Détection et dosage de résidus d’agents

désinfectants dans les boissons et plus

particulièrement dans la bière.

Ing. C. SAUSSEZ
Dr ir N. VELINGS
ISICHt-Mons

Ce projet, réalisé pour un partenaire industriel, consiste en la mise au point

d’une méthode de détection et de quantification de sous-produits d’agents
désinfectants (prioritairement chlore et dioxyde de chlore) dans la bière. Ce
travail a été réalisé en deux parties ; une étude bibliographique des
méthodes de dosage des chlorophénols dans les eaux de boissons, et ensuite
la transposition d’une de ces méthodes au cas particulier qu’est la bière.

Mots clés : produits désinfectants, chlore, dioxyde de chlore, bière,

chlorophénols, HPLC.

This project, realized for an industrial partner, consists of the development

of a method of detection and quantification of by-products of disinfecting
agents (firstly chlorine and dioxide of chlorine) in the beer. This work was
realized in two parts ; a bibliographical study of the methods of dosage of
chlorophenols in drinking waters, and next the transposition of one of these
methods in the particular case of the beer.

Keywords : disinfecting products, chlorine, chlorine dioxide, beer,

chlorophenols, HPLC.

Revue Scientifique des Ingénieurs Industriels n°26, 2012

 194

Abréviations utilisées
CPs = Chlorophénols HS-SPME =
Headspace-Solid MonoCp =
DAD = Diode Array Phase monochlorophénols
Detector Microextraction
MS = Mass
DCP = IARC = International Spectrometry
Dichlorophénols Agency for Research
on Cancer PCP =
DL50 = Dose létale 50 Pentachlorophénols
ICPS –Inchem =
DLLME = Dispersive International program PDMS =
Liquid Liquid on chemical safety – Polydiméthylsiloxane
Microextraction Chemical Safety
Information from SBSE = Stir Bar
EC = Electrochemical Sorptive Extraction
Detection intergovernmental
organizations
SPE = Solid Phase
EC50 = Half maximal Extraction
effective INRS = Institut
concentration National de
SPME = Solid Phase
Recherche et de
Microextraction
ECD = Electron Sécurité en France
Capture Detector TCP =
L-L = Extraction
Trichlorophénols
EPA = US Liquide Liquide
Environmental TeCP =
Protection Agency LC/ MS-MS = Liquid
Tétrachlorophénols
Chromatography /
FID = Flame Mass Spectrometry – USE = Ultrasonic
Ionization Detector Mass Spectrometry Extraction
GC = Gas LPME = Liquid Phase XAD = Amberlite
Chromatography Microextraction d’échange ionique
HF-LPME = Hollow MASE = Membrane
Fiber Liquid Phase Assisted Solvent
Microextraction Extraction

HPLC = High MIP-AES =

Performance Liquid Microwave Induced
Chromatography Plasma – Atomic
Emission
Spectrometry
 195

1. Introduction
L’industrie alimentaire a pour exigence l’utilisation d’équipements
correctement nettoyés et désinfectés. L’étape de nettoyage a pour objectif
d’ôter la salissure présente sur les équipements mis au contact des aliments.
La désinfection, quant à elle, a pour objet de ramener la population
microbienne sous un seuil acceptable au regard du processus alimentaire
concerné.

Les désinfectants sont généralement des solutions aqueuses contenant un ou

plusieurs agents biocides qui sont autorisés par la législation européenne sur
les biocides, appelées BPD pour « Biocidal Product Directive ». Une liste de
molécules acceptées par le législateur européen est en cours d’élaboration et
à chaque molécule sera associé l’ensemble des applications autorisées telles
que l’industrie alimentaire, l’industrie pharmaceutique, ….

Tout naturellement, l’industrie de la boisson faisant partie intégrante de

l’industrie alimentaire utilise des solutions désinfectantes lors des étapes de
nettoyage et désinfection de leurs équipements tels que cuves, conduites ou
encore soutireuses.

En Belgique, la brasserie est l’une des industries de la boisson la mieux

implantée et fait très logiquement appel aux désinfectants depuis ses débuts
car, nous pouvons imaginer aisément les dégâts occasionnés par la présence
d’un germe non voulu lors de la fermentation du moût, de la garde
(maturation) de la jeune bière voire même après la mise en bouteille.
Certaines bactéries Gram positives ainsi que quelques levures sauvages
peuvent être responsables de réels désastres en brasserie.

Les molécules désinfectantes couramment utilisées en industrie brassicole

sont l’acide monobromoacétique, les acides gras à courtes chaînes
(octanoïque et décanoïque), le mélange acide peracétique et eau oxygénée,
les oxydants halogénés tels que acide hypochloreux et dioxyde de chlore et
les ammoniums quaternaires.

En plus de la BPD, l’industrie alimentaire est soumise à une analyse des

risques et une étude des points critiques (HACCP). Cette analyse tend à
réduire les risques de contamination physique (morceaux de verre,
 196

limailles), chimique (pesticides, désinfectants, …) et microbiologique

(pathogènes, moisissures, …) des aliments.

Dans ce contexte, à la demande d’un producteur de produits de nettoyage et

désinfectant pour l’industrie de la boisson implanté en Wallonie, SOPURA
SA, le laboratoire de chimie analytique de l’ISICHt (Institut Supérieur
Industriel Catholique du Hainaut) s’est penché sur la détection et le dosage
de résidus d’agents désinfectants principalement dans la bière.

Très vite, une distinction entre deux grandes familles de molécules

désinfectantes a dû être réalisée ; les molécules relativement stables qui
devraient se retrouver comme telles dans le produit fini (acide
monobromoacétique, acides gras, ammonium quaternaires, …) et celles dont
le mode d’action est basé sur une oxydation et qui dès lors mèneront à la
formation de sous-produits (acide peracétique et eau oxygénée, acide
hypochloreux, dioxyde de chlore, …).

