Rôles des cellules Natural Killer canines et mise au

point de leur identification par cytométrie de flux au

BioPôle Alfort
Ruben Clodion

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Ruben Clodion. Rôles des cellules Natural Killer canines et mise au point de leur identification par
cytométrie de flux au BioPôle Alfort. Médecine vétérinaire et santé animale. 2023. �dumas-04442003�

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 RÔLES DES CELLULES NATURAL KILLER CANINES ET
MISE AU POINT DE LEUR IDENTIFICATION PAR
CYTOMÉTRIE DE FLUX AU BIOPOLE ALFORT

THÈSE
pour obtenir le diplôme d’État de
DOCTEUR VÉTÉRINAIRE
présentée et soutenue publiquement devant
la Faculté de Médecine de Créteil (UPEC)
le 20 octobre 2023

par
Ruben, Serge, Alain CLODION

sous la direction de
Delphine LE ROUX

JURY
Président du jury : M. Grégory JOUVION Professeur à l’EnvA
Directrice de thèse : Mme Delphine LE ROUX Maître de Conférences à l’EnvA - HDR
Examinateur : M. Edouard REYES-GOMEZ Maître de Conférences à l’EnvA
 Remerciements

Au Président du Jury de cette thèse, M. Grégory JOUVION, Professeur à l’EnvA, pour

l’enseignement fourni tout au long du cursus et pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de
présider cette thèse. Sincères remerciements.

À Mme Delphine Le Roux, Maître de conférences à l’EnvA, pour m’avoir guidé tout au long
de la réalisation de cette thèse, pour votre gentillesse, patience et bienveillance. Merci pour
votre aide précieuse, hommages respectueux.

À M. Edouard Reyes-Gomez, Maître de conférences à l’EnvA, pour l’enseignement fourni

tout au long du cursus et pour avoir accepté d’être examinateur de cette thèse. Sincères
remerciements.

Au personnel du Biopôle Alfort, pour la bienveillance dont il a fait preuve et l’aide apportée
tout au long des expérimentations.

Au service des Urgences et Soins Intensifs (UrSI) du Centre Hospitalier Universitaire

Vétérinaire d’Alfort pour Animaux de Compagnie (CHUVA-AC), pour leur aide dans la
réalisation de cette thèse.
Table des matières
Liste des figures ............................................................................................................................ 3
Liste des tableaux ......................................................................................................................... 7
Liste des abréviations ................................................................................................................... 9
Introduction ................................................................................................................................. 13
Première partie : bibliographie ................................................................................................... 15
1. Revue des connaissances sur la cellule Natural Killer (NK).................................................. 15
A. Le système immunitaire inné ............................................................................................................ 15
a. Généralités .................................................................................................................................................. 15
b. Les cellules lymphoïdes innées ou ILCs ..................................................................................................... 16
B. Ontogénie des cellules NK ................................................................................................................ 18
a. Chez l’Homme : .......................................................................................................................................... 18
b. Chez le chien .............................................................................................................................................. 21
C. Morphologie et coloration .................................................................................................................. 22
D. Marqueurs de caractérisation ........................................................................................................... 22
a. Chez l’Homme ............................................................................................................................................ 22
b. Chez la souris ............................................................................................................................................. 23
c. Chez le chien .............................................................................................................................................. 23
E. Répartition dans l’organisme et sous-populations ............................................................................ 26
F. Les lymphocytes NKT ....................................................................................................................... 27
G. Mécanisme d’action général ............................................................................................................. 28
a. Production moléculaire, récepteurs et équilibres d’intégration .................................................................... 28
b. Interactions cellulaires................................................................................................................................. 31
c. Influence externe......................................................................................................................................... 32
2. Approche fonctionnelle et dynamique des cellules NK ......................................................... 33
A. Les cellules NK et les maladies infectieuses .................................................................................... 33
a. Les cellules NK et les maladies virales ....................................................................................................... 33
b. Les cellules NK et les maladies bactériennes ............................................................................................. 34
c. Les cellules NK et les maladies fongiques .................................................................................................. 36
d. Les cellules NK et les maladies parasitaires ............................................................................................... 38
B. Les cellules NK et les maladies auto-immunes ................................................................................ 39
a. Dermatite atopique ...................................................................................................................................... 40
b. Affections hépatiques : ................................................................................................................................ 42
c. Maladie d’Alzheimer/Dysfonctionnement cognitif canin .............................................................................. 43
d. Myasthenia gravis ....................................................................................................................................... 44
C. Implications dans le processus de rejet de greffe ............................................................................. 45
D. Les cellules NK et la gestation .......................................................................................................... 49
E. Les cellules NK et le concept de mémoire ........................................................................................ 51
a. La mémoire spécifique d’haptène ............................................................................................................... 52
b. L’immunité spécifique de virus .................................................................................................................... 52
c. Pseudo-mémoire induite par les cytokines.................................................................................................. 53
F. Les cellules NK et les processus néoplasiques ................................................................................ 54
a. Implications anti-tumorales des cellules NK ................................................................................................ 54
b. Plasticité...................................................................................................................................................... 56
c. Epuisement des cellules NK ....................................................................................................................... 57
d. Echappement néoplasique.......................................................................................................................... 57
e. Le modèle canin au centre de stratégies d’immunothérapie ....................................................................... 59
f. Néoplasies des cellules NK......................................................................................................................... 61
Deuxième partie : étude expérimentale ..................................................................................... 71
1. Introduction .......................................................................................................................... 71

Page 1
 2. Matériels et méthodes .......................................................................................................... 71
A. Matériel.............................................................................................................................................. 71
a. Cellules mononucléées du sang périphérique canin (PBMCs) ................................................................... 71
b. Anticorps ..................................................................................................................................................... 72
c. Cytomètre de flux .......................................................................................................................................... 72
B. Protocole ........................................................................................................................................... 72
a. Isolement des PBMCs à partir du sang total et protocole de marquage ..................................................... 72
b. Acquisition................................................................................................................................................... 74
3. Résultats .............................................................................................................................. 75
A. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD5/CD8 ......................................................................... 75
a. Résultats du marquage du chien à l’origine de cette thèse ......................................................................... 75
b. Résultats du marquage sur les PBMCs congelées ..................................................................................... 76
b. Comparaison des valeurs obtenues selon l’état de congélation ................................................................. 77
c. Effet du sexe sur les pourcentages des différentes populations parmi les cellules CD3-............................ 80
B. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD5/CD8 ......................................................................... 81
C. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD8/NKp46 ..................................................................... 81
4. Discussion ............................................................................................................................ 82
Conclusion................................................................................................................................... 87
Liste des références bibliographiques ...................................................................................... 88

Page 2
Liste des figures
Figure 1 : La famille des cellules lymphoïdes innées (d'après Artis et Spits, 2015) ........................ 18

Figure 2 : Voies ontogéniques des cellules NK humaines (adapté d’Abel et al., 2018).. ................ 19

Figure 3 : Contrôle transcriptionnel de la lignée ontogénique des cellules NK (d'après Geiger et Sun,
2016). ............................................................................................................................................ 20

Figure 4 : Schéma du développement des cellules NK humaines dans la moelle osseuse et les
nœuds lymphatiques (d'après Abel et al., 2018)... ......................................................................... 21

Figure 5 (gauche) : Cellule NK humaine (en bas) à proximité d’un granulocyte éosinophile (en haut),
observés en microscopie optique (d’après Lazarchick, 2004). ....................................................... 22

Figure 6 (droite) : Cellule NK humaine observée en microscopie électronique à transmission. Les

flèches noires indiquent les mitochondries (d’après Paananen et al., 2000). ................................. 22

Figure 7 : Marqueurs phénotypiques de surface des cellules NK canines sur la base des preuves en
2019 (d’après Gingrich et al., 2019)............................................................................................... 25

Figure 8 : Principales caractéristiques phénotypiques des grandes sous-populations de cellules NK

humaines (d’après De Sanctis et al., 2022). .................................................................................. 27

Figure 9 : Résumé des fonctions des cellules NK humaines (d’après Crinier et al., 2020). ............ 30

Figure 10 : Régulation de la réponse immune par les cellules NK (Vivier et al., 2008)…. .............. 31

Figure 11 : Fonctions et régulations des lymphocytes NK hépatiques (d’après Tian et al., 2013). . 32

Figure 12 : Résumé du transfert de granulysine aux trophoblastes infectés par L. monocytogenes

par les cellules NK déciduales humaines (d’après Crespo et al., 2020)… ..................................... 35

Figure 13 : Interactions et mécanismes d’action des cellules NK dans le cadre de l’immunité

antibactérienne (d’après Schmidt et al., 2016). .............................................................................. 36

Figure 14 : Interactions entre les cellules NK et les pathogènes fongiques (d’après Schmidt et al.,
2017)… ......................................................................................................................................... 37

Figure 15 : Cellule NK humaine de la lignée NK92 conjuguée à des érythrocytes infectés par P.
falciparum en microscopie confocale (d’après Baratin et al., 2007).. ............................................. 38

Figure 16 : Résumé du rôle des cellules NK dans les maladies auto-immunes chez l’Homme (d’après
M. Liu et al., 2021)......................................................................................................................... 40

Figure 17 : Schéma de l’axe inhibiteur des cellules NK humaines sur les ILC2s tel que proposé par
Mack et al (d’après Kabashima et Weidinger, 2020)...................................................................... 42

Figure 18 : Mécanismes d’alloréactivité des cellules NK dans la cadre de greffe d’organe solide
(d’après López-Botet et al., 2017).................................................................................................. 46

Page 3
Figure 19 : Les multiples rôles des cellules NK dans la transplantation rénale (d’après Pontrelli et
al., 2020).. ..................................................................................................................................... 48

Figure 20 : Remodelage des artères spiralées par les cellules NK et les trophoblastes extra-villeux
dans divers cas de figure : absence de gestation à gauche, prééclampsie au centre, gestation
physiologique à droite (d’après Parham, 2004). ............................................................................ 50

Figure 21 : Résumé des différents types de réponse mémoire et « memory-like » des cellules NK
(d’après Gang et al., 2020). ........................................................................................................... 52

Figure 22 : Schéma récapitulatif des réponses mémoires et « memory-like » des cellules NK envers
différents pathogène (d’après Brillantes et Beaulieu, 2020).. ......................................................... 53

Figure 23 : La fonction des cellules NK est régulée par des récepteurs de surface et des cytokines
(d’après Wolf et al., 2023)... .......................................................................................................... 55

Figure 24 : Influence des cellules NK dans la lutte anti-tumorale et exemple d’une voie de
signalisation (d'après Wolf et al., 2023).. ....................................................................................... 56

Figure 25 : Mécanismes impliqués dans la dysfonction des cellules NK dans le microenvironnement

tumoral humain (d’après Cózar et al., 2021) . ................................................................................ 58

Figure 26 : Projet d’immunothérapie utilisant les cellules NK chez le chien (d’après Kisseberth et
Lee, 2021).. ................................................................................................................................... 60

Figure 27 : Lésions retrouvées lors de lymphome extranodal à cellules NK/T de type nasal
(Harabuchi et al., 2019).. ............................................................................................................... 62

Figure 28 : Histologie d’un nœud lymphatique d’un patient atteint de lymphome nodal à cellules NK/T
positif à l’EBV (d’après Kim et al., 2019).. ...................................................................................... 64

Figure 29 : Images endoscopiques d’iNKLPD (Mansoor et al., 2011).. .......................................... 66

Figure 30 : Coloration Wright-Giemsa d’un frottis de moelle osseuse d’un patient atteint de leucémie
agressive à cellule NK (×1,000) (d’après Yang et al., 2022). ......................................................... 68

Figure 31 : Microphotographies de frottis de moelle osseuse chez un chien atteint de LGLL

(coloration de Wright-Giemsa) (d’après Akiyoshi et al., 2019)... .................................................... 69

Figure 32 : Résultats typiques en cytométrie de flux de chiens avec un(e) LGLL (d’après Jaensch
et al., 2022).. ................................................................................................................................. 70

Figure 33 : Répartition des différents éléments figurés sanguins après centrifugation (d’après Ota et
Tanaka, 2017). .............................................................................................................................. 73

Figure 34 : Différentes portes sélectionnées sur le logiciel (PBMCs et lymphocytes). ................... 74

Figure 35 : Comparaison du marquage entre un échantillon incubé avec les marqueurs dont le CD3
(à droite) et son échantillon témoin (à gauche). ............................................................................. 74

Figure 36 : Exemple de vérification du marquage effectif des cellules par les deux autres marqueurs
du mix 2. ....................................................................................................................................... 75

Page 4
Figure 37 : Exemple de vérification du marquage effectif des cellules du chien à l’origine de cette
thèse par les deux autres marqueurs du mix 2. ............................................................................. 76

Figure 38 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 1. ................................................................................................................. 78

Figure 39 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 2. ................................................................................................................. 78

Figure 40 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 3. ................................................................................................................. 79

Figure 41 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 4. ................................................................................................................. 79

Figure 42 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 5. ................................................................................................................. 80

Figure 43 : Démonstration de l’absence de réactivité de l’anticorps anti-CD5 dans un des

échantillons testés. ........................................................................................................................ 81

Figure 44 : Démonstration de l’absence de réactivité du marqueur NKp46+ chez le chien IZ. ....... 82

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Page 6
Liste des tableaux

Tableau 1 : Répartition des marqueurs phénotypiques de surface des cellules NK canines sur la
base des preuves en 2019 (d’après Gingrich et al., 2019). ............................................................ 30

Tableau 2 : Classification des cellules NK sanguines chez les patients atteints de MA (d’après Qi et
al., 2022).. ..................................................................................................................................... 44

Tableau 3 : Résumé des caractéristiques des principaux anticorps utilisés. .................................. 72

Tableau 4 : Synthèse des différents pourcentages phénotypiques globaux des échantillons

congelés. ....................................................................................................................................... 76

Tableau 5 : Comparaison collective des différents pourcentages phénotypiques globaux des

échantillons frais et congelés......................................................................................................... 77

Tableau 6 : Comparaison collective des différents pourcentages phénotypiques selon le sexe. .... 80

Page 7
Page 8
Liste des abréviations
ABMR = Antibody Mediated Rejection
ADCC = Antibody-Dependant Cell-Mediated Cytotoxicity
AICD = Activation-Induced Cell Death
AIH = Autoimmune Hepatitis
AREG = Amphiréguine
ARN = Acide Ribonucléotidique
BEC = Biliary Epithelial Cell
CAR = Chimeric Antigen Receptor
CCL = Chemokine [C-C motif] Ligand
CD = Cluster of Differentiation
CLP = Common Lymphoid Progenitor
CPA = Cellule Présentatrice d’Antigène
CDV = Canine Distemper Virus
CIVD = Coagulation Intra-Vasculaire Disséminée
CSP = Cholangite Sclérosante Primitive
DA = Dermatite Atopique
DAMPs = Damage-Associated Molecular Patterns / motifs moléculaires associées à
l’endommagement
DMSO = Dyméthylsulfoxyde
dNK = decicual NK Cell
DSA = Donor-Specific Alloantibodies
EBER = Epstein-Barr virus-Encoded small RNAs
EBV = Epstein-Barr Virus
ENKTCL = Extranodal NK/T Cell Lymphoma
EVT = Extravillous Trophoblast
FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting
FLT3L = FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
GR = Globule Rouge
HE = Hémalun et Eosine
HLA = Human Leukocyte Antigen
HSC = Hematopoietic stem cell
IFN = Interféron
iKIR = inhibitory Killer Immunoglobulin-like Receptor
Ig = Immunoglobuline
IL = Interleukine
ILCs = Innate Lymphoid Cells
iNK = immature NK cell
iNKLPD = Indolent NK-cell LymphoProliferative Disorder of the GI tract)
KC = Kupffer’s Cell
KAR = Killer cell-Activating Receptor
KIR = Killer Immunoglobulin-like Receptor
L = Ligand
LGL = Large Granular Lymphocyte

Page 9
LGLL = Leucémies et Lymphomes à Grands Lymphocytes Granuleux
LMPP = Lymphoid-Primed Multipotential Progenitor
LTi = Lymphoid Tissue Inducer
lrNK = liver resident NK
MA = Maladie d’Alzheimer
MAIT = Mucosa-Associated Invariant T
mIR = Micro-ARN
mNK = mature NK cell
mTOR = Mechanistic Target of Rapamycin
MSC = Mesenchymal Stem Cells
NCR = Natural Cytotoxicity Receptor
NK = Natural Killer
NK-LGLL = NK-Large Granular Lymphocytic Leukaemia
NKR = NK cell’s Receptor
NKP = NK Cells Progenitor
NKT = Natural Killer T
PAMPs = Pathogen Associated Molecular Patterns / motifs moléculaires associés aux pathogènes
PB = Peripheral Blood
PBC = Primary Biliary cholangitis
PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBS = Phosphate-Buffered Saline
PCR = Polymerase Chain Reaction
PD = Programmed cell Death
PDGF = Platelet-derived growth factor
PDL = Programmed cell Death Ligand
PG = Prostaglandin
PRRs = Pattern Recognition Receptors
RBC = Red Blood Cell
SLT = Small Lymphatic Tissue
Tbx2I = T-box transcription factor T-bet
TCR = T Cell Receptor
TCMR = T Cell-Mediated Rejection
Tfh = lymphocytes T folliculaires helper
TGF = Transforming Growth Factor
TIA = T-cell Intracellular Antigen
TIGIT = T cell immunoglobulin and ITIM domain
Th = T helper
TNF = Tumour Necrosis Factor
TRAIL = Tumor necrosis factor (TNF)-Related Apoptosis-Inducing Ligand
TRM = T Resident Memory
TSLP = Thymic Stromal Lymphopoietin
XCL = Chemokine C-motif Ligand
uNK = uterine NK cells

Page 10
Page 11
Introduction
Les cellules Natural Killers (NK) ont été décrites pour la première fois chez l’Homme et la souris en
1975 sur la base de la découverte dans les années 60 de cellules possédant une activité cytotoxique
innée et intrinsèque. Elles sont en première ligne du concept, aujourd’hui débattu, de l’immunité
innée au travers de leur rôle cytotoxique. Elles sont largement décrites chez l’Homme et la souris,
malgré des différences de caractérisation inter et intra-spécifiques.

Récemment, au secteur Immunologie du BioPôle Alfort, le laboratoire d’analyses biologiques

vétérinaires de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, une cytométrie de flux a été prescrite dans le
cadre d’une suspicion de lymphome ou de leucémie chez un chien. Cette technique permet
d’immunophénotyper les cellules, sanguines dans ce cas, à l’aide d’anticorps spécifiques. De façon
intéressante, il s’agissait d’un lymphome de phénotype « ni lymphocyte B ni lymphocyte T ». Utilisant
d’autres anticorps disponibles au laboratoire, les cellules ont montré un phénotype particulier, faisant
penser à un lymphome « de type NK ». Les cellules NK sont difficilement identifiables en cytométrie
de flux chez les chiens car il n'existait pas encore, au moment du diagnostic, d'anticorps spécifiques
de ces cellules commercialement disponibles. De plus, la littérature parcourue ne montre pas de
données précises sur le pourcentage de cellules NK circulantes chez le chien, surement dû au
manque d’outils spécifiques pour les identifier.

C’est donc ainsi qu’a émergé ce sujet de thèse, afin de pouvoir donner les valeurs de
référence de la présence sanguine des cellules NK en utilisant ce nouvel éventail d’anticorps
disponibles au BioPôle Alfort, et d’ainsi pouvoir immunophénotyper un lymphome qui s’avèrerait
négatif pour les marqueurs classiques des lymphomes B et T. Toutefois, un tel marquage n’a jamais
été mis au point au BioPôle Alfort dans ce but. C’est pourquoi, en partant d’une banque de cellules
mononucléées du sang périphérique (PBMCs) de chiens surnuméraires et conservées congelées
au BioPôle, suite à d’autres projets de recherche cliniques, des essais de marquages avec ce panel
d’anticorps ont été réalisés. Ce manuscrit se compose donc de deux parties, une première partie
bibliographique qui introduit les cellules NK et la deuxième qui se consacre à l’étude expérimentale
de ces cellules à partir d’une banque de cellules sanguines canines.

Page 13
Page 14
Première partie : bibliographie

1. Revue des connaissances sur la cellule Natural Killer (NK)

A. Le système immunitaire inné

a. Généralités
Le système immunitaire englobe une variété de structures, de processus, de molécules et de cellules
qui protègent l’organisme d’antigènes représentés par des micro-organismes (virus, bactéries,
champignons, parasites), des toxines ou encore de cellules tumorales (Marshall et al., 2018; Tizard,
2016). L’enjeu est de ce fait de reconnaître et de réagir face à des éléments étrangers sans léser
l’organisme ; la discrimination d’éléments du « non soi » et du « soi » est alors cruciale (Nicholson,
2016). Une vue simpliste consiste à le représenter comme une double ligne défensive : le système
inné et le système adaptatif. Il est admis que le système immunitaire inné représente la première
ligne de défense contre les pathogènes. Le mécanisme de défense actif est antigène-indépendant
(donc non spécifique), réagissant en un intervalle de temps restreint après rencontre de l’élément
déclencheur (Marshall et al., 2018). Une absence de mémoire lui est souvent attribuée bien que ce
concept soit aujourd’hui débattu voire contredit (Brillantes et Beaulieu, 2020 ; Brooks et al., 2022).
Par opposition l’immunité adaptative est en revanche, antigène-spécifique, antigène-dépendante, et
nécessite alors un délai d’exposition à l’antigène. Une des caractéristiques de cette immunité est la
capacité de mémoire garantissant à l’hôte une réponse immunitaire plus rapide et efficace en cas
de réexposition de l’antigène (Marshall et al., 2018). Les immunités innée et adaptative ne sont pas
des mécanismes mutuellement exclusifs mais bel et bien complémentaires, et leurs défaillances
conduisent à une vulnérabilité accrue de l’organisme, voire à une réponse inappropriée (Bonilla et
Oettgen, 2010; Marshall et al., 2018; Turvey et Broide, 2010).
L’immunité innée peut être abordée comme une coalition de 4 types de défenses que sont
les barrières anatomiques (par exemple la peau), les barrières physiologiques (par exemple le pH
gastrique) les barrières cellulaires et enfin les barrières humorales (Marshall et al., 2018; Tizard,
2016).
Différentes molécules antimicrobiennes sont produites en continu par l’organisme, parmi
lesquelles il est possible de citer les peptides anti-microbiens ou encore le système du complément.
Ce dernier est un composant essentiel de l’immunité, tant innée qu’adaptative. Il est composé de
dizaines de protéines plasmatiques et membranaires, et par des mécanismes de cascade, il identifie
et opsonise entre autres, les pathogènes reconnus. Le complément favorise alors la phagocytose
de ces derniers, bien qu’il soit également en mesure dans certaines situations, de détruire des
agents pathogènes ou des cellules infectées (Aristizábal et González, 2013; Marshall et al., 2018;
Nicholson, 2016; Tizard, 2016).

Page 15
 Une inflammation se développe quelques minutes après l’endommagement d’un tissu. Lors
d’une intrusion, les pathogènes introduisent de facto des motifs moléculaires associés (PAMPs)
tandis que les cellules lysées sécrètent des motifs associées à l’endommagement (DAMPs) (Tizard,
2016). Les cellules sentinelles sont activées lors de la liaison de DAMPs ou de PAMPs avec leurs
récepteurs reconnaissant ces motifs (PRRs) et produisent en conséquence des cytokines, des
chimiokines et des enzymes qui exacerbent l’inflammation, inhibent la croissance de certains agents
pathogènes et enclenchent les premières étapes de la réponse adaptative (Marshall et al., 2018;
Tizard, 2016). Les principales cytokines inflammatoires sont le facteur de nécrose tumorale de type
alpha (TNFα), l’interleukine 1 (IL-1) et l’interleukine 6 (IL-6) (Abbas et al., 2015; Turvey et Broide,
2010). Ces cytokines sont essentielles à l’initiation de l’inflammation locale, au recrutement cellulaire
et à d’autres réponses systémiques telles que la fièvre (Marshall et al., 2018; Tizard, 2016). Cette
réponse nécessite donc la mise en place d’un équilibre entre une production cytokinique suffisante
pour une réponse immunitaire efficace, et une surproduction qui pourrait causer des dommages
collatéraux à l’organisme. Leur demi-vie courte permet en partie de limiter la survenue de la seconde
assertion, bien que la survenue de dommages systémiques et collatéraux soit largement décrite lors
de réponses inadaptées (Fajgenbaum et June, 2020). De nombreuses cellules immunitaires sont
impliquées dans la réponse immunitaire innée. On peut ainsi citer les granulocytes neutrophiles, les
granulocytes éosinophiliques, les granulocytes basophiles, les mastocytes, les macrophages, les
cellules dendritiques, les cellules lymphoïdes innées (ILCs) et enfin les cellules NK. Ces cellules
détiennent des propriétés propres bien que certaines se recoupent. A titre d’exemple les
macrophages partagent des propriétés de phagocytose avec les neutrophiles et sont impliqués dans
la présentation antigénique aux lymphocytes T tout comme les cellules dendritiques (Aristizábal et
González, 2013; Marshall et al., 2018; Turvey et Broide, 2010). Les ILCs seront développées dans
la partie suivante.

b. Les cellules lymphoïdes innées ou ILCs

D’après les littératures humaine et murine, les ILCs représentent les pendants innés de certains
lymphocytes T, et se caractérisent par une absence de récepteurs antigéniques adaptatifs (Artis et
Spits, 2015; Vivier et al., 2018). Il s’agit de cellules résidentes de tissus, intégrées dans
l’homéostasie tissulaire, la réponse innée à divers pathogènes et la régulation de l’inflammation
tissulaire (Figure 1). Par ailleurs il a été démontré que leurs différentes sous-populations sont douées
de plasticité (Vivier et al., 2018). Bien que ces dernières aient d’ores et déjà été intensément étudiées
chez l’Homme ou la souris, il est à noter un manque d’études à ce sujet concernant le chien, et par
conséquent l’existence de nombreuses lacunes ontogéniques, phénotypiques et fonctionnelles
(Gingrich et al., 2019).
Il existe par ailleurs des populations de lymphocytes T aux fonctions similaires à celles des
ILCs dans certains tissus, parmi lesquelles on peut citer les cellules MAIT (mucosa-associated
invariant T), les cellules TRM (T Resident Memory), diverses sous-populations de lymphocytes Tγδ,
ou encore les cellules NKT (Natural Killer T (cf infra))(Vivier et al., 2018).

