Université de ziguinchor

TECHNIQUES D’ANALYSE BIOCHIMIQUE:

Les Techniques Chromatographies

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I - Généralités sur les méthodes chromatographiques
II- Chromatographique Liquide Haute Performance (CLHP ou
HPLC)
III- Les différents types de techniques chromatographies
III-1-Chromatographies en phase liquide(CPL)
- Chromatographie de partage
- Chromatographie d’exclusion
- Chromatographie d’adsorption
- Chromatographie en phase inversé
- Chromatographie sur échangeur d’ions
- Chromatographie d’affinité
III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
-gaz-liquide -gaz- solide
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 I - Généralités sur les méthodes chromatographiques

HISTORIQUE

1903 - M. Tswett (botaniste russe)

réalise la séparation de pigments
végétaux de la chlorophylle sur une
colonne remplie de carbonate de
calcium avec de l’éther de pétrole

Différentes bandes colorées

 nom de la méthode « chromatographie », du grec khroma qui signifie
couleur

Constituants d’un mélange sont soumis à un grand nombre d’équilibre entre :

une phase stationnaire (=phase fixe) et une phase mobile parcourant la phase
stationnaire

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 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques

Définition:

La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un

mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long

d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des solutés

entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par

la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).

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 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques

1– Polarité et Chromatographique
1.1 Polarité d’une molécule

La polarité d’une molécule est une notion intrinsèque. Certaines molécules étant
dissymétriques, les électrons ne sont pas uniformément répartis autour d’elles. De ce fait
il existe un moment dipolaire permanent qui crée un champ électrique local. Ces
molécules sont dites polaires.
1.2. Interactions entre molécules

Dans la nature, les molécules ne sont pas isolées. Entre elles il existe différents types
d’interactions :
-les interactions diélectriques ou ioniques
-les liaisons " hydrogène "
-les forses de Van Der Waals

1.3. Notion de polarisabilité

Sur certaines molécules isolées qui ne possèdent pas de moment dipolaire permanent, un
champ électrique peut créer un champ dipolaire induit, en déformant les orbites électroniques
ou en modifiant la position relative des atomes. Ces molécules sont dites polarisables.

5
 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques
1– Polarité et Chromatographique
1.4. Application à la chromatographie
Pour qu'il y ait séparation chromatographique de composés, il faut que les molécules
interagissent de manières différentes avec au moins une des phases (stationnaire et
mobile). Ces phases doivent avoir des polarités différentes.
On peut appliquer la règle "qui se ressemble s'assemble" à l'ensemble soluté - phase
stationnaire.
Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus
que les composés non polaires.
Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus
retenus que les composés polaires.

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 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques

1– Principe des méthodes chromatographiques

Le principe de toute chromatographie est basé sur la différence d’affinité d’un composé
entre une phase mobile (gaz ou liquide) et une phase stationnaire (silice, alumine, résine
échangeuse d’ions, liquide…)
Sous l’influence de deux effets antagonistes :
-effet d’entraînement exercé par la phase mobile
-effet de rétention exercé par la phase stationnaire,
les constituants du mélange se déplacent à des vitesses différentes et sont alors séparés.

7
 A - Généralités sur les méthodes chromatographiques

2 – Intérêts, buts

➢Séparer les constituants d’un mélange plus ou moins complexe

séparation des composés
colorés de l’encre noire

séparation d’un mélange de

phénols

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 I - Généralités sur les méthodes chromatographiques

➢Identification et détermination quantitative des substances

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 A - Généralités sur les méthodes chromatographiques

3 - Pic chromatographique
Signal = C instantanée
(sortie de colonne)

100%

s 60% Si bonne séparation, 1 produit = 1 pic gaussien

I I
h 50%
d

13.5%
w

-2 0 1 2 Temps
Paramètres d’un pic
h : hauteur du pic
s : largeur du pic à 60 % de sa hauteur,
(s = écart type du pic = dispersion), (s2 = variance).
d : largeur du pic à mi-hauteur (d = 2,35 s).
w : largeur de base du pic à 13,5 % de sa hauteur (w = 4 s = 1,7 d).
L'aire comprise entre –2 et +2 vaut 95,4 % de l'aire totale comprise entre la courbe et l'axe des x.

