Les enzymes de Restriction et de modification
1. Définition
Ce sont des enzymes, principalement d’origine bactérienne, capables de couper l’ADN
double brin (et ce quelque soit son origine) à des endroits spécifiques (séquences
nucléotidiques) appelés sites de restriction généralement de 4 à 6 paires de bases.
2. La coupure ou phénomène de restriction
Le phénomène de restriction a été observé bien avant que les enzymes de restriction ne
fussent mises en évidence. En effet, lorsqu’un bactériophage colonise une bactérie, le
phénomène de lyse bactérienne, après multiplication du phage par le biais de la machinerie
enzymatique de la bactérie hôte peut ne pas avoir lieu.
Ceci est expliqué par le fait que :
1. l’ADN phagique est intégré, sous forme silencieuse, dans celui de la bactérie : cycle
lysogénique.
2. l’ADN phagique est complètement détruit (hydrolysé) par les enzymes de la bactérie hôte :
les enzymes de restriction (Werner Arber).
3. Enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont des endonucléases spécifiques, leur utilisation permet
d’obtenir des fragments d’ADN aux extrémités bien caractérisées, dont certains peuvent
contenir des gènes.
Il existe trois types d’enzymes de restriction :
Les enzymes de type I et III ne sont pas utilisées en pratique, car elles coupent l’ADN de
façon aléatoire.
Les enzymes de restriction de type II, clivent spécifiquement les deux brins d’ADN au niveau
d’une séquence bien définie. Elles ont la particularité de reconnaitre et de couper des
séquences palindromiques
Exemple de quelques endonucléases et leurs origines
1
4. Nomenclature des enzymes de restriction
Les trois premières lettres de chacune d’entre elle concernent
• La première lettre du nom de genre, par exemple E (Escherichia)
• Les deux premières lettres du nom de l’espèce, par exemple co (coli).
• La quatrième concerne la souche bactérienne d’où est extraite l’enzyme en question.
• Le chiffre romain : indique l’ordre de la caractérisation de l’enzyme chez la même souche.
HindIII signifie que c’est la troisième (III) Enzyme de restriction isolée et caractérisée de la
souche bactérienne Haemophilus influenza Rd.
5. Exemples des enzymes de restriction de type II
N : n’importe quelle base R : n’importe quelle purine Y : n’importe quelle pyrimidine / : Position
de coupure.
La plupart des enzymes de restriction de type II ont un site de reconnaissance de 4 ou 6
paires de bases, et un certain nombre d’enzymes de restriction reconnaissent des séquences à
5 ou à 7, 8 … paires de bases.
6. Les séquences reconnues : palindromiques
Le site de coupure, compris dans le site de reconnaissance est représenté par une flèche
verticale, et les produits de la digestion d’un génome par les enzymes de restriction sont
appelés les fragments de restriction. Selon la position de la coupure (dans l'axe ou loin de l'axe)
on distingue deux types de coupure :
- Coupure franche ex : Sma I : Dans l’axe Extrémités franches
5’……C C C G G G……3 ’ 5 ’ …..C C C G G G…3 ’
3 ’…..G GG C C C……5 ’ 3 ’ ….G G G C C C....5 ’
2
- Coupure cohésive (collant) ex : EcoR I : N’est pas dans l’axe. Extrémités cohésives
5 ’……G A A T T C …….3 ’ 5 ’……. G AATTC……3 ’
3 ’……C T T A A G …….5 ’ 3 ’……..CTTAA G……5 ’
7. Systèmes de restriction et de méthylation
Ces enzymes participent à un mécanisme de défense des bactéries vis-à-vis
des virus "système de restriction méthylation". Les endonucléases de restriction
coupent l'ADN étranger à des sites spécifiques. Et afin de protéger l'ADN
bactérien de l'hydrolyse par les enzymes, une méthylase, codé par le gène de
méthylation, va méthyler l'ADN au niveau des sites de coupure pour qu’ils ne
soient plus reconnus par l'enzyme de restriction.
8. Isoschizomères et famille d'enzymes
En général, des enzymes de restriction différentes reconnaissent des séquences
différentes. Cependant, plusieurs enzymes isolées d'organismes différents reconnaissent des
séquences identiques. On les appelle Isoschizomères. Ceux-ci ne coupent pas toujours la
séquence reconnue au même endroit.
Exemples :
3
Une famille d'enzymes est caractérisée par le fait que tous les membres de cette famille
produisent les mêmes extrémités, même si elles ont des séquences de reconnaissance
différentes.
Exemples :
- gatc : Sau 3Al, Bgl I, Bam HI, Bcl II, Xho II.
- ctag : Mae I, Spe I, Nhe I, Avr I, Xba I.
9. Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse)
Après coloration au BET
4
10. Estimation de la taille d’un fragment d’ADN :
Nombre de kb
(Échelle Log)
Migration mm
11. Utilisation des endonucléases de restriction pour établir la mappe de
restriction
La figure au dessous montre la digestion d'un fragment d'ADN de 5 kb par deux enzymes
de restriction (BamHI et EcoRI). L'analyse des résultats de la digestion nous permet de
déterminer les différentes possibilités de la localisation des sites de restriction pour chaque
enzyme
5
Gel d'agarose des produits de digestion d'un fragment de 5kb par deux enzymes de restriction
Les différentes possibilités de la localisation des sites de coupure par BamHI
Les différentes possibilités de localisation des sites de restrict ion des deux enzymes (EcoRI, et
BamHI)
6
12. Enzymes de modification des acides nucléiques
Les polymérases
- ADN polymérase I
- Le fragment de Klenow de la Pol I
- La Taq polymérase
- Les ARN polymérases
- La transcriptase réverse
Nucléases
- Rnase A (U et C)
- DNase I (C et T)
- Nucléase S1
- Exonucléase de phage λ
- Exonucléase III
- Ribonucléase T1
- Ribonucléase T2
- Nucléase Bal31
- Phosphatase alcaline
- Kinases
Les ligases
- ADN ligase, T4 DNA ligase
