Suivi de croissance de Penicillium camemberti et

Geotrichum candidum en culture pure et en association

au cours de l’affinage de fromages expérimentaux à pâte
molle de type camembert
P Molimard, L Vassal, Non Renseigné, He Spinnler

To cite this version:

P Molimard, L Vassal, Non Renseigné, He Spinnler. Suivi de croissance de Penicillium camemberti
et Geotrichum candidum en culture pure et en association au cours de l’affinage de fromages expéri-
mentaux à pâte molle de type camembert. Le Lait, 1995, 75 (1), pp.3-16. �hal-00929415�

HAL Id: hal-00929415

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Lait (1995) 75, 3-16 3
© Elsevier/INRA

Article original

Suivi de croissance de Penicillium camemberti

et Geotrichum candidum en culture pure
et en association au cours de l'affinage
de fromages expérimentaux à pâte molle
de type camembert

P Molimard 1, L Vassal 2, 1Bouvier 3, HE Spinnler 1

1 Laboratoire de recherches sur les arômes, INRA, BV 1540, F-21034 Dijon cedex;
2 Station de recherches
laitières, INRA, F-78352 Jouy-en-Josas cedex;
3 Sanofi Bio-Industries, division Cultures & enzymes, 66, avenue Marceau, F-75008 Paris, France

(Reçu le 20 juillet 1994 ; accepté le 3 novembre 1994)

Résumé - La cinétique de croissance de Penicillium camemberti (4 souches) et de Geotrichum can-

didum (3 souches) a été suivie, tout au long de l'affinage, sur des fabrications expérimentales de
camemberts. Elle a nécessité la mise au point d'une méthode de dénombrement spécifique de ces 2
espèces en culture mixte sur un milieu modèle et sur des camemberts du commerce. Geotrichum can-
didum se développe fortement pendant la première semaine d'affinage. Le niveau de population se
stabilise par la suite. La population de Penicillium camemberti reste au niveau d'ensemencement pen-
dant les 7 premiers jours, puis augmente jusqu'au 148 jour. Pendant les 2 dernières semaines d'affinage,
le nombre de cellules revivifiables de Penicillium camemberti est alors constant. La présence de Geo-
trichum candidum ne change pas de façon significative le niveau de population de Penicillium camem-
berti. En revanche, un effet souche Penicillium camemberti et Geotrichum candidum est mis en évidence.

Penicillium camemberti 1 Geotrichum candidum 1 culture mixte 1 dénombrement 1 camembert

Summary - Growth of Penicillium camemberti and Geotrichium candidum in pure and mixed cul-
tures on experimental mold ripened cheese of camembert-type. The growth of Penicillium came rn-
berti (4 strains) and Geotrichum candidum (3 strains) was followed during the ripening on experimen-
tal camembert cheeses. A method permitting to enumerate both species on a model medium and on
camembert cheese was set up. Geotrichum candidum growth is fast for the first ripening week. Then the
level of population is more stable. For the first week no growth of Penicillium camemberti is observed,
the population then grew until the 14th day. During the last 2 weeks of ripening the number of living cells
is constant. The growth ofGeotrichum candidum has no significant effect on the growth of Penicillium
camemberti. On the other hand, an effect of the Penicillium camemberti strain on Geotrichum can-
didum strain was observed.

Penicillium camemberti / Geotrichum candidum / mixed culture / enumeration / camembert

cheese
4 P Molimard et al

INTRODUCTION une meilleure connaissance d'une part, des

caractéristiques de croissance des souches
en mélanges, d'autre part de l'impact de
La consommation de fromages à pâte molle
cette flore sur le développement de la tex-
et à croûte fleurie, plus particulièrement de
ture et de la flaveur.
camembert, représente une part importante
du marché du fromage. Les qualités orga- L'objectif de notre étude est de suivre le
noleptiques de ces produits sont très développement de Penicillium camemberti
variables et parfois mal maîtrisées dans les et de Geotrichum candidum en association,
fabrications traditionnelles au lait cru. La au cours de l'affinage de fromages expéri-
technologie de fabrication, à partir de lait mentaux, de type camembert, à flore définie.
pasteurisé, apporte une plus grande repro- À cause des difficultés posées par le
ductibilité, mais on déplore alors une baisse dénombrement de champignons filamen-
de l'intensité et de la complexité aromatique teux en mélange (Jarvis et al, 1983), très
des produits. Les caractères organolep- peu de travaux ont été réalisés jusqu'à pré-
tiques du camembert apparaissent suite à sent sur la quantification de ces 2 espèces
d'importantes modifications des constituants en fromagerie. Mourgues et al (1983), dans
du caillé sous l'action des enzymes du lait, leur étude, ont dénombré uniquement la
de la présure et des micro-organismes qui population de Geotrichum candidum sur
peuplent le fromage (Adda et al, 1982). La des camemberts expérimentaux. Ils ont suivi
flore microbienne de camemberts obtenus à le développement de Penicillium camem-
partir de laits pasteurisés est relativement berti par une simple observation de la sur-
pauvre et se limite essentiellement aux seuls face des fromages. La première étape de
micro-organismes ajoutés pendant la fabri- notre travail a donc consisté à mettre au
cation (Tolle et al, 1980). Dans les fabrica- point une méthode d'estimation de la bio-
tions au lait cru, la flore est naturellement masse de Penicillium camemberti et de
plus complexe (Lenoir et Auberger, 1966). Geotrichum candidum en mélange, fiable,
Geotrichum candidum fait partie de la flore reproductible et simple à mettre en œuvre.
naturellement présente dans les fabrica- Il existe actuellement diverses techniques
tions au lait cru (Richard et Zadi, 1983 ; appliquées à la détection de champignons
Jean, 1989). Longtemps, on a cherché à contaminants des denrées alimentaires
éviter le développement de ce champignon (Frankland et Lindley, 1978 ; Cousin et al,
levuriforme qui, mal maîtrisé, est suscep- 1984 ; Lin et Cousin, 1985 ; Noterrnans et
tible de provoquer un défaut d'aspect de la Heuvelman, 1985 ; Lin et al, 1986 ; Noter-
croûte, appelé «peau de crapaud". Pour- mans et al, 1986 ; Kamphuis et al, 1989 ;
tant, son rôle important dans l'amélioration Notermans et Kamphuis, 1990). Ces tech-
des qualités organoleptiques des fromages niques, le plus souvent immunologiques,
a été démontré (Mourgues et al, 1983 ; ne sont pas quantitatives. Frankland et al
Ribadeau-Dumas, 1984 ; Molimard et al, (1981) ont développé une technique immu-
1994). Ces auteurs ont montré que Geotri- nologique permettant de quantifier la bio-
chum candidum peut réduire fortement masse mycélienne de Mycena galopus dans
l'amerture et renforcer la flaveur des fro- de l'humus. Cette technique, très spécifique,
mages sans en modifier l'aspect. Afin d'ob- est lourde à mettre en œuvre. Elle nécessite
tenir des produits typés, de manière repro- d'isoler un antigène spécifique de l'espèce
ductible, ce qui correspond à une demande à quantifier, ce qui est relativement difficile.
des consommateurs, les industriels s'orien- La production, chez le lapin, d'un anticorps
tent vers l'utilisation d'une flore plus com- monoclonal dirigé contre cet antigène est
plexe. La maîtrise de cette flore nécessite une autre étape longue et délicate. D'autres
 Croissance de P camemberti et G candidum 5

