1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Série n°01
EXERCICE 01 :
On réalise la carte de restriction d'un fragment amplifié par PCR avec les enzymes
de restriction EcoRI, BamHI, XbaI et NcoI. Les tailles des fragments obtenus sont
(en kilo paires de bases):
E B N X E-X E-N X-N
0,3 0,3
0,4 0,8 0,3 0,4
0,4 0,7
1,4 1,8 1 1,5 1
1,1 0,8
Donner la carte de restriction du fragment amplifié par PCR.
EXERCICE 02 :
Un plasmide portant les gènes Kan r Ampr (Kanamycine et Ampicilline) est traité
par l'enzyme Bgl II, dont le site de coupure est localisé dans le gène Amp. Ce
plasmide est lié en présence d'un gène étranger de drosophile digéré par la Bgl II.
Puis les plasmides circulaires obtenus sont utilisés pour transformer E. coli.
Quel antibiotique mettez-vous dans le milieu pour sélectionner les colonies
contenant un plasmide?
Quels types de phénotypes résistants aux antibiotiques trouvez-vous dans
le milieu ?
Quel sera le phénotype des colonies contenant un plasmide recombinant ?
Combien de fragments d’ADN vont être produits par une enzyme de
restriction que l'on fait agir sur un plasmide (molécule circulaire) possédant
1 site pour cette enzyme ? Sur l'ADN linéaire d'un bactériophage possédant
deux pour cette enzyme ?
EXERCICE 03 :
On clone un fragment d'ADN génomique Eco RI-Bam HI de 2 kb d'Arabidopsis
thaliana aux sites Eco RI et Bam HI du plasmide pBLQ54 (voir schémas ci-
dessous).
Dr MECHAI ABDELBASSET
1
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
EcoRI
HindIII 0
BamHI
5.5
1
PvuII 5
pBLQ54
(6kb)
2
4
2.5 HindIII
PvuII
PvuII
SstI EcoRI PvuII BamHI HindIII
0 0.5 1.5 2.5 4
amHI amHI
Région de l'ADN génomique contenant le fragment Eco RI-Bam HI de 2 kb:
1. Présentez un schéma du plasmide recombinant et positionnez les sites de
restriction sur ce schéma.
2. Pour contrôler le résultat du clonage, on fait une analyse par restriction du
plasmide recombinant en utilisant les enzymes de restriction HindIII et
PvuII séparément et en double digestion, puis en réalisant une
électrophorèse en gel d'agarose. Schématisez ce que l'on doit observer à
l'issue de l'électrophorèse pour les digestions enzymatiques en indiquant en
clair les tailles des différentes bandes obtenues.
Enfin pour s'assurer du résultat, on réalise un transfert sur membrane de
nitrocellulose (Southern blot) à partir du gel de la question 2. La membrane
est hybridée avec une sonde constituée du fragment Eco RI-Bam HI d'ADN
génomique d'A. thaliana marqué au 32P.
Dr MECHAI ABDELBASSET
2
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
3. Rappelez brièvement le principe d’hybridation moléculaire de type
Southern.
4. Parmi les fragments générés lors des digestions du plasmide pBLQ54
recombiné par les deux enzymes de restriction (Hind III et Pvu II), à quel(s)
fragment(s) s'hybridera la sonde?
Série n°02
EXERCICE 01 :
Afin de cloner un segment d’ADN linéaire double brin dans le plasmide pUC18,
on traite de
l’ADN à cloner avec les deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII. Les
plasmides recombinants sont incubés en présence d’une souche E.coli AMPS LacZ-
. Les bactéries sont ensuite cultivées sur une gélose contenant de l’ampicilline et
de l’IPTG et du X-gal, substrat incolore devenant bleu après hydrolyse par la β-
galactosidase.
Les résultats de ces expériences sont consignés dans le tableau suivant :
1. Quel est le rôle de l’ampicilline au cours de ces expériences ?
2. A quoi correspond une colonie bleue ? Une colonie blanche ?
3. Déterminer la taille de l’ADN inséré dans ce plasmide.
4. Etablir la carte de restriction de l’ADN inséré.
EXERCICE 02 :
Un fragment d’ADN génomique de levure de 1500 pb, contient la séquence
codante d’un gène (topo) codant une topoisomérase (figure 1). En vue
d’exprimer cette enzyme dans la bactérie E.coli, sa séquence codante est clonée
dans le vecteur plasmidique pBR322 (figure 3).
