Manuel de travaux pratiques d’enzymologie générale et

génie enzymatique
Mohammed Gagaoua

To cite this version:

Mohammed Gagaoua. Manuel de travaux pratiques d’enzymologie générale et génie enzymatique.
Master. Enzymologie générale et génie enzymatique, Algérie. 2016, pp.25. �hal-04308312�

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 République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche
Scientifique
Université Frères Mentouri Constantine 1
Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies
Agro-Alimentaires
(I.N.A.T.A-A)

Manuel de travaux pratiques

d’enzymologie générale et
génie enzymatique

Manuel élaboré et rédigé par Dr. Mohammed GAGAOUA

Mail: [email protected]

INATAA-UFMC1 -2016
 Programme de travaux pratiques d’enzymologie
générale et génie enzymatique

Préambule

Premier secteur industriel où l’homme a exploité la catalyse enzymatique, le domaine

agroalimentaire offre de multiples et diverses raisons d’utiliser les enzymes. Elles sont
essentiellement soit d’ordre technologique ou économique. Les gros consommateurs d’enzymes
sont l’industrie des détergents, la fromagerie, l’amidonnerie et d’autres industries alimentaires
(secteurs des boissons, boulangerie-pâtisserie, confiserie...).

L’une des enzymes utilisée dans le secteur des industries agro-alimentaires (IAA) est l'invertase
ouβ-fructofuranosidase (EC3.2.1.26). L’invertase de Saccharomyces cerevisiae, est une enzyme
qui catalyse le clivage de la liaison1-4 glycosidique du saccharose et libère un mélange équimolaire
de D-glucoseetD-fructose connu sous le nom de sucre inverti. Ce dernier est largement utilisé dans
les IAA.Vu son utilisation si importante dans les IAA et en particulier celle des industries des
sucres et des boissons à base du sucre inverti, l’invertase fera l’objet de travaux pratiques (TP).

Par ailleurs, d’autres enzymes d’intérêt agro-alimentaires sont utilisées, en particulier les
protéases. Ces dernières sont par exemple utilisées en fromagerie pour initier la coagulation
du lait. Les enzymes protéolytiques coagulantes du lait sont d’origine diverse, végétale,
animale, microbienne et de synthèse. Les enzymes coagulantes vont aussi être abordées dans
les TPs d’enzymologie en utilisant une enzyme d’origine végétale, la cucumisine ( EC
3.4.21.25) du concombre.

Le programme détaillé de l’ensemble des travaux pratiques est donné ci-après.

Instructions concernant les travaux pratiques d’enzymologie générale et génie enzymatique .......................1
TPn°01 : Préparation des tampons et solutions. ..............................................................................................2
TPn°02 : Courbes d’étalonnage de l’invertose. ...............................................................................................4
TPn°03 : Test de l’activité enzymatique de l’invertase. ..................................................................................6
TP n°04 : Dosage des protéines par la méthode Bradford et calcul de l’activité spécifique de l’invertase. ...8
TPn°05 : Détermination de la vitesse initiale d’hydrolyse du saccharose par l’invertase. ..............................10
TPn°06 : Etude de l’influence du pH sur l’activité de l’invertase ...................................................................12
TPn°07 : Etude de l’effet de la température sur l’activité de l’invertase. ........................................................14
TPn°08 : Détermination des constantes cinétiques Km et Vmax de l’invertase. ..............................................16
TPn°9 : Extraction de la Cucumisine - une enzyme coagulante du lait - du Cucumis sativus L. ...................18
TPn°10: Mise en évidence de l’activité coagulante de la cucumisine extraite de C. sativus..........................21

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 0

 INSTRUCTIONS

« Travaux pratiques d’enzymologie générale et génie enzymatique »

Veuillez au respect de ces instructions pour le bon déroulement des TPs

d’enzymologie générale et génie enzymatique.

1. Le port de la blouse est obligatoire avant d’entrer au laboratoire ;

2. Pour chaque TP, vous devez préparer une fiche technique sur une seule demi-fiche cartonnée recto-
verso (de préférence de couleur blanche). Elle doit être personnelle, individuelle et s’inspirer du Topo
de chaque TP et non une copie intégrale. Elle doit comporter : le but, le principe et le mode opératoire
sous forme de schéma illustratif et détaillé ;

3. Les comptes rendus sont préparés par sous-groupe de paillasse et remis la séance d’après. Aucun
retard de remise du compte-rendu ne sera toléré. Chaque compte-rendu comprend 2 à 3 pages au
format A4 (210 mm × 297 mm - feuilles blanches), incluant les parties suivantes : résultats (détaillés),
la discussion des résultats et la conclusion par rapport au TP réalisé. Il est inutile de réécrire la partie
Matériel et Méthodes (méthodologie);

4. Evitez d’écrire au stylo rouge ou rose que ce soit sur la fiche technique ou sur le compte rendu ;

5. Veuillez vous munir de trombones, de marqueur indélébile, du scotch et d’un chronomètre (un
par groupe de paillasse est suffisant) ;

6. Vous êtes répartis en sous-groupes et aucune permutation n’est autorisée sans l’autorisation de
l’enseignant responsable de la séance du TP en cours ;

7. Les étudiants répétitifs dont la moyenne des TPs obtenue durant l’année précédente est égale ou
supérieure à10/20 sont dispensés des TPs ;

8. A la fin de chaque TP, la verrerie doit être lavée et la paillasse nettoyée. Une note de paillasse est
attribuée à chaque groupe de paillasse et pour chaque TP réalisé (une moyenne sera calculé sur
l’ensemble des TP à la fin de l’année) ;