techniques plus simples mais moins spéci- cement de ces cultures a été réalisé avec une
fiques existent (Jarvis et al, 1983), telles suspension de spores obtenue à partir d'une cul-
ture de 21 jours en fioles de Roux sur milieu
que le comptage des propagules après
gélosé PDA (Merck, Darmstadt, Allemagne) à
broyage et dilution de l'échantillon à étu-
raison de 2,50103 spores de Penicillium camem-
dier. C'est cette technique qui ne dénombre berti et 2,50101 spores de Geotrichum candidum
que les cellules vivantes, que nous avons par ml de milieu. .
retenue. Après avoir mis au point un milieu L'optimisation de la méthode de broyage a
sélectif pour chacune des 2 espèces, les été effectuée sur des culots cellulaires obtenus
paramètres de broyage de l'échantillon après centrifugation pendant 10 min à 16 300 9 de
(temps, vitesse de rotation du broyeur, dilu- cocultures des souches Pc4 et Gc1 incubées 14
tion de l'échantillon) ont été optimisés sur j à 24°C. Le poids des culots cellulaires a été
des cultures en milieu synthétique et sur déterminé par pesées.
fromages, afin de définir des conditions L'évolution de la biomasse des cocultures et
répétables permettant une meilleure quan- des cultures pures des souches Pc4 et Gc1 en
milieu liquide a été suivie au cours du temps.
tification de la biomasse. Ensuite, nous
Pour cela, 6 fioles ont été prélevées aux temps 0,
avons suivi la croissance de ces 2 champi-
3, 6, 9, 14, 21 et 28 jours d'incubation à 12°C. À
gnons lorsqu'ils se développent en asso- chaque prélèvement, 3 fioles ont été réservées au
ciation, d'une part en milieu liquide afin de dénombrement des UFC après broyage et les 3
tester notre méthode de dénombrement, autres fioles à la mesure du poids sec après des-
puis au cours de "affinage de fromages sication à 101°C du mycélium filtré sur filtre Mil-
expérimentaux. lipore®, diamètre de pores de 0,45 urn (Millipore
corporation, Bedford, MA, États-Unis).
Les taux de croissance (Il), au temps t, ont
MATÉRIEL ET MÉTHODES été déterminés par la relation suivante, où X
représente le nombre d'unités formant colonies
(UFC) par ml :

Matériel biologique III = (1/Xt) [(Xl - Xt-1) / (t - L1) + (Xt+1 - Xl)

/ (t+1 - t)] (1/2)
Quatre souches de Penicillium camemberti (Pc1,
Pc2, Pc3, PC4) et 3 souches de Geotrichum can-
didum (Gc1, Gc2, Gc3) ont été utilisées. Le code
Broyages des échantillons
GcO est utilisé pour signaler l'absence de Geo-
trichum candidum dans les fromages. Ces
souches proviennent de la collection de la société Le culot cellulaire, ou le fromage, ont été broyés,
Sanofi Bio-Industries, division Cultures et après dilution avec de l'eau physiologique stérile
enzymes (Paris, France). (0,9% de NaCI), dans un pot en verre d'un volume
Deux souches de Lactococcus lactis subsp de 100 ml. Trois paramètres de broyage, sus- 1

cremoris, provenant de la collection du CNRZ ceptibles d'influencer directement le nombre des

(INRA-SRL, Jouy-en-Josas, France), ont été uti- UFC dénombrées après étalement du broyat sur
lisées lors des fabrications fromagères: la souche les milieux sélectifs, ont été optimisés: la vitesse 1

1139 G (Prott) et la souche 1140 P (Prot-). de rotation du broyeur ultra-turraxe T25 équipé
d'une sonde de broyage S25N-18G (IKA-Labor-
technick, Staufen, Allemagne), exprimée en 1

nombre de rotations par minute (rpm), le temps de

Cultures sur milieu liquide
broyage en secondes, la concentration en bio-
masse de la suspension à broyer exprimée en 1