Dr MECHAI ABDELBASSET
3
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
BamHI HindI EcoRI
300pb 1200pb
Figure 1 Carte de restriction du Figure 2 Séquence des sites de restriction
fragment d’ADN génomique de levure
contenant le gène topo
AmpR
AmpR
pBR322 (2800pb)
HindI
300pb TetR
TetR BamHI Le gène topo
ORi
200pb
ORi
EcoRI
Figure 3 Carte de restriction du Figure 4 : Plasmide recombinant contenant
plasmide pBR 322. le gène topo
Question 1 :
A. Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez
les clones recombinants
1. Quelle est le rôle de la présence du fragment ORI.
2. A l’aide des figures ci-dessus, mentionner les endonucléases de
restriction permettant l’insertion du gène topo dans le vecteur
plasmidique pBR322? Justifier. Quel est le type d’extrémités
générées ?
3. Quelle est la fréquence statistique des sites de restriction pour les
enzymes BamHI, EcoRI, HindI
Question 2 :
Dr MECHAI ABDELBASSET
4
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Le fragment d’ADN génomique et le vecteur pBR322 digérés sont alors mélangés
et mis en présence de l’ADN ligase du bactériophage T4. Quelles sont les
différentes molécules obtenues à l’issue de cette ligation ?
Question 3:
1. Positionner et numéroter, si besoin, les sites de restriction HindIII,
EcoRI et BamHI sur le schéma du plasmide recombinant dans la
feuille réponse. Indiquer la taille du plasmide recombinant.
2. Schématiser le profil électrophorétique des fragments issus de la digestion de ce
plasmide par chacune des enzymes, par les doubles digestions (BamHI + HindI ),
(BamHI + EcoRI ) , (EcoRI + HindI) et par la triple digestion
(BamHI+EcoRI+HindI)
EXERCICE 03 :
On souhaite étudier la fonctionnalité d’un gène M d’une bactérie. Pour cela, on essaie de cloner au
site EcoRI du vecteur plasmidique pBR330 (voir schéma) un fragment Eco RI-Eco RI d'ADN
génomique de la bactérie d’intérêt.
a- Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez les clones
recombinants.
Un plasmide recombinant contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré parles enzymes de
restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des fragments d'ADN
sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction
suivants:
Dr MECHAI ABDELBASSET
5
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.
Série n°03
EXERCICE 01 :
Soit un fragment d’ADN sur lequel sont représentés l’emplacement de certains sites de
restriction. Les zones d’hybridation correspondant à différentes sondes radioactives (utilisées
à raison d’une sonde par expérience) sont celles qui correspondent à la projection sur
l’ADN des zones délimitées par les rectangles hachurés. Les différents transferts de Southern
réalisés sont révélés par autoradiographie, (on considérera que quelle que soit la longueur de la
zone de complémentarité entre la sonde et la cible, il y a hybridation).
1. Quelle(s) sonde(s) permettrai(en)t de révéler sur l’autoradiographie, deux bandes
distinctes (correspondant à des poids moléculaires différents) après le transfert de
Southern de cet ADN coupé à la fois par HindIII et BamH1.
2. Rappeler brièvement le principe de la technique d’hybridation des acides nucléiques
EXERCICE 03 :
Dr MECHAI ABDELBASSET
6
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
On dispose de l’ADNc (ADN complémentaire) de l’insuline humaine, du plasmide
pBR322, de bactéries hôtes sensibles à l’ampicilline (AMP) et à la tétracycline
(TET) ainsi que deux enzymes de restriction : PstI et BamHI.
A la fin de cette expérience, nous obtenons trois types de clones
bactériens dont les caractéristiques sont regroupées dans le tableau suivant :
1/ Donner les principales étapes de cette expérience ?
2/ Interpréter les résultats regroupés dans ce tableau en précisant le clone positif
?
3/ Quels sont les avantages de la synthèse de l’insuline par génie génétique ?
Série n°04
EXERCICE 01 :
La séquence d’un ADN bicaténaire (double brin), correspondant à un gène, est
partiellement reportée ci-dessous.