9. La participation et l’assiduité de chaque étudiant sera notée à chaque TP, pour être comptabilisée
dans la note finale ;

10. Votre présence au TP est obligatoire. Toute absence doit être justifiée auprès de (s) l’enseignant(s)
qui a (ont) assuré la (les) séance (s)du TP.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 1

 TP n°01 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Préparation des tampons et solutions »

1. But : Préparation des tampons et solutions nécessaires à l’ensemble des TP d’enzymologie.

2. Principe : les notions de préparation de tampons et solutions chimiques acquises au module de chimie
analytique seront appliquées lors de ce TP. Il consiste d’appliquer la formule de Henderson–Hasselbalch
pour préparer le (s) tampon (s) de solubilisation de l’invertase.

pH = pKa + log [espèces basiques] / [espèces acides]

On procédera aussi à la préparation de la solution DNS nécessaire au dosage des sucres invertis.

3. Matériel
 Plaque chauffante et agitatrice ;  Fioles jaugées ;
 Vortex ;  Papier aluminium ;
 Spatules ;  Papier Whatman ;
 Tubes à essais ;  Portoirs ;
 Balance analytique ;  pH mètre ;
 Béchers ;  Barreaux magnétiques.

4. Réactifs et matériel biologique

 Tartrate de potassium sodique (NaKC4H4O6) ;  Acétate de sodium ;

 Phosphate de sodium monobasique  L’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS) ;
(NaH2PO4) ;  Eau distillée ;
 Phosphate de sodium dibasique  NaOH et HCl ;
(Na2HPO4.7H2O ou Na2HPO4.12H2O) ;  Saccharose, Glucose et Fructose ;
 Glycine  Invertase pure de Saccharomyces cerevisiae

5. Mode opératoire

 Préparer les tampons : glycine 25mM, pH 3.0, acétate 30mM, pH 4.5 et phosphate à 40 mM, pH 7.0 ;

 La solution de dinitrosalicylate (5g DNS, 8g soude (NaOH), 150g Tartrate de potassium sodique /500
mL qsp d’eau distillée) est préparée à l’abri de la lumière (obscurité) puis filtrée et conservée
dans un flacon couvert d’aluminium

 Pour sa préparation on procède comme suit : mettre 150 g de tartrate de potassium sodique dans une
fiole de 500 mL, ajouter 8 g de soude. Dissoudre complètement le mélange (en chauffant doucement)
dans 300 mL d’eau distillée environ. Ajouter doucement 5g de DNS. Couvrir avec du papier

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 2

 aluminium et attendre la dissolution du DNS. Laisser refroidir et compléter le volume à 500 mL.
Boucher la fiole et conserver à température ambiante et à l’abri de la lumière.

 Préparer la solution enzymatique de l’invertase à raison de 0.1g/20 mL dans un tube à essai. Peser 0.1
g d’enzyme lyophilisée (pure) et la solubilisée dans le tampon approprié (tampon glycine, acétate et
phosphate). Agiter doucement durant 5 à 10 minutes sur une plaque agitatrice réglée à 200 trs/min.
Solution enzymatique à conserver à 4°C pendant plusieurs semaines.

 Préparer les solutions des sucres nécessaires pour réaliser les courbes d’étalonnage. Solution de
saccharose à 100 mM et invertose à 5 mM qu’il faut préparer dans des tubes à essais pour un volume
final de 20 mL.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 3

 TP n°02 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Courbes d’étalonnage de l’invertose »

1. But : Réalisation des courbes d’étalonnage de l’invertose et dosage des sucres réducteurs.

2. Principe : il consiste de réaliser des gammes de concentration différentes en saccharose et invertose, et

dosage du taux des sucres réducteurs dans des tampons adéquats par la méthode au DNS (acide 3,5
dinitrosalicylique), méthode de Miller (1959).

Acide 3,5-dinitrosalicylique (jaune) Acide 3-amino-5-nitrosalicylique (rouge orangé)

En milieu alcalin et à chaud, l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS) jaune est réduit par les sucres
réducteurs en acide 3-amino-5-nitrosalicylique rouge orangé.

3. Matériel

 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;  Portoirs ;

 Vortex ;  pH mètre ;
 Tubes à essais ;  Micropipettes avec embouts respectifs ;
 Bain marie bouillant ;  Cuve visible de 1 cm de trajet optique.

4. Solutions et tampons

 Eau distillée ;
 Solution 3,5-DNS ;
 Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 Tampon phosphate pH 7.0 ;
mL eau distillée (ED)) ;
 Tampon glycine pH 3.0 ;
 Solution invertose (1 Glucose + 1
 Tampon acétate pH 4.5 ;
Fructose/1000 mL ED) à 5mM
5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de 6 tubes à essais numérotés de 0 à 5 ;

 Réaliser une gamme d’étalonnage selon le tableau 01 (au final 3 courbes, pour 3 tampons) ;
 Mettre le volume nécessaire de la solution du saccharose, puis celle de l’invertose dans chaque tube à
essai ;
 Agiter les tubes au vortex ;

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 4

  Ajouter dans l’ensemble des tubes 1,5 mL du tampon adéquat (pH 3.0, 4.5 et 7.0) pour un volume final
de 2,5 mL ;
 Ajouter immédiatement à l’aide d’une micropipette 1,5 mL de la solution du DNS ;
 Boucher les tubes avec du papier aluminium, puis homogénéiser au vortex avant de les porter
exactement 5 minutes au bain marie réglé à 100°C ;
 Après incubation, laisser refroidir les tubes environ 5 minutes à l’eau courante ;
 Effectuer la lecture au spectrophotomètre à 540 nm contre le témoin (tube 0) en mettant environ 2 mL
du mélange réactionnel dans des cuves visibles.