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 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques

4 - Temps de rétention

t’R2

tM (ou t0) : temps mort : temps de

t’R1
passage de la phase mobile dans la
colonne
tR : temps de rétention : temps
écoulé entre l’introduction du
composé dans la colonne et le
Composé non retenu moment où la substance sort à sa
concentration instantanée maximale

t’R : temps de rétention réduit

00 tM (ou t0) tR1 tR2 temps t’R1l = tR1 - tM

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 I- Généralités sur les méthodes chromatographiques

5 - Facteur de séparation (ou sélectivité)

t’R2

t’R1
 = t’R2/t’R1

 ne permet pas de savoir si la

séparation des 2 composés est
bonne ou mauvaise : ne tient pas
compte de la largeur des pics
temps

d : largeur du pic à mi-hauteur

Nombre de plateau théorique : N = 5.54 (tR / d )2
Hauteur equivalente à un plateau théorique ou HEPT = N / L

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 I - Généralités sur les méthodes chromatographiques

6 - Facteur de résolution

R = 2(tR2 – tR1) /(w1 + w2) R = 1,18 (tR2 – tR1) /(d1 + d2)

(Indice 2 pour le composé le plus retenu)

Exemples de résolution :

R = 0,75 R=1 R = 1,5

Séparation acceptable pour R  1

Séparation totale pour R  1,5

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 I - Généralités sur les méthodes chromatographiques

Schéma d'une séparation par élution

Evolution entre l'injection (début de chromatographie) et la détection (fin de chromatographie)

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 II – Chromatographique Liquide Haute Performance

Les méthodes de CLHP ou HPLC se sont progressivement diversifiées et

répandues dans tous les laboratoires ou elles représentent l’outil de séparation
chromatographique le plus courant ( à l’échelle analytique ou préparative). Ce sont
elles qui seront développées içi.

1 – Principe

Le principe de toute chromatographie est basé sur la différence d’affinité d’un composé
entre une phase mobile (gaz ou liquide) et une phase stationnaire (silice, alumine, résine
échangeuse d’ions, liquide…).

Sous l’influence de deux effets antagonistes :

-effet d’entraînement exercé par la phase mobile
-effet de rétention exercé par la phase stationnaire,
les constituants du mélange se déplacent à des vitesses différentes et sont alors séparés.

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 II – Chromatographique Liquide Haute Performance

2 - Appareillage

Ces différents modules sont reliés par

des tubes en acier inoxydable de
diamètre interne aussi faible que
possible (~0,1 mm)

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 II – Chromatographique Liquide Haute Performance

2 - Appareillage

Phase stationnaire : la colonne

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.1 La chromatographie de PARTAGE

Principe :
Cette chromatographie liquide-liquide est fondée sur la (ré)partition différentielle de chacun
des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre
la phase mobile. C'est une technique essentiellement qualitative. .

Théorie de la partition : La distribution d'un soluté A entre deux solvants non-miscibles, l'un
aqueux ( Saq ), l'autre organique ( Sorg ), relève de l'équilibre :

La constante d'équilibre (qui est le coefficient de partage) est égale à K :

C'est l'équation de Nernst pour le partage d'une substance entre 2 phases liquides-non
miscibles.
[ASorg] : concentrations en soluté A dans la phase organique

[ASaq] : les concentration en soluté A dans la phase aqueuse

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.1 La chromatographie de PARTAGE

Noter qu'ici, nous avons un soluté qui est plus miscible dans le solvant organique que dans
le solvant acqueux (ASorg est le numérateur et ASaq le dénominateur de l'équation). K aura
donc une valeur supérieure à 1.

Cette constante d'équilibre à une température donnée est appelée coefficient de partage
ou de distribution.
La transposition de cette partition d'un composé entre deux phases liquides dans un système
chromatographique est rendue possible par la fixation de l'un des solvants sur un support
inerte, l'autre solvant constituant la phase mobile. Un soluté très soluble dans la phase
fixée migrera lentement, la force de rétention prédominant sur la force d'entraînement. A
l'inverse, un soluté soluble dans la phase mobile migrera rapidement..

Figure 1 : Schéma d'une chromatographie liquide-liquide ascendant 19

 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.1 La chromatographie de PARTAGE

Le schéma ci-dessous montre comment calculer le RF dans le cas d'une chromatographie

liquide-liquide ascendante :

Figure 2 : Rapport frontal.