5’ ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGAAATTCC 3’
1. Ecrire la séquence et l’orientation du second brin de ce fragment.
5’ ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGAAATTCC 3’
2. Soient les enzymes de restriction BamH I, Pst I, Xho I et Mbo I dont les
sites reconnus sont :
BamH I : 5' G/GATCC 3'
Pst I : 5' CTGCA/G 3'
Dr MECHAI ABDELBASSET
7
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Xho I : 5' C/TCGAG 3'
Mbo I : 5' /GATC 3'.
3. Recopier la séquence de l’ADN et encadrer les sites de restriction en
indiquant la position des coupures.
4. Pour chaque enzyme, écrire les séquences des extrémités des molécules
d’ADN digérées et préciser le type d’extrémités obtenu.
EXERCICE 02 :
Dans le but d’étudier l’expression du gène nemaxe, des chercheurs ont préparé
un ADNc de ce gène. Cet ADNc a été obtenu par PCR.
1. Résumez brièvement le principe de la PCR.
Pour analyser cet ADNc, les chercheurs voudraient le cloner dans un vecteur de
clonage. Ils ont à leur disposition deux vecteurs pGEM 7ZF et pYAC (figure 1) et
un hôte récepteur bactérien.
2. De quel type de vecteurs s’agit-il ? Justifiez.
3. Le vecteur pYAC est dit vecteur navette, expliquez pourquoi ?
4. Quels avantages présente le clonage dans le vecteur pYAC ?
5. A quoi correspondent les séquences suivantes annotées sur les vecteurs ?
ColE1 ori Rep (pMB1)
bla (Apr) et Tet (Tcr) TEL
Lac Z ARS
Les chercheurs ont décidé d’utiliser le vecteur pGEM 7ZF. Vous réalisez une
digestion par l’enzyme XhoI (C/TCGAG) sur le vecteur pGEM 7ZF. Parallèlement,
vous pouvez préparer l’insert nemaxe , soit par une digestion Sau3A ( /GATC),
soit par une digestion SalI (G/TCGAC).
1. Qu’est-ce qu’un ADNc ? Expliquer brièvement comment obtenir de l’ADNc.
2. Expliquez pourquoi les chercheurs ne peuvent pas utiliser de l’ADN
génomique.
3. Quel enzyme choisissez-vous pour préparer votre insert et le cloner dans le
vecteur pGEM 7ZF?
4. Quel traitement pouvez-vous effectuer afin que le vecteur ne se
recircularise pas ? Expliquez le principe
Dr MECHAI ABDELBASSET
8
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
5. Dites comment vous pouvez choisir les cellules recombinées.
Après mise en culture, les bactéries sont lysés et l'ADN plasmidique est purifié.
Cet ADN est digéré par l'enzyme de restriction SalI et par double ou triple
digestion en associant les enzymes de restriction SalI , EcoRI et HindIII.
Ces différentes digestions produisent les fragments suivants :
Enzyme (s) utilisée Nombre de Taille des fragments obtenus
(s) fragments
obtenus
EcoRI 1 4900 pb
SalI 2 3100 pb + 1800 pb
HindIII 2 2700 pb + 2200 pb
EcoRI + SalI 3 2800 pb + 1800 pb + 300 pb
HindIII + EcoRI 3 2700 pb + 1400 pb + 800 pb
SalI + HindIII 4 1700 pb + 1400 pb + 1300 pb + 500
pb
a. Comment peut-on visualiser les différents fragments obtenus à l'issue des
différentes digestions ? Vous pourrez illustrer vos propos à l'aide d'un schéma.
b. b) Quelle est la carte de restriction du fragment d'ADN cloné ? Vous ferez un
schéma et argumenterez votre analyse.
Figure 1
Série n°05
EXERCICE 01 :
Dr MECHAI ABDELBASSET
9
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Un séquençage d’une région d’ADN est effectué par la technique de Sanger à partir de deux
échantillons d’ADN. Deux autoradiogrammes de gels de séquence sont présentés
- Rappelez le principe de séquençage de type Sanger.
- Comment visualiser les fragments d’ADN néosynthétisés ?
- Donnez la séquence du brin matrice des deux échantillons d’ADN.
- Quelle information vous apporte l’analyse comparative de ces 2 autoradiogrammes ?
A T G C A T G C
EXERCICE 02 :
Un fragment d’DNAX a été séquencé par la méthode de Sanger. Le résultat obtenu est représenté
par la figure ci dessous. Le sens de la migration électrophorétique est signalé par la flèche orientée
vers le bas
Question 1: Que représentent les bandes visibles sur l'autoradiogramme ?
