I- LES METHODES SEPARATIVES

CHROMATOGRAPHIE
Ø La chromatographie est une méthode physico-chimique de séparation des
constituants d’un mélange basée sur les différentes affinités d’un ou plusieurs
composés à l’égard de deux phases non-miscibles (stationnaire et mobile) en
contact.
Ø Buts de la chromatographie
• Objectif analytique : identifier des solutés qualitativement et/ou
quantitativement.

• Objectif préparatif : préparer des substances rares, sensibles à la chaleur

(protéines, etc...).
 VARIANTES CHROMATOGRAPHIQUES
1- Chromatographies en phase liquide.
• La chromatographie sur colonne (CPL) :
• chromatographie liquide - solide : CLS,
• chromatographie liquide - liquide : CLL).
(Chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP)).
• Chromatographie par échange d’ions.
- Chromatographie sur gel perméable.
- Chromatographie sur papier (CP)
- Chromatographie sur couche mince (CCM)

2- Chromatographie en phase gazeuse.

- Chromatographie gaz - solide : CGS)

- Chromatographie gaz - liquide : CGL).

3- Chromatographie en phase supercritique

 DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE
Type de chromatographie Type d’interaction Phase stationnaire
gaz/solide adsorption solide poreux
Colonnes remplies, solide poreux inerte
Chromatographie Partage (Partition) enrobé de liquide
en phase gazeuse gaz/liquide
Colonnes capillaires, paroi interne la
colonne qui sert de support

adsorption solide poreux

Solide à la surface duquel se trouve des

sites ioniques qui permettent à l’aide
échange d’ions
d’un solvant approprié l’échange d’ions
Liquide /solide
présents dans la phase mobile

Solide dont la dimension des pores

Chromatographie D’exclusion (filtration
permet la séparation des espèces selon
en phase liquide sur gel, perméation de gel)
leur taille

Solide poreux inerte enrobé de liquide

Partage phase normale
(de moins en moins utilisée)
Liquide/liquide
Solide poreux sur lequel sont greffées
Partage phase inversée des chaines hydrocarbonées non-
polaires
Chromatographie supercritique /liquide
en phase supercritique supercritique /solide
 TERMINOLOGIE GÉNÉRALE DE LA CHROMATOGRAPHIE.
• Soluté: toute substance constituant d’un mélange, séparée par
chromatographie.

• Phase mobile: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté.

• Phase stationnaire: le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va
permettre leur séparation quand la phase mobile les déplace.

• Support: Un substrat inerte qui porte la phase stationnaire.

• Remplissage: l’ensemble des produits (adsorbant, support + phase stationnaire, etc...) qui garnissent une colonne

chromatographique .
• Colonne chromatographique: tube de diamètre et longueur variable,
en verre, métal, ou autre substance, à l’intérieur duquel s’opèrent les
séparations chromatographiques.

• Développant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les

solutés dans la phase stationnaire, de telle manière qu’ils demeurent
dans celle-ci : cas de la CP et de la CCM.

• Éluant: une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les solutés
dans la phase stationnaire, jusqu’à ce qu’ils sortent de celle-ci
• Chromatographie d’élution: La phase mobile parcourt en
permanence la phase stationnaire . La phase mobile est inerte vis-à-
vis de la phase stationnaire.

• Chromatographie de déplacement : procédé dans lequel la phase

mobile a plus d’affinité que le soluté pour la phase stationnaire, donc
le pousse devant elle.

• Rapport frontal: rapport entre la distance parcourue par un soluté

dans une phase stationnaire et la distance parcourue dans le même
temps par le développant.
• Coefficient de partage: rapport des concentrations respectives du
soluté dans la phase stationnaire et la phase mobile, au cours de
l’analyse.

• Valeurs de rétention: toutes données qui permettent de chiffrer

l’action spécifique d’une phase stationnaire donnée sur un soluté
donné, au cours d’une analyse chromatographie.

• Chromatogramme: trace sur un papier enregistreur des réponses

successives du détecteur, au cours de l’élution des solutés hors des
colonnes.
 PARAMÈTRES INTERVENANT DANS LA SÉPARATION.
Paramètres Type de Domaine d’application
chromatographie
La charge Echange d’ions • Protéines, Polypeptides, Acides aminés,
Acides nucléiques, sucres

La taille et la forme (le volume) Exclusion ou gel de • Protéines, Polypeptides, Acides nucléiques,
filtration Sucres, Lipides

L’existence de structures Affinité • Protéines

particulières qui permettent
d’établir des liaisons spécifiques

Polarité et hydrophobicité Polarité de phase • Protéines, Polypeptides, Acides aminés,

inversée ou phase Acides nucléiques, Sucres, Acide gras
reverse

Interactions • Protéines
hydrophobes
 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

Expérience de base

Principe de l’analyse
chromatographie
 GRANDEURS FONDAMENTALES
• Coefficient de distribution ou de partage
𝐶!
𝐾=
𝐶"

Répartition (elle peut être différente) des

molécules d’un composé entre les deux phases.

