INTRODUCTION [17, 24]

Les entérobactéries sont des bacilles Gram négatif dont la plupart sont
mobiles grâce à des flagelles disposés de manière péritriche. Leur culture est
facilement réalisée sur les milieux usuels.

Leur abondance dans l’intestin, leur mobilité, leur rapidité de

multiplication, leur fréquente résistance aux antibiotiques expliquent qu’elles
soient les bactéries les plus impliquées en pathologie infectieuse humaine
surtout en milieu hospitalier.

Parmi la gamme très variée de bactéries telles que les entérobactéries,

d’autres espèces ont été identifiées en particulier les bacilles Gram négatifs
non fermentaires.

Ce sont des bactéries immobiles ou mobiles par leur ciliature polaire.

Leur culture s’effectue très facilement sur les milieux usuels.
Ce groupe bactérien est très riche en individualité, il est composé d’une
vingtaine de genres et de plusieurs dizaines d’espèces. Celles-ci sont souvent
opportunistes et responsables d’infections nosocomiales.

L’importance des entérobactéries et des bacilles Gram négatifs non

fermentaires, en pathologie humaine s’explique aussi bien par la variété des
espèces qui le composent qu’à leur incidence au niveau de la santé des
populations.

L’identification de ces espèces est de plus en plus facilitée au

laboratoire par l’utilisation de nombreuses galeries d’identification dont :
 Les galeries classiques avec un nombre de caractères limités. Mais elles
nécessitent souvent le recours à d’autres tests biochimiques
complémentaires.
 Les galeries API sont très performantes mais leur coût est élevé.

1
 C’est dans cette lancée que l’unité de recherche et de biotechnologie
microbienne du laboratoire de bactériologie-virologie de l’hôpital Aristide Le
Dantec a élaboré une technique d’identification reposant sur l’utilisation de
mini galeries à savoir les microplaques CSB.

De nombreuses études effectuées dans ce laboratoire ont démontré

l’efficacité de ces microméthodes dans l’identification bactérienne. En effet
celles-ci sont simples, fiables, peu onéreuses et surtout accessibles aux
structures de santé.

Seulement, l’identification n’était possible qu’après une incubation 24h

de ces microplaques ce qui a constitué un handicap dans l’établissement d’un
traitement efficace et rapide.

Ainsi notre souci actuel est de pouvoir délivrer des résultats fiables
dans un délai aussi court que possible pour une bonne prise en charge des
patients. C’est dans cette optique que nous nous sommes fixés les objectifs
suivants :

o Rechercher l’effet de l’inoculum sur l’identification des bactéries

o Etudier l’impact de la taille de l’inoculum sur le temps
d’incubation des galeries Micro-CSB.

Pour atteindre ces objectifs, nous allons d’abord après un bref rappel
des généralités, rechercher grâce à la technique de dénombrement sur boîte de
pétri, l’inoculum adéquat, nous permettant ensuite d’obtenir un meilleur profil
d’identification en un temps réduit.

2
I. LES ENTEROBACTERIES

1.1. Définition [9, 13, 26, 32]

La famille des entérobactéries comprend plusieurs genres bactériens. Ce

sont des bacilles à Gram négatif, immobiles ou mobiles grâce à une ciliature
péritriche. Ils sont aéro- anaérobies facultatifs et se développent sur milieu
ordinaire. Ils sont dépourvus d’oxydase et ont la faculté de fermenter le
glucose, mais aussi de réduire les nitrates en nitrites.
Les différences entre les nombreux genres et espèces viennent de critères
plus précis, comme la fermentation des différents sucres, la production ou non
de sulfure, la présence ou l’absence d’enzymes du métabolisme (désaminases,
décarboxylases).

1.2. Taxonomie

1.2.1. Historique [11, 12, 25]

La période de naissance de la famille des Enterobacteriaceae se situe

entre 1937 lorsque 0tto RAHN proposa le genre Enterobacter pour regrouper
les microorganismes présentant des propriétés biochimiques et
morphologiques communes et parmi lesquels on trouvait déjà des noms tels
que Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Serratia ou Shigella.
Deux années après cette description qui concernait 112 espèces, ce
nombre fut ramené à 67.
Avec les travaux de DON BRENNER et de PATRICK A.D.
GRIMONT, cette famille a connu un essor et beaucoup de nouveaux genres et
espèces furent découverts.
En 1972, EDWARD et EWING intégraient 11 genres et 26 espèces dans
la famille des Enterobacteriaceae.

3
 En 1973, 31 genres et 139 espèces étaient caractérisés.
En 1985, FARMER et COLL décrivaient 22 genres comprenant 69
espèces et 29 groupes entériques.

1.2.2. Habitat [3, 10]

Les Enterobactéries sont des hôtes du tube digestif de l’homme et de

nombreux animaux où ils sont retrouvés soit à l’état de pathogène, soit à l’état
de commensaux. Mais cette localisation digestive n’est pas exclusive.
On les retrouve également dans l’environnement (sols, eau) où ils
participent à la dégradation des matières organiques, à l’altération des plantes
suite à des nécroses, à une dégénérescence ou à un ramollissement.

1.2.3. Classification

La famille des Enterobacteriaceae comprend actuellement 100 espèces

répertoriées. Les espèces les plus communément isolées en bactériologie
clinique appartiennent à 12 genres : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serretia,
Shigella, Yersinia.

Cette classification est résumée dans le tableau I :

4
Tableau I : Classification des espèces d’entérobactéries les plus
fréquentes en clinique humaine [26]

Groupes Familles Genre Espèces

Edwardsielleae Edwardsiella
Salmonella typhi
GROUPE I Salmonnelleae Salmonella S. paratyphi
S. enteritidis
Escherichia Escherichia coli
Shigella Shigella dysenteriae
GROUPE II Escherichieae Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
Levineae Levinea
Klebsiella Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxymore
Enterobacter Enterobacter aerogenes
GROUPE III Klebsielleae Enterobacter cloaceae
Serratia Serratia marcescens
Erwinia
Proteus Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
GROUPE IV Proteae Proteus rettgerii
Providencia
Yersinia Yersinia enterolitica
GROUPE V Yersinieae Y. pseudotuberculosis

5
 1.3 Les caractères bactériologiques

I.3.1 Les caractères morphologiques [5, 6, 10, 22, 24]

Toutes les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique,

sous forme de bacilles à gram négatif de 2 à 3µ de long sur 0,6µ de large
généralement polymorphes. Les espèces les plus nombreuses le sont grâce à
une ciliature péritriche. Les autres sont immobiles (Klebsiella, Shigella,
Yersinia pestis). La présence d’une capsule visible au microscope est
habituelle chez Klebsiella. La plupart des espèces pathogènes chez l’homme
possèdent des pili (ou fimbriae) qui constituent des facteurs d’adhésion.

I.3.2. Les caractères culturaux [5, 10, 15, 27]

Les entérobactéries aérobie-anaérobies facultatives se développent

facilement sur milieux nutritifs simples.
Sur milieux gélosés, les colonies d’entérobactéries sont habituellement
lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou S). Cet aspect
peut évoluer après cultures successives vers des colonies à surface sèche et
rugueuse (type « rough » ou R).
Les colonies de bactéries capsulées telles que Klebsiella sont mucoïdes,
plus grandes que les colonies S, avec une tendance à la confluence.

I.3.3. Les caractères biochimiques [21]

Le diagnostic de genre et d’espèce repose sur l’étude des caractères

biochimiques, après que le diagnostic de famille ait été établi avec certitude.

I.3.3.1. Production d’Hydrogène sulfuré (SH2)

La production de SH2 par les microorganismes est mise en évidence par

incorporation du fer ou de plomb dans le milieu destiné à cette étude. Il se
forme un précipité noir de sulfure de fer ou de plomb. Ce souffre réduit va se
combiner avec le fer ferreux Fe2+ qui vient du sulfate de fer.

6
 I.3.3.2. Recherche de l’uréase

Les bactéries possédant une uréase active scinde l’urée en dioxyde de

carbone et en ammoniaque. Ceux-ci en se combinant donnent du carbonate
d’ammonium.
Le carbonate d’ammonium formé alcalinise le milieu, ce qui ce traduit
par le virage de l’indicateur coloré de l’orange au rose framboise ou dans de
rares cas au rouge violacé.

[Link]. Production d’indole

Certaines bactéries dégradent le tryptophane grâce à une tryptophanase.

Il se forme de l’indole, de l’acide pyruvique et de l’ammoniac.
L’indole est apolaire et réagit fortement avec le paradiméthylamino-
benzaldéhyde en milieu acide pour donner un anneau rouge qui remonte en
surface.

[Link]. Recherche des décarboxylases

Les décarboxylases (LDC, ODC, ADH) scindent les acides aminés,

entraînant la formation de l’amine correspondante et la libération de CO2.
Il s’agit d’enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH
acide (pH optimum : 3,5 à 5,5) et des conditions d’anaérobiose.
Le milieu d’étude contient du glucose, un indicateur coloré (le rouge
phénol) et bien entendu un acide aminé.
Chez les bactéries à métabolisme, la fermentation du glucose entraîne
une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthèse de l’enzyme ;
l’alcalinité due à l’amine entraîne ensuite le virage de l’indicateur au violet
après une courte phase de jaunissement.
Si la bactérie étudiée ne possède pas de décarboxylases, le milieu restera
acide, donc jaune.

7
 [Link]. Recherche des désaminases oxydatives

Les désaminases, enzymes induites, agissent sur les acides aminés en

entraînant la formation des acides cétoniques correspondants.
Les acides cétoniques formés ont la propriété de donner des complexes
colorés avec les ions Fe3+, réaction utilisée pour la lecture.

[Link]. Utilisation du Citrate de Simmons (CS)

L’utilisation du citrate, comme seule source de carbone par les bactéries,
se traduit par une alcalinisation du milieu (virage au bleu).

[Link]. Utilisation du malonate

Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate
déshydrogénase).
Seules les bactéries qui peuvent utiliser le cycle glyoxalique sont
capables de pousser sur un milieu au malonate.
L’utilisation du malonate s’accompagne d’une libération d’ions OH -
alcalinisant

[Link]. Action de la Phényl Alanine Désaminase (PDA)

La PDA, enzyme induite, agit sur la phényl alanine en entraînant la
formation d’acide cétonique correspondant.
L’acide cétonique formé a la propriété de donner des complexes colorés
avec les ions Fe3+ donnant une coloration bleue.

[Link]. Milieu au Citrate de Christensen (CC)

A la différence du Citrate de Simmons, ce milieu contient une faible

quantité de glucose, d’extrait de levure et une source d’azote organique.
Dans ces conditions, certaines bactéries citrate négatif sur milieu de
Simmons sont capables d’utiliser le citrate en milieu de Christensen.
La formation d’ions hydroxyles alcalinise le milieu (virage du jaune au
rose).

8
 [Link]. Recherche de l’acétoïne ou Réaction de Voges-Proskauer (VP)

On étudie la formation de l’acétyl méthyl carbinol (A.M.C. ou acétoïne)

soit à partir de deux molécules d’acide pyruvique, soit à partir du glucose.
En présence d’une base forte, l’acétoïne donne une coloration rouge en
milieu très oxygéné (oxydation en diacétal).

[Link]. Test à l’ONPG (Orthonitrophényl -D-Galactopyranoside)

Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de -galactosidase

dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l’ONPG et non le
lactose.
En effet, il existe des germes qui reconnaissent l’ONPG du côté du nitro-
2-phénol et non de celui du -galactoside. Ces germes ont donc une activité
ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas les lactoses.
Le test à l’ONPG est une technique basée sur l’action directe de l’enzyme
sur une molécule chromogène pouvant être l’ortho-nitrophényl--D-
galactopyranoside ou le 2-naphtol--D-galactopyranoside. Ceux-ci sont
utilisés comme substrats et libèrent respectivement l’orthonitrophénol (jaune)
et le -naphtol.

1.4. Etude des principaux genres

1.4.1. Escherichia [8, 17, 27]

Ce genre ne comporte qu’une seule espèce Escherichia coli. Les souches

immobiles et agazogènes anciennement décrites comme Alkalescens dispar ne
sont plus qu’un biovar d’Escherichia coli.