Page 16
 □ Les ILC1 et les cellules NK

Les ILC1s et les cellules NK représentent respectivement les pendants innés des lymphocytes T
CD4+ helper 1 et des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (Eberl et al., 2015; Vivier et al., 2018). Les
ILC1s sont en général non ou faiblement cytotoxiques et constituent une première ligne de défense
cellulaire contre des processus tumoraux, des virus et certaines bactéries et parasites intracellulaires
(Artis et Spits, 2015). Les ILC1s et les cellules NK détiennent diverses caractéristiques communes.
A titre d’exemple chez ces deux types cellulaires l’interféron γ (IFNγ) représente la principale
production cytokinique par le biais du facteur de transcription T-bet (dont il faut noter une
dépendance concernant les ILC1s). Une production de TNFα est également commune aux deux
entités (Abel et al., 2018; Artis et Spits, 2015; Vivier et al., 2018). En revanche le caractère
cytotoxique des cellules NK leur attribue de fait une classification distincte (Abel et al., 2018 ; Brooks
et al., 2022). Ainsi, si on retrouve une forte expression de perforine chez les cellules NK, c’est
l’inverse qui est retrouvé chez les ILC1s. De plus leurs voies ontogéniques diffèrent (Vivier et al.,
2018).
La caractérisation phénotypique précise des ILC1s reste ardue en raison de la variabilité
retrouvée en fonction de l’état d’activation et du tissu de résidence. De plus elles partagent selon le
tissu de résidence, certains marqueurs en commun avec les ILC3s et les cellules NK (notamment
NK1.1, NKp44, NKp46 et NKp44, NKp46, CD127 respectivement chez la souris et chez l’Homme)
(Vivier et al., 2018).

□ Les ILC2s

Il s’agit des pendants innés des lymphocytes Th2 (Eberl et al., 2015; Vivier et al., 2018). Les ILC2s
sont définies par leur capacité à produire des cytokines de type 2 telles que l’IL-4, l’IL-5, l’IL-9 et l’IL-
13 (Artis et Spits, 2015; Vivier et al., 2018). Elles sont impliquées dans la réponse innée aux
parasites et dans la réparation tissulaire par le biais de la production d’AREG (une cytokine au rôle
pro-mitotique chez les cellules épithéliales entre autres (Zaiss et al., 2015)) (Spits et al., 2013; Vivier
et al., 2018).

□ Les ILC3s

Il s’agit des pendants innés des lymphocytes Th17 (Eberl et al., 2015; Vivier et al., 2018). Les ILC3s
sont retrouvées en grandes quantités au niveau des muqueuses, où elles se développent après la
naissance à la suite d’une stimulation par le microbiote. Elles sont de fait impliquées dans la réponse
immune aux bactéries extra-cellulaires, mais aussi dans l’endiguement de la flore commensale ainsi
que dans la régulation de la réponse des lymphocytes Th17. Il est à noter leur production d’IL-22 qui
leur permet de participer au maintien de l’homéostasie intestinale et de promouvoir la prolifération
des cellules souches intestinales. Il existe deux sous-populations d’ILC3s en fonction de leur
expression de NKp46 (chez la souris) ou de Nkp44 (chez l’Homme)(Spits et al., 2013). Par ailleurs
les ILC3s humaines et murines sont en mesure de produire du GM-CSF (une cytokine promouvant
le développement et la maturation des cellules myéloïdes (Egea et al., 2010)) (Artis et Spits, 2015;
Vivier et al., 2018).

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Figure 1 : La famille des cellules lymphoïdes innées (d'après Artis et Spits, 2015). Les groupe 1, 2 et 3
des ILCs se définissent en fonction de l’expression de leurs marqueurs de surface, de leurs facteurs de
transcription clés et des différentes cytokines sécrétées. Les ILCs sont activées par une large variété de stimuli
et contribuent à l’immunité innée, au développement de l’inflammation et au maintien de l’homéostasie
tissulaire. Des dérégulations des réponses des ILCs peuvent mener au développement de maladies
inflammatoires chroniques, de cancers et de déséquilibres métaboliques.

B. Ontogénie des cellules NK

a. Chez l’Homme :
Tout comme l’ensemble des éléments figurés du sang, les cellules NK proviennent initialement de
cellules souches hématopoïétiques (Figure 2) qui se définissent par deux de leurs propriétés, la
première reposant sur une capacité d’auto-renouvèlement à long terme, et la seconde sur la capacité
à aboutir à des catégories cellulaires finales différenciées. Cet équilibre entre les deux points
précédents est régulé par de nombreux facteurs impliqués dans la survie, le renouvellement et la
différentiation cellulaires. Ces facteurs peuvent être catégorisés en intrinsèques (les facteurs de
transcription) et extrinsèques (les cytokines) (Brooks et al., 2022). En effet la différentiation du
progéniteur lymphoïde commun (CLP) en cellules NK nécessite, entre autres, une guidance par
l’éomésodermine et le facteur de transcription Tbx2I (Figure 3). Ce dernier est également impliqué
dans la différenciation des ILC1s (Del Zotto et al., 2017). Il est aujourd’hui établi le rôle essentiel de
cytokines telles que L’IL-2, l’IL-7, l’IL-15 dans le développement et la différentiation de la cellule NK
(Abel et al., 2018). La mise en évidence du rôle d’autres cytokines (IL-12, IL-18, IL-27, and IL-35)
dans l’amorçage transcriptionnel des cellules NK est en cours d’émergence (Abel et al., 2018).

Il a longtemps été admis chez l’Homme que le développement des cellules NK était exclusif
à la moelle osseuse sur la base de la possibilité in vitro d’aboutir à des cellules NK à partir de cellules
souches hématopoïétiques CD34+, à qui on fournissait du stroma de moelle osseuse ou de l’IL15
(produit par le stroma). Cependant la découverte il y a une décennie de stades de développement
intermédiaires au niveau d’organes lymphoïdes secondaires localisés dans les tonsilles palatines,
la rate et les nœuds lymphatiques, a remis ce dogme en cause (Di Vito et al., 2019).

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Figure 2 : Voies ontogéniques des cellules NK humaines (adapté d’Abel et al., 2018). Les cellules
souches hématopoïétiques (HSCs) Lin−CD34+ se différencient en progéniteurs multipotentes à amorçage
lymphoïde (LMPPs) CD45RA+. Au travers de l’expression du CD38, CD7, CD10, et du récepteur α à l’IL-7
(CD127), les LMPPs amorcent une transition en CLPs qui détiennent un potentiel d’engagement dans les
voies des lymphocytes T, des lymphocytes B, des ILCs, ou encore de se différencier en progéniteurs des
cellules NK (NKPs). A ce titre, l’expression du récepteur β à l’IL-2 marque l’engagement irréversible des CLPs
dans la lignée des cellules NK. L’apparition du CD56 (molécule d'adhésion des cellules neurales) signe la
transition finale de cellules NK immatures (iNK) en cellules « matures » (encadrés en rouge sur la figure ci-
dessous). La plupart des cellules iNK aboutit à une population CD56bright minoritaire (~5%) qui se convertit
par la suite en population CD56dim majoritaire (> 90%). Il est également supposé que les cellules iNK peuvent
directement aboutir à une population CD56dim (flèches en pointillés).

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Figure 3 : Contrôle transcriptionnel de la lignée ontogénique des cellules NK (d'après Geiger et Sun,
2016). Un réseau complexe de facteurs de transcription régit l’aiguillage de maturation des CLPs. Une liste
simplifiée des facteurs induisant les voies des ILCs et des lymphocytes T et B est présentée. À partir de la
CLP, les facteurs de transcription indiqués ci-dessous promeuvent la différentiation des CLPs en NKPs, en
iNKs et enfin en cellules NK matures (mNKs). Les facteurs menant la transition de l'étape iNK à l'étape mNK
sont répertoriés dans deux colonnes en fonction de leur ordre chronologique supposé. Les facteurs de
transcription sont placés en fonction de l'endroit où un défaut ou un arrêt du développement est observé chez
la souris knockout lorsque cela est possible. L'expression des facteurs peut se produire avant l'étape indiquée.

Des travaux ont défini six stades de développement des cellules NK chez l’Homme, sur la
base d’observations au sein de la moelle osseuse et des nœuds lymphatiques (Abel et al., 2018 ;
Scoville et al., 2017) (Figure 4).

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Figure 4 : Schéma du développement des cellules NK humaines dans la moelle osseuse et les nœuds
lymphatiques (d'après Abel et al., 2018). Un total de six étapes distinctes de développement a été décrit,
avec les stades 2 et 4 présentant des sous-stades supplémentaires. Les cellules NK humaines expriment
CD244 tout au long du processus de développement, à partir du Stade 1 (qui correspond aux précurseurs des
cellules NK). CD117 (c-Kit) et les faibles niveaux d'expression de l'IL-1R1 définissent respectivement le stade
2a et le stade 2b (qui correspond aux NKP). Une expression plus élevée d’IL-1R1 définit le Stade 3 (qui
correspond aux iNKs), où les expressions de NKG2D, CD335 (NKp46), CD337 (NKp30) et CD161 (NK1.1)
sont initiées. Les stades 4a et 4b définissent une transition des iNKs vers des cellules NK matures, et sont
différenciés par l'expression du NKp80 au stade 4b. Les expressions de NKG2D, CD335, CD337 et CD161
atteignent leur niveau maximal au Stade 4. Plus important encore, l'expression de CD56 atteint son pic
(CD56bright). Des différences significatives entre le stade 4b et le stade 5 sont définies par une diminution de
l'expression de CD56 (CD56dim) dans la plupart des cas, et l'initiation de l'expression de CD16 (FcγRIIIA) et
du récepteur KIR (CD158) dans un sous-ensemble de cellules NK. Le stade 6 définit la génération de cellules
NK "adaptatives" ou "memory-like" à la suite d’une exposition antigénique, et se caractérise par une expression
élevée de NKG2C.

Le détail moléculaire de l’ « éducation » des cellules NK est toujours débattu à ce jour, et

les mécanismes précis la concernant restent à élucider (Abel et al., 2018).

b. Chez le chien

A notre connaissance, un manque de littérature concernant l’ontogénie des cellules NK canines est
à signaler. Seules quelques données concernant la prolifération ou la survie des cellules NK sont à
ce jour disponibles. Il est en revanche suggéré que le marqueur NKp46 pourrait constituer un
marqueur de maturation chez le chien (Gingrich et al., 2021).

De nombreuses équipes ont mentionné l’emploi de cytokines humaines recombinantes pour

la prolifération des cellules NK, telles que l’IL-2, l’IL-12, l’IL-15 et l’IL-21 (Gingrich et al., 2019), bien
qu’il semblerait que l’IL-15 constitue davantage un facteur de survie et d’activation plutôt que de
prolifération et de croissance (Gingrich et al., 2021). La lignée cellulaire irradiée K562 est également

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employée pour la croissance et l’activation de cellules NK en culture. L’utilisation de lignées
cellulaires infectées comme cela est décrit chez l’Homme, a été tentée chez le chien sans résultats
fiables et reproductibles à la clé (Gingrich et al., 2019).

C. Morphologie et coloration
Les cellules NK sont majoritairement caractérisées par leur grande taille parmi les lymphocytes, leur
cytoplasme basophile et la présence de granules intracytoplasmiques azurophiles à la coloration de
May-Grünwald-Giemsa et denses en microscopie à transmission électronique (Brooks et al., 2022;
Kisseberth et Lee, 2021; Tsuchiyama et al., 1998) (Figure 5 & Figure 6).

Chez le chien, il est fait mention de cellules d’un diamètre entre 5,5 et 6,5 micromètres dotées
d’un noyau réniforme et de granules cytoplasmiques électroniquement denses (Gingrich et al., 2019;
Knapp et al., 1993). Par ailleurs une réactivité positive à l’acide periodique-Schiff a été observée
chez les cellules NK canines (Brooks et al., 2022).

Figure 5 (gauche) : Cellule NK humaine (en bas) à proximité d’un granulocyte éosinophile (en haut),
observés en microscopie optique (d’après Lazarchick, 2004).

Figure 6 (droite) : Cellule NK humaine observée en microscopie électronique à transmission. Les

flèches noires indiquent les mitochondries (d’après Paananen et al., 2000).

D. Marqueurs de caractérisation

a. Chez l’Homme
Chez l’Homme, les cellules NK périphériques sont classiquement qualifiées de CD3-
/CD56+/NKp46+ (Tizard, 2016). Les cellules NK du sang périphérique ont longtemps été divisées
en deux sous-populations selon l’intensité d’expression du marqueur CD56 : CD56bright et
CD56dim. La première sous-catégorie est classiquement décrite comme possédant une forte
capacité de synthèse de cytokines associée à une faible activité cytotoxique tandis que la seconde
se démarque par une activité cytotoxique importante (Luetke-Eversloh et al., 2013; Tizard, 2016).
On note typiquement une moindre expression des marqueurs CD16, KIRs et CD57 chez les cellules

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NK CD56bright tandis qu’elle est plus fréquente chez CD56dim (Björkström et al., 2016; Gingrich et
al., 2019). Cependant les marqueurs CD16, KIR, CD57, mais aussi CD62L, CD94/NKG2A, CD11b,
CD27 ne permettent pas d’identifier de sous-populations distinctes mais mettent plutôt en évidence
un continuum d’intermédiaires complexes, et de stades de maturation parfois différents (Fu et al.,
2014; Luetke-Eversloh et al., 2013).

b. Chez la souris
Les marqueurs chez la souris varient en fonction de la souche et de la lignée en question (Gingrich
et al., 2019). Chez cette espèce les cellules NK sont généralement définies comme des lymphocytes
CD3-NK1.1+ (un type de Ly49) ou encore CD3-NKp46+ (Walzer et al., 2007). Les cellules NK
murines peuvent également exprimer le CD49b, le CD27 ainsi que le CD11b, tandis qu’une absence
de CD127 est observée (Fu et al., 2014; « Natural Killer Cell Markers: R&D Systems », 2017). Trois
sous-population sont établies en fonction de l’intensité de l’expression des marqueurs CD11b et
CD27 : les cellules de phénotypes CD11dimCD27bright, CD11bbrightCD27dim et
CD11bbrightCD27bright. Les cellules NK CD27dim détiennent une activité cytotoxique et une
production cytokinique moindre par rapport aux cellules NK CD27bright (Fu et al., 2014; Hayakawa
et al., 2006; « Natural Killer Cell Markers: R&D Systems », 2017).
A titre d’exemple, les souris de souche C57Bl/6 ou encore SJL (Swiss Jim Lambert)
expriment les marqueurs de surface NK1.1, NKp46, et CD49b, mais pas CD3 (Goh et Huntington,
2017).

c. Chez le chien
Les premiers essais de caractérisation ont mis en évidence des résultats contradictoires concernant
le récepteur CD3 (marqueur traditionnel des lymphocytes T) ; avec certaines études mettant en
évidence des cellules CD3+ possédant des propriétés imputables aux cellules NK, tandis que
d’autres trouvaient des propriétés similaires chez des cellules CD3- (Foltz et al., 2016). Il faut
cependant noter une absence de marqueurs fiables lors des premières phases de recherche,
d’autant que l’IL2, fréquemment utilisée pour la mise en culture des cellules NK lors des premières
tentatives de caractérisation canine, stimule les cellules NK mais aussi les lymphocytes T. Ainsi il
est envisageable de supposer l’existence de résultats biaisés par la présence de nombreux
lymphocytes T voire NKT, lors des premières tentatives de caractérisation phénotypique des cellules
NK (Michael et al., 2013a). La présence du CD3 dans certaines études reste de fait énigmatique. Il
est également émis l’hypothèse que les cellules NK pourraient exprimer le CD3 lors de certains
stades de maturation (Lee et al., 2018; Yasuda et al., 2009), ou encore qu’il s’agisse d’un artefact
de fixation aspécifique (notamment avec des anticorps d’autres espèces). De fait le niveau de preuve
de l’expression du CD3 par les cellules NK canines n’est en l’état pas concluant ni complètement
décrit (Gingrich et al., 2019).
Les cellules NK canines sont CD4- et CD20- (des marqueurs phénotypiques des
lymphocytes T et B, respectivement)(MCDonough et Moore, 2000). Il a cependant été observé, bien
que non systématiquement, l’expression du CD8 dans certains travaux, allant jusqu’à 30% de la
population sélectionnée (Lin et al., 2018 ; Lin et al., 2010). Une équipe (Huang et al., 2008) a révélé
que le marqueur CD5, et plus précisément une faible expression (CD5dim) de ce marqueur,
représentait un intérêt à la caractérisation des cellules NK canines. En effet ces cellules qui

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représentaient 15% des PBMCs étaient de plus grande taille que les cellules CD5bright et à la suite
d’une exposition à l’IL-2, les cellules CD5dim détenaient des granules cytoplasmiques et une
cytotoxicité spontanée. De plus la réalisation d’une réaction de polymérase en chaine (PCR) sur les
cellules CD5dim purifiées a mis en évidence la présence d’acide ribonucléotidique (ARN) messager
correspondant à divers récepteurs activateurs et inhibiteurs des cellules NK (Huang et al., 2008).
Sur cette base, une autre étude s’est intéressée aux différences phénotypiques entre une
population de grands lymphocytes granuleux (LGL) cytotoxiques (CD3+CD5dimCD21−) et celle des
cellules NK sanguines (CD3−CD5−CD21-)(Lee et al., 2018). Ainsi pendant 21 jours, les cellules
CD3+CD5dimCD21− ont été mises en culture avec de l’IL-2, 15 et 21 et des cellules K562. Il a
ensuite été constaté que la fréquence des cellules CD3+CD5dimCD21− avait fortement diminué
tandis que celle des cellules CD3−CD5− CD21− avait augmenté, et un faible nombre de cellules
présentait le phénotype CD3−CD5dimCD21−. De plus, après culture ces cellules n’exprimaient pas
le TCR αβ ou le TCRγδ, amenant les auteurs à conclure qu’il s’agissait de cellules NK. Si les cellules
CD3+CD5dimCD21− présentaient une plus forte production d’IFNγ que les cellules
CD3−CD5−CD21−, leur cytotoxicité était en revanche équivalente (Lee et al., 2018). La transition
phénotypique lors de la culture a été attribuée à un phénomène d’activation et il a été supposé que
les phénotypes sus-cités correspondaient à différents stades de maturation des lymphocytes NK.
Une étude a mis en évidence une expression variable du CD11b (42% +/- 30%) après culture chez
des cellules CD3-CD5- (Michael et al., 2013a).
Un autre marqueur d’intérêt chez le chien est le NKp46/NCR1, un récepteur activateur pan-
mammalien des cellules NK (Gingrich et al., 2019). En effet, dans une étude utilisant l’anticorps
murin anti-NKp46 bovin, les phénotypes NCR1+ et NCR1- ont été retrouvés parmi les cellules CD3-
GranzymeB+, avec une population CD3-NCR1+ qui représentait 2,5% des lymphocytes. Ces
résultats sont plus faibles que la fréquence des cellules NK chez l’Homme et la souris. (Grøndahl-
Rosado et al., 2015 ; Huang et al., 2008). Par la suite lors d’exposition des cellules triées par
cytométrie de flux à de l’IL2 et de l’IL15 canines et humaines, le pourcentage de cellules CD3-NCR1+
avait significativement augmenté. Après exposition à de l’IL12 humaine, l’immense majorité des
cellules GranzymeB+ exprimaient NCR1 (Grøndahl-Rosado et al., 2016). Il a ainsi été conclu que
les phénotypes CD3−GranzymeB+NCR1− et CD3−GranzymeB+NCR1+ représentaient deux sous-
populations de cellules NK, et que la présence de NKp46 pourrait être induite à la suite d’une
exposition cytokinique (Grøndahl-Rosado et al., 2016). De fait, il a été par la suite démontré que le
marqueur NCR1 n’identifiait pas l’ensemble des cellules NK sanguines à l’état quiescent (Gingrich
et al., 2021; Grøndahl-Rosado et al., 2016). Par ailleurs, bien que le marqueur CD5dim apparaisse
plus sensible pour identifier de plus grands nombres de cellules NK circulantes, ce dernier inclut en
réalité une population hétérogène comprenant des entités non rattachables aux cellules NK
(Gingrich et al., 2021, 2019). Il existait (et existe) de fait le besoin d’une caractérisation plus poussée.
Sur cette base a été développé un anticorps anti-NKp46 canin par l’équipe de Fotz et al (2016), dans
un contexte où un manque d’anticorps monoclonaux spécifiques des cellules NK canines était à
déplorer (Foltz et al., 2016).
Des expériences similaires à la précédente ont été réalisées avec ce nouvel
anticorps identifiant à nouveau une double population CD3-NKp46- et CD3-NKp46+, cette dernière
représentant similairement à la précédente étude entre 2 et 3% des lymphocytes périphériques et
possédant une importante cytotoxicité. La population CD3-NKp46- présentait une cytotoxicité

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moindre en dépit d’une sécrétion cytokinique semblable, et il a aussi été démontré qu’elle pouvait
exprimer le NKp46 après stimulation (Foltz et al., 2016).
A notre connaissance, le dernier marqueur d’intérêt est le CD94. En effet un anticorps canin
a été développé en 2019 et se liait à environ 7,7 % des PBMCs (Graves et al., 2019). Cet anticorps
a par la suite été testé sur une population CD5dim et deux sous-populations ont alors émergé :
CD5dimCD94+NKp46+CD3− and CD5dimCD94+NKp46+CD3+ (il est à noter qu’elles étaient
négatives pour les CD4 et CD21). En dépit de l’exploration d’une éventuelle présence de récepteur
iTCRα (Gingrich et al., 2019), il a été supposé que la population CD5dimCD94+NKp46+CD3+
représentait les lymphocytes NKT (Graves et al., 2019).

Ainsi l’identification précise des cellules NK canines demeure un enjeu d’actualité (Figure 7).

Figure 7 : Marqueurs phénotypiques de surface des cellules NK canines sur la base des preuves en
2019 (d’après Gingrich et al., 2019).

L’analyse du transcriptome canin a mis en évidence des gènes associées à des protéines de
surface telles que KRLB1 (NK1.1), CD96, KLRF1 et KLRK1 (NKG2D). Il est à souligner par ailleurs,
que le transcriptome des cellules NK canines CD3-NKp46+ démontre une plus forte similitude avec
celui de l’Homme qu’avec celui de la souris (Gingrich et al., 2021).