Le rapport frontal est donc égal à :

Un soluté très soluble dans la phase fixe aura un RF faible ; très soluble dans la phase
mobile, son RF sera élevé et proche de 1.
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 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

PHASE NORMALE

aminopropyle Si (CH2)3 NH2 para-nitrobenzyle Si CH2 NO2

alkylenitrile Si (CH2)n C N diol Si (CH2)3 O C CH CH2

H2
OH OH

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

PHASE NORMALE

EXEMPLES

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

PHASE INVERSE

C8 ou RP-8 Si (CH2)7 CH3

C18 ou RP-18 Si (CH2)17 CH3

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
PHASE INVERSE

EXEMPLES

Milieu acide :
Phase mobile :Acetonitrile:20mM Phosphate de potassium, pH
2.5 (65:35)
Débit :1.0ml/min
Température colonne :30°C
Détection:UV à 254nm
Volume d'injection :10µL
Colonne: Alltima™ C18, 5m, 150 x 4.6mm
O 2 OH 3 4
1 CONEt2
NH CO2H

N O
H
uracile phénol acide 4-phénylbutyrique
(non utilisé à pH 7) N ,N -diéthyl-méta-toluamide
6 O OH 7 8
5

N
O OH
3-butylpyridine propylbenzène butylbenzène
Quinizarin
Colonne: Adsorbosphere™ C18, 5m, 150 x 4.6mm

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.2 La chromatographie d’Exclusion

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou

perméation de gel.

Principe :
Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur
forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et
sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et
moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration
est freinée.

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une
relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

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III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.2 La chromatographie d’Exclusion

Figure 1 : Schéma du tamisage moléculaire.

Types de gels :
Gels hydratés (les plus utilisés) : le SéphadexTM (G10 à G200) qui sont des
polyosides bactériens de type dextran (poly D-glucopyranosyl a, 1 -> 6), et le
SépharoseTM (agarose).

Le gain d'eau correspond au nombre de grammes d'eau fixés par gramme de

substance sêche.
Gels permanents : ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux
(silice). Ici, des effets d'adsorption s'ajoutent au tamisage moléculaire.
26
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.2 La chromatographie d’Exclusion

Figure 2 : Représentation d'un gel d'exclusion.

Représentation des résultats :

Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution (Figure 2 ci-
dessous) : log MM = f (Ve)
Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage
entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV).

Le KAV, est le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel :

KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm)
Vt = volume total (il est mesuré en remplissant la colonne d'eau)
Vm = volume mort (il est déterminé en mesurant le Ve d'une substance totalement exclue) 27
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.2 La chromatographie d’Exclusion
présentation du logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution :

Figure 3 : Variation du volume d'élution en fonction de log MM

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont
donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ).

Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur
migration est freinée.

Une molécule totalement incluse sera éluée avec un volume d'élution V* = Vm + Vi, où Vi est le
volume d'eau interne aux granules de gel(voir plus bas).
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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.2 La chromatographie d’Exclusion
Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires (voir figure
ci-dessous).

Figure 4 : Elution des solutés dans l'ordre inverse des masses moléculaires.
Théorie de la chromatographie d'exclusion :

On considère une colonne de volume total Vtotal remplie d'un gel solvaté :
Vtotal = V0 + Vi + Vg

-V0 = Vm = volume d'eau externe aux granules

-Vi = volume d'eau interne aux granules
-Vg = volume du gel
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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.2 La chromatographie d’Exclusion
Un soluté est distribué dans l'eau interne et l'eau externe selon un coefficient de distribution (de partage) : K
si K = 0,le soluté est totalement exclu.
si 0 < K <1, le soluté est partiellement inclus. Le taux d'inclusion augmente avec K.
si K = 1, valeur théorique correspondant à une inclusion totale d'un composé dans le gel.
si K > 1, le soluté est inclus et adsorbé.

Figure 5 : Diagramme d'élution des substances A et B.

Donc, si l'on dépose un mélange de 2 solutés A et B dont les constantes de distribution sont respectivement
égales à 0 et 1,
A sera élué avec un volume d'élution VeA = Vm
B sera élué avec un volume d'élution VeB = Vm + Vi
L'expression générale qui relie le volume d'élution d'un soluté à son coefficient de distribution est :

La constante K est égale à : concentration du soluté dans l'eau interne / concentration du soluté dans l'eau
externe. 30
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III -1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)
III-1.2 La chromatographie d’Exclusion
Application de la chromatographie d’exclusion:

Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l’élimination des sels ou de petites
molécules dans les solutions
Protéiques : DESSALAGE, ECHANGE DE TAMPON….
Elle est également appliquée au FRACTIONNEMENT DE MELANGE DES
MACROMOLECULES ET A LA DETERMINATION (approximative) DE LA MASSE MOLAIRE
DES PROTEINES.
Dans ce dernier cas , il faut d’abord étalonner la colonne avec des protéines connus de masse
molaire connue
, tracer la courbe Ve = f(Log M) , puis effectuer une détermination graphique

31
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1.2 La chromatographie d’Exclusion stérique en HPLC

EXEMPLES

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.3 La chromatographie d’Adsorption:

Principe :
Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la (ré)partition des solutés entre
l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de
rétention (par adsorption) et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui
en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce
qui permet leur séparation.

