TPE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
THEME : TECHNIQUE DE RESTRICTION
ENZYMATIQUE ET D’HYBRIDATION
NOMS DES ETUDIANTS
GAN-NAA KAMENI DAVID
LIHAN JOSEPH LANDRY
SAMBO ZEWA DANIEL. A
TECHNIQUE DE RESTRICTION ENZYMATIQUE ET D’HYBRIDATION 1
PLAN
INTRODUCTION
I. LA RESTRICTION ENZYMATIQUE
Définition
Fonction des enzymes de restriction
Caractéristiques
II. HYBRIDATION
1. Définition
2. Types d’hybridation
3. Principe
4. Procédé
CONCLUSION
TECHNIQUE DE RESTRICTION ENZYMATIQUE ET D’HYBRIDATION 2
INTRODUCTION
Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des bactéries pour se
protéger des infections de virus (bactériophages). Ces enzymes coupent l’ADN viral a
des endroits spécifiques. Ce mécanisme de résistance aux bactériophages, dénommé
restriction, fut étudié par W. ARBER à l’université de Genève dans les années 60.
Aujourd’hui plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes sont disponibles
commercialement. Elles font parties des outils (ciseaux moléculaires) indispensable aux
biologistes moléculaires. Ces outils permettent de couper l’ADN afin d’isoler certains
fragments, de construire des cartes génétiques (cartes de restriction), de créer de
nouvelles combinaisons d’ADN etc… Les enzymes de restrictions ont dont permis
l’avènement de la biologie moléculaire. Dans cette même perspective, l’hybridation quant
à elle nécessite un apport d’énergie et prédit la géométrie dans un autre cadre. Les
liaisons covalentes dans les molécules poly atomiques sont formées par le recouvrement
d’orbitales non hybrides (les liaisons obtenues suite à une hybridation ne s’écartent pas
du modèle de liaison de valence). Cette apport d’énergie suscitée par l’hybridation est
dont compensée par l’énergie libérée durant la formation des liaisons. Dans ce travail,
nous allons étudier tour à tour les techniques de restrictions enzymatiques en s’attardant
sur les différentes fonctions et leurs caractéristiques ainsi que l’hybridation dans son sens
globale.
TECHNIQUE DE RESTRICTION ENZYMATIQUE ET D’HYBRIDATION 3
I. LA RESTRICTION ENZYMATIQUE
Definition
Les enzymes de restriction sont une sorte de ciseaux moléculaires servant à couper
l’ADN en des sites bien précis. Ces enzymes sont des endonucléases (situe entre les
nucléotides); elles possèdent donc un site actif d’hydrolyse de l’ADN, mais aussi un site
de reconnaissance de la séquence cible aussi appelée site de restriction.
Fonction des enzymes de restriction
Chaque enzyme de restriction reconnait et coupe spécifiquement une séquence
particulière de bases nucléotidiques, de quatre à une dizaine de paires de bases
Produite par les bactéries, les enzymes de restriction sont un moyen de défendre
contre les infections par les virus. En effet, elles coupent en petit morceaux l’ADN de ces
intrus, ce qui restreint leur infectiosite (d’où le nom de ces enzymes). Les bactéries sont-
elles même protégées par ces enzymes car elles méthyles leur propre génome, ce qui
empêche les enzymes de reconnaitre l’ADN bactérien comme une cible.
Elles sont très utiles en biologie moléculaire pour extraire ou recombiner des
morceaux d’ADN lors du clonage. On utilise beaucoup EcoRI, BamHI ou
encore HindIII, qui reconnaissent respectivement les séquences GAATTC,
GGATCC, AAGCTT.
Caractéristiques
Les enzymes de restriction proviennent des bactéries. Leur rôle est de couper L’ADN
étranger des virus qui infecte les bactéries, les bactériophages. Ainsi celles-ci empêchent
les virus de se multiplier et permettent aux bactéries de survivent.
Les enzymes de restriction sont de 4 types (type 1,2, 3, 4) ayant chacune des
caractéristiques bases sur la structure, le besoin en cofacteurs et leurs spécificités de
clivage.
Les enzymes de Type 1 coupent l’ADN sur un site aléatoire loin de la
séquence de reconnaissance. Ces enzymes ont besoin d’ATP et de SAM(S-
adénosyl-L-méthionine) pour fonctionner.