9
  Escherichia coli
Hôte normal de l’intestin et des animaux, c’est l’espèce aérobie la plus
représentée dans le tube digestif. La présence de colibacilles ou espèces
voisines dans l’eau est un témoin de contamination fécale [1, 5]
Escherichia coli exprime les caractères généraux des entérobactéries. Il
est en outre :
- lactose +
- indole +
- citrate -
- acétoïne -
- H2S -
- gaz +
- uréase -

Il existe différents pathotypes d’Escherichia coli responsables

d’infections intestinales :
- ETEC : Enterotoxinogen Escherichia coli, responsable de la
« diarrhée des voyageurs » ou « turista » et des syndromes
épidémiques dans les pays du Tiers-monde ;
- EIEC : Enteroinvasive Escherichia coli, encore appelé Escherichia
coli Shigella-like, responsable de syndromes dysentériques avec
invasion de la muqueuse intestinale ;
- EHEC : Enterohaemorragic Escherichia coli, responsable de
diarrhées sanglantes liées à la production de toxines ;
- EPEC : Enteropathogen Escherichia coli, responsable de gastro-
entérites infantiles.

10
 1.4.2. Klebsiella [12, 18, 21]

Au sein des entérobactéries, les bactéries du genre Klebsiella se

distinguent par leur immobilité constante, leur groupement en diplobacilles
généralement encapsulés.
On distingue cependant plusieurs espèces mais Klebsiella pneumoniae
est la plus fréquemment retrouvée en clinique humaine.

 Klebsiella pneumoniae

Connue autrefois sous le nom de pneumobacille de Friedlander,

Klebsiella pneumoniae est une bactérie commensale de l’intestin, des voies
respiratoires et des animaux.
Chez l’homme, elle est l’agent responsable des pneumopathies aiguës,
d’angines, d’otites, de cystites et d’affections rénales.
Ce sont des bactéries Gram négatif immobiles capsulées, surtout au sortir
de l’organisme, très polymorphes.
Sur gélose : les colonies de type mucoïde ont un aspect caractéristique ;
elles sont volumineuses (4 mm de diamètre), bombées, brillantes, opaques et
souvent confluentes.
En bouillon, on note la formation d’un trouble dense avec colorette
visqueuse.
Klebsiella pneumoniae est en général :
- Gaz +++
- Lactose +
- ONPG +
- Urée +
- Indole -
- VP +
- ODC -.

11
 1.4.3. Salmonella [7, 8, 27]

Présents dans l’eau et dans diverses denrées alimentaires, les

Salmonelles sont pathogènes, soit exclusivement pour l’homme (Salmonella
typhi), soit exclusivement pour l’animal (Salmonella abortus ovis).
Chez l’homme, elles sont responsables de la fièvre typhoïde et de gastro-
entérites.
Chez l’animal, les tableaux cliniques sont variés : avortements chez
différentes espèces, septicémies du jeune ou entérites.
La morphologie est celle des entérobactéries. Certaines souches
habituellement mobiles peuvent à l’isolement se présenter sous forme
immobile.
Les colonies mesurent en général 1,5 à 3 mm après 24 heures
d’incubation à 37°C et apparaissent lors de l’isolement sous forme S.
Cependant on observe des colonies naines avec des sérotypes pathogènes
pour les animaux (Salmonella abortus ovis, Salmonella typhi suis) et
exceptionnellement avec des sérotypes pathogènes pour l’homme.
La plupart des salmonelles sont :
- H2S + (sauf paratyphi A)
- LDC +
- ONPG -
- Indole -
- CS variable
- Gélatine -
- Uréase et TDA -.

12
II. BACILLE A GRAM NEGATIF NON FERMENTAIRE :
ACINETOBACTER [4, 22]

2.1. Historique

En 1911 BEIJERINCK a décrit un germe isolé du sol, Micrococcus

calcoaceticus.
En 1939 DE BORD publie un travail préliminaire en mettant en place un
groupe de coccobacilles à Gram négatif proches des Neisseria qu’il classe
dans la tribu des Mimae (Mima polymorpha).
En 1940 AUDUREAU décrit une espèce qu’il rapproche des Moraxelles, sans
savoir leurs exigences nutritives, sous le nom de Moraxella lwoffi.
Le genre Acinetobacter a été décrit par BRISOU et PREVOT en 1954.
BAUMANN, DOUDOROFF et STANIER en 1968 ont proposé de réunir
toutes ces variétés dans une seule espèce et un seul genre Acinetobacter
calcoaceticus.

2.2. Classification

Dés 1940, AUDUREAU avait noté la ressemblance entre B. anitratum et les

Moraxella. En décrivant M. glucidolytica, PIECHAUD proposa de scinder les
Moraxella en deux groupes :
 Moraxella du groupe I : avec une oxydase
 Moraxella du groupe II : sans oxydase
Le sous-comité a proposé de séparer définitivement Acinetobacter de
Moraxella. Ainsi Acinetobacter correspond aux Moraxella du groupe II de
PIECHAUD.
Les Moraxelles constituent désormais le genre III de la famille des
Neisseriaceae. Les Acinetobacter, proposés initialement en appendice de cette
famille, en constituent maintenant le genre IV.

13
Une seule espèce est reconnue : Acinetobacter calcoaceticus.
Parmi les travaux qui ont permis de clarifier la position de Acinetobacter, il
faut citer l’importante étude taxonomique que publia en 1967, MARGARET
THORNLEY.

2.3. Habitat

Acinetobacter est une bactérie tout à fait ubiquitaire : elle existe sur le sol,
dans les eaux douces et marines. Chez les animaux, elle est présente dans le
tube digestif et à la surface des muqueuses ouvertes sur l’extérieur ; de même
que chez l’homme. Son isolement est assez habituel à partir de l’expectoration
et des prélèvements génitaux, où sa présence peut parfois poser des problèmes
de diagnostic différentiel avec certaines espèces de Neisseria.
Etant donné sa répartition dans la nature, Acinetobacter est donc fréquemment
un agent de contamination : aliments, produits biologiques, malades.

2.4. Caractères Bactériologiques

2.4.1. Les caractères morphologiques

Les espèces du genre Acinetobacter se présente sous forme de bacilles de

longueur variable de 1µm (formes coccoïdes) à 3µm ou 5µm (en moyenne)
jusqu’à des formes filamenteuses de plusieurs dizaines de µm. Leur diamètre
est légèrement supérieur à 1µm.
Acinetobacter est à Gram négatif. Cette bactérie ne possède pas de flagelle
elle est immobile.

14
 2.4.2. Les caractères culturaux

Acinetobacter est aérobie strict. Il se développe facilement sur milieux

nutritifs simples. En milieu liquide, le trouble est homogène, avec parfois une
légère collerette en surface (souches muqueuses). Sur gélose nutritive, les
colonies en 24h ont un diamètre de 2 à 3mm ; elles sont convexes, luisantes
et blanchâtres. Sur gélose au sang les colonies sont plus volumineuses.
Quelques souches se développent sans difficulté sur certains milieux sélectifs
destinés à l’isolement des entérobactéries.
La température optimale de pousse est inférieure à 37°C. Acinetobacter
n’est pas pigmenté et n’élabore pas de toxine.

2.4.3. Les caractères biochimiques

Dans une batterie d’épreuves d’identification pour bacilles à Gram négatif,

Acinetobacter montre beaucoup de réactions constamment négatives :
- indole (-)
- nitrate-réductase (-)
- H2S (-)
- VP (-)
- RM (-)
Un certain nombre de caractères varient suivant les souches :

 L’acidification à partir des sucres

Les souches qui attaquent le glucose, acidifient ainsi le milieu à partir du

xylose, de l’arabinose et du galactose. Le lactose est aussi attaqué mais par
une voie ne produisant que peu d’acide ; aussi est-il nécessaire pour mettre en
évidence cette attaque d’utiliser une concentration de lactose à 10% dans un
milieu. L’attaque des sucres se fait toujours par voie oxydative en aérobiose.
Le saccharose, le fructose, le mannitol ne sont jamais attaqués.

15
  L’hydrolyse de la gélatine

Environ 10% des souches non glucidolytiques et 25% des souches

glucidolytiques hydrolysent la gélatine (le résultat est plus facilement observé
si la culture est faite en aérobiose à la surface d’une gélose à la gélatine).

 L’hémolyse au sang frais

Certaines souches montrent une hémolyse intense, d’autres ne modifient

pas le sang. La nature du sang ne semble pas avoir d’importance.

 L’utilisation du citrate

La majorité des souches utilisent le citrate comme seule source de

carbone mais certaines se développent sans alcaliniser le milieu de Simmons.

 Les autres sources de carbone

On observe une utilisation très variable suivant les souches. Leur source
d’énergie est également très variable.

 L’uréase

Certaines souches possèdent une uréase très active. Ce fut le cas de

toutes les souches isolées en 1952 par LEMOIGNE et à partir d’échantillon de
sol provenant de diverses régions de France.

 Désaminase Décarboxylase : Absentes

Enfin toutes les souches de Acinetobacter se développent sur un milieu

minéral simple.

16
III. NUTRITION ET CROISSANCE BACTERIENNES [2]

3.1. Conditions nutritionnelles et environnementales

La croissance bactérienne est dépendante de la composition de son

environnement, qui lui fournit toutes les substances indispensables et les
conditions convenables à son développement.

3.1.1. Besoins nutritifs de la cellule bactérienne

Les bactéries ont toutes des besoins communs de base, comme eau,
sources d’énergie, et nutriments (sources de carbone, d’azote et autres
éléments nécessaires aux biosynthèses).

[Link]. Les nutriments de base permettant de générer la biomasse

La première indication des besoins est liée à la constitution de la cellule

bactérienne. L’analyse de la cellule bactérienne montre que 95% de son poids
sec correspond à quelques éléments majeurs. Ceux-ci sont appelés les
macroéléments ou macronutriments. D’autres éléments sont nécessaires en
quantité faible : micro-éléments ou micronutriments.

 L’eau

L’eau représente 80 à 90% du poids cellulaire. C’est un élément

fondamental, solubilisant les nutriments, assurant leur transport et réalisant
des réactions d’hydrolyse. Un paramètre, l’Aw (activité de l’eau), quantifie la
disponibilité de l’eau. Il est compris entre 0 et 1. Les micro-organismes
exigent un certain seuil d’humidité. Si l’Aw est trop faible, la croissance
diminue. Les formes de résistance des bactéries (endospores), peuvent se
maintenir dans un environnement « sans eau libre ».

17
  Macro-éléments

Six de ces éléments représentent environ les 95% du poids sec de la

bactérie. Ce sont le carbone, l’azote, l’oxygène, l’hydrogène, le phosphore et
le souffre, mais aussi les constituants des acides nucléiques, glucides, lipides
et protéines.
D’autres ont une moindre importance quantitative, par ex : potassium,
magnésium, calcium et fer (certains participant à l’activation d’enzymes).

 Besoins en carbone

Deux groupes de bactéries existent quand à l’assimilation du carbone :

Ceux qui utilisent comme source unique de carbone, un carbone minéral
(comme le CO2) : ce sont les C-autotrophes. La réduction du carbone à partir
de l’anhydride carbonique demande beaucoup d’énergie et de nombreuses
bactéries ne peuvent effectuer cette transformation. Celles qui utilisent
comme sources de carbone, un composé organique, préformé et réduit par
d’autres organismes sont les C-hétérotrophes. Souvent les substances sont en
même temps des sources d’énergie.
Certaines bactéries peuvent utiliser le carbone minéral et organique (« C-
mixotrophes »). Certains substrats carbonés ne sont pas assimilés mais servent
de source d’énergie.

 Micro-éléments

Pour les autres bio-éléments, la cellule en demande de très faibles

quantités. Ils sont souvent apportés comme impuretés du matériel, de l’eau,
des sels utilisés pour fabriquer le milieu de culture. Citons les plus
importants : Mn, Co, Cu, Mo, Zn, Ni.