L'adsorption : L'adsorption est la fixation des molécules dissoutes par la phase solide. Cette
fixation est due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la
molécule adsorbée : liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals.

Les adsorbants : Ce sont des solides très divisés (l'adsorption est un phénomène de
surface); c'est ainsi que 1 g d'alumine pour chromatographie peut représenter une surface de
l'ordre de 100 m2. On distingue :
-Les adsorbants à faible capacité d'adsorption comme l'alumine, le talc ou le
carbonate de sodium.
-Les adsorbants forts comme le gel de silice.

33
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.3 La chromatographie d’Adsorption:

Certains adsorbants présentent une forte polarité électrique comme le gel de silice ou
l'alumine ; d'autres ont une faible polarité comme le charbon actif.

Figure 1 : Silices polaires greffées.

Les solvants : Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase
stationnaire, la température, la pression et le soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité
du solvant :
34
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.3 La chromatographie d’Adsorption:

Technologie : La chromatographie d'adsorption est appliquée selon différentes

techniques :
sur colonne : ouverte à pression ambiante, en flash chromatographie, à moyenne
pression, en HPLC;
sur papier : en chromatographie ascendante ou radiale ; dans cette technique le papier
constitue la phase fixe ;
sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coulé sur une plaque (verre,
aluminium, plastique), mélangé à un liant (platre).

Solvant de base : un solvant qui a peu d'affinité pour la phase stationnaire.

Exemple : les alcanes (hexane, isooctane…)
Les Solvants sélectifs : prendre des solvants qui ont une affinité pour la phase stationnaire.
Pour changer la sélectivité, faire des essais en changeant de groupe de sélectivité (I, V ou
VIII).
Exemples : éther isopropylique (groupe I) ou dichlorométhane (groupe V) ou chloroforme
(groupe VIII). 35
 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION

EXEMPLES

séparation de sept phénothiazines

NMe2
H
N Cl N OMe

S S
a : 2-Chlorophénothiazine b : levomepromazine
NMe2 NMe2

N Cl
N SO 2NMe2
S
c : chlorpromazine
OH S
d : diméthothiazine
N OH

N N
N

N
S N
e : propériciazine
S SO2NMe2
f : pipothiazine
N

S
O O g : oxomémazine

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.4 La chromatographie en phase inverse

Principe :

C'est une chromatographie d'adsorption liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire

se distingue par son apolarité. Elle est constituée, la plupart du temps, par des silices
apolaires greffées. Il existe des greffons apolaires de taille différente, de 2 à 18 atomes
de carbone (C2 à C18), donc de polarités différentes.

La phase mobile est polaire et hydrophile. Les séparations sont fondées sur des interactions
hydrophobes entre les molécules à séparer et la phase stationnaire.

Ainsi, plus un soluté est apolaire, plus il sera retenu au niveau de la phase solide
stationnaire. A l'inverse, plus un soluté est polaire, plus il sera entraîné par la phase mobile
liquide.

37
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.4 La chromatographie en phase inverse

Figure 1 : Silices apolaires greffées.

Technologie : Dans la pratique, cette chromatographie ne s'applique qu'en HPLC, elle

porte le nom de RP-HPLC (ou Reverse Phase HPLC, ou HPLC en phase inverse). La RP-
HPLC s'applique bien à la séparation de petites molécules apolaires : lipides, acides
aminés, peptides.

38
 – Chromatographique Liquide Haute Performance

CHROMATOGRAPHIE DE PAIRES D’IONS

Notion de paire d'ions : Les composés ioniques tels que A- ou C+ se séparent mal dans ce
type de chromatographie, d'où l'utilisation d'une technique appelée paire d'ions : on forme un
ensemble neutre et apolaire tel que (A- / X+) ou (C+ / Y-) qui est chromatographié.

Exemple : séparation d'acides nucléiques AMP, ADP, ATP :

39
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.4 La chromatographie sur échange d’ions

Principe :
Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements
ionisables, qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions, au
contact d'autres ions provenant d'une solution.
Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une résine cationique est
chargée négativement.
Résine-G- / X+ + cation+ <=> Résine-G- / cation+ + X+

Figure 1 : Résine échangeuse de cations (résine cationique).