Migration de trois composés en fonction

de leur répartition entre les deux phases.
 Chromatogramme
𝑡! ou 𝑡" (temps mort) = temps pendant lequel un
t'R
constituant non retenu sort de la colonne

𝑡# = temps de rétention d’un constituant qui représente le

temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui qui
correspond sur le chromatogramme

𝑡#$ = La différence entre le temps de rétention et le

temps mort 𝑡"
temps
𝑡!
𝑉! ou 𝑉" (Volume mort) = tM.D : Volume de la phase
mobile dans la colonne

𝑉# = VR= tRD :Volume d'élution ou volume de rétention VR

𝑉#$% = ω·D : Volume d'un pic

D est le débit
 • Facteur de rétention k •Facteur de résolution entre deux pics
(ou de capacité) : rapport de la Pour traduire numériquement la plus ou moins bonne
quantité de produit dans la phase séparation entre deux composés,
stationnaire sur la quantité de produit
dans la phase mobile. t R ( 2 ) - t R (1) VR ( 2 ) - VR (1)
R=2 =2
k=
mS C .V V
= S S =K S w1 +w 2 w1 +w 2
m M C M .VM VM - Si RS = 0, les deux pics sont confondus
𝑡$ − 𝑡% 𝑡′$ - Si RS ≥ 1,5, la séparation est totalement réalisée.
𝑘# = =
𝑡% 𝑡%

•Facteur de séparation α
(ou sélectivité) entre deux solutés
'
k 2 K 2 t R ( 2)
a= = = '
k1 K 1 t R (1)
Si α = 1, il n’y a pas de séparation
possible des deux composés
 EFFICACITÉ D’UNE COLONNE
Efficacité réelle (nombre de plateaux
Efficacité théorique N (nombre de plateaux théoriques effectifs)
théoriques). 𝒕#𝑹
Plus le pic est large moins est bon la séparation 𝐍𝒆𝒇𝒇 = 𝟏𝟔( )𝟐 =
𝛚
𝐭𝐑 𝒕#𝑹 𝟐 𝒕#𝑹 𝟐
𝐍 = 𝟏𝟔( )𝟐 = 𝟓, 𝟓𝟒( ) = ( )
𝛚 𝛅 𝛔
𝐭𝐑 𝟐 𝐭𝐑 𝟐 On définie alors la hauteur de plateau effectif
𝟓, 𝟓𝟒( ) = ( )
𝛅 𝛔
L
la hauteur équivalente à un plateau théorique 𝐻=
(HEPT), de la manière suivante: 𝑁+,,
𝐋
H=
𝐍 • Hauteur de plateau réduite.
où L est la longueur de la colonne.
H L
h= =
d m N .d m
 Chromatographie en phase gazeuse
(CPG)
C’est une méthode de séparation de
composés susceptibles d’être
vaporisés par chauffage (sans
décomposition).

La séparation se fait dans une colonne

soit par partage soit par adsorption
INJECTEUR
Introduire de l’échantillon, son évaporation et
son entraînement par le gaz vecteur vers la
colonne :

T°injecteur = T°produit le moins volatil + 20°C

Injecteur à vaporisation directe

Injecteur avec système de fuite

Injecteur à température programmable (PTV)

Injection à froid dans la colonne

Four Enceintes dans laquelle se trouve la colonne
Ø Programmation de da température
- stable et identique du début à la fin de la manipulation (= conditions isothermes)
- programmée par palier successif (= en gradients)

Colonnes Tube fin enroulé qui contient la phase stationnaire

- Les colonnes remplies ( 2≤ D≤ 6 mm et 1≤ L≤ 3m).

support poreux et inertes en formes de grains sphériques (D≥0,2mm) imprégné de
la phase stationnaire

- Les colonnes capillaires ( 0,1 ≤ D≤ 0,53mm et 10≤ L≤ 100m).