Question 2: Où se situe la différence entre le ddATP et le dATP ?
Question 3: Déduire à partir de cette figure la séquence nucléotidique du brin matrice
correspondant au DNAX.
Dr MECHAI ABDELBASSET
10
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
EXERCICE 03 :
Un fragment d'ADN produit par l'enzyme de restriction SalI est inséré dans un
vecteur plasmidique de 60 kb ne comportant qu'un seul site de restriction SalI.
Des bactéries compétentes sont transformées avec les plasmides recombinés. A la
suite de cette transformation, des clones bactériens ont été isolés. Après mise en
culture de chacun de ces clones en milieu liquide, les bactéries sont lysés et
l'ADN plasmidique est purifié. Cet ADN est digéré par l'enzyme de restriction SalI
et par double ou triple digestion en associant les enzymes de restriction SalI ,
EcoRI et HindIII.
Ces différentes digestions produisent les fragments suivants :
Enzyme (s) de restriction Tailles des fragments obtenus
utilisée (s)
Digestion 1 SalI 20kb, 60 kb
Digestion 2 SalI + EcoRI 7 kb, 13 kb, 60 kb
Digestion 3 SalI + HindIII 4 kb, 60 kb, 5 kb, 11 kb
Digestion 4 SalI + EcoRI + HindIII 3 kb, 4 kb, 60kb, 5kb, 8 kb
Remarque : le vecteur plasmidique utilisé ne comporte pas de site de restriction
EcoRI et HindIII.
a) Comment peut on visualiser les différents fragments obtenus à l'issue des
différentes digestions ? Vous pourrez illustrer vos propos à l'aide d'un schéma.
b) A quoi correspondent les fragments de 20 et 60 kb ?
c) Quelle est la carte de restriction du fragment d'ADN cloné ? Vous ferez un
schéma et argumenterez votre analyse.
Série n°06
EXERCICE 01 :
Ou fait agir sur un plasmide deux enzymes de restriction afin de rechercher les
sites de coupures de ces deux enzymes et de construire la cartes de restriction
correspondantes ainsi que la carte combinée.
La digestion terminée, chaque lot d'ADN est soumis à une électrophorèse en gel
d'agarose qui sépare les fragments d'ADN selon leur taille
Dr MECHAI ABDELBASSET
11
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Le document suivant donne les électrophorèses après des digestions simples et
multiples.
1. Quel est la taille du plasmide en paires de bases ?
2. Combien possède-t-il de sites de coupure pour l'enzyme EcoR I ?
3. Pour l'enzyme BamHI ?
4. Ordonnez les différents fragments obtenus les uns par rapport aux autres.
EcoR I Bam HI EcoR I + Bam HI
17.00pb
16.75pb
15.15pb
13.20pb
08.15pb
07.50pb 07.50pb
07.00pb
05.70pb 05.70pb
05.00pb
03.60pb 03.60pb
02.50pb
EXERCICE 02 :
Soit les enzymes de restriction a, b et c que l’on agir sur un plasmide de 4000pb.
L’électrophorégramme est représenté dans la figure ci-dessous Positionnez les
a b c ab ac bc
sites de restriction sur le plasmide.
4000pb
500 3800pb
3000pb
1000 2000pb
1400pb
4000pb 900 1000pb
900pb
500 500pb
200
200pb
900
Dr MECHAI ABDELBASSET
12
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
EXERCICE 03 :
L'ADN plasmidique pBR 607 est circulaire et double brin et a une taille de 2,6 Kb
Ce plasmide porte deux gènes qui lui confèrent la résistance à la tétracycline
(TET-r) et à l'ampiciline (Amp-r) dans les bactéries.
Cet ADN a un site unique pour chacune de ces enzymes : ECoRI, Bam Hl, Hind
III, Pst I et Sal 1.
En clonant dans EcoRI aucune de ces résistances n'est affectée. Par contre en
clonant dans Bam Hl, Hind III et Sal 1 la résistance à la tétracycline est
supprimée, en clonant dans Pst I c'est la résistance à Tampicilline qui l'est.
La digestion avec certaines de ces enzymes donne les fragments représentés dans
le tableau suivant .
