie (non quantifiable) de la matrice totale. Il est donc très
probable que la concentration en polysaccharides dans la matrice soit

188
 largement supérieure { celle autour de cellules planctoniques. D’autre
part, il est possible que la densité (compactage) des molécules
exocellulaires soit différente entre ces deux conditions et, dans le cas
d’une faible densité, conduisent { un signal fluorescent trop faible.

Effet de la souche cultivée

Le dosage des polysaccharides extraits pour L. lactis NCDO 2118 et IL1403 montre une
différence significative de concentration entre ces deux souches. Il convient néanmoins
d’être très prudent pour l’analyse de ces résultats. En effet, ces dosages sont effectués
sur des extraits. Conclure que IL 1403 présente moins de PS que NCDO 2118 implique
que les rendements d’extraction sont similaires pour ces deux souches, Cependant, le
filament obtenu avec IL 1403 semble plus solide et moins aérien, suggérant que la
matrice est plus difficile à déstructurer.

Composition de la matrice

Quelle que soit la souche { l’origine de la matrice, le traitement d’extraction permet

d’extraire environ 8 fois plus de protéines que de matière glucidique (tableau III.4).
Cette prédominance des protéines sur les polysaccharides ne semble pas être un
artéfact lié au choix du moyen d’extraction utilisé. Si le traitement par ultrasons tend à
privilégier l’extraction de grosses molécules (≈100 kDa), il permet une extraction
représentative de la matrice initiale, sans privilégier l’extraction d’un type de molécule
par rapport à un autre (Comte et al. 2006; 2007). On remarque également que ces
résultats sont semblables aux observations menées sur des substances
extrapolymériques extraites de boues activées, dans lesquelles il y a une prédominance
des protéines sur les polysaccharides dans les compositions.

Le fait que la matrice contienne des protéines en proportions plus importantes laisse à
penser que ce sont ces dernières qui interviennent principalement dans la cohésion et la
structure de la matrice, les polysaccharides étant éventuellement piégés dans le réseau
créé par les protéines. Cette hypothèse est cohérente avec les observations de cultures à
pH non régulé dans un milieu enrichi en tampon. Le phénotype apparait tant que le pH

189
est autour de 6,6. Lorsque la culture se poursuit et que le pH diminue, le phénotype
disparait. Cela indique que le phénotype est contrôlé par une molécule sensible au pH. Si
les polysaccharides présentent souvent des groupements carboxyles amphotères, le pKa
de ces fonctions est situé autour de 3-4, et par conséquent ces fonctions ne changent pas
de charge au début de l’acidification du milieu de culture. Cependant, les protéines
présentent une gamme de pHi (points isoélectriques) très variés, il est donc probable
que le réseau de base de la matrice comprenne des substances protéiques pour
lesquelles une diminution trop importante du pH entraine la perte de la capacité à créer
des liaisons ioniques. Dans des domaines voisins du champ de cette étude, il a été
prouvé que les protéines jouent un rôle important dans le processus d’agrégation
(Lazarova and Manem 1995) et l’augmentation d’adhérence des biofilms. Il a été aussi
démontré qu’il y a une corrélation positive entre la teneur en protéines et la capacité de
floculation (Wilén et al. 2003).

Essai
NCDO 2118 NCDO 2118 IL 1403
(souche et vitesse de
20 RPM 114 RPM 20 RPM
rotation)

Ratio
8,6 6,7 7,9
protéines/polysaccharide

Tableau III.4 : ratios protéines/polysaccharides

Les marquages par des lectines ont montré la présence de polysaccharides dans la
matrice cellulaire. Des dosages complémentaires après destruction partielle de la
matrice par un traitement aux ultrasons ont aussi révélé la présence d’ADN et de
protéines en quantité non négligeable. Cette composition est assez caractéristique de la
composition de la matrice extracellulaire présente autours de biofilms (Nielsen et al.
1997). L’ADN pourrait jouer un rôle d’agent de cohésion (Briandet, communication
personnelle). Cette présence d’ADN pourrait indiquer une forte proportion de cellules
lysées. Cependant, des observations comparatives sur des champs microscopiques
identiques de cellules marquées (live) et de cellules observées en contraste de phase
n’indiquent pas de mort cellulaire significative (figure III.1).

190
 marquage Live Dead Cellules observées en contraste de phase

Figure III.1 photographie de cellules emprisonnées dans un filament. A cellules vivantes, B cellules totales.

Cette approche permet un début de caractérisation de la matrice cellulaire. Néanmoins,

il reste encore beaucoup à faire pour obtenir une caractérisation précise. Composition
exacte et structure doivent être élucidées. Différents traitement d’extraction sont {
même de permettre une description qualitative, mais en ce qui concerne la description
quantitative, il convient aussi de déterminer les rendements d’extraction (globaux et
aussi spécifiques aux types moléculaires). D’autre part, la forte teneur en protéines
extraites laisse suspecter une forte activité enzymatique qu’il conviendra de mesurer.

Enfin, le mécanisme d’adhésion reste { éclaircir. Le fait que des cultures cultivées à 114
RPM et transférées dans un écoulement ondulatoire forment des filaments dans un
intervalle de temps court (40 min) suggère que les cellules ont acquis la capacité à
adhérer entre elles préalablement. Il est fort probable que les propriétés surfaciques
des cellules soient impliquées dans le processus d’agrégation ; ces propriétés, analysées
uniquement par un test d’affinité pour des solvants (MATS), semblent similaires quelles
que soient les cellules testées et les conditions de culture. D’autres méthodes,
notamment de caractérisation biochimique de la surface cellulaire, seront à mettre en
œuvre pour comprendre les mécanismes d’agrégation.

191
3 CONCLUSION GENERALE

Cultivé en batch dans un réacteur Couette, Lactococcus lactis NCDO 2118 présente un
caractère phénotypique unique lorsque le réacteur est opéré en régime ondulatoire
modulé. Ce caractère phénotypique est amplifié lorsque la fermentation conduit à
produire plus de biomasse, en augmentant la concentration initiale de glucose. Il semble
également que, quelle que soit la géométrie du réacteur Couette, toute fermentation
réalisée dans ce régime d’écoulement particulier (Modulated Vortex Flow) conduise { ce
phénotype.

La principale différence entre les deux conditions opératoires testées étant le niveau
d’énergie dissipée dans le réacteur, les premières hypothèses visant { expliquer ce
phénotype sont liées { un défaut de mélange. Cependant, l’analyse du comportement
métabolique de L. lactis NCDO 2118 a montré qu’aucun shift métabolique n’apparaissait
lors des fermentations. Or, cette souche présente la particularité de présenter deux
comportements métaboliques (homolactique et métabolisme mixte) selon le flux de
substrat reçu. Il apparait alors évident que les différentes conditions opératoires
n’affectent pas le flux de substrat reçu puisque sans effet sur le métabolisme, ce qui
témoigne de conditions non significativement différentes en termes de mélange. Les
cultures étant régulées pour maintenir un pH optimal, un défaut de mélange de la
potasse peut également constituer un point critique. Ici encore, cette hypothèse a été
écartée puisque les cultures réalisées dans un milieu sur-tamponné, permettant de
retarder l’acidification et donc l’ajout de potasse, présentent le même phénotype tant
que le pH n’est pas trop bas, indiquant que ce dernier n’est pas causé par un quelconque
défaut de mélange de la potasse.

Le marquage par des lectines et des dosages réalisés sur des extraits de la matrice
témoignent de la présence de polysaccharides. Cependant, la production
d’exopolysaccharides au sens strict par la souche ne semble pas requise pour
l’obtention du phénotype. En effet, les cultures de L. lactis IL1403 présentent le même
phénotype. De plus, la quantité d’EPS produite est bien souvent corrélée au rapport

192
entre substrat carboné et azoté assimilé par la cellule. Cependant, les cultures dans un
milieu avec un ratio N/C modifié présentent le même phénotype.

Des analyses complémentaires sur la composition de la matrice révèlent la présence

d’ADN et protéines, sans que les cellules emprisonnées dans la matrice ne soient lysées.
Ces caractéristiques sont semblables aux caractéristiques de communautés cellulaires
vivant en biofilms. D’autre part, la présence de protéines peut expliquer le rôle du pH
dans la cohésion de la matrice. L’analyse MATS quant { elle, semble suggérer que
quelles que soient les conditions de cultures, les cellules présentent les mêmes
caractéristiques en termes d’affinités pour les différents solvants, suggérant une
capacité préalablement acquise. La préalable acquisition de la capacité d’adhésion est
confirmée par le fait que le transfert de cellules en phase stationnaire dans un
écoulement toroïdal ondulatoire conduit rapidement à la formation de filaments.

Le suivi granulométrique des cultures dans les premières étapes conduisant au

phénotype révèle un processus d’agrégation. Ce phénomène ne peut avoir lieu que si les
cellules se rencontrent à une fréquence suffisante et si les forces de cohésion sont
supérieures aux contraintes mécaniques subies. Plusieurs questions découlent de cette
remarque.

Qui dit forces de cohésion dit cohésion, quel en est le mécanisme? Est-ce un mécanisme
induit ? Si les mécanismes d’adhésion sont liés aux caractéristiques biochimiques et
biophysiques des constituants de la matrice, sujet qu’il faudra approfondir, il semble
que les caractéristiques des cellules aptes { s’agréger soient identiques quelle que soit la
vitesse de rotation. Cette déduction est renforcée par le fait que le transfert de cellules
d’une condition planctonique { une condition provoquant l’agrégation conduit
effectivement à une agrégation rapide, même pour des cellules en phase stationnaire de
croissance. Il en découle que : (i) aucune modification (bio)chimique des cellules,
notamment une expression de gènes modifiée qui conduirait à une composition
différente en métabolites (de surface), n’est { invoquer pour observer le phénotype ; (ii)
une concentration particulière, ou critique, de molécules exocellulaires
(polysaccharides et protéines) ne semble pas un pré-requis pour observer l’agrégation.

193
Il est alors probable que cette concentration est non différente dans les deux conditions
de culture, avec ou sans agrégation, même si nos essais de quantification sont encore
trop imprécis pour le démontrer. Ces observations permettent de penser que la nature
des molécules, de surface ou exocellulaires, impliquées ou pas dans l’agrégation, n’est
pas non plus différente dans les deux conditions. Il faut donc envisager que leur
disposition, ou leur conformation, varie avec l’écoulement, et permette un
« accrochage » de structures moléculaires entre elles dans une condition d’écoulement
particulière. Cette caractérisation fine du mécanisme d’agrégation reste un challenge
pour l’avenir.

Quelles sont les contraintes mécaniques subies ? En considérant simplement le rapport

entre contraintes mécaniques et forces de cohésion, il est évident que des cultures
« statiques » dans lesquelles l’énergie dissipée est faible, devraient selon cette logique,
elles aussi présenter ce phénotype filamenteux. Ce n’est pas le cas ici, peut-être est-il
nécessaire d’intégrer { nos hypothèses la notion de contrainte seuil requise pour
induire une capacité de cohésion.

Les expériences concernant le transfert de cultures d’un réacteur présentant un

écoulement turbulent (fermenteur de laboratoire classique ou réacteur Couette en
régime turbulent) vers un régime ondulatoire modulé montrent que non seulement les
contraintes mécaniques subies, mais aussi la structure de l’écoulement jouent un rôle
important. Il convient alors de caractériser de façon plus fine les contraintes subies par
les cellules dans les différents écoulements générés dans le réacteur Couette.

C’est donc l’objectif du chapitre suivant, qui va s’attacher à décrire et caractériser les
différences au niveau de l’écoulement et les contraintes subies par des cellules circulant
dans ces environnements.

194
DESCRIPTION DES CONTRAINTES LOCALES PAR SIMULATION NUMERIQUE DE
L’ECOULEMENT

L’hypothèse d’un défaut lié au mélange pour expliquer le phénotype ayant été exclue
dans le chapitre précédant, nous allons nous attacher ici à identifier les caractères
spécifiques de l’écoulement menant { nos observations. L’objectif de ce chapitre est de
réaliser une caractérisation détaillée des contraintes hydrodynamiques subies par des
cellules en culture dans un réacteur de Couette et ce dans les différents régimes
d’écoulement précédemment évoqués. L’analyse des données de la littérature a montré
que l’intensité d’un stress n’est pas la seule information { considérer mais que les
variations temporelles contribuent également à déterminer la réponse biologique.

Il a également été souligné que parmi les paramètres clés de l’écoulement, le taux de
dissipation de l’énergie jouait un rôle central. L’évaluation globale de cette grandeur
n’est pas problématique mais sa détermination { l’échelle de la cellule ainsi que les
variations spatio-temporelles sont en pratique très difficiles à mesurer (Huchet et al.
2009). Un moyen d’accéder { ces informations consiste { mettre en œuvre une
simulation numérique de l’écoulement

Nous avons ainsi réalisé la simulation numérique directe (DNS) de l’écoulement dans le
réacteur dans différentes conditions. La simulation de tels écoulement n’est pas triviale
et une analyse théorique préliminaire s‘impose afin de guider les choix lors du
paramétrage. Une fois les simulations validées par comparaison avec des données
expérimentales ou théoriques, l’écoulement est décrit dans son ensemble. Des valeurs
de contraintes moyennes ainsi que leurs répartitions volumiques sont calculées et une
cartographie du réacteur est ainsi réalisée. Un lâcher de particule a également été
effectué afin de recueillir des informations sur l’historique des contraintes subies par
les cellules. L’analyse des contraintes le long de la trajectoire d’une cellule dans le
réacteur relève de l’approche dite Lagrangienne. En conclusion de ce chapitre et grâce {
l’éclairage des données numériques récoltées, nous tenterons d’affiner les hypothèses
expliquant le lien entre phénotype et conditions hydrodynamiques locales et globales.

195
1 DESCRIPTION DE L’ECOULEMENT DANS LE REACTEUR COUETTE

1.1. Caractérisation du régime d’écoulement

Comme il a été évoqué dans la partie bibliographique consacrée à la description des

transitions dans un réacteur Couette, l’écoulement dans cette géométrie confinée peut
revêtir de nombreuses formes (laminaire, modulé, turbulent). Si le nombre de Taylor
est largement utilisé dans le domaine du génie des procédés pour qualifier le niveau de
turbulence dans le réacteur Couette, l’approche mécanique des fluides préfère souvent
le nombre de Reynolds défini comme suit.