18
 [Link]. Les aliments énergétiques

Les micro-organismes ont besoin d’énergie pour synthétiser la biomasse,

pour réaliser un travail (mobilité, transport de substrats). La source d’énergie
peut être la lumière ou souvent l’oxydation d’un substrat oxydable dit
« énergétique » donneur d’électrons. La récupération de l’énergie sous forme
d’ATP est liée, soit à un transfert d’électrons par des chaînes de transport à
partir d’un donneur vers un accepteur, soit à une phosphorylation au niveau
du substrat.

3.1.2. Autres facteurs intervenant dans la croissance des bactéries

En dehors de l’eau, des nutriments et des sources énergétiques, le milieu

de croissance doit présenter des paramètres physiques adaptés aux
caractéristiques des bactéries présentes.

[Link]. Le pH

Il intervient dans l’activité métabolique et la perméabilité membranaire.

Les bactéries maintiennent un pH interne relativement constant, mais elles
tolèrent de large variation de pH. De nombreuses bactéries se multiplient
préférentiellement à un pH neutre (6,5 - 7,5). Les acidophiles préfèrent des
pH inférieurs à 6, les basophiles ou alcalinophiles se développent de façon
optimale à pH supérieur à 8.
Par conséquent, il sera possible d’enrichir un prélèvement en un type de
bactérie recherché par utilisation d’un milieu à un pH déterminé (ex : pH=9
pour Vibrio cholerae).
Le développement de micro-organismes dans un milieu de culture peut
modifier fortement le pH. Il est donc nécessaire d’introduire des substances
tampons pour limiter ces variations.

19
 [Link]. La pression osmotique du milieu

La pression osmotique est fonction de la concentration du soluté de part

et d’autre d’une membrane. Les bactéries ont des systèmes de transport qui
assurent des conditions osmotiques constantes à l’intérieur de la cellule. La
plupart des bactéries ont une bonne tolérance aux variations de pression
osmotique, en raison de la présence d’une paroi rigide et maintiennent une
pression de turgescence, à l’exception des mycoplasmes (sans paroi).
Certaines bactéries ne peuvent croître que dans des milieux à forte
concentration de NaCL (supérieure à 0,2M), ce sont des halophiles. Il y en a
qui sont non halophiles et qui se développent à des taux de NaCL inférieurs à
0,2M.

[Link]. La température

Le domaine de température de croissance d’une bactérie est défini par les

températures cardinales : température optimale, minimale et maximale.
Les bactéries mésophiles peuvent se développer à environ 5 à 45 °C
(optimum 30 à 37°C).
Les bactéries thermophiles peuvent croître entre 25 et > 55°C (optimum
vers 50°C)
Les bactéries psychrophiles peuvent se développer à environ -15°C à
20°C (optimum vers 5 – 10°C).
Les bactéries psychrotrophes quand à elles croissent à des températures
comprises entre -5°C et 35°C (optimum souvent vers 20 - 25°C).

20
 [Link]. L’oxygène moléculaire

Certaines bactéries ont besoin d’oxygène libre pour leur métabolisme.

Lors de leur métabolisme énergétique, la récupération de l’énergie par des
chaînes de transport d’électron est liée à un accepteur final d’électrons qui est
l’oxygène moléculaire. C’est la respiration des bactéries aérobies strictes.
D’autres bactéries ne peuvent pas suivre en présence d’oxygène libre : elles
sont anaérobies strictes. D’autres par contre peuvent survivre en présence ou
en l’absence d’oxygène libre : ce sont les anaérobie-aérobies facultatives.

3.2. Croissance bactérienne

3.2.1. Définition [30]

La croissance bactérienne se définit comme l’accroissement ordonné et

coordonné de tous les constituants du micro-organisme unicellulaire, jusqu’à
une dimension limite, qui normalement conduit à la division cellulaire par
scission binaire. Il en résulte une augmentation du nombre d’individus et une
augmentation de la masse cellulaire. Cette multiplication bactérienne conduit
à la réplication du nucléoïde bactérien, suivi de la division cellulaire, résultant
de l’allongement concomitant de la membrane cytoplasmique et de la paroi,
avec formation d’un septum transversal qui partage les composants
cytoplasmiques et sépare les deux nucléoïdes bactériens. Deux cellules filles
identiques sont issues de la cellule mère.

3.2.2. La courbe et les phases de la croissance [17, 30]

Si un milieu liquide non renouvelé est ensemencé avec des cellules

bactériennes prélevées d’une culture déjà saturée et le nombre de cellules
viables par millilitre déterminé régulièrement, une courbe du type de celle de
la figure ci-dessous, est habituellement obtenue. La courbe peut être
segmentée en 7 phases représentées par les chiffres 1 – 7.

21
Log N UFC/ml)

1 2 3 4 5 6 7 Temps

Figure 1 : Les 7 phases de la cinétique de croissance d’une population

bactérienne d’après Buchanan (1919) [17, 30].

 La phase de latence (1) [30]

Elle représente la période où les cellules ayant épuisées les métabolites et

les enzymes de leur environnement initial, s’adaptent à leur nouvel
environnement. Les enzymes et les intermédiaires sont formés et
s’accumulent jusqu’à ce qu’ils soient présents à des concentrations permettant
une reprise de la croissance.
Elle peut être supprimée en incubant le milieu avec des bactéries
prélevées pendant la phase exponentielle de croissance.

 La phase d’accélération (2) [30, 31]

Au cours de laquelle, le taux de croissance s’accroît régulièrement.

22
  La phase exponentielle (3) [19, 30, 31]

Les cellules sont en équilibre. Le nouveau matériel de la cellule est

synthétisé à un taux constant, mais ce matériel est également catalysé, et la
masse augmente de façon exponentielle. Ceci continue jusqu’à ce que l’un des
deux phénomènes suivants se produisent : un ou plusieurs des nutriments
s’épuisent dans le milieu, ou, que des produits métaboliques toxiques
s’accumulent et inhibent la croissance. Le taux de croissance devient constant
et atteint sa valeur maximale.

 La phase de ralentissement (4) [16, 30, 31]

Elle est liée à l’épuisement du facteur limitant. La valeur de µ diminue

progressivement.
µ : taux de croissance

 La phase stationnaire (5) [16, 30]

Elle est liée à l’épuisement de l’aliment, à l’accumulation de produits

toxiques ou à la constitution d’un équilibre ionique défavorable.

 La phase de décroissance (6) [30, 31]

Au cours de laquelle la masse bactérienne décroît et le taux de croissance

prend des valeurs négatives. Cette phase de décroissance correspond à une
mort et à une lyse progressive des bactéries en présence des déchets du
métabolisme accumulés pendant la croissance.

 La phase de mortalité logarithmique (7) [30]

Durant cette phase le taux de mortalité par organisme reste constant.

23
 3.2.3. Techniques de mesure de la croissance bactérienne [19, 31]

La croissance bactérienne peut être appréciée en estimant, en fonction du

temps, les variations de la masse bactérienne ou, plus souvent, du nombre de
cellules.
Des concentrations microbiennes peuvent être mesurées en termes de
concentration en cellules (le nombre de cellules viables par unité de volume
de culture) ou de la concentration de biomasse (poids sec de cellules par unité
de volume). Ces deux paramètres ne sont pas toujours équivalents, parce que
le poids sec moyen de la cellule change à différentes étapes de l’évolution
d’une culture. Ils ne sont pas non plus d’importance égale.
Deux groupes de méthodes sont utilisés pour mesurer la croissance
bactérienne :
- les méthodes de numération,
- les méthodes quantitatives.

 Méthode de numération [16, 19, 20, 31]

Deux méthodes principales peuvent être utilisées :

 Numération totale : elle consiste à dénombrer au microscope ou

avec des compteurs spéciaux les individus viables ou non.
Les cellules mortes ne peuvent pas être distinguées de celles en vie.
Seules les suspensions denses peuvent être comptées (>10 cellules par ml),
mais des échantillons peuvent être concentrés par centrifugation ou filtration
pour augmenter la sensibilité ;
 Numération des cellules viables : on compte les colonies
bactériennes apparues sur ou dans un milieu de culture gélosé
convenable, inoculé par une aliquote d’une suspension bactérienne
homogène et suffisamment diluée.

24
 Sur un milieu approprié, chaque unité viable croît et forme une colonie.
Chaque colonie pouvant être comptée s’appelle une unité formant colonies
(UFC), et le nombre d’UFC est lié au nombre de bactéries viables dans le
milieu. Cette méthode est plus facile et de très grande sensibilité, mais elle
nécessite beaucoup de dilutions et de boîtes.

 Méthodes quantitatives [16, 19, 20, 31]

Plusieurs méthodes sont envisageables, parmi lesquelles :

 La mesure directe de la masse bactérienne : en principe, la biomasse

peut être mesurée directement en déterminant le poids sec d’une culture
microbienne. Les bactéries sont lavées, séchées et pesées. C’est une
méthode longue qui nécessite une grande quantité de cellules pour que
les pesées soient assez précises. Mais c’est la méthode de référence
(1mg de poids sec correspond à quelques milliards de corps bactériens).
 La mesure de l’activité enzymatique : mesure du pH, mesure de la
consommation de l’oxygène. Ces méthodes sont peu précises.
 Le dosage de l’azote bactérien : cette méthode a les mêmes applications
que la méthode gravimétrique.
 La mesure de la densité optique : ici on admet que l’absorption
lumineuse est proportionnelle à la masse des microbes. Elle est rapide
et précise, mais sa sensibilité est modérée, car il faut une teneur d’au
moins 10 bactéries/ml pour obtenir une densité optique mesurable. Elle
est fortement entachée d’erreurs en cas de suspensions bactériennes non
homogènes.

25
 3.2.4. Conditions de croissance des familles bactériennes étudiées [17, 28]

[Link]. Les entérobactéries

Elles se développent entre 20 et 40°C avec un optimum à 37°C.

Ces germes mésophiles et neutrophiles (pH optimum voisin de 5,5-8) sont
assez tolérants aux variations de la pression osmotique. Ils sont aéro-
anaérobies facultatifs avec un métabolisme fermentatif.

[Link]. Bacilles Gram négatif non fermentaires

Bactéries psychrophiles, c’est-à-dire se développant à 0°C, alcalinophiles et

qui supportent assez bien les variations de la pression osmotique.
Elles sont aérobies strictes avec un métabolisme oxydatif.

26
IV. QUELQUES PARAMETRES DE VALIDATION [34]

4.1. Corrélation et droite de régression

4.1.1. Notion de corrélation

La corrélation consiste à mesurer le degré d’association existant entre deux

caractères. Pour calculer le coefficient de corrélation entre 2 variables, cela
revient à résumer la liaison qui existe entre les variables à l'aide d'une droite.
On parle alors d'un ajustement linéaire.
Pour calculer les caractéristiques de cette droite, il faut faire en sorte que
l'erreur que l'on commette en représentant la liaison entre nos variables par
une droite, soit la plus petite possible. Le critère formel le plus souvent utilisé,
mais pas le seul possible, est de minimiser la somme de toutes les erreurs
effectivement commises au carré. On parle alors d'ajustement selon la
méthode des moindres carrés ordinaires. La droite résultant de cet ajustement
s'appelle une droite de régression. Plus la qualité globale de représentation de
la liaison entre nos variables par cette droite est bonne, et plus le coefficient
de corrélation linéaire associé l'est également. Il existe une équivalence
formelle entre les deux concepts.

27
 4.1.2. Droite de régression

Dans les cas où le diagramme de dispersion montre l'existence d'une relation

linéaire, on désire déterminer la droite qui décrira le mieux cette relation.
Cependant, le choix de cette droite dépend d'un critère qu'il faudra fixer.
Le critère mathématique est celui des moindres carrés. Selon ce critère, on
cherche à minimiser la somme des carrées des écarts entre les valeurs
estimées et les valeurs observées de la variable dépendante.
En formule la droite de régression sera donnée par :

Avec :

x = la valeur de la variable indépendante

y’ = la valeur estimée de la variable indépendante
a = l’ordonnée à l’origine
b = la pente

4.2. Limite de détection

C’est la plus petite quantité ou concentration qui peut être distinguée, avec
une probabilité connue, d’un blanc de la réaction réalisé dans les mêmes
conditions. Elle et égale à k fois l’écart type de précision, mesuré sur le blanc.
Si le nombre de valeur = 30, la valeur de 3 est retenue pour k.