Les enzymes de types 2 coupent l’ADN dans ou près de la séquence de
reconnaissance. Ces enzymes ne requièrent pas d’ATP et sont indépendantes
de la methylase. Les enzymes de types 2 sont endonucléases de restriction les
plus utiles pour le travail de laboratoire. Toutes nos enzymes de restriction
NIPPON Génétics EUROPE sont de type 2.
Les enzymes de types 3 coupent l’ADN a environs 20-25 paires de bases de
la séquence de reconnaissance. Elles ont besoin D’ATP et de SAM pour
fonctionner.
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Les enzymes de types 4 coupent uniquement l’ADN modifier classiquement
de l’ADN méthyle. Et ce, contrairement aux types 1 à 3 qui sont
généralement inhibes par la méthylation.
II. HYBRIDATION
1. Définition
L’hybridation moléculaire est la propriété que présente une molécule d’acide
nucléique monobrin de s’associer spontanément et de façon spécifique et réversible
à une autre molécule monobrin qui lui est complémentaire.
L’hybridation moléculaire est permise par les liaisons hydrogènes que peuvent
établir les bases puriques et pyrimidiques qui constituent les deux brins d’acides
nucléiques.
La force de liaison entre les deux brins d’ADN (ou d’ARN) dépend du nombre de
liaisons hydrogène qui lient les deux brins entre eux.
L’hybridation moléculaire est :
spécifique : sous certaines conditions expérimentales, un monobrin ne peut s'apparier
qu’avec un autre monobrin de séquence complémentaire.
Réversible : l’expérimentateur peut, en jouant sur les conditions expérimentales
(essentiellement la température du milieu réactionnel et sa composition) réaliser ou au
contraire supprimer (dissociation) l’hybridation de deux molécules.
On distingue à la fin des hybrides : ADN-ADN (homoduplex) ou ADN-ARN
(hétéroduplex).
2. Types de l’hybridation
L’hybridation peut se réaliser sur des échantillons :
- En solution (hybridation en phase liquide)
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- Fixée sur support solide (hybridation sur support solide) :
-immobilisation sur membrane, sur verre
-colonies bactériennes
-chromosome
-coupe de tissues ...
3. Principe générale de l’hybridation
Détecter une molécule que l’on appellera « cible » (ADN, ARN ou une protéine) dans
un mélange en contenant des millions similaires mais non identique.
Par exemple :
Rechercher si un gène est présent chez une personne donnée.
Rechercher si un ARN est présent dans un type tissulaire donné (muscle).
Rechercher si la protéine particulière est présente dans le sang d’une personne.
Pour cela on utilise une molécule appelée sonde qui va se fixer/hybrider spécifiquement
au type moléculaire recherché.
Hybridation Signale
Cible Sonde
Complexe sonde/cible
NB : C’est donc l’association spécifique d’une sonde et une cible qui définit une hybridation.
Lors d’une hybridation les types de cible pouvant être recherché sont :
o ADN:
- Rechercher si un gène est présent ou absent dans une cellule.
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- Identifier un réarrangement d’un gène.
o ARN:
- Étudier l’expression d’un gène dans des conditions différentes.
- Détecter l’expression d’un gène dans un tissu donné.
o Protéines:
- Rechercher la présence d’une protéine dans des conditions différentes.
- Détecter la présence d’une protéine dans un tissu donné.
Egalement au niveau des sondes quelques caractéristiques sont prisent en compte à
savoir :
o Les différents types de sondes
ADN : simple brin,
pas de sonde double
brins
ARN : appelé
ribosonde
Protéines : ces sondes sont dans la très grande majorité des cas des anticorps
o Les propriétés d’une sonde:
Reconnaître de manière spécifique la cible recherchée.