Tableau 01 : Gamme d’étalonnage à utiliser pour le dosage de l’invertose

Tubes 0 1 2 3 4 5
Saccharose (100mM) en µL 1000 800 600 400 200 0
Invertose (5mM) en µL 0 200 400 600 800 1000
Tampon adéquat en µL 1500
Mélange final en µL 2500
3,5-DNS en µl 1500

Absorbance (λ = 540nm) … … … … … …

6. Résultats
 Tracer séparément sur feuilles millimétriques les courbes d’étalonnage DO = f (nombres de moles de
sucre inverti en µM ou mM/tube) ;
 Déterminer les équations de ces courbes d’étalonnage à l’aide du tableur Excel 2003 ou 2007 .

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 5

 TP n°03 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Test de l’activité enzymatique de l’invertase »

1. But : Mise en évidence de l’activité saccharitique d’une invertase d’origine eucaryote (Saccharomyces
cerevisiae).

2. Principe : Les enzymes sont des molécules protéiques ou glycoprotéiques qui catalysent spécifiquement
les réactions du métabolisme des êtres vivants. L'activité de ces molécules peut être utilisée dans le dosage
de nombreux composés. Cette activité enzymatique est exprimée en unités internationales ou U, telle
qu'une unité internationale provoque la transformation d'une micromole de substrat en une minute dans
les conditions optimales. Ainsi, dans notre cas l’activité saccharitique (enzyme = invertase) est déterminée
en présence du saccharose (substrat) dans une solution tampon d’acétate de sodium.

3. Matériel

 Bain-marie thermostaté à 40 et 100 °C ;  Chronomètre ;

 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;  Portoirs ;
 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;  Vortex ;
 Micropipettes de 100 et 1000 µl avec  Tubes à hémolyse ou à essais ;
embouts ;  pH mètre.

4. Solutions et tampons

 Tampon acétate pH 4.5 ;  Invertase pure de S. cerevisiae ;

 Solution 3,5-DNS ;  Solution NaOH ou HCl à 1N ;
 Eau distillée  Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 La glace ou eau du robinet froide ; mL tampon d’acétate) ;

5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir trois tubes à essais marqués Témoin (1) et Test (2) ;
 Réaliser le mélange réactionnel (Enzyme + Substrat) dans les deux tubes Test avec 100 µL de
l’invertase pure et 900 µL de la solution de saccharose à 100 mM ;
 Réaliser le tube Témoin avec 900 µL de la solution de saccharose ;
 Boucher les tubes et homogénéiser au vortex ;
 Incuber les 3 tubes à 40 °C au bain-marie pendant 10 minutes ;
 Stopper la réaction enzymatique du mélange, en additionnant 1,5 mL de la solution DNS ;
 Porter subséquemment le mélange à ébullition pendant 5 minutes exactement ;
 En même temps, ne pas oublier de réaliser le témoin (essai à blanc) correspondant à la solution de
saccharose incubée sans enzyme à 40 °C pendant 10 minutes, en rajoutant par la suite 1,5 mL de la
solution DNS puis 0,1 mL d’enzyme ;
Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 6
  Enfin, réaliser la lecture des absorbances à λ = 540 nm, après refroidissement des tubes à l’eau
courante.

6. Expression des résultats

Comme cité ci-haut, une unité d’activité saccharitique est définie comme étant la quantité d’enzyme qui
produit une μmole de sucres réducteurs (équivalent en invertose), par minute, dans un mL de l’enzyme pure et
dans les conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L’activité de l’invertase est calculée selon la
formule suivante :

(Cx – Ct) D
Activité invertase (U/ml) =
t

Cx : Concentration des sucres réducteurs du mélange réactionnel (μmole/ml).

Ct : Concentration des sucres réducteurs du mélange témoin (μmole/ml).
D : facteur de dilution.
t : temps d’incubation (minutes).

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 7

 TP n°04 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Dosage des protéines par la méthode Bradford et détermination de l’activité spécifique »

Préambule

Les protéines sont composées d'acides aminés. De nombreuses méthodes ont été mises au point
pour leur dosage. Ce sont généralement des méthodes spectrophotométriques basées sur diverses
propriétés spectrales ou réactionnelles des acides aminés constituant les protéines. Le choix d’une
méthode de dosage dépend des besoins et des caractéristiques recherchées: fiabilité, sensibilité,
rapidité, taille des échantillons, possibilité de récupérer l'échantillon après dosage, présence de
substances interférentes dans l'échantillon…etc.

1. But: Dosage des protéines par la méthode (Bradford1976).

2. Principe : La concentration des protéines est déterminée selon la méthode de Bradford (1976). C’est une
méthode colorimétrique qui utilise le bleu de Coomassie G-250. Ce dernier se lie aux protéines, provoquant
l’augmentation de l’absorbance de 365 à 595nm. Une fois lié aux protéines sa couleur vire du rouge vers le
bleu. Le haut coefficient d’extinction permet d’avoir un dosage des protéines même à de faibles
concentrations, inférieures à 20μg/mL. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de
protéines présente dans l’échantillon. La densité optique des échantillons est mesuré eau spectrophotomètre
à 595nm. Une solution de sérum albumine bovine (1mg/mL) est utilisée comme standard pour réaliser la
courbe étalon.