28
 LD = S x k

LD = S x k

LD = limite de détection LD = S x k

S = écart-type
K = facteur dépendant du nombre de mesures effectuées

4.3. Précisions

C’est le degré d’accord entre les résultats obtenus lors d’essais différents. Elle
est mesurée par la dispersion des résultats individuels de part et d’autre de la
moyenne et elle est généralement représentée par l’écart-type ou par le
coefficient de variation calculé après avoir appliqué la méthode complète de
façon répétée à un certain nombre d’échantillons identiques sur le même lot
homogène du produit à analyser.

29
I. CADRE D’ETUDE

Ce travail a été effectué à l’unité de recherche et de biotechnologie

microbienne du laboratoire de bactériologie-virologie de l’hôpital Aristide Le
Dantec et au laboratoire de bactériologie-virologie fondamentale et appliquée
de l’UCAD II.

II. MATERIELS ET REACTIFS

2.1. Matériels

2.1.1. Souches bactériennes

Une souche de référence et des souches de contrôle ont été sélectionnées, en

effet celles-ci ont déjà été identifiées et conservées à -20°C. Il s’agissait pour
-La souche de référence de :
 Escherichia coli : [Link] ATCC 25922

-Les souches de contrôle d’ :

 Une souche de Klebsiella pneumoniae
 Une souche de Salmonella Paratyphi A
 Une souche de Acinetobacter

2.1.2 Matériel pour l’enrichissement et l’isolement

- Bec bunsen
- Autoclave
- Anse de platine
- Boite de pétri
- Etuve

30
2.1.3. Matériel pour l’identification

- Autoclave
- Balance de précision
- Bain marie
- Eprouvettes
- Erlenmeyer
- Filtres millipores
- Flacon en verre avec bouchon rodé
- Tubes à essai stériles
- Bec bunsen
- Etuve
- Four à micro-ondes
- Agitateur magnétique
- Dessiccateur sous vide à air renouvelé
- -Microscope optique
- Micropipettes
- Embouts stériles
- Plateau (inoxydable de préférence)
- Anse de platine
- Becher rempli d’eau de javel
- Emballage en plastique
- Lames porte-objet
- Lamelles
- Papier buvard
- Microplaques

31
 2.1.4 Matériel pour la conservation des souches

- Tubes nunc
- Tubes stériles à vis
- Gryotubes avec billes
- Portoirs
- Anse de platine

2.2. Réactifs

2.2.1. Réactifs pour l’enrichissement et l’isolement

- Bouillon au thioglycolate (BT)

- Bouillon trypticase soja (BTS)
- Gélose Müller Hinton (MH)
- Gélose Mac conkey

2.2.2. Réactifs pour l’identification

- Acétate de plomb
- Alcool 95°C
- Bleu de bromothymol
- Bromocresol pourpre
- Citrate de fer ammoniacal
- Citrate trisodique
- Disque ONPG
- Extrait de levure
- Extrait de viande
- Glucides: glu, lact, mannitol, sorbitol, saccharose,
inositol, rhamnose
- Gélatine

32
 - Bouillon nutritif
- L-tryptophane, L-arginine , L-phenyl alanine , L-
lysine, ornithine
- NaCl
- NaOH
- Peptone triptyque

2.2.3. Réactifs de révélation

- Acide sulfanilique à 8g/l

- Acide alpha naphtylamine à 5g/l
- Alpha naphtol
- FeCl 3
- KOH
- Réactif de kovacs
- Lugol
- Fuschine phéniquée
- Alcool 95°C
- Eau distillée

33
III. CONTROLE DE QUALITE DES TESTS EFFECTUES

Chaque lot de milieu a été préparé et soumis à un contrôle de stérilité et

à un contrôle d’efficacité sur le plan bactériologique.

3.1. Contrôle de qualité des milieux d’enrichissement et d’isolement

3.1.1. Contrôle de stérilité

[Link]. Milieux liquides

Un millilitre de chaque milieu préparé a été mis dans un tube à

hémolyse stérile et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24 à 48 heures.
Les milieux ont été considérés stériles en l’absence de trouble et de
virage de l’indicateur coloré

[Link]. Milieux solides

Chaque boîte contenant la gélose préparée a été placée à l’étuve à 37°C

pendant 24h à 48h.
Les milieux ont été considérés stériles en l’absence d’apparition de
colonies ou de virage de l’indicateur coloré.

3.1.2. Contrôle d’efficacité

Chaque lot de milieux préparés a été testé avec une souche de référence de
« l’American Type Culture Collection » (ATCC).
Des souches de profil bien connu ont été choisies au hasard.
L’ensemencement de ces souches effectué sur les milieux préparés a montré
que le profil des milieux pour les souches choisies était identique.

34
 3.2. Contrôle de qualité des galeries d’identification déshydratées

100µl de milieu ont été distribués dans chaque puit. La déshydratation a

été faite en présence d’un dessiccateur ou dans un four à micro-ondes.

3.2.1. Contrôle de stérilité

La stérilité a été mise en évidence par l’absence de souillures des milieux

préalablement déshydratés.
Pour les entérobactéries, les cupules renfermant des milieux allant de
ADH à URE ont été inoculés avec de l’eau physiologique stérile et ceux de
GLU à XYL avec le MEVAG Entérobactéries.
Pour les bacilles à Gram négatif non fermentaires, les cupules renfermant
les substrats de ADH à URE ont été inoculés avec de l’eau physiologique et
ceux allant de GLU à XYL avec le MEVAG Entérobactéries.
Après 24 à 48h d’incubation et après révélation de certains tests, le lot a
été considéré stérile en l’absence de virage de l’indicateur et de réaction
positive pour les tests révélés.

35
Tableau II : Plan de contrôle de stérilité des microplaques CSB

Entérobactéries

ADH ONPG CC CS
Eau physiologique Eau physiologique Eau Eau
stérile stérile physiologique physiologique
stérile stérile
VP GEL H2S / IND MAL / PDA
Eau physiologique Eau physiologique Eau Eau
stérile stérile physiologique physiologique
stérile stérile
LDC ODC URE GLU
Eau physiologique Eau physiologique Eau MEVAG
stérile stérile physiologique
stérile
LAC MAN SOR XYL
MEVAG MEVAG MEVAG MEVAG

36
Tableau III : Plan de contrôle de stérilité des microplaques CSB
Bacilles à Gram négatif non fermentaires (BGN NF)

ADH ONPG CC CS
Eau physiologique Eau physiologique Eau Eau
stérile stérile physiologique physiologique
stérile stérile
ESC GEL H2S / IND MAL / PDA
Eau physiologique Eau physiologique Eau Eau
stérile stérile physiologique physiologique
stérile stérile
NIT TDC URE GLU
Eau physiologique Eau physiologique Eau MEVAG
stérile stérile physiologique
stérile
LAC MAN SOR XYL
MEVAG MEVAG MEVAG MEVAG

3.2.2. Contrôle d’efficacité

Ce contrôle a été réalisé avec des souches de référence et de contrôle

dont le profil biochimique présente une stabilité bien connue.
Ainsi le milieu considéré stérile a pu faire l’objet d’une étude en ce qui
concerne sa capacité à donner un résultat positif avec une souche dont le
caractère correspondant est positif et à donner un résultat négatif si ce
caractère est négatif pour une autre souche donnée.

37
  Technique

Deux plaques ont été prévues pour chaque galerie (contrôle positif et
négatif)
Une suspension bactérienne a été préparée à partir d’une culture de 24h
sur milieu solide.

Tableau IV : Contrôle d’efficacité des substrats des microplaques

CSB entérobactéries et bacilles à Gram négatif non Fermentaires

Substrats Témoins positifs Témoins négatifs

LDC Escherichia coli Enterobacter
ODC Enterobacter cloaceae Klebsiella
ADH Enterobacter cloaceae Escherichia coli
UREE Klebsiella Pneumoniae Escherichia coli
VP Klebsiella Pneumoniae Escherichia coli
GEL Proteus mirabilis Escherichia coli
CS Klebsiella Escherichia coli
CC Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
H2S Salmonella Typhi Escherichia coli
IND Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
MAL Klebsiella pneumoniae Escherichia coli
PDA Proteus vulgaris Escherichia coli
ONPG Escherichia coli Shigelli flexneri
LAC Escherichia coli Pseudomonas
aeroginosa
GLU Escherichia coli Proteus mirabilis
MAN Escherichia coli Shigella flexneri
SOR Escherichia coli Shigella flexneri
XYL Staphylococcus xylosus Staphylococcus aureus

38
 3.2.3. Contrôle des appareils

 L’étuve
La température était toujours maintenue à 37°C
 Le densitomètre

3.2.4. Contrôle des paramètres dynamiques

La température, paramètre très sélectif, a été maintenue à 37°C. Celle-ci

a été favorable à la croissance des bactéries utilisées lors de notre étude.
Le pH toléré par les bactéries se situe entre 6 et 9, donc avant chaque
manipulation nous avons effectué un ajustement du pH de tous les milieux
liquides utilisés. Nous avons pu avoir une bonne identification de nos
bactéries en utilisant les galeries Micro-CSB.
Les bactéries ont une certaine tolérance vis-à-vis des variations ioniques,
en effet notre étude n’a pas été influencée par leur présence.

IV. METHODES

4.1. Isolement et identification

4.1.1. Isolement

En vue d’obtenir des colonies des germes à identifier, les souches

conservées à -20°C ont été régénérées dans un bouillon d’enrichissement puis
ensemencées sur la gélose CLED. L’incubation a été faite à l’étuve à 37°C
pendant 24 heures.

4.1.2. Identification

[Link]. Examen macroscopique

Les souches de [Link] ont donné sur le milieu CLED de grosses colonies
sèches, lactose positif et à contours irréguliers.
39
 Les souches de [Link] ont donné sur le milieu CLED de grosses
colonies muqueuses, lactose positif, ayant un aspect de goutte de miel avec
une tendance à la confluence.
Les souches de Salmonella quant à elles ont montré des colonies lisses
de type S à bord régulier.
Les souches de Acinetobacter ont développé sur le milieu MH des
colonies lisses à bordures nettes.

[Link]. Examen microscopique

 Coloration de Gram

 Principe

La coloration de Gram est la coloration de base de la bactériologie ; elle

consiste à mettre en évidence les caractères morphologiques propres à une
bactérie. Elle permet ainsi de distinguer les bactéries à gram négatif des
bactéries à Gram positif.

 Technique

La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes qui se succèdent.

Il s’agit de :

- Fixer le frottis à la flamme d’un bec bunsen,

- Recouvrir le frottis de la solution de violet de gentiane,
laisser agir une minute,
- Laver la lame au lugol puis de la recouvrir de lugol, laisser
agir 30 secondes,
- Rejeter le lugol puis laver à l’eau,

40
 - Décolorer à l’alcool à 95°C ,
- Rincer la lame à l’eau courante et la recouvrir de solution de
fuchsine avant de laver abondamment,
- Egoutter et lire au microscope optique à l’objectif 100 avec
une goutte d’huile à immersion.

 Résultat

Des bacilles colorés en rose ont été observés.

[Link]. La réaction à l’oxydase

 Principe
Cette réaction est recherchée sur des cultures en milieux gélosés exempts
de sucres fermentés cibles ou de sang. Les bactéries possédant des oxydases
donnent en présence de sucre, des métabolites qui se combinent avec le réactif
utilisé pour donner une coloration variable selon la bactérie.
 Technique

Le test a été réalisé à l’aide d’un disque de commerce prêt à l’emploi,

imprégné d’eau distillée sur lequel a été déposée une colonie.