La biomasse a été obtenue à partir d'une culture facteur de dilution. La vitesse du broyeur peut
de 21 jours sur milieu liquide PDB (Difco Labo- être régulée entre 8 000 et 24 000 rpm. Quant
1
ratories, Detroit, États-Unis) en erlenmeyer de au temps de broyage, des essais préliminaires
500 ml contenant 150 ml de milieu. L'ensemen- ont montré qu'en dessous de 10 s l'échantillon
1
6 P Molimard et al

n'est pas homogène et au-delà de 35 s, il y a for- ce cas, été incubées 3 jours à 30°C. Geotrichum
mation d'une mousse trop abondante. est, en effet, très sensible au sel. Son inhibition se
Ces facteurs ont été étudiés selon un plan manifeste entre 1 et 2% de NaCI dans le milieu.
d'expériences central composite permettant de La température optimale de croissance pour les
tester l'influence de chacun d'eux et leurs inter- souches feutrantes est située entre 25 et 30°C
actions, en optimisant le nombre des essais à (Guéguen, 1984 ; Guéguen et Schmidt, 1992).
réaliser (Goupy, 1988). Pour chacun des fac- Le Chloramphénicol a été stérilisé séparé-
teurs, 3 niveaux ont été fixés dans les limites ment par filtration sur filtre stérilisant Millipore®,
imposées par le matériel utilisé: diamètre de pores de 0,2 urn (Millipore corpora-
- X = vitesse de rotation du broyeur: 10 500, tion, Bedford, MA, États-Unis). Il a été ajouté au
13500,16500 rpm ; milieu après autoclavage afin de permettre l'éli-
mination ou le ralentissement de la plupart des
- y = temps de broyage: 10, 20, 30 s ; bactéries.
- Z = dilution du culot cellulaire: 0,25, 0,5, 0,75.
La matrice d'expériences comprend 23 points
nécessaires à l'étude des 3 facteurs à 3 niveaux. Fabrication des fromages
La variabilité a été déterminée sur le point central
du domaine expérimental (13 500; 20 ; 0,5),
répété 9 fois. Les points aux sommets du cube Quarante litres de lait, standardisé à 28% de
forment le domaine expérimental. Six points sont matière grasse et pasteurisé 18 s à 72°C, ont été
situés à l'extérieur du domaine expérimental (8 utilisés pour obtenir un lot de 20 fromages. Le
450; 20; 0,5), (18540; 20; 0,5), (13500; 3 ; lait, refroidi à 35°C, a été inoculé immédiatement
0,5), (13500 ; 37 ; 0,5), (13500 ; 20 ; 0,08), (13 à 2% avec un mélange contenant 5% d'une cul-
500 ; 20 ; 0,92). ture sur lait autoclavé de Lactococcus lactis Prot-
Le broyat a été dilué dans de l'eau physiolo- (souche t 139 G) et 95% d'une culture de Lacto-
gique stérile, de 10 en 10. Les dilutions com- coccus lactis Prot- (souche 1140 Pl.
prises entre 10-1 et 10-4 ont été étalées sur 3 Les suspensions de spores de Penicillium
boîtes de Pétri de 100 mm de diamètre de chacun camemberti et Geotrichum candidum ont été ajou-
des 2 milieux sélectifs. Le nombre moyen d'UFC tées au lait avant l'emprésurage, à raison de
sur les 3 boîtes a été retenu. 2 500 spores/ml environ (99% de Penicillium
camemberti et 1% de Geotrichum candidum
lorsque ces 2 espèces ont été utilisées en asso-
ciation). L'emprésurage a été réalisé avec 15
Milieux sélectifs
ml/100 1 de lait, de présure Granday® à 520 mg/I
de chymosine (Sanofi Bio-Industries, Paris,
Penicillium camemberti a été cultivé sélective- France). Le temps de coagulation était d'environ
ment sur milieu gélosé composé de 50 gol-1 de 40 min. Le caillé a été découpé lorsque le pH
PDA (Merck) ; 75 mgol-1 de Chloramphénicol atteignait 6,1 ± 0,1 puis moulé grâce à un dispo-
(France Biochem, Meudon, France) ; 6% de NaCI sitif permettant le retournement des bassines.
(Prolabo, Paris, France). Les boîtes de Pétri ont Les moules ont été retournés 2 fois pendant
été incubées 6 jours à 20°C. En effet, Penicillium l'égouttage, la première à pH 5,5 ± 0,9 et la
camemberti est particulièrement résistant au sel, seconde à pH 4,9 ± 0,1. Le lendemain les fro-
la plupart des souches ne sont complètement mages ont été salés en saumure saturée, pendant
inhibées qu'à partir de 25% de NaCI dans le 40 min à 15°C. Les fromages ont ensuite été
milieu. En milieu solide, des teneurs de 1 à 2% maintenus 24 h à 15°C et 85% d'humidité relative,
favorisent sa croissance. Sa température opti- puis affinés à 12°C et 95% d'humidité relative.
male de développement sur extrait de malt est Ils ont été emballés à l'âge de 12 jours et placés
comprise entre 20 et 25°C; à 30°C sa croissance ensuite à 8°C et 85% d'humidité relative pendant
est fortement réduite. Il ne pousse plus à 3YOC deux semaines.
(Cerning et al, 1987). Chaque souche de Penicillium camemberti
Geotrichum candidum a été cultivé sélective- a été utilisée seule et en association avec les 3
ment sur milieu gélosé PDA (Merck) (50 gol-1), souches de Geotrichum candidum, soit 16 pro-
Chloramphénicol (France Biochem) (75 mgol-1) duits. Leur fabrication a été répétée 4 fois. Pour
dépourvu de NaCI. Les boîtes de Pétri ont, dans chacune des répétitions de fabrication des 16
 Croissance de P camemberti et G candidum 7

