Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie
"Toufik Khaznadar"
Chapitre 4:
Techniques chromatographiques
Partie 3: Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Présenté par:
Dr. GASMI M.
Introduction
La HPLC est la plus connue parmi les techniques chromatographiques dont la
phase mobile est un liquide.
HPLC = Chromatographie en phase liquide à haute résolution, à haute pression, à
grande vitesse, et enfin ; à haute performance.
Permet de réaliser des analyses qui ne sont pas possible avec les techniques sur
couche mince ou en phase gazeuse.
Son champ d’application recouvre une grande partie du domaine de la CPG auquel
s’ajoute celui de l’analyse des composés thermosensibles ou de masses
moléculaires à la fois très grandes et même polaires.
L'efficacité de séparation « α », ou la résolution « R », en chromatographie
liquide augmente, lorsque la taille des particules de phase stationnaire
diminue.
le « P » de « pression » optimisation de la technique (diminution de la
taille de particules de la phase stationnaire) « P » pour « performance »
Obtention d’une nette amélioration de l’efficacité de séparation en
diminuant la granulométrie du support.
Différentes méthodes
d'HPLC
En fonction de la phase stationnaire
il existe différents modes de séparation en chromatographie en phase liquide :
l'adsorption
le partage (80% des séparations)
l' échange d'ions
l'exclusion stérique
Les trois premiers types utilisent la polarité des solutés pour les séparer.
Pour la dernière: la séparation s'effectue suivant la taille des molécules organiques
séparer les molécules de PM > 10kDa
Conception Générale D’un
Appareil d’HPLC
Un ou plusieurs réservoirs de phase
mobile solvants purs soit des
mélanges de solvants dans des
concentrations connues.
Pompe pour injecter la phase
mobile
Un système d'injection de
l’échantillon
Une colonne en acier inox de
quelques centimètres de long remplie
de phase stationnaire.
Un détecteur permettant à la fois,
de mettre en évidence la sortie des
solutés de la colonne et de donner un
signal proportionnel à la quantité de
chacun de ces solutés, dans un
mélange.
Un réservoir de solvant (éluant ou phase mobile)
Un appareil HPLC est équipé d'un ou plusieurs réservoirs contenant chacun de
200 à 1000ml de solvant.
Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité
suffisante. Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont
disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs
solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse.
Réservoir équipés des dispositifs permettant d'en éliminer les poussières et les
gaz dissous Les bulles et les poussières perturbent le fonctionnement du
détecteur et entraîne un élargissement des pics.
La pompe
Munie d'un système permettant d'effectuer une programmation . Elle permet de
travailler:
en mode isocratique utilisation d'un solvant pur ou d'un mélange de solvants de
composition constante dans le temps (a).
en mode gradient utilisation d'un mélange de solvants dont la composition est
variable dans le temps (b).
Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques μl à plusieurs ml/min
L’injecteur
c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage.
Ces boucles permettant de choisir des volumes d'échantillon compris entre 5
et 500µl boucles interchangeables
Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et
de la concentration supposée des produits à analyser.
Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant,
ce qui est important pour l'analyse quantitative.
L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire en un
temps bref afin de perturber le moins possible le régime de circulation de la phase
mobile qui doit être stable de la colonne au détecteur. On utilise pour ce faire, une
vanne haute pression à plusieurs voies, manuelle ou motorisée dans le cas des
injecteurs automatiques, placée juste avant la colonne.. Elle fonctionne en deux
temps :
Dans la position chargement, où seule la communication entre pompe et colonne
est assurée, l’échantillon est introduit à pression atmosphérique à l’aide d’une
seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle. Celle-ci, dont il existe tout
un choix de volumes, est soit extérieure, soit intégrée dans le corps de la vanne.
Dans la position injection, l’échantillon est inséré dans le flux de phase mobile par
rotation de 60° d’un levier qui permet d’inverser le sens de circulation dans la
boucle. Une bonne reproductibilité des volumes n’est atteinte que si la boucle a
été totalement remplie par l’échantillon.
Les colonnes
généralement courtes et droites en acier inoxydable
se caractérise par leur géométrie (diamètre intérieur de 4 mm et une longueur
de 5 à 30 cm) et par la nature des phases qu’elles contiennent colonnes
standard.
Elles sont de plus en plus supplantées par des colonnes de plus faibles diamètres:
narrow-bore (DI 2-4 mm),
micro-bore (DI 1-2 mm),
capillaires remplies (DI 0,1-1 mm).
Ainsi pour une colonne standard, le débit est de l’ordre de 1 ml/min, alors qu’il
tombe à quelques ml/min pour une colonne micro-bore,
Ceci nécessite des pompes et des détecteurs adaptés (quelques gouttes
suffisent pour éluer tous les composés).
La colonne est souvent précédée d’une pré-colonne (colonne de garde) courte (0,4
à 1 cm), remplie de la même phase stationnaire, ce qui sert à retenir certaines
impuretés.
On augmente ainsi la durée de vie de la colonne principale en préservant ses
performances.
Phase stationnaire
Phase normale
constituée de gel de silice imprégné par un liquide polaire utilisation d’une
une phase mobile (éluant) apolaire.
Les analytes polaires d’un échantillon sont retenus dans la colonne,
contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du
temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des
séparations.
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Phase inverse « R − HPLC »
La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des
chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18).
Cette phase est apolaire et nécessite un éluant (phase mobile) polaire (ACN,
MeOH, H20).
Ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.
Plus des trois quarts de HPLC est effectuée en mode inversé utilisation
comme phases mobiles des mélanges d’eau et d’un modifiant tel le méthanol ou
l’acétonitrile
ACN Acétonitrile
MeOH Méthanol
H20 Eau distillée
Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase
stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc
maintenue constante.
Détecteurs
L’analyse par chromatographie est utilisée pour repérer la présence ou doser un
composé présent, pour lequel on a choisi un détecteur bien adapté Le détecteur
universel n’est donc pas indispensable.
Le détecteur suit en continu l'apparition des solutés.
Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-chimiques.
Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à
celui de la phase mobile seule.
Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques
des composés :
Absorption de la lumière détecteur spectrophotométrique
Fluorescence détecteur spectrofluorimétrique
Indice de réfraction Détecteur réfractométrique
Ainsi que différents types de couplage :
Spectrométrie infrarouge
Spectrométrie de masse
Résonance Magnétique Nucléaire...
Application de la
chromatographie à l'analyse
Analyse des chromatogrammes
Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics
correspondant à chacun des produits.
La composition de la phase mobile est un paramètre particulier à la HPLC. Il faut
donc préciser pour chaque analyse :
le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…
la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, débit,
mode de détection λ en nm.
la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité
du détecteur, etc…
Analyse qualitative
Le temps de rétention « Tr » (en min) caractéristique de chaque soluté dans
les conditions opératoires fixées.
Comparaison du «Tr» de deux solutés mesure du facteur de sélectivité «α »
Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics Plus elle
est supérieure à 1 plus les temps de rétention sont éloignés.
Analyse quantitative
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé
Etablissement d’une courbe d’étalonnage
Méthode de l'étalonnage externe
Méthode de l'étalon interne
Méthode des additions connues
