I.

Méthodes d’étude de la morphologie des cellules

[Link] microscopie

La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des

structures à l’échelle microscopique. Le principe est dans tous les cas le même :
une onde est envoyée sur la préparation et émise ensuite par la préparation. Cette
onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par un oculaire qui crée
une image observable. Cette image est soit observée à l’œil nu, soit photographiée,
soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour retraitement.

Le but du microscope est de donner accès à la structure microscopique des objets

observés. Un microscope sert donc à voir des détails plus fins de l'objet et pas
seulement à en faire une image agrandie. La performance principale de cet
instrument est donc sa résolution, c'est-à- dire sa capacité à séparer ces détails.

Résolution et distance de travail

La résolution est la plus petite distance séparant deux objets que l'on peut
distinguer à l'aide du microscope: elle dépend de la qualité des lentilles et de la
nature même de la lumière: elle est au maximum de 0,2 µm. On peut l'augmenter
en plaçant une goutte d'huile à immersion (huile incolore dans laquelle la lumière se
propage à la même vitesse que dans le verre) sur la préparation: on réalise alors
une observation "à l'immersion", l'huile remplaçant l'air entre l'objet et l'objectif.

La distance de travail

est la distance entre l'objectif et l'objet : elle doit être d'autant plus petite que le
grossissement recherché est fort.

Les techniques de révélation permettent aujourd'hui d'identifier de façon précise

toutes sortes de molécules et les photographies (sur pellicules ou numériques)
peuvent être analysées pour des études quantitatives (taille, nombre et
emplacement des éléments observés). Aujourd'hui la microscopie est divisée en
deux grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire
impliquée :

• le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il utilise des photons,

• le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet.

MICROSCOPIE OPTIQUE

La technique de microscopie optique est la plus ancienne utilisée.

Le principe est le suivant, la préparation est éclairée par une lampe. Les molécules
à observer vont interagir avec la lumière de plusieurs façons :

Ø soit en absorbant certaines longueurs d'onde de la lumière. C'est la microscopie

en lumière directe.

Ø soit en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux. C'est la

microscopie en contraste de phase.

Ø soit en émettant de la lumière à une autre longueur d'onde que celle d'origine.
C'est la microscopie à fluorescence.

Donc il existe plusieurs types de la microscopie optique :

Ø La microscopie en lumière directe (transmission).

Ø La microscopie en contraste de phase.

Ø Le microscope à fond noir.

Ø Le microscope à lumière polarisée.

Ø La microscopie à rayons UV (à fluorescence).

Ø Le microscope à balayage.

La microscopie en lumière directe

C'est le cas le plus simple. Les structures à observer sont colorées, soit qu'elles le
soient naturellement, soit comme résultat d'un marquage. La lumière blanche
émise par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse. Selon
l'intensité de la coloration, la lumière sera plus ou moins absorbée et l'endroit
apparaîtra plus ou moins sombre, les zones peu marquées restant relativement
claires. La coloration est due soit à un colorant qui se fixe de façon préférentielle à
une molécule particulière ou une famille de molécules, soit à un précipité sombre.

Un microscope à transmission comporte principalement les éléments suivants : une

source lumineuse, un condenseur, un objectif et des oculaires (voir figure ci-
dessous).

[Link] principaux éléments d’un microscope

Source (lampe) : La première source utilisée était le soleil. Maintenant, la lampe

hallogène a remplacé la source naturelle, offrant plus de puissance, une intensité
plus constante.

Miroir : utilisé pour réfléchir la lumière ambiante pour éclairer

l'échantillon Condenseur C’est principalement une lentille servant à concentrer la
lumière de la source lumineuse sur l’échantillon. Son rôle est essentiel pour la
qualité des images, notamment le contraste et la résolution.

Diaphragme : ouverture de diamètre variable permettant de régler la quantité de

lumière qui éclaire l'échantillon.

Platine porte-échantillon : où l'on pose l'échantillon. La platine peut être mobile

(gauche-droite et avant-arrière), ce qui permet de balayer l'échantillon et de
sélectionner la partie observée.

Objectif : L’objectif est le cœur du microscope, l’élément essentiel. Il peut se

résumer à une simple lentille à fort pouvoir grossissant. C’est lui qui détermine la
résolution optique du microscope. La figure suivante montre un objectif avec un
grossissement 60 fois (60x) et une ouverture numérique.

Oculaires : Les oculaires servent à grandir l’image fournie par l’objectif (comme
une loupe) et à pouvoir regarder l’échantillon sans que l’œil doivent accommoder,
pour le confort de l’utilisateur.