produits (variable «prodult»), un fromage a été RÉSULTATS ET DISCUSSION

prélevé à 7, 14,21 et 28 jours d'affinage (variable
«jour») afin de dénombrer les populations de
Penicillium camemberti et Geotrichum candi- Mise au point de la méthode de broyage
dum.
Une fabrication supplémentaire a été réalisée
dans le but d'étudier les premiers jours d'affinage. Dans un premier temps, nous avons réa-
Quatre produits ont alors été fabriqués avec Pc2 lisé un plan d'expériences à 3 facteurs
(Pc2*GCO, Pc2*Gc1, Pc2*Gc2, Pc2*Gc3). Un fro- (temps, vitesse de rotation du broyeur, dilu-
mage a été prélevé à 1, 2, 6, 7, 9,14,21 et 28 tion de l'échantillon) et 3 niveaux pour défi-
jours d'affinage). Des fromages ont également nir les conditions qui permettent d'optimi-
été prélevés à 1,2,6,7,9, 14,21 et 28 jours ser le dénombrement.
d'affinage d'une fabrication réalisée avec l'asso-
L'analyse de la régression montre que,
ciation des souches Pc2 et Gc2, mais à raison
de 5% de Gc2. globalement, ce modèle explique seulement
29,8% de la variabilité totale observée (dont
20,1% sont expliqués par l'effet linéaire des
Analyses statistiques facteurs et 9,2% par les interactions d'ordre
2). L'effet des facteurs étudiés n'est pas
significatif (P> 0,05). La dilution et les inter-
Toutes les analyses statistiques ont été menées
actions d'ordre 2 entre les facteurs possè-
sur le logiciel SAS® (SAS Institute Inc, Cary, NC,
dent les effets· les moins marqués sur la
États-Unis). La planification des expériences (plan
central composite et plan complet) ainsi que
mesure.
l'ordre aléatoire de réalisation des essais, afin de Compte tenu de la très faible contribu-
tenir compte des facteurs non contrôlés pouvant tion du modèle à l'explication de la variabi-
influencer les réponses mesurées, ont été déter- lité, l'étude des facteurs temps et vitesse
minés par les macros ADX. de rotation du broyeur a été affinée par la
Les résultats obtenus après réalisation du réalisation d'un plan complet d'expériences
plan d'expériences central composite ont été répété trois fois. Ce protocole permet d'éva-
explorés par un test d'analyse de la variance sur luer la variabilité sur chacun des points. Le
les 3 facteurs: temps, vitesse et dilution. Une
domaine expérimental a été redéfini par rap-
analyse de régression a été réalisée par la pro-
port aux résultats obtenus précédemment:
cédure RSREG de SAS/STAT® (1989).
Les résultats obtenus après réalisation des
- X = vitesse: 12 000, 18 000, 24 000 rpm ;
plans d'expériences complets ont été explorés - y = temps: 15,25,35 s.
par une analyse de variance à 2 facteurs (temps
La biomasse a été diluée 4 fois. L'espace
et vitesse) au moyen de la procédure GLM de
expérimental est alors formé par 9 points.
SAS/STAT® (1989) ainsi que par une analyse de
la régression par la procédure RSREG de Pour Penicillium camemberti, le Log des
SAS/STAT® (1989). UFC/ml est compris entre 5,6 ± 0,2 après 15
Les résultats des dénombrements au cours s de broyage à 24 000 rpm et 6,2 ± 0,1
de l'affinage des fromages expérimentaux ont après 25 s à 24 000 rpm.
été soumis à une analyse de variance à 2 fac- Le Log du nombre d'UFC/ml de Geotri-
teurs (produit et jour) et interaction. Une analyse
chum candidum est situé entre 5,3 ± 0,2
de variance sur les facteurs Penicillium camem-
pour 15 s à 24 000 rpm et 5,6 ± 0,2 pour
berti et Geotrichum candidum et interaction a
également été réalisée.
25 s à 24 000 rpm (tableau 1).

Les représentations graphiques (figs 3, 4 et L'étude de la régression et de l'analyse

5) ont été obtenues grâce au programme Charter de la variance montre que le modèle étu-
sur SAS® (P SChlich, INRA-LRSA, Dijon, France). dié explique 54,3% de la variabilité pour
8 P Molimard et al

Tableau 1. Population de Penicillium camemberti Tableau Il. Population de Penicillium camem-

(Pc4) et Geotrichum candidum (Gc1) dénombrée berti(Pc4) et Geotrichum candidum (Gc1) dénom-
après broyage de culots cellulaires obtenus par brée après broyage de 25 g de fromage. Log du
culture en milieu liquide. Log du nombre d'UFC/ml nombre d'UFC/g de fromage, moyenne de 3
de culot cellulaire, moyenne de 3 broyages. broyages.
Population of Penicillium camemberti (Pc4) and Population of Penicillium camemberti (Pc4) and
Geotrichum candidum (Gc1) enumerated after Geotrichum candidum (Gc1) enumerated after
grinding of cell pellets obtained by culture in liquid grinding. Log of the number of CFU/g of cheese,
medium. Log of the number of CFU/g of cell pel- mean of 3 grindings.
let, mean of 3 grindings.

Temps Espèce' Vitesse de broyage (rpm)

Temps Espèce' Vitesse de broyage (rpm) (s)
(s) 12 000 18 000 24 000
12 000 18 000 24 000

15 Pc 6,7 ± 0,2 6,6 ± 0,1 6,6 ± 0,2

15 Pc 5,8 ± 0,1 5,9± 0,3 5,6 ± 0,2 Gc 5,1 ± 0,5 4,7 ± 0,3 4,9 ± 0,4
Gc 5,3 ± 0,1 5,3 ± 0,4 5,3 ± 0,2
25 Pc 6,6 ± 0,3 6,6 ± 0,3 6,8 ± 0,4
25 Pc 5,8 ± 0,2 5,8± 0,3 6,2 ± 0,1 Gc 5,1 ± 0,3 4,9 ± 0,5 4,9 ± 0,6
Gc 5,5 ± 0,1 5,5 ± 0,1 5,6 ± 0,2
35 Pc 6,7 ± 0,2 6,7 ± 0,3 6,5 ± 0,2
35 Pc 6,0 ± 0,3 5,9 ± 0,2 5,9 ± 0,2 Gc 5,1 ± 0,7 4,9 ± 0,9 4,8 ± 1,0
Gc 5,6 ± 0,1 5,6 ± 0,2 5,5 ± 0,2