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 E. Répartition dans l’organisme et sous-populations

Il est admis que les cellules NK sont largement réparties dans l’organisme (Björkström et al., 2016).
Chez l’Homme il est estimé que les cellules NK (tout du moins celles définies par la combinaison de
marqueurs CD16+CD56+CD3-) représentent entre 5 et 20% des cellules mononuclées du sang
périphérique (Langers et al., 2012). D’autres travaux font état d’une grande variabilité du
pourcentage de cellules NK périphériques parmi les lymphocytes tant chez l’homme (1–32.6%, avec
une valeur médiane à 7.6%) que chez le chien (2.5–15%) selon les études (Gingrich et al., 2019;
Kisseberth et Lee, 2021). Par ailleurs le « turnover » des cellules NK humaines dans le sang humain
est d’environ 2 semaines (Vivier et al., 2008).
Il est estimé que les cellules NK sanguines humaines sont constituées à 90% de cellules de
phénotype CD56dim et 10% de cellules CD56bright (Luetke-Eversloh et al., 2013; Yamin et al.,
2019). Le phénotype CD56bright est en revanche majoritaire dans les organes lymphoïdes
secondaires (Luetke-Eversloh et al., 2013). Elles représentent entre 20 et 30% des lymphocytes
hépatiques et 10% des lymphocytes pulmonaires chez l’Homme en bonne santé (Ferlazzo et
Carrega, 2012).
Consécutivement à l’influence de nombreuses voies de signalisation et du micro-
environnement de résidence, il est possible de résumer trois sous-populations fonctionnelles de
cellules NK : les NK « tolérantes » caractérisées par une dominance des signaux inhibiteurs, les
NK « cytotoxiques », caractérisées par une dominance des récepteurs activateurs, et enfin les NK
« régulatrices » caractérisées par une dominance des signaux d’activation et une importante
production de molécules inflammatoires. Leurs phénotypes respectifs sont principalement
CD56bright et/ou CD27-/CD11b- ; CD56dim et/ou CD11b+/CD27- ; CD56bright et/ou CD7+ (Fu et
al., 2014). Ces différentes catégories se déclinent en prime dans une grande variété d’organes,
diversifiant encore leurs spécificités (Shi et al., 2011)(Figure 8). Ainsi et à titre d’exemple, les cellules
NK hépatiques se retrouvent impliquées dans la tolérance du système immunitaire et dans la
cinétique de diverses lésions (Tian et al., 2013) tandis que les cellules NK déciduales médient la
tolérance immune entre la mère et le fœtus ; et le remodelage vasculaire avec l’aide des
trophoblastes villeux (Fu et al., 2014; Sargent et al., 2006). Ainsi une autre dichotomie peut être
définie entre les cellules NK périphériques et celles résidentes de tissus, d’autant que leurs profils
cytokiniques et leurs marqueurs caractéristiques diffèrent selon leur localisation (Hashemi et
Malarkannan, 2020).

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Figure 8 : Principales caractéristiques phénotypiques des grandes sous-populations de cellules NK
humaines (d’après De Sanctis et al., 2022).

S’il existe des particularités phénotypiques des cellules NK selon leur tissu de résidence, il
reste à déterminer si cette hétérogénéité provient de signaux tissulaires périphériques ou d’une
origine centrale (Luetke-Eversloh et al., 2013).
Chez le chien il est supposé que le marqueur NKp46 représente un élément discriminant entre
plusieurs sous-population de cellules NK, ce dernier représentant alors un phénotype « activé »
(Gingrich et al., 2019).

F. Les lymphocytes NKT

Il existe des lymphocytes exprimant simultanément des marqueurs propres respectivement aux
lymphocytes T et aux cellules NK, ils sont ainsi qualifiés de « lymphocytes NKT » (Tizard, 2016).
Ces caractéristiques leur permettent une activation dépendante, comme indépendante, de la
signalisation par le TCR. Bien qu’issues de la lignée des lymphocytes T, leur morphologie
s’apparente plus à celles des cellules NK. En effet on retrouve chez ces deux types cellulaires un
faible rapport nucléo-cytoplasmique, et on note également la présence d’amas de chromatine
dispersés au sein de leur noyau. Les deux entités sont qualifiées de grands lymphocytes granuleux
(Krijgsman et al., 2018). D’un point de vue immunophénotypique chez l’Homme, ces cellules étaient
longtemps caractérisées par les marqueurs CD3+/CD56+(Krijgsman et al., 2019; Li et al., 2017) bien
qu’il ait été mis en évidence une sous population de lymphocytes T (les lymphocytes NKT « like »)
partageant la même combinaison (Krijgsman et al., 2018). Chez le chien il est fait mention de
cellules CD3+/CD94+ et/ou de CD5low/Nkp46+ (Graves et al., 2019), voire de CD3+/iTCRα+
(Gingrich et al., 2019).

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 Ces cellules produisent des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IFNγ et le TNFα mais
aussi anti-inflammatoires comme l’IL4 et l’IL10, leur permettant ainsi une activité
immunomodulatrice. Elles déclenchent ainsi la libération de cytokines et de chimiokines, exacerbent
la fonction des cellules NK, promeuvent la maturation des cellules dendritiques et la réponse des
lymphocytes B. Leur sécrétion d’IL12 diminue notamment la production d’IL10 par les granulocytes
neutrophiles. Elles inhibent également le développement des lymphocytes Th17 et régulent la
production d’IL17 (Tizard, 2016; Wu et Kaer, 2011). On en distingue deux sous-catégories selon le
type de TCR exprimé, qui présente par ailleurs une variabilité limitée chez ces cellules (Brooks et
al., 2022).
Les lymphocytes NKT1 détiennent un TCR modifié au niveau de la chaîne β ; et sont en
mesure de reconnaître des antigènes lipidiques, lipopeptidiques et glycolipidiques à l’aide du CD1.
Ils représentent environ 1% des cellules mononuclées du sang périphérique chez l’Homme et sont
retrouvés préférentiellement au niveau des tissus lymphoïdes, du foie (avec un tropisme pour les
sinusoïdes hépatiques) et du tissu adipeux (Brooks et al., 2022; Tizard, 2016; Wu et Kaer, 2011).
Ce type cellulaire exprime le TCR CD3, le CD28, le CD8 et le CD4 bien qu’en proportions variables
selon les sous-populations (Krijgsman et al., 2018).
Les lymphocytes NKT2 expriment quant à eux un TCR qualifié d’oligoclonal et sont en mesure
de reconnaître des antigènes lipidiques (Brooks et al., 2022; Tizard, 2016). Leur fonction est
principalement anti-inflammatoire et il leur est supposément attribué un rôle immunorégulateur
(Tizard, 2016). Cette catégorie contient à ce jour de nombreuses zones d’ombre quant à son
phénotype précis et une partie de ses fonctions (Krijgsman et al., 2018).
Bien que possédant des fonctionnalités communes les champs d’action des cellules NK et
lymphocytes NKT ne se recoupent pas toujours. Il a par exemple été démontré que ces cellules
exhibaient des propriétés et des profils métaboliques différents lors de l’immunité antitumorale (Liu
et al., 2021).

G. Mécanisme d’action général

a. Production moléculaire, récepteurs et équilibres d’intégration

Les cellules NK se démarquent des autres éléments de la réponse innée par leur activité cytotoxique
directe couplée à la production de cytokines (Vivier et al., 2008). Les cellules NK expriment différents
récepteurs de surface ayant différent rôles : activation, inhibition, adhésion, réception de cytokines
ou encore chimiotactisme (Kisseberth et Lee, 2021). Lors de l’activation des cellules NK, une
synapse est formée avec la cellule cible et conduit à la libération de granules cytolytiques (Thiery et
al., 2011). En effet la plupart des cellules NK humaines et murines sont cytotoxiques. Elles
produisent des granules lytiques contenant diverses molécules (de la perforine, des granzymes
chez l’Homme, le chien et la souris (Foltz et al., 2016), et de la granulysine chez l’Homme) qui
contribuent à la mort cellulaire chez les cellules cibles. La perforine forme des pores sur la membrane
des cellule cibles, permettant alors l’entrée des autres molécules lytiques dont les granzymes qui
induisent l’apoptose via l’activation de la voie des caspases (Thiery et al., 2011).
Elles expriment plusieurs éléments de la famille des TNF tels que FASL et TRAIL, qui
induisent l’apoptose chez les cellules cibles par le biais d’une fixation à leurs récepteurs FAS et

Page 28
TRAILR. Il est à signaler également l’expression de TLR leur permettant de reconnaître les PAMPs
qui une fois liés induisent une cascade inflammatoire aboutissant à une production cytokinique, et
un recrutement des cellules présentatrices d’antigène (Noh et al., 2020).
Les cellules NK produisent :

- Diverses cytokines dont les principales sont l’IFNγ (stimulant la réponse antigène spécifique
et activant les acteurs de l’immunité cellulaire innée dont les macrophages (Kang et al.,
2018)) ; le TNFα (dont les fonctions incluent une différenciation des lymphocytes Th1, une
augmentation de l’activité macrophagique, une promotion de la diapédèse et une
augmentation de l’expression du CMH de classe I (Mah et Cooper, 2016)), et l’IL-10 (une
interleukine à rôle immunorégulateur (Saxton et al., 2021)).

- Des facteurs de croissance tels que le GM-CSF.

- Des chimiokines (parmi lesquelles il est possible de citer CCL3, CCL4, CCL5, XCL (Crinier
et al., 2020). Les chimiokines sont une superfamille de médiateurs inflammatoires qui guident
le recrutement et le positionnement des leucocytes dans les tissus sains ou malades
(Gismondi et al., 2010).

La modulation de la réponse des cellules NK repose sur un équilibre d’intégration de signaux

en provenance de récepteurs exprimés à la surface et en réponse à diverses cytokines (telles que
l’IL 15, l’IL 18 et l’IL 2). On peut globalement classer ces récepteurs dans deux catégories : les
récepteurs activateurs et les récepteurs inhibiteurs. Les premiers (NKG2D, NKp30, CD16 etc.)
reconnaissent des ligands spécifiques et induisent des signaux d’activation. Il est à noter la
particularité du CD16 qui ne reconnaît pas directement un ligand cellulaire mais des anticorps liés à
la cellule cible et qui contribue donc à la toxicité cellulaire médiée par les anticorps (ADCC) (Lo Nigro
et al., 2019). Les seconds (par exemple NKG2A, KIR chez l’Homme, Ly49 chez la souris) détectent
principalement des molécules du CMH de classe I et induisent des signaux inhibiteurs antagonisant
les activateurs (Gingrich et al., 2019; Osuna-Espinoza et Rosas-Taraco, 2023). En effet les KIRs
chez l’Homme et leurs pendants murins (Ly49) correspondent à des familles liant le CMH de classe
I. Lorsque ces derniers sont exprimés et liés par les cellules NK à la surface cellulaire, il n’y a
classiquement pas de réponse cytotoxique initiée bien que le signal inhibiteur associé puisse être
surpassé en cas d’engagement important des récepteurs activateurs (Gingrich et al., 2019). De fait
en cas de dérégulation du CHM de classe I lors de diverses pathologies, l’absence de signal
inhibiteur abaisse le seuil d’activation et donc de cytotoxicité (Gingrich et al., 2019). L’hétérodimère
CD94/NKG2A est un récepteur inhibiteur reconnaissant chez l’Homme des séquences élémentaires
conservées d’un point de vue évolutif contrairement aux récepteur KIRs et leur diversité de ligands,
le rendant ainsi complémentaire à ces derniers (Vilches et Parham, 2002). Les KIRs font référence
à des récepteurs inhibiteurs dont on note une forte diversité morphologique comparable à celle du
CMH de classe I, leur permettant ainsi de reconnaître différents types de HLA (Vilches et Parham,
2002). Ainsi cette diversité présente chez les sous-populations de cellules NK permet une
surveillance spécifique de chaque sous-type de HLA. De ce fait, cela inhibe la diffusion de certains
pathogènes dont le mécanisme d’évasion repose sur la dérégulation de molécules du CMH I
spécifiques (Vilches et Parham, 2002) (Figure 9 : Résumé des fonctions des cellules NK humaines
(d’après Crinier et al., 2020).

Page 29
Figure 9 : Résumé des fonctions des cellules NK humaines (d’après Crinier et al., 2020).

Le chien ne détient pas de KIR, et on note un unique récepteur de type Ly49 chez ce dernier
(Foltz et al., 2016)(Tableau 1). Bien qu’un manque de données globales et plus spécifiquement
concernant les mécanismes d’activation et d’inhibition soit à noter chez le chien, il est supposé que
les mécanismes sus-cités sont évolutivement conservés (Gingrich et al., 2019).

Tableau 1 : Répartition des marqueurs phénotypiques de surface des cellules NK canines sur la base
des preuves en 2019 (d’après Gingrich et al., 2019).

Page 30
 b. Interactions cellulaires
Bien que principalement abordées sous leur angle anti-tumoral et leur capacité à lyser des cellules
infectées par des virus, il est aussi à créditer aux cellules NK de multiples interactions avec des
cellules de la lignée immunitaire comme non immunes (Björkström et al., 2016). En effet l’intensité
et la qualité de la réponse cytokinique et cytotoxique des cellules NK dépend du micro-
environnement cytokinique et d’interactions avec d’autres cellules du système immunitaire telles que
les cellules dendritiques, les macrophages ou encore les lymphocytes T (Long, 2007). Les
interférons de type I, l’IL12, 15 et 18 sont des activateurs fonctionnels des cellules NK (Walzer et al.,
2005). Ces derniers voient leur activité régulée par le TGFβ, produit entre autres par les lymphocytes
T régulateurs (Vivier et al., 2008) (Figure 10).

Figure 10 : Régulation de la réponse immune par les cellules NK (Vivier et al., 2008). Les flèches rouges
correspondent à une activité de promotion de la maturation et de l’activation, tandis que les flèches bleues
font référence à l’action de cytotoxicité. Les flèches vertes intègrent les cytokines activatrices des cellules NK.

Les cellules NK endossent un rôle régulateur vis à vis de nombreux types cellulaires tels que
les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques ou encore les cellules endothéliales. Il a en effet
été démontré chez l’Homme et la souris que les cellules NK pouvaient lyser les cellules dendritiques
immatures, influençant alors leur homéostasie. Indirectement les destructions cellulaires par les
cellules NK favorisent la présentation antigénique croisée par ces mêmes cellules dendritiques, ce
qui contribue à la réponse immune adaptative. Au travers de la production d’IFNγ et de TNF, les
cellules NK promeuvent la maturation des cellules dendritiques qui en retour activent les cellules NK
par le biais de l’IL-12 (Vivier et al., 2008). Toujours de par leur sécrétion d’IFNγ, les cellules NK
promeuvent la maturation de lymphocytes T CD4+ Th1 dans les nœuds lymphatiques (Vivier et al.,
2008). Elles sont également en mesure de détruire les lymphocytes T activés en fonction de leur
expression du CMH de classe I (Morandi et al., 2006).

Page 31
 Il faut de plus, attribuer aux cellules NK une capacité de communication avec des cellules
non immunes telles que les cellules endothéliales, les trophoblastes ou encore les hépatocytes
(Shmeleva et Colucci, 2021; Tian et al., 2013; Vivier et al., 2008) (Figure 11).

Figure 11 : Fonctions et régulations des lymphocytes NK hépatiques (d’après Tian et al., 2013).

c. Influence externe
Certains facteurs externes peuvent influencer la fonction des cellules NK. Il est par exemple admis
chez l’Homme que la chimiothérapie et l’anesthésie affectent négativement le nombre et la fonction
des cellules NK (Kisseberth et Lee, 2021) tandis qu’une consommation d’alcool chronique est
associée à une suppression de fonction des cellules NK hépatiques (Tian et al., 2013). La radiation
à faible dose active les cellules NK tandis qu’elle altère la fonction de ces dernières à haute dose
(Chen et al., 2020). Il a aussi été démontré que diverses molécules médicamenteuses pouvaient
moduler l’activité et la fonction des cellules NK chez l’Homme (Miyazato et Hayakawa, 2020).

Chez le chien une étude s’est intéressée à l’influence in vitro de diverses molécules
anesthésiques sur la cytotoxicité des lymphocytes périphériques (sans tri des cellules NK)(Barr et
al., 2021). S’il n’a pas été démontré d’impact de la kétamine, de l’alfaxalone ou encore du propofol
in vitro sur la cytotoxicité de ces lymphocytes, les émulsions lipidiques accompagnant le propofol
avaient un effet réducteur sur leur cytotoxicité.

Page 32
 2. Approche fonctionnelle et dynamique des cellules NK

A. Les cellules NK et les maladies infectieuses

a. Les cellules NK et les maladies virales

La lutte virale par les cellules NK requiert une activation appropriée de ces dernières mais également
un recrutement efficace au(x) site(s) d’infection (Brandstadter et Yang, 2011). Les cellules NK
détiennent de multiples mécanismes pour détruire les cellules infectées par des virus, incluant
notamment l’implication de récepteurs de mort cellulaire, l’exocytose de granules cytolytiques ainsi
que la production d’une large gamme de cytokines pro-inflammatoires détenant une activité
antivirale (Lee et al., 2007). L’action combinée de récepteurs activateurs permettent de prévenir
l’inhibition potentiellement générée par les récepteurs inhibiteurs (De Sanctis et al., 2022). Des
protéines virales peuvent être reconnues par les récepteurs NCR, KIR, ou encore par le CD16
directement ou par l’intermédiaire du complément (Mancini et Vidal, 2020 ; van Erp et al., 2019 ;
Vivier et al., 2008). Les cellules NK expriment de multiples ligands des récepteurs de mort cellulaire,
incluant le Fas ligand (FasL) et le TRAIL (Colucci et al., 2003), capables déclencher la voie
extrinsèque de l’apoptose au travers de la voie de récepteurs de la mort exprimés sur les cellules
cibles. Cependant il est attribué aux récepteurs de mort cellulaire un rôle multi-facettes et
controversé dans le contrôle de l’infection et de la pathogénie associée (Cardoso Alves et al., 2020).
Il a été montré que, lors d’une infection virale, TRAIL module l’activité des cellules NK
indépendamment de leur fonction pro-apoptotique. Chez des souris infectées par le virus de la
chorioméningite lymphocytaire, la déficience en TRAIL a mené à une amélioration de la réponse
spécifique des lymphocytes T CD8+, menant à une suppression plus rapide du pathogène dans
l’organisme et des expériences de déplétion ont démontré que cet effet était médié par les cellules
NK. Par ailleurs TRAIL exprimé par les cellules immunitaires module positivement et de façon dose-
dépendante, la production de granzyme B médiée par l’IL15 des cellules NK, menant ainsi à une
augmentation de l’activité cytotoxique des lymphocytes T médiée par les cellules NK. Il restreint
également la production d’IFNγ par les cellules NK (Cardoso Alves et al., 2020).
Parallèlement le relargage dans la cellule cible de granules cytolytiques contenant de la
perforine et des granzymes déclenche l’apoptose cellulaire par le biais de l’activation de la voie des
caspases (Brandstadter et Yang, 2011). Ainsi tandis que la perforine perméabilise la cellule cible au
travers de la formation de pores membranaires, les granzymes alors insérés dérégulent le cycle
cellulaire, dissolvent le noyau et lèsent la séquence d’ADN. Par ailleurs, la production de certaines
cytokines (IL-12, IL-18, et TNFα entre autres) active les cellules cytotoxiques environnantes (De
Sanctis et al., 2022). La production d’IFNα est une fonction cruciale des cellules NK activées. En
effet, en plus d’une action directe contribuant à rendre les cellules hôtes moins accessibles
notamment en modulant l’expression et la distribution de récepteurs cellulaires requis pour l’entrée
virale, en inhibant la synthèse, la réplication et la transcription, la stabilité du génome ou encore la
transmission et la réactivation virale (Kang et al., 2018) ; elle intervient également dans le
recrutement d’une variété de leucocytes. Il a été démontré chez l’Homme qu’une déficience en cette
cytokine augmentait significativement la survenue d’une infection virale (Novelli et Casanova, 2004).
Chez le chien il a été établi que le CDV (canine distemper virus), agent de la maladie de
Carré, active les cellules NK, que ces dernières détiennent un rôle significatif dans la lutte antivirale
contre cet agent et que cet effet est médié par une cytolyse directe, l’ADCC ainsi qu’une production
d’IFNγ (Park et al., 2015).

Page 33
 b. Les cellules NK et les maladies bactériennes
Il est établi que les cellules NK détiennent un rôle dans la réponse aux infections bactériennes au
travers d’une activité directe et indirecte (Schmidt et al., 2016) (Figure 13). Les cellules NK expriment
des PRR leur accordant la capacité de reconnaître des PAMPs (Schmidt et al., 2016). A titre
d’exemple les cellules NK humaines sont activées via le Toll-like receptor (TLR) 2 par une protéine
de membrane de Klebsiella Pneumoniaie (Chalifour et al., 2004).
L’activité directe est médiée par l’activation des récepteurs de la mort et la sécrétion de
molécules solubles (Schmidt et al., 2016). Une activité de la granulysine et de la perforine a été
décrite concernant une grande variété de bactéries tant gram positives que gram négatives,
intracellulaires qu’extracellulaires telles que Salmonella typhimurium, Bacillus anthracis, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus ou encore Mycobacterium tuberculosis
(Endsley et al., 2009; Ernst et al., 2000; Schmidt et al., 2016). En plus de ces deux molécules, on
note également la production de peptides antibactériens par les cellules NK tels que l’alpha-
défensine et la cathélicidine bien que leurs rôles restent encore faiblement compris (Agerberth et al.,
2000). Il est également supputé une influence des récepteurs de mort cellulaire dans la lutte
antibactérienne directe. En effet le LPS et Listeria monocytogenes sont en mesure d’activer les
récepteur FasL des cellules NK (Schmidt et al., 2016). Il a également été démontré que les cellules
NK étaient en mesure de tuer directement la bactérie Pseudomonas aeruginosa par le biais d’une
effraction membranaire et de l’action des granzymes (Feehan et al., 2022). Une équipe a démontré
que le récepteur KIR2DS4 était en mesure de reconnaître un peptide bactérien présenté par l’HLA-
C dont l’épitope d’intérêt est commun à de nombreuses bactéries (dont Helicobacter pylori,
Campylobacter jejuni et Chlamydia trachomatis) (Bryceson et al., 2006). Ainsi il apparaît que le la
famille des KIRs, en plus de ses autres rôles, est impliquée dans la défense antibactérienne
(Theresine et al., 2020).

Une propriété antibactérienne notable est constatée chez les cellules NK déciduales
humaines. Il a de fait été démontré que ces dernières étaient en mesure de transférer sélectivement
et uniquement de la granulysine au sein des trophoblastes fœtaux infectés par Listeria
monocytogenes par le biais de nanotubes dont le mécanisme de mise en place reste encore inconnu
à ce jour, détruisant alors les bactéries sans lyser la cellules infectée (Figure 12). De plus, des souris
transgéniques exprimant de la granulysine et infectées par L. monocytogenes détenaient une charge
bactérienne plus faible et un taux d’avortement moindre par rapport au groupe témoin (Crespo et
al., 2020).

Page 34
Figure 12 : Résumé du transfert de granulysine aux trophoblastes infectés par L. monocytogenes par
les cellules NK déciduales humaines (d’après Crespo et al., 2020).

Les cellules NK détiennent comme précisé ci-dessus une activité antibactérienne indirecte.
Une fois activées les cellules NK sécrètent une large palette de cytokines et de chimiokines (Souza-
Fonseca-Guimaraes et al., 2012). Par exemple la production d’IFNγ stimule la migration,
l’adhérence, la phagocytose et l’activité de destruction oxydative des neutrophiles et des
macrophages (Schmidt et al., 2016).

Page 35
Figure 13 : Interactions et mécanismes d’action des cellules NK dans le cadre de l’immunité
antibactérienne (d’après Schmidt et al., 2016).

Un manque de littérature sur ce sujet est à signaler chez le chien.

c. Les cellules NK et les maladies fongiques

Certains champignons sont susceptibles d’être tués directement par les cellules NK (Moretta et al.,
2001). Diverses études ont en effet démontré que les cellules NK humaines et murines démontraient
une activité anti-fongique in vitro contre divers pathogènes tels qu’Aspergillus fumigatus, Aspergillus
niger, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus oryzae,
Lichthemia ramosa ou encore Absidia corymbifera (Figure 14)(Schmidt et al., 2017).
Il a été montré que les récepteurs et les voies de signalisation dans la destruction de
champignons de la famille Cryptococcus différaient de ceux utilisés pour la destruction de cellules
tumorales (Jones et al., 2009; Xiang et al., 2016). Contrairement aux processus tumoraux où de
nombreux récepteurs sont impliqués, seuls deux récepteurs activateurs, NKp30 et NKp46 sont
identifiés dans la lutte anti-fongique (Ogbomo et Mody, 2017). En effet le récepteur NKp30 est en
mesure de reconnaître directement et d’induire la destruction de Cryptococcus neoformans et
Cryptococcus albicans (Li et al., 2013), tandis que le NKp46 réalise les mêmes actions vis-à-vis de
Candida glabrata (Vitenshtein et al., 2016). Par ailleurs, de multiples champignons expriment de
multiples PAMPs dont des adhésines, et à titre d’illustration le NKp46 reconnait les adhésines Epa
1, 6 et 7 exprimées par C. glabrata. D’autres travaux sont nécessaires pour mettre en évidence
d’éventuels autres récepteurs activateurs et établir si une synergie activatrice est nécessaire à la

Page 36
reconnaissance et à la cytotoxicité dirigée contre les champignons (Ogbomo et Mody, 2017). Par
ailleurs, dans le cadre de l’immunité anti-fongique médiée par les cellules NK, il n’est pas reporté
d’utilisation du granzyme B. Les cellules NK sécrètent en revanche de la perforine pour lyser
directement C. neoformans et C. albicans (Longhi et al., 2012; Voigt et al., 2014), de la granulysine
pour tuer directement Paracoccidioides brasilensis (Bouzani et al., 2011), ou encore de l’IFNγ pour
endommager Aspergillus fumigatus. Le mécanisme précis autour des voies de signalisation de la
sécrétion de granules cytotoxiques est en cours d’élucidation (Ogbomo et Mody, 2017).
Les cellules NK sont également en mesure de médier une élimination indirecte des
champignons. En effet il a été montré que leur sécrétion d’IFNγ pouvait faciliter une phagocytose de
C. albicans par des macrophages spléniques, ou encore que leur sécrétion de GM-CSF promouvait
la phagocytose neutrophilique de ce même agent pathogène (Lehrnbecher et Schmidt, 2019).

