UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

BIOTECHNOLOGIES VEGETALES
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
Dr OUMAR BA
 BIOTECHNOLOGIES ?!?

« Toute application technologique qui utilise des SYSTÈMES BIOLOGIQUES,

des organismes vivants ou des dérivés de ceux-ci, pour réaliser ou modifier des
produits ou des procédés à usage spécifique » (Convention de Rio sur la diversité biologique, 1992)

SYSTÈME
BIOLOGIQUE

Plantes Animaux

Micro-organismes
(bactéries, Champignons, virus) 1
Les Biotechnologies
 Biotechnologies vertes
Les biotechnologies vertes reposent
sur un vaste ensemble de techniques
de recherche en biologie végétale,
techniques de culture in vitro ou
techniques moléculaires telles que
mutagenèse, transgénèse, etc.,

L’émergence d’innovations
biotechnologiques dépend étroitement
de la progression des connaissances
sur le fonctionnement du génome et
des plantes.
 Biotechnologies « vertes »
• Culture in vitro de tissus et/ou d’organes
• Multiplication de plantes à grande échelle.
• Technologies de 2ème génération (Génie génétique…)

CLONAGE IN VITRO

o Technologie majeure pour la production de végétaux sains et de haute qualité

2
o Applications commerciales qui génèrent des emplois
 Culture in vitro ?
Il s’agit d’une technique par laquelle n’importe quelle partie de la plante (explant) est
cultivée dans un milieu nutritif approprié contenant des phytohormones, sous des
conditions aseptiques, pour obtenir la croissance d’une ou des nouvelle (s) plante (s)
dans un espace réduit et un environnement contrôlé.

3
Conditions naturelles
 Concept de Totipotence cellulaire

Haberlandt, 1902
“Toute cellule végétale est capable de se dédifférencier et de
régénérer un autre individu identique à celui dont elle est issue”

Cellules méristématiques et différenciées

Cellules dédifférenciées

Possibilité de régénérer une plante entière à partir de n'importe

laquelle de ses cellules 4
La plupart des cellules végétales peuvent se développer en plantes entières
• Soit en formant des embryons
• Soit en formant des bourgeons ou des plantes entières enracinées

La totipotence des cellules et tissus végétaux permet donc de

reproduire les plantes à l’identique : propagation clonale 5
 Historique

- Concept de la totipotence cellulaire végétale (G.HABERLANDT, 1902)

- Action de la gibbérelline sur la croissance (E. KUROSAWA, 1926)

- Réussite culture de racines de tomates (P.R. WHITE, 1934)

- Culture et multiplication de cellules cambiales de saule avec ajout

d’auxines dans le milieu (R.J.GAUTHERET, 1935)
 Historique

- Cultures indéfinies de tissus de carotte: cal (R.J.GAUTHERET, 1939)

-Tumeurs végétales ou crown-gall, amorce les travaux conduisant aux

première manipulations génétiques (A.C.BRAUN, 1941)

- Dédifférenciation: rejuvénilisation (R.BUVAT, 1944)

- Régénération de plants à partir d'apex de grande taille (E.BALL, 1946)

- Absence de virus dans les méristèmes de tabac virosé (P.LIMASSET et

P.CORNUET, 1949)
- Régénération de plantes saines de Dahlia (G. MOREL et
C.MARTIN,1952)
- Premières cultures de cellules isolées à partir de cals friables en milieu
liquide agité (W.H.MUIR et col., 1954)
 Historique
- Premières cultures de cellules isolées à partir de cals friables en milieu
liquide agité (W.H.MUIR et col., 1954)

- Cytokinines induisent des divisions cellulaire dans des cultures de tissus

de tabac (C.O.MILLER et col.,1955)
- Régénération de racines et tiges à partir de cals sous auxines et
cytokinines (F.SKOOG et C.MILLER, 1957)
- Obtention d’embryons somatiques à partir de racines de carotte
(F.C.STEWART et J.REINERT, 1958)
- Mise au point du milieu MS (T.MURASHIGE et F. SKOOG, 1962)

- Culture d’anthère et obtention de plantes haploïdes de Datura innoxia

(S.GUHA et S.C.MAHESHWARI, 1964)
 Historique

- Régénération de plantes à partir de protoplastes de Nicotiana tabacum

(I.TAKEBE et col., 1971)

- Culture d'ovaires d'orge non fécondés (L.H.SAN NOEUM, 1976)

- Cryoconservation d'apex d’œillets (-196°C) et régénération pousses

(SEIBERT, 1976)

- Premières plantes de tabac transgéniques résistantes à la kanamycine

(M. Van MONTAIGU et col., 1983)
 CULTURE IN VITRO

L’appellation générale « CIV » fait référence à 4 catégories de culture :

➢ cultures d’organes,
➢ culture de tissus,
➢ culture de cellules en suspension
➢ culture de protoplastes.

La réussite fait appel à un corpus de méthodes qui font intervenir :

- choix & prélèvement du matériel végétal,
- conditions d’asepsie,
- satisfaction des besoins nutritifs de l’explant : milieu nutritif de culture synthétique,
- conditions d’incubation adéquates (T°C, Lux, Humidité…). 6
 MICROPROPAGATION IN VITRO

Ou

MULTIPLICATION VEGETATIVE IN VITRO

Ou

CULTURE IN VITRO
d’organes, de tissus et de cellules

Ou

CLONAGE IN VITRO
7
 PRINCIPE
Il s’agit de régénérer dans de brefs délais et de façon accélérée des
milliers de plantes entières conformes au pied-mère

Les explants sont constitués de fragments d’organes

L’ensemencement s’effectue sous des conditions aseptiques rigoureuses 1
5
8
 MODES DE REPRODUCTION DANS LA NATURE
➢ Deux modes de reproduction chez les angiospermes :
❑ Reproduction sexuée : rencontre ❑ Reproduction asexuée : processus de
des gamètes haploïdes : Fécondation: multiplication végétative
formation de la graine ou semence sèche
ou orthodoxe ou récalcitrante

Graine
9
 DEFINITION

Multiplication végétative : Mode de reproduction en dehors des phases de

sexualité assurant la propagation d’individus identiques, sans qu’il y ait un
brassage génétique

Production d’un végétal nouveau à partir d’un simple fragment de végétal

(morceaux de tiges, de bourgeons, etc.) ou grâce à des organes spécialisées :
stolon, rhizome, tubercule, bulbe, bulbilles, etc.