1 Pc : Penicillium camembet1i ; Gc : Geotrichum candi-

1 Pc : Penicillium camembet1i; Gc : Geotrichum candi- dum.
dum.

Penicillium camemberti et 32,9% pour Geo- et 5,1 ± 0,3 Log UFC/g après 25 s à 12 000
trichum candidum. Dans cette part de la rpm pour Geotrichum candidum. La popu-
variabilité expliquée par les facteurs testés, lation de Penicillium camemberti est com-
la contribution du facteur temps de broyage prise entre 6,5 ± 0,2 Log UFC/g après 35
est de 16,9% pour Penicillium camemberti et s à 24 000 rpm et 6,8 ± 0,4 Log UFC/g
de 83,7% pour Geotrichum candidum et après 25 s à 24 000 rpm (tableau Il). Il n'y a
celle de la vitesse de broyage est de 1% pas de différence significative (P > 0,05)
pour Penicillium camemberti et 2,3% pour entre les 3 niveaux de vitesse de broyage
Geotricum candidum. L'interaction temps x (12 000,18 000, 24 000 rpm) et de durée de
vitesse contribue à cette variabilité au niveau broyage (15, 25, 35 s) testés.
de 82,1 % pour Penicillium camemberti et
Au vu des résultats précédents, il s'avère
14% pour Geotrichum candidum. Cepen-
que lorsque les conditions de broyage per-
dant, pour les 2 facteurs, l'effet sur le Log
mettent d'obtenir une homogénéisation cor-
UFC/ml des 3 niveaux testés n'est pas signi-
recte de l'échantillon à dénombrer, il y a peu
ficatif (P > 0,05).
de modification du nombre d'UFC dans le
Le même plan d'expérience a été réalisé domaine expérimental étudié. Nous avons
sur des camemberts au lait cru du commerce. donc retenu les conditions de 25 s à 18 000
Pour cela, 25 g de fromage ont été broyés rpm, qui sont des conditions moyennes don-
dans 50 ml d'eau physiologique stérile. nant une bonne homogénéité de l'échan-
On a ainsi dénombré entre 4,7 ± 0,3 Log tillon. Ces conditions seront celles
UFC/g après 15 s de broyage à 18 000 rpm employées pour tous les dénombrements
 Croissance de P camemberti et G candidum 9

de la flore de suriace des camemberts expé- lèlement, le nombre d'UFC/ml croît rapide-
rimentaux que nous avons analysés, ainsi ment jusqu'au 10e jour de culture (3,0-107
que des cultures en milieu liquide. UFC/ml) avant de se stabiliser à ce niveau
(fig 2). La corrélation entre le Log du nombre
d'UFC/ml et le Log de la teneur en matière
Suivi des populations de Penicillium sèche des cultures est hautement signifi-
camemberti et Geotrichum candidum cative (r= 0,98; P= 0,0001 ; ddl = 20). Le
en milieu liquide dénombrement des UFC donne donc une
bonne estimation de la biomasse.
Penicillium camemberti (Pc4) se développe
En cultures pures beaucoup plus lentement et atteint une
teneur en matière sèche de 4,57 ± 0,34
La teneur en matière sèche (MS) des cul- mg/ml après 28 jours (fig 1). Cette biomasse
tures de Geotrichum candidum (Gc1) aug- est comparable à celle de Geotrichum cen-
mente progressivement jusqu'à un maxi- didum après 14 jours de culture malgré un
mum de 4,73 ± 0,19 mg/ml au 14e jour. Elle ensemencement en Penicillium camemberti
chute ensuite très légèrement jusqu'à 4,0 ± 100 fois plus important que celui de Geo-
0,09 mg/ml en fin de culture (fig 1). Paral- trichum candidum. Le nombre d'UFC/ml

6 10

_ 4

E
Cl
E
c
;
en
li
2

12 16 20 24 26" 4 B 12 16 20 24 28
.Jours Jours

Fig 2. Évolution du Log d'UFC par ml de cultures

Fig 1. Évolution de la matière sèche (MS en pures et de cocultures de Penicillium camem-
mg/ml) des cultures pures et des cocultures en bert; (Pc4) et de Geotrichum candidum (Gc1). 0
milieu liquide de Geotrichum candidum (Gc1) et Penicillium camemberti en culture pure; 0 Peni-
de Penicillium camemberti (Pc4). 0:'
Coculture ; 0 cillium camemberti en coculture ; 0 Geotrichum
culture pure de Geotrichum candidum ; 0 culture candidum en culture pure ; ~ Geotrichum candi-
pure de Penicillium camemberti. dum en coculture.
Evolution of the dry matter (MS in mg/ml) of pure Evolution of the Log of CFU of pure cultures and
and coculture in liquid medium of Geotrichum cocultures of Penicillium camemberti (Pc4) and
candidum (Gc1) and Penicillium camemberti Geotrichum candidum (Gc1). 0, Penicillium camem-
(Pc4). ;Ié, Coculture; 0, pure culture of Geotri- berti in pure culture; D, Penicillium camemberti in
chum candidum; 0, pure culture of Penicillium coculture; 0, Geotrichum candidum in pure cul-
camemberti. ture; ~, Geotrichum candidum in coculture.
10 P Molimard et a/

dénombré évolue parallèlement à la teneur en cultures mixtes la croissance continue

en matière sèche. La corrélation entre le jusqu'en fin de culture.
Log de ces 2 modes d'expression de la bio- Le nombre d'UFC de Penicillium camem-
masse est là aussi hautement significative berti (Pc4) par ml de culture augmente à
(r= 0,81 ; P= 0,0003; ddl = 14) .. Là aussi, partir du 66 jour jusqu'à un maximum de
par le dénombrement des UFC, nous avons 6,5-104 au 146 jour, il diminue par la suite
une estimation correcte de la biomasse. (fig 2). Penicillium camemberti se développe
plus rapidement pendant les premiers jours
En cultures mixtes en cultures mixtes, mais son développe-
ment se stabilise rapidement, alors qu'en
Le taux de matière sèche, dans les cultures, culture pure il se développe tout au long
augmente progressivement jusqu'à un maxi- des 28 jours de culture. Au 96 jour, le taux
mum de 5,03 ± 0,21 mg/ml de culture au de croissance (tableau III) est significative-
216 jour. Il diminue par la suite jusqu'à ment plus important en coculture qu'en cul-
4,31 ± 0,45 mg/ml de culture au 286 jour ture pure. À 14 et 21 jours, le taux de crois-
(fig 1). Le nombre d'UFC de Geotrichum sance devient significativement plus
candidum (Gc1) par ml de culture augmente important en culture pure. Peut-être que
régulièrement tout au long des 28 jours de cette stimulation ne s'exprime qu'avant épui-
culture et atteint un maximum de 5,5-108 sement du glucose.
(fig 2). Cette population maximum est com- Cette étude montre clairement que le
parable à celle obtenue en culture pure. Sur nombre d'UFC estimé en milieu liquide, par
la figure 2, il apparaît clairement que la crois- notre méthode, est directement lié à la quan-
sance de Geotrichum candidum est plus tité de biomasse présente dans le milieu.
faible en coculture. Cependant, les taux de Elle permet également de mettre en évi-
croissance (tableau III) à 9, 14 et 21 jours, dence une interaction, entre les 2 souches
calculés sur le nombre d'UFC/ml sont signi- de chacune des 2 espèces, sur milieu
ficativement plus importants en coculture liquide. Le développement plus rapide de
qu'en culture pure pour Geotrichum candi- Penicillium camemberti, observé pendant
dum. En effet, à 9 jours de cultures pures, la les premiers jours de cocultures sur milieu
croissance est presque terminée, donc le synthétique, est particulièrement intéres-
taux de croissance est faible. En revanche, sant. En effet, en fromagerie, une couverture