 Résultat

La réaction positive s’est traduite par l’apparition d’une coloration

violette à l’endroit où la colonie a été déposée. Les résultats obtenus étaient
les suivants :
Les entérobactéries comme Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, et
Salmonella paratyphi A étaient dépourvues d’oxydase négative, c'est-à-dire
qu’il n’y a pas eu de coloration.
La souche d’Acinetobacter s’est également révélé oxydase négative

41
 [Link]. Mini galerie d’identification

 Milieu mannitol-mobilité

C’est une gélose molle conditionnée en tubes qui permet d’étudier la

fermentation du mannitol ainsi que la mobilité des germes.
La bactérie est ensemencée par piqûre centrale jusqu’au fond du tube à
l’aide d’une anse de platine.

 Résultat

La fermentation du mannitol a été matérialisée par un virage du milieu

au jaune.
Les bacilles mobiles ont diffusé à partir de la ligne d’ensemencement,
créant un trouble du milieu ; nous avons l’exemple des bacilles comme E. coli
ou encore S. paratyphi A.
Les bacilles immobiles ont uniquement poussé le long de la strie
d’ensemencement ; nous avons pris comme exemple K. pneumoniae.

 Milieu kliger hajna

C’est un milieu solide coulé en pente et contenant du thiosulfate, des

ions ferreux, de la lysine, du glucose, du lactose et également des éléments
nutritifs permettant la multiplication et la croissance des bactéries.
Sur ce milieu on peut rechercher les 6 caractères suivants :
- La fermentation du lactose : le milieu vire du rouge au jaune,
- La fermentation du glucose,
- La production de gaz,
- La production d’hydrogène sulfuré,
- La présence de lysine décarboxylase.

42
  Résultat

Les souches de E. coli fermentaient le glucose ainsi que le lactose, elles

produisent du gaz mais pas du sulfure d’hydrogène H2S.
Les souches de K. pneumoniae ont fermenté le glucose mais pas le
lactose, par contre elles ont produit du gaz et du H2S.
Les souches de S. typhi A fermentaient le glucose ainsi que le lactose,
mais n’ont produit ni du gaz ni du H2S.
Quant à la souche d’Acinetobacter, elle n’a rien fermenté et n’a pas
produit de gaz ni de H2S.

 Milieu du citrate de simmons

Ce milieu est coulé en tube pour l’étude de l’utilisation du citrate comme

seule source de carbone par les germes.
Il contient un indicateur de pH qui est le bleu de bromothymol, ce qui
confère au milieu une coloration verte à l’état acide.
Les germes qui utilisent le citrate comme seule source de carbone
entraînent une alcalinisation du milieu, d’où le virage du vert au bleu.

 Résultat

Les souches de [Link] n’utilisent pas le citrate comme seule source de

carbone, de même que la souche de S. paratyphi A. Les souches de
[Link] et de Acinetobacter utilisent le citrate comme seule source de
carbone.

Le milieu Urée-Indole

C’est un milieu liquide dans lequel on recherche trois caractères :

- la production d’uréase qui se matérialise par le changement de la
coloration jaune en rose, du fait de l’alcalinisation du milieu ;

43
 - la présence d’indole qui se matérialise par un anneau rouge, après
addition du réactif de Kovacs ;
- la présence de TDA qui se matérialise par un changement de la
coloration du jaune au rouge, après addition de perchlorure de fer
(FeCL3).

4.2. Recherche de l’effet inoculum et de l’effet du temps

d’incubation des galeries Micro-CSB sur l’identification des
bactéries Gram négatif

4.2.1. Recherche de l’effet inoculum sur l’identification

Après identification des bactéries sur lesquelles a porté notre étude, une
colonie isolée sur le milieu CLED a été prélevée à l’aide d’une anse de platine
puis ensemencée dans 10ml de bouillon thioglycolate.
Après homogénéisation, une suspension a été obtenue et celle-ci a été
considérée comme un échantillon de volume V0 =10ml et de concentration C0
à l’instant t=0 min (T0)
A partir de ce moment, un prélèvement a été effectué toutes les 20 à 30
min et ceci pendant 2 à 3heures. Durant les deux premières demi-heures
100µl ont été prélevés uniquement pour le dénombrement bactérien. Alors
que pour les demi heures restantes 1,5ml de la suspension ont été prélevés
servant aussi bien pour l’ensemencement des galeries Micro-CSB
Entérobactérie que pour le dénombrement bactérien.

[Link]. Le dénombrement bactérien

 Principe

La technique de mesure de la croissance d’une population bactérienne

par dénombrement sur boîtes de pétri consiste à ensemencer à des intervalles
de temps réguliers des boîtes de pétri par des dilutions appropriées d’un
échantillon de la suspension bactérienne : la dilution est calculée pour obtenir

44
entre 30 et 300 colonies sur chaque boîte, ces deux bornes étant considérées
comme donnant le moins d’erreurs sur le dénombrement final. Cette étape est
suivie d’une culture de 24 à 48h à 37°C au terme de laquelle les colonies sont
dénombrées.
 Technique

Une dilution en série a été effectuée à chaque espace de temps, ainsi

donc 100µl de suspension ont été prélevés et dilués à une concentration
convenable dans 900µl d’eau physiologique. Les derniers 100µl ont été
déposés sur une gélose MH, puis dispersés grâce à un étaleur stérile. Les
boîtes ont été placées à l’étuve pendant 24h à 37°C.
Dans un souci de minimiser les erreurs de dénombrement, nous avons
décidé d’ensemencer à chaque point de prélèvement deux boites.
Après incubation nous avons pu dénombrer les colonies viables obtenues
au niveau des deux boites.

 Expression des résultats

Les résultats ont été obtenus en faisant la moyenne du dénombrement

des deux boîtes de pétri. Ils sont exprimés en UFC/ml.

[Link]. Recherche de l’effet du temps d’incubation des galeries

Micro-CSB sur l’identification des bactéries

 Principe

Il s’agit d’une méthode miniaturisée permettant la mise en évidence

d’activité enzymatique, de la fermentation des sucres et de la croissance en
milieu hostile.

45
 Les galeries Micro-CSB des entérobactéries et les bacilles Gram négatif
non fermentaires permettent de réaliser respectivement 16 tests biochimiques
et de faire le diagnostic d’espèce de la plupart des entérobactéries ainsi que
des bacilles à Gram négatif non fermentaires.

 Technique
Les inocula qui ont été obtenus aux différents intervalles de temps ont
ensuite été ensemencés dans les galeries Micro-CSB Entérobactérie et
BGNNF.

 Inoculation des microplaques Entérobactéries

Il fallait :
- distribuer 100µl d’inoculum bactérien par micro cupule de ADH
à URE,
- mélanger 100µl de la suspension bactérienne à 1ml de
- MEVAG Entérobactéries,
- ensemencer les cupules de GLU à XYL avec 100µl de MEVAG
ainsi inoculé,
- recouvrir les puits destinés à la recherche des décarboxylases,
d’ADH, d’uréase et des sucres avec 2 gouttes de paraffine afin
de maintenir l’anaérobiose nécessaire à ces réactions,
- incuber les galeries à 37°C sur un plateau recouvert de papier
buvard imbibé d’eau,
- faire la lecture toutes les 4 heures pendant 12 heures,
- faire une dernière lecture à 24 heures et s’il y a lieu ajouter des
réactifs de révélation,
- noter toutes les modifications observées lors de ces lectures.

46
  Les bacilles Gram négatif non fermentaires
Il fallait :
- distribuer 100µl d’inoculum bactérien par micro cupule de ADH à URE,
- verser le reste de la suspension bactérienne dans 1ml de MEVAG
Entérobactéries,
- ensemencer les cupules de GLU à XYL avec 100µl de MEVAG
ainsi inoculé,
- recouvrir les puits destinés à la recherche des décarboxylases,
d’uréase et des sucres avec 2 gouttes de paraffine afin de maintenir
l’anaérobiose nécessaire à ces réactifs,
- incuber les galeries à 37°C sur un plateau recouvert de papier
buvard imbibé d’eau,
- faire la lecture toutes les 4 heures pendant 12 heures, puis à 24 h
- noter toutes les modifications observées lors de ces lectures.

 Lecture et interprétation

La lecture a reposé sur le changement de la coloration initiale des

différents milieux. Pour la plupart des milieux, la lecture a été faite
directement, alors que pour d’autres elle a nécessité l’addition de réactifs de
révélation.
La lecture des caractères était effectuée grâce à une fiche de lecture (cf.
tableau IV et V)

47
 Tableau V : Tableau de lecture de l’entérobactérie

Tests substrats Réactions / Enzymes Réactifs de Résultats Résultats

révélation positifs négatifs
LDC Lysine Lysine décarboxylase Rouge Jaune
ODC Ornithine Ornithine Rouge Jaune
décarboxylase
ADH Arginine Arginine Rouge Jaune
décarboxylase
URE Urée Uréase Rose Orange
framboise
VP Glucose Production d’acétoïne VP1+ Rose rouge Incolore
pyruvate VP3
GEL Gélatine Gélatine Diffusion Inchangé
du charbon
CS Citrate de Utilisation du citrate Bleu Vert
simmons
CC Citrate de Utilisation du citrate Rose Jaune claire
chistensen
H2S Sulfate Production d’H2S Noir Incolore
Sodium
IND Tryptophane Tryptophane 1 goutte de Anneau Anneau
kovacs rouge incolore
MAL Malonate Utilisation du Bleu Jaune vert
Sodium malonate
PDA Phénylalanine Phénylamine 1 goutte de Vert Jaune
désaminase perchlorure
ONPG ONPG β-galactosidase Jaune Incolore
GLU Glucose Fermentation Jaune Bleu
ARA Arabinose

48
Tableau VI : Tableau de lecture des bacilles à Gram négatif non fermentaire

Tests Réactifs à ajouter Interprétation

Positif Négatif
NIT 1 goutte d’acide Rose Incolore
sulfanilique
1goutte d’ά-naphtylamine
± poudre de zinc

UREE Rouge violacé Jaune

MAL Bleu Jaune vert
PDA 1 goutte de FeCL3 Vert Jaune
ADH Violet Jaune
CS Bleu Vert
CC Rose Jaune clair
ESC Nuage noir Jaune
GEL Diffusion du pigment Pas de diffusion
H2S Précipité noir Incolore
IND 1 goutte de Kovacs Anneau rouge Anneau jaune
ONPG Jaune Incolore
GLU Jaune Bleu vert
LAC Jaune Bleu vert
SOR Jaune Bleu vert
MAN Jaune Bleu vert
XYL Jaune Bleu vert

49
 I. EFFET DE L’INOCULUM SUR L’IDENTIFICATION
BACTERIENNE EN FONCTION DU TEMPS D’INCUBATION

1.1. Escherichia coli

1.1.1. Résultats du dénombrement

Le tableau ci-dessous montre les résultats du dénombrement de Escherichia coli

Tableau VII : Dénombrement de Escherichia coli

Temps T0 = 0 T1 = 30 T2 = 50 T3 = 70 T4 = 90 T5 =110 T6=130

(min)

Inoculum 6,3 105 7,5 105 5,5 106 6,85 106 7,65 106 1,75 107 1,4 108
(UFC/ml)

L’inoculum a été préparé avec du bouillon thioglycolate, ensuite incubé

à l’étuve à 37°C. Pour un début de croissance, seule la première phase
d’incubation n’a duré que 30 minutes. Les autres phases d’incubation ont duré
20 minutes, suffisant pour un bon suivi de la croissance de cette souche. Un
accroissement de la concentration bactérienne est observé tout au long de ces
2h10min de manipulation. Lequel accroissement s’est effectué de manière
timide jusqu’au bout de 80 minutes.

1.1.2. Conditions d’interprétation

L’identification d’une bactérie est régie par un certain nombre de critères
qui permettent de catégoriser leur interprétation en cinq groupes selon le
pourcentage de positivité des galeries testées.

50
 Ainsi nous avons :
 99,9% : excellente identification,
 99% : très bonne identification,
 90% : bonne identification,
 80% : identification acceptable,
 < 80% : identification inacceptable.