Le présent article ne portera que sur la détection et le dosage de sous-

produits provenant de l’utilisation de l’acide hypochloreux ou du dioxyde de
chlore. En effet, SOPURA SA souhaitait, dans un premier temps, se
focaliser essentiellement sur les dérivés d’une contamination au chlore ainsi
que sur l’acide monobromoacétique.

2. Revue bibliographique
2.1 Identification des sous produits

Les sous-produits formés lors d’une contamination de l’eau par un agent

désinfectant chloré ont été largement étudiés. Par contre, en ce qui concerne
la bière, la littérature offre peu d’éléments. Il est donc nécessaire de
s’inspirer de ce qui a été observé dans l’eau pour imaginer quels sous-
produits seront potentiellement formés dans la bière.
Les sous-produits connus de la désinfection aux agents oxydants chlorés de
l’eau sont [5] : les trihalométhanes, les acides haloacétiques, les
haloacétonitriles, les halocétones, les chlorophénols, les hydrates de chloral,
les chloropicrines.
 197

Il nous est paru opportun de sélectionner les chlorophénols comme sous-

produits cibles car ils sont connus pour apporter un faux goût à la bière. Les
chlorophénols ont donc un double intérêt dans le cas de la détection d’une
contamination par le chlore de la bière, à savoir :

• Détecter une contamination au chlore de la bière ;

• Prévenir l’apparition de faux goûts dans la bière finie.

La formation des chlorophénols serait due à la réaction entre le chlore actif

libre du produit de désinfection et les phénols présents naturellement dans la
bière.
Dans l’eau, la vitesse de chloration des phénols varie avec le pH. Ceci
s’explique par le fait que la vitesse est proportionnelle à la production
d’acide hypochloreux et à la concentration en ions phénolates [4].
Il est à noter qu’une fraction appréciable de la réaction entre le chlore
aqueux et le dichlorophénol procède par l’oxydation directe plutôt que par la
substitution en trichlorophénols suivie par une oxydation. La nature exacte
de ces produits d’oxydation est de faible intérêt pour nous puisqu’ils ne
contribuent pas aux propriétés organoleptiques [4].
Les différentes sources potentielles de chlorophénols dans la bière sont [1] :

• Réaction entre le chlore et les phénols contenus dans la bière ;

• Les chlorophénols présents dans l’eau de brassage elle-même traitée au

chlore ou au dioxyde de chlore ;

• La présence de pentachlorophénols dans les bois traités ;

• La présence de chlorophénols dans le packaging.

 198

2.2 Généralités concernant les chlorophénols

Les chlorophénols sont des composés organiques dans lesquels un ou

plusieurs atomes d’hydrogène du noyau phénolique sont remplacés par des
atomes de chlore. On dénombre 19 chlorophénols :
Les monochlorophénols (CP) : 2-CP ; 3-CP et 4-CP
Les dichlorophénols (DCP) : 2,3-DCP ; 2,4-DCP ; 2,5-DCP ; 2,6-DCP ; 3,4-
DCP et 3,5-DCP
Les trichlorophénols (TCP) : 2,3,4-TCP ; 2,3,5-TCP ; 2,3,6-TCP ; 2,4,5-
TCP ; 2,4,6-TCP et 3,4,5-TCP
Les tétrachlorophénols (TeCP) : 2,3,4,5-TeCP ; 2,3,4,6-TeCP et 2,3,5,6-
TeCP
Le pentachlorophénol = PCP
Tous les chlorophénols sont solides à température ambiante excepté les 2-
chlorophénol, 4-chlorophénol et 3-chlorophénol qui sont des liquides. Les
mono et dichlorophénols sont les plus volatils.
Le tableau n°1 résume les caractéristiques principales de 4 chlorophénols.
Le 2-CP, le 4-CP et le 2,4-DCP sont probablement trois des chlorophénols
les plus rapidement formés lors d’une contamination au chlore de la bière.
 199

Caractéristiques 2-CP 4-CP 2,4-DCP 2,4,5-TCP

Synonymes 2-CP, 2 chloro- 4-CP, 4-chloro- 2,4-DCP, 2,4- 2,4,5-TCP
1- 1-hydroxy- dichlorohydro
hydroxybenzen benzene, 4- xy-benzene
e, 2 hydroxy- hydroxy-
chlorobenzene, chlorobenzene,
o-chlorophénol, p-chlorophénol
Formule C6H5ClO C6H5ClO C6H4Cl2O C6H3Cl3O
chimique
Numéro CAS1 95-57-8 106-48-9 120-83-2 95-95-4
Poids 128,56 g/mol 128,56 g/mol 163,00 g/mol 197,46 g/mol
moléculaire
Couleur Orange clair Blanc Blanc Gris
Etat physique Liquide Liquide Solide Solide
Point de fusion 9,3°C 43,2 à 43,7°C 45°C 67°C
Point 174,9°C à 760 220°C 210°C 235°C
d’ébullition mmHg
Densité 1,2634 1,2238 1,383 1,678
Odeur Odeur Odeur médicale Odeur Forte odeur
médicale, médicale forte phénolique
désagréable
Seuil d’odeur :
Eau 0, 33µg/L 0, 33µg/L 0,35 µg/L 11 µg/L
Air 0,0189 mg/m3 0,0189 mg/m3 1,40 mg/m3 Pas de
données
Solubilité :
Eau à 25°C 20000 ppm 27000 ppm 4500 ppm 948 ppm
Solvant acétone, alcool, alcool, glycérol, Ethyl alcool, Acétone,
organique benzène éther, tétrachlorure benzène,
Et autre solvant hydroxyde de chloroforme, de carbone, tétrachlorure
sodium huile volatile ou éthyl éther, de carbone,
non volatile, benzène, éther, alcool
benzène chloroforme dénaturé,
méthanol,
toluène
pKa 8,49 8,85 7,68 7,43
Pression de
vapeur (à 25°C) : 0,99 mmHg 0,23 mmHg 0,14 mmHg 0,05 mmHg
Liquide 0,99 mmHg 0,15 mmHg 0,09 mmHg 0,02 mmHg
solide
Point éclair 64°C 121°C 114°C Pas de
données
1
: chemical abstract service
Tableau n°1. Identité chimique et propriétés physico-chimiques des
chlorophénols
 200