Tableau III. Taux de croissance en j-1 de Penicillium camemberti (Pc4) et Geotrichum candidum
(Gc1) en culture pure et coculture en milieu liquide, calculé sur le nombre d'UFC/ml.
Growth rate in dey:' of Penicillium camemberti (Pc4) and Geotrichum candidum (Gc1) in pure
culture and cocu/ture in Iiquid medium ca/cu/ated with the number of CFU/m/

Jours Penicillium camemberti Geotrichum candidum

Cocu/tures Culture pure Cocu/tures Culture pure

6 1,3 ± 0,8 1,4±0,7

9 7,1 ± 2,2 0,1 ± 0,0 4,6 ± 3,4 0,1 ± 0,0
14 0,1 ± 0,0 0,8± 0,3 0,9 ± 0,3 0,1 ± 0,0
21 -1,9±0,7 2,1 ± 0,8 1,5 ± 0,4 0,4± 0,3
 Croissance de P camemberti et G candidum 11

plus précoce du fromage est particulière- lium camemberti et de Geotrichum candi-

ment recherchée pour une compétition plus dum est supérieur en cultures mixtes à celui
forte et plus précoce avec les éventuels des cultures pures. Or la quantité de matière
contaminants d'une part et pour un affinage sèche en cultures mixtes est plus faible que
plus rapide d'autre part. Or ilsemble que la la somme des matières sèches des cultures
souche de Penicillium camemberti Pc4 et pures de Penicillium camemberti et de Geo-
la souche de Geotrichum candidum Gc1 , trichum candidum. Il y a donc plus de cel-
lorsqu'elles se développent ensemble sur lules viables par unité de matière sèche en
ce milieu synthétique, ont une croissance cultures mixtes qu'en cultures pures (tableau
plus rapide. De plus, Geotrichum candidum
IV). Il ya également plus de cellules viables
se développe plus tôt que Penicillium
par unité de matière sèche en début de cul-
camemberti, pouvant ainsi assurer une
ture qu'en fin de culture. Cependant, la forte
occupation plus précoce du milieu.
viabilité du mycélium en culture pure à 6
Il n'existe pas de grande différence entre jours (17,10 Log UFC/mg MS) peut être due
les populations finales des cultures pures à une imprécision de la mesure de la
et des cultures mixtes (fig 2). Ce qui veut matière sèche qui est à un niveau faible à ce
dire que le nombre total d'UFC de Penici/-
stade de culture. Ces résultats peuvent lais-
ser penser qu'en cocultures l'activité méta-
Tableau IV. Différence de viabilité spécifique, bolique globale est plus intense qu'en culture
exprimée en Log d'UFC/mg de matière sèche pure, puisque la viabilité de la biomasse
(MS), entre les cultures pures et les cultures semble plus importante. Il reste à savoir si
mixtes. ce qui est observé sur milieu modèle est
Change in specifie viability, expressed as Log of
CFU/mg of dry matter (MS), between pure cul-
également vrai sur fromage. Ceci pourrait
tures and mixed cultures. laisser supposer un affinage plus rapide en
culture mixte.

Jours Log UFC/mg MS Coefficient

Culture pure' Culture mixte2 de viabilité
Suivi des populations de Penicillium
(1) (2) (2)1(1)
camemberti et Geotrichum candidum en
fabrications fromagères expérimentales
6 2,53 17,10 7.00
14 1,39 2,25 1,62
21 1.16 1,48 1,27 La population de Penicillium camemberti au
28 1,03 2,02 1,96 7e jour d'affinage, pour les 4 souches, est
significativement plus faible (P < 0,05) que
celle présente après 14 jours. Au contraire,
1 Log UFC/mg MS = Log [(UFC de Geotrichum candi-
dum en culture pure) + (UFC de Penicillium camemberti il n'y a aucune différence significative (P>
en culture pure)] / [(MS de Geotrichum candidum en cul- 0,05) entre les dénombrements effectués
ture pure) + (MS de Penicillium camemberti en culture à 14, 21 et 28 jours. L'interaction
pure)]. 2 Log UFC/mg MS = Log [(UFC de Geotrichum
produit'jours n'est pas signifiative (P> 0,05),
candidum en culture mixte) + (UFC de Penicillium
camemberti en culture mixte)] / (MS de la culture mixte). ce qui signifie que le classement du nombre
1 Log CFUlmg MS = Log [(CFU of Geotrichum candi- moyen d'UFC des 4 souches de Penicillium
dum in pure culture) + (CFU of Penicillium camemberti in camemberti reste le même tout au long de
pure culture)] / [(MS of Geotrichum candidum in pure
l'affinage. La population de la souche Pc1
culture) + (MS of Penicillium camemberti in pure cul-
ture)]. 2 Log CFUlmg MS = log ({CFU ofGeotrichum can-
est significativement plus importante que
didum in mixed culture) + (CFU of Penicillium camemberti celle de Pc2 et Pc3 au seuil de 0,2%, pour
in mixed culture)] / (MS of the mixed culture). toutes les associations confondues (fig 3).
12 P Molimard et al