La phase stationnaire (0,05 ≤ D≤ 5 µm est directement déposée sur la paroi interne
de la colonne.
 Phase mobile ou gaz vecteur
Gaz inerte et pur tel que l’hélium, le diazote ou le dihydrogène. La nature du gaz ne
modifie pas de manière significative la séparation des composants

Phase stationnaire
• Une phase apolaire retiendra d’autant plus un composé qu’il sera apolaire (et
inversement)

• Une phase apolaire retiendra les composés dans l’ordre de leur température d’ébullition
(donc sortie des composés dans l’ordre de leur température d’ébullition croissante)

• Une phase phénylée retiendra mieux un composé aromatique

• Une phase fluorée retiendra mieux les cétones

Détecteurs
Plus ou moins spécifiques des composés à détecter.

ð T°détecteur = T°produit le moins volatil + 20°C

- Quantité minimale détectable (QMD)

- Sensibilité : correspond au rapport entre signal / concentration (mg/mL) ou
entre signal / débit (mg/s)
DETECTEUR Gaz vecteur Linéarité QMD Sélectivité Applications
(spécificité)
Catharomètre H2/He 105 1 à 10 ng NS Tous composés
FID He/N2 107 20 à 100 pg NS Composés organiques
Capture d’e- N2 104 0,1 pg S Composés halogénés
Thermoionique N2 104 P:1 pg / N:10 S Composés avec N ou P
pg
Photométrie de N2/H2 103 P: 10 pg/ S: 1 S Composés avec S ou P
flamme ng
 Chromatographie Liquide Haute Performance
- Utilise une phase mobile liquide.

- Séparer les différents constituants

d'un mélange en fonction de leur
polarité.

- Son champ d’application recouvre

une grande partie du domaine de la
chromatographie en phase gazeuse
auquel s’ajoute celui de l’analyse
des composés thermosensibles ou de
masses moléculaires à la fois très
grandes et même polaires.
1.Système de Pompes
Pour forcer le passage de phase mobile à travers la colonne dont le
remplissage est très compact.
Les pompes utilisées en chromatographie doivent présenter les qualités
suivantes :
- Très bonne régularité du débit (avec possibilité de variation)
- Possibilité de très hautes pressions
- Les pulsations ne doivent pas être détectées
- Résistances à la corrosion

Les pompes sont appelées binaires, ternaires, quaternaires suivant le nombre

de solvants qu’elles peuvent mélanger.
 - Injecteurs
ØL’injection rapide d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne (direct
ou par vanne d’injection)
ØManuelle ou Automatique

- Colonne
 Phases stationnaires
ØLe gel de silice, matière de base des phases actuelles SiO2)x(H2O)n

Ø silices greffées
- Phases monomériques (10—15 μm d’épaisseur).
monochorosilane phases classiques RP-8 (groupement diméthyloctylsilane)
RP-l 8 (groupement diméthyloctadécylsilane, ou ODS).

- Phases polymériques (25μm ou plus en épaisseur). di- ou trichlorosilane en présence de

vapeur d’eau qui provoque une polymérisation en solution du réactif avant dépôt et greffage
sur la silice. On obtient ainsi une couche polymérique réticulée.

Autres phases à polarités variées

l’alumine ou l’oxyde de zirconium (ZrO2) comme supports de dépôts réticulés à base de
polybutadiène ou d’autres polymères styrène/divinylbenzène ou hydroxyméthylstyrène
(
 Phases mobiles
Une phase stationnaire polaire on oppose une phase mobile peu ou pas polaire et vice-versa.
Phase normale
phase inversée (« R — HPLC »)

Détecteurs
- Détecteurs spectrophotométriques (UV correspond donc à une détection sélective)..
Détection monochromatique
Détection polychromatique.

- Détecteur spectrofluorimétrique (longueur d’onde d’excitation et d’émission.)

- Détecteur réfractométrique

Autres détecteurs
Spectrométrie de masse (CLHP/SM),
RMN (CLHP/RMN’ H)
 Chromatographie planaire
La chromatographie planaire, également connue sous le nom de chromatographie sur
couche mince (CCM), est une technique complémentaire de la CLHP, ayant sa propre
spécificité. Bien que la mise en œuvre de ces deux techniques soit différente, le principe
de la séparation et la nature des phases restent les mêmes.

Différentes étapes de la CCM

- Dépôt de l'échantillon

- Développement de la plaque

- Révélation post-chromatographique
 Quelques paramètres de séparation et de rétention
Rapport Frontal
dis tan ce parcourue par le soluté x
R f
=
dis tan ce parcourue par le front de solvant
=
xo
Efficacité N facteur de rétention k
x2 1
N = 16 𝑘= −1
w 𝑅!
Hauteur équivalente à un
plateau théorique N Résolution R

x x -x
H = R =2 2 1

N
w +w
1 2