Figure 14 : Interactions entre les cellules NK et les pathogènes fongiques (d’après Schmidt et al., 2017).
Les flèches vertes indiquent une activation ou une stimulation, tandis que les flèches rouges indiquent une
inhibition ou un endommagement.

Un manque de littérature concernant l’implication des cellules NK dans la réponse anti-fongique est
à souligner chez le chien.

Page 37
 d. Les cellules NK et les maladies parasitaires
Une activité anti-parasitaire est également attribuée aux cellules NK, notamment de par leur
production d’IFNγ (Lieke et al., 2004) bien que moins bien étayée que pour d’autres de ses fonctions.
Il a par exemple été démontré chez la souris que les cellules NK participaient directement à la phase
précoce de la réponse contre Trypanosoma cruzi en tuant directement les parasites libres au travers
d’un exocytose de granules lytiques après contact avec la pathogène dans un mécanisme
dépendant de l’IL-12 produit entre autres par les macrophages infectés, bien que la lutte contre ce
parasite soit principalement dépendante des lymphocytes T (Lieke et al., 2004). Ainsi la déplétion
en cellules NK dans un modèle murin lors d’infection par T. cruzi aboutit à une parasitémie élevée
en phase aigüe (Cardillo et al., 1996, p. 10), bien que cette déplétion n’empêche pas la mise en
place par la suite d’une forte et efficace réponse Th1 (Lieke et al., 2004). Il a également été établi
chez l’Homme, que les IgG isolées d’adultes vivant en région endémique de malaria (P. Falciparum)
étaient en mesure d’activer les cellules NK d’individus naïfs par le biais de l’ADCC, permettant alors
une lyse sélective des globules rouges (GR) infectés in vitro (Arora et al., 2018). D’autres travaux
concernant ce pathogène ont mis en évidence une contribution directe des cellules NK contre la
parasitémie via leur sécrétion d’IFNγ et leur action cytotoxique (« naturelle » et médiée par l’ADCC)
contre les hépatocytes et les GR infectés (Burrack et al., 2019)(Figure 15). Il est cependant
nécessaire de confirmer voire reproduire ces études pour aboutir à un niveau de preuves
convaincant (Wolf et al., 2017).

Figure 15 : Cellule NK humaine de la lignée NK92 conjuguée à des érythrocytes infectés par P.
falciparum en microscopie confocale (d’après Baratin et al., 2007). La conjugaison a lieu spécifiquement
avec les érythrocytes infectés.

Des travaux chez la souris suggèrent un rôle protecteur tissulaire inattendu dans la cadre
d’infection par des parasites helminthiques (Heligmosomoides polygyrus bakeri). La phase précoce
de l’infection se traduisait par une accumulation dans l’intestin de cellules NK en provenance de la
circulation sanguine par le biais des récepteurs à l’IFNγ où elles encerclaient les larves. Une telle
augmentation n’a pas été retrouvée chez les autres ILCs dans ce cadre. Des expériences de
déplétion n’ont pas mis en évidence de différences majeures du point de vue parasitaire quantitatif
mais ont abouti à de plus importantes lésions vasculaires. Ces résultats suggèrent que les cellules

Page 38
NK médient une protection tissulaire lors de certaines infections parasitaires par le biais d’un
mécanisme encore inconnu (Gentile et al., 2020).
Un manque de données concernant l’implication des cellules NK dans la réponse anti-parasitaire
est par ailleurs à souligner chez le chien.

B. Les cellules NK et les maladies auto-immunes

Les maladies auto-immunes sont causées par une réponse inappropriée envers des auto-antigènes
entrainant une grande variété de lésions et de symptômes. Ces affections peuvent être spécifiques
d’organes ou au contraire systémiques, et résultent souvent d’une intrication complexe avec des
facteurs génétiques et environnementaux. Si les lymphocytes T auto-réactifs et les lymphocytes B
producteurs d’auto-anticorps sont des acteurs majeurs des maladies auto-immunes, les ILCs, dont
les cellules NK, sont retrouvées dans les tissus inflammés et prennent part à l’initiation et/ou à
l’évolution de ces pathologies (Yang et al., 2021). La contribution de ces dernières dans les troubles
auto-immuns questionne depuis des décennies et des travaux ont mis en évidence des rôles dans
l’initiation, la progression voire la résolution de ces troubles de par leur cytotoxicité et leur production
cytokinique (Kucuksezer et al., 2021; M. Liu et al., 2021). Il est aussi fait état dans certaines
affections de la présence de spécificités génétiques aboutissant à la formation de molécules pouvant
jouer un rôle de ligands pour les récepteurs des cellules NK et ainsi affecter leur fonction (Harvey et
al., 2009). Des dysfonctions des propriétés régulatrices des cellules NK pourraient également aboutir
à une réponse T non contrôlée et ainsi participer à la pathogénèse de certaines maladies
(Kucuksezer et al., 2021). En effet certains travaux suggèrent un rôle protecteur dans certaines
maladies qui impliquerait une destruction directe des cellules dendritiques immatures et de
lymphocytes auto-réactifs ou encore une sécrétion d’IL-10 qui bloquerait alors l’activation et les
fonctions effectrices de ces derniers (M. Liu et al., 2021). La Figure 16 résume cette ambivalence. Il
subsiste en effet de nombreuses zones d’ombre quant à la fonction précise des cellules NK dans
les maladies auto-immunes, en partie en raison d’une littérature parfois contradictoire et par les
suggestions de fonctions des cellules NK variables selon l’avancement de la maladie (M. Liu et al.,
2021). Ainsi comprendre le rôle précis de ces cellules dans l’initiation, la progression voire la
résolution de ces maladies constitue un enjeu de compréhension et thérapeutique majeurs (M. Liu
et al., 2021).

Page 39
Figure 16 : Résumé du rôle des cellules NK dans les maladies auto-immunes chez l’Homme (d’après
M. Liu et al., 2021).

Comme développé ci-dessus, dans la grande majorité des cas leur rôle précis reste encore
à élucider chez l’Homme. A notre connaissance une littérature encore plus pauvre est présente chez
le chien. Seules quelques-unes des maladie auto-immunes (suspectées ou avérées) pour lesquelles
les cellules NK ont un rôle avéré ou suspecté sont traitées dans les sections à venir. Une grande
majorité d’entre-elles (maladie de Behçet, sclérose en plaque, sclérose multiple, polyarthrite
rhumatoïde, psoriasis, lupus érythémateux systémique, diabète de type I, Parkinson (Harvey et al.,
2009; Kucuksezer et al., 2021; Qi et Liu, 2023; Yang et al., 2021)) ont été écartées selon des critères
de niveau de preuve et de concision.

a. Dermatite atopique
La dermatite atopique (DA) représente une des pathologies inflammatoires non infectieuses de la
peau les plus communes au monde (Kabashima et Weidinger, 2020; Sroka-Tomaszewska et
Trzeciak, 2021). Il s’agit d’une affection chronique et récurrente dont les principaux symptômes sont
du prurit, de l’érythème, des papules, des lésions exsudatives et de la xérose cutanée pouvant
aboutir au long cours à de la lichénification. Du point de vue de la pathogénie, la maladie est
caractérisée chez l’Homme par une production élevée de cytokines au travers des lymphocytes Th2
(IL 4, 5 et 13)(Min et al., 2022) mais il est également à noter l’influence récemment mise en évidence
de basophiles ou encore d’ILC2s. On retrouve de fait une infiltration dermique d’ILC2s chez les
patients atteints de dermatite atopique, où ces derniers sécrètent des cytokines pro-allergiques
(Mack et al., 2020; Sroka-Tomaszewska et Trzeciak, 2021). Si plusieurs études ont mis en évidence
de multiples anomalies dans les populations de cellules NK systémiques de patients atteints de DA,
leur nature précise et leur implication dans la maladie restent à élucider (Mack et al., 2020). Il a été
mis en évidence une diminution quantitative des cellules NK CD56dim périphériques sanguines chez
les patients atteints de cette affection et une augmentation de leur expression de gènes d’apoptose
(Mack et al., 2020). De plus, on retrouve dans la peau lésionnelle comme non lésionnelle des

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patients, une forte dérégulation des marqueurs des cellules NK avec notamment un déséquilibre
d’expression des récepteurs inhibiteurs et activateurs (Möbus et al., 2021). Une autre étude
mentionne quant à elle une accumulation de cellules NK dysfonctionnelles caractérisées par le
marqueur NKG2Dlow et associés une dysfonction de la barrière cutanée chez l’enfant (Ochayon et
al., 2023). L’hypothèse de ligands solubles au NKG2D induits par les allergènes pourraient expliquer
cette dérégulation (Ochayon et al., 2023).
Il a été démontré chez la souris qu’une diminution du taux quantitatif de cellules NK était
associée à une exacerbation de la réponse pathogène des cellules ILC2s, suggérant ainsi un rôle
régulateur de ces cellules lors de dermatite atopique (Mack et al., 2020) (Figure 17). Cette hypothèse
est appuyée par une étude qui a démontré in vitro une inhibition de la prolifération d’ILC2s et des
cytokines associées par les cellules NK par le biais de l’IFNα ou encore de l’acide polyinosinique-
polycytidylique (un agent activateur des cellules NK). Il a résulté de ces découvertes la mise en
évidence d’une régulation négative des ILC2s par les cellules NK lors d’inflammation pulmonaire
débutante (Bi et al., 2017). De plus une étude a montré chez des souris chez lesquelles ont été
induite une DA, qu’une population de cellules NK de sous-type CD1dhighPD-L1highCD27+ et
produisant du TGFβ, était quantitativement moindre dans le sang, la rate et les nœuds lymphatiques
de ces souris, mais augmentée dans les tissus auriculaires. Une transfusion de ces cellules a résulté
en une chute significative du nombre d’ILC2s et de lymphocytes Th2. Le ratio Treg/Th2 était
augmenté, suggérant un lien chez l’homme entre l’état fonctionnel de la sous-population de cellules
NK sécrétant de larges quantités de TGFβ et la sévérité de l’affection (Min et al., 2022). Ainsi, il est
donc envisagé que la déplétion systémique en cellules NK retrouvée chez les patients atteints de
DA contribue à l’inflammation et aux lésions cutanées retrouvées dans cette maladie. Enfin la
restauration observée du nombre de cellules NK à la suite du blocage des cytokines produites par
les ILC2s, suggère que la réduction initialement observée pourrait être imputable à l’inflammation
allergique médiée, créant ainsi un cercle vicieux (Mack et al., 2020). Ces résultats suggèrent qu’une
diminution quantitative des cellules NK et de leurs fonctions pourrait constituer un facteur de risque
prédisposant à l’apparition de DA chez l’Homme et que la restauration de ce déficit pourrait
présenter un intérêt thérapeutique, comme cela a été démontré lors d’administration d’IL15 dans un
modèle murin (Mack et al., 2020; Möbus et al., 2021).
Si la dermatite atopique est également décrite chez le chien, seule une étude fait mention
d’expressions augmentées de 13 gènes associés à la mort cellulaire induite par activation (AICD)
chez les cellules NK de chiens atteints de DA (Kuendee et al., 2021).

Page 41
Figure 17 : Schéma de l’axe inhibiteur des cellules NK humaines sur les ILC2s tel que proposé par
Mack et al (d’après Kabashima et Weidinger, 2020).

b. Affections hépatiques :
 Généralités
Le foie est enrichi en cellules NK qui présentent des caractéristiques morphologiques et
fonctionnelles différentes des cellules NK périphériques. Le mécanisme derrière cette
recrudescence et ces singularités reste inconnu, mais l’influence de chimiokines produites par le foie
est suspectée dans le recrutement des cellules NK (M. Liu et al., 2021 ; Maghazachi, 2010), en plus
d’une interaction entre les différentes populations cellulaires au sein de cet organe (Tian et al., 2013).
On distingue chez l’Homme trois maladies auto-immune du foie principales : la cholangite primaire
(PBC), la cholangite sclérosante primitive (PSC), et l’hépatite auto-immune (AIH) (Highton et al.,
2021; M. Liu et al., 2021). Ces trois entités, bien que partageant des aspects pathogéniques
communs, se traduisent par des atteintes hépatiques distinctes (Xiao et al., 2018).

 La cholangite primaire
Dans le cadre de la PBC, les lésions infligées aux voies biliaires peuvent mener à une cirrhose de
ces voies ainsi qu’à une destruction des espaces portes (M. Liu et al., 2021). Un des mécanismes
intervenant dans la pathogénèse de l’affection repose sur l’expansion de cellules NK aberrantes
capables de détruire les cholangiocytes autologues (Gershwin et al., 2000; Mikulak et al., 2019). Il
a été démontré que lors d’un ratio cellules NK/cellules épithéliales biliaires (BECs) haut, les cellules
NK attaquaient les BECs, induisant alors le relargage d’autoantigènes pouvant activer les
lymphocytes T auto-réactifs en présence de cellules présentatrices d’antigènes. D’autre part, lors
d’un ratio NK/BECs faible, les cellules NK n’attaquaient pas les BEC mais sécrétaient d’importantes

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quantités d’IFNγ, induisant l’expression d’HLA de classe I et II sur les BECs, les protégeant alors
d’une cytolyse lors d’exposition à des cellules NK auto-réactives (Shimoda et al., 2015).

 La cholangite sclérosante primitive

Dans le cadre de la cholangite sclérosante primitive (CSP), les canaux hépatiques sont ciblés,
aboutissant alors à une obstruction de l’arbre biliaire, une cirrhose voire une hypertension portale
(M. Liu et al., 2021). Des trois affections traitées dans cette partie le CSP est celle dont la
pathogénèse est la moins bien décrite (Mikulak et al., 2019), bien qu’une influence péjorative des
cellules NK, directe ou non, soit suspectée. En effet des recherches ont montré que l’expression de
ligands du KIR était significativement réduite chez les patients atteints de CSP tandis que celle de
ligands activateurs était surexprimée (M. Liu et al., 2021).

 L’hépatite auto-immune
Il s’agit d’une inflammation chronique du parenchyme hépatique par une réponse auto-immune
dirigée contre les hépatocytes et dont l’étiologie précise n’est pas encore pleinement élucidée bien
qu’un rôle prépondérant des lymphocytes T CD4+ et CD8+ (Xiao et al., 2018), ainsi qu’un rôle trouble
des cellules NK, ait été rapporté (M. Liu et al., 2021). Une étude a mis en évidence qu’une diminution
du taux de cellules NK périphériques CD56dim était négativement corrélée à l’évolution de la
maladie chez les patients atteints d’AIH (M. Liu et al., 2021). L’administration in vivo d’acide
polyinosinique-polycytidylique (molécule possédant une activité de stimulation immune pléiotrope
(Kunzmann et al., 2004)) chez des souris, a induit une hépatite auto-immune au sein de laquelle les
cellules NK hépatiques avaient activement contribué aux lésions tissulaires (Strassburg et al., 2000).

c. Maladie d’Alzheimer/Dysfonctionnement cognitif canin

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie dégénérative retrouvée chez l’Homme et caractérisée
par une inflammation chronique du tissu nerveux associée à une mort neuronale sélective médiée
en partie par une dérégulation des cellules gliales dont le mécanisme précis présente actuellement
des zones d’ombres (Jadidi-Niaragh et al., 2012; Zhang et al., 2020). Si l’étiologie précise reste en
effet encore à déterminer, l’influence de facteurs environnementaux et génétiques est aujourd’hui
fortement suspectée (Jadidi-Niaragh et al., 2012). Il a été de plus été mis en évidence une implication
de cellules non gliales dans la pathogénèse de la MA, et plus particulièrement de cellules du système
immunitaire. En effet l’implication des granulocytes neutrophiles dans le déclin cognitif lors de MA a
été mis en évidence dans un modèle murin. A contrario, d’autres travaux prêtent aux ILC2s des
propriétés de soulagement du déclin cognitif associé à l’âge en dépit de modalités précises encore
obscures (Zhang et al., 2020).
Une implication des cellules NK vis-à-vis de l’inflammation tissulaire et des fonctions
cognitives a été mise en évidence dans un modèle murin. En effet chez ces souris, la déplétion en
cellules NK a mené à une diminution de l’inflammation tissulaire, une stimulation de la neurogénèse
et une amélioration des fonctions cognitives sans modification pour autant de la concentration en
amyloïde-β ni de la capacité phagocytaire des microglies par rapport à cette dernière (Zhang et al.,

Page 43
2020). Par ailleurs les cellules NK retrouvées dans le tissu nerveux intracrânien se caractérisaient
par une faible production de TNF et de cytokines avec un profil cytotoxique et une hyper-activation.
Cette dernière pourrait s’expliquer par la présence d’un micro-environnement inflammatoire propice
à l’activation avec notamment une expression accrue d’IL 18 (chez l’Homme comme chez la souris)
ou encore la fixation directe d’oligomères d’amyloïde-β sur les TLR de ces lymphocytes (Zhang et
al., 2020). A contrario, d’autres recherches chez des souris mutantes pour les protéines APP/PS1
ont établi que l’apport de cellules NK spléniques était associé par la suite à une réduction des dépôts
d’amyloïde-β dans le cortex et le gyrus dentelé de ces souris ainsi qu’à une amélioration des
fonctions cognitives de ces dernières. Un séquençage ADN a mis évidence une régulation négative
des gênes associés à l’homéostasie et la maladie des microglies par la suite, suggérant alors l’intérêt
thérapeutique des cellules NK dans cette affection (Hwang et al., 2022).
Chez l’Homme, ont été mis en évidence une quantité ainsi qu’une activité cytotoxique réduite
dans le sang de patients atteints de la maladie par rapports aux individus sains (Qi et al., 2022). Une
autre étude fait elle, mention d’une augmentation de l’expression du CD16 chez les cellules NK
périphériques (Qi et Liu, 2023). Les travaux de l’équipe de Qi et al. (2023) ont mis en évidence la
présence d’une sous-population spécifique de cellules NK1 (Tableau 2) exprimant de nombreux
facteurs de transcription (tels que TBX21, NFATC2 and SMAD3) et négativement corrélée au déclin
cognitif lié à la maladie d’Alzheimer (Qi et al., 2022) (Tableau 2).

Tableau 2 : Classification des cellules NK sanguines chez les patients atteints de MA (d’après Qi et al.,
2022). Les 10 gènes les plus fréquemment exprimés sont retrouvés dans la partie « top 10 ». Les protéines
sécrétées sont en bleu, les éléments membranaires sont en rouge et les facteurs de transcription sont en vert.

d. Myasthenia gravis

La myasthenia gravis représente une des maladies neuromusculaires les plus communes
chez le chien, caractérisée par la présence d’auto-anticorps produits par les lymphocytes B, fixés
par le complément et dirigés contre les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine. L’étiologie est
également commune, entre autres, à l’Homme et aux rongeurs (Ge et al., 2023). Plusieurs formes
sont décrites chez le chien, incluant une forme localisée intéressant les muscles de l’œsophage
et/ou de la sphère oro-pharyngée ou encore une atteinte systémique de multiples muscles striés,
voire les deux formes combinées (Forgash et al., 2021).

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 Une étude a établi chez l’Homme que les patients atteints de myasthenia gravis avec des
épisodes aigus détenaient un nombre réduit de cellules NK circulantes totales, et plus
particulièrement celles de phénotype CD56dim ainsi que celles produisant de l’IFNγ (Ge et al.,
2023). Ce postulat n’est en revanche pas retrouvé dans une autre étude qui mettait en évidence une
expression moindre de NKG2D chez les cellules NK périphériques des patients atteints de
myasthenia gravis (Liu et al., 2021), tandis que les cellules NK CXCR5+ étaient significativement
augmentées en quantité. Ces dernières exprimaient de plus grandes quantités d’ICOS (récepteur
médiant entre autres la libération d’anticorps par les lymphocytes B) et de PD-1, et produisaient
moins d’IFNγ que les cellules NK CXCR5-. Par ailleurs le nombre de cellules NK CXCR5+ était
positivement corrélé à la quantité de lymphocytes T folliculaires helper (Tfh) et le taux d’anticorps
dirigés contre les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine circulants. L’équipe de Liu et al. (2021) a
mis en évidence un défaut de suppression des lymphocytes T autologues et des Tfh par les cellules
NK, et une activation et différentiation augmentée des Tfh par le biais de ces mêmes cellules. De
plus dans l’étude de Ge et al. (2023) les cellules NK CXCR5- inhibaient la différentiation des
plasmablastes, tandis que les cellules NK CXCR5+ promouvaient plus efficacement la prolifération
des lymphocytes B. Il a ainsi été suspecté l’influence des cellules NK CXCR5+ dans la pathogénèse
de la myasthenia gravis et la possibilité qu’il s’agisse d’un nouveau type de lymphocyte folliculaire
helper (Ge et al., 2023).

C. Implications dans le processus de rejet de greffe

La greffe d’organes solides représente l’option thérapeutique de choix pour beaucoup d’organes en
stade d’insuffisance terminale. En dépit d’améliorations notables des taux de rejet aigu des greffes
au fil du temps par le biais des soins apportés aux patients, de l’immunodépression induite ou de la
sensibilité diagnostique, ces différentes méthodes ne permettent pas d’amélioration franche de la
survie de la greffe à long terme (O’Neill et Hidalgo, 2021). Le rejet d’allogreffes représente une des
complications majeures lors de transplantations d’organe solides (López-Botet et al., 2017). S’il a
longtemps été admis que les cellules NK n’avaient pas de contribution particulière dans la phase de
rejet aigüe (Benichou et al., 2011), différentes études ont récemment remis ce postulat en question
(Benichou et al., 2011; López-Botet et al., 2017) avec la mise en évidence d’une activation de
cellules NK peu de temps après une transplantation allogénique (a contrario des transplantations
autogéniques) pouvant ainsi contribuer à l’allo-réponse à médiation cellulaire et au processus de
rejet aigu (Benichou et al., 2011).
Il est démontré au travers de biopsies rénales et de modèles expérimentaux que les cellules
NK contribuent au rejet de greffe médié par les anticorps (ABMR) chronique (López-Botet et al.,
2017). Les anticorps anti-HLA du donneur (DSA) crées par le système immunitaire de l’hôte, en plus
d’activer le système du complément, peuvent déclencher les cellules NK qui au travers du CD16
enclenchent la production de cytokines et l’activation d’ADCC (López-Botet et al., 2017) (Figure 18).
L’engagement des cellules NK médiées par le DSA lié aux cibles endothéliales initie alors une
cascade pro-inflammatoire aboutissant à un recrutement d’autres cellules NK ainsi que de
monocytes (O’Neill et Hidalgo, 2021). Il en résulte de fait une micro vascularite de la greffe
caractéristique des ABMR (O’Neill et Hidalgo, 2021). De plus un nombre élevé de cellules CD56+ a
été observé dans les lésions de greffe des patients souffrant d’ABMR (López-Botet et al., 2017). Des
dérégulations du CD16 et l’expression de marqueurs d’activation ont été observées dans les cellules
NK circulantes de patient ayant subi une greffe rénale.