RiRo  Ri 
Re  Eq IV.1


On définit de la même façon un nombre de Reynolds critique au-delà duquel le régime

laminaire disparait et l’écoulement, devenu instable, s’organise en donnant naissance
aux vortex de Taylor (Esser and Grossmann 1995).

Re c 
1 1   2
Eq IV.2
 2 2 1   3   

Ri
Avec   et α = 0,1556
Ro

La définition du nombre de Reynolds critique donnée par ces auteurs découle d’une
analyse linéaire de stabilité. Elle est de fait théorique et donne la limite approximative
au-del{ de laquelle l’écoulement ne peut plus être laminaire. Pour le réacteur étudié ici,
on calcule donc Rec = 117.

Au cours de cette étude, nous avons travaillé avec des vitesses allant de 20 à 114 RPM.
Le tableau IV.1 ci-dessous résume les différents régimes d’écoulement attendus en
fonction de la vitesse de rotation du cylindre interne.

196
 Vitesse de rotation Reynolds réduit
Reynolds Régime d’écoulement
(RPM) (Re*=Re/Rec)
10 1751 13,4
Tourbillonnaire ondulant /
20 3142 26,9
éventuellement modulé
30 4712 40,3
70 10996 94,1
114 17907 153,3 Turbulent vortex flow
200 31416 268,9
Tableau IV.1: détermination des régimes d’écoulement rencontrés

Les différents régimes en fonction de Re* sont cohérents avec les résultats de
simulation numérique directe (DNS) de Dong (Dong 2007) selon lesquels les vortex de
Taylor sont laminaires pour Re*=14 puis turbulents pour Re*= 42 – 114 dans un
réacteur de ratio η=0,5. Par une approche de Simulation Numérique Directe de
l’écoulement et expérimentale, Rudman (Rudman et al. 2008) trouve que la transition
entre le régime ondulant et un régime relativement chaotique a lieu pour un Re compris
entre 120 et 160 dans un réacteur dont la géométrie est telle que η=0,856 soit Rec=111
et Re* entre 1,4 et 1,6.

Ces remarques indiquent que la transition est très rapide entre ces différents régimes
(régime vortex ondulatoires, modulés et turbulents). D’autre part, il semble que dans le
régime modulé, l’obtention d’une structure d’écoulement donnée soit de plus
dépendante de l’histoire de l’écoulement (Climent, communication personnelle). C’est
cette existence de solutions expérimentales multiples qui a été avancée an chapitre 2
pour expliquer une partie de la variabilité des cultures réalisées à 20 RPM.

De ces descriptions, quelques remarques sont à prendre en compte afin de réaliser une
résolution numérique la plus exacte possible. Du régime laminaire { l’apparition de
vortex de Taylor, l’écoulement est axisymétrique. Par la suite, l’augmentation de la
vitesse de rotation du cylindre interne entraine l’apparition de nouvelles instabilités :
on observe alors des vortex ondulants. L’écoulement perd de ce fait son caractère
axisymétrique et devient pseudo périodique : la valeur de vitesse en un point varie au
cours du temps mais cette variation est périodique. L’augmentation du nombre de

197
Reynolds entraine ensuite une modulation : une deuxième onde vient se superposer à la
première. L’écoulement devient alors peu { peu chaotique et par conséquent, difficile à
prédire, modéliser et observer. Par la suite, les vortex deviennent turbulents mais
stables en moyenne et l’écoulement moyen retrouve son caractère axisymétrique dans
le régime turbulent.

1.2. Puissance dissipée et contraintes

Des corrélations permettent de prédire des valeurs de couple, puissance dissipée, taux
de dissipation et cisaillement dans le réacteur Couette. Le couple exercé par le fluide sur
le cylindre en rotation est estimé selon la corrélation de Wendt (équations IV.3 à IV.5),
dont la validité a été plus récemment confirmée par les travaux expérimentaux de
(Lathrop et al. 1992).

C  Ga dim  2 H Eq IV.3

Gadim correspond au couple adimensionnalisé, son expression varie selon l’écoulement

considéré (équations IV.4 et IV.5) :

3
2
3
400 ≤ Re ≤ 10 000 Ga dim  1,45 Re 2 Eq IV.4
1   
7
4

3
2
Re ≥ 10 000 Ga dim  0,23 Re1, 7 Eq IV.5
1   
7
4

On en déduit la puissance dissipée P égale au produit du couple par la vitesse angulaire

de rotation du cylindre interne. Le taux de dissipation de l’énergie (en [Link]-1)
correspond { l’énergie dissipée par unité de temps et de masse du fluide (équation IV.6)
Le taux de cisaillement moyen basé sur la puissance dissipée totale est calculé selon la
relation IV.7.

198
 P
  Eq IV.6
V


  Eq IV.7


Les valeurs de ces grandeurs globales ont été calculées pour la géométrie du réacteur
Couette utilisé dans cette étude. Elles sont résumées dans le tableau IV.2 ci-dessous et
vont permettre par la suite d’évaluer la convergence de la solution trouvée
numériquement.

Taux de
Vitesse de Puissance
Couple Taux de dissipation <ε> cisaillement
rotation dissipée
(N.m) ([Link]-1) <  >
(RPM) (10-3 W)
(s-1)
10 0,44 0,46 0,00027 16,4
20 1,24 2,6 0,00153 39,1
30 2,28 7,2 0,00451 64,9
70 8,29 60,8 0,03574 189,1
114 18,99 226,7 0,13336 365,0
200 49,38 1,03.103 0,60838 780,0
Tableau IV.2: Valeurs caractéristiques pour différentes vitesses de rotation.

1.3. Conséquences pour la mise en œuvre des simulations

Si des résultats de simulations de ces écoulements en 2D, RANS-k-epsilon sont

disponibles (Coufort, 2004), nous avons choisi de résoudre ces écoulements en 3D par
de la DNS qui offre une meilleure résolution spatiale et permet, à terme, de faire du suivi
Lagrangien de particules. Par ailleurs, à 20 et 30 RPM, des ondulations instationnaires
se développent et l’écoulement n’est pas forcément axisymétrique ni turbulent ce qui
nécessite une simulation 3D et instationnaire.

En effet, l’écoulement qui s’établit { 20 RPM est très proche de la zone dans laquelle
apparait le régime ondulatoire modulé (Modulated Wavy Vortex Flow). Cela signifie
qu’une onde modulée se superpose aux vortex de Taylor. Ces derniers oscillent de façon

199
axiale selon une période et une amplitude donnée et l’onde ne se déplace pas { la même
vitesse que le fluide. Cependant, le caractère modulé, que l’on peut décrire comme un
enchaînement de constriction et d’expansion des vortex de Taylor, entraine une double
instabilité qui rend la résolution numérique de ce type d’écoulement très périlleuse. Si
l’écoulement dans un réacteur Couette suscite l’intérêt des scientifiques depuis de
nombreuses années, la description et la simulation des régimes périodiques et modulés
ne sont pas pleinement résolus. Parmi les récents travaux en mécanique des fluides
numériques s’attachant { résoudre ce type particulier d’écoulement, citons Dong (Dong
2007) et Bilson et Bremhorst (Bilson and Bremhorst 2007). Une autre illustration de la
difficulté à décrire les phénomènes ayant lieu autour de ces transitions est la
problématique du mélange intravortex et son lien avec les vitesses de rotation qui
suscite de nombreuses controverse.

Dans ce cas particulier, il convient traiter les résultats numériques avec une très grande
attention, la simulation pouvant mener à plusieurs solutions stables différentes. Dong
(Dong 2007) remarque que plus le rapport hauteur/rayon interne est élevé, plus il y a
de chances (ou de risques) d’obtenir des écoulements résolus multiples (par exemple,
des écoulements ondulatoires de période différentes). Cette multiplicité n’est cependant
pas un artefact et rejoint certaines observations expérimentales (Coles 1965).

La présence de l’onde axiale rend l’écoulement non axisymétrique et instationnaire

dans un repère fixe. Cependant, dans un repère mobile selon l’onde, l’écoulement wavy
vortex flow redevient stationnaire, ce qui n’est pas le cas du régime en onde modulée. Le
cas particulier de l’écoulement se produisant { 20 RPM est d’autant plus difficile {
résoudre numériquement qu’il n’est pas complètement turbulent. Il est donc très délicat
d’utiliser des équations de fermeture modélisant la turbulence car les hypothèses sous-
jacentes ne sont pas satisfaites.

2 DESCRIPTION DE L’ECOULEMENT A L’AIDE DE LA MECANIQUE DES FLUIDES NUMERIQUE

2.1. Mise en œuvre de la simulation numérique directe (DNS)

Le code de calcul commercial Fluent permet d’obtenir une solution numérique de

200
l’écoulement dans le réacteur Couette pour différentes vitesses de rotation par
simulation numérique directe (DNS).

2.1.1. Description de la DNS

 Equations de Navier Stokes (fluide newtonien incompressible) : conservation de

la masse et de la quantité de mouvement (Eq. IV.8) :

U i
 x
i
0
i
Eq IV.8
U i U i 1 p   2U i
 U j   
t j x j  xi  j x 2j

Dans le cas de la Simulation Numérique Directe (ou DNS), les équations de Navier-
Stokes, exactes, sont discrétisées et résolues sans formuler aucune hypothèse sur la
nature turbulente de l’écoulement. En d’autres termes, toutes les échelles de temps et
de longueur sont résolues ce qui conduit à une description spatiale et temporelle de
l’écoulement très détaillée. En contrepartie, la résolution spatiale et temporelle doit être
suffisamment fine afin de décrire effectivement l’ensemble des échelles présentes dans
l’écoulement. Ceci impose une taille maximale de maille et un pas de temps
judicieusement choisis. En pratique, il est souhaitable de raffiner jusqu’{ la taille des
plus petites structures turbulentes, définies par l’échelle de Kolmogorov. Les valeurs
des échelles spatiales et temporelles de Kolmogorov (échelle sous laquelle la dissipation
visqueuse domine) sont données dans le tableau IV.3. Ces deux grandeurs ont été fixées
a priori, en se basant sur la théorie de la turbulence, à partir de la valeur de la puissance
spécifique moyenne donnée par la corrélation de Wendt. Puisqu’il s’agit d’une péthode )
priori, et en particulier pour les écoulements peu turbulents (pour lesquels on ne peut
pas parler d’échelle de Kolmogorov stricto sensu), il conviendra de valider les
simulations en examinant la qualité des résultats notamment en comparant l’intégrale
de puissance dissipée localement à la puissance spécifique moyenne donnée par la
corrélation de Wendt.

201
  Maillage

Un maillage de type cylindrique a été réalisé. Il contient 3.145.728 mailles

hexaédriques soit 64*196*256 dans un repère (r,,z). En terme de taille les mailles font
en moyenne 0,230*1,150*0,660 mm.

 Conditions limites

Type : « Wall » ( condition d’adhérence + loi de paroi) pour les cylindres interne,
externe et le fond, « Symetry » pour la frontière supérieure ( vitesse normale nulle
et gradients normaux nuls pour les autres composantes : vitesses dans le plan). La
surface supérieure ne se déforme pas mais possède les propriétés d’une surface libre :
frottement nul.

 Paramètres de la simulation

Les équations de Navier Stokes ont été discrétisées { l’ordre 3 en espace et 2 en temps,
et résolues en double précision, 3D, instationnaire.

Schéma de discrétisation spatiale: ordre 3 MUSCL, ordre 2 pression.

Schéma d’intégration temporelle : ordre 2 implicite, « non iterative time advancement ».

Le pas de temps constant est fixé à un ordre de grandeur plus faible que le temps
caractéristique des plus petites échelles turbulentes calculé en considérant la puissance
dissipée moyenne issue de la corrélation de Wendt (voir tableau IV.3).

1/ 4 1/ 2
3   
k    tk   
 dt
RPM       (s)
(µm) (s)
20 160 0,0279 * 0,01
30 125 0,0155 0,001
70 73 0,0053 0,0005
120 50 0,0028 0,0001
* le caractère pleinement turbulent n’est pas établi à 20 rpm

202
 Tableau IV.3 : échelles caractéristiques turbulentes pour les différentes vitesses de rotation utilisées à
partir de la dissipation moyenne

o Algorithme de couplage vitesse pression :

 Couplé pour les simulations à 20 -30 RPM

 PISO imposé par l’option « non iterative time advancement » à 70

RPM et 114 RPM

o Critère de convergence numérique

 Résidus inférieurs à 10-4. En pratique les résidus sur les vitesses

tombaient sous 10-6 quand la continuité passe sous 10-4

o Critère de convergence physique : l’examen de la valeur du couple sur les

cylindres intérieur et extérieur renseigne sur le caractère établi de
l’écoulement. L’intégrale de la puissance dissipée localement est
comparée à la puissance totale.

o Le suivi de particules est réalisée sur des particules microniques, sans

interactions avec l’écoulement sur un champ de vitesse instantané. Les
options par défaut proposées par FLUENT sont utilisées. Le temps total de
suivi est fixé de manière à suivre les particules pendant environ 40 tours.

2.1.2. Convergence des écoulements résolus en DNS

Critères

La convergence des résultats de simulations est estimée à travers le suivi du couple

exercé sur le cylindre interne et externe en fonction du temps (stabilité de la résolution)
et par comparaison des valeurs de couples et de puissances dissipées avec des valeurs
issues des corrélations, comme expliqué précédemment. La concordance des valeurs de
couples exercés sur les cylindres internes et externes renseignent sur l’établissement de
l’écoulement dans l’entrefer. Les résultats de simulation sont également validés par une
double approche macro-micro :

203
  Intégrale des contraintes sur le cylindre intérieur qui permet de calculer
le couple puis la puissance fournie et la dissipation globale (dissipation
moyenne volumique calculée selon les équations IV.4 à IV.6 (à partir de la
puissance totale dissipée dans le réacteur),

 Intégrale volumique de la dissipation locale (Eq. IV.9 et IV.10). Celle-ci

n’étant pas calculée explicitement lors d’une simulation numérique
directe, une fonction utilisateur a été utilisée. Le taux de dissipation local
instantané est donné par l’équation IV.9.

   u 2  v 2  w 2    u v 2  v w 2  u w 2 
    2                          Eq IV.9
   x   y   z     y x   z y   z x  
 

1 Eq
V V
  V  dV
IV.10

Examen de la convergence

Le graphe IV.1 ci-dessous présente l’évolution d’un critère choisi par Fluent
représentatif du couple exercé sur le cylindre dans l’écoulement { 20 RPM.