3. Matériel
 Spectrophotomètre à λ=595nm;  Tubes à essais;
 Micropipettes de 100 et 1000µ;  Chronomètre;
 Cuve visible de 1cm de trajet optique;  Vortex;
 Portoirs;

4. Solution et tampons

 Tampon acétate pH4.5;  Solution de Bradford;

 Eau distillée  Solution de SAB (sérum albumine bovine)

5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de tubes à essais numérotés de 0 à 5;

 Réaliser une gamme d’étalonnage selon le tableau 01;
 Mettre le volume nécessaire de la solution SAB à concentration finale de 1mg/mL;
 Ajouter dans chaque tube le volume nécessaire du tampon adéquat (ici le tampon acétate de Na) ;
Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 8
 Ajouter dans l’ensemble des tubes 3mL du réactif Bradford;
 Boucher les tubes, puis homogénéiser au vortex avant de les garder à l’obscurité pendant exactement
5min;
 Effectuer la lecture au spectrophotomètre à λ=595nm en mettant environ 2mL du mélange réactionnel
dans des cuves visibles.

Tableau 01 : Gamme d’étalonnage à utiliser pour le dosage des protéines.

Tubes 0 1 2 3 4 5
Gamme SAB en (μg/mL) 0 10 20 30 40 50 Après
SAB (µL) 0 5 10 15 20 25 avoir
Tampon acétate de Na(µL) 100 95 90 85 80 75 réalisé
Réactif Bradford (µL) 3000 deux
courbes d’étalonnage par la paillasse 1 et 2, les autres paillasses (3et4) prendront en charge le dosage
des protéines de la solution enzymatique de l’invertase.

 Préparer dans un portoir trois tubes à essais marqués Témoin(1) et Test (2);
 Réaliser le mélange (solution enzymatique + tampon) dans les deux tubes Test avec 25µL de la solution
enzymatique et 75µL de la solution tampon d’acétate de Na;
 Réaliser le tube Témoin avec 100µL de la solution tampon;
 Ajouter dans l’ensemble des tubes 3mL du réactif Bradford;
 Boucher les tubes, puis homogénéiser au vortex avant de les garder à l’obscurité pendant exactement
5min;
 Effectuer la lecture au spectrophotomètre à λ=595nm en mettant environ 2mL du mélange réactionnel
dans des cuves visibles.

6. Résultats

 Tracer sur une feuille millimétrique la courbe DO=f([SAB]);

Déterminer l’équation de la courbe d’étalonnage à l’aide du tableur Excel 2003 ou 2007 ;
Déterminer à l’aide de la courbe d’étalonnage la quantité d’invertase en µg de protéines présente dans
la solution enzymatique utilisée dans le précédent TP et calculer l’activité spécifique en utilisant la
formule (Activité enzymatique/teneur en protéines).

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 9

 TP n°05 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Détermination de la vitesse initiale d’hydrolyse du saccharose par l’invertase »

1. But : Détermination de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique.

2. Principe : Opérer en présence d'enzyme (invertase) et de substrat (saccharose) à concentration constante,

en milieu adéquat tamponné à pH=4,5 et thermostaté à 40°C. Dans ce cas, on fait varier le temps de
contact entre le substrat et l’enzyme. Afin de pouvoir mesurer la vitesse initiale avec une bonne
approximation, il faut se situer dans la zone où la vitesse forme un palier pendant un temps suffisamment
long (un lap de temps de 3 minutes), ce que l’on peut facilement vérifier en rapportant en continu
l’apparition du produit formé (invertose ou sucre inverti).

3. Matériel

 Bain-marie thermostaté à 40 et 100 °C ;  Chronomètre ;

 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;  Portoirs ;
 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;  Vortex ;
 Micropipettes de 100 et 1000 µl avec  Tubes à essais ;
embouts ;  pH mètre.

4. Solutions et tampons

 Tampon acétate pH 4.5 ;  Solution d’invertase pure de S. cerevisiae ;

 Solution 3,5-DNS ;  Solution NaOH ou HCl à 1N ;
 Eau distillée  Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 La glace ou eau du robinet froide ; mL tampon d’acétate) ;

5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de tubes à essais numérotés de 0 à 5 ;

 Réaliser le mélange réactionnel dans les 6 tubes avec 2000 µL du tampon acétate pH 4.5 et 400 µL de
la solution de saccharose à 100 mM (tableau 01) ;
 Boucher et homogénéiser les tubes au vortex avant de les préincuber au bain marie à 40 °C pendant 5
minutes ;
 Ajouter uniquement dans le tube témoin (tube n°0), 1500 µL de la solution 3,5-DNS ;
 Ajouter subséquemment dans tous les tubes 0,1 mL de la solution enzymatique et les porter au bain
marie thermostaté à 40 °C ;
 A des intervalles de temps de trois minutes, prélever un tube et achever ainsi la réaction enzymatique
en incubant le mélange réactionnel à 100 °C pendant 5 minutes, après avoir stopper la réaction
enzymatique du mélange, en additionnant 1,5 mL de la solution DNS ;

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 10

  Enfin, effectuer la lecture au spectrophotomètre à 540 nm, après refroidissement de chaque tube dans
l’eau froide. La lecture s’effectue dans une cuve visible contre le témoin (tube 0) en prélevant environ
2 mL du mélange réactionnel.