Multiplication végétative naturelle ou in vivo : obtention de plantes entières ou plantes-

filles qui possèdent le même programme génétique que la plante d’origine

Produits : copies conformes du végétal « parent » : clone 10

 APPLICATIONS DE
LA TECHNIQUE EN HORTICULTURE
MULTIPLICATION CONFORME OU CLONAGE

• Exploitation par les horticulteurs,

pépiniéristes et les jardiniers

• BOUTURAGE, MARCOTTAGE, GREFFAGE

• Conservation des caractères d’une variété

donnée

• Clonage des végétaux beaucoup plus

11
simple à réaliser que le clonage animal
 AVANTAGES DE LA PROPAGATION CLONALE NATURELLE
PAR RAPPORT A LA FECONDATION

Les graines peuvent avoir Certaines espèces produisent peu ou pas de

une période de GRAINES VIABLES
DORMANCE trop longue
ou présenter des Les plants croisés produisent une descendance trop
dormances complexes variable (FORT TAUX D’HÉTÉROGÉNÉITÉ)

Les plantes peuvent avoir une période de JUVÉNILITÉ TROP LONGUE

Obtention de plantes présentant toutes les mêmes caractéristiques :

CLONES
La descendance clonale est fortement Le clonage permet de combiner les
UNIFORME pour tous les caractères GÉNOTYPES en une seule plante12
 INCONVENIENTS DE LA MULTIPLICATION
VEGETATIVE NATURELLE PAR RAPPORT A LA
FECONDATION

➢ BEAUCOUP D’ESPÈCES RÉFRACTAIRES À LA

MULTIPLICATION VÉGÉTATIVE

Exemples : arbres, espèces ligneuses, etc.

Quelques espèces peuvent être multiplié à partir de feuilles :

Sansévière, Bégonia, Kalanchoe, Saintpaulia, Peperomia,
Crassulacée.

13
Peperomia Crassulacée Saintpaulia Sansévière
 Tous les végétaux ne peuvent pas être multipliés par voie
végétative
✓ Pourquoi de nombreuses espèces sont-elles réfractaires aux techniques
traditionnelles de multiplication végétative ?

✓ Si on arrive à bouturer des tiges, pourquoi n’arrive-t-on pas à faire la même

chose avec les racines ?

✓ Pourquoi n’arrive-t-on pas à bouturer des petits morceaux de plantes ?

✓ Face à ces problèmes les chercheurs se sont tournés vers une autre
alternative :

LA CULTURE IN VITRO. 14
 La micropropagation in vitro dérive de la
multiplication végétative naturelle

❑ La micropropagation in vitro dérive de ce phénomène, par observation dans la

nature de la multiplication végétative.

❑ On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu nutritif artificiel et

dans un environnement contrôlé.

❑ Suite aux subcultures successives, on obtient des plantes identiques à la plante

de départ et que l'on peut continuer à multiplier.

❑ On exploite ainsi la propriété de totipotence des cellules végétales.

15
DIFFERENTS TYPES DE CULTURE IN VITRO
Culture
de
graines
Culture de Culture
méristèmes de
cellules

Culture Culture Culture de

de cal in vitro bourgeons

Culture Culture de
d’organes protoplastes
Culture
d’embryons
16
 TECHNIQUES ACQUISES SUR LE CLONAGE IN VITRO

• Microbouturage in vitro accéléré et conforme pour multiplier à

grande échelle : clonage massale
• Bourgeonnement adventif
• Embryogenèse somatique, Suspensions
cellulaires : Création de variants somaclonaux, production de
métabolites secondaires
• Culture de méristèmes : Assainissement variétal
• Haplométhodes : Androgénèse et gynogénèse
création de lignées pures
• Culture de protoplastes Control Bt corn
• Transgénèse:
• Plantes transgéniques
• Acquisition de résistance à
• des maladies, Herbicides, insectes,
• des contraintes abiotiques
yaleglobal.yale.edu 17
 QUEL EST LE (S) ROLE (S) DE LA CULTURE IN VITRO?

La culture in vitro est au service de

la qualité des semences et plants

Essentielle pour Cela passe par l’utilisation de

améliorer la variétés améliorées ou de
compétitivité des plants produits selon un cahier
entreprises du végétal des charges particulier

Son principe repose sur la capacité des cellules végétales, dans les
conditions adéquates, à régénérer une nouvelle plante
18
 Elle offre des outils qui peuvent aider à différents niveaux du programme
d'amélioration pour :

- réduire les délais de mise sur le marché des nouveaux cultivars,

- diffuser rapidement des espèces à cycle de développement long,
- exploiter facilement les ressources génétiques
- assainir les variétés, les conserver et réduire les coûts de production,
- produire en masse des génotypes performants sélectionnés,
- produire des substances naturelles, des métabolites secondaires,
- créer des variétés nouvelles par le biais de la transformation génétique
ou l’exploitation de la variation somaclonale,
- décrypter la physiologie des plantes au plan fondamental,
- sauvegarder la biodiversité. 19
 Propagation des plantes

• Fécondation • Végétative
• Sexuée • Asexuée
• Graines • Clones
• Individus • In vitro
• In vivo • Microplantes

LONG !!! RAPIDE !!!!