40
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.4 La chromatographie sur échange d’ions

Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une résine anionique est
chargée positivement.
Résine-G+ / Y- + anion- <=> Résine-G+ / anion- + Y-

Figure 1 : Résine échangeuse d ’ anions (résine anionique).

41
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.4 La chromatographie sur échange d’ions

Technologie : La chromatographie par échange d'ions se pratique le plus souvent sur

colonne, mais la méthode peut être transposée sur couche mince. Du papier échangeur
d'ions est également commercialisé . Enfin l'échange d'ions peut être réalisé en batch : la
résine est mise en présence de la solution et agitée mécaniquement.

Propriétés des échangeurs d'ions : Le support peut être minéral, mais il est le plus
souvent organique (résine de copolymérisation, polyosides : dextrines ou celluloses. Les
groupements fonctionnels chargés des résines sont fixés par covalence sur le support.

Les groupements fonctionnels des résines cationiques (résines classées d'après

leurs aptitudes à l'ionisation) :

Résines cationiques fortes : sulfoniques (très fortement ionisées, quel que soit le pH) :

Résine sous forme acide :Résine-SO3- / H+ (contre-ion : H+)

Résine sous forme sodique :Résine-SO3- / Na+(contre-ion : Na+)

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 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL

III-1.4 La chromatographie sur échange d’ions

Résines cationiques intermédiaire :

à groupement phospho : Résine-H2PO4- / H+ Résine-H2PO4- / Na+
Résines cationiques faibles :
carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) : Résine-COO- / H+ Résine-
COO- / Na+

à groupement carboxyméthyl : Résine-CH2-COO- / H+ Résine-CH2-

COO- / Na+
Résines cationiques très faibles :
phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin) : Résine-O- / H+ Résine-O- /
Na+

Les Groupements fonctionnels des résines anioniques :

Résines anioniques fortes :
résines à groupements aminés quaternaires.
résines à groupements aminés tertiaires.

Résines anioniques faibles :

résines à groupements aminés secondaires et primaires.
43
 III – Les différents types de techniques chromatographies
III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL
III-1.4 La chromatographie sur échange d’ions

Capacité de rétention d'un échangeur d'ions : C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la
résine peut échanger par unité de masse. On l'exprime par gramme de résine sèche (ou moins souvent
par unité de volume : par ml de résine humide).

Elution : L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de chargé et de concentration
plus élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+, H+...
.

44
 III – Les différents types de techniques chromatographies

CHROMATOGRAPHIE ECHANGE DE CATION

45
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.5 La chromatographie d’affinité

Principe :

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromoléculaire

chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique
pour un soluté de l'échantillon à analyser.

Trois types d'affinités sont utilisées :

•affinité enzyme-substrat
•affinité ligand-récepteur
•affinité antigène-anticorps

Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra
de purifier l'enzyme, le récepteur ou l'antigène, respectivement .

46
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.5 La chromatographie d’affinité

Figure 1 : Les trois étapes d'une chromatographie d'affinité.

1 - Etape de FIXATION : Le mélange de molécules contenant le composé à purifié est chargé

sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue
par l'effecteur greffé sur la phase stationnaire.

2 - Etape de PURIFICATION : En continuant à faire passer du tampon dans la colonne,

toutes les molécules contaminantes sont éliminées et éluées.

3 - Etape d'ELUTION : La molécule purifiée est décrochée de la colonne et est recueillie dans
l'éluant.

47
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.5 La chromatographie d’affinité

Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protéine (P),
l'autre sera qualifié de ligand (L) de cette protéine :

P + L <=> PL

L'association de P et de L forme le complexe PL. La constante définissant cet équilibre

est :

Ka = (P).(L) / (PL)

NB : C'est une constante d'association à l'équilibre, qui s'écrit donc avec un "K"
majuscule.

La phase stationnaire (le gel d'affinité) : elle est constituée d'un effecteur fixé par
covalence à un support (carboxyméthylcellulose, Séphadex, gel de polyacrylamide)
par l'intermédiaire d'un bras de fixation ("spacer" en anglais).

48
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.5 La chromatographie d’affinité

Exemples de dérivés de la carboxyméthylcellulose ou CM-cellulose :

La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.

- O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long)

La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.

- O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court)

La CM- aminohexylique (ou aminododécylique) succinylée : permet la fixation d'un
effecteur à fonction -NH2 réactive.