[Link] étapes d’utilisation d’un microscope optique

Il permet de visualiser des objets très fins, montés dans une goutte d’eau ou de
liquide coloré sur une lame porte objet et recouvert d’une lamelle couvre objet très
fragile, ou des coupes fixées et colorées selon un protocole qui sera présenté
ultérieurement. La lumière qui traverse l’objet remonte dans les lentilles de verre
(objectif et oculaire) ce qui agrandit l’objet.

L’observation au microscope passe par les étapes suivantes :

Ø Préparation de l’observation : la préparation à observer est placée sur la

platine et centrée pour que la lumière traverse le tube optique donnant un rond
lumineux dans l’oculaire.

Ø La mise au point : le petit objectif (faible grossissement) est placé dans l’axe
du tube optique. Il faut ensuite regarder dans l’oculaire et, à l’aide de la vis
macrométrique de mise au point, remonter le tube jusqu’à l’obtention d’une image
nette.

Ø Exploration de la préparation : la préparation est déplacée délicatement

jusqu’à trouver l’objet recherché.

Ø Changement de grossissement : il faut placer la zone à agrandir au centre de

la platine, puis changer d’objectif en tournant le barillet, sans toucher au réglage
précédent. Le changement d’objectif se fait toujours du plus faible au plus fort
grossissement. La nouvelle mise au point se fait seulement par la petite vis. Que
faire pour ne pas endommager les préparations.

1- Toujours commencer l’observation avec l’objectif le plus faible.

2- N’utiliser la vis macrométrique (la grosse) qu’à faible grossissement.

3- Fixer la lame avec les valets : si l’un d’eux est manquant, ne pas incliner le
microscope

4- Ne jamais descendre le tube sans surveiller la platine et la lame en regardant

sur le côté.

5- Aux grossissements supérieurs, n’utiliser que la vis micrométrique.

6- Si la vis semble bloquée, il faut s’assurer que l’objectif n’appuie pas sur la lame.

La microscopie en contraste de phase

Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans
leur milieu d'origine. C'est donc l'une des rares qui permet d'observer des cellules
vivantes. Elle est ainsi
très utilisée en ingénierie cellulaire. Le principe est basé sur le fait que les
structures biologiques sont transparentes.

Cette technique permet de transformer une différence d’indice de réfraction dans

l’échantillon en une différence d’intensité. Le principe consiste à éclairer
l’échantillon avec un anneau lumineux (obtenu en plaçant une plaque percée d’un
anneau dans le condenseur) et à récupérer la lumière avec un objectif spécial
comportant une plaque de phase, c’est-à-dire une plaque avec un anneau (de la
taille de l’image de l’anneau du condenseur par l’objectif) entrainant un déphasage
de la lumière qui le traverse (figure 1).

Figure 1. Microscope en contraste de phase

Seule la lumière non-déviée par l’échantillon passera par cet anneau et sera ainsi
en opposition de phase avec la lumière réfractée (qui passe dans le reste de la
plaque de phase). Il s’ensuit des interférences destructrices au plan image ce qui
permet d’observer des variations d’amplitude correspondantes à des variations de
l’indice de réfraction de l’échantillon. L’alignement de la plaque de phase et de
l’anneau du condenseur est particulièrement important pour obtenir cet effet.

Mode de fonctionnement

Technique du microscope à fond noir (microscopie par transmission en

champ sombre)

Le microscope à fond noir est un microscope optique utilisé pour augmenter

les contrastes (répartition de la lumière entre les parties claires et sombres)
des objets transparents

Avant le développement de la microscopie à contraste de phase dans les années

1930, la microscopie à fond sombre était la seule méthode de renforcement du
contraste pour des objets non colorés.

Le microscope à fond noir (ou en champ sombre) permet d'améliorer le contraste

d'échantillons qui sont transparents et difficilement observables au microscope
optique classique. L’échantillon est éclairé de derrière de telle façon que
l'éclairage ou La lumière source (transmise) ne tombe pas (n'atteint pas)
directement dans l'objectif ; Seule la lumière déviée par l'échantillon atteint
l'objectif (seule la lumière diffusée et donc déviée par l'échantillon peut être
observée). Le fond de l'image apparaît donc sombre, tandis que les objets de
l'échantillon paraissent clairs et le contraste est ainsi fortement amélioré, sans
nécessiter la coloration d'un échantillon pourtant transparent (figure 2).

La microscopie à fond noir est adaptée aux échantillons non colorés. Elle permet
d'observer des structures vivantes et en déplacement comme des bactéries ou des
organismes