L’ensemble de ces caractéristiques nous sera utile lors du développement de

notre méthode d’analyse.
Nous utiliserons notamment les données concernant la solubilité.
De nombreuses utilisations des chlorophénols sont indiquées dans la
littérature :

• Formes polychlorées utilisées comme agents de préservation (bois,

peinture, cuir, …), fongicides, pesticides, désinfectants … ;
• Composés moins chlorés entrant dans la composition de produits
pharmaceutiques, de colorants, de dérivés de chlorophénols.

2.3 Toxicité des chlorophénols

Tout d’abord, notons qu’il n’existe pas d’études connues sur la toxicité d’un
mélange de chlorophénols.
Les études toxicologiques réalisées concernent essentiellement des
travailleurs exposés à de hautes concentrations en chlorophénols (par
exemple dans une scierie). Ces études ne sont donc pas tout à fait
transposables à la présence de traces de ces molécules dans la bière.
La toxicité des chlorophénols dépend du pH, du nombre d’atomes de chlore
et de leur position dans la molécule. La plupart des chlorophénols sont
classés par l’US EPA (United States Environmental Protection Agency) et
par l’Union Européenne comme des polluants prioritaires. La limite
standard de concentration des chlorophénols totaux dans l’eau de boisson
est de 0,5 µg/l. Chaque phénol pris séparément ne peut excéder 0,1 µg/l.
Les chlorophénols sont rapidement absorbés par ingestion, par inhalation ou
par contact avec la peau. Ils s’accumulent surtout dans le foie et les reins des
animaux de laboratoire et, à un degré moindre, dans le cerveau, les muscles
et les tissus adipeux. S’ils s’accumulent plus dans les reins et dans le foie
c’est parce que ceux-ci participent à la détoxification et à l’élimination de
composés de ce type. Ils sont fixés par les glucuronides et les sulfates dans
le foie. Ces liaisons ainsi que la déchloration et la méthylation concourent à
la détoxification des chlorophénols (Informations obtenues sur le site
« Santé Canada »).
 201

Le 2,3,5,6-tétrachlorophénol est métabolisé en une substance plus toxique,

la tétrachloro-p-hydroquinone. Cette substance est capable de se lier de
manière covalente aux protéines impliquées dans le métabolisme de l’ADN.
Les chlorophénols sont éliminés soit à l’état libre soit en s’associant avec
d’autres molécules sous forme de composés principalement dans l’urine
(pour les tri- et tétra – CPs, il y a association à des sulfates), et une
proportion beaucoup plus faible est éliminée dans les matières fécales. La
vitesse d’élimination est plus rapide pour certains tissus, elle peut aller d’un
à plusieurs jours. Les monochlorophénols ne restent pas longtemps dans le
corps. Ils sont métabolisés en produits moins toxiques et se retrouvent dans
les urines après 24 heures. Les di- , tri- et tétra-chlorophénols quittent
également le corps via les urines mais ils peuvent y séjourner plusieurs
jours.
La plupart des chlorophénols vont avoir le même effet qualitativement mais
pas quantitativement. Chez les rats exposés à des chlorophénols peu chlorés,
la dose létale entraînant la mort chez 50% de la population testée (LD50) va
de 130 à 4000 mg/kg de masse corporelle.
Lorsque les composés sont administrés oralement ou par injection sous-
cutanée, leur toxicité évolue de la manière suivante : TeCP > monoCP >
DCP > TCP. (Informations provenant de IPCS Inchem)
Si l’on considère une exposition aux CPs hors d’un cadre de travail (tel que
dans une scierie), de faibles niveaux de CPs sont trouvés dans le sérum, les
urines et les tissus adipeux de la population générale (Informations
provenant du site de l’IPCS Inchem).
Un homme lambda qui a comme sources principales de contamination l’eau
de boisson et la nourriture ne subirait donc pas l’effet toxique des CPs (trop
petites doses).
Les CPs ont une lipophilicité, affinité d’une substance pour les solvants
apolaires tels que les lipides, moyennement haute. Ce sont des acides
organiques faibles avec une valeur de pKa allant de 5,4 à 8,9 (cfr tableau
N°1). En conséquence, l’absorption peut être favorisée dans l’estomac et les
intestins. L’absorption à travers le tractus gastro-intestinal se fait par simple
diffusion et est aussi rapide que complète.
 202

Le principal mode d’action des CPs est l’inhibition de la phosphorylation

oxydative dans les mitochondries. L’intensité de cette inhibition dépend du
degré de chloration des CPs, plus il y a de molécules de chlore, plus
l’inhibition est importante. Certains CPs sont également capables de se lier
aux protéines mitochondriales (Informations provenant du site de l’ICPS
Inchem).
Le 2,4-DCP et le 2,4,6-TCP s’attachent fortement aux globulines et à
l’albumine.
Chez l’homme, l’unique étude publiée estime une dose létale orale
minimum pour tous les chlorophénols de 29 mg/kg de masse corporelle
c’est-à-dire environ deux grammes pour une personne moyenne (de 68 à
103 kg) [6].
La IARC (International Agency for Research on Cancer) a classé les
polychlorophénols dans la catégorie 2B c’est-à-dire potentiellement
cancérogènes pour l’homme.
Nous pouvons donc considérer les chlorophénols comme des substances
toxiques. Cependant, la modification organoleptique qu’ils confèrent à la
bière empêcherait le consommateur d’en ingérer de trop grandes quantités
[1].
Il faut bien comprendre que la dose de chlorophénols conduisant à une
modification des propriétés organoleptiques de la bière est de loin inférieure
à celle présentant une toxicité quelconque pour la bière.