20
21
 Autres Avantages

• Plus rapide que la technique in vivo : Gain de temps et d’espace de

stockage (Miniaturisation)
• Le transport et le matériel de départ est plus aisé à manipuler
• Les plantes sont plus vigoureuses et plus juvéniles
• Production en très grand nombre à l’année
(taux de multiplication: X10 tous les 2mois –possibilité de produire 106
microplantes à partir d’une seule plante en 1 an)
• Contraintes saisonnières et environnementales éliminées
• Mise sur le marché très rapide des plants produits
• Gain d’argent : Coût du vitroplant : 0.15€ par explant (~100 FCFA)
22
23
 Autres Contraintes
• Personnel qualifié exigé
• Investissement de départ coûteux (labo)
• Difficulté d’enracinement (ligneux)
• Sevrage obligatoire des plantes
• Acclimatation en serre délicate
• Le coût du plant in vitro peut être plus élevé

24
 Applications

♣ Beaucoup de laboratoires commerciaux Jeunes plants de Cymbidium

(Orchidées)
♣ Des centaines de millions de plantes issues de microbouturage sont
produites annuellement dans le monde, pour un nombre toujours grandissant
d'espèces.

♣ Plus de 300 espèces seraient concernées par la multiplication in vitro à

l'échelle industrielle.

♣ CIV peut également induire la formation d’organes de réserve comme des

microtubercules (Pomme de terre), des bulbilles ou des protocormes chez les
Orchidées. 32
PRODUCTION DE SEMENCES DE
POMME DE TERRE

www.gnis-pedagogie.org
26
33
 PHASES DE PRODUCTION

 Phase au laboratoire

 Phase en serre

 Phase au champ
27
 PROPAGATION MASSALE

Germes mis en
culture
1

Transfert en bocaux
3
2 de culture Vitroplants

4
28
Découpage
Types de Semences
✓ Vitroplants

✓ Microtubercules

✓ Minitubercules

✓ Tubercules 29
 MILIEUX LIQUIDES : SUSPENSIONS CELLULAIRES
✓ Générallement initié pour permettre un développement homogène et synchrone de
cals, pour la production de métabolites secondaires, productions d’amas pro-
embryogènes (embryogenèse somatique), fusion de protoplastes, transformations
génétique, etc.
✓ Croissance très rapide des agrégats cellulaires
✓ Meilleure nutrition et oxygènation des explants par rapport au milieu solide
✓ Certaines voies métaboliques sont spontanément mieux exprimées
✓ Optimisation de conditions de cultures simples processus de différenciation ont été identifiés
✓ Nécessité de respecter la fréquence de repiquage car la sécretion de métabolites
toxiques dans le milieu peut empêcher la croissance de la culture.

VINBLASTINE et VINCRISTINE :
anticancéreux les plus utilisés en
chimiothérapie contre leucémie, la
maladie d’Hodgkins et les tumeurs
solides 30
 MILIEUX LIQUIDES : CULTURES EN BIOREACTEUR

✓ Passage en BIORÉACTEUR : augmentation de la

capacité de culture : production industrielle (Nestlé)

✓ Permet le changement d’échelle « scaling up » :

PRODUCTION INDUSTRIELLE DE MÉTABOLITES
SECONDAIRES (anti-cancéreux, molécules d’intérêt)

✓Utilisé en phase de prolifération et de

morphogenèse embryonnaire

✓ GENES DE FLAVONOÏDES isolés des plantes et

voie de biosynthèse reconstruite dans les bactéries.

✓ Les bactéries sont cultivées dans les bioréacteurs

pour la PRODUCTION MASSALE DE FLAVONOÏDES
31
BIOREACTEURS INDUSTRIELS

32
 LABORATOIRE CAMPUS DE BIOTECHNOLOGIES VÉGÉTALES
(LCBV, BV-FST, UCAD)
Production de vitroplants de : Pomme de terre, Manioc, Tomate, Riz, Bambou, Filao, Baobab,
Parkia, Detarium, Corossol, Pomme canelle, Dugor, Sterculia (Platane du Sénégal) etc.
LABORATOIRE NATIONAL DE RECHERCHES SUR LES PRODUCTIONS
VÉGÉTALES (URCI-LNRPV, ISRA-Bel-air)
Production de vitroplants de Pomme de terre, Manioc, Patate douce,Ananas,Banane douce,
Banane plantain…
AGENCE NATIONALE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE APPLIQUÉE (ANRSA -
MESRI) 2011-2019
Production de vitroplants de Pomme de terre, Patate douce, Manioc, Sterculia, Baobab, Banane,
Tamarin. Transfert aux CRE.
SENEGINDIA SA (SWAMI AGRI) - 2017 ONG ASeS et projet SB- AGROIN –
Construction d’un laboratoire et production de CDH : Production de vitroplants de manioc
vitroplants de Pomme de terre (Projet)/ Semences pour les producteurs de Thiès 33
▪ ENJEUX

➢ MAÎTRISE DES TECHNIQUES de régénération (pas universelle), les différentes

espèces ont un comportement in vitro inégal
➢ Nécessité d’un PERSONNEL QUALIFIÉ et d’équipements
➢ Capacité de gestion d’une SERRE/OMBRIÈRE à GRANDE ÉCHELLE
➢ Etre capable de produire du matériel végétal de qualité, vigoureux et sain , notamment
pour la PRODUCTION DE SEMENCES
➢ Méthodes de clonage in vitro: Permet de PRÉSERVER et de propager une structure
génétique particulière, Outils de CONSERVATION DE LA BIODIVERSITÉ
➢ Savoir LIMITER LE NOMBRE DE CYCLE DE REPIQUAGE (subcultures)
pour éviter la dégénérescence
➢ Réaliser des diagnostics des BESOINS EN COMPÉTENCES ET EN
FORMATIONS
➢ Inciter le secteur privé à la création d’ENTREPRISES ou d’INDUSTRIES
▪ OPPORTUNITÉS