1.1.3. Résultats des galeries Micro-CSB

Les plaques ont été incubées à l’étuve à 37°C après les avoir
ensemencées avec l’inoculum obtenu. Les deux premiers inocula
correspondant respectivement aux temps T0 = 0min et à T1 = 30min n’ont pas
été utilisés pour l’ensemencement des plaques du fait de leur faible
concentration. Les résultats obtenus ont été inscrits dans les tableaux
suivants :

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 4éme, à la 8éme, à la

12éme et à 24heures d’incubation en fonction de l’inoculum

51
 Tableau VIII : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Escherichia coli)

Caractères
5,5 10 6
6,85 10 6 6
7,65 10 d’identification
Inocula(UFC/ml) de [Link]
[4,14, 23]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques

ADH - - - - - - - - - - - - d
ONPG - - - + - - - + - - - + +
CC - - - - - - - - - - - - -
CS - - - - - - - - - - - - -
VP i i i - i i i - i i i - -
GEL - - - - - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - - - - - -
IND i i + i i i + i i i + +
MAL - - - - - - - - - - - - -
PDA i i i - i i i - i i i - -
LDC - - - - - - - - - - - - d
ODC - + + + - + + + - + + + d
URE - - - - - - - - - - - - -
GLU - + + + - + + + + + + + +
LAC - + + + - + + + - + + + +
MAN - + + + - + + + - + + + +
SOR - - - + - - - + - - + + d
XYL - - + + - + + + - + + + d
Concordance des 60 80 86 100 60 86 86 100 66 86 93 100 100
caractères (%)
Légende : (+) = caractère positif,
(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = caractère indéterminé.

52
Tableau IX : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Escherichia coli)

Caractères
d’identification
1,75 107 1,4 108
de [Link]
Inocula (UFC/ml)
[4,14, 23]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques

ADH - - - - - - - - d
ONPG - - - + - - - + +
CC - - - - - - - - -
CS - - - - - - - - -
VP i i i - i i i - -
GEL - - - - - - - - -
H2 S - - - - - - - - -
IND i i i + i i i + +
MAL - - - - - - - - -
PDA i i i - i i i - -
LDC - - - - - - - - d
ODC - + + + - + + + d
URE - - - - - - - - -
GLU + + + + + + + + +
LAC - + + + + + + + +
MAN - + + + - + + + +
SOR - - + + - - + + d
XYL - + + + - + + + d
Concordance des 66 86 93 100 73 86 93 100 100
caractères (%)
Légende : (+) = caractère positif,
(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = caractère indéterminé.

53
 Les résultats des tests pour la mise en évidence de l’indole, de la réaction
de Voges-Proskauer et de la phényl alanine désaminase n’ont pu être
déterminés qu’au bout de 24h pour cause, leur révélation a nécessité
l’addition de réactifs.
Les pourcentages de concordance des caractères biochimiques en
fonction du temps d’incubation des microplaques CSB pour chaque inoculum
ont été illustrés sur les figures suivantes :

Figure 2 : Concordance des caractères de [Link] en fonction du temps

d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 5,5 106 UFC/ml

L’identification de la souche a été d’emblée acceptable à la 8éme heure

d’incubation de la microplaque. Dans ce cas, il s’agit d’une bonne
représentativité de l’inoculum. Les concordances ont crû dans le même sens
que les temps d’incubation des plaques Micro-CSB.

54
Figure 3 : Concordance des caractères de [Link] en fonction du
temps d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 6,85 106 UFC/ml

Il est important de noter que la progression de cette concordance est

fonction de l’allongement du temps d’incubation mais également de
l’accroissement de la taille de l’inoculum. En effet la concordance observée à
la 8éme heure d’incubation pour l’inoculum de 6,5 106 UFC/ml est passée de
80% à 86% pour l’inoculum de 6,85 106 UFC/ml.

55
Figure 4 : Concordance des caractères de [Link] en fonction du
temps d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 7,65 106 UFC/ml

Il y a une bonne corrélation entre la concordance des caractères étudiés

et le temps d’incubation.

56
Figure 5 : Concordance des caractères de [Link] en fonction du
temps d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 1,75 107 UFC/ml

Le parallélisme entre ces deux paramètres s’est précisé au fur et à

mesure que la concentration de l’inoculum augmentait. Les résultats sont
superposables pour les inocula de 7,65 106 UFC/ml et de 1,75 107 UFC/ml
bien que la population ait augmenté d’une puissance de 10.

57
Figure 6 : Concordance des caractères de [Link] en fonction du
temps d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum
de 1,4 108 UFC/ml

Nous avons constaté une évolution de la concordance des caractères à la

4éme heure de lecture avec un pourcentage qui est passé de 66 % UFC/ml à
73 % UFC/ml.

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 12éme heure

d’incubation en fonction de l’inoculum
Les résultats obtenus après 24 heures ont été analysés et validés par des
études antérieures. Seuls les résultats obtenus durant la période
d’incubation, comprises entre 4 heures et 12 heures ont été retenus pour
cette étude. Les meilleurs de ceux-ci ont été obtenus à la 12éme heure
mais déjà après 8h d’incubation nous pouvions observer une bonne
identification de la souche. Nous avons donc fait une étude comparative
de nos résultats à cette heure en fonction des différents inocula.

58
Tableau X : Etude comparative des résultats obtenus à la 12éme heure
d’incubation en fonction des inocula

I2 I3 I4 I5 I6
Inocula (UFC/ml)
5,5 106 6,85 106 7,65 106 1,75 107 1,4 108
Caractères

Biochimiques
ADH - - - - -
ONPG - - - - -
CC - - - - -
CS - - - - -
VP I i i i i
GEL - - - - -
H2S - - - - -
IND I i i i i
MAL - - - - -
PDA I i i i i
LDC - - - - -
ODC + + + + +
URE - - - - -
GLU + + + + +
LAC + + + + +
MAN + + + + +
SOR - - + + +
XYL + + + + +
% de concordance des 86 86 93 93 93
caractères

Légende : (I) = inoculum

(i) = caractère indéterminé

59
 L’évolution de la concordance des caractères biochimiques à la
douzième heure en fonction de l’inoculum est représentée par la figure

Figure 7 : Identification de E. coli au bout de 12h d’incubation des

Plaques en fonction des différents inocula

Sur les 18 tests biochimiques étudiés, les trois tests à savoir l’indole, le
VP et le PDA n’ont pu être déterminés qu’à la 24 éme heure car leur révélation
a nécessité l’addition de réactifs.
Pour les deux premiers inocula, seuls deux caractères ont donné des
réactions négatives. Il s’agit de l’ONPG et du sorbitol.
Pour les trois derniers inocula, seul l’ONPG s’est présenté comme étant
un caractère discordant.

60
 1.2. Klebsiella pneumoniae
1.2.1. Résultats du dénombrement

Le tableau ci-dessous montre les résultats du dénombrement de

Klebsiella pneumoniae

Tableau XI : Dénombrement de Klebsiella pneumoniae

Temps T0 = 0 T1 = 30 T2 = 60 T3 = 90 T4 = 120 T5 =150 T6=180

(min)

Inoculum 2,32 106 7,45 106 2 107 1,35 108 1,5 108 3,45 108 1,75 109
(UFC/ml)

Le bouillon thioglycolate, après inoculation, a été incubé à l’étuve

pendant 3h. En effet la souche de K. pneumoniae présente un temps de
génération de 30min. Toutes les 30min durant donc, une plaque a été
ensemencée avec l’inoculum ainsi obtenu. Cette souche a présenté une
croissance assez significative.

1.2.2. Conditions d’interprétation

L’identification d’une bactérie est régie par un certain nombre de critères
qui permettent de la catégoriser (cf. 1.1.2).

1.2.3. Résultats des plaques Micro-CSB

Les conditions d’étude de Klebsiella pneumoniae ont été les mêmes que
celles de [Link] (cf. I.1.1.3).

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 4éme, à la 8éme, à la 12éme

et après 24heures d’incubation en fonction de l’inoculum

61
 Tableau XII : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Klebsiella pneumoniae)
Caractères
d’identification
Inocula (UFC/ml) de K.
2 107 1,35 108 1,5 108 pneumoniae
[4,14, 23]
Temps
d’incubation
en heures 4 8 12 24 4 8 12 24 4 8 12 24

Tests
biochimiques
ADH - - - + - - - + - - - + -
ONPG - - - + - - - + - - - + +
CC - - + + - - + + - + + + +
CS - - + + - - + + - + + + +
VP i i i + i i i + i i i + +
GEL - - - - - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - - - - - -
IND i i i - i i i - i i i - -
MAL - - - - - - - - - - - - +
PDA i i i - i i i - i i i - -
LDC - - + + - - + + - - + + +
ODC - - - + - - - + - - - + -
URE - - - + - - - + - - - + +
GLU + + + + + + + + + + + + +
LAC - - - + - - - + - - + + +
MAN + + + + + + + + + + + + +
SOR + + + + + + + + + + + + d
XYL + + + + + + + + + + + + d
Concordance des 53 53 73 83 53 53 73 83 53 66 80 83 100
caractères (%)

Légende : (+) = caractère positif,

(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = Indéterminé.
62
Tableau XIII : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Klebsiella pneumoniae)

Caractères
d’identification
Inocula(UFC/ml) 3,45 108 1,75 109 de K.
pneumoniae
[4,14, 23]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques
ADH - - - + - - - + -
ONPG - - - + - - - + +
CC - + + + - + + + +
CS - - + + - - + + +
VP i i i + i i i + +
GEL - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - -
IND i i i - i i i - -
MAL - - - - - - - - +
PDA i i i - i i i - -
LDC - - + + - - + + +
ODC - - + + - - + + -
URE - - + + - - + + +
GLU + + + + + + + + +
LAC - - - + - - - + +
MAN + + + + + + + + +
SOR + + + + + + + + d
XYL + + + + + + + + d
Concordance des 53 66 80 83 53 73 80 83 100
caractères (%)

Légende : (+) = caractère positif,

(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = Indéterminé.

63
 Les résultats des tests pour la mise en évidence de l’indole, de la réaction
de Voges-Proskauer et de la phényl alanine désaminase n’ont pu être
déterminés qu’au bout de 24h pour cause, leur révélation a nécessité
l’addition de réactifs.
Les pourcentages de concordance des caractères biochimiques en
fonction du temps d’incubation des microplaques CSB pour chaque inoculum
ont été illustrés sur les figures suivantes :

Figure 8 : Concordance des caractères de K. pneumoniae en

fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 2 107 UFC/ml

Une bonne identification de la souche n’a pu être possible qu’à la 24éme

heure ce qui montre que les inocula n’étaient pas tant significatifs pour donner
de bons résultats. Le pourcentage des caractères a évolué dans le temps
jusqu’à donner un bon résultat à la 24éme heure d’incubation des
microplaques.

64
Figure 9 : Concordance des caractères de K. pneumoniae en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 1,35 108 UFC/ml

Les résultats sont superposables pour les inocula de 1,35 10 8 UFC/ml et

2 107 UFC/ml. Bien que la différence entre les inocula soit grande, les
caractères biochimiques n’ont pas évolué.

65
Figure 10 : Concordance des caractères de K. pneumoniae en fonction
du temps d’incubation de la microplaque CSB avec un inoculum de
1,5 108 UFC/ml

Par contre pour l’inoculum de 1,5 108 UFC/ml, le pourcentage des

caractères a bien progressé en passant 66% à la 8éme heure à 80% après
12heures d’incubation ; permettant ainsi une bonne identification de la
souche. A cet inoculum nous avons pu avoir une identification de la souche à
12 heures.

66
Figure 11 : Concordance des caractères de K. pneumoniae en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 3,45 108 UFC/ml

Les résultats pour l’inoculum de 3,45 108 UFC/ml sont superposables à

ceux de 1,5 108UFC/ml. Ceci est compréhensible parce que la différence de la
population n’est pas grande.

67
Figure 12 : Concordance des caractères de K. pneumoniae en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 1,75 109 UFC/ml

Même pour l’inoculum le plus élevé, l’identification de la souche n’a pu

se faire qu’à 12 et à 24 heures d’incubation des plaques Micro-CSB. Les
caractères à la 24éme heure sont restés constants pour pratiquement tous les
inocula.
 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 12éme heure d’incubation
en fonction de l’inoculum
D’une manière générale, les résultats obtenus pour cette souche n’ont
pas été fameux. Même à la 12éme heure, avec certains inocula, nous
n’avons pas pu bien identifier la souche de Klebsiella pneumoniae.
Mais en moyenne l’identification est assez bonne. L’étude comparative
des résultats de cette souche s’est faite quand même à la 12éme heure,
car avant 24 heures, les concordances étaient acceptables à cette heure.