Tableau 01 : Méthode de détermination de la vitesse initiale d’hydrolyse du saccharose par l’invertase

Tubes 0 1 2 3 4 5
Saccharose (100mM) en µL 400
Tampon acétate (pH 4.5) en µL 2000
Mélange final en µL 2400
Préincuber 5 minutes à 40 °C
3,5-DNS en µL 1500
Invertase pure (0.1g/20 mL) en µL 100

Incuber à 40 °C pendant (en min) 0 3 6 9 12 15

3,5-DNS en µL 1500

Absorbance (λ = 540nm) … … … … … …
6. Résultats

 Tracer sur une feuille millimétrique la courbe DO = f(t en min) ;

 Tracer sur la même feuille millimétrique la courbe [P] = f(t en min) ou P = produit d’hydrolyse (sucres
réducteurs ou invertose) ;
 Calculer la vitesse initiale de la réaction (Vi) en µmol de saccharose hydrolysé litre-1 min-1.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 11

 TP n°06 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Etude de l’influence du pH sur l’activité de l’invertase »

7. But : Etude de l’influence du pH sur l’activité enzymatique.

8. Principe : Opérer en présence d'enzyme (invertase) et de substrat (saccharose) à concentration constante,

en milieu thermostaté à 40°C, et faire varier le pH du milieu réactionnel de l’enzyme (travailler avec 3
tampons, pH 3.0, pH 4.5 et pH 7.0).

9. Matériel

 Chronomètre ;
 Bain-marie thermostaté à 40 et 100 °C ;
 Portoirs ;
 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;
 Vortex ;
 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;
 Tubes à essais ;
 Micropipettes de 100 et 1000 µl avec embouts ;
 pH mètre.

10. Solutions et tampons

 Tampon glycine pH 3.0 ;  Solution d’invertase pure de S. cerevisiae ;

 Tampon acétate pH 4.5 ;  Solution NaOH ou HCl à 1N ;
 Tampon phosphate pH 7.0 ;  Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 Solution 3,5-DNS ; mL tampon adéquat) ;
 La glace ou eau du robinet froide ;  Eau distillée.

11. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de tubes à essais codifiés (01, 11 pour pH 3.0), (02, 22 pour pH 4.5)
et (03, 33 pour pH 7.0) ;
 Réaliser le mélange réactionnel dans les 6 tubes avec 2000 ou 2100 µL du tampon adéquat aux 3
différents pH et 400 µL de la solution de saccharose à 100 mM (tableau 01) ;
 Boucher et homogénéiser les tubes au vortex avant de les préincuber au bain marie à 40 °C pendant 5
minutes ;
 Ajouter à l’aide d’une P100, 0.1 mL de la solution enzymatique puis incuber immédiatement
l’ensemble des tubes (11, 22 et 33) à 40 °C pendant exactement 6 minutes ;
 Achever la réaction enzymatique en incubant le mélange réactionnel à 100 °C pendant 5 minutes, après
avoir additionné le mélange réactionnel avec 1,5 mL du réactif 3,5-DNS ; puis ajouter 0.1ml d’enzyme
dans les tubes témoin (01, 02 et 03)
 Enfin, effectuer la lecture au spectrophotomètre à 540 nm, après refroidissement de chaque tube dans
l’eau froide. La lecture s’effectue dans une cuve visible contre le témoin sans enzyme en prélevant
environ 2 mL du mélange réactionnel.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 12

 Tableau 01 : Méthode d’étude de l’influence du pH sur l’activité de l’invertase.

Tubes 01 11 02 22 03 33
Saccharose (100mM) en µL 400
Tampon adéquat 2100 ou 2000 µL pH 3.0 pH 4.5 pH 7.0
Mélange final en µL 2400
Préincuber 5 minutes à 40 °C
Invertase pure (0.1g/20 mL) en µL 0 100 0 100 0 100

Incuber à 40 °C (en min) 6

3,5-DNS en µL 1500

Absorbance (λ = 540nm) … … … … … …

12. Résultats

1. Tracer la courbes Vi = f(pH).

2. Interpréter l'allure de la courbe.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 13

 TP n°07 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Etude de l’effet de la température sur l’activité de l’invertase »

1. But : Etude de l’effet de la température sur l’activité enzymatique.

2. Principe : Opérer en présence d'enzyme (invertase) et de substrat (saccharose) à concentration constante,

en milieu tamponné à pH=4.5, et faire varier la température du milieu réactionnel de 20 à 80 °C.

3. Matériel

 Chronomètre ;
 Bain-marie thermostaté ;
 Portoirs ;
 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;
 Vortex ;
 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;
 Tubes à essais ;
 Micropipettes de 100 et 1000 µl avec embouts ;
 pH mètre.

4. Solutions et tampons

 Tampon acétate pH 4.5 ;  Solution d’invertase pure de S. cerevisiae ;

 Solution 3,5-DNS ;  Solution NaOH ou HCl à 1N ;
 La glace ou eau du robinet froide ;  Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 Eau distillée ; mL tampon acétate) ;

5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de tubes à essais codifiés (02, 20), (04, 40), (06, 60) et (08, 80) ;

 Réaliser le mélange réactionnel dans l’ensemble des tubes avec 2000 ou 2100 µL du tampon acétate
pH 4.5 et 400 µL de la solution de saccharose à 100 mM (tableau 01) ;

 Boucher et homogénéiser les tubes au vortex avant de les préincuber à la température désirée (20, 40,
60 ou 80) pendant 5 minutes ;

 Ajouter à l’aide d’une P100, 0.1 mL de la solution enzymatique puis incuber immédiatement les tubes
correspondant à la température désirée pendant exactement 6 minutes ;

 Achever la réaction enzymatique en incubant le mélange réactionnel à 100 °C pendant 5 minutes, après
avoir additionné le mélange réactionnel avec 1,5 mL du réactif 3,5-DNS , puis ajouter 0.1ml d’enzyme
au tubes témoin (02, 04, 06 et 08) ;
 Enfin, effectuer la lecture au spectrophotomètre à 540 nm, après refroidissement de chaque tube dans
l’eau froide. La lecture s’effectue dans une cuve visible contre le témoin sans enzyme en prélevant
environ 2 mL du mélange réactionnel.

Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 14

 Tableau 01 : Méthode d’étude de l’influence de la température sur l’activité de l’invertase

Tubes 02 20 04 40 06 60 08 80
Saccharose (100mM) en µL 400
Tampon acétate pH 4.5 en µL 2100 2000 2100 2000 2100 2000 2100 2000
Mélange final en µL 2400 ou 2500
Préincuber à l’eau tiède pendant 5 minutes
Invertase pure (0.1g/20 mL) en µL 0 100 0 100 0 100 0 100

Incuber 6 minutes à T°C désirée 20 °C 40 °C 60 °C 80 °C

3,5-DNS en µL 1500

Absorbance (λ = 540nm) … … … … … … … …

6. Résultats
1. Tracer la courbes Vi = f(T°C).
2. Interpréter l'allure de la courbe.

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 TP n°08 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Détermination des constantes cinétiques Km et Vmax de l’invertase »

1. But : Détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax d’une réaction enzymatique.

2. Principe : On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme (invertase) à concentration

constante, en milieu tamponné pH = 4.5 et thermostaté à 40°C. On fait varier la concentration en substrat
(saccharose). Le temps de contact entre enzyme et substrat étant identique dans chaque tube. Les
paramètres cinétiques Vmax et Km se calculent à partir de l’inverse de la vitesse et de la quantité des
sucres réducteurs respectivement.

3. Matériel

 Chronomètre ;
 Bain-marie thermostaté à 40 °C ;
 Portoirs ;
 Spectrophotomètre à λ = 540 nm ;
 Vortex ;
 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;
 Tubes à essais ;
 Micropipettes de 100 et 1000 µl avec embouts ;
 pH mètre.

4. Solutions et tampons

 Tampon acétate pH 4.5 ;  Solution d’invertase pure de S. cerevisiae ;

 Solution 3,5-DNS ;  Solution NaOH ou HCl à 1N ;
 La glace ou eau du robinet froide ;  Solution saccharose à 100 mM (3.42g/100
 Eau distillée ; mL tampon acétate) ;

5. Mode opératoire

 Préparer dans un portoir une série de 7 tubes à essais numérotés de 0 à 6 ;

 Réaliser le mélange réactionnel dans l’ensemble des tubes comme indiqué au tableau 01 en utilisant le
tampon acétate (pH 4.5) et une solution de saccharose à 100 mM ;
 Boucher les tubes et homogénéiser au vortex ;
 Préincuber les 7 tubes à essais pendant 5 minutes au bain marie thermostaté à 40°C ;

 Ajouter dans tous les tubes un volume constant de 0,1 mL d’enzyme (invertase) ;

 Laisser les tubes dans le portoir et les incuber immédiatement à 40°C pendant une durée de 9 minutes,
tout en remuant les tubes d’un temps à l’autre ;
 Achever la réaction enzymatique après ajout de 1,5 mL du réactif du 3,5-DNS en incubant le mélange
réactionnel à 100 °C pendant 5 minutes ;
 Enfin, effectuer la lecture au spectrophotomètre à 540 nm, après refroidissement de chaque tube dans
l’eau froide pendant 5 minutes. La lecture s’effectue dans une cuve visible en prélevant environ 2mL
du mélange réactionnel.
Manuel élaboré et mis en place par Dr. Gagaoua M. Année 2016 16
 Tableau 01 : Méthode de détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax de l’invertase

Tubes 0 1 2 3 4 5 6
Saccharose (100mM) en µL 0 100 200 400 600 800 900
Tampon acétate pH 4.5 en µL 2400 2300 2200 2000 1800 1600 1500
Mélange final en µL 2400
Préincuber à 40°C pendant 5 minutes
Invertase pure (0.1g/20 mL) en µL 100

Incubation pendant 9 minutes à 40 °C avec agitation

3,5-DNS en µL 1500

Absorbance (λ = 540nm) … … … … … … …
6. Résultats

1. Calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences, à l'aide de la courbe [P] = f(t) obtenue dans le TP
n°04 ;
2. Calculer les valeurs de [S] pour chacune des expériences.
3. Tracer les courbes Vi = f ([S]) et 1/Vi = f (1/[S]).
4. Déterminer KM et Vmax.