➢ Assurer la PROPAGATION CLONALE (propagation massale) DE GÉNOTYPES

ÉLITES d’intérêts pour satisfaire les besoins en Agriculture et en phytothérapie : maintien
permanent d’un stock suffisant d’individus pour assurer la fourniture régulière d’une
variété/clone couramment commercialisée
➢ CIV: outil très efficace au service de la RECHERCHE BIOLOGIQUE,
PHYSIOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE,
➢ CONSERVER UNE BIODIVERSITÉ de qualité : conservation de génotypes dans des
conditions idéales de protection contre les intempéries, les agresseurs et les pathogènes dans
un environnement restreint
➢ Maintien par bouturage in vitro de variétés et de collection de BANQUES DE GÈNES dans
des instituts nationaux ou internationaux (CIP, ICARDA, ICRISAT, IITA, IRRI, CIAT, etc.)
➢ REJUVÉNILISATION INDUITES pour les vitroplants et gain en vigueur
➢ CRÉATION D’EMPLOIS, D’ENTREPRISES, DE LABORATOIRES PRIVÉS
➢ Collaboration et partenariat possibles entre le secteur PUBLIC et PRIVÉ 35
 Chapitre II

Conditions
de la
culture in vitro
Dr OUMAR BA
Laboratoire Campus de
Biotechnologies Végétales
 PLAN
I. Les explants

II. Le milieu synthétique

III. Conditions stériles

IV. Environnement contrôlé

 Les explants

Les explants sont divers :

tige, feuille, racine, fleurs, graines, embryons,
bourgeons, apex, méristèmes, cellules somatiques ou
sexuelles, protoplastes

NB: Le choix de l'explant est fonction de la technique

utilisée, de l'objectif et de l'espèce
 Le milieu synthétique
- Eau distillée

- Microéléments ( Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, B, Cl, Co, Ni)

- Macroéléments (N, Ca, K, S, Mg, P)
- Source carbonée : sucres
Distillateur
- Vitamines
- Acides aminés
- Phytohormones
- Agent gélifiant (milieu solide)
- charbon actif (pour éviter les nécroses)
PH ajusté entre 5 et 6
Vitroplant sur milieu solide:
NB: Autoclavage à 120°C pendant 20mn Omar NIANG
Préparation des milieux de culture
 Quelques exemples de milieux de culture
1. Milieu de Murashige et Skoog (MS ou MS0, 1962)
Mis au point par les physiologistes végétalistes Toshio Murashige et Folke K. Skoog alors que
Murashige effectuait des recherches pour trouver un nouveau régulateur de croissance chez le tabac.
Milieux dérivés du milieu MS: MMS (Mathur et al, 1995), MS/2...
2. Milieu B5 DE Gamborg (1968)
Milieu de culture optimisé pour la culture in vitro de cellules, tissus et organes végétaux. Il contient
un mélange de sels inorganiques, de vitamines et de glucides.
3. Woody Plant Medium (WPM - Lloyd et McCown, 1981)
Développé à l'origine pour la culture du laurier de montagne (Kalmia latifolia). Depuis, ce milieu est
devenu une norme pour la culture de nombreuses espèces de plantes ligneuses.
Les niveaux de nitrate d'ammonium sont 4 fois moins élevés par rapport au milieu de Murashige
& Skoog. L'azote est également fourni par le nitrate de calcium.
4. Milieu de Schenk & Hildebrandt (SH, 1972)
Le milieu Schenk en Hildebrandt a été développé pour la croissance de suspensions de cellules
monocotyles et dicotyles
 Conditions stériles
- Désinfection: explants

- Stérilisation: milieu de culture, verrerie, pinces…

NB: Tout se fait dans un environnement stérile sous

une hotte à flux laminaire horizontale

Pour qu’aucun champignon ou bactérie ne vienne coloniser le

milieu qui leur est très favorable
 Agitateur Hotte à flux laminaire
Autoclave

Machine à laver Hotte à flux laminaire

 Environnement contrôlé

- Température

- Eclairement: Photopériode

- Hygrométrie

Leurs valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi que de la

technique utilisée
Tout se fait sur un espace réduit replanter des hectares de

terrain à partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés

La lumière et la photopériode
➢ La lumière est un facteur déterminant pour la culture in vitro des plantes, elle
est indispensable au déclenchement et au bon déroulement de certains processus
morphogénétiques.
➢ La longueur de jour affecte la vigueur et le développement des proliférations
ainsi que la croissance des cals.
➢ le début de croissance nécessite une faible intensité lumineuse avec 12 à 16
heures de photopériodes

La température
La température est également un élément important lors de la pratique des
cultures in vitro, elle doit être, en général, constante et régulée entre 20 et 25 °C
en continu.