Les coefficients sont stables au delà de t =10s et sur une durée de 10 s supplémentaires,
on peut donc affirmer que l’écoulement est établi { 20 RPM sur cette durée, ce qui
représente 3 révolutions du cylindre interne.

204
 0,00E+00
0 5 10 15 20 25

-5,00E-07

20 RPM

-1,00E-06

-1,50E-06

-2,00E-06

-2,50E-06

-3,00E-06

Graphe IV.1 : stabilisation du couple pour des simulations { 20 RPM (l’axe des ordonnées correspond { un
coefficient de calcul proportionnel au couple)

Les valeurs du couple exercé sur les cylindres interne et externe sont représentées sur
le graphe IV.2. Ce graphique compare, pour les simulations de l’écoulement { 20, 30, 70
et 114 RPM, les valeurs de couple relevés par Fluent avec celles calculées { l’aide de la
corrélation de Wendt ou mesurées par Coufort (Coufort 2004). Ces valeurs sont très
proches, ce qui confirme le caractère établi de l’écoulement. De plus, ces valeurs
coïncident avec la corrélation de Wendt (Tableau IV.4). Pour l’écoulement établi { 114
RPM cependant, il demeure un écart entre les valeurs des couples exercés sur les
cylindres externe et interne, indiquant que la résolution pourrait encore être améliorée
(ce qui nécessite un temps de calcul important). Cependant, on verra que les
conséquences sont négligeables sur l’évaluation de la dissipation.

Taux de dissipation moyen Taux de dissipation moyen

Vitesse de calculé à partir du couple volumique (Eq. IV.10)
rotation
(Eq. IV.6)   V ([Link]-1)
(RPM)
<ε> ([Link]-1)
20 1,7.10-3 1,6.10-3
30 4,2.10-3 3,7.10-3
70 36 .10-3 52.10-3
114 128.10-3 165.10-3
Tableau IV.4 : Valeurs moyenne et moyenne volumique de la dissipation

205
 0,100
1000 10000 100000

0,010
Couple

0,001
Couple (Wendt)

Couple (Coufort, d'après mesures)

Couple exercé sur le cylindre interne

Couple exercé sur le cylindre externe

0,000
Re (-)

Graphe IV.2 : Valeur du couple en fonction du nombre de Reynolds d’après Wendt (empirique), Coufort
(mesure) et les valeurs calculées lors des simulations.

De la même manière, le graphe IV.3 compare la valeur du taux dissipation de l’énergie :

 Calculée à partir des gradients de vitesses locaux via une custom field
function Fluent (équation IV.9)et obtenue en intégrant sur l’ensemble du
volume du réacteur la dissipation locale.

 Calculée d’après la corrélation de Wendt

 Calculée à partir de la valeur du couple mesurée dans la simulation

(équation IV.10 et présentées dans le tableau IV.2).

On observe une très bonne concordance entre ces valeurs pour toutes les simulations.
Les écarts observables pour les simulations { 70 et 114 RPM peuvent s’expliquer par la
réduction de l’échelle de dissipation liée { l’augmentation de la vitesse. Le maillage étant
identique, le calcul de la dissipation à partir des gradients de vitesse locaux est
susceptible de perdre en précision lorsque la vitesse de rotation augmente.

206
 1,000
1000 10000 100000

0,100
Dissipation

0,010

Wendt (1933)
0,001
Dissipation calculée à partir du couple

Dissipation calculée à partir de l'intégrale

des valeurs locales
0,000
Re (-)

Graphe IV.3 : dissipation en fonction du Reynolds, obtenue par calcul et numériquement

Le point fort des calculs est que ces deux approches surfaciques et volumiques (couple
et dissipation) coïncident assez bien entre elles et avec les prédictions de la corrélation
de Wendt.

Examen local : profil de vitesse tangentielle sur un plan horizontal z = 10 cm

Le graphe IV.4 montre le profil de la valeur moyenne des moments angulaires

normalisés. Le moment angulaire M* et coordonnée radiale r* sont normalisés comme
suit :

r  u
M*  Eq IV.11
R1  U 0

r  R1
r*  Eq IV.12
R 2  R1

207
 Graphe IV.4 : Profil du moment angulaire normalisé pour des simulation en DNS de l’écoulement { 20
RPM.

Ce graphe montre que le moment angulaire pour le fluide évoluant au centre de

l’entrefer (r* compris entre 0,1 et 0.8) est constant (autour de 0,5  R1  U 0 ), en accord

avec les simulations de Dong et al. et les mesures de Coufort (Coufort 2004). Un petit
bémol peut cependant être relevé en ce qui concerne la pente du profil, légèrement
positive pour les simulations de Dong et al. et les valeurs expérimentales auxquelles ils
les ont comparées, bombées dans le cas de nos simulations.

2.2. Description de l’écoulement grâce aux résultats obtenus en DNS

2.2.1. Ecoulement à 20 RPM

Parmi les écoulements résolus numériquement dans cette étude, l’écoulement { 20 RPM
(Modulated WVF) est le plus délicat à résoudre numériquement. Aussi, les résultats
décrivant cet écoulement font l’objet d’une attention particulière.

Profils de vitesse moyenne à différents instants

Les graphes ci-dessous représentent les profils des trois composantes de la vitesse (ur,
uθ et uz) dans un plan horizontal en fonction de la coordonnée radiale
adimensionnalisée (équation IV.11). 7 champs instantanés de l’écoulement établi { 20
RPM ont été enregistrés. Chaque profil correspond à un instant particulier . Les valeurs

208
en un point sont issues d’une moyenne sur un cercle de rayon constant { hauteur z = 10
cm fixée. La moyenne d’ensemble correspondant { la valeur moyenne de la vitesse
tangentielle sur tous les instants considérés est représentée en gras.

La direction principale de l’écoulement étant tangentielle (graphe IV.5), on remarque

que c’est la composante tangentielle de la vitesse uθ qui prend les valeurs les plus
élevées. La vitesse est maximale en r*=0, le fluide est entrainé par la rotation du
cylindre interne. Elle décroit rapidement et présente un profil plat sur toute la largeur
de l’entrefer. De plus, le profil de cette composante de la vitesse est relativement stable
au cours du temps (+/-10% dans l’entrefer)

Le profil de vitesse axiale (graphe IV.6) présente une amplitude inférieure au profil de
vitesse tangentielle. Les ordres de grandeur sont inférieurs d’un facteur 10 { celui de la
vitesse tangentielle et sont similaire à celui de la vitesse radiale. Elle renseigne sur le
sens de rotation du vortex. S’agissant de vortex en rotation dans un plan vertical et de
section égale { l’entrefer, la vitesse axiale est donc nulle { l’inflexion, soit au centre de
l’entrefer (extrémités hautes et basses du vortex). Ici, le plan horizontal d’altitude z
traverse un vortex tournant dans le sens trigonométrique.

0,18
Vitesse tangentielle (m/s)

0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
r*(-)
Graphe IV.5 : Profil de la composante tangentielle de la vitesse en moyenne spatiale et temporelle (en
gras) dans un plan horizontal z=10 pour différents champs instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s
(∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5= t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

209
 0,015

0,010

Vitesse axiale (m/s)

0,005

0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-0,005

-0,010

-0,015

-0,020

-0,025
r*(-)
Graphe IV.6 : Profil de la composante axiale de la vitesse en moyenne spatiale dans un plan horizontal
z=10 pour différents champs instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s (∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5=
t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

0,008

0,006
Vitesse radiale (m/s)

0,004

0,002

0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-0,002

-0,004

-0,006
r*(-)
Graphe IV.7 : Profil de la composante radiale de la vitesse en moyenne spatiale dans un plan horizontal
z=10 pour différents champs instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s (∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5=
t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

La vitesse radiale quant à elle est nulle aux extrémités latérales du vortex et les valeurs
sont opposées selon un plan de symétrie horizontal coupant le vortex en son centre.
Son profil, qui renseigne sur la position du plan de mesure par rapport au tourbillon, est

210
visualisé sur le graphe IV.7. On observe une alternance de valeurs positives et négatives
selon l’instant considéré. Ceci est le reflet de l’instationarité de l’écoulement { 20 RPM
(onde superposée aux vortex). Ces trois profils nous montrent ainsi, dans un plan fixe, la
trace d’un vortex qui oscille verticalement au cours du temps.

Le rapport entre les composantes radiales et tangentielles ur et uθ est de l’ordre de 0,1,

ce qui correspond aux observations expérimentales de Coufort. Les profils de vitesses
tangentielle et axiale semblent relativement stables dans le temps et varient peu
relativement à la moyenne. Cependant, les profils de vitesse radiale varient avec la
même amplitude absolue et relativement plus que les deux profils précédents.

Profils de vitesse moyenne à différentes altitudes dans un champ figé

Sur un même champ instantané, nous avons également comparé les profils de vitesses
pour différentes hauteurs dans le réacteur, c’est ce qui est illustré par les graphes IV.8 {
IV.10. Les vitesses sont moyennées sur un tour (points de coordonnées radiales et
axiales fixes).

Comme décrit précédemment, le profil de vitesse tangentielle est similaire quelle que
soit la hauteur dans le réacteur. La vitesse tangentielle n’est soumise { aucune
instabilité spatiale ou temporelle.

211
Graphe IV.8 : Profil de vitesse radiale à 20 RPM pour des plans horizontaux de hauteur z=2, 6, 12 et 14 cm

Graphe IV.9 : Profil de vitesse axiale à 20 RPM pour des plans horizontaux de hauteur z=2, 6, 12 et 14 cm

212
Graphe IV.10 : Profil de vitesse tangentielle à 20 RPM pour des plans horizontaux de hauteur z=2, 6, 12 et
14 cm

On remarque que les profils de vitesses radiales et axiales varient en fonction de la

position du plan de mesure. Ceci dépend en pratique de la position du plan de mesure
par rapport aux vortex.

2.2.2. Comparaison des profils de vitesse pour différentes vitesses de rotation

Les profils de vitesse radiale, tangentielle et axiale sont présentés pour différents plans
horizontaux (coordonnée axiale z=10cm) sur les graphes IV.11 à IV.13. Comme
précédemment, les valeurs des composantes de la vitesse en différents points de
coordonnée radiale fixée arbitrairement sont moyennées.

Les profils de vitesse tangentielle on l’allure décrite précédemment : la vitesse dans

cette zone décroit avec la vitesse de rotation du cylindre. Enfin, lorsqu’on s’approche du
cylindre externe, la vitesse décroit rapidement et atteint une valeur nulle à la paroi. Les
profils de vitesse radiale, comme les profils de vitesse axiale, indiquent que la position
verticale des vortex varie en fonction de la vitesse de rotation du cylindre.

213
Graphe IV.11 : Profil de la vitesse tangentielle moyennée sur un plan vertical (z= 14 cm) pour différentes
vitesses de rotation

Graphe IV.12 : Profil de la vitesse axiale moyennée sur un plan vertical (z= 14 cm) pour différentes
vitesses de rotation

214
 Graphe IV.13 : Profil de la vitesse radiale moyennée sur un plan vertical (z = 14 cm) pour différentes
vitesses de rotation

2.3. Confrontation avec les résultats expérimentaux

Le graphe IV.14 représente les profils de vitesse tangentielle de la vitesse moyenne

obtenus expérimentalement (Coufort 2004) en fonction de la coordonnée radiale
adimentionnalisée r*. Ces profils ainsi que les valeurs moyennes correspondent aux
résultats obtenus numériquement dans cette étude. La concordance obtenue dans deux
études expérimentales et numériques menées indépendamment est remarquable.
Toutefois, les résultats de la simulation à 114RPM semblent devoir encore être affinés.

215
 0,75
20 RPM DNS 110RPM 70RPM
30RPM 120 RPM DNS 70 RPM DNS
30 RPM DNS

vitesse tangentielle (m/s)

0,50

0,25

0,00
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
r* (-)

Graphe IV.14 : les profils de vitesse tangentielle de la vitesse moyenne obtenus expérimentalement par
Coufort à 30 RPM (♦),50 RPM (□),70 RPM (▲),90 RPM (○) et 110 RPM (●).

2.4. Conclusion

Les simulations numériques semblent avoir convergé vers des solutions raisonnables et
les bilans sur la dissipation de l’énergie sont très convaincants. Les valeurs de couple et
de dissipation sont proches des corrélations de la littérature et les profils de vitesse
sont cohérents et similaires à ceux obtenus expérimentalement par Coufort sur ce
même réacteur.

3 OBSERVATION DES CHAMPS INSTANTANES – APPROCHE PHENOMENOLOGIQUE

Sur la figure IV. 1 présentant les champs instantanée de dissipation calculés par Fluent à
20 RPM, on observe des vortex de position et de diamètres différents, caractéristiques
de l’écoulement tourbillonnaire modulé. Ces vortex sont en nombre impair, ce qui peut
s’expliquer par la hauteur simulée dans notre cas (seulement 17 cm) et d’un nombre
variable, la disparition puis la disparition d’une paire de vortex correspondant à un

216
régime pseudo stationnaire de l’écoulement réalisé dans ces conditions. Ici encore, les
observations de Dong et al. sont d’une aide précieuse { l’interprétation de nos résultats.
Si l’écoulement VF présente des vortex de Taylor occupant tout l’espace de l’entrefer
avec une distinction claire entre les vortex, ce n’est pas le cas pour les écoulements {
Reynolds plus élevé. Ainsi, pour des écoulements à Reynolds réduit proche de 40 (WVF
et MWVF), on peut observer des vortex moins bien délimités, avec des cellules
tourbillonaires « élémentaires » en réalité constituées de deux vortex contrarotatifs

Figure IV. 1: champs instantanés de dissipation pour une section verticale de l’écoulement { 20 RPM

Les figures IV.1 et IV.2 montrent une cartographie d’une section verticale du réacteur
Couette présentant l’intensité de la dissipation et les champs de vitesse. La valeur
maximale de la dissipation a été limitée à 1 pour permettre une meilleure observation
de ses variations dans l’entrefer.