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 Il est également à noter que l’absence de reconnaissance du « soi » par les cellules NK
provoque également une micro-vascularite indépendante cette fois-ci du mécanisme induit par les
anticorps. Cela présuppose en revanche une activation conjointe des récepteurs activateurs au
travers des potentiels ligands fournis par la greffe. Il est estimé qu’un mésappariement entre le KIR
du donneur et le ligand de la greffe est présent dans 50 à 75% des cas de transplantations rénales
non identiques du point de vue de l’HLA. Il existe à l’heure actuelle un désaccord sur l’influence de
ce mésappariement sur un éventuel rejet à court terme de greffes rénales (López-Botet et al., 2017).
Par ailleurs les cellules NK influencent la maturation des cellules dendritiques et par conséquent
l’activation de lymphocytes T, d’autant que des biopsies rénales de transplantation rénales rejetées
chez l’Homme ont mis en évidence une augmentation du nombre absolu de cellules CD56bright
(Kildey et al., 2019). De plus elles produisent de façon précoce de l’IFNγ qui module une réponse
de type Th1 (Pontrelli et al., 2020). Enfin les interactions avec les lymphocytes T CD4+ augmente la
réactivité de cellules NK, aboutissant potentiellement à des mécanismes de rejets aigus de greffe
(Ito et al., 2008; Kildey et al., 2019; Pontrelli et al., 2020).

Figure 18 : Mécanismes d’alloréactivité des cellules NK dans la cadre de greffe d’organe solide
(d'après López-Botet et al., 2017). (A) Les cellules NK déficientes en KIR inhibiteur (iKIR) spécifiques de la
classe d’HLA du donneur peuvent potentiellement médier une production cytokinique et une cytotoxicité
dirigée contre l’allogreffe. L’alloréactivité des cellules NK est favorisée par des conditions cellulaires
stressantes (comme des stimuli pro-inflammatoires) induisant l’expression par la greffe de ligands pour les
récepteurs activateurs des lymphocytes NK (NKR). (B) : Les allo-anticorps spécifiques du donneur (DSA)
déclenchent l’ADCC et une production cytokinique contre l’allogreffe, surpassant le potentiel contrôle par l’iKIR
(gauche) et un mésappariement entre le KIR et son ligand amplifie cette réponse (à droite).

En dépit de leur rôle dans le rejet d’allogreffes, les cellules NK sont également en mesure de
promouvoir la tolérance envers ces mêmes greffes (Beilke et al., 2005). Il a par exemple été
démontré chez des souris ayant subi une greffe de peau que les cellules NK du donneur induisaient
une tolérance au greffon en tuant les cellules présentatrices d’antigène allogéniques (Pontrelli et al.,
2020). De plus un lien entre la tolérance de greffe et la production d’IL10 est mis en cause. Sous
stimulation par des glycolipides, les cellules NK produisent de grandes quantités d’IL10 qui promeut
le développement de cellules dendritiques régulatrices (Figure 19)(Kojo et al., 2005). Aussi dans
une étude, les souris tolérantes aux greffes détenaient d’importants taux d’IL10 (Pontrelli et al.,

Page 46
2020). Par ailleurs, dans une autre étude, les cellules NK de patients connaissant une tolérance
spontanée à des greffons rénaux se caractérisaient par un profil transcriptionnel particulier. Il a été
montré que les cellules NK des patients connaissant une tolérance spontanée, présentaient un profil
activateur réduit avec une expression moindre des gènes codant pour KIR2DS5 , NKp46, and CD16,
avec par conséquent une réduction des fonctions effectrices de ces cellules (Dugast et al., 2017;
Lozano et al., 2011; Pontrelli et al., 2020). Il est aussi suspecté qu’une certaine sous population de
cellules NK caractérisée par un phénotype NKG2Cbright joue un rôle compensatoire de défense
contre le cytomégalovirus humain (HCMV) dans le cadre de transplantation rénale chez des patients
infectés, compensant alors les effets de l’immunosuppression sur les lymphocytes T (López-Botet
et al., 2017). Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un herpesvirus responsable d’infections à vie
très fréquentes chez l’Homme, en général asymptomatiques chez les individus immunocompétents.
Le virus a la capacité d’entrer en latence, se réactivant de manière occasionnelle, permettant alors
une transmission par le biais des sécrétions de l’organisme (López-Botet et al., 2017). L’infection
par ce virus constitue un facteur de risque de vasculopathie associée à une insuffisance chronique
de la greffe dans le cadre de transplantations cardiaques ou rénales, et est directement associée au
taux de rejet de greffe et à un temps de survie réduit (Sagedal et al., 2004; Tong et al., 2002).

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Figure 19 : Les multiples rôles des cellules NK dans la transplantation rénale (d’après Pontrelli et al.,
2020). (A) Rejet de la greffe. Les cellules NK CD56dim/CD16+ peuvent favoriser la cytotoxicité dépendante
des anticorps (ADCC) contre la greffe en interagissant avec les DSA liés aux cellules endothéliales de la
greffe, entraînant ainsi un rejet médié par les anticorps (ABMR). En revanche, les cellules NK CD56bright
peuvent jouer un rôle spécifique dans le rejet médié par les lymphocytes T (TCMR) par la sécrétion de
molécules pro-inflammatoires telles que l'IFNγ. (B) Tolérance à la greffe. Les cellules NK activées peuvent
directement tuer les cellules dendritiques d'origine donneuse, favorisant ainsi la tolérance à la greffe. Dans les
modèles murins de tolérance, les cellules NK peuvent également produire des niveaux élevés d'IL10, montrant
ainsi une capacité tolérogène. Les cellules NK et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) pourraient également
s'influencer mutuellement par un antagonisme réciproque ou par une définition temporaire de leur contribution
à l'induction de la tolérance à la greffe. (C) Immunosuppression. Les médicaments immunosuppresseurs
pourraient moduler le phénotype des cellules NK, qui peuvent conserver leur capacité à répondre à la
stimulation. De plus, l'immunosuppression peut réduire le nombre de cellules NK après une transplantation
rénale. La surveillance du nombre et des fonctions des cellules NK chez les patients transplantés sous des
régimes immunosuppresseurs spécifiques est importante pour contrôler et prédire l'apparition d'infections et
de néoplasies.

Un manque de littérature est à noter chez le chien, bien que l’influence de cellules NK activées
dans la rejet de greffe soit également suspectée (Graves et Storb, 2020). Une étude a mis en
évidence l’incapacité de cellules cytotoxiques CD94+ (marqueur partagé par les lymphocytes NK et
NKT) à promouvoir une tolérance et prévenir d’un rejet de greffe chez des chien recevant des greffes
de moelle osseuse, sur un nombre certes faible d’individus (n=5) (Abrams et al., 2020). Enfin un
essai comparant les effets de l’injection de cellules NK et de PBMCs canines chez des souris, a mis
en évidence de nombreuses lésions tissulaires secondaires à l’injection de PBMCs au sein

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desquelles ces dernières sont retrouvées, tandis qu’une absence de lésions et de signes cliniques
étaient à signaler dans la cadre d’injection de cellules NK seules. L’équipe a conclu que ces résultats
suggèrent que les cellules NK canines ne causent pas d’effets secondaires significatifs lors de greffe
et que des cellules NK allogéniques pourraient être utilisées de façon sécuritaire en vue d’une
immunothérapie tumorale chez le chien (Kim et al., 2022).

D. Les cellules NK et la gestation

La viviparité des mammifères à placenta résulte d’une co-évolution avec le système immunitaire. La
formation du placenta, organe nourricier, implique une coopération entre une population
numériquement étendue et activée de cellules NK maternelles utérines (uNK), et de trophoblastes
fœtaux extra-villeux (EVT) qui modulent l’apport sanguin. En effet on assiste lors de la gestation à
un remodelage des vaisseaux sanguins de l’endomètre externe qui devient alors un tissu différentié
appelé « decidua ». Ce remodelage est bien plus profond chez l’Homme que chez d’autres espèces
(Faas et de Vos, 2017; Parham, 2004). La progestérone est un acteur majeur dans la mise en place
de la decidua et de ses acteurs. Bien que les cellules NK utérines (uNK) soient dépourvues de
récepteurs à la progestérone, des études ont montré que cette dernière induisait la production d’IL15
par les cellules endométriales avec pour conséquence une prolifération et une différenciation des
cellules uNK. Par ailleurs, la fonction de ces cellules peut également être modulée par la
progestérone et les oestrogènes. Les oestrogènes régulent directement la migration des uNK et
induisent la sécrétion par ces dernières de CC motif ligand 2 (CCL2), augmentant ainsi la fonction
angiogénique de ces dernières. En effet le CCL2 est une chimiokine produites par de nombreux
types cellulaires au sein de l’organisme, avec des fonctions variées telles que l’induction
macrophagique, la cicatrisation, la prolifération cellulaire ou encore l’angiogenèse dont le
mécanisme précis reste à élucider (Peng et al., 2023). Il a été rapporté une réaction croisée
significative entre la progestérone et le récepteur aux glucocorticoïdes des cellules NK et il est
suspecté que cette hormone puisse inhiber la production de TNFα par ce biais, menant alors à une
tolérance immune en début de gestation (Zhang et Wei, 2021).
Par ailleurs, chez l’Homme les cellules NK déciduales (dNK), une sous-catégorie de cellules
NK utérines, représentent entre 50 et 90 % des lymphocytes présents dans la decidua (Parham,
2004; Xie et al., 2022). Ces cellules sont caractérisées par une forte expression du CD56 et une
absence d’expression du CD16 (Faas et de Vos, 2017; Parham, 2004) et une étude a mis en
évidence une surexpression d’au moins 278 gènes chez cette sous-population par rapport aux
cellules NK périphériques. Il reste encore à déterminer si ces spécificités sont acquises au sein de
la decidua ou si ces dernières proviennent de rares précurseurs périphériques atypiques (Faas et
de Vos, 2017; Parham, 2004). En dépit de leur production de cytokines et de chimiokines induisant
l’invasion trophoblastique, le remodelage tissulaire (Figure 20), le développement embryonnaire et
la placentation (Zhang et Wei, 2021), la fonction exacte de ces dNK reste encore trouble (Faas et
de Vos, 2017). Il a été démontré que ces cellules étaient douées de cytotoxicité bien que moindre
par rapport aux cellules NK périphériques et non dirigée vers les trophoblastes extravilleux (Faas et
de Vos, 2017). Ces derniers sont par ailleurs les seuls types de trophoblastes à exprimer des
molécules du CMH de classe I, liant les récepteurs des cellules NK, et plus spécifiquement HLA-C
(ligand de la famille des récepteurs KIR), HLA-E (ligand pour le CD94–NKG2A/C) et HLA-G (ligand

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pour le récepteur LILRB1) (Parham, 2004; Sargent et al., 2006). Trois sous-populations de cellules
NK déciduales ont été mises en évidence et sont discriminées selon les marqueurs exprimés. Si
toutes ces cellules expriment les marqueurs CD49A et CD9, seules les dNK1 expriment CD39,
CYP26A1 et B4GALNT1, tandis que ANXA1 définit les dNK2. Les dNK3 expriment CD160, KLRB1
et CD103. Enfin ITGB2 est commun aux deux derniers types cellulaires cités (Vento-Tormo et al.,
2018). Ainsi il est suspecté que les dNK1 apportent un bénéfice lors de la grossesse au travers d’une
modulation immunologique, tandis que les deux autres types pourraient interagir avec les autres
cellules au sein de la decidua par le biais de facteurs tels que XCL-1, ce dernier médiant notamment
l’attraction des cellules dendritiques et des trophoblastes (Shmeleva et Colucci, 2021).
La prééclampsie est un trouble spécifique à l’Homme se caractérisant par un remodelage
incomplet des artères spiralées (Figure 20) intervenant dans la seconde moitié de 5 à 10% des
grossesses et dont l’unique traitement consiste en la délivrance du fœtus (Parham, 2004). Une
étiologie génétique a été mise en évidence avec plus spécifiquement la combinaison KIR maternel
de génotype AA et un HLA de type C2 fœtal. En effet, en raison d’une liaison particulièrement forte
un puissant signal inhibiteur est alors transmis aux cellules NK et à cela s’ajoute l’absence relative
d’expression de récepteurs activateurs pouvant fournir des signaux compensatoires. Ces éléments
convergent vers une pathogénie basée sur une inhibition excessive des cellules NK utérines menant
à un arrêt prématuré du remodelage des vaisseaux sanguins maternels par les trophoblastes villeux,
augmentant alors la probabilité de survenue d’une prééclampsie. Il ne s’agit en revanche pas d’une
association binaire, en effet seule une minorité de grossesses avec des fœtus C2 et des mères AA
mène à une prééclampsie, et toutes les prééclampsies ne sont pas caractérisées par cette
association (Faas et de Vos, 2017; Parham, 2004). Si plusieurs études font état d’une dérégulation
quantitative des cellules uNK dans le cadre de prééclampsie, en faisant une potentielle cible en vue
d’une amélioration thérapeutique, les résultats obtenus sont contradictoires. (Zhang et Wei, 2021).

Figure 20 : Remodelage des artères spiralées par les cellules NK et les trophoblastes extra-villeux
dans divers cas de figure : absence de gestation à gauche, prééclampsie au centre, gestation
physiologique à droite (d’après Parham, 2004).

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 Une étude fait mention des cellules NK canines utérines en post-implantation et ces cellules
ont été retrouvées autour des glandes utérines superficielles mais aussi profondes (Tavares Pereira
et al., 2021). En revanche, on peut supposer que la placentation endothélio-choriale de la chienne
complique un éventuel parallélisme avec la femme.

E. Les cellules NK et le concept de mémoire

Définie par l’habilité à reconnaître rapidement et à répondre plus vigoureusement à un pathogène
préalablement rencontré, la mémoire immunologique fournit une immunité spécifique augmentée et
sur la durée (Gang et al., 2020). En dépit de la catégorisation initiale des cellules NK en tant que
cellules immunitaires innées, plusieurs études ont démontré que ces dernières montraient des
caractéristiques propres aux acteurs de l’immunité adaptative, telles que l’expansion clonale de
cellules effectrices spécifiques d’un antigène et la génération de populations mémoires à longue
survie capables d’une réponse augmentée en cas de représentation de l’antigène (Brillantes et
Beaulieu, 2020). Plusieurs termes sont utilisés pour caractériser ces propriétés. Le terme de
« mémoire » décrit une réponse augmentée ou a minima reprogrammée intrinsèque aux cellules en
question, spécifique d’un antigène et durant dans le temps. Le terme « memory-like/pseudo-
mémoire » caractérise une réponse des cellules NK où un ou plusieurs des critères sus-cités sont
manquants ou non-établis (Brillantes et Beaulieu, 2020). On distingue ainsi chez les cellules NK la
mémoire spécifique d’haptène, la mémoire/pseudo-mémoire spécifique de virus et enfin la « pseudo-
mémoire » induite par les cytokines (Figure 21) (Cerwenka et Lanier, 2016; Gang et al., 2020) dans
un contexte qualifié de « trained immunity » (Brooks et al., 2022). Plusieurs modalités de ce concept
restent encore à élucider, bien que de nombreux espoirs thérapeutiques (dont la vaccination)
reposent dessus (Brillantes et Beaulieu, 2020).

Page 51
Figure 21 : Résumé des différents types de réponse mémoire et « memory-like » des cellules NK
(d’après Gang et al., 2020).

a. La mémoire spécifique d’haptène

Un haptène est une molécule souvent de bas poids moléculaire, qui lorsqu’elle est combinée à une
molécule porteuse peut induire une antigénicité (Brooks et al., 2022). La capacité des cellules NK à
développer une mémoire spécifique d’antigène à initialement été décrite dans le cadre
d’hypersensibilités de contact avec des haptènes chimiques chez des cellules NK hépatiques de
souris. D’autres expérimentations ont montré que cette fonction était dépendante de l’expression de
CXCR6, un récepteur de chimiokines vital à la survie et l’homéostasie des cellules, bien que les
mécanismes précis restent encore à élucider (Gang et al., 2020).

b. L’immunité spécifique de virus

Une réponse mémoire spécifique d’antigène a d’abord été démontrée chez le cytomégalovirus
murin, bien que par la suite une mémoire (ou pseudo-mémoire) ait également été démontrée ou
suspectée concernant divers autres agents pathogènes (Brillantes et Beaulieu, 2020) (Figure 22).

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Ce procédé peut être illustré avec l’exemple suivant du cytomégalovirus humain (HCMV). En effet
une infection par ce virus résulte en une différentiation, prolifération et survie de cellules NK au
phénotype CD94/NKG2C+ (López-Botet et al., 2023). Dans un contexte de transplantation
allogénique de moelle osseuse hématopoïétique, ces mêmes cellules NK CD94/NKG2C+ des
donneurs séropositifs pour le HCMV, se multipliaient sélectivement à la suite d’une réactivation du
HCMV associée à une forte production d’IFNγ, bien qu’à un degré variable selon les individus
(Brillantes et Beaulieu, 2020; Cichocki et al., 2018). Ces cellules NK survivent dans l’organisme dans
le temps et ultérieurement à l’élimination du HCMV circulant (Foley et al., 2012). Il a également été
montré que ces cellules réagissaient à l’UL40 (un peptide du HCMV) lorsque ce dernier est associé
à l’HLA-E (un ligand du NKG2C).

Bien que de nombreux éléments indiquent que l’expansion de ces cellules NKGC2+ résulte
d’un mécanisme spécifique, ce dernier reste encore à élucider (Brillantes et Beaulieu, 2020).

Figure 22 : Schéma récapitulatif des réponses mémoires et « memory-like » des cellules NK envers
différents pathogène (d’après Brillantes et Beaulieu, 2020). Des points d’interrogations sont adressés en
direction des pathogènes eucaryotes pour lesquels des investigations complémentaires sont nécessaires.

c. Pseudo-mémoire induite par les cytokines

Il existe une forme de pseudo-mémoire induite par l’environnement cytokinique (Gang et al., 2020).
Des travaux ont mis en évidence que des cellules murines activées avec une combinaison de
cytokines démontraient par la suite des propriétés de pseudo-mémoire (Cooper et al., 2009b). En
effet des cellules NK soumises à une stimulation cytokinique (IL 12, 15 et 18) ont produit
d’importantes quantités d’IFNγ. Ces mêmes cellules une fois transférées dans des souris
syngéniques étaient entrées en état de repos une semaine après transfert. Après restimulation, ces
dernières exprimaient significativement plus d’IFNγ que les cellules contrôles ou encore que celles
des souris hôtes (Cooper et al., 2009b; Gang et al., 2020). Cette capacité à produire plus d’IFNγ
était indépendante d’une éventuelle prolifération, intrinsèque à ces cellules et a persisté après

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mitose (Cooper et al., 2009a). Cette « pseudo-mémoire » a également été établie chez l’Homme au
travers d’expériences similaires où on note également une importante prolifération après
restimulation (Romee et al., 2012). En termes de potentielles applications de cette découverte, il a
été démontré in vivo chez la souris que les cellules NK activés par les mêmes combinaisons
précédentes détenaient de plus fortes fonctions effectrices contre les processus néoplasiques (Gang
et al., 2020). De même il a été noté des fonctions intéressantes dans le cadre du rejet de greffe chez
la souris (Gang et al., 2020; Hüber et al., 2015).

Un manque de littérature concernant le potentiel de mémoire ou de pseudo-mémoire des cellules

NK est à signaler concernant le chien.

F. Les cellules NK et les processus néoplasiques

a. Implications anti-tumorales des cellules NK

Les cellules NK exercent leur rôle anti-tumoral au travers d’un mode d’action à la fois direct et
indirect. En effet, on note dans ce cadre la libération de granules contenant de la perforine et des
granzymes, couplée à la libération de molécules effectrices comme l’IFNγ, à la liaison de l’activation
de récepteurs de la mort et d’ADCC (Corvino et al., 2022). La Figure 23 résume les différentes
récepteurs et leurs ligands impliqués dans l’immunité anti-tumorale. Il été démontré l’influence de
voies de signalisation activatrices, et plus particulièrement de la voie cGAS–STING mise en
évidence chez la souris. En effet cGAS est une enzyme cytosolique capable de détecter l’ADN qui,
lorsqu’elle rencontre ce dernier dans le cytosol, catalyse la synthèse de cGAS GMP–AMP 2′3′-
cyclique (2′3′-cGAMP) (Ablasser et Chen, 2019). Une fois généré, ce second messager se lie et
active une protéine du réticulum endoplasmique (STING), ce qui, par le biais d’autres cascades
moléculaires, aboutit à la transcription de gènes codant pour des interférons de type I ainsi que pour
diverses cytokines et chimiokines (Figure 24) (Barber, 2015; Wolf et al., 2023). De plus, la libération
de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines enclenche le recrutement et la maturation
d’éléments de la réponse immunitaire adaptative, tels que les lymphocytes T et les cellules
dendritiques (Kisseberth et Lee, 2021; Wolf et al., 2023) (Figure 24). Ainsi de nombreuses études
associent l’infiltration tumorale de cellules NK à un facteur pronostic positif dans de multiples
processus néoplasiques (Nersesian et al., 2021; Wolf et al., 2023), bien que l’inverse ait également
été décrit avec une potentielle influence du phénotype desdites cellules (Corvino et al., 2022).

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Figure 23 : La fonction des cellules NK est régulée par des récepteurs de surface et des cytokines
(d’après Wolf et al., 2023). Les interactions qui activent (en vert) ou inhibent (rouge) la réponse des cellules
NK envers des tumeurs ou d’autres cellules sont représentées. D’autres interactions détiennent une fonction
mixte (en bleu) en fonction du sous-type de récepteur ou du contexte. Certains ligands peuvent lier des
récepteurs tant inhibiteurs qu’activateurs. Les récepteurs SLAM peuvent aboutir à des signaux activateurs ou
inhibiteurs en fonction des protéines adaptatrices exprimées par les cellules NK. Les principaux récepteurs
cytokiniques d’intérêt sont également schématisés. ‘Hu’ indique une caractéristique humaine tandis que ‘m’
indique une caractéristique murine.

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Figure 24 : Influence des cellules NK dans la lutte anti-tumorale et exemple d’une voie de signalisation
(d'après Wolf et al., 2023). (a) L’inhibition des cellules NK par les récepteurs inhibiteurs (KIR, NKG2A)
empêche la destruction de cellules exprimant le CMH I. (b) Les cellules NK sécrètent des chimiokines qui
recrutent des cellules dendritiques (DCs) de type 1 et du ligand de la tyrosine kinase 3 apparentée au Fms
(FLT3L) qui activent ces DCs qui induisent à leur tour des lymphocytes T cytotoxiques tumoraux. (d)
L’endommagement de la séquence d’ADN au sein des cellules tumorales mène à la production de GMP-AMP
par l 'enzyme cGAS qui active la protéine STING au sein de la même cellule ou qui peut être transportée aux
cellules voisines où elle activera STING. Ceci mène à la production d’IFN de type I et de cytokines qui activent
les cellules NK et les DCs.

b. Plasticité

Il a été démontré chez l’Homme que les cellules NK infiltrant certains processus tumoraux détenaient
un phénotype et des propriétés uniques et partageaient un grand nombre de similarités avec des
cellules résidentes de tissus (Corvino et al., 2022). Ainsi plusieurs travaux font état de cellules NK
aux caractéristiques s’apparentant à celles des cellules NK déciduales, de par un phénotype
CD56bright, des capacités pro-inflammatoires et cytolytiques amoindries, et la production de
facteurs pro-angiogéniques. De telles cellules sont retrouvées notamment au sein de carcinomes
pulmonaires à grandes cellules, de carcinomes rénaux, de mélanomes, ou encore
d’adénocarcinomes mammaires (Bosi et al., 2018; Bruno et al., 2013; Guan et al., 2020; Levi et al.,
2015) bien que les conséquences fonctionnelles de leur présence restent encore à explorer. Il est
cependant suspecté une corrélation négative de ce phénotype avec le pronostic du patient en raison
de l’activité pro-angiogénique de ces cellules (Corvino et al., 2022).

En revanche d’autres études ont rapporté l’existence de cellules NK infiltrant les tumeurs,
présentant des similitudes avec les cellules NK résidentes de tissus mais cette fois-ci avec une
fonction antitumorale augmentée. Ces cellules sont qualifiées d’ieILC1-like (ie pour intraépithéliales)
en raison de similarités avec ces dernières qui détiennent par ailleurs un rôle critique dans l’immunité
antitumorale (Dadi et al., 2016). D’autres travaux sont nécessaires à une compréhension exhaustive
de cette plasticité constatée (Corvino et al., 2022).