Hygrométrie
L’hygrométrie doit atteindre les 100% dans les flacons.
 Les étapes
de la
culture in vitro
Dr OUMAR BA
Laboratoire Campus de
Biotechnologies Végétales
 Stades de la culture

- Stade 0 : préparatif

- Stade 01 : initiation

- Stade 02 : multiplication

- Stade 03 : élongation et enracinement

- Stade 04 : sevrage et acclimatation

 Stade préparatif

- Phase importante pour remédier contamination

- Culture plante mère sous conditions hygiéniques

- Culture en serre

- Eviter arroser sur la plante

- Pas seulement situation sanitaire mais aussi survie

- Prétraitement avec régulateurs de croissance

 SERRE

CSIR-IHBT, 2014: Inde

 Stade initiation

- Conditions d’obtention de cultures axéniques

- Utilisation bourgeons apicaux, axillaires en général

- Age plante, âge physiologique, taille : méthode à utiliser

- Stress: isolement substances phénoliques

 Stade initiation
Tout type d’organes peut être utilisé pour la culture in vitro; cependant leur
réactivité est variable et dépend de nombreux facteurs comme :

- l’âge de la plante-mère

- la date de prélèvement de l’explant

- La localisation de l’explant sur la plante

- La taille et la nature de l’explant

- L’espèce végétale sur laquelle l’explant est prélevé

- Les explants les plus utilisés sont des fragments de tiges, de feuilles et de racines.
Stade initiation
 Stade multiplication

- Bourgeonnement adventif en général

- Bourgeonnement axillaire

- Embryogenèse somatique

- Comportement explant méthode utilisée

- Evaluer mutations et variations somaclonales

- Influence type explant bien documenté: stade01

 Stade multiplication

- Comportement différents explants lors subcultures

- Meilleur explant pas le même pour tte espèce végétale

- Choix technique effet sur différentes étapes in vitro et ex vitro

- Technique rendement élevé: pas meilleur choix

- Choix technique guidé par facilité manipulation

- Environnement culture influence sur le système

Stade multiplication
 Stade élongation-enracinement

- Produire des boutures et jeunes plantes

- Economie, savoir-faire et infrastructures choix

- Quantité et qualité détermine à terme l’approche

- Nbre, long (racines et tiges), nbre plants enracinés mais qualité

- Vitrification (hyperhydrie) peut affecter survie vitroplants en serre et champ :

Anomalies de croissance se traduisant parfois par un aspect hyalin des explants
qui semblent gorgés d'eau.

- Certains explants: absence stade 03

 Stade élongation-enracinement

- Manipulation individuelle de tiges: main d’œuvre coûteuse

- Elongation des tiges sur milieu sans cytokinines

- Enracinement in vivo

- plus facile de planter une tige

- Opération laborieuse pour enracinement in vitro
- Racines formées in vitro pas fonctionnelles
- Racines in vitro endommagées, porte d’infection
- Autre approche: enracinement in vitro substrat inerte
Stade élongation - enracinement
 Stade Sevrage-Acclimatation
- Qualité des vitroplants à la phase 03

- Vitrification Stress hydrique

- Conditions de serre

- Retour progressif des caractéristiques normales

- Etape 03 détermine niveau autotrophie, vitrification

et facilité sevrage

- Système multicouches, utilisation efficiente espace

Stade Sevrage-Acclimatation
Technique de multiplication végétative qui
consiste à prélever des fragments d'une
plante (rosier, orchidée, etc.) et à les
cultiver en flacons fermés, pour régénérer
un seul ou un grand nombre d'individus.
76
Microbouturage
 Microbouturage

Enracinement

Sevrage

Acclimatation
LCBV, BV/UCAD
Chambre de culture

CSIR-IHBT, 2014: Inde

 Microbouturage
Objectif
- Produire en grande quantité des cultivars d'intérêt horticole, sylvicole, ou
agronomique…

- Multiplication de plantes difficiles à reproduire naturellement (Orchidées)

: 1 à 2 plantes/1 million de graines
 Microbouturage
Avantages

- Plantes génétiquement identiques

- Production en masse (4M plants d’oeillet à partir d’un apex/an)
- Laps de temps court
- Plantes de bonne qualité sanitaire
- Affranchissement des saisons
- Nombre de pieds mères: gain d’énergie
- Multiplication des plantes stériles
- Miniaturisation des vitroplants: plus de 1000 plants/m2
Adansonia digitata, NDOYE Casuarina, NDOYE
Travaux, DIAGNE

Travaux, DIAGNE Manihot, SANE

Sterculia setigera, NIANG Solanum tuberosum, DIEME

Maerua, DIATTA
Mini-tubercules de Solanum tuberosum, DIEME
 Inconvénients Microbouturage

- Coût du plant in vitro élevé

- Main-d'œuvre spécialisée
 Culture de méristèmes et thermothérapie

0,2 à 0,3 mm

Objectif: plantes saines indemnes de virus (on parle d’assainissement)

 Culture de méristèmes
- Thermothérapie associée à la culture de méristème: soumission à des hautes ou basses
températures compatibles (37°C longue durée, 50°C bref) pour éliminer inactiver
agents pathogènes (les virus etc.)

- Applications: pomme de terre, fraisier, pois, arachide, citrus…

- Seule méthode de sauvetage de variétés dont les plantes sont toutes atteintes de virose
 Culture de méristèmes
Avantages
- sauvetage de variétés menacées de disparition car très virosées
sauvegarder la biodiversité

- Plantes à reproduction végétative: pomme de terre, fraisier…

- Plantes saines: sans virus, champignons ou bactéries
- variétés conformes
- Multiplication intensive: rosier (109/apex/an)
 Culture de méristèmes
Limites

- Plantes indemnes mais pas résistantes

- Disparition des chimères (caractère horticole)

 Microgreffage
C’est une technique d'assainissement souvent utilisée lorsque la culture de
méristème est difficile. Exemple : chez les agrumes

Elle consiste à prélever un apex (exempt de virus) d'une plante virosée, et à le

micro-greffer in vitro sur un hypocotyle (partie de la tige située entre la base et
les premiers cotylédons) d'un plant de semis.
 Microgreffage

Greffon portant le
méristème apical

Micro-greffe replacée in
vitro pour permettre la
Plante virosée soudure

Greffon et porte-
greffe taillés en
biseau prêts à être
greffés

Porte greffe enraciné Hypocotyle de la Vitroplants obtenus

in vitro (semis) plante porte-greffe par microgreffage
RAJEUNISSEMENT PAR MICROGREFFAGES RÉPÉTÉS SUCCESSIFS

Microgreffage de méristème sur jeune

semis, un outil puissant d’introduction in
vitro et de rajeunissement des arbres
matures sélectionnés

Les jeunes micro-greffes peuvent

exprimer des caractéristiques
morphologiques juvéniles, croissance,
forme des feuilles ou restauration de
capacités d’enracinement
 DEDIFFERENCIATION
- Organogenèse

- Embryogenèse

La dédifférenciation signifie que les

cellules perdent les caractéristiques de
leurs tissus constitutifs.