Enzymes in mixture Molecular welghis of fragments
EcoRI, Pstl 0.46, 2.14
EcoRI, BamHI 0.2. 2.4
EcoRI. HLnd III 0.05, 2.55
EcoRI, SalI 0-55. 2.05
EcoRI, BamHI, Psil 0.2,0.46, 1.94
Positionnez les sites les uns par rapport aux autres.
Série n°07
EXERCICE 01 :
L'une des six cartes de restriction représentées ci-après est compatible avec le
profil des bandes (représenté juste en dessous), obtenu après digestion par
plusieurs endonucléases de restriction.
Les enzymes qui ont été utilisées sont indiquées.
Dr MECHAI ABDELBASSET
13
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
1. Analysez le profil des bandes sur le gel et sélectionnez la carte correcte :
expliquez votre raisonnement.
2. Dans un Southern blot préparé à partir de ce gel, les bandes en rose sont
hybridées au gène pep. Où est situé le gène pep ?
Série n°08
EXERCICE 01:
Caractérisation de la nature de la mutation par séquençage.
On réalise, selon la méthode de Sanger et Coulson, le séquençage du brin d'ADN porteur de la
séquence B mutée 5'-TGGCCT-3'.
A quel profil électrophorétique vous attendez-vous ?
N.B. : la flèche indique le sens de migration sur gel
EXERCICE 02 :
Exercice 01. On effectue un transfert de Southern pour lequel une sonde s’hybridera avec une
séquence minisatellite de 60 pb. L’ADN d’un patient est coupé à l’aide des enzymes de restriction
Sal I, Hind III et Xho I. Sur le schéma ci-dessous est représenté l’emplacement où devrait se fixer la
sonde ainsi que ceux des sites de restriction des enzymes citée.
Dr MECHAI ABDELBASSET
14
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
Quel est la figure parmi les suivantes, qui correspond au cas où le patient possède ce minisatellite ?
Quel est la figure parmi les suivantes, qui correspond au cas où le patient possède ce minisatellite ?
Série n°09
EXERCICE 01:
MspI et HpaII sont deux endonucléases qui clivent le même motif palindromique
CC/GG. Il est par ailleurs démontré que la méthylation des cytosines qui
précèdent les guanines protège les sites CC/GG de l’attaque de HpaII et non celle
de MspI.
1/ Comment appelle-t-on les enzymes HpaII et MspI ?
L’étude de deux fragments d’ADN (A) et (B) isolés à partir de deux tissus
différents d’un même individu, est réalisée à l’aide de ces deux enzymes.
L’électrophorégramme ci-après est obtenu après coloration au BET des sous
fragments de digestion des deux ADN, préalablement séparés par électrophorèse.
2/ Que peut-on dire des ADN A et B ? Justifiez votre réponse.
Dr MECHAI ABDELBASSET
15
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
3/ Quelle signification physiologique peut revêtir le constat fait à la question 2 ?
En vue de cartographier les fragments d’ADN A et B, ils sont marqués avec le (y32
p) ATP, puis digérés par les enzymes de restriction.
L’autoradiogramme obtenu est présenté ci-dessous :
4/ Donnez la cartographie des ADN (A) et (B).
EXERCICE 02 :
Vous disposez d'un brin d'ADN à séquencer (matrice), d'une amorce, d'ADN
polymérase, des quatre 2'-désoxyribonucléotides (dXTP) et d'un jeu des différents
2',3'- didésoxyribo-nucléotides (ddXTP). L'amorce est radiomarquée par du
phosphore radioactif 32P.
L'ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC—comporte, à son extrémité 3', une
séquence supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé)
sur laquelle l'amorce va s'hybrider, créant ainsi le site d'initiation de l'ADN
polymérase.
1. Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du
didésoxyribonucléotide.
2. Compléter le tableau en indiquant la composition des différents milieux
réactionnels et, pour chaque milieu, le type et la taille des fragments
néosynthétisés.
Dr MECHAI ABDELBASSET
16
1ere Master Biochimie Appliquée / séries de TD de Bioingénierie des Biomolécules
3. Sur le gel ci-dessous, représenter la taille des fragments néosynthetisés
dans chaque milieu réactionnel (utiliser l'échelle de taille représentée à
gauche du schéma)
4. Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence
recherchée, en indiquant le sens de lecture des séquences établies.
Dr MECHAI ABDELBASSET
17