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 c. Epuisement des cellules NK
L’épuisement immunologique a d’abord été caractérisé et décrit chez les lymphocytes T et
ses principales caractéristiques sont une réduction de la cytotoxicité et de la production cytokinique,
ainsi qu’une régulation à la hausse des récepteurs inhibiteurs (Bi et Tian, 2017; Wherry, 2011). Ce
phénomène mime un rhéostat immunologique visant à limiter les pathologies auto-induites résultant
de réponses immunologiques soutenues. Des travaux empiriques ont décrit des phénotypes chez
les cellules NK s’apparentant à de l’épuisement immunologique. En effet, les cellules NK infiltrant
les tumeurs présentent régulièrement dans divers travaux, une cytotoxicité ainsi qu’une production
de cytokines amoindries (Corvino et al., 2022). De plus il est retrouvé dans plusieurs processus
tumoraux, une surexpression des récepteurs inhibiteurs (et plus spécifiquement TIM1 et PD-1) chez
les cellules NK infiltrant les tumeurs (Bi et Tian, 2017). De même le récepteur inhibiteur NKG2A a
été retrouvé en plus grande quantité à la surface des cellules NK infiltrantes de patients atteints de
carcinome hépatocellulaire comparée à ceux de prélèvements péritumoraux ou du groupe contrôle
sain (Corvino et al., 2022; Sun et al., 2017).

d. Echappement néoplasique
Dans le cadre de tumeurs (et plus particulièrement les tumeurs dites « solides ») sont retrouvés de
nombreux mécanismes de suppression de la réponse immunitaire. On peut citer, entre autres, le
recrutement de lymphocytes T régulateurs, de cellules myéloïdes suppressives ou de macrophages
au sein des tumeurs, l’induction de récepteurs inhibiteurs chez les lymphocytes NK et T, ou encore
la production de cytokines immunosuppressives dont fait partie le TGFβ. (Kisseberth et Lee, 2021).
La surproduction de TGFβ par des phénomènes néoplasiques est fréquente, et réduit l’activité des
cellules NK en inhibant l’expression du NKG2D, du CD16 et la libération de cytokines ainsi que la
synthèse de perforine (Kisseberth et Lee, 2021). La synthèse de ces mécanismes est retrouvée
dans la Figure 25.

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Figure 25 : Mécanismes impliqués dans la dysfonction des cellules NK dans le microenvironnement
tumoral humain (d’après Cózar et al., 2021). Les cellules tumorales peuvent modifier l'environnement
extracellulaire en produisant des cytokines immunosuppressives telles que le TGFβ, qui réduit la fonctionnalité
et l'infiltration des cellules NK. Les cellules tumorales peuvent également affecter la fonction des cellules NK
en favorisant des conditions d'hypoxie, ce qui active la protéine intracellulaire mTOR-DRP1, provoquant la
fragmentation mitochondriale dans la cellule NK. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les
cellules tumorales produisent de la prostaglandine-E2 (PGE2), qui diminue la cytotoxicité des cellules NK. Les
cellules T régulatrices (Treg) peuvent directement supprimer la fonction des cellules NK ou influencer
indirectement l'inhibition des cellules NK en sécrétant de l'IL10 et du TGFβ. Les cellules myeloides
suppressives (MDSC) peuvent inhiber l'ADCC des cellules NK via la sécrétion d'oxyde nitrique (NO). Les
cellules tumorales sécrètent de l'IL6 et de l'IL8 qui altèrent l'activité et la fonction des cellules NK via STAT3,
supprimant l'expression des récepteurs activateurs des cellules NK NKp30 et NKG2D. Dans de nombreux
cancers humains, une diminution de l'expression des récepteurs activateurs NKp46, NKp30, NKG2D, DNAM1
et CD16 a été observée sur les cellules NK, ayant un impact direct négatif sur l'activation des cellules NK et
leur fonction antitumorale. De plus, les cellules tumorales sont en mesure de produire et libérer les ligands de
ces récepteurs activateurs (par exemple, le ligand B7-H6 de NKp30 et les ligands MICA et MICB de NKG2D),
induisant une inhibition des voies de signalisation activatrices. La métalloprotéase ADAM17 exprimée à la
surface des cellules tumorales, en plus de participer à la libération de B7-H6, est également capable d'induire
le clivage du CD16 activateur. Les cellules tumorales peuvent attirer les plaquettes, qui à leur tour favorisent
la libération de NK2GDL et de TGFβ, contribuant à la suppression de la fonction des cellules NK. Les cellules
tumorales peuvent également surexprimer des ligands (par exemple, CD155, PD-L1 et HLA-E) des cellules
NK.

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 e. Le modèle canin au centre de stratégies d’immunothérapie

En raison de leurs propriétés énumérées ci-dessus, les cellules NK se retrouvent au centre de

projets visant à utiliser leur fonction dans un but anti-tumoral. Il est possible de classer ces dernières
en deux catégories : la première regroupant des stratégies d’exacerbation de l’activité anti-tumorale
des cellules NK (notamment au travers d’un apport de cytokines, ou d’anticorps visant à rediriger la
cytotoxicité des cellules NK contre les processus tumoraux) et la seconde regroupe des optiques de
transferts de cellules NK ou de leur dérivés, qu’il s’agisse de cellules non modifiées, génétiquement
modifiées de par la présence de récepteurs d’antigènes chimériques (CAR), ou encore l’emploi de
vésicules extra-cellulaires dérivées des cellules NK (Hu et al., 2019). Dans la partie suivante nous
nous intéresserons exclusivement aux projets impliquant les chiens.
Le chien est étudié dans ce cadre en raison de sa pertinence biologique en termes
d’oncologie comparative. En effet il s’agit de mammifères non consanguins développant
spontanément des processus néoplasiques dans un contexte de système immunitaire inné intact.
Ils démontrent également des affections communes à l’Homme avec par exemple des
ostéosarcomes, des lymphomes, des gliomes ou encore des mélanomes. De fait la présentation,
les mutations génétiques (telles que les translocations de Bcr-Abl, et les mutations conservées des
gènes BRAF and c-kit) et les réponses thérapeutiques des processus néoplasiques canins montrent
de grandes similarités avec celles de l’Homme. Enfin leur statut d’animal de compagnie leur assure
un environnement commun à l’Homme et une espérance de vie augmentée propice à l’apparition
de processus néoplasiques (Gingrich et al., 2019 ; Gingrich et al., 2021).
Au moins chez le chien, une des stratégies répond à une hypothèse dans un cadre anti-
tumoral d’un déficit en cellules de l’immunité innée, du fait d’une réduction du nombre et de la
fonction des cellules NK, entre autres, qui pourrait potentiellement être contré par un ajout exogène
en ces dernières. Cette réduction effectrice et quantitative pourrait s’expliquer en partie par les
différentes stratégies employées lors de processus néoplasiques (anesthésie, radiothérapie,
chimiothérapie) ou encore la sécrétion de TGFβ par certains processus tumoraux comme les
ostéosarcomes, qui peuvent avoir un effet négatif sur ces cellules (Kisseberth et Lee, 2021).
Une des tentatives d’aboutir à une amélioration de la fonction des cellules NK dans un
microenvironnement tumoral hostile, consiste à conférer une résistance relative au TGFβ à ces
dernières en réalisant une exposition chronique à de l’IL2 et du TGFβ lors de la phase
d’accroissement des cellules (Figure 26). Il a été démontré que les cellules NK exposées à ces deux
facteurs précédents, présentaient une sécrétion d’IFNγ et de TNFα significativement plus
importantes que les cellules non exposées en l’absence et en présence de TGFβ. De plus, le premier
groupe détenait une meilleure cytotoxicité et une meilleure résistance au TGFβ que le groupe témoin
dans un contexte d’amputation appendiculaire et de traitement adjuvant avec de la carboplatine. En
revanche, l’influence du donneur, et plus spécifiquement de la race, sur les cellules NK en fin de
protocole reste à établir (Kisseberth et Lee, 2021). Par ailleurs les temps de survie ne figuraient pas
dans l’étude.

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Figure 26 : Projet d’immunothérapie utilisant les cellules NK chez le chien (d’après Kisseberth et Lee,
2021). Des PBMCs sont isolées chez le chien par une séparation sur gradient de Ficoll. Ces cellules subissent
une déplétion en CD5 et sont ensuite co-cultivées et récursivement (3 fois) stimulées en présence d’IL2 (+/-
TGFβ) pendant 3 semaines en compagnie de cellules nourricières K562 exprimant de l’IL21. Les cellules
peuvent être ensuite utilisées directement ou congelées pour un emploi ultérieur.

Des essais combinant radiothérapie et immunothérapie ont également été entrepris chez le
chien, d’abord dans un contexte de xénogreffe chez la souris, puis directement sur un modèle canin.
En effet après des phases d’isolation, d’expansion puis d’activation des cellules NK canines sont
injectées à des souris chez lesquelles des sarcomes canins ont été greffés. Ces derniers, et plus
particulièrement les cellule souches cancéreuses, se sont révélés être sensibles à la cytotoxicité des
cellules NK. Il a ensuite été démontré sur des cellules d’ostéosarcome canin in vitro et in vivo sur le
modèle murin précédemment cité, que les radiations augmentaient la cytotoxicité des cellules NK
canines dans le premier cas, tandis qu’elles augmentaient le recrutement de cellules NK intra-
tumorales dans le second. Ces observations ont mené les auteurs à réaliser un essai in vivo chez
des chiens atteints d’ostéosarcomes locaux sans métastases. Une radiothérapie palliative et des
injections de cellules NK ont ensuite été réalisées. Les chiens de l’étude présentaient par la suite
une survie du paramètre « sans progression » améliorée et une diminution de l’incidence de
métastases (avec une influence quantitative du nombre de cellules injectées) par rapport aux
témoins historiques (Canter et al., 2017).
Une autre équipe (Lee et al., 2021) a quant à elle démontré l’influence d’exosomes de
cellules NK canines activées chez des souris chez lesquelles ont été induit un carcinome mammaire
canin. Un poids tumoral plus faible a été constaté chez le groupe traité avec les exosomes comparé
au groupe témoin, démontrant alors un rôle antitumoral de ces derniers. On retrouvait également
dans le groupe traité une réduction significative de Bmi-1 (une protéine impliquée dans le
renouvellement des cellules souches mammaires), MMP-3 (une protéine impliquée dans la
formation tumorale murine), d’IL1β, d’IL6, de TNFα (des cytokines pro-inflammatoires), de Bax (une

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protéine impliquée dans l’apoptose mitochondriale), et de Bcl-xL (une protéine pro-survie et anti-
apoptotique), ainsi que du CD133 (une protéine transmembranaire impliquée dans la tumorigénèse).
Ont également été retrouvées une expression réduite de PCNA et une discrète augmentation de
l’expression de la protéine p53. Les auteurs ont alors suggéré que ces exosomes exercent leur effet
anti-tumoral en régulant à la baisse les marqueurs associés aux cellules souches cancéreuses et
en augmentant le rôle suppresseur tumoral de la protéine p53 dans ce modèle.

f. Néoplasies des cellules NK

 Chez l’Homme
Les processus néoplasiques des cellules NK ont été réorganisés chez l’Homme en 2022 à l’occasion
de la 5ème édition de la classification des néoplasies hémato-lymphoïdes par l’OMS sur la base d’une
actualisation des connaissances sur ces entités aux caractéristiques souvent troubles en raison de
leur rareté. Ainsi, nous distinguerons dans cette partie la leucémie agressive à cellules NK, la
leucémie à grands lymphocytes NK granuleux, le lymphome extranodal à cellules NK/T (cellules NK
et lymphocytes T ; à différencier des cellules NKT qui sont une seule population cellulaire), le
lymphome nodal à cellules NK/T des individus positifs au virus d’Epstein-Barr (EBV) et enfin les
troubles lymphoprolifératifs indolents du tractus digestif (Alaggio et al., 2022).

□ Le lymphome extranodal à cellules NK/T/ Extranodal (NK/T-cell lymphoma)

Le lymphome extra nodal à cellules NK (ENKTCL) est un processus néoplasique confondu dans le
terme « lymphome extranodal à cellules NK/T » en raison des deux lignées cellulaires qu’il intéresse,
majoritairement focal et qui intéresse préférentiellement la face, bien que de rares cas décrivent une
insuffisance hépatique et médullaire secondaires à une infiltration tumorale. Cette forme est rare
chez l’Homme, touche préférentiellement les hommes d’âge moyen et possède un tropisme
asiatique (3-10% des lymphocytes non Hodgkiniens contre moins de 1 % en occident) (Valli, 2007).
Bien que le détail génétique derrière cette néoplasie reste encore à élucider, il est suspecté une
influence de causes génétiques, infectieuses (EBV) ou encore environnementales (exposition à des
pesticides)(Harabuchi et al., 2019). Les tissus environnants tels que les sinus paranasaux, les
orbites et la peau de la face sont fréquemment infiltrés (lui valant son qualificatif de « nasal-
type »(Alaggio et al., 2022))(Figure 27) et parfois les nœuds lymphatiques et d’autres tissus à
distance tels que le foie, les poumons, le tractus digestif et la moelle osseuse. On peut également
retrouver une ulcération ainsi qu’un granulome nécrotique progressifs des cavités nasales, du palais
et de l’oropharynx. Ainsi, une obstruction nasale, de l’épistaxis, un gonflement de la face, des
douleurs au niveau de la gorge et un enrouement sont des symptômes classiquement retrouvés
dans le cadre de l’ENKTCL. On retrouve également des signes systémiques aspécifiques tels qu’une
fièvre persistante et une perte de poids (Harabuchi et al., 1996 ; Harabuchi et al., 2019). Des
métastases cutanées, entériques et testiculaires sont décrites (Valli, 2007).
L’affection se caractérise par une large variabilité phénotypique et une nécrose extensive,
rendant son diagnostic anatomo-pathologique parfois complexe (Valli, 2007). On retrouve à l’échelle
tissulaire des infiltrations diffuses de cellules lymphomateuses pléomorphes accompagnées de

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cellules inflammatoires dans un contexte de nécrose. Bien qu’encore trouble, un rôle de l’EBV dans
la lymphomatogénèse est établi et il est suspecté une implication de ce virus dans la capacité à
échapper au système immunitaire (Harabuchi et al., 1996 ; Harabuchi et al., 2019). Des cytokines,
chimiokines et mIR possiblement en lien voire produits par les protéines ontegéniques de l’EBV sont
des acteurs majeurs de la progression tumorale dans le cadre de l’ENKTL (Harabuchi et al., 2019)

Figure 27 : Lésions retrouvées lors de lymphome extranodal à cellules NK/T de type nasal (Harabuchi
et al., 2019). (a) Granulomes au sein de la cavité nasale ; (b) Tissu nécrotique au sein de la cavité nasale ; (c)
Ulcération du palais dur ; (d) Granulome nécrotique dans le nasopharynx ; (e,f) Infiltration de la peau.

Le diagnostic repose sur la mise en évidence par immunohistochimie de cellules infiltrantes

exprimant l’EBER1 ou le CD56 (Harabuchi et al., 2019), bien qu’il ait été également rapporté
l’expression variable de CD3, CD4, CD5,CD7, CD30, CD45, ou de TIA-I (Pongpruttipan et al.,
2011).. D’autres méthodes, telles que la mise en évidence d’ADN viral sérique de l’EBV ou encore
de microARN ou d’un taux élevé de PD-L1 sérique peuvent constituer une aide au diagnostic
(Harabuchi et al., 2019). Le volet thérapeutique repose sur une chimiothérapie basée sur la L-
asparaginase en association avec une radiothérapie (Alaggio et al., 2022) avec une médiane de
suivi de 32 mois et une survie à 2 ans de 78% (Harabuchi et al., 2019).

□ Le lymphome nodal à cellules NK/T des individus positifs à l’EBV/EBV+ nodal T-

and NK-cell lymphoma

Il s’agit d’un lymphome rare lié à une infection par l’EBV intéressant primairement les nœuds
lymphatiques sans implication nasale et une rare implication extra-nodale. Il affecte des individus
globalement plus âgés que pour l’ENKTCL avec une prédilection masculine (Kim et al., 2019). Les

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patients présentent généralement une lymphadénomégalie et des troubles systémiques
aspécifiques. La cinétique est agressive, ainsi son pronostic est sombre et sa médiane de survie
inférieure à 4 mois (Jeon et al., 2015; Quintanilla-Martinez et al., 2023). Concernant l’aspect
morphologique, on retrouve des proliférations de larges cellules atypiques à caractéristiques
centroblastiques ou encore une prolifération diffuse de cellules pléomorphes occasionnellement
associée à de la nécrose et encore plus rarement à des lésions d’angiodestruction. La majorité des
cas rapportés fait état d’un immunophénotype les rattachant aux lymphocytes T (Figure 28), en effet
les cas présentant un phénotype de cellules NK ne sont retrouvés que dans 6 à 15% des cas (Kim
et al., 2019). De fait on retrouve dans la plupart des cas, en plus de la détection de l’EBV, des
arrangements clonaux du TCR, une surrégulation de la voie PD-L1, des marqueurs CD2 et CD8 et
une sous-expression du CD56 comparé aux troubles lymphoprolifératifs indolents du tractus digestif
(cf infra) (Kim et al., 2019).

Page 63
Figure 28 : Histologie d’un nœud lymphatique d’un patient atteint de lymphome nodal à cellules NK/T
positif à l’EBV (d’après Kim et al., 2019). (A) Nœud lymphatique avec un effacement complet de son
architecture par un infiltrat diffus s’étendant au-delà de la capsule et infiltrant le tissu adipeux péri-nodal
(hémalun et éosine (HE), grossissement 12,5x). (B) Les cellules néoplasiques sont de grande taille,
pléomorphes, dotées d’un noyau irrégulier et d’un cytoplasme pâle ou clair (HE, 400×). (C–E) Cellules
néoplasiques positives pour EBER, CD56, TIA-1 (hybridation in situ et immunohistochimie, 400×). (F) Un
immunomarquage du TCR-gamma met en évidence la déviance gamma-delta des cellules tumorales
(immunohistochimie, 400×). (G) Le TCR alpha-beta (BetaF1) est absent des cellules tumorales mais présent
chez les lymphocytes T réactifs (immunohistochimie, 400×).

□ Leucémie à grands lymphocytes NK granuleux/ NK-large granular lymphocytic

leukaemia

La leucémie à grands lymphocytes granuleux (NK-LGLL : NK-large granular lymphocytic leukaemia)

est un trouble rare constituant entre 2 et 5% des troubles lymphoprolifératifs chroniques en Occident
(Moignet et Lamy, 2018), semblant affecter préférentiellement les individus âgés sans prédisposition
sexuelle (Moignet et Lamy, 2018; Rahul et al., 2022). Il est établi qu’elle représente 10% des cas
des troubles lymphoprolifératifs chroniques de LGL (Moignet et Lamy, 2018).

Anciennement qualifiée de « troubles lymphoprolifératifs chroniques des cellules NK » dans

e
la 4 classification, la découverte récente d’expansion clonale ou oligoclonale dans cette affection a

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motivé une modification d’appellation en raison de points communs avec la leucémie à grands
lymphocytes T granuleux (Alaggio et al., 2022). Il est à noter que la littérature traite souvent des
deux affections communément. L’origine précise de la prolifération clonale est encore inconnue à
ce jour, en dépit de la mise en évidence de voies moléculaires impliquées dans la pathogénie de
l’affection (Rahul et al., 2022). Il a également été démontré un rôle important de l’IL 15 et du PDGF
dans l’activation et la prolifération incontrôlée des LGL (Lodolce et al., 2002; Rahul et al., 2022).

L’aspect clinique est dominé par de l’abattement dans la moitié des cas (Rahul et al., 2022),
et des cytopénies sont également décrites, bien qu’un tiers des patients soit asymptomatique au
moment du diagnostic (Moignet et Lamy, 2018). La présentation initiale est souvent caractérisée par
des infections chroniques relatives à une neutropénie induite. En effet on note une neutropénie dans
la moitié des cas et une thrombocytopénie dans moins de 20% des cas ainsi que des anémies et
des infiltrations lymphocytaires de la moelle osseuse (Sokol et Loughran, 2006). On retrouve parfois
une splénomégalie, et encore plus rarement une hépatomégalie ou une lymphadénopathie (Moignet
et Lamy, 2018; Pflug et al., 2022). Cette néoplasie est associée à la présence de maladies auto-
immunes dans 15 à 40% des cas, dont notamment l’arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux
systémique ou encore le syndrome de Sjögren. L’électrophorèse des protéines sériques met en
évidence une hypogammaglobulinémie polyclonale (Moignet et Lamy, 2018).

D’un point de vue phénotypique la NK-LGLL se caractérise principalement par des cellules
CD3-/CD8+/CD16+/CD56+/CD57+/- (Lamy et al., 2017; Lima et al., 2004) et plus précisément par le
phénotype CD2+/sCD3-/CD3ε+/TCRαβ-/CD4-/CD8+/CD16+/CD56+/CD57+/- (Lima et al., 2004;
Moignet et Lamy, 2018). Il a longtemps été difficile d’établir la clonalité de la NK-LGLL puisque ses
cellules n’expriment pas de TCR (Moignet et Lamy, 2018). Néanmoins plusieurs éléments
permettent de contourner cette problématique, tels que la présence d’une expression du KIR
restreint (à savoir une faible expression d’au moins 2 types de récepteurs KIR) ou encore la mise
en évidence de mutation somatiques des gènes STAT3, STAT5b, TET2 ou TNFAIP3 (Drillet et al.,
2022).

Cette affection est associe à une cinétique indolente (Pflug et al., 2022). De fait une majorité
de patients ne nécessite pas de traitement particulier au moment du diagnostic, en dehors d’une
surveillance et de contrôles réguliers. Cependant l’évolution est progressive et de nombreux patients
nécessitent par la suite d’être traités au moment où ils deviennent symptomatiques (Rahul et al.,
2022).

□ Troubles lymphoprolifératifs indolents du tractus digestif

Anciennement distingués sous les noms de gastropathie lymphomatoïde ou d’entéropathie à

cellules NK, les troubles lymphoprolifératifs indolents du tractus digestif, aussi qualifiés d’iNKLPD
(Indolent NK-cell lymphoproliferative disorder of the GI tract) ont longtemps été supposés émaner
de processus réactionnels. Leur caractère néoplasique est établi à ce jour (Alaggio et al., 2022).
Les iNKPLD correspondent à un désordre lymphoprolifératif atypique de découverte récente
et d’étiologie inconnue. Les patients atteints présentent fréquemment des signes digestifs troubles
et certaines équipes ont identifié la présence d’hémorragies muqueuses, d’ulcères superficiels et/ou
de polypes touchant plusieurs organes du tractus digestif tels que l’estomac, l’intestin grêle, le côlon

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ou plus rarement la vésicule biliaire (Jaffe, 2020; Koo et al., 2021; Xia et al., 2019) avec des lésions
infra-centimétriques dans la plupart des cas (Figure 29)(Koo et al., 2021).

Figure 29 : Images endoscopiques d’iNKLPD (Mansoor et al., 2011). (A-B) Lésions coliques. Ces lésions
coliques prennent généralement la forme d’ulcères entourés d’érythème et d’œdème (A), bien que certaines
lésions prennent un aspect plus nodulaire ou polypoïde (B). (C-D) Lésions gastriques et duodénales.

Les lésions peuvent persister, régresser ou apparaître sur d’autres sites du tractus digestif
(Xia et al., 2019). La faculté de ces deux affections à mimer des lymphomes à cellules T et NK
agressifs peut conduire à une erreur de diagnostic et donc à une thérapie inappropriée (Xia et al.,
2019).
En dépit d’une origine inconnue et de l’aspect prolongé mais indolent de l’affection chez les
patients atteints, un caractère bénin leur a été attribué à leur découverte bien que des tests de
clonalité n’aient pu être réalisés (Mansoor et al., 2011). En effet tous les cas rapportés suivent une
cinétique indolente, avec à ce jour, aucune mortalité associée rapportée (Wang et al., 2019).
Le profil immunohistochimique des iNKLPD est caractéristique : les cellules expriment le
CD56 et des marqueurs cytotoxiques (TIA-1 et/ou le granzyme B) avec une expression variable de
marqueurs des lymphocytes T (positifs pour CD7 et le CD3 cytoplasmique, et négatifs CD5, CD4,
CD8, CD10, CD20, CD30, and TCRβF1)(Wang et al., 2019). D’autres travaux rapportent une
positivité pour le CD43, le CD45 et le CD56. Par ailleurs le test de clonalité des lymphocytes T est

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utilisé comme examen d’exclusion (Xia et al., 2019). Des mutations de JAK3 ont également été
rapportées dans cette affection (Jaffe, 2020).
Par ailleurs il a été noté la présence d’Helicobacter pilori chez la majorité des individus
nippons présentant un iNKLPD (à l’époque gastropathie lymphomatoïde). La régression et l’absence
de récidive des lésions ulcératives de l’estomac et de l’intestin lors de la prise en charge d’un patient
infecté par cette bactérie lors du diagnostic et ayant subi une antibiothérapie ciblée suggère un lien
entre l’infection par l’agent pathogène et l’entité décrite (Nakajima et al., 2022). En revanche tous
les cas rapportés de ces affections étaient négatifs pour le virus d’Epstein-Barr (Xia et al., 2019).

□ Leucémie agressive à cellules NK

Il s’agit d’une affection rare chez l’Homme où elle est principalement retrouvée au Moyen-Orient et
en Asie et fréquemment associée à une infection par le virus d’Epstein-Barr (EBV) (Lima, 2013; Valli,
2007). L’étiologie précise reste peu comprise en raison de sa rareté, bien que l’EBV semble
constituer un des facteurs responsables de sa nature agressive et jouer un rôle dans la pathogénèse
de l’affection (Kimura et Fujiwara, 2019; Takahashi et al., 2011).