2.4 Influence des chlorophénols sur les propriétés

organoleptiques de la bière

Les chlorophénols sont bien connus pour apporter un goût phénolique,

pharmaceutique ou encore médicamenteux à la bière.

Le seuil de perception des chlorophénols est égal ou inférieur à 1 µg/l. De

très petites quantités de cette substance altèrent la flaveur de la bière [1].
Le tableau n°2 reprend les informations utiles au point de vue de l’odeur
développée par quelques types particuliers de chlorophénols mais également
leur niveau de perception olfactive et gustative [19].
 203

Type de Sensation olfative Niveau de perception Niveau de

CPs olfactif ppb ou µg/l perception
gustatif ppb
ou µg/l
2-CP Iode/médical 0,36 - 2 0,1 -0,14
4-CP Iode/médical 20 – 60 39
2,4-DCP Iode/médical 0,4 – 29 0,3 – 0,98
2,6-DCP Iode/médical 3,5 0,0062 – 0,2
2,4,6-TCP Iode/médical 300 2 - > 12
PCP Phénolique 23 - 1600 8 – 30
Tableau n°2. Informations concernant l’influence de différents CPs sur le
profil gustatif et olfactif.

2.5 Techniques analytiques

Il existe peu d’études concernent le dosage des chlorophénols dans la bière.
En effet, seules deux références traitant le sujet ont été relevées [21] [10].

Par contre, les chlorophénols ont largement été étudiés dans l’eau de
consommation, les sédiments, le vin et les bouchons de liège car ils sont
considérés comme des polluants prioritaires. Par ailleurs, ils sont considérés
comme responsables de l’odeur de « moisi » ou de « goût de bouchon » du
vin.
Les méthodes développées pour ces matrices sont nombreuses. Les
différents protocoles distinguent les étapes d’extraction, de concentration,
de dérivatisation et de séparation/détection. Quelques exemples sont
succinctement présentés dans le tableau ci-dessous.
Le tableau n°3, ci-dessous synthétise les informations essentielles des
méthodes recensées dans la littérature pour le vin. Le tableau 4 résume les
deux méthodes d’analyse des chlorophénols répertoriées dans la littérature
pour la bière.
 204

Composés Extraction Dérivatisation Séparation/ LOD Référence

analysés Détection
L-L Anhydride acétique GC/ECD Nicholls C.R., 2004
GC/MS
2,4,6-TCP SPE (OASIS Anhydride acétique GC/MS-MS 0,5 ng/l et 2,4 ng/l Martinez-Urunuela
2,3,4,6-TeCP HLB) (TCA) A., 2005
PCP
2,4,6-TCP SPE (OASIS Tests avec diazométhane, GC/ECD 0,8 à 1,5 ng/l Insa S., 2004
2,3,4,6-TeCP HLB) pentafluorobenzyl
PCP bromide, méthyl iodide,
anhydride acétique
2,4,6-TCP SPE (OASIS Tests avec diazométhane, GC/ECD 0,8 à 2,5 ng/l Insa S., 2006
2,3,4,6-TeCP HLB) pentafluorobenzyl
PCP bromide, méthyl iodide,
anhydride acétique
2,4,6-TCP DLLME Anhydride acétique GC/MS 0,005 à Campillo N., 2010
PCP 0,063 ng/l
2,6-DCP (pour échantillon de
2,3,4,6-Te CP vin rouge)
PCP HS-SPE (Oasis Pentafluorobenzoyl GC/ECD 0,003 à 0,020 µg/l Martinez-Urunuela,
2,3,4,6-TeCP HLB) chloride ou anhydride 2004
2,4,6-TCP acétique
TCP SPE (C18) GC/MS 0,7 à 4 ng/l Soleas J.G., 2002
TCP DLLME Anhydride acétique GC/ECD 2,2 à 5,3 ng/l Pizarro C., 2010
TeCP
PCP
2,4,6-TCP HS-SPME Anhydride acétique GC/ECD 0,58 à 0,93 ng/l Insa S., 2007
2,3,4,5-TeCP (PDMS)
PCP
2,4,6-TCP SBSE (PDMS) GC/MS 7,56 à 61,56 pg/l Zalacain A., 2004
2,3,4,5-TeCP dans le vin rouge
PCP
2,4,6-TCP SBSE (PDMS) GC/MS Jusqu’à 23,03 ng/g Callejon R.M., 2007
2,3,4,6-TeCP pour le 2,3,4,6-
PCP TeCP

Tableau n°3. Méthodes d’extraction et d’analyse de CPs sur vin (rouge ou

blanc) et bouchons de liège
L’extraction est réalisée sur phase solide, par « solid phase
microextraction » SPME ou plus récemment par « stir bar sorptive
extraction » SBSE. Certaines techniques telles que la « dispersive liquid
liquid microextraction » DLLME sont également envisagées mais restent
des cas plus isolés. Dans le vin, toutes les méthodes font appel à une
détection par chromatographie gazeuse couplée avec une spectrométrie de
masse ou un ECD. Ces méthodes semblent particulièrement adaptées à la
détection de traces dans des matrices complexes comme le vin.
 205