- O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long)

La longueur du bras est choisie de manière à limiter les contraintes stériques.

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-1-La Chromatographie en phase liquide (CPL)

III-1.5 La chromatographie d’affinité

Effecteurs :
•Affinité enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs réversibles,
effecteurs allostériques, coenzymes.
•Affinité ligand-récepteur : haptènes, antigènes, anticorps.
•Affinité antigène-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques.

Elution : elle peut être réalisée de différentes façons :

•Tampon de pH différent de celui ayant permis la charge : changement de l'état
d'ionisation de la protéine : désorption
•Tampon de force ionique différente de celle ayant permis la charge : changement de
conformation de la protéine.
•Compétition avec un ligand libre.

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III – Les différents types de techniques chromatographies

III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Principe :

1 - La chromatographie gaz-liquide (partage).

La phase stationnaire est un liquide non volatil fixé par imbibition d'un support inerte. Le
soluté se partage entre le gaz vecteur et le liquide stationnaire. Plus un soluté est soluble
dans la phase stationnaire, plus le RF (distance parcourue par le soluté / distance
parcourue par la phase mobile) est petit et le temps d'émergence élevé.

2 - La chromatographie gaz-solide (adsorption).

La phase stationnaire est un solide adsorbant (gel de silice, alumine…). Plus l'adsorption
d'un soluté sur la phase stationnaire est élevée, plus le RF est faible et le temps
d'émergence élevé.

Dans les deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés ; la phase mobile est
constituée du gaz vecteur et des solutés gazeux.

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Figure 1 : schéma d'un chromatographe en phase gazeuse.

Les échantillons : les échantillons liquides sont injectés dans la chambre de

vaporisation à l'aide d'une micro seringue. La température est telle (c'est généralement
celle du four) que la vaporisation est immédiate. Les limites de sensibilité sont, selon
les appareils, de l'ordre du ng et même du pg. 52
 III – Les différents types de techniques chromatographies

III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse(CPG)

Le traitement de l'échantillon varie selon les substances analysées :

- lorsque les solutés sont directement volatilisables, les substances sont solubilisées
dans un solvant et chromatographiées.
- lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien
sont décomposés à cette température, il faut les transformer en dérivés volatils stables
: les acides aminés sont ainsi estérifiés par le butanol, les acides gras estérifiés par le
méthanol, les oses réduits en alditols, puis acétylés…

La température : on adopte généralement une température légèrement supérieure au

point de vaporisation du constituant le moins volatil. D'un point de vue technique, la
colonne est maintenue dans un four à bain d'air thermostaté.

Les supports utilisés : le chromosorb (brique réfractaire pilée), le kieselguhr (terre de

diatomées), le quartz... Le liquide stationnaire est un hydrocarbure, un silicone, un
ester, un polyol, caractérisé par sa température d'utilisation et sa polarité.

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

III- 2-Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Les colonnes : elles peuvent être métalliques, en plastique pour des séparations à
basse température, en verre et joints Téflon. Diverses formes ont été utilisées :
rectilignes, en U, en spirales (la plus répandue).

Les détecteurs : à catharomètre ; à ionisation de flammes ; à capture d'électrons ;

spectrographie de masse.

En CPG d'adsorption on utilise des colonnes de 1 m de long. En CPG de partage on

travaille avec des colonnes pouvant atteindre 5 m.

Chromatographie en phase gazeuse capillaire (CPGC) : C'est une chromatographie

de partage gaz-liquide, utilisant une colonne capillaire (longueur 5 à 10 m, diamètre :
100 à 250 mm), sans support inerte ; la paroi interne du capillaire sert de support. Elle
permet d'obtenir un nombre de plateaux égal à 100000/m.

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 III – Les différents types de techniques chromatographies

III-2-Les Chromatographies en phase gazeuse (CPG)

La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans ce cas :

- La chromatographie gaz-liquide :
C'est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fixé par imbibition d'un
support inerte.
- La chromatographie gaz-solide :
C'est une chromatographie d'adsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant.

EN RÉSUMÉ :
Les différents principes de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de
l'un des facteurs suivants, afin de séparer des composés constituant un mélange :
- la solubilité dans un solvant liquide : dans la chromatographie de partage
- la taille, la forme : dans la chromatographie d’exclusion
- la polarité : dans la chromatographie d’adsorption , et d’ adsorption en phase inversé
- la charge électrique : dans la chromatographie d’échange d’ions
- la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers : dans la
chromatographie d’affinité.
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