68
Tableau XIV : Etude comparative des résultats obtenus à la 12éme heure
d’incubation en fonction des inocula

I2 I3 I4 I5 I6
Inocula (UFC/ml)
2 107 1,35 108 1,5 108 3,45 108 1,75 109
Caractères
Biochimiques
ADH - - - - -
ONPG - - - - -
CC + + + + +
CS + + + + +
VP i i i i i
GEL - - - - -
H2S - - - - -
IND i i i i i
MAL - - - - -
PDA i i i i i
LDC + + + + +
ODC - - - + +
URE - - - + +
GLU + + + + +
LAC - - + - -
MAN + + + + +
SOR + + + + +
XYL + + + + +
% de concordance des 73 73 80 80 80
caractères

(I) = inoculum
(i) = caractère indéterminé
L’évolution de la concordance des caractères biochimiques à la
douzième heure en fonction de l’inoculum est représentée à la figure 13.

69
 Figure 13 : Identification de K. pneumoniae au bout de 12h
d’incubation des Plaques en fonction des différents
inocula

Sur les 18 tests biochimiques, les trois n’ont pu être révélés qu’à la 24éme
heure d’incubation des microplaques car leur identification a nécessité l’ajout
de réactifs de révélation.
Pour les inocula de 2 107 UFC/ml et de 1,35 108 UFC/ml, l’identification
de la souche n’a pas pu être possible car sur les 15 tests, les quatre ont donné
des résultats négatifs. Parmi ces tests discordants il y a le lactose, l’urée, le
malonate, l’ONPG. Le malonate est resté négatif pendant toute la durée de
l’opération alors qu’il devait être positif.
Pour les inocula de 1,5 108 UFC/ml, de 3,45 108 UFC/ml, et de 1,75 109
UFC/ml, l’identification de la souche a été acceptable, et le pourcentage a
diminué avec deux caractères discordants. C’est le malonate qui a persisté
dans sa négativité ; l’ONPG, mais aussi le test à l’urée ne sont restés négatifs
que pour l’inoculum de 1,5 108 UFC/ml. Il y a l’ODC qui est passé d’un
caractère négatif à un caractère positif alors que ce caractère devait rester
négatif pour pouvoir répondre aux normes d’identification de cette souche.

70
 1.3. Salmonella paratyphi A

1.3.1. Résultats du dénombrement

Le tableau ci-dessous montre les résultats du dénombrement de

Salmonella paratyphi A

Tableau XV : Dénombrement de Salmonella paratyphi A

Temps T0 = 0 T1 = 30 T2 = 60 T3 = 90 T4 = 120 T5 =150 T6=180

(min)

Inoculum 3,5 105 4 105 4 105 1,2 106 1,42 106 3,5 106 1,2 107
(UFC/ml)

L’inoculum de départ a été mis à l’étuve à 37°C pendant 3h. Durant ces
3h le tube qui contenait la suspension d’inoculum est sorti toutes les 30min.
Ceci nous a permis d’obtenir les résultats inscrits dans le tableau ci-dessus. Il
faut signaler que cette croissance est assez lente.

1.3.2. Conditions d’interprétation

L’identification d’une bactérie est régie par un certain nombre de critères qui
permettent de la catégoriser (cf. 1.1.2).

71
 1.3.3. Résultats des plaques Micro-CSB

Comme pour les autres souches, les plaques ensemencées avec la souche
de Salmonella paratyphi A ont été incubées à l’étuve à 37°C. Les phases
d’incubation ont duré 30min. Les résultats obtenus ont été inscris dans les
tableaux ci-après :
 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 4éme, à la 8éme, à la 12éme
et à 24 heures d’incubation en fonction de l’inoculum

72
 Tableau XVI : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Salmonella paratyphi A)
Caractères
d’identification
Inocula (UFC/ml) de S. paratyphi
4 105 1,2 106 1,42 106 A
[4,14, 23]
Temps
d’incubation
en heures 4 8 12 24 4 8 12 24 4 8 12 24

Tests
biochimiques
ADH - - - - - - - - - - - - d
ONPG - - - - - - - - - - - - -
CC - - - - - - - - - - - - -
CS - - - - - - - - - - - - -
VP i i i - i i i - i i i - -
GEL - - - - - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - - - - - d
IND i i i - i i i - i i i - -
MAL - - - - - - - - - - - - -
PDA i i i - i i i - i i i - -
LDC - - - - - - - - - - - - -
ODC - + + + - + + + - + + + d
URE - - - - - - - - - - - - -
GLU - - + + - - + + - - + + +
LAC + + + - + + + - + + - - -
MAN + + + + + + + + + + + + +
SOR + - + + + - + + + - + + d
XYL + - + + - - + + + - + + d
Concordance des 86 86 93 100 86 86 93 100 86 86 100 100 100
caractères (%)
Légende : (+) = caractère positif,
(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = caractère indéterminé.

73
Tableau XVII : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Salmonella paratyphi A)

Caractères
d’identification
Inocula(UFC/ml) 3,5 106 1,2 107
de S.
paratyphi A
[22, 11, 17]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques
ADH - - - - - - - - d
ONPG - - - - - - - - -
CC - - - - - - - - -
CS - - - - - - - - -
VP - - -
GEL - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - d
IND - - -
MAL - - - - - - - - -
PDA - - -
LDC - - - - - - - - +
ODC - + + + - + + + d
URE - - - - - - - - -
GLU - + + + + + + + +
LAC + - - - + - - - -
MAN + + + + + + + + +
SOR + - + + + - + + d
XYL + - + + + - + + d
Concordance des
caractères (%) 86 93 100 100 93 100 100 100 100

Légende : (+) = caractère positif,

(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable.
(i) = caractère indéterminé.

74
 Les résultats des tests pour la mise en évidence de l’indole, de la réaction
de Voges-Proskauer et de la phényl alanine désaminase n’ont pu être
déterminés qu’au bout de 24h, pour cause leur révélation a nécessité
l’addition de réactifs.

Les pourcentages de concordance des caractères biochimiques en

fonction du temps d’incubation des microplaques CSB pour chaque inoculum
ont été illustrés sur les figures suivantes :

Figure 14 : Concordance des caractères de S. paratyphi A en

fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 4 105 UFC/ml

L’identification a été d’emblée acceptable à la 4 éme heure d’incubation,

elle est très bonne à la 24éme heure. Il suffit donc d’un faible inoculum pour
avoir une bonne identification. Le pourcentage des caractères a évolué en
fonction du temps.

75
Figure 15 : Concordance des caractères de S. paratyphi A en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 1,2 106 UFC/ml

Les inocula de 4 105 UFC/ml et de 1,2 106 UFC/ml ont présenté des
résultats superposables. Les concordances n’ont pas varié malgré la différence
des inocula après 4 heures, 8 heures et 12 heures d’incubation.

76
Figure 16 : Concordance des caractères de S. paratyphi A en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 1,42 106 UFC/ml

Nous avons constaté que la concordance des caractères à la 12éme heure

de lecture a progressé de 14% par rapport à la 8éme heures.

77
Figure 17 : Concordance des caractères de S. paratyphi A en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 3,5 106 UFC/ml

Une autre évolution a été observée à la 8éme de lecture, le pourcentage est

passé de 86% à 93%. Plus la population devenait importante, plus le délai
pour l’obtention de bons résultats était réduit.

78
Figure 18 : Concordance des caractères de S. paratyphi A en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 1,2 107 UFC/ml

Pour l’inoculum de 1,2 107 UFC/ml l’identification de la souche était

excellente à l’exception de la lecture à 4h.

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 12éme heure d’incubation

en fonction de l’inoculum

Nous avons obtenus de très bons résultats à tous les inocula.

79
 Tableau XVIII : Etude comparative des résultats obtenus à la 12éme heure
d’incubation en fonction des inocula

Inocula (UFC/ml) I2 I3 I4 I5 I6
Caractères 4 105 1,2 106 1,42 106 3,5 106 1,2 107
Biochimiques
ADH - - - - -
ONPG - - - - -
CC - - - - -
CS - - - - -
VP i i i i i
GEL - - - - -
H2S - - - - -
IND i i i i i
MAL - - - - -
PDA i i i i i
LDC - - - - -
ODC + + + + +
URE - - - - -
GLU - - + + +
LAC + + - - -
MAN + + + + +
SOR + + + + +
XYL + + + + +
% de concordance des 93 93 100 100 100
caractères

(I) = inoculum
(i) = caractère indéterminé

80
Figure 19 : Identification de S. paratyphi A au bout de 12h
d’incubation des Plaques en fonction des différents
inocula

Les concordances ont varié dans le même sens que les différents inocula.
Il y avait 18 tests biochimiques dont les 3 nécessitaient l’ajout de réactifs pour
leur identification.
Pour les inocula de 4,5 105 UFC/ml et 1,2 106 UFC/ml sur les 15 tests
restant, il y a eu deux caractères discordants qui étaient le lactose et le
glucose.
L’ensemble des caractères a pu être déterminé avec les inocula de 1,42
106 UFC/ml, de 3,5 106 UFC/ ml et de 1,2 107 UFC/ml.

81
 1.4. Acinetobacter

1.4.1. Résultats du dénombrement

Le tableau ci-dessous montre les résultats du dénombrement de Acinetobacter

Tableau XIX : Dénombrement de Acinetobacter

Temps T0 = 0 T1 = 30 T2 = 60 T3 = 90 T4 = 120 T5 =150 T6=180

(min)

Inoculum 6,95 105 9,1 105 2,35 106 3 106 2,7 107 3,85 107 8 107
(UFC/ml)

1.3.2. Conditions d’interprétation

L’identification d’une bactérie est régie par un certain nombre de critères qui
permettent de les catégoriser (cf. 1.1.2).

1.3.3. Résultats des plaques Micro-CSB

Les conditions d’étude de Acinetobacter ont été les mêmes que celles de
[Link] (cf. 1.1.3).

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 4éme, à la 8éme, à la 12éme

et à 24 heures d’incubation en fonction de l’inoculum

82
 Tableau XX : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Acinetobacter)

Inocula Caractères
(UFC/ml) d’identification
2,35 106 3 106 2,7 107 de
Acinetobacter
[4, 14, 23]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques
ADH - - - - - - - - - - - - -
ONPG - - - - - - - - - - - - -
CC - - - + - - - + - - - + +
CS - - - + - - + + - - + + +
ESC - - - - - - - - - - - - -
GEL - - - - - - - - - - - + d
H2S - - - - - - - - - - - - -
IND i i i - i i i - i i i - -
MAL - - - - - - - - - - - - -
PDA i i i - i i i - i i i - -
NIT i i i - i i i - i i i - -
URE - - - - - - - - - - - - d
GLU - - - - - - - - - - - - -
LAC - - - - - - - - - - - - -
MAN - - - - - - - - - - - - -
SOR - - - - - - - - - - - - d
XYL - - - - - - - - - - - - d
Concordance 85 85 85 100 85 85 92 100 85 85 92 100 100
des caractères
(%)

Légende : (+) = caractère positif,

(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = caractère indéterminé.
83
Tableau XXI : Concordance des caractères biochimiques en fonction de
l’inoculum et du temps d’incubation des plaques (Acinetobacter)

Caractères
Inocula (UFC/ml) d’identification
3,85 107 8 107 de
Acinetobacter
[4, 14, 23]
Temps
d’incubation 4 8 12 24 4 8 12 24
en heures

Tests
biochimiques
ADH - - - - - - - - -
ONPG - - - - - - - - -
CC - - + + - - + + +
CS - + + + - + + + +
ESC - - - - - - - - -
GEL - - - - - - - - d
H2S - - - - - - - - -
IND i i i - i i i - -
MAL - - - - - - - - -
PDA i i i - i i i - -
NIT i i i - i i i - -
URE - - - - - - - - d
GLU - - - - - - - - d
LAC - - - - - - - - -
MAN - - - - - - - - -
SOR - - - - - - - - d
XYL - - - - - - - - d
Concordance des 85 92 100 100 85 92 100 100 100
caractères (%)

Légende : (+) = caractère positif,

(-) = caractère négatif,
(d) = caractère variable,
(i) = caractère indéterminé.