Composés Extraction Dérivatisation Séparation/ LOD Réf.

détectés Détection

CPs mais Distillation Réaction Moins West

pas plus de et ampoule à colorimétrique d’1 D.B.,
précisions décanter avec 4- µ/l 1965
amynoantipyrine
4-CP Distillation RP-HPLC µg/l Jones
et puis (isochratique) R.D.,
SPE 1988
(cyclohexyl)

Tableau n°4. Méthodes d’extraction et d’analyse de CPs sur bière finie

Seulement deux articles concernant la détection des chlorophénols dans la

bière ont été trouvés [21] [10].
Le premier implique une réaction colorimétrique. Les auteurs emploient la
4-aminoantipyrine comme indicateur coloré après distillation de la bière. Ils
ajoutent une quantité standard de chlorophénol et par l’intermédiaire d’un
calcul retrouve la quantité de chlorophénol initiale.
Dans le second article [10], les auteurs développent une analyse des phénols
dans la bière après distillation. 500 ml de bière sont ajustés à pH 5,2 pour
minimiser la codistillation ultérieure des acides. Les 500 ml sont transférés
dans un ballon (d’un litre) contenant des pierres ponces. Un condenseur (30
cm) avec une double gaine est connecté et la distillation à la vapeur peut
commencer. En début de distillation, il faut faire attention à l’excès de
mousse. Après la disparition de la mousse (après 30 minutes), il faut
chauffer vigoureusement.
La distillation est poursuivie jusqu’à atteindre un volume de 250 ml. Le
distillat obtenu est clair et dépourvu de coloration brune. Cinquante ml du
distillat sont ajustés à pH 6 avec de l’acide sulfurique (2M) et du chlorure de
sodium (12,5 gr) est ajouté. Le distillat ainsi traité est extrait avec une
cartouche Bondelut (SPE). Cette cartouche est préalablement conditionnée
avec 10 ml de méthanol suivis par 30 ml d’eau.
Une solution de standard interne de 2,4-DCP est préparée dans le méthanol
(16 mg/l). 50 µl de ce standard sont ajoutés au distillat traité avant analyse.
 206

Pour l’analyse HPLC, l’éluant est composé de méthanol, acétonitrile,

tampon acétate (pH 6) contenant du perchlorate de sodium en proportion
38 :8 :56. La vitesse du flux est de 1,5 ml/min et le détecteur
électrochimique est réglé à + 0,9 V. Ils obtiennent un bon taux de
récupération pour le 4-chlorophénols mais passent ensuite à l’analyse
d’autres composés. L’article ne donne que très peu de précisions sur le
temps de rétention du 4-chlorophénol et sur ce qu’il en est des autres
chlorophénols.
Les publications discutant de la détection des chlorophénols dans la bière ne
paraissent pas adaptées à la détection de traces.
La suite du présent travail présentera la méthode développée par le
laboratoire de chimie analytique de l’ISICHt. Nous avions comme
contrainte l’utilisation exclusive de l’HPLC. En effet, la société SOPURA
SA possédant déjà ce matériel, elle désirait que nous développions une
méthode utilisant l’HPLC.

3. Matériel et méthode
Comme il a été précisé dans la revue bibliographique, la mise en évidence
des chlorophénols dans la bière demande trois étapes principales :

- La préparation de l’échantillon par extraction en phase solide

- La séparation des différents constituants par chromatographie en
phase liquide
- La détection dans l’UV
L’extraction en phase solide est une technique préparative largement
utilisée. Son principe est simple, elle se base sur l’affinité entre une phase
stationnaire contenue dans une cartouche (ayant la forme d’une seringue) et
un composé d’intérêts présent dans un liquide et qui va passer à travers cette
phase stationnaire. Les composés d’intérêts sont retenus sur cette phase
stationnaire tandis que les autres percolent à travers la cartouche sans s’y
adsorber. On élimine donc ainsi une grande partie des substances
indésirables. Il existe une grande variété de phases stationnaires des plus
générales aux plus spécifiques. Trois grandes catégories sont à retenir :
l’extraction en phase normale, en phase inverse ou par échange d’ions. Cette
technique nous semblait adaptée à un travail de routine. De plus, elle utilise
 207

très peu de solvants (contrairement à l’extraction liquide/liquide) ce qui est

un bon point écologiquement parlant.
Cette étape préparative est déterminante, elle est une des principales sources
d’erreurs entachant le résultat de l’analyse. Elle aura une influence sur la
limite de détection, la reproductibilité et la répétabilité ainsi que sur la
fiabilité.
Pour la percolation des différents solvants, nous avons eu recours à un
« manifold » qui nous permettait d’ajuster correctement le vide et d’obtenir
un débit d’élution des solvants plus ou moins constant.
Le choix de la colonne dépend du volume de l’échantillon à traiter, de sa
concentration en analytes et du type d’échanges recherchés. L’adsorbant
sélectionné doit bien entendu avoir une excellente affinité pour le composé
cible et présenter un minimum d’affinités pour les interférents de la matrice,
dans notre cas, la bière de type « Pils ».
Le choix s’est porté sur une cartouche SPE Chromabond C18 octadecyl
silice modifiée avec un diamètre de pores de 60 nanomètres et une taille
moyenne des particules de 45 µm de chez Macherey Nagel (réf 739 004).
L’extraction en phase solide comporte elle-même plusieurs étapes. D’abord
le conditionnement de la cartouche, il s’agit de l’activer et d’en éliminer les
substances contaminantes tout en favorisant les échanges avec l’adsorbant.
Cette étape est souvent réalisée au moyen d’un solvant organique. Dans
notre cas, en référence à l’article sur base duquel nous avions décidé de
travailler, nous n’appliquons pas d’étape de conditionnement de la
cartouche [11].
La deuxième étape consiste en l’application de l’échantillon sur la
cartouche, qui sera dans le présent cas, la première étape. Des échantillons
de 50 ml de bière préalablement contaminée par une quantité définie de
chlorophénol ont été préparés. Ces échantillons ont été ajustés à un pH de
8,5 au moyen d’ammoniac à 28%, car il est établi qu’à ce pH la sorption est
maximale. L’ajustement de pH provoque une précipitation des protéines et
des polyphénols de la bière. Ce précipité risque de boucher les cartouches
d’extraction, il nous est donc apparu judicieux de centrifuger l’échantillon
avant de l’appliquer sur la cartouche. Avant l’ajustement de pH et
l’extraction, nous ajoutons également un standard interne dans notre
solution. Le choix d’employer le pentachlorophénol, le 2,5-dichlorophénol,
 208