217
De manière qualitative, on observe des zones où l’intensité de la dissipation est élevée,
aux extrémités des vortex près des parois et des zones de plus faible intensité
dissipatrice, correspondant au cœur des vortex. On observe que la dissipation est forte
en paroi et dans les zones de rencontre des vortex.

218
219
 Figure IV.2 : champs de dissipation locale et champs de vitesse pour un plan vertical de l’écoulement {
20RPM

Les champs de vitesse quand à eux, témoignent correctement de la présence de

tourbillons contrarotatifs dans l’entrefer. Les champs de vitesse en sortie de tourbillon,
faisant penser à un jet sont semblables aux observations de Rudman (Rudman 1998;
Rudman et al. 2008). On remarque néanmoins la présence de boucles de recirculation
(figure IV.3).

Figure IV.3 : zoom sur une boucle de recirculation

4 UTILISATION DE LA CFD POUR DECRIRE LES CONTRAINTES

Les résultats de simulation numérique étant correctement validés, nous pouvons donc
exploiter les bases de données générées pour tenter d’expliquer les différences de
comportement des cellules dans ces écoulements. Nous allons entre autre exploiter :

 Les distributions volumiques (de dissipation, contraintes…)

220
  Le suivi Lagrangien d’une particule lancée dans l’écoulement qui permet
en outre de caractériser de manière plus fine les fluctuations subies et la
nature des contraintes.

4.1. Amplitude et distributions des contraintes – cartographie de l’écoulement

Comme en témoignent les champs de dissipation locale, celle-ci est assez hétérogène
dans le réacteur. Il en est donc de même pour les valeurs de la microéchelle de
Kolmogorov et du taux de cisaillement. Les distributions volumiques sont représentées
sous la forme d’une distribution de probabilité. La valeur lue en ordonnée exprime la
probabilité p(x) de trouver un volume élémentaire dV à la valeur x lue en abscisse. A
partir de ces distributions, trois grandeurs sont calculées :


 La valeur moyenne  x   p( x)  x  dx Eq IV.13
o

xm 
 La valeur médiane xm, telle que  p( x)  dx 
0
 p( x)  dx  0,5
xm
Eq IV.14

 La valeur la plus probable, qui correspond à la valeur au sommet du pic de

la distribution.

4.1.1. Représentativité des valeurs

Paramètres de description

Ces distributions de probabilité sont issues de l’analyse des données collectées dans un
plan vertical, ce qui représente au total environ15000 points. Dans le cas d’une
distribution non normale, au sens statistique du terme, la moyenne (équation IV.13)
seule ne permet pas de caractériser le niveau d’intensité du paramètre, la valeur
médiane (équation IV.14) a elle aussi été calculée.

Représentativité des distributions à 20 RPM

221
Les distributions volumiques de la dissipation, du gradient de vitesse et de l’échelle de
Kolmogorov sont calculées { partir d’un plan vertical dans l’écoulement résolu. Si les
écoulements à 30, 70 et 120 RPM peuvent être considérés comme axisymétriques, et de
ce fait la distribution sur un plan vertical peut être considérée comme représentative,
l’écoulement { 20 RPM lui, est instationnaire. Il convient donc de vérifier que la
distribution sur un unique plan vertical représente correctement l’ensemble. Pour ce
faire, le graphe IV.15 compare les distributions en nombre (qui ne prend donc pas en
compte le volume de chaque maille) de la dissipation pour un plan vertical x=0 en 7
instants séparés chacun de 2s.

Le profil des distributions varie peu avec le temps. Les échelles qui varient
correspondent { des dissipations de l’ordre de 10-4 W/kg. Il s’agit des faibles échelles de
dissipation, probablement au cœur des vortex. La variation s’explique par l’apparition
aléatoire de bouffées turbulentes dans l’écoulement. De ce fait, dans la suite de ce
chapitre, on considère que les distributions sur un plan vertical sont représentatives de
l’ensemble du volume considéré et ce quelle que soit la vitesse de rotation.

Graphe IV.15 : Distribution en nombre de la dissipation sur un plan x=0 à différents instants pour
l’écoulement { 20 RPM.

222
4.1.2. Dissipation

La distribution radiale du taux de dissipation dans l’entrefer est représentée sur le

graphe IV.16. Celle-ci, élevée aux parois, atteint un minimum au centre de l’entrefer.
C’est en effet { cet endroit que se situent les cœurs des vortex, où la dissipation est la
plus faible. De manière logique, on observe que plus la vitesse de rotation (et donc
l’énergie apportée au système) augmente, plus la dissipation est élevée.

Les distributions volumiques à différentes vitesses sont ensuite comparées sur le

graphe IV.17 et les valeurs de dissipation moyennes et médianes obtenues sont
récapitulées dans le tableau IV.5. Sans surprise, l’augmentation de la vitesse de rotation
a pour conséquence l’augmentation de la dissipation d’énergie globalement et
localement, mais aussi de conduire à une distribution moins étalée : on observe un pic
beaucoup plus resserré pour la dissipation { 30 RPM qu’{ 20 RPM. Les distributions {
30, 70 et 120 RPM sont autosemblables.

Graphe IV.16 : profil de dissipation moyennée dans un plan vertical dans l’entefer { 20 RPM (○), 30 RPM
(+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)

223
Graphe IV.17 : distribution volumique de la dissipation sur un plan x=0 pour des écoulements à 20, 30, 70
et 114 RPM.

Vitesse de
Taux de dissipation médian Taux de dissipation moyen
rotation
εm ([Link]-1) <ε> ([Link]-1)
(RPM)

20 0,01 .10-3 1,7.10-3

30 0,26 .10-3 3,7.10-3

70 0,81 .10-3 32 .10-3

114 1,8 .10-3 108.10-3

Tableau IV.5 : valeurs moyennes et médianes de la dissipation pour les différents écoulements considérés

Le ratio moyenne/médiane indique que la dissipation s’étale jusqu’{ des valeurs

relativement élevées, mais qui ne concernent qu’une faible proportion du volume. C’est
ce qui sera visualisé sur les graphiques.

224
4.1.3. Echelle de Kolmogorov

Pour chaque vitesse de rotation, la microéchelle de Kolmogorov a été calculée. Profils,

distribution et valeurs caractéristiques sont représentés sur les graphes IV.18 et le
tableau IV.6. Il est possible que la turbulence dans l’écoulement { 20 RPM ne soit pas
complètement établie. De ce fait, il est délicat de calculer une échelle de Kolmogorov
pour ce cas précis.

La distribution de la taille caractéristique (ν3/ε)1/4 (équivalente { l’échelle de

Kolmogorov pour les écoulements turbulents) dans l’entrefer est représentée sur le
graphe IV.18. Dans les zones proches des parois, celle-ci est faible. Il s’agit de zones dans
lesquelles le niveau de turbulence est important. Au centre de l’entrefer, l{ où la
probabilité de se trouver au milieu d’un vortex (zone de faible turbulence) est plus
importante, la taille de la microéchelle de Kolmogorov augmente sensiblement. De
manière logique, on observe que plus la vitesse de rotation (et donc l’énergie apportée
au système) augmente, plus la taille de la microéchelle diminue. On notera une valeur de
l’ordre de 200 µm au centre de l’entrefer { 114 RPM. Cette valeur de l’ordre de la
dimension radiale des mailles (220mm), mais plus petit que leur dimension axiale
(660mm).

La distribution de l’échelle de (ν3/ε)1/4 à 20 RPM présente deux pics, correspondant très

certainement aux zones intra-vortex d’une part, l{ ou l’écoulement est plutôt laminaire
(centre de l’entrefer) et aux zones de contact entre les vortex et aux parois, l{ où
l’énergie est principalement dissipée.

225
Graphe IV.18 : profil de l’échelle de Kolmorogov* moyennée dans un plan vertical dans l’entefer { 20 RPM
(○), 30 RPM (+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)
* : seule une estimation est donnée à 20 RPM

Le tableau IV.6 présente les valeurs médianes et moyennes de l’échelle de Kolmogorov

calculées pour différentes vitesses de rotation. On remarque que plus l’agitation est
importante, plus ces deux valeurs se rapprochent : l’écoulement devient turbulent et
homogène.

Le graphe IV.19 ci-dessous présente les profils de distribution volumique de l’échelle de

Kolmogorov pour différentes vitesses de rotation.

Echelle de Kolmogorov Echelle de Kolmogorov

Vitesse de rotation
médiane moyenne
(RPM)
(µm) (µm)

20 299 336

30 256 251

70 177 184

114 146 149

Tableau IV.6: valeurs moyennes et médianes de l’échelle de Kolmogorov (µm)

226
Graphe IV.19 : distribution volumique de l’échelle de Kolmogorov sur un plan x=0 pour des écoulements à
20, 30, 70 et 114 RPM.

Le graphe IV.20 ci-dessous présente la comparaison entre les tailles les plus probables
de la microéchelle de Kolmogorov obtenues expérimentalement par Coufort (Coufort
2004) et les valeurs moyennes et médianes tirées des simulations numériques. Ces
valeurs sont proches, d’autant plus proches que l’écoulement devient turbulent.

320

270
taille (µm)

220

170

120
0 20 40 60 80 100 120 140
vitesse de rotation (RPM)

Graphe IV.20 valeurs médiane (□), moyenne (■)et la plus probable selon Coufort (▲)de l’échelle de
Kolmogorov en fonction de la vitesse de rotation du cylindre interne

227
4.1.4. Contrainte de cisaillement

Le profil du taux de cisaillement (graphe IV.21), qui est une fonction de la dissipation est
donc similaire au profil de cette dernière. Ici encore, l’augmentation de la vitesse de
rotation conduit à une augmentation globale du cisaillement dans le réacteur,
augmentation accentuée aux parois.

Graphe IV.21 : profil du taux de cisaillement moyenné dans un plan vertical dans l’entefer { 20 RPM (○),
30 RPM (+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)

Fluent propose d’extraire un strain rate, correspondant au cisaillement dont les

distributions sont présentées dans le graphe IV.22 et les valeurs caractéristiques sont

reprises dans le tableau IV.7.

228
Graphe IV.22 : Distribution volumique du taux de cisaillement sur un plan x=0 pour des écoulements à 20,
30, 70 et 114 RPM.

Taux de cisaillement Taux de cisaillement

Vitesse de rotation
médian moyen
(RPM)
(s-1) (s-1)

20 10 23

30 16 37

70 30 82

114 44 134

Tableau IV.7: valeurs moyennes et médianes du taux de cisaillement (s -1)

On peut remarquer ici encore la différence notable entre la valeur de la moyenne

volumique de cette grandeur et la valeur calculée à partir du taux de dissipation moyen.

4.2. Suivi Lagrangien de particule : nature et fluctuation des contraintes

Une particule a été lancée dans l’écoulement afin d’enregistrer les gradients de vitesse
rencontrés le long de sa trajectoire. Ces gradients permettent de reconstituer le tenseur
des contraintes et de calculer la dissipation localement. Nous n’avons suivi pour cette

229
étude qu’une seule particule et n’avons donc pas la prétention de décrire
statistiquement le niveau de fluctuations mais d’apporter une contribution { la
description des perturbations rencontrées par les cellules. Par la suite, le suivi
instationnaire de trajectoire d’un plus grand nombre de particules permettra cette
analyse plus fine.

4.2.1. Amplitude et fluctuation

Les graphes IV.23 à IV.26 permettent de visualiser le niveau de dissipation rencontrée

par la particule le long de sa trajectoire dans des écoulements à 20, 30, 70 et 114 RPM.
La durée du suivi de particule a été imposée de façon à ce que cela corresponde à un
nombre de tour équivalent pour les quatre vitesses de rotation, soit environ 40 tours. La
dissipation est ici normée par la dissipation moyenne calculée précédemment.

Graphe IV.23 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une particule le long de
sa trajectoire à 20 RPM

230
Graphe IV.24 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une particule le long de
sa trajectoire à 30 RPM

Graphe IV.25 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une particule le long de
sa trajectoire à 70 RPM

231
Graphe IV.26 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une particule le long de
sa trajectoire à 114 RPM

Quel que soit l’écoulement considéré, la particule est exposée de façon ponctuelle { des
niveaux de dissipation importants. La fréquence de ces perturbations est estimée à
partir du nombre de pics tels que ε/εmoy>10 sur la durée du suivi (tableau IV.8). Plus la
vitesse de rotation augmente, plus l’amplitude et la fréquence des perturbations sont
importantes. L’amplitude relative maximale croit également avec la vitesse de rotation,
tout comme la valeur moyenne de la dissipation (paragraphe 4.3.2). Nous verrons les
effets quantitatifs lors de l’analyse détaillée des contraintes.

Vitesse de Durée du suivi (s) Nombre estimé de

rotation Nombre de pics tels
perturbation
que ε/εmoy>10
(RPM) /100s

20 10 140 7
30 6 80 7,5
70 8 35 23
114 11 25 44
Tableau IV.8 : fréquence des perturbations

232
Cette analyse nous informe sur l’intensité et la fréquence des évènements stressants
rencontrés mais l’analyse peut être poussée un peu plus loin en examinant la nature des
contraintes.