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 TP n°09 d’enzymologie générale et génie enzymatique

« Extraction de la Cucumisine - une enzyme coagulante du lait - du Cucumis sativus L. »

Préambule

La coagulation du lait qui est la première étape de la transformation fromagère joue un rôle
déterminant sur la qualité du produit fini, le fromager doit donc s’efforcer de la maitriser au mieux. Il
s’agit de la transformation du lait liquide en un gel, appelé aussi coagulum ou caillé qui, après un certain
nombre de transformations, deviendra un fromage. Le processus de la coagulation est provoqué par
l’action d’un agent coagulant.
Dans le monde, l’agent coagulant (enzyme) le plus utilisé est la présure. Toutefois et pour
plusieurs raisons, particulièrement économiques, la présure ne peut répondre à la demande sans cesse
croissante et pour cela l’utilisation de succédanés d’origine animale, microbienne ou végétale s’est
développée.
Les protéases d’origine végétale ont été utilisées comme coagulants du lait pour préparer des
fromages pendant des siècles soit sous forme d’extraits bruts ou purifiée. Parmi ces enzymes, la
cucumisine (EC 3.4.21.25), une sérine protéase thermostable extraite initialement à partir des fruits du
melon (Cucumis melo) et aujourd’hui dans de nombreuses plantes appartenant à la famille des
cucurbitacées dont le concombre (Cucumis sativus).

1. But : Extraction de la cucumisine, une enzyme coagulante, du sarcocarpe du concombre.

2. Objectifs

a). Initiation aux techniques d’extraction des protéines : broyage, homogénéisation, solubilisation, filtration et
centrifugation.

b). Extraction de l’enzyme coagulante de la chaire ou « sarcocarpe » du concombre (voir figure 01).

c). Utilisation de l’extrait enzymatique pour la coagulation du lait (lors du TP n°12).

3. Principe : l’extraction consiste en la libération, la séparation et la récupération des enzymes. Cette

extraction nécessite le plus souvent des procédés mécaniques. Dans notre cas, nous nous intéressons à la
cucumisine présente dans le sarcocarpe du concombre. Après découpe du concombre en petits cubes, un
broyage/homogénéisation dans le tampon phosphate de sodium (30mM, pH 6.5) est appliqué pour éclater
les cellules et libérer l’enzyme cible. L’homogénat est filtré à travers une gaze pour éliminer les débris
cellulaires avant d’effectuer une centrifugation et récupérer le filtrat contenant l’enzyme coagulante du
concombre. Ce matériel est désigné sous le nom de l’extrait brut enzymatique du concombre.

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4. Matériels

 Spatules  Plaque agitatrice ;

 Béchers  Centrifugeuse ;
 Scalpel  Portoirs pour tubes à essais ;
 Couteau éplucheur  Fioles jaugées ;
 Eprouvettes  Entonnoirs ;
 Papier aluminium ;  pH mètre ;
 Gazes pour filtration ;  Barreaux magnétiques ;
 Verres de montre  Broyeur Ultra-Turrax IKA
 Cristallisoirs  Balance analytique ;

5. Matériel végétal, solutions et réactifs

 Tampon phosphate 30mM, pH 6.5 ;  La glace ;

 Eau distillée ;  2 concombres de l'étalage du marché ;

6. Mode opératoire

Pour extraire les protéines de la chaire « sarcocarpe » du concombre (figure 01) il faut suivre
les étapes suivantes :
Eplucher à l’aide d’un couteau éplucheur un concombre et récupérer sa pelure (la peau) dans un
verre de montre étiqueté ;
Epépiner et vider à l’aide d’une spatule l’intérieur du concombre épluché pour récupérer
l’ensemble du jus, placentas et graines dans un autre verre de montre étiqueté ;
Découper (ou hacher) le sarcocarpe (partie à utiliser pour l’extraction) en fines lanières (tranches)
puis en petits cubes à l’aide d’un scalpel et récupérer le tout dans un verre de montre étiqueté ;

Figure 01 : Section transversale d’un concombre (Cucumis sativus L. de la famille des Cucurbitacées).

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 Peser environ 45 g du sarcocarpe haché dans un bêcher de 100 mL et ajouter environ 40 mL
du tampon phosphate pH 6.5 ;
Procéder au broyage et homogénéisation à l’aide d’un Ultra-Turrax de type IKA (un broyeur-
homogénéisateur) du contenu du bêcher à une vitesse de 15 000x RPM pendant 45 sec (2
fois);
Mettre le bêcher contenant l’homogénat à l’intérieur d’un cristallisoir contenant de la glace
puis laisser sous agitation pour une extraction à froid pendant 20 min ;
Après extraction, procéder à une filtration sur gaze pour enlever les débris cellulaires ;
Récupérer le filtrat et le répartir dans des tubes à essais puis centrifuger à une vitesse de 4000
RPM pendant 10 min afin de clarifier le filtrat ;
Récupérer délicatement le surnageant représentant l’extrait brut enzymatique du concombre
(EBEC) et jeter le culot représentant les débris cellulaires restant.
Collecter les surnageants (EBEC) dans un seul tube étiqueté ;
Conserver l’EBEC à -20°C jusqu’au TP prochain (TP n°12) pour le dosage des protéines et
la mise en évidence de son activité coagulante.

7. Expression des résultats

Mesurer le pH de l’extrait enzymatique (EBEC) et commenter ;

Synthétiser en illustrant l’ensemble des étapes de l’extraction des protéines du concombre
effectuées dans un diagramme (figure) ;
Donner dans un tableau le principe et objectif de chacune des étapes réalisées ;
Effectuer une recherche bibliographique sur les enzymes coagulantes du lait d’origine
végétale (comme succédanés de présure) et rapporter le nom scientifique de la plante et la
partie utilisée dans un tableau (trois colonnes : nom de l’enzyme, nom de la plante et partie
de la plante utilisée).