Une cellule dédifférenciée présente des

caractères embryonnaires et recouvre
une potentialité importante de
développement.
 Dédifférenciation
ORGANOGENESE
Néoformation zone méristématique formation bourgeons

Enracinement des tiges Formation de tiges

Sékouna Diatta
 Dédifférenciation
EMBRYOGENESE SOMATIQUE
L'embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative qui permet
d'obtenir des embryons à partir de cellules somatiques, c’est-à-dire non sexuelles.
 EMBRYOGENESE SOMATIQUE DIRECTE Dédifférenciation

- En général, passage par callogenèse

- Formation directe d’embryons sur les

explants
c
Exp: Crinum hybridum

- Cellules épidermiques et certaines cellules

sous épidermiques sont pré-embryogènes

La méthode directe consiste à former des

protoplastes, à les ensemencer dans des c
milieux fortement concentrés en régulateurs
de croissance durant quelques semaines, et
ensuite à réduire la concentration de ceux-ci.
Les cellules devraient spontanément former
des embryons somatiques.
 EMBRYOGENESE SOMATIQUE INDIRECTE
Les méthodes indirectes passent par la
callogenèse et la culture de cellules en
suspension pour produire les embryons
somatiques.

En variant la concentration d'auxines, il est

possible, dans certains cas, d'obtenir une
grande quantité d'embryons. Dans d'autres
cas, il est préférable de maintenir les
concentrations d'auxines à de faibles
niveaux.
99
 Dédifférenciation
Technique
forte dose d'auxine Cal Embryons bipolaires Plantes

Explants Colonies d’embryons

Cals embryogènes
 Dédifférenciation
EMBRYOGENESE SOMATIQUE INDIRECTE

- Réactif de Schiff - Immunolocalisation du 2,4-D

- Naphtol Blue Black (NBB) - DAPI
Plants de palmier dattier, SANE et SAGNA
 EMBRYOGENESE SOMATIQUE Dédifférenciation

Avantages

- Automatisation: réduction des coûts de production

- Rendement en plantes produites très élevé

- Semences artificielles: encapsulation des embryons dans

de l’alginate
- Rejuvénation des tissus: transformation génétique

Limites
- dérive génétique: Variation somaclonale
(organes anormaux, stérilité…)
 Balance hormonale

AUXINES CYTOKININES

Rhizogenèse Sur Bouture

Embryogenèse

Rhizogenèse Sur Cals

Callogenèse

Néoformation De Bourgeons

Prolifération Bourgeons
 HAPLO-DIPLOÏDISATION ou création de lignées pures

- Plantes haploïdes sont parfaitement

viables

- Doublement chromosomique
lignées homozygotes

- Gain de temps énorme

/autofécondation nécessitant dizaine de
générations
 Haplo-diploïdisation
HAPLOÏDES SPONTANES
- Faible nombre dans la nature: petite taille et stérilité

- Polyembryonie( riz, piment…) Plantes haploïdes

- Parthénogenèse et androgenèse( maïs, piment, chou…)

Plantes haploïdes

NB : La parthénogenèse est la qualité d'un organisme femelle (animal ou végétal) à se reproduire, par
voie asexuée, tout seul, sans fécondation de l’ovule qui se développe seul.
 Haplo-diploïdisation
HAPLOÏDES IN PLANTA

Pollinisation avec du pollen irradié (inactif): initiation des divisions de

l’ovule plantule sans fécondation

Les fruits qui se développent, par parthénogenèse, n'ont pas de graines

ou de pépins. Ce qui est intéressant pour le melon ou la pastèque par
exemple.
 Haplo-diploïdisation in vitro

PRODUCTION HAPLOÏDES IN VITRO

Objectifs

- Plantes haploïdes doublées

- Lignées pures: quelques mois au lieu de 8 à 10 ans

- L'obtention de lignées pures est une étape nécessaire

- des programmes d'amélioration des plantes

 Haplo-diploïdisation in vitro

PRODUCTION HAPLOÏDES IN VITRO

Les plantes haploïdes sont issues d'une cellule sexuelle mâle ou d'une
cellule sexuelle femelle sans fécondation.

Les plantes obtenues n’ont qu'un seul lôt de chromosomes, qui est
doublé artificiellement afin qu'elles deviennent fertiles.

2 Voies
- androgenèse

- gynogenèse
 Haplo-diploïdisation in vitro
Androgenèse ou plantes "sans mère"
C'est une technique qui consiste à régénérer des plantes entières à partir
de culture de cellules sexuelles mâles : des grains de pollen immatures
(culture de pollen isolé ou culture d'anthères)
 Haplo-diploïdisation in vitro
Androgenèse ou plantes "sans mère"

- Culture in vitro gamétophytes mâles de Datura (Guha et Maheswari, 1964)

- Culture pollen de tabac (Bourgin et Nitsch, 1967) et riz

- Ouverture de la voie aux technologies de production d’haploïdes

- Culture sur milieu synthétique mitoses successives

 Haplo-diploïdisation in vitro
Androgenèse ou plantes "sans mère"
 Haplo-diploïdisation in vitro
Androgenèse ou plantes "sans mère"
Avantages

- Gain de temps énorme, ce

qui permet de mettre plus
rapidement sur le marché de
nouvelles variétés

- Plantes totalement
homozygotes, ce qui permet
l'expression des allèles
récessifs responsables de
caractères intéressants
 Haplo-diploïdisation in vitro

Androgenèse ou plantes "sans mère"

Limites
- Rendement (nombre de plantes
viables/100 anthères cultivées) est
souvent dépendant du cultivar

- Plantes albinos, donc non viables

 Haplo-diploïdisation in vitro
Gynogenèse ou plantes "sans père"
- Culture d’ovules ou d’ovaires non fécondés, le plus souvent immatures.