4.2.2. Nature des contraintes

L’ensemble des composants du tenseur des contraintes (équation IV.15) est accessible
par la simulation directe. Les termes diagonaux représentent les contraintes normales,
alors que les termes non diagonaux représentent les termes de cisaillement. La
comparaison des termes diagonaux et non diagonaux renseigne sur les contraintes
dominantes.

 du  du dv   du dw  
 2        
 dx  dy dy   dz dx  
  dv du  dv  dv dw  
S v ij       2      Eq IV.15
  dx dy  dy  dx dy  
  du dw   dv dw  dw 
         2 
  dz dx   dz dy  dz 

La diagonalisation du tenseur des contraintes permet d’extraire une matrice des valeurs
propres (diagonale) et une matrice des vecteurs propres (représentant les coordonnées
des vecteurs propres dans la base de départ x, y, z). La matrice diagonale obtenue par la
diagonalisation du tenseur représente les contraintes normales dans le repère des
vecteurs propres (équation IV.16).

 u  
  0 0 
 SI 0 0   x 
   v  
S propre   0 S II 0  0 0  Eq IV.16
0 y 
 0 S III   
 0 w  
 0 
 z  

233
La trace de cette matrice (équation IV.17) correspond à la divergence de la vitesse et le
déterminant correspond au produit des valeurs propres.

u  v  w
  0 Eq IV.17
x  y  z 

L’amplitude des contraintes est proportionnelle au module des valeurs propres alors
que leur signe renseigne sur la nature des contraintes subies : si la valeur propre est
négative, il y a compression dans la direction associée, élongation dans le cas d’une
valeur positive. On notera qu’au moins l’une de ces valeurs propres doit être négative
car leur somme est nulle. Ainsi, si le déterminant de la matrice diagonale (produit des
valeurs propres) est négatif, il s’agit d’une bi-élongation alors que s’il est positif, il s’agit
d’une bi-compression. La direction dans laquelle s’exercent ces contraintes est donnée
par les vecteurs propres.

Après avoir vérifié que le calcul de la dissipation basé sur les gradients de vitesse
extraits le long de la trajectoire de la particule renvoyait des valeurs identiques à celles
calculées dans Fluent, nous avons tracé l’évolution de l’amplitude des contraintes
(valeurs minimales et maximales de la matrice des valeurs propres à chaque instant)
vues par une particule au cours de son trajet dans l’écoulement (graphes IV.27 et IV.28).
Le temps de suivi de particule étant différent pour chaque vitesse de rotation, nous
attirons l’attention du lecteur sur le changement d’échelle sur l’axe des abscisses.

Au cours de son passage dans le réacteur, la particule est donc soumise à une alternance
de contraintes élongationelles et de compression d’amplitudes variables. La fréquence
de ces alternances et l’amplitude de ces contraintes est proportionnelle { la vitesse de
rotation.

234
 Graphe IV.27 : Amplitude des contraintes vues par une particule le long de sa trajectoire à 20 RPM

Graphe IV.28 : Amplitude des contraintes vues par une particule le long de sa trajectoire à 120 RPM

Comme expliqué plus haut, le déterminant représente le produit des valeurs propres.
Les valeurs propres les plus grandes en valeur absolue sont tracées sur les graphes
précédents : { chaque fois, une valeur positive et une valeur négative. C’est donc le signe

235
de la valeur propre de valeur absolue la plus faible qui va déterminer le signe du
déterminant. Les graphes IV.29 et IV.30 représentent, via l’évolution de la plus petite
valeur propre (en valeur absolue), l’alternance entre contraintes de compression et
d’élongation pour des écoulements { 20 et { 120 RPM. L’amplitude du signal est environ
10 fois plus faible que précédemment, indiquant que les contraintes dominantes sont
plutôt en deux dimensions. De plus, on visualise très bien l’alternance entre les zones de
compression et celles d’élongation. La fréquence des fluctuations augmente avec la
vitesse de rotation.

Graphe IV.29: Alternance des contraintes de compression et d’élongation vue par une particule le long de
sa trajectoire à 20 RPM

236
Graphe IV.30 : Alternance des contraintes de compression et d’élongation vue par une particule le long de
sa trajectoire à 114 RPM

L’analyse du tenseur des contraintes dans les cas où la dissipation subie est importante
révèle que le cisaillement y est moins important que les contraintes normales. De même,
l’analyse des vecteurs propres a montré que les efforts s’exerçaient dans deux
directions préférentielles : une droite verticale (Oz) et une droite contenue dans le plan
horizontal (rθ).

5 APPLICATION AUX CULTURES DE LACTOCOCCUS LACTIS EN REACTEUR COUETTE

5.1. Effet des contraintes sur la taille des agrégats

Les profils de distribution de taille des agrégats sont représentés sur le graphe IV.31

237
 18

20 RPM
16 30 RPM
70 RPM
114 RPM
14

12
% volume

10

0
0,01 0,1 1 10 100 1000

taille (µm)

Graphe IV.31 : Distribution volumique de la taille des agrégats à 20 RPM (○), 30 RPM (+), 70 RPM (□) et
120 RPM (*).

Le graphe IV.32 permet de comparer la taille des agrégats compris entre 0 et 1 mm

(avant la formation d’agrégats de taille supérieure) avec les échelles de Kolmogorov
moyennes et médianes. Dans la gamme de taille d’agrégat considérée, celle-ci est
toujours bien inférieure { l’échelle de Kolmogorov. Ces remarques sont similaires aux
observations de tailles de flocs minéraux (Coufort 2004) ou biologiques (Stricot et al.
2010).

Le tableau IV.9 permet de comparer la taille des agrégats aux paramètres de

l’écoulement.

238
 350

300

250
taille (µm)
200

150

100

50

0
0 20 40 60 80 100 120 140
vitesse de rotation (RPM)

Graphe IV.32 : comparaison entre la taille des agrégats(▲) et les échelles de Kolmogorov médiane (□) et
moyennes (■)

Vitesse de rotation Taille

Taille agrégats/(εmed)-1/4
(RPM) agrégats/(cisaillementmoy)
20 12 5,3
30 10 2,1
70 2,2 0,16
114 2 ,1 0,07
Tableau IV.9 : taille des agrégats rapportés à la dissipation et au cisaillement

Le ratio taille agrégats/(εmed)-1/4 (ce dernier termes évoluant de la même manière que
l’échelle de Kolmogorov ) est égal à 2 à 70 et 114 RPM, ce qui semble indiquer que la
taille des agrégats dont la croissance est limitée est contrôlée par le niveau de
dissipation localement rencontrée.

Le taux de cisaillement semble contrôler la taille des agrégats formés à 70 et 114 RPM.
En revanche, dans les écoulements établis à 20 et 30 RPM, celui-ci ne semble pas
suffisant pour contrôler la taille de l’agrégat. On observe sur le graphe IV.33, qui
représente la taille des agrégats en fonction du cisaillement moyen, une limite (située
entre 40 et 80 s-1) en deç{ de laquelle la croissance du filament n’est plus limitée.

239
 160

taille de l'aggrégat (µm) 140

120

100

80

60
y = 14027x-1,4887
40 R2 = 0,979

20

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
cisaillement moyen (1/s)

Graphe IV.33 : Evolution de la taille des agrégats de taille inférieure à 1mm en fonction du taux de
cisaillement.

Les gammes de taux de cisaillement subi (15-134 s-1 environ) sont bien inférieures aux
cisaillement au-delà duquel Sahoo et ses collaborateurs (Sahoo et al. 2003) observent
une modification significative des profils de croissance (741 s-1).

5.2. Contraintes, structure de l’écoulement et agrégation

5.2.1. Aspect quantitatif des contraintes

Le phénotype particulier et atypique décrit dans le chapitre précédent n’apparaît que

pour les cultures à faibles vitesses de rotation. Pour ces cultures, les niveaux de
contraintes s’exerçant sur les cellules sont résumés dans le tableau IV.10.

La contrainte exercée sur les petits agrégats est calculée d’après Henzler (Schügerl et al.
2000) { l’aide de l’équation IV.18 (contrainte due { la dissipation visqueuse) et sur les
gros agrégats, on calcule la contrainte turbulente (équation IV.19). Le calcul de la
contrainte { partir de l’estimation du gradient de vitesse (équation IV.20) est donné {
titre indicatif. Cette approche de la contrainte tend à surestimer les niveaux de

240
contrainte exercés aux petites échelles et à sous estimer celles subies par des particules
de taille supérieure { l’échelle de Kolmogorov.


 t  0,0676   d p2 Eq IV.18


 t  1,9  d p 3
2
Eq IV.19

   G Eq IV.20

Contrainte Contrainte
Contrainte
Echelle de sur calculée à
sur
Vitesse de Kolmogorv Taille de l’agrégat de partir du
l’agrégat de
rotation (λk) l’agrégat diamètre > gradient de
diamètre
(RPM) médiane (µm) 12 λk vitesse
dp=1/6 λk local
(µm) dp = 4 mm
(Pa) (Pa)
(Pa)
20 299 120 0,3.10-3 0,7 23.10-3
30 256 80 0,4.10-3 1,1 37.10-3
70 177 13 1,9.10-3 4,9 82.10-3
114 146 10 4,3.10-3 10,8 134.10-3
Tableau IV.10 : Contraintes s’exerçant sur des bactéries ou ensembles de bactéries dans les zones
inertielle diffusive et inertielle convective

On calcule une contrainte subie entre 0,3 et 4 mPa, ce qui est loin des valeurs
dommageables pour les cellules bactériennes (Schügerl et al. 2000; Yim and Shamlou
2000).

Si les contraintes ne sont pas létales pour les cellules (ce qui a d’ailleurs été confirmé
par des marquages type live/dead sur des cultures) ; il n’est pas { exclure que ces
contraintes entrainent des modifications plus subtiles au niveau des composés

241
membranaires (sur un plan qualitatif : confirmation des molécules ou type de
molécules) ou sur un plan quantitatif.

Les contraintes exercées sur les agrégats à 70 et 120 RPM sont supérieures à la force de
cohésion de l’ensemble. Elles sont de l’ordre de 10-3 Pa. La contrainte exercée sur les
agrégats formés { 70 RPM est inférieure { celle causée par l’écoulement { 120 RPM,
suggérant que la taille de l’agrégat peut augmenter si on considère que seul le niveau de
contrainte limite la croissance. En revanche, ces contraintes sont inférieures pour
l’écoulement { 20 et 30 RPM, d’où la liberté pour la matrice de se former.

Cependant, le filament placé dans des écoulements peu turbulents grossit et subit donc
des contraintes plus importantes (tableau IV.10), supérieures aux contraintes qui
limitaient leur taille dans les écoulements à 70 et 120 RPM. Le maintien de la structure
peut être expliqué par différentes hypothèses :

 propriétés viscoélastique de la matrice, qu’il conviendra par la suite de

mesurer,

 évolution de la force de cohésion, permettant une meilleure résistance.

Le passage de 20 à 114 RPM ne permet pas la déstructuration du filament, tout comme

le traitement aux ultrasons (voir chapitre 3). Ceci nous renseigne sur le caractère
évolutif de la matrice. Si le niveau de contrainte et ses fluctuations à 114 RPM
préviennent l’agrégation (donc supérieur { la force de cohésion initiale), elle ne permet
pas la destruction du filament final.

5.2.2. Aspect qualitatif des contraintes

Comme soulevé { l’issu du chapitre 3 consacré à la description du phénotype, il est fort

probable que la nature particulière de l’écoulement joue un rôle important dans
l’établissement de ce phénotype.

242
Suivi de l’évolution des vecteurs propres indique que les agrégats subissent des
contraintes dans un écoulement que l’on peut considérer comme bi-dimensionnel : jet
en sortie de vortex (Rudman).

Le suivi de trajectoire d’un point matériel n’est pas adapté pour le suivi des contraintes
exercées sur des filaments car leur taille est bien supérieure et leur mouvement est
sensiblement différent de celui d’une particule microscopique. En effet, le filament, plus
gros est aussi soumis aux effets des forces centrifuges (d’ailleurs, on observe
expérimentalement le filament de placer de manière préférentielle { l’extérieur) et des
fluctuations de vitesses aux plus grandes échelles.

De plus, le suivi des contraintes s’exerçant sur la particule indique qu’il s’agit d’une
alternance de contraintes d’élongation et de compression. On rejoint ici les conclusions
de Rudman sur l’advection de fluide entre les vortex dans les écoulements WVF avec la
présence de jets en sortie de vortex.

6 CONCLUSION

La résolution des écoulements en DNS permet d’accéder aux paramètres descriptifs des
contraintes localement rencontrées par les cellules.

Le suivi de la distribution de taille de particules semble indiquer que les cellules

s’agrègent quelle que soit la vitesse de rotation, mais que la taille finale des agrégats est
limitée pour les fortes vitesses de rotation. Dans les écoulements très turbulents, la
taille des agrégats est contrôlée par le niveau de dissipation et celle-ci ne dépasse pas la
valeur de l’échelle de Kolmogorov. Il existe un seuil de cisaillement au-delà duquel la
contrainte exercée est supérieure { la force de cohésion de la matrice que l’on peut alors
estimer. Cependant, celle-ci présente un caractère évolutif et sa résistance aux
contraintes semble augmenter au fur et { mesure de sa structuration d’une part, et
grâce à ses propriétés élastiques d’autre part.

Au regard des résultats de la CFD, la nature des écoulements entre faible et fort
Reynolds se distingue par la présence de zones à faible dissipation dans lesquelles les

243
cellules ou agrégats peuvent rester un temps relativement long puisque l’intérieur des
vortex n’est pas soumis { l’écoulement chaotique., en cohérence avec les travaux de
Rudman (Rudman 1998; Rudman et al. 2008).

Le suivi d’une particule (qu’il conviendra d’étendre { plusieurs particules et sur des
durées plus longues) nous renseigne sur lles fluctuations et la nature des contraintes.
Mais Rusconi et al. (2009) ont également observé ce type de phénotype dans des
écoulements purement laminaires.

244
CONCLUSION

L'origine de ce travail reposait sur la question des interactions entre réaction biologique
et procédé. Largement étudiés aux grandes échelles, les effets des contraintes
hydrodynamiques sont moins critiques aux petites échelles et ont été l’objet de peu
d’études, mais sont néanmoins { prendre en compte lors de l'extrapolation des
bioréacteurs. En s'intéressant plus particulièrement aux phénomènes agissant aux
petites échelles, nous avons donc cherché à identifier, caractériser et quantifier les
couplages hydro-bio à l'échelle de la cellule.

La revue bibliographique met en exergue deux types de stress induits par les conditions
hydrodynamiques sur les cellules : un stress mécanique et un stress chimique. Ces deux
types de contraintes sont contrôlés par le niveau de l'un des paramètres
hydrodynamique caractéristique de l'écoulement : le taux de dissipation de l'énergie
cinétique turbulente (ε). C'est pourquoi le choix d'un réacteur de type Couette s'est
rapidement imposé, offrant l'avantage de présenter une dissipation relativement
homogène dans tout le volume.