-
Cl

It
o
~ 5

.§'

Pel Pe2 Pe3 Pe4 Pel Pe2 Pd Pe4 Pel Pe2 Pd Pe4 Pel Pe2 Pd Pe4 SOUCHE
t--- 07 ---i t--- 14 ---i t--- 21 ---i t--- 28 ---i JOURS

Fig 3. Évolution de la population des 4 souches de Penicillium camemberti au cours de l'affinage des
fromages. Log UFC Pc/g : Log UFC Penicillium camemberti par gramme de fromage frais, moyenne
des 4 produits fabriqués 4 fois, soit 16 mesures. Souche: souche de Penicillium camemberti. Jours:
nombre de jours d'affinage. Les barres verticales représentent l'intervalle de confiance à 95%.
Change in the population of the four Penicillium camemberti strains during cheeses ripening. Log
UFC Pc/g: Log CFU of Penicillium camemberti per 9 of fresh cheese, mean of the 4 products and 4
cheese making replicates (16 measures). Souche: Penicillium camemberti strains. Jours: number of
ripening days. The verticalline represents the confidence interval at the level of 95%.

La population de Penicillium camemberti dant les 7 premiers jours à 3,6 ± 0,1 Log
n'est pas significativement différente (P > UFC/g. La croissance débute après 7 jours
0,05) en présence ou non de Geotrichum et la population se stabilise au 148 jour à
candidum, quelle que soit la souche de 5,2 ± 0,5 Log UFC/g. Malgré cette stabilité
Penicillium camemberti. Un exemple est du nombre d'UFC, l'observation de la sur-
montré figure 4, avec la souche Pc4. Pour- face des fromages montre une importante
tant, l'observation de la surface des fro- évolution de la couverture mycélienne après
mages révèle des aspects différents en pré- le 148 jour. Cela peut s'expliquer par le fait
sence de Geotrichum candidum, et ceci en que notre méthode ne dénombre que les
fonction des souches. Ces différences d'as- cellules revivifiables. On peut penser qu'une
pects sont très certainement imputables aux partie du mycélium est constituée de cel-
caractéristiques de développement des lules non revivifiables, qui ne sont donc pas
souches de Geotrichum candidum (souches dénombrées. Le nombre des cellules revi-
plus ou moins feutrantes). vifiables serait constant au-delà de 14 jours.
Pour les 4 produits dont les UFC ont été La population de Geotrichum candidum,
dénombrées en début d'affinage, la popu- pour les 3 souches étudiées, n'est pas dif-
lation de la souche Pc2 est constante pen- férente entre les 3 prélèvements effectués à
 Croissance de P camemberti et G candidum 13

6.5

5.5

.....Cl
o 4.5
a.
U
u.
:;)

8'
..J
J.5

2.5

1,5
P P P P P P P P P P P P P P P P SOUCHE
c c c c c c c c c c c c c c c c
4
G
4 4
G
.
4
G
4 4

G
4
G
4

G
4 4

G G
. .
4 4
G
4

G
.
4

G
4
.
4

G
c c c c c c c c c c c c
1 2 J 1 2 J 1 2 J 1 2 J
t---- 07- t---- 14- t---- 21- t---- 28- JOURS

Fig 4. Évolution de la population de la souche de Penicillium camemberti 4 (Pc4) au cours de l'affinage

des 4 fromages (Pc4 seul ou associé avec les 3 souches de Geotrichum candidum). Log UFC Pc/g :
Log UFC Penicillium camemberti par gramme de fromage frais, moyenne des 4 répétitions de fabrication.
Souche : combinaisons des souches de Penicillium camemberti et Geotrichum candidum. Jours:
nombre de jours d'affinage. Les barres verticales représentent l'intervalle de confiance à 95%.
Evolution of the population of the Penicillium camemberti strains 4 (Pc4) during the ripening of the 4
cheeses. Log UFC Pdg: Log CFU of Penicillium camemberti per 9 of fresh cbeese, mean of the 4 cheese
making replicates. Souche: Penicillium camemberti and Geotrichum candidum strain. Jours: Number
of ripening days. The verticalline represents the confidence interval at the level of 95%.

14,21 et 28 jours (fig 5). Seuls les prélève- Geotrichum candidum. En effet, quelle que
ments réalisés à 7 jours sont significative- soit la souche de Geotrichum candidum, le
ment plus faibles (P < 0,05). Pour les 3 nombre d'UFC/g, en fin d'affinage, est signi-
souches de Geotrichum candidum asso- ficativement plus important lorsque ce cham-
ciées avec la souche Pc2, on observe une pignon est associé avec la souche Pc3.
croissance du nombre d'UFC/g pendant les Contrairement aux produits ensemen-
9 premiers jours, avec une légère inhibition cés avec !?% de Geotrichum candidum, les
du développement au deuxième jour, cer- produits ensemencés avec 1% de Geotri-
tainement due à l'effet du salage. Le déve- chum candidum n'ont pas donné de défaut
loppement des souches de Geotrichum can- de surface de type «peau de crapaud». Cer-
didum diffère en fonction de la souche de tains de ces derniers avaient cependant un
Penicillium camemberti qui lui est associée. aspect de surface plus «visqueux» que la
Il existe une forte interaction entre les normale. Enfin, tous les produits ensemen-
souches de Penicillium camemberti et de cés avec Geotrichum candidum ont un
14 P Molimard et al