- Première fois culture ovaire orge (San Noeum, 1976)

- Méthode souvent utilisée chez les espèces qui sont récalcitrantes à l'androgenèse
 Haplo-diploïdisation in vitro
Gynogenèse ou plantes "sans père"
Objectifs

- Plantes haploïdes doublées

- Lignées pures: quelques mois au lieu de 8 à 10 ans

Embryon émergeant d'un ovule de betterave

Avantages

- Par rapport à l'androgenèse, les risques d'obtention de plantes albinos

sont fortement diminués voire nuls
 Haplo-diploïdisation in vitro

Utilisation des haploïdes en sélection

- Plantes homozygotes utilisables
comme variétés homogènes chez les
espèces autogames (blé, riz…)

- Plantes haploïdes utilisées comme

génitrices de variétés hybrides

- Actuellement des haploïdes doubles

(maïs, colza, orge, piment) intégrés
dans les programme de sélection

- Malgré les succès, rendement restent

faibles et poursuite des recherches
 PROTOPLASTE ET HYBRIDATION SOMATIQUE
- Notion d’espèce: impossibilité
intercroisement-stérilité des hybrides

- Régulation naturelle flux de gènes entre

espèces

- Contournement incompatibilité
génétique entre espèces

- Fusion cellules somatiques

confronter génome plaste et
mitochondrie

- Structure nucléocytoplasmiques avec

variabilité génétique impossible avec
croisement classique
 Protoplaste et hybridation somatique
Protoplaste
- Cellule entourée simplement par le
plasmalemme

- Facilité d’introduction matériel génétique

exogène

- Facilité de fusion des protoplastes quelle

que soit la distance entre les espèces

- Application: soja et maïs, carotte et orge

- Fusion induite par choque électrique

Cybride : Individu hybride qui résulte de la
fusion de deux protoplastes mais qui ne
possède qu'un seul noyau appartenant à l'un ou
l'autre des protoplastes parentaux
 L'hybridation
somatique consiste à
fusionner, avec des
agents chimiques ou un
champ électrique, des
protoplastes provenant
de cellules
génétiquement
différentes. Les hybrides
somatiques ainsi
obtenus contiennent
l'ensemble du matériel
génétique et
cytoplasmique des deux
protoplastes fusionnés.

120
 PROTOPLASTE ET HYBRIDATION SOMATIQUE
- Divisions mitotiques organisées (bourgeons, embryons) sensibles à la structure génétique de la cellule

- Plantes hybrides entre tomate et pomme de terre (Melchers et al, 1978)

- Actuellement hybridation somatique dans presque 12 familles (Johnson et Veilleux, 2001)

- Hybridation somatique conserve rarement les deux génomes

 Hybridation somatique et amélioration plantes

- Objectifs ambitieux pour création hybrides freiné par importante

élimination chromosomique

- Néanmoins hybridation somatique introgression rapide

- Transfert de résistances (virus, champignons) d’espèce sauvage à

cultivée: Solanum tuberosum (Helgeson et al, 1993), aubergine, tomate,
tabac

- Difficultés de régénération à partir de protoplastes et croisement entre

espèces hybride et cultivée
 Hybridation somatique et amélioration plantes
- Résultats fructueux pour création de variabilité cytoplasmique : plantes uniquement
femelles (stérilité mâle)
- Variabilité cytoplasmique amélioration plantes

- Moyen de transfert de gène non encore isolé entre espèces végétales incompatibles
sans transgénèse
 LA MUTAGENESE : Création de variabilité
Une mutation est une modification de l’information génétique contenue dans l’ADN

Les mutations sont la source de la

variabilité dans une même espèce.

- Des mutations apparaissent

naturellement (mutations
spontanées)

- D’autres sont induites par des

techniques biotechnologiques
pour l’obtention de nouvelles
variétés (mutations induites) :
plus de 2000
 Création de variabilité
LA MUTAGENESE : techniques
La mutagenèse chimique La mutagenèse physique

Des produits chimiques mutagènes ajoutés dans Radiations qui peuvent altérer la séquence et la
les milieux de culture peuvent induire des structure de l'ADN. Exemples : rayonnements UV,
mutations intéressantes au niveau horticole ou rayonnements gamma et alpha qui sont ionisants,
agronomique. Les ultrasons,
Exemples : le benzopyrène, le bromure d'éthidium,
le dichlorométhane, le diéthylpyrocarbonate,
l'éthanal, le trichloréthylène
 Création de variabilité
Limites

- Apparition aléatoire de modifications sur les chromosomes

- Proportion faible de mutants présentant un intérêt horticole ou

agronomique
 Conclusion

Synthèse des différents stades

 AVANTAGES INCONVENIENTS
Economie Conservation - Coût du plant élevé que celui d’une
bouture classique
- Production en masse - Obtention de clones sélectionnés pour
vigueur ou caractères intéressants - Automatisation limitée
- Production rapide
- Assainissement végétaux - Main d’œuvre qualifiée et spécialisée (60 à
- Taux de multiplication élevé (100 à 1000 70% du prix de revient)
fois que méthodes traditionnelles) - Sauvegarde espèces en danger(
plantes carnivores, plantes tropicales…) - Réintroduction longue des plantes sur le
- Diminution des coûts de production terrain
- Multiplication espèces difficiles avec
- Facilité de stockage méthodes traditionnelles - Plantes récalcitrantes