Si des contraintes d'ordre mécanique (cisaillement, structure de l'écoulement,

dissipation de l'énergie cinétique) peuvent modifier le comportement de cellules en
bioréacteurs, nous avons surtout ciblé celles d’ordre chimique (contraintes liées au
mélange du substrat). Les régimes d'écoulement étudiés ici n'ont aucunement la
prétention de mimer les écoulements usuellement rencontrés dans les bioréacteurs
industriels mais peuvent néanmoins aider à comprendre quels sont les mécanismes de
couplage en jeu.

Pour étudier la contrainte liée au mélange, nous avons choisi la souche Lactococcus
lactis NCDO 2118 pour sa capacité à orienter son métabolisme en fonction du flux de
substrat reçu. En effet, l’analyse préliminaire des interactions mélange-réaction et des
mécanismes du mélange turbulent montre que ce dernier peut affecter la manière dont
le substrat est transféré aux cellules. Cependant, nos résultats expérimentaux indiquent
que le niveau de dissipation de l'énergie dans le réacteur n'a pas d'effet sur le

245
métabolisme cellulaire. Si l’hypothèse d’une différence dans l’intensité du mélange {
l’échelle cellulaire peut expliquer certains comportements biologiques dans des
réacteurs de type scale down, celle-ci est négligeable dans les conditions expérimentales
étudiées.

En revanche, l'inhibition par l’oxygène de la pyruvate formiate lyase, enzyme

responsable de la production de formiate, dans le cas où la culture n'est pas inertée et
réalisée à forte vitesse (114 RPM) met en évidence un couplage transfert – mélange –
réaction. L’étude de la compétition entre ces trois mécanismes, écartés dans cette étude,
n’est pas dénuée d’intérêt dans le domaine des bioprocédés dans la mesure où la
plupart des bioréactions nécessite un apport en oxygène. L’étude du couplage transfert
– mélange – réaction dans ce type de configuration expérimentale (inhibition de la PFL
de L. lactis NCDO 2118 cultivé en réacteur Couette en microaérophilie) constitue donc
une première perspective intéressante.

Cependant, si les contraintes chimiques semblent négligeables, il semble que la

structure de l'écoulement en elle-même ait une influence sur la physiologie
microbienne. Les cultures réalisées dans les régimes d’écoulements Wavy Vortex Flow
et Modulated Wavy Vortex Flow présentent toutes un retard de croissance, traduisant
des conditions non optimales auxquelles les cellules doivent s’adapter. De plus, dans ces
configurations d’écoulements, les cellules sont emprisonnées dans une matrice protéo-
polysaccharidique dont la formation ne semble pas initiée par un stress de type
chimique (limitation en composés nutritifs induite par un défaut de mélange) mais par
la nature de l’écoulement. Par la suite, il sera intéressant de vérifier si la prolongation
du temps de séjour de la matrice dans la suspension cellulaire a pour conséquence
d’augmenter la proportion de cellules agrégées, auquel cas cette configuration pourrait
être transposée à la séparation de cellules. Une autre option pour cette éventuelle
application pourrait être de réduire encore la vitesse de rotation (< 20 RPM) pour
diminuer les contraintes appliquées aux agrégats.

La matrice obtenue présente des caractéristiques communes avec les biofilms :

composition biochimique, présence d’ADN, cellules vivantes. Ses propriétés

246
viscoélastiques, qu’il conviendra de caractériser, permettent aux filaments longs de
résister aux contraintes imposées par les écoulements à faible vitesse de rotation. La
composition exacte, les propriétés physico-chimiques ainsi que la caractérisation
rhéologique de la matrice manquent { ce travail. Avec la caractérisation de l’état de
surface des cellules, ces propriétés permettraient de mieux appréhender les
mécanismes d'adhésion d'une souche bactérienne, tant sous l’aspect de la biochimie que
de la microbiologie dans des conditions hydrodynamiques contrôlées. La
caractérisation de l’état de surface des cellules cultivées dans différentes conditions
d’écoulement permettra également d’infirmer ou de valider l’hypothèse privilégiée {
l’heure actuelle concernant l’origine de l’agrégation cellulaire, { savoir une modification
de la structure des molécules de surface. Une autre approche consiste également à
étudier la réponse transcriptomique des cellules cultivées dans les différents
écoulements, notamment concernant les gènes codant pour la production de
polysaccharides, afin de vérifier si l’agrégation résulte d’une adaptation cellulaire
nécessitant une expression différenciée de certains gènes. A ce stade de nos travaux,
l’élucidation du mécanisme biochimique de l’adhésion, en lien avec l’écoulement et l’état
de surface des cellules, est une perspective essentielle.

Les conditions hydrodynamiques locales auxquelles sont soumises les cellules jouent
donc un rôle important dans l’établissement du phénotype. La simulation numérique
directe des écoulements a permis d’établir une description qualitative et quantitative
des contraintes exercées par l’écoulement sur les particules.

Il apparait alors que, comme pour les flocs minéraux, la taille des agrégats est limitée
par les échelles de la turbulence (écoulements turbulents, 70 et 114 RPM). Dans des
écoulements peu turbulents (Wavy Vortex Flows, 20 et 30 RPM), en revanche, l’agrégat
peut grossir librement jusqu’{ la formation de filaments.

L’analyse des contraintes exercées sur des particules de différentes tailles via l’analyse
de données de simulation numérique montre qu’un cisaillement supérieur { quelque
dizaines de s-1 affecte la croissance du filament mais n’entraine pas la déstructuration
de la matrice une fois formée. Ceci indique que la cohésion de la matrice augmente dans

247
les écoulements à faible vitesse de rotation, lui conférant une meilleure résistance aux
contraintes. Les données numériques montrent, d’autre part, que le cœur des vortex
dans les écoulements tourbillonnaires et tourbillonnaires modulés est le siège d’une
très faible dissipation. Cela explique également le caractère phénotypique observé :
transporté dans de telles structures, l’agrégat a toute la liberté de croitre. La nature,
l’intensité et le niveau de fluctuation des contraintes ont pu être évalués par le suivi
d’une particule lancée dans l’écoulement. Il apparait alors que les cellules subissent des
fluctuations plus faibles en fréquence et en intensité dans les écoulements à 20 et 30
RPM que dans des écoulements à 70 et 114 RPM. Dans ces conditions, la matrice peut se
former et atteindre un niveau de cohésion lui permettant de résister aux contraintes.

Comme nous l'avons précédemment évoqué, le niveau de contrainte mécanique subi par
les cellules est sans doute à l'origine de l'apparition de la matrice, via une modification
de la conformation des molécules décorant la surface (ce qui modifie l’affinité des
cellules entre elles), hypothèse privilégiée { l’heure actuelle, ou bien via l'induction de la
synthèse de molécules. L’outil de simulation numérique offre la possibilité d’évaluer les
niveaux de contraintes subies localement. La cartographie de la dissipation permet
d'accéder au niveau de contrainte moyenne mais ne constitue qu'une description à
l’échelle de la population cellulaire. Le suivi de trajectoire de particule est en revanche
très prometteur. L’apport de ce travail sur ce point est relativement modeste (suivi
d’une seule particule en Euler-Lagrange) et une des premières perspectives est
d’envisager le suivi d’un plus grand nombre de particules afin d’obtenir une meilleure
représentativité.

Enfin, le réacteur Couette, très utile pour cette étude car son hydrodynamique
relativement homogène est bien décrite, n'est pas un réacteur standard pour les
cultures bactériennes. Forts des résultats obtenus en réacteur Couette, il faut les mettre
en perspective avec un réacteur plus classique dans lesquels les écoulements sont bien
souvent plus turbulents et couvrent des niveaux de dissipation d’énergie plus larges. De
ce fait, les conditions hydrodynamiques de ces bioréacteurs sont peu susceptibles
d’engendrer un phénotype tel que nous l’avons observé et sont { l’origine de contraintes
fluctuantes d’amplitude plus importantes pour les cellules. Cependant, nos résultats

248
montrent que, si les niveaux de contraintes subies sont inférieurs à ceux rencontrés
dans les bioréacteurs de type cuve agitée, ces contraintes provoquent une réponse à
l’échelle cellulaire.

249
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Yim S, Shamlou P. 2000. The Engineering Effects of Fluids Flow on Freely Suspended
Biological Macro-Materials and Macromolecules. Influence of Stress on Cell
Growth and Product Formation: Springer Berlin / Heidelberg. p 83.

265
266
TABLE DES ILLUSTRATIONS

LISTE DES FIGURES

Figure I.1 : Spectres de l’´energie cinétique E(σ) et des fluctuations de concentration

G(σ) (d’après Delafosse (2008)

Figure I.2 : représentation schématique des mécanismes de mélange turbulent, d’après

Baldyga et Bourne repris de (Delafosse 2008)

Figure I.3 : Champs de concentration en glucose obtenu par simulation LES (Large Eddy
Simulation) dans un bioréacteur de 22 m3 alimenté en glucose à 500 g/L au taux
de 180 L/h, d’après Enfors et al., 2000.

Figure I.4 – Ordre de grandeur des temps de relaxation des microorganismes (Bailey
and Ollis 1986)

Figure I.5 Expression de la contrainte adimensionnalisée en fonction de la taille de la

particule considérée

Figure I.6 d’après (Yim and Shamlou 2000): estimation de la contrainte minimum
nécessaire à la rupture de la bioparticule considérée.

Figure I.7 (Rusconi et al.) : observation de streamer dans un écoulement laminaire

Figure I.8 d’après Taherzadeh et al. (2010) : perturbation de l’écoulement par un

streamer

Figure I.9 : schéma simplifié des niveaux de régulation et d’observation de la réponse

biologique

Figure I.10: représentation schématique du réacteur Couette

Figure I.11 : transitions dans un réacteur Couette, d’après Andereck, 1986

267
Figure I.12 Schématisation des tourbillons de l’écoulement Taylor vortex flow, d’après
Ohmura et al., (1997)

Figure I.13 (Haut et al., 2003) : visualisation du mélange dans un écoulement

tourbillonnaire

Figure I.14d’après Rudman et al. 2008 : non mixing vortex cores

Figure I.15 : d’après Coufort, 2004 : profil de répartition de la dissipation et du

cisaillement dans un réacteur Couette

Figure I.16 : schéma succinct du système PTS (Görke and Stülke 2008 XXX)

Figure I.17 : voie de la glycolyse (et bilan carbonne)

Figure I.18 : Métabolisme du pyruvate. LDH : lactate deshydrogénase, PFL : pyruvate

formiate lyase, PDH : pyruvate deshydrogénase, PTA : phosphotransacétylase,
ACK : acétate kinase, ADHE : alcool deshydrogénase.

Figure I.19, d’après de Vuyst and Degeest, 1999 XXX : représentation schématique des
voies métaboliques mettant en jeu catabolisme du lactose et synthèse d’EPS chez
Lactococcus lactis fermentant le lactose (transport du lactose via un système
spécifique de phosphotransférase) et les souches Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus and Streptococcus thermophilus, galactose-negative (transport du
lactose via un système d’antiport lactose/galactose). Chez les souches fermentant
le glucose, celui ci est transporté { l’intérieur de la cellule par le système PTS et
entre dans les voies métaboliques sous forme phosphorylée. Les enzymes
impliquées sont numérotées comme suit : 1, phospho-L-galactosidase; 2, L-
galactosidase; 3, glucokinase; 4, phosphoglucomutase; 5, UDP-glucose
pyrophosphorylase; 6, UDP-galactose-4-epimerase; 7, dTDP-glucose
pyrophosphorylase; 8, dehydratase; 9, epimerase reductase; 10, phosphoglucose
isomerase; 11, 6-phosphofructokinase; 12, fructose-1,6-bisphosphatase; 13,
fructose-1,6-diphosphate aldolase; 14, galactose 6- phosphate isomerase; 15,
tagatose 6-phosphate kinase; 16, tagatose-1,6-diphosphatealdolase.

268
Figure I.20 : schéma de la paroi des Gram + , membrane plasmique et peptidoglycane,
d’après Delcour et al. 1999.

Figure II.1 : Illustration du transfert de matière par diffusion vers les cellules et
influence de la concentration moyenne sur le flux transféré

Figure II.2 : représentation schématique du réacteur scale down utilisé par Dunlop

Figure II.3 : Illustration du micromélange par incorporation et de son effet sur le couple
concentration/proportion de la population concernée.

Figure III.1 : photographie de cellules emprisonnées dans un filament. A cellules

vivantes, B cellules totales.

Figure IV. 1: champs instantanés de dissipation pour une section verticale de

l’écoulement { 20 RPM

Figure IV.2 : champs de dissipation locale et champs de vitesse pour un plan vertical de
l’écoulement { 20RPM

Figure IV.3 : zoom sur une boucle de recirculation

LISTE DES TABLEAUX

Table I.1 : échelles caractéristiques du mélange dans un écoulement turbulent

homogène

269
Tableau II.1 : Echelles spatiotemporelles caractéristiques du réacteur Couette utilisé
pour le mélange de glucose.

Tableau II.2 : valeur moyenne du rendement formiate/glucose et écart type pour des
cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○)Figure II.1 : Illustration du transfert de
matière par diffusion vers les cellules et influence de la concentration moyenne
sur le flux transféré

Tableau II.3 : synthèse des résultats de l’expérience de Dunlop

Tableau III.1 : résultats du dosage des polysaccharides liés aux cellules par la méthode à
l’anthrone

Tableau III.2 : résultats du dosage des protéines liées aux cellules par la méthode BCA

Tableau III.3 : affinité pour les solvants selon la méthode MATS .

Tableau III.4 : ratios protéines/polysaccharides

Tableau IV.1: détermination des régimes d’écoulement rencontrés

Tableau IV.2: Valeurs caractéristiques pour différentes vitesses de rotation.

Tableau IV.3 : échelles caractéristiques turbulentes pour les différentes vitesses de

rotation utilisées à partir de la dissipation moyenne

Tableau IV.4 : Valeurs moyenne et moyenne volumique de la dissipation

Tableau IV.6: valeurs moyennes et médianes de l’échelle de Kolmogorov (µm)

Tableau IV.7: valeurs moyennes et médianes du taux de cisaillement (s-1)

270
Tableau IV.8 : fréquence des perturbations

Tableau IV.10 : Contraintes s’exerçant sur des bactéries ou ensembles de bactéries dans
les zones inertielle diffusive et inertielle convective

LISTE DES GRAPHES

Graphes II.1 : croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction du temps pour
des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○)

Graphes II.2 : taux de croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction de la

biomasse (évaluée en termes de densité optique à 580 nm) pour des cultures à
20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○)

Graphe II.3 : évolution de la concentration en glucose pour des cultures à 20 RPM

(■ □) et 114 RPM (● ○).