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 TP n°10 d’enzymologie générale et génie enzymatique
« Mise en évidence de l’activité coagulante de la cucumisine extraite de C. sativus »

Préambule

La coagulation du lait opère par différents mécanismes dont la coagulation enzymatique. Cette
dernière se déroule en trois phases. La première est une hydrolyse enzymatique qui concerne
l’hydrolyse de la caséine kappa (k), au niveau de la liaison peptidique Phe105-Met106, conduisant à la
formation de la paracaséine k (1-105), et de caséinomacropeptide (CMP) (106-169). La libération du
CMP se traduit par une réduction du potentiel de surface des micelles et par conséquent, une
diminution des répulsions électrostatiques qui, à l’état initial, contribue à la stabilité du système
colloïdal. La deuxième phase est l’agglomération, et prend place lorsque environ 80% de la caséine
k est hydrolysée. La vitesse d’agrégation s’accroit rapidement avec l’état d’avancement de la réaction
enzymatique. Enfin, la dernière phase de protéolyse généralisée, où les micelles agrégées subissent
de profondes réorganisations : des liaisons de natures variées s’établissent entre les micelles
(électrostatiques, hydrophobes et salines) pour former un gel constitué par un réseau lâche
emprisonnant le lactosérum. Dans le gel ainsi formé, la caséine est présente sous une forme fortement
minéralisée et ce degré de minéralisation élevé confère au gel présure des caractères différents de
ceux du gel lactique. Le gel présure est souple, très cohésif, imperméable et contractile.

1. But : Mise en évidence de l’activité coagulante par la détermination du temps de coagulation.

2. Principe : Le temps de coagulation est déterminé en incubant 2 ml de lait écrémé fraichement

préparé dans un tube à essai pré-incubé dans un bain marie à 35°C pendant 10 minutes avec 0,2 ml
d’extrait coagulant du concombre obtenu au TP n°11. Le tube à essai est soumis à un mouvement de
rotation lente à l’intérieur du bain marie. Puis, on mesure le temps qui s’écoule entre l’introduction
de l’extrait coagulant de concombre (EBC) et le moment où un mince film (ou apparition de grumeaux
ou flocons du lait) commence à se former à l’intérieur des parois du tube à essai. L’activité coagulante
est exprimée en unité coagulante et représente le nombre de volumes de lait frais coagulés par un
volume d’extrait coagulant en 40 minutes (40 * 60 sec = 2400sec) à 37°C.

3. Matériels

 Micropipettes de 100 et 1000 μL ;  Chronomètre ;

 Cuve visible de 1 cm de trajet optique ;  Vortex ;
 Tubes à essais et portoir ;  Bain-marie ;
 Papier aluminium ;  Spectrophotomètre ;

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4. Solutions

 Tampon phosphate 30mM, pH 6.5 ;  Solution de lait (12% lait écrémé, 10mM
CaCl2, pH 6.4) ;
 Eau distillée ;
 Solution de Bradford ;

5. Mode opératoire

 Préparer pour chaque groupe de paillasse et dans un portoir deux tubes à essais marqués (1) et
(2) ;
 Prélever et mettre dans chaque tube, exactement 2 mL de la solution du lait ;
 Pré-incuber au Bain-marie thermostaté à 35°C les deux tubes pendant 10 min ;
 Inoculer avec 0,2 mL de l’extrait enzymatique de concombre chaque tube ;
 Immédiatement après inoculation, chronométrer le temps de coagulation en secondes ;
 Calculer le temps de coagulation en secondes nécessaire pour l’apparition des premiers
grumeaux (flocons) de lait sur la paroi des tubes ;
 Après détermination de l’activité coagulante, procéder au dosage des protéines de l’extrait brut
enzymatique de concombre par la méthode de Bradford ;
Détermination de l’activité coagulante de la
cucumisine extraite (extrait coagulant)

Lait écrémé 12% Pré-incubation de

CaCl2 à 10 mM 2mL de la solution de
pH 6.4 lait : 10 min à 35°C

Inoculer avec 0,2 mL Au bain-marie

de l’extrait coagulant thermostaté à 35°C

Chronométrer à la Calculer le temps de

seconde coagulation en sec

Calculer l’activité
Déterminer l’activité spécifique
coagulante du lait en
après dosage des protéines
utilisant la formule

Figure 1. Schéma récapitulatif de l’ensemble des étapes à suivre pour la détermination de l’activité
coagulante de l’extrait brut enzymatique de concombre.

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7. Expression des résultats

 Calculer l’activité coagulante du lait de l’extrait enzymatique de concombre en utilisant la formule

suivante :
𝟐𝟒𝟎𝟎 ∗ 𝑽
𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒕é 𝒄𝒐𝒂𝒈𝒖𝒍𝒂𝒏𝒕𝒆 (𝑼/𝒎𝑳) =
𝑻𝒄 ∗ 𝒗
V : volume du lait en mL ;
Tc : temps de floculation en sec ;
v : volume de la solution enzymatique en mL ;

L’activité coagulante représente le volume du lait coagulable par unité de volume d’une enzyme ou
d’un extrait enzymatique, en 40 minutes (2400 sec), à 35°C et pH égale à 6,4.

 Calculer la concentration en protéines de l’extrait brut enzymatique du concombre en utilisant la courbe

d’étalonnage pour le dosage des protéines (TP N° 05).

 Calculer l’activité spécifique de l’extrait coagulant.

L’activité spécifique est définie comme étant le rapport entre l’activité coagulante et la teneur en protéines de
l’extrait enzymatique et exprimée en U/mg : Activité spécifique = activité coagulante (U) / teneur en protéines
(mg).

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