- Production de substances biochimiques - Rajeunissement d’un végétal - Variations génétiques (cals, culture
pour pharmacie prolongée sur milieu contenant
-Tolérance à divers facteur ( sécheresse, phytohormones
- Espèces demandées ou exotiques plus salinité, froid/chaud, herbicides…)
rapidement sur le marché - Difficulté à disposer des milieux de
- Reboisement régénération ou culture adaptés
- Economie d’énergie
- Cryopréservation (banque de gènes) - Culture in vitro difficile à mettre en place
(asepsie)

- Vitrification (malformations dues à un

déséquilibre hormonal)
 Perspectives Conclusion

- perspectives industrielles et économiques intéressantes

- Tester les milieux et les conditions de culture adéquates pour chaque espèce

- Tester les milieux et les conditions de culture adéquates pour chaque étape de
l’organogenèse

- Eviter les altérations chromosomiques : mutants sans intérêts

- Eviter le risque d’un appauvrissement génétique en développant des banques de

gènes d’individus sauvages
TRANSGENÈSE
VÉGÉTALE
 Historique

1982 : Première plante transgénique, tabac résistant à un antibiotique

1985 : Premiers essais en champ de plantes transgéniques résistant à un insecte,

Virus, une bactérie ont lieu aux États-Unis

1994 : Administration des produits pharmaceutiques et alimentaires (FDA) autorise

la mise sur le marché d'une tomate transgénique

1995 - 1996 : Mise sur marché du soja et du maïs transgéniques, premier coton
transgénique est commercialisé aux États-Unis.

1999 : Chercheurs allemands et suisses (variété de riz, le riz doré)

2000 : Premier séquençage complet du génome d'une plante, Arabidopsis thaliana

 Transgenèse végétale

- La transformation génétique est l'aspect le plus récent de la culture de tissus qui fournit le moyen de
transfert de gènes ayant des traits souhaitables. La technique a un grand potentiel d'amélioration
génétique des différentes plantes cultivées

- Notamment pour l'introduction de caractères agronomiques importants tels que : une meilleure qualité
et une meilleure résistance aux maladies et aux ravageurs

- La transformation génétique chez les plantes peut être obtenue par transfert indirect de gènes (par un
vecteur) ou par procédé direct sans utilisation d’un vecteur (par bombardement de particules enrobées
de fragments d’ADN)

- Parmi les méthodes de transfert de gènes dépendant du vecteur, la transformation génétique par
Agrobacterium tumefasciens est la plus largement utilisé pour l'expression de gènes étrangers dans des
cellules végétales.
 Transgenèse végétale
Génie génétique: outil formidable

- Une source de gènes étendue: franchir

la barrière des espèces, des genres et
des règnes : universalité du code
génétique

- Ainsi, il est possible d'introduire des

caractères qu'il ne serait pas possible
d'introduire par sélection classique

- Le transfert d'un gène précis : permet

de transférer le seul gène désiré et non
de transférer plusieurs gènes comme
lors de la reproduction sexuée.

- Permet d’inactiver un gène précis

(technologie anti-sens) Amélioration génétique des plantes
TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE: ETAPES Transgenèse végétale
 TRANSFORMATION BIOLOGIQUE : utilisation d’Agrobacterium Transgenèse
végétale

Transfert indirecte
136
ETAPE 1 : RÉALISATION DE LA CONSTRUCTION GÉNÉTIQUE
ETAPE 2: MULTIPLICATION DE LA CONSTRUCTION GÉNÉTIQUE: CLONAGE DE GÈNE
Etape 3 : INFECTION CO-CULTURE ET TRANSFORMATION
 Etape 4: DÉTECTION DES TRANSFORMANTS PAR PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)

La réaction PCR permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un

acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour
sa détection

Une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN

double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR,
les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour
le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes.
(1) Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin;

(2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides

amorces spécifiques;

(3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire.

A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.
SCHEMA DE SELECTION POUR L’OBTENTION D’UNE VARIETE OGM
Domaines d’applications
 Agriculture
1 - Endotoxine de Bacillus thuriengensis (Bt) contre larve de lépidoptère

- Protoxine clivée dans l’intestin moyen

-Toxine active : ulcération, perte d’appétit, rupture des cellules, mort des
larves
2 - Tolérance aux virus
3 - Résistance à la phosphinotrycine
4 - Tolérance aux stress abiotiques
5 - Salinité

6 - Acidité du sol

7 - Sécheresse
 Contrôle du mûrissement des fruits
Alimentation
- Tomate : production d’éthylène mûrissement

- Blocage des gènes de synthèse de l’éthylène

- Amélioration des qualités nutritionnelles

- Composition en acides aminés des protéines de réserve des graines,

pour améliorer leur saveur, ou bien leur qualité nutritive

- Riz doré (golden rice) : introduction de 4 gènes synthèse de B-carotène

 Applications industrielles

- Industrie papetière: lignine très coûteux à éliminer et source de pollution

- Plantes transgéniques productrices d'élastomères et plastiques

biodégradables: hévéa

- Production de molécules d’intérêt pharmaceutique

 CONCLUSION

Les biotechnologies végétales sont un secteur clé pour le futur étant donné la

contribution qu’elles peuvent apporter à l’autosuffisance alimentaire, au secteur de la

santé, mais aussi à la qualité de la vie des agriculteurs et des consommateurs.

Cependant, les pays en voie de développement doivent renforcer les systèmes

publics d’investissement, d’encadrement, de formation et de vulgarisation. Les

structures universitaires et les instituts de recherches doivent aussi mener une

politique plus adéquate pour intéresser le secteur privé car aucun état ne peut tout

supporter.