Émettre un signal (détection).
o Les différents types de signaux portés par les sondes :
En fonction du type de marquage utilisé (radioactif ou fluorescent) selon les stratégies tel que
(Nick translation « déplacement de brèche », Multi-amorçage au hasard, Marquage des
extrémités5’, PCR) on obtient des signaux suivant :
Les signaux dits « chauds » →Émission de radioactivité (utilisant soit le radio-isotope
phosphate32 soit l’hydrogène3=tritium)
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Les signaux dits « froids » →Émission d’un signal lumineux (Marquage direct avec
fluorophore tel que la Cyanine5 ou 3, ou marquage indirect où le nucléotide est marqué par un
reporteur qui sera lui-même repéré par une molécule affine couplé à un fluorochrome)
Dans le marquage indirect les étapes se subdivise en :
o Incorporation d’un nucléotide modifié non fluorescent (digoxigénine ou biotine) au
cours de la synthèse ;
o Utilisation d’un anticorps couplé à un fluorochrome complémentaire aux nucléotides
modifiés.
Les sondes peuvent être des produits de PCR ou issu d’un clonage et pouvant être marquer
pendant leur synthèse (par PCR) ou après leur synthèse (par les autres stratégies).
Principe :
a. Hybridation : Fixation spécifiques de la
sonde au niveau de sa cible.
Hybridation
La vage
b. Lavage : Élimination des sondes
qui ne sont pas fixer de façon
spécifique.
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Détection
c. Détection : On recherche si du signal est
encore présent dans l’échantillon après le
lavage. Un signal = la cible est présente
4. Procédé de l’hybridation
o Hybridation en phase liquide :
Les segments complémentaires sont placés dans une solution contenant un tampon et de la
formamide. L’agitation thermique assure la liaison entre les fragments complémentaires.
Cette température est généralement inférieure à 15°C de la température de demie dénaturation
de l’ADN concerné. Les hybrides formés sont ensuite quantifiés selon trois méthodes :
-la spectrophotométrie
-la technique de nucléase S1 (digestion des ADN et ARN simples brins)
-la chromatographie sur hydroxyapatite (seul les doubles brins se fixent en raison d’une forte
concentration en sels)
o Hybridation sur support solide :
La séquence complémentaire cible est fixée sur un support solide. On note les étapes
suivantes :
-la dénaturation de l’ADN/ARN (sous chaleur ou NaOH)
-fixation sur support
-addition de la sonde
-hybridation
-lavage pour éliminer la sonde non hybridée
Cette hybridation s’effectue avec plusieurs types de support qui permet d’immobiliser les
brins d’acides nucléiques : la nitrocellulose, les membranes synthétiques à base de nylon.
o Hybridation in situ (HIS) :
Cette technique qui permet, par l’utilisation des sondes, de mettre en évidences et de repérer,
dans des cellules ou tissus, des séquences d’acides nucléiques connues. Elle est très proche,
dans son principe, du Southern et du Northern Blot et repose, comme eux sur l’hybridation
d’une sonde d’acide nucléique marquée avec une séquence complémentaire d’acides
nucléiques que l’on cherche à identifier et localiser. A la seule différence que le Southern et le
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Northern Blot se font sur des broyats de tissu alors que l’HIS se fait sur une coupe
histologique de tissu.
Plusieurs sondes peuvent être utilisé pour réaliser une HIS : ADN (double brin ou rarement
monobrin) ou un ARN-messager (riboprobes) ou des oligonucléotides synthétiques (de 20 à
50 nucléotides).
CONCLUSION
Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des bactéries pour se
protéger des infections des virus (bactériophages). Elles jouent un rôle crucial dans ce
processus, car elles permettent en coupant le brin a un endroit précis et de manière
asymétrique, l’intégration d’un brin d’ADN spécifique codant une protéine précise, dans
un plasmide dans le but de l’exprimer dans une bactérie. La méthode d’hybridation
consiste à utiliser une sonde fluorescente ou radioactive qui reconnait spécifiquement une
séquence nucléique complémentaire, comme l’ARN messager recherché. Dans ce cas,
elle se fixe sur l’ARN messager s’il est présent dans la cellule. La présence d’un signal
fluorescent, ou radioactif révèle alors que la sonde s’est bien fixée sur sa cible. Cette
dernière dévient donc visible. Comme toutes les méthodes elles ont des contraintes et des
limites qui découlent de la nature des enzymes et du type de marquage utilisé. Mais grâce
à une meilleure connaissance de la biologie, ces contraintes peuvent êtres modifier de
façon a adapté les enzymes aux différents besoins
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