Graphe II.4 : concentration en lactate en fonction du temps pour des cultures à 20 RPM
(■ □) et 114 RPM (● ○).

Graphe II.5 : concentration en formiate en fonction du temps pour des cultures à 20

RPM (■ □) et 114 RPM (● ○)

Graphes II.6 : concentration en formiate en fonction du glucose résiduel pour des

cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM (● ○)

Graphe II.7 : vitesse spécifique de production de formiate en fonction de la

concentration en glucose résiduelle pour des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM
(● ○). Les vitesses spécifiques moyennes à 20 RPM (-) et 114 RPM (--) sont
également indiquées.

Graphe II.8 : évolution de la densité optique pour des cultures à 20 RPM (□, différentes
nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris)

271
Graphe II.9 : taux de croissance de Lactococcus lactis NCDO 2118 en fonction de la
biomasse (évaluée en termes de densité optique à 580 nm) pour des cultures à
20 RPM (□, différentes nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de
gris)

Graphe II.10 : évolution de la concentration en glucose pour des cultures à 20 RPM (□,
différentes nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris)

Graphe II.11: évolution de la concentration en lactate pour des cultures à 20 RPM (□,
différentes nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris)

Graphe II.12 : évolution de la concentration en formiate pour des cultures à 20 RPM (□,
différentes nuances de gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris)

Graphe II.13 : évolution de la concentration en formiate en fonction de la concentration

en glucose résiduelle pour des cultures à 20 RPM (□, différentes nuances de
gris) et 114 RPM (○, différentes nuances de gris) et courbes de régression
linéaire 20 RPM (-) et 114 RPM (--).

Graphe II.14 : vitesse spécifique de production de formiate en fonction de la

concentration en glucose résiduelle pour des cultures à 20 RPM (■ □) et 114 RPM
(● ○).

Graphe II.15 : Effet de la ségrégation sur l’assimilation de substrat { concentration en

substrat élevée

Graphe II.16 : effet de la ségrégation lorsque la concentration moyenne en substrat est

faible (tk=500ms)

Graphe IV.1 : stabilisation du couple pour des simulations { 20 RPM (l’’axe des
ordonnées correspond à un coefficient de calcul proportionnel au couple)

272
Graphe IV.2 : valeur du couple en fonction du reynolds d’après Wendt (empirique),
Coufort (mesure) et

Graphe IV.3 : dissipation en fonction du Reynolds, obtenue par calcul et numériquement

Graphe IV.4 : profil du moment angulaire normalisé pour des simulation en DNS de
l’écoulement { 20 RPM

Graphe IV.5 : Profil de la composante tangentielle de la vitesse en moyenne spatiale et

temporelle (en gras) dans un plan horizontal z=10 pour différents champs
instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s (∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5=
t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

Graphe IV.6 : Profil de la composante axiale de la vitesse en moyenne spatiale et

temporelle (en gras) dans un plan horizontal z=10 pour différents champs
instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s (∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5=
t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

Graphe IV.7 : Profil de la composante radiale de la vitesse en moyenne spatiale et

temporelle (en gras) dans un plan horizontal z=10 pour différents champs
instantanés : t0 (◊), t1= t0+2s (□), t1= t0+4s (∆),t3= t0+6s (x), t4= t0+8s (*), t5=
t0+10s (○), t6= t0+12s (+).

Graphe IV.8 : Profil de vitesse radiale à 20 RPM pour des plans horizontaux de hauteur
z=2, 6, 12 et 14 cm

Graphe IV.9 : Profil de vitesse axiale à 20 RPM pour des plans horizontaux de hauteur
z=2, 6, 12 et 14 cm

Graphe IV.10 : Profil de vitesse tangentielle à 20 RPM pour des plans horizontaux de
hauteur z=2, 6, 12 et 14 cm

Graphe IV.11 : profil de la vitesse tangentielle moyennée sur un plan vertical (z= 14 cm)
pour différentes vitesses de rotation

273
Graphe IV.12 : profil de la vitesse axiale moyennée sur un plan vertical (z= 14 cm) pour
différentes vitesses de rotation

Graphe IV.13 : profil de la vitesse radiale moyennée sur un plan vertical (z= 14 cm) pour
différentes vitesses de rotation

Graphe IV.14 : les profils de vitesse tangentielle de la vitesse moyenne obtenus

expérimentalement par Coufort à 30 RPM (♦),50 RPM (□),70 RPM (▲),90 RPM
(○) et 110 RPM (●).

Graphe IV.15 : distribution en nombre de la dissipation sur un plan x=0 à différents

instants pour l’écoulement { 20 RPM

Graphe IV.16 : profil de dissipation moyennée dans un plan vertical dans l’entefer { 20
RPM (○), 30 RPM (+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)

Graphe IV.17 : distribution volumique de la dissipation sur un plan x=0 pour des
écoulements à 20, 30, 70 Tableau IV.5 : valeurs moyennes et médianes de la
dissipation pour les différents écoulements considérés

Graphe IV.18 : profil de l’échelle de Kolmorogov* moyennée dans un plan vertical dans
l’entefer { 20 RPM (○), 30 RPM (+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)

Graphe IV.19 : distribution volumique de l’échelle de Kolmogorov sur un plan x=0 pour
des écoulements à 20, 30, 70 et 114 RPM.

Graphe IV.20 valeurs médiane (□), moyenne (■)et la plus probable selon Coufort (▲)de
l’échelle de Kolmogorov en fonction de la vitesse de rotation du cylindre interne

Graphe IV.21 : profil du taux de cisaillement moyenné dans un plan vertical dans
l’entefer { 20 RPM (○), 30 RPM (+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*)

Graphe IV.22 : distribution volumique du cisaillement sur un plan x=0 pour des
écoulements à 20, 30, 70 et 114 RPM.

274
Graphe IV.23 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une
particule le long de sa trajectoire à 20 RPM

Graphe IV.24 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une
particule le long de sa trajectoire à 30 RPM

Graphe IV.25 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une
particule le long de sa trajectoire à 70 RPM

Graphe IV.26 : Niveau de dissipation normée par la dissipation moyenne vue par une
particule le long de sa trajectoire à 120 RPM

Graphe IV.27 : Amplitude des contraintes vues par une particule le long de sa trajectoire
à 20 RPM

Graphe IV.28 : Amplitude des contraintes vues par une particule le long de sa trajectoire
à 120 RPM

Graphe IV.29: Alternance des contraintes de compression et d’élongation vue par une
particule le long de sa trajectoire à 20 RPM

Graphe IV.30 : Alternance des contraintes de compression et d’élongation vue par une
particule le long de sa trajectoire à 120 RPM

Graphe IV.31 : Distribution volumique de la taille des agrégats à 20 RPM (○), 30 RPM
(+), 70 RPM (□) et 120 RPM (*).

Graphe IV.32 : comparaison entre la taille des agrégats(▲) et les échelles de

Kolmogorov médiane (□) et moyennes (■)Tableau IV.9 : taille des agrégats
rapportés à la dissipation et au cisaillement

Graphe IV.33 : évolution de la taille des agrégats de taille inférieure à 1mm en fonction
du taux de cisaillement

275
276
ANNEXE 1 : CULTURE DE LACTOCOCCUS LACTIS NCDO 2118

1 SOUCHES

La majeure partie des cultures conduites au cours de cette thèse a été réalisée avec la
souche Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118. Cette souche a été choisie car elle
présente la particularité de répondre à une modification du flux glycolytique par un
shift métabolique, comme expliqué précédemment.

Des essais complémentaires ont été réalisés avec Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403,
d’origine laitière et curée de tous ses plasmides, et Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis LD61, souche laitière industrielle de la collection SOREDAB.

2 CULTURES

2.1. Milieux de cultures

Au cours de cette étude, deux milieux de culture ont été utilisés pour les cultures des
différentes souches du genre Lactococcus : un milieu riche et un milieu chimiquement
défini (MCD).

Le milieu riche M17 (M17 broth - OXOID LTD., Basingstoke, Hampshire, England) est
composé de tryptone (5 g/L), peptone de soja (5 g/L), extrait de viande (5 g/L),
extrait de levure (2,5 g/L), acide ascorbique (0,5 g/L), sulfate de magnésium (0,25
g/L) et di-sodium glycérophosphate (19 g/L). La source carbonée, ici le glucose, est
ajoutée en fonction de la concentration finale désirée (5 ou 25 g/L).

La composition du milieu chimiquement défini est rappelée dans les tableaux ci-
dessous. Après reconstitution, le pH est ajusté à 6,6 et le milieu est conservé à 4°C et
utilisé dans les 5 jours suivant sa préparation.

277
  Sucres et sels

Concentration Concentration
Composé Composé
(g/L) (g/L)

Glucose 25 MgCl2, 6H2O 0.2

Acétate de sodium 1 FeSO4, 7 H2O 0.011

Citrate d’ammonium 0.6 CaCl2, 2H2O 0.05

KH2PO4 9 ZnSO4, 7H2O 0.005

K2HPO4 7.5 CoCl2, 6H2O 0.0025

 Acides aminés

Concentration Concentration
Composé Composé
(g/L) (g/L)

Alanine 0.24 Sérine 0.34

Arginine 0.12 Thréonine 0.23

Asparagine 0.34 Tryptophane 0.05

Glutamine 0.51 Valine 0.33

Glycine 0.17 Isoleucine 0.2

Histidine 0.11 Leucine 0.47

Lysine 0.35 Phénylalanine 0.28

Méthionine 0.12 Tyrosine 0.29

Proline 0.68 Cystéine 0.17

278
  Bases azotées

Concentration Concentration
Composé Composé
(g/L) (g/L)

Adénine 0.01 Uracile 0.01

Guanine 0.01 Xanthine 0.01

 Vitamines

Concentration Concentration
Composé Composé
(g/L) (g/L)

Biotine 0.01 Acide nicotinique 0.001

Riboflavine 0.001 Inosine 0.005

B12 (Cyano-cobalamine) 0.001 Pyridoxine 0.002

Pantothénate de calcium 0.001 Thiamine 0.001

Acide Lipoique 0.0025 Thymidine 0.005

Acide folique 0.001

2.2. Techniques de culture

2.2.1. Conservation des souches

Des cellules en phase exponentielle de croissance réalisées sur milieu M17 (glucose 5
g/L) sont conservées dans des cryotubes à -80 °C avec 20 % (V/V) de glycérol.

279
2.2.2. Précultures

Les précultures sont réalisées dans des fioles scellées, dans le milieu choisi pour la
fermentation. Une première préculture est réalisée à partir de cellules décongelées
(inoculation 1,5 % V/V, incubation une nuit à 30 °C sous agitation). La seconde
préculture est réalisée à partir de la précédente (inoculation 4 % V/V) dans les mêmes
conditions de milieu et d’incubation. Les cellules issues de cette préculture sont ensuite
ensemencées dans le réacteur alors qu’elles sont en phase de croissance.

2.2.3. Cultures batch en réacteur

Les cultures ont été réalisées dans deux réacteurs Couette et un fermenteur
parfaitement mélangé.

[Link]. Réacteurs Couette

Un réacteur Couette est constitué de deux cylindres concentriques. L’espace inter-

annulaire appelé entrefer, contient le milieu de culture.

Le réacteur principalement utilisé est constitué des deux cylindres concentriques

suivants :

 un cylindre interne rotatif en PVC de rayon R1 = 100 mm,

 un cylindre externe fixe en plexiglas de rayon R1 = 115 mm.

L’espace annulaire e entre ces deux rayons est de 15 mm et le ratio des diamètres η =
0,87. La hauteur des deux cylindres, H = 200 mm, confère au dispositif un rapport de
forme H/e ≈ 13.3. Le volume utile du réacteur est de 2 L.

Les vitesses de rotation du cylindre interne vont de 5 à 110 RPM avec une précision de 3
RPM. Cette installation repose sur un socle externe carré fait en aluminium. Le schéma
simplifié de l’installation est donné dans la figure XXX. Ce réacteur a été adapté afin de
permettre la culture bactérienne en son sein. Il a en particulier été équipé d’un dispositif
de régulation de température et de pH.

280
Des essais ont également été réalisés dans un réacteur Couette de caractéristiques
légèrement différentes :

 cylindre interne rotatif en PVC de rayon R1 = 100mm,

 cylindre externe fixe en PVC de rayon R1 = 120 mm.

L’espace annulaire e entre ces deux rayons est de 20 mm et le ratio des diamètres η =
0,83. La régulation de température est assurée par une circulation externe de liquide.

[Link]. Réacteur Parfaitement Mélangé

Certaines cultures sont réalisées dans des fermenteurs de 2 L (SGI) équipés d'une
turbine de Rushton. Les fermenteurs sont autoclavés (121 °C, 20 min) remplis d’eau. Le
milieu est ensuite introduit stérilement dans le fermenteur puis dégazé { l’azote
pendant 30 min.

2.2.4. Conditions de culture régulation du pH, température

Un module SGI permet de réguler les différents paramètres de culture. L’agitation est
fixée à 80 RPM et la température est maintenue constante à 30 °C par une barre
chauffante et un circuit de refroidissement par circulation d’eau. Le pH est régulé { 6,6

281
par ajout automatique de KOH 5 N. Les fermenteurs sont inoculés avec 60 mL de
préculture à DO = 1.

2.2.5. Echantillonnage et suivi de la croissance

La concentration cellulaire est évaluée par mesure de la densité optique (DO) à 580 nm
{ l’aide d’un spectrophotomètre. Si nécessaire, les échantillons sont dilués pour rester
dans la gamme de linéarité de l’appareil (DO < 0,6).

La corrélation établie par Even XXX (2001) permet d’accéder { la concentration en

biomasse X en g.l-1 à partir de la mesure de la DO à 580 nm : X = 0,3 × DO.