Elle touche préférentiellement l’individu adulte sans préférence de sexe. Les principaux sites
impliqués sont la moelle osseuse, le sang périphérique, le foie et la rate (Ishida, 2018). L’aspect
clinique et paraclinique est dominé par la présence de fièvre, de figures d’hémophagocytose lors
de frottis de la moelle osseuse, d’insuffisance hépatique et de coagulation intravasculaire
disséminée (CIVD) (Ishida, 2018 ; Yang et al., 2022). En l’absence de critère diagnostique
standardisé ce dernier repose sur l’épidémiologie, la reconnaissance des sites impliqués et des
éléments cliniques mais surtout sur l’identification de cellules leucémiques aberrantes d’un point de
vue immunophénotypique et morphologique (Ishida et al., 2012; Li et al., 2014). Les cellules
tumorales ressemblent à de grands lymphocytes granuleux mais affichent parfois un pléomorphisme
(Figure 30). Ces cellules affichent un immunophénotype CD2+, CD3- en surface, CD7+, CD3ε+,
CD16+ et CD56+ avec une absence de TCR et une absence de marqueurs caractéristiques des
cellules myéloïdes et des lymphocytes B (Ishida, 2018; Yang et al., 2022). Malgré l’agressivité
clinique et l’issue très souvent létale avec une médiane de survie d’environ 2 mois (Lima, 2013; Tang
et al., 2017), il n’existe pas d’option thérapeutique de choix pour l’ANKL (Nazarullah et al., 2016).
En effet la production de glycoprotéines P (une molécule de transport à fonction notamment de
barrière biologique en expulsant certaines toxines et xénobiotiques des cellules (Lin et Yamazaki,
2003)) par les cellules NK néoplasiques, mène à une faible réponse des patients à l’administration
de diverses molécules telles que le cyclophosphamide, la doxorubicine, la vincristine et la
prednisolone (Egashira et al., 1999; Yang et al., 2022). De par la capacité de la L-asparginase à
induire l’apoptose de cellules NK tumorales (Ando et al., 2005), cette molécule est à la base de
plusieurs protocoles de chimiothérapie tels que SMILE (dexaméthasone, méthotrexate, ifosfamide,
L-asparaginase, and etoposide), AspaMetDex (L-asparaginase, méthotrexate, and dexaméthasone)
et VIDL (etoposide, ifosfamide, dexaméthasone, and L-asparaginase). En revanche on observe
moins de 20% de rémission avec ces traitements et une greffe de cellules souches
hématopoïétiques est nécessaire pour améliorer les chances de rémission (Ishida et al., 2012; Jung
et al., 2016).

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Figure 30 : Coloration Wright-Giemsa d’un frottis de moelle osseuse d’un patient atteint de leucémie
agressive à cellule NK (×1,000) (d’après Yang et al., 2022). (A) Figure d’hémophagocytose. (B–D) Large
lymphocytes granuleux.

 Chez le chien – Leucémie et lymphome à grands lymphocytes granuleux

Si les leucémies et lymphomes à grands lymphocytes granuleux (LGLL) sont décrits chez le chien
(ADACHI et al., 2022; Kotb et al., 2021) il est à noter un manque de littérature spécifique concernant
les processus néoplasiques des cellules NK. De plus les processus néoplasiques provenant des
cellules NK sont considérés comme minoritaires parmi les LGLL (Bonkobara et al., 2007; Jaensch
et al., 2022) et sont souvent diagnostiqués sur la base d’une absence d’expression de CD3 et de
TCR (Bonkobara et al., 2007; Snead, 2007). Il s’agit d’une affection rare, à différencier d’une
lymphocytose réactionnelle (Snead, 2007) parfois secondaire à une infection par Ehrlichia canis
(Heeb et al., 2003) et intéressant usuellement les chiens d’âge moyen à âgé. L’aspect clinique est
trouble avec des symptômes vagues voire absents et la cytologie montre, la plupart du temps, de
grands lymphocytes non blastiques avec un cytoplasme abondant contenant fréquemment des
granules azurophiles (Bonkobara et al., 2007; Elliott et Villiers, 2018) (Figure 31).

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Figure 31 : Microphotographies de frottis de moelle osseuse chez un chien atteint de LGLL (coloration
de Wright-Giemsa) (d’après Akiyoshi et al., 2019). (A, B) Les flèches indiquent des phagocytoses par les
macrophages. (C) Les flèches indiquent des lymphocytes matures dotées d’un nombre variable de granules
azurophiles.

Une lymphocytose variable est retrouvée allant jusqu’à 90% des lymphocytes circulants
(Jaensch et al., 2022), ainsi qu’une cytopénie modérée à absente, ou encore une neutrophilie (Elliott
et Villiers, 2018; Jaensch et al., 2022). L’analyse d’articles précédents fait état d’une anémie dans
56 % des cas, une thrombocytopénie dans 25% des cas, une neutropénie dans 17% des cas. Une
neutrophilie est également rapportée dans 49% des cas (Jaensch et al., 2022). Un syndrome
hémophagocytaire est occasionnellement rapporté (Akiyoshi et al., 2019). Sur le plan biochimique
une étude met en évidence une augmentation des GGT associée à des valeurs usuelles pour le
reste des marqueurs hépatiques. L’étiologie de ce phénomène reste à ce jour inconnue (Jaensch et
al., 2022).
D’un point de vue phénotypique il apparaît que la combinaison la plus courante est celle de
lymphocytes T CD3+/CD4-/CD8+, bien que de rares cas aient été reportés avec un phénotype
atypique CD3+/CD4+/CD8+ ou encore CD3+/CD4-/CD8- (Jaensch et al., 2022).

Page 69
Figure 32 : Résultats typiques en cytométrie de flux de chiens avec un(e) LGLL (d’après Jaensch et
al., 2022). Dans ce cas précis l’entité se caractérisait par les marqueurs CD3+CD4-CD8+.

On retrouve concernant cette affection un pronostic variable. Ainsi, une étude comptant 9
chiens fait état de survies variant entre 5 et 54 mois (Jaensch et al., 2022). Concernant le volet
thérapeutique des protocoles CHOP, combinant de la lomustine, de la vincristine et de la
procarbazine ou combinant de la prednisolone, de la lomustine et de la cytarabine, ou encore de la
lomustine et de la cyclosporine A ont été décrits dans ces affections (Adachi et al., 2022). La réponse
au traitement montre une grande variabilité selon la localisation anatomique, le protocole
thérapeutique et les études publiées (entre 6 et 508 jours ; résultats comprenant majoritairement
des essais sur des lymphomes à cellules T) (Adachi et al., 2022).

Ainsi il transparaît un manque de données globales concernant les cellules NK canines, et

ces connaissances, lorsqu’elles sont présentes, sont principalement orientées vers des essais
thérapeutiques. De fait on note une faible quantité d’études sur la cellule NK canine en conditions
physiologiques et il en découle une opacité concernant leur nombre chez le chien sain corrélée à
une absence d’outils spécifiques d’identification, bien qu’actuellement certains sont en cours de
développement et/ou de commercialisation. La mise au point de combinaisons d’éléments de
caractérisation sensibles et spécifiques représente un enjeu majeur dans l’identification de
lymphomes et leucémies atypiques des cellules NK, et le Biopôle Alfort détient certains anticorps
capables de se lier à des marqueurs spécifiques des lymphocytes canins. Ainsi, la seconde partie
de ce manuscrit sera consacrée à la mise au point de ces nouveaux marquages avec ces anticorps
disponibles, voire d’une combinaison des anticorps, afin d’identifier les cellules NK canines dans la
population lymphocytaire circulante, par cytométrie de flux au Biopôle Alfort.

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Deuxième partie : étude expérimentale

1. Introduction
Cette thèse est inspirée par un chien dont un échantillon sanguin a été présenté au Biopôle Alfort
en vue d’un immunophénotypage sur la base d’une suspicion de lymphome/leucémie.
L’immunophénotypage par cytométrie de flux des lymphocytes présents dans le sang, a montré un
phénotype CD3- et CD21- pour la population lymphocytaire majoritaire. Ainsi, l’identification des
cellules circulantes parmi les PBMCs de caractéristiques lymphocytaires en taille et granulosité étant
ressortie non concluante, une suspicion de lymphome à cellules NK a été établie. Les anticorps
permettant une caractérisation de marqueurs spécifiques des cellules NK canines n’étant pas
disponibles au moment de débuter cette thèse, ni à l’heure actuelle, un essai d’identification de ces
cellules à l’aide d’anticorps spécifiques des marqueurs CD3, CD8 et CD11b, a été entrepris suivant
la littérature citée dans la première partie de ce manuscrit qui suggère que ces marqueurs peuvent
permettre de discriminer les différentes populations lymphocytaires et d’identifier les cellules NK qui
seraient de phénotype CD3-/CD8+ et CD11b+. Ainsi, il a été décidé dans un premier temps de tester
cette combinaison de marqueurs à la fois sur les cellules restantes de ce chien particulier, et
également à partir de PBMCs isolées et conservées à -80°C au BioPôle Alfort, surnuméraires, issues
d’autres projets de recherche clinique (ayant eu une autorisation du Comité de Recherche Clinique
de l’EnvA), et issues de « déchets biologiques » provenant de chiens du service des Urgences et
Soins Intensifs (URSI) du Centre Hospitalier Universitaire Vétérinaire des Animaux de Compagnie
(CHUV-AC). Dans un second temps, d’autres marqueurs cités dans la littérature ont été testés pour
affiner ce phénotypage, tels que CD5 et NKp46 (Gingrich et al., 2019 ; Gingrich et al., 2021).
Le but de ce travail est in fine de pouvoir offrir un immunophénotypage supplémentaire pour
identifier potentiellement des lymphomes ou des leucémies qui seraient négatifs pour les marqueurs
classiques des lymphocytes T et B, respectivement CD3 et CD21.

2. Matériels et méthodes

A. Matériel

a. Cellules mononucléées du sang périphérique canin (PBMCs)

Les PBMCs utilisées dans ce projet provennaient :
- du chien à l’origine de cette thèse, avec une suspicion de leucémie, immunophénotypé au BioPole
pour CD3 et CD21 initialement (n=1, cellules fraîches, c’est-à-dire non congelées avant
l’immunophénotypage)
- de chiens admis au service des urgences et soins intensifs du CHUV-AC, dont le sang avait été
prélevé à des fins diagnostiques. Le reste de sang non utilisé, considéré comme « déchet
biologique » avait été récupéré pour cette étude. (n=7, cellules fraiches et congelées). Les

Page 71
consentements des propriétaires sont disponibles sur demande auprès de l’auteur ou de la directrice
de cette thèse.
- du chien dit « IZ », dont le sang avait été envoyé au BioPôle par une clinique extérieure pour
immunophénotypage CD3/CD21 sur sang total (n=1, cellules fraîches / « déchet biologique »)
- de PBMCs isolées et conservées à -80°C au BioPôle Alfort, surnuméraires, issues d’autres projets
de recherche clinique (n=31)
Le traitement de ces échantillons pour l’obtention des PBMCs et leur marquage est décrit ci-après.

b. Anticorps
Le Tableau 3 résume les caractéristiques des différents anticorps utilisées dans cette étude :

Tableau 3 : Résumé des caractéristiques des principaux anticorps utilisés.

Spécificité Validé chez

d’espèce Fluorochrome le chien
Type Fournisseur Dilution
(espèce associé
source)
Utilisé
Anti-chien BioRad
Anti-CD3 FITC couramment 1/20ème
(souris) Antibodies
en routine
Anti-humain Jamais
Anti-CD5 PE Miltenyi 1/50ème
(souris) testé
Utilisé
BioRad
Anti-CD8 Anti-chien (rat) A647 couramment 1/20ème
Antibodies
en routine
Utilisé
Anti-humain
Anti-CD11b PE Miltenyi couramment 1/50ème
(souris)
en routine
Anti-humain Jamais
Anti-Nkp46 PE Miltenyi 1/50ème
(souris) testé

Trois combinaisons ont été réalisées : anti-CD3/anti-CD5/anti-CD8 (mix 1), anti-CD3/anti-

CD11b/anti-CD8 (mix 2) ainsi qu’anti-CD3/anti-CD8/anti-NKp46 (mix 3).

c. Cytomètre de flux
Le cytomètre employé était un cytomètre BD Accuri™ C6 Plus à jour de ses révisions, et le traitement
des données a été réalisé avec le logiciel associé (BD CSampler™ Plus). L’ensemble du matériel
consommable a été fourni par le Biopôle Alfort.

B. Protocole

a. Isolement des PBMCs à partir du sang total et protocole de marquage

 Isolement des PBMCs

Le sang récemment prélevé sur tube EDTA était dilué avec 2 mL de PBS (Phosphate Buffered
Saline) puis déposé délicatement sur 3 mL de Ficoll (polysaccharide hydrophile neutre)
préalablement présent dans le tube de centrifugation de 15 mL. Le tube était ensuite centrifugé à

Page 72
2000 rotations par minute (rpm) pendant 20 minutes sans frein. L’anneau de PBMCs était alors
prélevé à l’aide d’une pipette pasteurelle (Figure 33) puis versé dans 5 ml de PBS. Deux lavages des
cellules de l’anneau étaient réalisés avec une centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm entre chaque
lavage. Le culot cellulaire était ensuite resuspendu dans 5 ml de PBS s’ils devait être analysé
directement, ou dans la quantité nécessaire de sérum de veau fœtal (SVF) contenant 5 % de
dyméthylsulfoxyde (DMSO) s’il devait être congelé à -80°C (Le Roux, 2022).

Figure 33 : Répartition des différents éléments figurés sanguins après centrifugation (d’après Ota et
Tanaka, 2017).

 Protocole de marquage
Avant le marquage par les anticorps, pour éviter la mort et donc la perte cellulaire, les cellules doivent
être fixées. Pour cela, le culot de cellules (décongelées ou récupérées à partir de l’anneau de
PBMCS et lavées deux fois) était resuspendu avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) puis
centrifugé à 1200rpm pendant 5min. Après centrifugation, le surnageant était jeté et le culot était
resuspendu avec 1 ml de ParaFormaldéhyde (PFA) à 1% et incubé à température ambiante pendant
30min. Après incubation, les cellules fixées en PFA étaient diluées en tampon FACS (PBS + 1%
d’albumine sérique bovine (BSA) ; 4mL par tube) puis centrifugées à 1200rpm pendant 5min. Le
surnageant était ensuite éliminé et le culot était resuspendu dans la quantité suffisante de tampon
FACS pour séparer le culot en différents tubes selon les marquages à effectuer (en général deux
tubes : un pour les cellules non marquées, c’est-à-dire sans anticorps, et un qui recevra le mix
d’anticorps pour marquage, selon les dilutions décrites dans le tableau 3). Une nouvelle
centrifugation à 1200 rpm pendant 5 min était réalisée. Le surnageant était jeté et les culots
suspendus avec les différentes combinaisons d’anticorps (Mix 1 et/ou 2 et/ou 3), préparées au
préalable aux concentrations mentionnées ci-dessus dans du tampon FACS, de telle sorte à pouvoir
administrer 50 µL par tube. 50µL de tampon FACS et de la combinaison d’anticorps étaient ensuite
ajoutés respectivement dans les tubes témoins (NM) et testés (Mix). Une incubation de 30 minutes
à température ambiante était respectée à la suite de laquelle les cellules étaient lavées avec 500µL
de tampon FACS puis centrifugées à 1200rpm pendant 5min. Ceci était répété une deuxième fois
et les culots cellulaires ensuite resuspendus avec 300 µL de PBS étaient enfin ajoutés dans chaque
tube avant passage au cytomètre (Le Roux, 2022).

Page 73
 b. Acquisition
Une porte (ou « gate ») de PBMCs était définie sur le logiciel en fonction de la taille et de la
granulosité attendue afin d’acquérir le nombre désiré de cellules. Un mode d’acquisition lent était
sélectionné, et le cytomètre cessait son activité lorsque le volume liquide total du tube était atteint
ou que 30 000 évènements (ou cellules) étaient comptabilisés au sein de la porte des PBMCs. La
population lymphocytaire était ensuite sélectionnée parmi les PBMCs grâce à leurs caractéristiques
de taille et de granulosité qui permet de les séparer des monocytes, autre population mononuclée
présente dans l’anneau de PBMCs (Figure 34).

Figure 34 : Différentes portes sélectionnées sur le logiciel (PBMCs et lymphocytes).

Parmi ces lymphocytes, pour tous les échantillons, en premier, le marquage effectif du
marqueur CD3 était testé comparativement entre les tubes « Mix » et non marqués (NM) (Figure
35).

Figure 35 : Comparaison du marquage entre un échantillon incubé avec les marqueurs dont le CD3 (à
droite) et son échantillon témoin (à gauche).

Pour les analyses, par la suite parmi la population lymphocytaire CD3-, qui correspond aux
lymphocytes non-T (donc les lymphocytes B et les cellules NK entre autres), les deux autres
marqueurs sélectionnés se voyaient à leur tour évalués (Figure 36) (soit CD5/CD8 (mix 1), soit
CD11b/CD8 (mix 2) soit CD5/NKp46 (mix 3)). La figure 36 montre l’exemple de la stratégie de

Page 74
sélection (ou « gating ») qui permet d’obtenir les différentes proportions cellulaires parmi les
lymphocytes CD3-. Les résultats sont présentés dans la section suivante.

Figure 36 : Exemple de vérification du marquage effectif des cellules par les deux autres marqueurs
du mix 2 (à droite des cellules incubées avec les marqueurs, à gauche son échantillon témoin, les
couleurs sont données de façon arbitraire et peuvent varier).

CD11b
CD11b

CD8 CD8

3. Résultats

A. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD5/CD8

a. Résultats du marquage du chien à l’origine de cette thèse

Les PBMCs du chien à l’origine de cette thèse ont été fixées en PFA 1% le jour de la demande du
diagnostic et ont été marquées avec les anticorps anti-CD3 et anti-CD21, conformément à la
demande des cliniciens pour statuer sur le phénotype des lymphocytes sanguin. La suspicion
s’orientant vers un lymphome ou une leucémie, le marqueur CD34 avait été aussi demandé. Ces
trois marquages se sont révélés négatifs pour les lymphocytes présents dans le sang du chien
(résultats non montrés pour CD21 et CD34, et pour CD3 : cf figure 37 – panel du milieu). En effet,
la majorité des lymphocytes de ce chien étaient négatifs pour CD3 (86,6%). Ainsi ces trois
marqueurs étant négatifs, les marqueurs CD8+ et CD11b+ ont été testés le lendemain, sur les
cellules restantes et non marquées le jour J (figure 37 – panel de droite). De façon intéressante, le
phénotype des lymphocytes majoritairement présents dans le sang de ce chien était revenu CD3-
/CD8+CD11b+.

Page 75
Figure 37 : Exemple de vérification du marquage effectif des cellules du chien à l’origine de cette thèse
par les deux autres marqueurs du mix 2.

Ce résultat surprenant a motivé la décision de tester ce panel d’anticorps afin de pouvoir

identifier les cellules NK sans les marqueurs classiquement décrits et dont les anticorps ne sont pas
disponibles dans le commerce. Ainsi, ces anticorps anti-CD8 et anti-CD11b, ont donc été testés sur
d’autres PBMCs provenant de stocks congelés d’autres projets de recherche (cf partie 2.A.a –
description des échantillons).

b. Résultats du marquage sur les PBMCs congelées

Sur tous les échantillons testés pour le panel CD3/CD8/CD11b, 6 échantillons ont été écartés en
raison de leur faible cellularité invalidant leur interprétation. Un total de 27 échantillons congelés a
donc pu être analysé ; dont certains provenaient de chiens identiques mais prélevés à des temps
différents (Tableau 4).

Tableau 4 : Synthèse des différents pourcentages phénotypiques globaux des échantillons congelés.
« Moy » = moyenne

Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de

Lymphocytes
lymphocytes lymphocytes lymphocytes
CD3-
CD3- CD3- CD3-CD11b-
Parmi la
CD11b+CD8- CD11b+CD8+ CD8+
population de
Parmi les Parmi les Parmi les
lymphocytes
lymphocytes lymphocytes lymphocytes
totaux
CD3- CD3- CD3-
Moy(écart-type)
Moy(écart-type) Moy(écart-type) Moy(écart-type)
Echantilllons
38,7% (20,4) 6,1% (5,2) 0,1% (0,2) 8,3% (7,8)
congelés (n=27)
Possibles
Possibles Possibles
Phénotype LB et cellules NK monocytes
cellules NK ? cellules NK ?
contaminants

L’analyse de ces résultats montrait un faible très pourcentage (0,1%) de cellules CD3-
CD8+CD11b+ présent dans les PBMCs de ces échantillons (population putative de cellules NK du

Page 76
sang périphérique). Cependant, un pourcentage plus élevé de cellules CD3-CD11b-CD8+ était
fréquemment retrouvé avec une moyenne à 8,3% de cellules de ce phénotype parmi les
lymphocytes CD3-. Ainsi, cette population pourrait éventuellement représenter une autre population
de cellules NK canines. Ces résultats différant des initiaux, différentes comparaisons ont été
réalisées par la suite. Notamment, il était important de savoir si la congélation des échantillons
pouvait affecter l’expression de certains marqueurs.

b. Comparaison des valeurs obtenues selon l’état de congélation

Le fait de retrouver parmi les lymphocytes CD3- très peu de cellules CD11b+ et CD8+, a soulevé
l’hypothèse que l’expression de ces marqueurs pouvait être affectée par la congélation. Ainsi, à
partir de sang frais issus de chiens hospitalisés au service des urgences (« déchets biologiques »),
les PBMCs obtenues ont été soit marquées tout de suite ou congelées pour un marquage ultérieur.
Les PBMCs analysées directement après sélection sont notées « cellules fraiches ». Les PBMCs
issues des mêmes individus et analysées après une période de congélation à - 80°C, sont qualifiées
de « cellules congelées » (Parmi les échantillons retenus, un chien présentait à son admission une
récidive de pyothorax (chien 1), un autre un accident de la voie publique (chien 2), deux du méléna
et de l’hématémèse (chiens 3 et 5), et un de la dyspnée (chien 4).
Tableau 55, Figures 39 à 43). Deux chiens ont été écartés en raison de la faible cellularité de leurs
échantillons à la suite de la phase de préparation. Parmi les échantillons retenus, un chien présentait
à son admission une récidive de pyothorax (chien 1), un autre un accident de la voie publique (chien
2), deux du méléna et de l’hématémèse (chiens 3 et 5), et un de la dyspnée (chien 4).

Tableau 5 : Comparaison collective des différents pourcentages phénotypiques globaux des

échantillons frais et congelés.

Lymphocytes Lymphocytes Lymphocytes

Lymphocytes CD3- CD3- CD3- CD3-
Parmi la population CD11b+CD8- CD11b+CD8+ CD11b-CD8+
de lymphocytes Parmi les Parmi les Parmi les
totaux lymphocytes lymphocytes lymphocytes
CD3- CD3- CD3-
Moy(écart-type)
Moy(écart-type) Moy(écart-type) Moy(écart-type)
Cellules
Fraîches 38,0% (9,8) 3,9% (2,6) 0,0% (0,0) 1,2% (0,7)
(n=5)
Cellules
congelées 34,6% (18,4) 6,4% (3,0) 0,1% (0,1) 1,2% (0,8)
(n=5)

Les pourcentages des populations CD11b+/CD8+, CD11b-CD8+ et CD11b+CD8- parmi les

cellules CD3- variaient peu en fonction de l’état de congélation. Il est à noter cependant une légère
augmentation du pourcentage de cellules CD3-CD11b+CD8-. Les figures ci-après détaillent les
résultats sous forme de graphe pour chaque chien admis.

Page 77
Figure 38 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 1.

50 45,2 Enchantillon frais Echantillon congelé

45
40
34,5
35
30
25
20
15
10 6,6
5 0,7 0 0 1,3 0,8
0
Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de
lymphocytes CD3- (%) lymphocytes CD3- lymphocytes CD3- lymphocytes CD3-
CD11b+CD8- (%) CD11b+CD8+ (%) CD11b-CD8+ (%)

Figure 39 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 2.

60 54,5
55 50,5 Enchantillon frais Echantillon congelé
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5 1,6 1,6 0,2 1,8 2
0
0
Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de
lymphocytes CD3- (%) lymphocytes CD3- lymphocytes CD3- lymphocytes CD3-
CD11b+CD8- (%) CD11b+CD8+ (%) CD11b-CD8+ (%)

Page 78
Figure 40 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 3.