5
Gel Gc2 Gd Gel Gc2 Gd Gel Gc2 Gd Ge1 Gc2 Gd SOUCHE
t-- 07 --< >-- 14 --< t-- 21 --< t-- 28 --< JOURS

Fig 5. Évolution de la population des 3 souches de Geotrichum candidum au cours de l'affinage des
fromages. Log UFC Gclg : Log UFC Geotrichum candidum par gramme de fromage frais, moyenne des
4 produits fabriqués 4 fois avec Geotrichum candidum, soit 16 mesures. Souche: souche de Geotri-
chum candidum. Jours: nombre de jours d'affinage. Les barres verticales représentent l'intervalle de
confiance à 95%.
Evolution of the population of the 3 Geotrichum candidum strains during cheeses ripening. Log UFC
Gclg: log CFU of Geotrichum candidum per g of fresh cheese, mean of the 4 products and 4 cheese
making replicates (16 measures). Souche: Geotrichum candidum strain. Jours: Number of ripening days.
The verticalline represents the confidence interval at the level of 95%.

aspect de surface moins feutrant, une croûte montré que les UFC dénombrées sont des
plus fine qu'en présence de Penicillium fragments mycéliens ainsi que des spores.
camemberti seul. Mourgues et al (1983) ont Les spores de Penicillium camemberti n'ap-
également observé ce type d'aspect de sur- paraissent que sur les prélèvements effec-
face. Ces auteurs ont décrit ce phénomène tués après 9 jours d'affinage. Cettè méthode
comme une occupation du terrain par Geo- de dénombrement ne quantifie que les cel-
trichum candidum, gênant l'implantation et lules revivifiables après broyage. Pourtant,
le développement de Penicillium camem- même si elle ne donne qu'une sous-esti-
berti. Notre étude montre que ces 2 phé- mation de la biomasse, elle a le mérite d'être
nomènes ne semblent pas liés. Cependant, facile à mettre en œuvre et de ne nécessi-
Mourgues et al (1983) n'ont pas utilisé les ter qu'une mise au point réduite.
mêmes souches et le niveau d'ensemen- Les méthodes basées sur le dosage des
cement en Geotrichum candidum était plus constituants de parois, telles que le dosage
important. chimique de la glucosamine ou des hexo-
Des dénombrements effectués après fil- samines (Frankland et Lindley, 1978 ; Cousin
tration de l'échantillon sur toile à bluter ont et al, 1984 ; Lin et Cousin, 1985) ne don-
 Croissance de P camemberti et G candidum 15

nent également qu'une estimation de la bio- de Penicillium camemberti ne démarre. Au

masse. La teneur des composés dosés peut 14e jour d'affinage, cette population a atteint
évoluer au cours de la croissance. De plus son maximum. La croissance de Penicil-
les constituants de parois ne sont pas spé- lium camemberti ne semble pas, au vu de
cifiques d'une espèce et sont présents sur nos résultats, être gênée par la présence
les cellules mortes. de Geotrichum candidum au niveau d'en-
Les techniques basées sur une réaction semencement de 1 "Jo. Cette croissance ne
antigène-anticorps offrent une plus grande débute qu'après le le jour d'affinage et le
spécificité d'espèce. Elles sont encore peu nombre de cellules revivifiables reste
développées et utilisées essentiellement constant à partir du 14e jour d'affinage.
pour la détection des champignons conta- La méthode de dénombrement mise au
minants de denrées alimentaires, et non point et utilisée lors de cette étude ne quan-
pour leur quantification (Notermans et Heu- tifie que les cellules revivifiables après
velman, 1985 ; Lin et al, 1986 ; Notermans et broyage de l'échantillon. Le nombre d'UFC
al, 1986 ; Kamphuis et al, 1989 ; Notermans que nous obtenons est un mode d'expres-
et Kamphuis, 1990). La méthode développée sion de la biomasse vivante sur le fromage,
par Frankland et al (1981), grâce à l'utilisa- elle ne tient pas compte de l'activité enzy-
tion d'un antisérum conjugué à la f1uores- matique de la biomasse. La biomasse non
céine-isothiocyanate, permet une quantifi- revivifiable et les cellules lysées peuvent
cation spécifique de Mycena galopus. Il jouer un rôle non négligeable dans les acti-
existe cependant des limites à cette tech- vités métaboliques, par les enzymes libé-
nique. La réaction a lieu, en effet, indiffé- rées dans le milieu.
remment avec les cellules vivantes et les
cellules mortes. De plus, il n'existe pas, sur
le marché, d'antisérum dirigé contre Peni- REMERCIEMENTS
cillium camemberti ou Geotrichum candi-
dum. La production de ces antisérums, chez
Les auteurs remercient tout particulièrement:
le lapin, serait lourde à mettre en œuvre.
l'équipe du laboratoire de développement de
Sanofi Bio-industries, division Cultures & enzymes,
pour la production des souches; M Bigret et P
CONCLUSION Schlich pour leur assistance scientifique; G Mau-
vais et G Pitel pour leur participation technique; la
société Sanofi Bio-Industries, division Cultures &
Le temps de broyage, la vitesse de rotation
enzymes, le ministère de l'Enseignement supé-
du broyeur et la dilution permettant une rieur et de la Recherche ainsi que la région Bour-
homogénéisation correcte de l'échantillon gogne pour leur soutien financier.
n'ont pas d'effet significatif sur le nombre
d'UFC. Les conditions moyennes de 25 s à
18 000 rpm ont donc été retenues pour cette RÉFÉRENCES
étude. Sur des cultures en milieu liquide, le
nombre d'UFC estimé par cette méthode est
Adda J, Gripon JC, Vassal L (1982) The chemistry 01
corrélé de façon hautement significative à Ilavor and texture generation in cheese. Food Chem
la teneur en matière sèche des cultures. 9,115-129

Sur les fromages expérimentaux de type Cerning J, Gripon JC, Lamberet G, Lenoir J (1987) Les
activités biochimiques des Penicillium utilisés en Iro-
camembert, nous avons pu observer que
magerie. Lait 67, 3-39
Geotrichum candidum se développe dès
Cousin MA, Zeidler CS, Nelson PE (1984) Chemical
les premiers jours d'affinage, malgré l'effet detection 01 mold in processed loods. J Food Sci
inhibiteur du salage, avant que la croissance 49,439-445
16 P Molimard et al

Frankland JC, Lindley DK (1978) A comparison of Iwo Lin HH, Lister RM, Cousin MA (1986) Enzyme-linked
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