qui est moins formé naturellement, ou le 4-bromophénol s’est avéré

possible. Le 4-bromophénol a été sélectionné car il offre un pic
caractéristique bien visible à un temps de rétention d’environ 16 minutes,
sans interférer avec les temps de rétention des autres chlorophénols, excepté
le 2,6-DCP, et ce, sans alourdir inutilement le chromatogramme. De plus,
les chances de rencontrer des bières contaminées en bromophénols sont très
faibles voire inexistantes. Afin d’obtenir une meilleure résolution, il faut
d’après l’article de référence ajouter un ammonium quaternaire,
nous employons le chlorure de didécyldiméthylammonium à raison de
0,25 mM .
Le vide est ajusté de manière à ce que l’échantillon puisse passer à travers la
cartouche à un débit d’environ 2 ml/min.
Aucun séchage de la cartouche n’est nécessaire. Après passage de
l’échantillon, nous réalisons un lavage de la cartouche avec 1 ml d’eau
déminéralisée afin d’éliminer une partie des constituants qui auraient été
adsorbés par la cartouche mais qui n’auraient aucun intérêt pour nous. La
dernière étape est celle de l’élution de l’échantillon. Elle consiste en théorie
à récupérer 100% des chlorophénols présents au départ dans la bière.
Le solvant ou le mélange de solvants employé doit avoir le maximum
d’interactions avec les analytes et le moins possible avec les autres
interférents qui peuvent rester adsorbés. Son volume doit être faible afin
d’obtenir une pré-concentration maximum. Dans notre cas, 5 ml de
méthanol sont utilisés [11].
Une étape de concentration supplémentaire aurait pu être envisagée, mais
les chlorophénols sont des constituants semi-volatils, il est dès lors difficile
d’utiliser des techniques de concentration traditionnelles tel que
l’évaporation par « rotavapor ».
Notre expérience a en effet indiqué qu’ils quittaient bel et bien la solution en
employant un appareil de ce type.
Une fois l’échantillon préparé, il reste à aborder les étapes de séparation et
de détection. Pour la chromatographie en phase liquide nous nous sommes
également directement inspirés de l’article qui a servi de base à la mise au
point [11]. Nous avons donc opté pour une colonne « GraceSmart RP 18 5
µ » de 150 mm x 4,6 mm et pour un mode d’élution par gradient.
 209

La chaîne HPLC utilisée dans le cadre de ce travail est de marque Merch

Hitachi. Elle est constituée d’une interface de type D-7000, d’un détecteur
UV L-7400 et d’un système de pompe L-7100.
Le gradient est réalisé entre du méthanol pour HPLC et une solution de
phosphate ajustée à pH 3,5.
De 0 à 3,5 minutes : méthanol 35% et tampon phosphate 10 mM 65%
De 3,5 à 27 minutes : gradient croissant jusqu’à 100 % en méthanol
De 27 à 32 minutes : 100 % méthanol
De 32 à 62 minutes : méthanol 35 % et tampon phosphate 10 mM 65%
(équilibration de la colonne)
Un volume d’injection de 30 microlitres, un débit de 0,6 ml/min ont été
sélectionnés. La détection a été réalisée à deux longueurs d’onde proches :
280 et 284 nm.
 210

4. Résultats
Dans un premier temps, la détermination des temps de rétention de chacun
des mono- et dichlorophénols sélectionnés a été réalisée. Pour cela, des
échantillons de 50 ml de bière ont été dopés d’une concentration
suffisamment importante en chlorophénol pour que la détermination du
temps de rétention ne laisse aucun doute.
Ci-après un exemple de chromatogramme obtenu sachant que l’ensemble de
la procédure a été appliquée à savoir : préparation de l’échantillon
(ajustement du pH), extraction en phase solide sur cartouche, séparation par
chromatographie en phase liquide haute pression et détection UV. Il s’agit
du chromatogramme du 2,4-DCP dont la concentration dans l’échantillon de
départ était de 1.10-1 g/l. Le chromatogramme a été enregistré à 280 nm
dans cet exemple. Le chromatogramme représente l’intensité d’absorbance
en fonction du temps de rétention :

Figure 1. Chromatogramme du 2,4-DCP à 280 nm. Concentration de

l’échantillon de départ 1.10-1 g/l.