50
44 42,9 Enchantillon frais Echantillon congelé
45
40
35
30
25
20
15
9,3
10
4,7
5 0,1 0 0,1 0,1
0
Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de
lymphocytes CD3- (%) lymphocytes CD3- lymphocytes CD3- lymphocytes CD3-
CD11b+CD8- (%) CD11b+CD8+ (%) CD11b-CD8+ (%)

Figure 41 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 4.

30
24,8 Enchantillon frais Echantillon congelé
25

20

15
11,8
10 8,6
6,0
5 2
1,9
0,0 0,2
0
Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de
lymphocytes CD3- (%) lymphocytes CD3- lymphocytes CD3- lymphocytes CD3-
CD11b+CD8- (%) CD11b+CD8+ (%) CD11b-CD8+ (%)

Page 79
Figure 42 : Comparaison des différents pourcentages phénotypiques selon l’état de congélation des
échantillons du chien 5.

40 36
Enchantillon frais Echantillon congelé
35
30
25
18,7
20
15
10 6,4 6
5 1,1 1,2
0 0
0
Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de
lymphocytes CD3- (%) lymphocytes CD3- lymphocytes CD3- lymphocytes CD3-
CD11b+CD8- (%) CD11b+CD8+ (%) CD11b-CD8+ (%)

c. Effet du sexe sur les pourcentages des différentes populations parmi les
cellules CD3-
Afin d’établir s’il existe un effet du sexe sur les pourcentages des différentes populations
lymphocytaires étudiées, une comparaison a été réalisé en fonction du sexe de l’animal (tableau 6)

Tableau 6 : Comparaison collective des différents pourcentages phénotypiques selon le sexe.

Lymphocytes
Lymphocytes Lymphocytes Lymphocytes
CD3-
CD3- CD3- CD3-
Parmi la
CD11b+CD8- CD11b+CD8+ CD11b-CD8+
population de
Parmi les Parmi les Parmi les
lymphocytes
lymphocytes lymphocytes lymphocytes
totaux
CD3- CD3- CD3-
Moy(écart-
Moy(écart-type) Moy(écart-type) Moy(écart-type)
type)
Femelles entières
32,6 (24,0) 5,2 (6,1) 0,2 (0,2) 9,8 (11,7)
(n = 8)
Femelles stérilisées
37,6 (17,7) 5,4 (5,8) 0,1 (0,1) 10,2 (5,2)
(n = 8)
Mâles entiers
38,3 (14,4) 8,1 (5,2) 0,2 (0,1) 6,1 (6,1)
(n = 6)
Mâles castrés
35,3 (15,8) 5,8 (4,3) 0,1 (0,1) 3,4 (4,5)
(n = 3)

Les résultats présentés ici ne montraient pas de différence majeure de l’ordre grandeur des
cellules CD3-CD8+CD11b+ des cellules en fonction du sexe des animaux sélectionnés (Tableau 6).
On compte respectivement 3 et 2 échantillons provenant des mêmes animaux (femelles stérilisées)
mais avec des dates de prélèvement différentes. Cependant, les femelles semblaient posséder plus
de cellules CD3-CD8+CD11b- circulantes que les mâles (près de deux fois plus si les moyennes

Page 80
sont comparées), mais comme pour les mâles, la stérilisation ne semblait pas affecter ces
pourcentages.

Suite à ces différents résultats, qui ne permettaient pas de conclure sur le phénotype NK des
cellules CD3-CD11b-CD8+ et CD3-CD11b+CD8+, la décision a été prise de tester d’autres
marqueurs phénotypiques utilisés dans la littérature pour identifier mieux les cellules NK par
cytométrie de flux, c’est-à-dire CD5 et aussi NKp46. Les anticorps dirigés spécifiquement contre ces
marqueurs n’étant pas disponibles en routine au BioPôle Alfort, des échantillons « tests » ont été
fournis par Miltenyi, afin de profiter de ces essais pour déterminer s’il existe une réaction croisée,
c’est-à-dire si ces anticorps, développés pour les molécules humaines, sont capables de reconnaitre
les formes canines, tout comme l’anti-CD11b-PE, provenant du même fournisseur.

B. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD5/CD8

L’ensemble des échantillons présents en double exemplaire et provenant de deux anciennes
thèses (n = 21) a été testé avec le marqueur CD5 (avec l’hypothèse que les cellules NK soient CD5-
voire CD5dim (Gingrich et al., 2019; Huang et al., 2008; Michael et al., 2013b)). La figure 43 présente
un exemple de marquage pour un échantillon.

Figure 43 : Démonstration de l’absence de réactivité de l’anticorps anti-CD5 dans un des échantillons

testés.

Une absence de marquage effectif du marqueur anti-CD5 était à noter concernant l’ensemble
des échantillons testés (Figure 43). Ainsi, cet anticorps ne reconnait pas la forme canine de CD5,
les résultats de ce marquage réalisés sur les 21 échantillons n’étaient donc pas exploitables.

C. Résultats du marquage avec le mix CD3/CD8/NKp46

Tout comme pour l’anti-CD5, un échantillon d’anticorps anti-NKp46 dirigé contre la forme humaine
de la protéine, a été fourni au Biopôle Alfort, par Miltenyi Biotec pour être testé sur les PBMCs

Page 81
canines, avec l’espoir d’une possible réaction croisée. La faible quantité de l’anticorps et les résultats
négatifs avec l’anti-CD5 testé sur 21 échantillons, a motivé la décision de ne le tester que sur les
cellules d’IZ, un chien dont l’échantillon avait été traité pour un immunophénotypage de lymphome
ou leucémie, réalisé au BioPôle en mai 2022. Les résultats sont présentés dans la figure 44.

Figure 44 : Démonstration de l’absence de réactivité du marqueur NKp46+ chez le chien IZ.

Le chien présentait donc une majorité de lymphocytes CD3+ (61%) ce qui était attendu dans
le sang (la valeur de référence pour les CD3+ circulantes est autour de 80 à 85%).
Malheureusement, l’anticorps donné par Miltenyi Biotec ne semblait pas reconnaitre la forme canine
d’NKp46.

4. Discussion

Suite à un immunophénotypage par cytométrie de flux, réalisé sur un chien présentant un lymphome
ou une leucémie à lymphocytes non-B non-T, l’hypothèse d’un lymphome à cellules NK avait été
posée. Aucun d’anticorps spécifique des cellules NK canines n’était disponible commercialement au
début de ce projet de thèse, et ces derniers sont actuellement très peu nombreux et difficilement
disponibles. Ainsi, plusieurs marqueurs ont été choisis en fonction des anticorps disponibles au
BioPôle et pouvant être exprimés par les cellules NK canines, selon la littérature retrouvée (cf.
première partie de ce manuscrit). Les résultats de ce chien ont montré de façon intéressante, une
population lymphocytaire majoritaire CD3-CD8+ et CD11b+. Une équipe (Grudzien et al., 2021) a
créé une lignée cellulaire canine CD3-CD8+ sur la base d’une néoplasie à cellules NK, mais cette
lignée n’a pas été testée pour le marqueur CD11b. Cependant, il est aussi possible d’envisager une
dérégulation aberrante de certains CD par les cellules néoplasiques, comme cela a déjà été décrit
chez le chien (Comazzi et Riondato, 2021) notamment dans certains lymphomes T où une perte
d’expression du CD3 ou du CD5 est parfois observée (Gelain et al., 2008).

Page 82
 Sur la base de cet immunophénotype de lymphome ni B ni T et possiblement NK, la décision
a été prise de tester l’expression les marqueurs CD3, CD8 et CD11b sur des lymphocytes provenant
d’échantillons de PBMCs congelées et disponibles au BioPôle, à l’aide d’anticorps spécifiques, afin
de pouvoir identifier des cellules de phénotype CD3-CD8+CD11b+ sur d’autres échantillons. Alors
que le chien à l’origine de ce projet de thèse présentait une majorité de cellules CD3- qui étaient
CD11b+ et CD8+, il s’avère que la majorité des échantillons testés présentaient plutôt des cellules
CD3- et CD8+ mais CD11b-. En effet, les résultats mentionnés ci-dessus font état de taux compris
entre 0,0 et 0,7 % de cellules CD3-CD8+CD11b+ pour une moyenne globale de 0,1 %. Aucun effet
de la congélation des échantillons n’a été observé sur les pourcentages de ces différentes
populations cellulaires, bien que certaines études ont montré que la congélation peut impacter
négativement la viabilité et la fonction des cellules NK (Kisseberth et Lee, 2021). Pourtant,
l’utilisation avec succès de cellules NK cryopréservées dans un contexte de transplantation chez
l’Homme laisse envisager le contraire, ou a minima un effet moindre (Ciurea et al., 2017; Kisseberth
et Lee, 2021). De même, aucun effet du sexe n’a été relevé sur le taux de cellules CD3-
CD8+CD11b+ parmi les lymphocytes, tandis que chez l’Homme il a été démontré que les hommes
adultes détenaient un taux de cellules NK plus élevé que les femmes adultes (Huang et al., 2021).
En revanche dans la population testée les femelles semblaient détenir deux fois plus de cellules
CD3-CD8+CD11b- que les mâles, bien que ces résultats nécessitent une investigation sur un plus
grand nombre d’échantillons.
Les valeurs obtenues dans ce projet sont à comparer avec celles de la littérature. En effet
des études récentes et basées sur les marquages spécifiques des cellules NK canines estiment que
la population de cellules NK parmi les PBMCs représente entre 2,5 et 15% des lymphocytes
périphériques (Gingrich et al., 2019; Grøndahl-Rosado et al., 2016; Huang et al., 2008) sur la base
respectivement des marqueurs NKp46 et CD5. Il a de plus été rapporté une expression du CD8 et
CD11b variables (respectivement jusqu’à 30 % (Lin et al., 2018, 2010) et entre 12 et 72% (chez des
cellules CD3-CD5- dans le dernier cas de figure (Michael et al., 2013a)). Dans les résultats présentés
ici, les cellules CD3- parmi les lymphocytes des PBMCs congelées mais aussi à partir des cellules
fraiches, représentent autour de 30% des lymphocytes totaux. Ces cellules, qui donc ne sont pas
des lymphocytes T, sont majoritairement des lymphocytes B et des cellules NK. Afin d’écarter aussi
les lymphocytes B, il aurait fallu rajouter un anticorps spécifique des LB (par exemple un anti-CD21).
Or les fluorochromes associés aux anticorps disponibles pour ces marqueurs sont très limités et ne
permettent pas de mettre 4 anticorps dans un même tube. Ainsi, une raison technique n’a pas permis
de faire ce marquage. En effet, avec ce type de marquage, les cellules NK auraient pu être identifiées
sur la base de la non-expression de marqueurs de LT et de LB (et donc CD3-CD21- parmi les
lymphocytes circulants).
De même dans la littérature, le pourcentage de LT CD3+ circulant est autour de 80% (80,0
± 7,4 (Faldyna et al., 2001)) et des LB circulants (CD3-) est d’environ 15% (14,4 ± 5,9) parmi les
lymphocytes totaux. Ici la moyenne des lymphocytes CD3- dans le sang des chiens admis aux
urgences du CHUV-AC est légèrement supérieure (38% pour les cellules fraîchement marquées et
34,6% pour les cellules congelées plusieurs semaines, décongelées puis marquées).
Cependant, il est aussi important de noter que beaucoup des échantillons congelés
provenaient de chiens souffrant de néoplasies diverses provenant de la thèse de Philippe Colombe
(n=17) soutenue en 2020 : Les biomarqueurs sanguins en oncologie comparée - état actuel des
connaissances en 2020 - application aux cellules myéloïdes suppressives canines) ou encore de

Page 83
celle de Clémence Nadal soutenue en 2018 : thèse expérimentale sur les cellules myéloïdes
suppressives comme outil diagnostique potentiel des cancers canins (n=10), et certains d’entre eux
souffraient par exemple de syndromes lymphoprolifératifs (n=9) pouvant affecter les pourcentages
des différentes populations lymphocytaires circulantes. Les chiens issus du service des Urgences
et Soins Intensifs (URSI) du CHUV-AC de l’EnvA ne détenaient pas de néoplasies lors du
prélèvement sanguin mais des pathologies inflammatoires et/ou infectieuses. En définitive seul un
individu sain issu de la thèse de Philippe Colombe précédemment citée, a priori exempt de
processus néoplasique ou infectieux, ou de signes rattachables, est inclus dans cette étude (avec
pour cet échantillon 0,1 % de population CD8+/CD11b+ parmi la population de cellules
lymphocytaires CD3-).
Au vu de ces résultats et après avoir analysé la littérature sur le phénotype des cellules
NK canine, le marquage anti-CD5 et anti-NKp46 a été réalisé, en collaboration avec le fournisseur,
afin de tester une potentielle réaction croisée de leurs anticorps spécifiques des formes humaines.
Malheureusement ces anticorps n’ont pas présenté de réaction croisée, et les résultats ne sont donc
pas interprétables. Cependant, une équipe américaine a réussi à obtenir à l’aide d’hybridome, un
anticorps spécifique du NKp46 canin (Foltz et al., 2016). Nous avions contacté l’équipe au cours de
cette thèse, la réponse a été apportée le 29 juillet 2023, en proposant de nous envoyer un peu de
surnageant. Cependant, l’équipe nous a également appris que leur anticorps était commercialement
disponible chez Millipore, mais pour l’instant non couplé à un fluorochrome, ce qui rend un
immunophénotypage par cytométrie de flux non pas impossible, mais plus complexe.

Une des limites de la cytométrie de flux est le phénotype « tout négatif ». En effet, il est
impossible de décrire une population cellulaire sur la base de plusieurs marqueurs qui ne sont pas
exprimés, comme CD3-CD21-CD4- qui indiquerait que ces cellules ne sont ni des LT CD4+ ni des
LB mais sans avoir un caractère positif, il est impossible d’affirmer à 100% que ce sont des cellules
NK, par élimination et sur la base unique de connaissances théoriques. Dans l’idéal, afin de pouvoir
identifier clairement les cellules NK canines, il faudrait confirmer leur identité par des tests
fonctionnels. En effet, les cellules NK sont douées d’un pouvoir cytotoxique puissant. De plus une
des limites de la cytométrie de flux est le phénotype « tout négatif ». Il est de fait impossible de
décrire une population cellulaire sur la base de plusieurs marqueurs qui ne sont pas exprimés,
comme CD3-CD21-CD4- qui indiquerait que ces cellules ne sont ni des LT CD4+ ni des LB mais
sans avoir un caractère positif, il est impossible d’affirmer à 100% que ce sont des cellules NK, par
élimination et sur la base unique de connaissances théoriques. Ainsi, pouvoir trier ces cellules sur
la base de leur phénotype, par un cytomètre de flux/trieur et de réaliser ensuite, avec les cellules
triées, des tests de cytotoxicité sur des cellules-cibles par exemple, ou encore une analyse du
transcriptome pourrait être envisagée. Dans ce sens, deux premières tentatives de tri cellulaire des
4 populations lymphocytaires (CD3-CD8-CD11b-/CD3-CD8+CD11b+/CD3-CD8-CD11b+/CD3-
CD8+CD11b-), ont été réalisées. Chaque population triée a été colorée au May Grunwald Giemsa
(MGG) afin de visualiser les caractéristiques morphologiques des cellules NK, notamment un
cytoplasme plutôt azurophile et des granules intracytoplasmiques bleues foncées comme décrit par
Brooks et al. (2022). Malheureusement, aucun de ces essais de tri n’a été concluant suite à des
soucis techniques intervenus à différents niveaux et n’ont donc pas été présentés dans ce manuscrit.

Page 84
Page 85
Conclusion
Si les cellules NK canines sont au centre de divers projets de recherche visant à exploiter leurs
propriétés antitumorales, il existe encore à ce jour un manque de connaissances global à leur sujet,
notamment concernant leur caractérisation ou encore leurs néoplasies. Dans ce sens un
approfondissement du premier point bénéficierait probablement à l’appréhension du second, comme
en témoigne à titre d’exemple le développement de thérapies antitumorales contre les lymphomes
et leucémies à lymphocytes B basées sur la mise au point d’anticorps monoclonaux anti-CD20 canin
et humain.
C’est dans ce but qu’a été entrepris un essai de caractérisation des cellules NK par
cytométrie de flux (méthode ayant historiquement contribué à la caractérisation des troubles
lymphoprolifératifs et à leur prise en charge adaptée (Bellesi et al., 2023; Sagedal et al., 2004)), avec
les marqueurs disponibles au Biôpole Alfort. La combinaison testée dans cette thèse
(CD3/CD8/CD11b, avec une population putative de cellules NK CD3-CD8+CD11b+) sur des PBMCs
de chiens congelés a mis en évidence une population quantitativement faible de cellules CD3-
CD8+CD11b+ (0,1% en moyenne parmi les lymphocytes) par rapport à la plus basse estimation
disponible dans la littérature canine (2,5 % établis par Gingrich et al., 2019). Si aucun effet de la
congélation de l’échantillon ou bien du sexe de l’animal n’a pu être observé sur le pourcentage des
cellules précédentes ; il apparaît que les femelles de l’échantillon détenaient un taux de cellules
CD3-CD8+CD11b+ deux fois plus important que les mâles, résultat qui nécessiterait de plus amples
investigations. D’autres marqueurs des cellules NK cités dans la littérature, ont pu être testés sur les
PBMCs, tels que CD5 et NKp46, mais les anticorps fournis, spécifiques des formes humaines de
ces protéines, n’ont pas reconnu les formes canines. De plus amples essais sont nécessaires,
notamment sur un plus grand nombre de chiens sains pour pouvoir statuer sur le pourcentage
physiologiques des cellules CD3-CD8+CD11b+, voire de déterminer une nouvelle combinaison de
marqueurs. En effet de nombreux chiens inclus dans l’étude souffraient de néoplasies dont des
syndromes lymphoprolifératifs, et de processus inflammatoires et infectieux pouvant potentiellement
influer sur les différents pourcentages retrouvés.
Ainsi, il serait nécessaire de mettre en place des caractérisations plus directes et/ou
fonctionnelles des cellules CD3-CD11b-CD8+ et CD3-CD8+CD11b+ au BioPôle Alfort (comprenant
par exemple une analyse du transcriptome, des tests de cytotoxicité, ou a minima une visualisation
de la population en question entre autres). La mise au point d’une méthode d’identification fiable
permettrait de pouvoir clairement discriminer les cellules NK canines et offrir ainsi un nouvel
immunophénotypage aux cliniciens face à des lymphomes ou leucémies à lymphocytes non-B non-
T ; en dépit d’une incidence très faible à ce jour des néoplasies provenant des cellules NK canines
(une minorité des moins de 1,8% de lymphomes/leucémies à grands lymphocytes granuleux parmi
les lymphomes qui représentent entre 7 et 24% des néoplasies canines (Jaensch et al., 2022; Kotb
et al., 2021).

Page 87
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Page 105
RÔLES DES CELLULES NATURAL KILLER CANINES ET MISE AU POINT
DE LEUR IDENTIFICATION PAR CYTOMÉTRIE DE FLUX AU BIOPOLE
ALFORT

AUTEUR : Ruben CLODION

RÉSUMÉ :
Les cellules Natural Killer (NK) canines représentent des éléments clés de la réponse immunitaire
innée au concept aujourd’hui débattu. Elles s’insèrent au sein de la classification des cellules
lymphoïdes innées et contribuent à diverses immunités au sein de l’organisme ; leur valant un intérêt
particulier dans le cadre de la mise en place de thérapies émergentes. Ces cellules sont en
revanche impliquées dans certaines pathologies de l’organisme, allant du rejet de greffe à diverses
maladies auto-immunes, voire des néoplasies des cellules NK. En l’absence d’anticorps disponibles
pour suivre les marqueurs conventionnels dans l’espèce canine, la caractérisation précise de cette
population cellulaire particulière reste à ce jour un enjeu important. La littérature récente à ce sujet
en est la preuve et un consensus n’est pas encore clairement identifié sur le phénotype des cellules
NK canines. Face à l’enjeu que représente l’identification des cellules NK, cette thèse a pour objet
de tenter de les identifier à l’aide des anticorps disponibles au BioPôle Alfort (anti-CD3, anti-CD8 et
anti-CD11b, avec une hypothèse de phénotype CD3-/CD8+/CD11b+ pour les cellules NK). Ces
marquages ont été effectués sur des cellules mononucléées du sang périphérique, à partir
d’échantillons canins disponibles au service d’immunologie du BioPôle Alfort. Les résultats obtenus
indiquent près de 0,1 % en moyenne pour les cellules de phénotype CD3-/CD8+/CD11b+ et 8,3 %
en moyenne pour les cellules CD3-/CD8+/CD11b-, sans influence de l’état de congélation des
cellules, ni du sexe des animaux pour le phénotype CD3-CD8+CD11b+. Face à ces valeurs bien en
deçà de l’estimation la plus basse disponible dans la littérature canine (2,5%, Gingrich et al., 2019),
des essais incluant d’autres anticorps ont été tentés (anti-CD5 et anti-NKp46 humains), avec une
absence de marquage lors des essais réalisés. De plus, de nombreux échantillons provenaient de
chiens atteints de processus néoplasiques dont des troubles lymphoprolifératifs, pouvant biaiser les
résultats obtenus. Le marquage étant maintenant mis au point techniquement au service
d’immunologie du BioPôle Alfort, d’autres travaux sur du sang issu de chiens sains, sont nécessaires
à l’identification précise de la nature des cellules CD3-CD8+CD11b+ et CD3-CD8+CD11b- (analyse
du transcriptome, tests de cytotoxicité, visualisation de la population en question entre autres), afin
de pouvoir offrir dans un futur proche, une possibilité de phénotyper les cellules NK canines au
cliniciens, lors de présentation de lymphome ou de leucémie, en plus des immunophénotypages
classiquement proposés.
MOTS CLÉS : CYTOMÉTRIE DE FLUX, NATURAL KILLER, LYMPHOCYTE, LYMPHOME,
IDENTIFICATION, CHIEN, BIOPOLE ALFORT
JURY :
Président : Pr Grégory JOUVION
Directrice de thèse : Dr Delphine LE ROUX
Examinateur : Dr Édouard REYES-GOMEZ
ROLES OF CANINE NATURAL KILLER CELLS AND DEVELOPMENT OF
THEIR IDENTIFICATION BY FLOW CYTOMETRY AT BIOPOLE ALFORT

AUTHOR: Ruben CLODION

SUMMARY:

Canine Natural Killer (NK) cells are key components of the innate immune response, a concept that
is currently debated. They fall under the classification of innate lymphoid cells and contribute to
various immunities within the body (antiviral, antibacterial, antiparasitic, antitumor). These properties
make them of particular interest in the development of emerging therapies. However, these cells are
also implicated in some pathologies of the body, ranging from graft rejection to various autoimmune
diseases and even NK cell neoplasms. In the absence of available antibodies for tracking
conventional markers in the canine species, the precise characterization of this specific cell
population remains an important challenge to this day. Recent literature on this topic serves as
evidence, and a consensus has not yet been clearly identified regarding the phenotype of canine NK
cells. Given the importance of identifying NK cells, this thesis aims to attempt their identification using
antibodies available at BioPôle Alfort (anti-CD3, anti-CD8, and anti-CD11b, with a hypothesis of
CD3-/CD8+/CD11b+ phenotype for NK cells). These markers were applied to peripheral blood
mononuclear cells from canine samples available at the immunology department of BioPôle Alfort.
The results obtained indicate an average of approximately 0.1% for the CD3-/CD8+/CD11b+
phenotype and an average of 8.3% for CD3-/CD8+/CD11b- cells, with no influence of cell freezing
or the animals' sex on the CD3-CD8+CD11b+ phenotype. As these values are significantly lower
than the lowest estimate available in canine literature (2.5%, Gingrich et al., 2019), further trials
involving other antibodies were attempted (anti-CD5 and anti-human NKp46), with no labeling
observed during the experiments. Moreover, many samples came from dogs with neoplastic
processes, including lymphoproliferative disorders, which could bias the results obtained. Now that
the labeling has been technically established at the immunology department of BioPôle Alfort, further
work on blood from healthy dogs is necessary to precisely identify the nature of CD3-CD8+CD11b+
and CD3-CD8+CD11b- cells (transcriptome analysis, cytotoxicity tests, visualization of the
population in question, among other analyses). This will potentially offer clinicians the ability to
phenotype canine NK cells when presented with lymphoma or leukemia cases, in addition to the
traditionally proposed immunophenotyping methods.

KEYWORDS: FLOW CYTOMETRY, NATURAL KILLER, LYMPHOCYTE, LYMPHOMA, DOG,

ALFORT BIOPOLE
JURY:
Chairperson: Pr Gregory JOUVION
Thesis Director: Dr Delphine LE ROUX
Reviewer: Dr Edouard REYES-GOMEZ