2 x 1ml d’échantillons sont également régulièrement prélevés et centrifugés (3 min – 12

000 RPM – 4 °C) et le surnageant conservé à -18 °C pour des analyses ultérieures.

282
ANNEXE 2 : CHIMIE ANALYTIQUE

1 DOSAGES BIOCHIMIQUES

1.1. Dosage des polysaccharides par la méthode à l’anthrone

Réactif : Anthrone ({ préparer le jour même de l’analyse)

 20 mg d’anthrone en poudre

 10 mL d’H2SO4 concentré

Ces dosages sont réalisés en microplaques avec 50 µL d’échantillon + 200 µL de réactif à

l’anthrone. La plaque est homogénéisée au shaker avant d’être incubée 20 min { 60 °C.
Les absorbances à 620 nm sont ensuite lues au spectrophotomètre dans des micro
cuves.

Pour chaque série d’analyses, une gamme étalon en glucose (de 0 à 0,15 g/L) est traitée
simultanément. Chaque étalon de la gamme et chaque échantillon sont dosés en
triplicats.

1.2. Dosage des sucres et acides en HPLC

Les surnageants des échantillons prélevés lors des cultures sont analysés par
chromatographie liquide { haute pression (HPLC). Le système d’HPLC (Hewlett Packard
series 1050) est équipé d’un passeur automatique (Waters 717 Autosampler), d’une
précolonne (Biorad Microguard) et d’une colonne de type H+ (Biorad HPX87H) qui
effectue une séparation par échange d’ions et exclusion. L’analyse des échantillons est
réalisée à 48 °C et avec un débit d’éluant (H2SO4 5 mM) de 0,5 [Link]-1. La détection est
assurée par un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer LC90Bio) à 210 nm pour le lactate
et le formiate, et par un réfractomètre (Hewlett Packard series 1047A) pour le glucose,
tous deux branchés en série. Les concentrations de ces composés dans les surnageants
de culture sont déterminées grâce au dosage de solutions étalons.

283
1.3. Dosage des protéines

La quantification des protéines par la méthode { l’acide bicinchonique (BCA) implique la

formation d’un complexe BCA-Cu2+ de couleur pourpre dont l’intensité est mesurée à
570 nm.

Le kit de dosage par la méthode au BCA est constitué de deux solutions :

 une solution A contenant de l’acide bicinchonique, du carbonate de

sodium, du bicarbonate de sodium, du tartrate de sodium. Les composés
sont dissous dans de la soude 0.1N.

 une solution B contenant du cuivre pentahydraté (CuSO4 5H2O) 4 % (w/v)

La solution de travail BCA se prépare en mélangeant la solution A et B dans des

proportions 50/1.

Ces dosages sont réalisés en microplaques : 25 µL d’échantillon sont mélangés avec 200
µL de solution de travail BCA. L’ensemble est agité sur le shaker avant d’être incubé { 60
°C pendant 30 min. Après refroidissement { température ambiante, l’absorbance est
mesurée à 570 nm.

Une gamme étalon de BSA à différentes concentrations (0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1,
0.25, 0.5, 0.75 g/L) est traitée de manière identique en parallèle.

Chaque échantillon est dosé en triplicat.

1.4. Quantification des polysaccharides par précipitation à l’éthanol

Le protocole d’extraction et de quantification des exopolysaccharides dans le milieu de

culture contenant des cellules en phase stationnaire est adapté des travaux de Jung et al.
(2008). 4 % (W/V) d’acide trichloroacétique est ajouté au milieu, l’ensemble est chauffé
100 °C pendant 20 min (dénaturation des protéines et amélioration du détachement des
EPS de la surface cellulaire) puis centrifugé (4000 RPM/4 °C/15 min). Le mélange
éthanol-surnageant (50 % V/V) est ensuite agité sur rouleaux d’agitation pendant 48 h {

284
4 °C. Les EPS ainsi précipités sont ensuite filtrés (filtres millipores 0.45 µm), séchés (24
h / 60 °C / 0.2 atm) et pesés.

285
286
ANNEXE 3 : MESURES PHYSICOCHIMIQUES

1 QUANTIFICATION DE L’AFFINITE POUR LES SOLVANTS – MATS (MICROBIAL ADSORPTION

TO SOLVENTS)

Cette technique permet de caractériser certaines propriétés physicochimiques

(caractère hydrophile-hydrophobe, donneur ou accepteur d’électrons) des surfaces des
cellules.

La mesure est réalisée sur des cellules lavées deux fois dans de l’eau physiologique
(NaCl 9 g/L). Quatre solvants sont testés : chloroforme, acétate d’éthyle, hexadécane et
décane. Après mélange intime entre la phase cellulaire aqueuse et le solvant, l’affinité
pour ledit solvant est fonction de la proportion de cellule restant dans la phase aqueuse
après séparation des phases (décantation pendant 15 min).

DOinit
Affinite  1   100
DO finale

2 MESURES GRANULOMETRIQUES

Le suivi de la taille moyenne des cellules et des agrégats au cours des premières heures
de fermentation a été réalisé { l’aide d’un granulomètre Mastersizer Malvern.

Les échantillons sont dilués dans de l’eau additionnée de NaCl { 9g/L, puis le volume
d’échantillon est ajusté afin de se situer dans une zone définie d’obscuration du laser.
Ici, c’est la zone 5 – 15 % qui est choisie. Il est nécessaire de définir cette zone dans
laquelle les distributions sont ‘linéaires’. En effet, un échantillon, trop concentré
(obscuration > à la limite supérieure fixée) ou pas assez concentré (obscuration < à la
limite inférieure), renverra des distributions très différentes. La zone de ‘linéarité’
correspond à la zone dans laquelle les distributions renvoyées sont identiques.

287
3 TRAITEMENTS D’EXTRACTION

3.1. Séparation des cellules et de la matrice filamenteuse

3.1.1. Traitement aux ultrasons

A l’issue de la fermentation, on récolte 400 mL de milieu de culture, répartis en 8 flacons

à centrifuger de 50 ml.

Les cellules sont lavées 3 fois selon le protocole suivant : centrifugation 20 min à 4000
rpm et 4 °C, élimination du surnageant, compléter à 50 ml avec du tampon PBS.

A l’issue de la dernière centrifugation, les culots sont récoltés dans un seul flacon et le
volume complété à 50 ml avec du PBS.

Le traitement aux ultrasons est réalisé avec un appareil (Bioblock Scientific Vibra Cell
72412) dont la fréquence est 20 KHZ et la puissance est de 600W. L’amplitude de
l’appareil est réglée { 20 % ; soit pour le traitement de 50 ml de solution, une puissance
volumique de 2,4 W/ml. La sonde de diamètre 1 cm est plongée dans 1 cm
d’échantillon. Chaque cycle comprend une phase de traitement (20 s - 2,4 W/ml – 0 °C)
et une phase de refroidissement (1 min – 0 °C). Après 4 cycles, l’échantillon est
centrifugé et le surnageant conservé à -18 °C.

3.1.2. Vérification de la lyse cellulaire par le dosage de l’activité LDH

La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme intracellulaire catalysant la réduction

du pyruvate en lactate, réaction associée à l’oxydation du NADH en NAD.

288
Le dosage de l’activité de LDH s’effectue par la mesure de la diminution de NADH
(coefficient d’extinction à 340 nm de 6223 [Link]-1) qui peut être suivie par lecture de
l’absorbance { 340 nm, en fonction du temps. La solution de mesure de l’activité
enzymatique contient 250 µL de PBS, 100 µL de MgCl2 (50 mM), 100 µL de NADH (6
mM), 400 µL d’eau et 100 µL de surnagent après traitement aux ultrasons. 50 µL de
pyruvate (400 mM) sont ajoutés dans la solution pour initier la réaction. L’absorbance {
340 nm est suivie à 30 °C pendant 10 min, une mesure étant faite toutes les 12 s. La
cinétique d’absorbance est collectée par l’enregistreur du spectrophotomètre (Hewlett
Packard 8453).

289
290
ANNEXE 4 : FLUORESCENCE ET MICROSCOPIE

1 ECHANTILLONNAGE ET PREPARATION

Les échantillons sont prélevés en fin de fermentation. Des brins de filaments sont
récoltés { l’aide d’une aiguille stérile plongée dans le milieu de culture. Après quelques
secondes, celle-ci est entourée de masse filamenteuse. Elle est alors délicatement retirée
et l’échantillon est placé dans un tube Eppendorf. Le fait de travailler avec des
échantillons récoltés en fin de culture permet de s’affranchir de la présence de glucose
résiduel.

Les échantillons sont ensuite fixés selon une méthode décrite par Böckelmann et al.
(2002) selon le protocole suivant : cellules + PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde
(PFA), incubation 2 h à 4 °C, 3 lavages successifs dans du PBS, centrifugation 10000
RPM – 5 min puis élimination du surnageant et ajout de 500 µL de PBS au culot.

Les échantillons fixés sont ensuite déshydratés (condition sinequanone à la fixation des
lectines) : l’échantillon est mis au contact de solutions d’éthanol de concentration
croissante (50 % , 80 % et 96 % V/V) pendant 3 min.

2 FISH (FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION)

Après fixation et déshydratation, les échantillons sont hybridés. Chaque échantillon est
traité avec 100 µL de solution d’hybridation et 10 µL de solution de sonde à 50 ng/µl. La
sonde utilisée ici est la sonde universelle bactérienne EUB338-cy3 (Aman et al. 1990).
Les échantillons sont incubés pendant 1,5 h, à 46 °C et dans l’obscurité.

Les échantillons hybridés sont ensuite lavés avec la solution de lavage pendant 10 min à
48 °C et rincés 3 fois { l’aide de la solution de lavage.

Enfin, chaque échantillon est rincé 2 fois avec le tampon de lavage.

Les compositions des solutions sont rappelées ci-dessous :

291
Solution d’hybridation Solution de lavage

0.9 M NaCl 0.15 M NaCl,

20 mM Tris-HCl pH 8 20 mM Tris-HCl pH 8

25 % formamide 5 mM EDTA

0.02 % de SDS. 0.01 % SDS (SodiumDodecylSulfate)

Sonde Tampon de lavage

50 ng/L EUB338-cy3 88 mM NaCl

20 mM Tris-HCl pH 8

0.01 % SDS

3 MARQUAGE PAR DES LECTINES

Chaque lectine (Sigma Aldrich inc.) est marquée au FITC (Fluorescein isothiocyanate).
L’origine, le nom commun, les sucres spécifiques aux lectines utilisées ainsi que les
concentrations sont résumés dans le tableau suivant.

Les échantillons traités selon les protocoles décrits précédemment sont incubés en
présence de 100 µL de lectine pendant 30 min à température ambiante et { l’obscurité.
Chaque échantillon ainsi marqué est ensuite lavé 5 fois avec le tampon de rinçage afin
d’éliminer les lectines non fixées. Il convient ici de faire très attention { ne pas détruire
l’échantillon et le lavage s’opère en éliminant les surnageants { la pipette.

Les échantillons ainsi hybridés et marqués sont ensuite délicatement déposés sur les
lames multi puits et séchés pendant 1 nuit { 35 °C avant d’être observés en microscopie
confocale à épifluorescence.

292
 Sucre(s) specifique(s)
Nom commun Taxonomie (selon les specifications Concentration
du fournisseur)

Carnivalia Concanavalin A -glucose, -mannose 0.12 mg/ml

ensiformis

Lentil Lens culinaris -D-mannosyl and -D- not specified

glucosyl residues

Griffonia Bandeiraea -D-galactosyl residues not specified

simplicifolia simplicifolia and N-acetyl--D-
galactosaminyl residues

Coral tree Erythina D-galactose and D- 0.04 mg/ml

cristagalli galactosides

characteristics of the lectins used in the lectin-binding assays of L. lactis NCDO 2118

4 MICROSCOPIE CONFOCALE ET EPIFLUORESCENTE, CFDA ET SYTO 61

4.1. Intérêt et principe de la microscopie confocale

La microscopie confocale permet de faire des visualisations avec une très faible
profondeur de champs, ce qui a pour conséquence d’obtenir des images avec une
résolution améliorée par rapport aux techniques de microscopie optique. Cette
technique présente un intérêt certain pour l’observation d’échantillons d’une certaine
épaisseur car cela permet de faire des images dans une coupe de très faible épaisseur.
La superposition des plans ainsi obtenus permet de réaliser une image en 3D de
l’échantillon.

4.2. Epifluorescence

L’échantillon, dont les molécules d’intérêt ont été préalablement marquées par une
molécule liée à un fluorochrome, est soumis à une excitation laser. La molécule
fluorescente, excitée par des rayons lumineux d’énergie appropriée, réémet un signal

293
fluorescent. C’est ce signal qui est ensuite filtré par le sténopé du microscope et
transmis { l’observateur.

Les marqueurs utilisés dans cette étude portent différents fluorochromes dont les
longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont résumées dans le tableau suivant
(tableau XXX)

Fluorochrome Longueur d’onde excitatrice Longueur d’onde émise

FITC 494 nm 521 nm

Cy3 512 – 550 nm 570 – 615 nm

marqueurs fluorescents, longueurs d’ondes caractéristiques

4.3. Observation des échantillons hybridés et marqués par les lectines

Pour permettre une meilleure visualisation, une goutte de cytifluor est déposée à la
surface de chaque échantillon. Ceux-ci sont observés { l’immersion avec un microscope
confocal à épifluorescence (Leica TCS SP2 with argon, GreNe and HeNe laser).

La reconstruction des images est effectuée { l’aide du logiciel Volocity (PerkinElmer).

294
ANNEXE 5 : METHODOLOGIE D’IDENTIFICATION DES PARAMETRES DE MELANGE
CRITIQUE

Cette série d’expérience permet d’identifier le ou les mécanismes de mélange contrôlant

une réaction. Cette méthodologie s’applique particulièrement { des réacteurs alimentés
(réacteurs continus et fed batch) et agités mécaniquement. Pour ces réacteurs, cinq
paramètres physiques dont dépend le mélange sont identifiés.

vitesse d’agitation (N)

Temps caractéristique de l’alimentation (tF)
Position du point d’alimentation
Nombre de points d’alimentation (nF)
Viscosité du milieu (μ)

Série d’expériences permettant d’identifier le ou les mécanismes de mélange contrôlant une réaction,
d’après Bourne.

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