Le pic caractéristique du 2,4-DCP à 20,60 minutes est bien visible ainsi que
le pic caractéristique du standard interne à 17, 60 minutes. Les autres pics
présents sont ceux provenant des constituants de la bière.
Ci-dessous, dans le tableau n°5, sont repris l’ensemble des temps de
rétention pour les mono- et dichlorophénols sélectionnés à une longueur
d’onde de 280 nm qui est un bon compromis entre les maxima d’absorption
 211

des différents chlorophénols. Toutefois, pour le 2,4-DCP une longueur

d’onde de 284 nm sera sélectionnée car elle permet l’obtention de meilleurs
résultats.

RT (280) Aire (280)

2-CP 13.07 7660458

3-CP 14.92 6799682

4-CP 14.40 7602726

2,4-DCP 19.34 8067948

2,3-DCP 17.91 2586402

2,5-DCP 18.52 2123817

2,6-DCP 15.30 505373

Tableau n°5. Détermination des temps de rétention des différents

chlorophénols.
Ces temps de rétention dépendent de la température de travail et de la
colonne utilisée, ils sont caractéristiques d’un composé. En possédant cette
information, il sera possible de déterminer la présence de chlorophénol dans
la bière : il suffira de vérifier si le chromatogramme présente un pic au
temps de rétention caractéristique d’un ou plusieurs chlorophénols.
Pour chacun des chlorophénols une droite de calibration a été réalisée.
Celle-ci permet également d’avoir une première idée de la limite de
détection pour chacun d’entre eux. Le protocole décrit dans « matériel et
méthode » a été appliqué.
 212

Quatre échantillons de concentrations différentes ont été préparés afin de

réaliser ces droites de calibration :

- Pour les monochlorophénols et pour le 2,4-dichlorophénols : 1.10-1

g/l ; 5.10-2 g/l ; 1.10-3 g/l et 1.10-4 g/l dans 50 ml de bière au départ.
Echantillons préparés par dilution à partir d’une solution mère à 1 g/l
- Pour les autres dichlorophénols : 1.10-2 g/l ; 5.10-3 g/l ; 1.10-3 g/l et
1.10-4 g/l dans 50 ml de bière au départ. Echantillons préparés à
partir d’une solution mère de 0,1 g/l (limite de solubilité de ces
chlorophénols ne permettent pas de commencer à 1 g/l)

Les tableaux n°6 à 11 ci-dessous reprennent, à chaque fois, les

concentrations de départ dans la bière des échantillons, les quantités de
chlorophénol qui sont réellement injectées sur la colonne de
chromatographie et enfin les aires réduites. Il est à noter que l’aire réduite
est le rapport entre l’aire obtenue pour le pic de chlorophénol concerné et
l’aire du pic du standard interne, le 4-bromophénol.

Pour chaque courbe de calibration, une figure permettra de visualiser les

résultats obtenus dont les équations des courbes et les coefficients de
régression linéaire ou non.

Concentration de Quantité sur la Aire réduite à

l’échantillon de départ (g/l) colonne (g) 280 nm

1.10-1 g/l 3.10-5 3,78

5.10-2 g/l 1,5.10-5 1,91

1.10-3 g/l 3.10-7 0,46

1.10-4 g/l 3.10-8 0,39

Tableau n°6. Résultats obtenus pour le 2-chlorophénol :

 213

Aire réduite du 2-CP en fonction de la quantité sur la

colonne
4
3,5 y = 111,36x + 0,373
R² = 0,9967
3
Aire réduite

2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 2. Représentation de l’aire réduite du 2-CP en fonction de

la quantité sur la colonne en mg.
Une régression linéaire présente une droite dont le R2 de 0,9967 confirme la
pertinence du choix linéaire de cette régression.

Il est possible d’estimer une limite de détection de la méthode ; le pic

obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est encore plus de
20 fois supérieur au bruit de fond de la méthode.

Concentration de Quantité sur la Aire réduite à

l’échantillon de départ (g/l) colonne (g) 280 nm

1.10-1 g/l 3.10-5 6,67

5.10-2 g/l 1,5.10-5 3,49

1.10-3 g/l 3.10-7 0,59

1.10-4 g/l 3.10-8 0,35

Tableau n°7. Résultats obtenus pour le 3-chlorophénol :

 214

Aire réduite du 3-CP en fonction de sa quantité sur la

colonne
8
A 280 nm
7
y = 207473x + 0,4238
6
R² = 0,99925
Aire réduite

5
4
3
2
1
0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 3. Représentation de l’aire réduite du 3-CP en fonction de

la quantité sur la colonne en mg.
Une régression linéaire présente une droite dont le R2 de 0,9993 confirme la
pertinence du choix linéaire de cette régression.
A nouveau, il est possible d’estimer une limite de détection de la méthode ;
le pic obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est encore
plus de 20 fois supérieur au bruit de fond de la méthode.

Concentration de Quantité sur la Aire réduite à

l’échantillon de départ colonne (g) 280 nm
(g/l)
1.10-1 g/l 3.10-5 5,27
-2 -5
5.10 g/l 1,5.10 2,88

1.10-3 g/l 3.10-7 0,34

1.10-4 g/l 3.10-8 0,24

Tableau n°8. Résultats pour le 4-chlorophénol
 215

Aire réduite du 4-CP en fonction de sa quantité sur la

colonne
6
5
Aire réduite

4
3
y = 167613x + 0,283
2
R² = 0,99936
1
0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 4. Représentation de l’aire réduite du 4-CP en fonction de la

quantité sur la colonne en mg.
Une régression linéaire présente une droite dont le R2 de 0,99936 confirme
la pertinence du choix linéaire de cette régression.

Une fois de plus, il est possible d’estimer une limite de détection de la

méthode ; le pic obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est
encore plus de 20 fois supérieur au bruit de fond de la méthode.
Concentration de Quantité sur la Aire réduite à
l’échantillon de départ colonne (g) 280 nm
(g/l)

1.10-2 g/l 3.10-6 0,95

5.10-3 g/l 1,5.10-6 0,75

1.10-3 g/l 3.10-7 0,27

1.10-4 g/l 3.10-8 0,023

Tableau n°9. Résultats obtenus pour le 2,3-dichlorophénol :

 216

Aire réduite du 2,3-DCP en fonction de sa quantité

sur la colonne
1,2
y = -121459x2 + 667,94x + 0,0361
1
R² = 0,994
0,8
Aire réduite

0,6

0,4

0,2

0
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 5. Représentation de l’aire réduite du 2,3-DCP en fonction de la

quantité sur la colonne en mg.
Dans ce cas, la régression linéaire ne donne pas de résultats satisfaisants. La courbe
de calibration est une courbe polynomiale du second degré qui présente un R2
satisfaisant de 0,994.
Encore une fois, il est possible d’estimer une limite de détection de la méthode ; le
pic obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est encore plus de 20
fois supérieur au bruit de fond de la méthode.
 217

Concentration de Quantité sur la Aire réduite à

l’échantillon de départ colonne (g) 284 nm
(g/l)

1.10-1 g/l 3.10-5 5,27

5.10-2 g/l 1,5.10-5 2,88

1.10-3 g/l 3.10-7 0,34

1.10-4 g/l 3.10-8 0,24

Tableau n°10. Résultats pour le 2,4-dichlorophénol :

Aire réduite du 2,4-DCP en fonction de la quantité sur la colonne

(mg)
6
y = 167,61x + 0,283
R² = 0,9994
5

4
Aire réduite

0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 6. Représentation de l’aire réduite du 2,4-DCP en fonction de la

quantité sur la colonne en mg.
Une régression linéaire présente une droite dont le R2 de 0,9994 confirme la
pertinence du choix linéaire de cette régression.
 218

Une fois de plus, il est possible d’estimer une limite de détection de la

méthode ; le pic obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est
encore plus de 20 fois supérieur au bruit de fond de la méthode.

Concentration de Quantité sur la Aire réduite à 280

l’échantillon de départ (g/l) colonne (g) nm

1.10-2 g/l 3.10-6 0,53

5.10-3 g/l 1,5.10-6 0,43

1.10-3 g/l 3.10-7 0,19

1.10-4 g/l 3.10-8 0,17

Tableau n°11. Résultats pour le 2,5-dichlorophénol :

Aire réduite du 2,5-DCP en fonction de sa quantité

sur la colonne
0,6

0,5

0,4
Aire réduite

0,3
y = -37195x2 + 240,46x + 0,1451
0,2
R² = 0,99
0,1

0
0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035
Quantité sur la colonne (mg)

Figure 7. Représentation de l’aire réduite du 2,5-DCP en fonction de

la quantité sur la colonne en mg.
 219

A nouveau, dans le cas présent, la régression linéaire ne donne pas de

résultats satisfaisants. La courbe de calibration est une courbe polynomiale
du second degré qui présente un R2 satisfaisant de 0,99.

Encore une fois, il est possible d’estimer une limite de détection de la

méthode ; le pic obtenu pour l’échantillon le moins concentré (1.10-4 g/l) est
encore plus de 20 fois supérieur au bruit de fond de la méthode.

Enfin, pour le 2,6-DCP, il n’a pas été possible de fournir une droite de
calibration. En effet, le 2,6-DCP et le standard interne sélectionné ont des
temps de rétention très proches et dès lors coéluent. Il n’a pas été possible
de trouver un standard interne qui permette l’analyse de l’ensemble des
chlorophénols sans coélution avec au moins un des différents chlorophénols
à quantifier. Dès lors, si l’analyse du 2,6-DCP s’avérait indispensable, il
faudrait alors choisir un autre standard interne pour celle-ci.
 220

5. Conclusion et perspectives
Ce présent travail a permis de répondre aux attentes du partenaire industriel,
à savoir disposer d’une méthode de détection et de quantification de
différents chlorophénols dans la bière. Ces derniers, responsables d’un goût
caractéristique et désagréable sont souvent présents suite à une
contamination de la bière par un agent oxydant chloré tel que l’hypochlorite
de sodium ou encore le dioxyde de chlore.

La méthode doit maintenant être prise en main par le partenaire industriel et

adaptée à ces propres équipements de chromatographie tels que chaînes,
colonnes, …

Toutefois, dans le but d’augmenter la robustesse de la méthode, nous

suggérons au partenaire industriel de pratiquer quelques essais
complémentaires tels que : dupliquer les droites de calibration sur ses
propres installations, confirmer et dupliquer les limites de détection, Valider
la méthode (reproductibilité, robustesse, …) au regard de ses propres
besoins.

De plus, il nous semblerait intéressant, si le temps le permet, de déterminer

le taux de récupération des cartouches, d’augmenter le volume de bière
prétraités afin d’abaisser encore la limite de quantification quitte à
sélectionner des cartouches possédant une plus grande quantité d’adsorbant,
de tester différents volumes d’élution dans le méthanol lors de l’étape de
récupération (SPE), de vérifier l’utilité du lavage par l’eau déminéralisée, le
faire avec un volume plus ou moins important ou avec un autre type de
solvant pour éliminer le maximum de pics interférents, tester un débit de
phase mobile plus important afin de réduire sensiblement le temps
d’analyse.

Enfin, il serait utile de réaliser une contamination de la bière par du chlore

actif libre afin de vérifier la formation de chlorophénols au cours du temps,
et ce, en appliquant la méthode mise au point. La pertinence de la technique
de dosage serait alors définitivement démontrée.
 221

6. Sources
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