84
Figure 21 : Concordance des caractères de Acinetobacter en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 2,35 106 UFC/ml

Dès la 4éme heure, nous avons pu obtenir de bons résultats, cela veut dire
que cet inoculum est adéquat pour permettre une bonne identification.

85
Figure 22 : Concordance des caractères étudiés de Acinetobacter en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 3 106 UFC/ml

Les données observées pour l’inoculum de 3 10 6 UFC/ml sont

superposables à celles de l’inoculum de 2,35 106 UFC/ml pour les heures de
lecture suivantes : 4 heures, 8 heures et 24 heures. Alors qu’une évolution a
été observée à la 12éme heure, le pourcentage de concordance à cette heure est
passé de 85 % à 92 %.

86
Figure 23 : Concordance des caractères de Acinetobacter en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 2,7 107 UFC/ml

Les résultats observés pour l’inoculum de 2,7 107 UFC/ml sont les
mêmes que ceux de l’inoculum de 3 106 UFC/ml.

87
Figure 24 : Concordance des caractères de Acinetobacter en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 3,85 107 UFC/ml

L’évolution des concordances s’est faite en fonction du temps. En

passant de l’inoculum de 2,7 107 UFC/ml à 3,85 107 UFC/ml, les
pourcentages ont bien évolué. A la 4éme heure de lecture le pourcentage des
caractères est passé de 85 % à 92 %, à la 8éme heure de lecture celui-ci est
passé de 92 % à 100 %, signe d’une bonne évolution dans l’identification de
la souche.

88
Figure 25 : Concordance des caractères de Acinetobacter en
fonction du temps d’incubation de la microplaque CSB avec
un inoculum de 8 107 UFC/ml

Pour les inocula 3,85 107 UFC/ml et 8 107 UFC/ml, les concordances
étaient constantes.

 Résultats des galeries Micro-CSB obtenus à la 12éme heure

d’incubation en fonction de l’inoculum

Les résultats obtenus à la 12éme heure étaient acceptables.

89
Tableau XXII : Etude comparative des résultats obtenus à la 12éme heure
d’incubation en fonction des différents inocula.

I2 I3 I4 I5 I6
Inocula (UFC/ml)
2,35 106 3 106 2,7 107 3,85 107 8 107
Caractères
Biochimiques
ADH - - - - -
ONPG - - - - -
CC - - - + +
CS - + + + +
ESC - - - - -
GEL - - - - -
H2S - - - - -
IND
MAL - - - - -
PDA
NIT
URE - - - - -
GLU + - - - -
LAC - - - - -
MAN - - - - -
SOR - - - - -
XYL - - - - -
% de concordance des 85 92 92 100 100
caractères

(I) = inoculum
(i) = caractère indéterminé

90
 Figure 26 : Identification de Acinetobacter au bout de 12h
d’incubation des Plaques en fonction des différents
inocula

Il y a 17 tests biochimiques qui permettent d’identifier Acinetobacter,

mais parmi ces 17 tests, les trois n’ont pu être déterminés qu’à la 24 éme heure
de lecture après ajout de réactifs de révélation.
Pour le premier inoculum, deux caractères étaient discordants ; c’étaient
le CS et le CC. Pour les inocula 3 106 UFC/ml et 2,7 107 UFC/ml, seul le CC
est resté négatif. Ils se sont tous révélés aux deux derniers inocula.

91
II. VALIDATION DE LA METHODE

2.1 Détermination de la droite de régression

2.1.1 Paramètres de détermination

La droite de régression fournit une idée schématique de la relation entre deux

variables.

Pour faire la prédiction, il s'agira simplement de substituer la valeur donnée à x

dans l'équation de régression et de calculer la valeur de y’.
Pour cela nous avons tracé la droite la plus représentative de l’ensemble qui
est donnée par l’équation :

où a et b sont des constantes déterminées par les formules suivantes :

x et y sont des variables

92
Ce qui nous a permis de calculer un coefficient de corrélation entre les deux
variables, r de formule :

r = coefficient de corrélation; xi = données observées

b = pente de la droite; a = ordonnée à l’origine
n = concentration inocula; C = concordance des caractères
Y’ = données à l’ordonnée de droite de corrélation
N = nombre de paires (x ; y) utilisées pour calculer la droite de concordance.

Critères d’interprétation de «r » et de « a »

r = 0,2 à 0,4 : Corrélation faible ou quasi absence de corrélation.

r = 0,4 à 0,6 : Corrélation moyenne.
r = 0,6 à 0,8 : Bonne corrélation.
r = 0,8 : Corrélation élevée.
r = 1 où -1 : Corrélation parfaite

a = 0 : pas de corrélation
a < 0 : corrélation négative
a > 0 : corrélation positive

93
 2.1.2. Escherichia coli

Tableau XXIII : Résultats de [Link] à la douzième heure d’incubation des

microplaques

Concentrations
inocula 5,5 106 6,85 106 7,65 106 1,75 1,4 108
(UFC/ml) 107
Concordance
des caractères 86 86 93 93 93
(%)
x = log [n] 6,7 6,83 6,88 7,24 8,14
y=C 0,86 0,86 0,93 0,93 0,93
a 0,040
b 0,613
Y’ 0,881 0,886 0,888 0,90 0,94
r 0,614

La corrélation entre la taille de l’inoculum et la concordance des caractères est

bonne. L’équation de la droite obtenue par la méthode des moindres carrés est
sous la forme de y’ = 0,040x + 0,613, avec r = 0,614. La valeur de a, pente de
la droite est supérieure à zéro donc la corrélation est positive.

94
 2.1.3. Klebsiella pneumoniae

Tableau XXIV : Résultats de K. pneumoniae à la douzième heure

d’incubation des Microplaques

Concentrations
inocula (UFC/ml) 2 107 1,35 1,5 108 3,45 1,75
108 108 109
Concordance des
caractères (%) 73 73 80 80 80
x = log [n] 7,3 8,13 8,17 8,53 9,24
y=C 0,73 0,73 0,8 0,8 0,8
a 0,039
b 0,444
Y’ 0,73 0,761 0,763 0,77 0,80
r 0,725

La corrélation entre la taille de l’inoculum et la concordance des

caractères est bonne. L’équation de la droite obtenue par la méthode des
moindres carrés est sous la forme de y’ = 0,039x + 0,444, avec r = 0,725. La
valeur de a, pente de la droite est supérieure à zéro donc la corrélation est
positive.

95
 2.1.4. Salmonella paratyphi A

Tableau XXV : Résultats de S. paratyphi A à la douzième heure d’incubation

des microplaques
Concentrations
inocula 4 105 1,2 106 1,42 106 3,5 106 1,2 107
(UFC/ml)
Concordance
des caractères 93 93 100 100 100
(%)
x = log [n] 5,6 6,08 6,15 6,54 7,08
y=C 0,93 0,93 1 1 1
a 0,051
b 0,648
Y’ 0,93 0,95 0,96 0,98 1
r 0,74

L’équation de la droite obtenue par la méthode des moindres carrés est

suivante : y’ = 0,051x + 0,648 avec r = 0,74. Une bonne corrélation a été
obtenue entre la taille de l’inoculum et la concordance des caractères. La
valeur de a, pente de la droite est supérieure à zéro donc la corrélation est
positive.

96
 2.1.5. Acinetobacter

Tableau XXVI : Résultats de Acinetobacter à la douzième heure d’incubation

des Microplaques

Concentrations
inocula (UFC/ml) 2,35 106 3 106 2,7 107 3,85 8 107
107
Concordance des
caractères (%) 85 92 92 100 100
x = log [n] 6,37 6,47 7,43 7,58 7,90
y=C 0,85 0,92 0,92 1 1
a 0,078
b 0,376
Y’ 0,87 0,88 0,95 0,97 0,99
r 0,85

Une corrélation élevée a été observée entre la taille de l’inoculum et la

concordance des caractères. L’équation de la droite obtenu par la méthode des
moindres carrés est sous la forme de y’ = 0,078x + 0,376, avec r = 0,85. La
pente de la droite est supérieure à zéro donc la corrélation est positive.

97
 Notre étude tournait au tour de deux objectifs majeurs à savoir :
 La recherche de l’effet de l’inoculum sur l’identification des
bactéries
 L’étude de l’impact de la taille de l’inoculum sur le temps
d’incubation des galeries Micro-CSB.
Une analyse pratique réalisée de façon minutieuse au laboratoire a donné
des résultats fiables et utilisables.

I. LES SOUCHES BACTERIENNES

Pour atteindre nos objectifs nous avons choisi de travailler avec quatre
espèces. Ces souches ont été identifiées avant chaque manipulation pour
confirmer leur authenticité. Il s’agit de trois bacilles à Gram négatif qui
étaient E. coli, K. pneumoniae et S. paratyphi A et d’un bacille Gram négatif
non fermentaire : Acinetobacter. Ces souches ont été isolées sur de la gélose
CLED (cysteine lactose electrolyte deficient). Celle-ci avec son composant
lactosé permettait une meilleure caractérisation de l’ONPG. Les souches qui
fermentent le lactose, présentaient sur la gélose des colonies jaunes alors que
celles qui ne le fermentent pas présentaient des colonies transparentes ou
bleues. Pour les identifier nous avons utilisé la mini galerie classique
d’identification pour avoir une assurance de la qualité de la souche étudiée.

II. ETUDE DE LA CROISSANCE PAR LA METHODE

DU DENOMBREMENT SUR BOITE DE PETRI

Quelques difficultés ont été rencontrées au cours de notre étude. Trouver

la dilution adéquate pour obtenir un inoculum convenable était le problème
majeur. Cette technique est très fastidieuse, il fallait effectuer plusieurs

98
dilutions. A chaque point de prélèvement nous devions faire des dilutions
progressives et ensemencer cet inoculum par étalement sur des boîtes de pétri
contenant de la gélose MH. Pour obtenir cet inoculum convenable, nous
avons rencontré quelques difficultés mais cela s’est amélioré après quelques
manipulations. L’autre difficulté était d’éviter la présence de souillures au
cours de nos opérations, car celles-ci pouvaient modifier considérablement
nos résultats.

III. EFFET DE L’INOCULUM ET DU TEMPS D’INCUBATION SUR

L’IDENTIFICATION DES BACILLES GRAM NEGATIFS

Les galeries d’identification Micro-CSB Entérobactéries et Micro-CSB

BGNNF ont été validées par les études de stabilité, d’efficacité, et de
reproductibilité avant leur utilisation.
Le nouvel objectif qu’il fallait atteindre avec ces plaques était la
réduction de leur délai de lecture. Il fallait tout d’abord inoculer les plaques
avec différentes concentrations obtenues au cours des 3h ou 2h10min de
manipulation. Ensuite les plaques étaient incubées à l’étuve à 37°C, elles
devaient rester 4h dans cette environnement ce qui correspondait à la
première phase de lecture. A cet instant les caractères définissant la souche
n’étaient pas très significatifs. La plaque était ré-incubée pour quatre autres
heures ce qui correspondait à 8h d’incubation. A cette heure de lecture nous
avons constaté une amélioration de la positivité des caractères. La plaque est
remise à l’étuve pendant 4h ce qui revenait à un total de 12h d’incubation. La
majorité des caractères pouvaient correctement être identifiés à cette heure de
lecture. Certains des caractères n’ont pu être déterminés qu’après 24h
d’incubation car ceux-ci nécessitaient l’ajout de réactifs pour leur révélation.

99
 Toute cette opération avait pour objectif la réduction du temps
d’incubation. Et cette réduction pouvait permettre à ces plaques d’avoir une
compétitivité sur le marché par rapport aux autres méthodes d’identification
des bacilles à Gram négatif.

3.1. Escherichia coli

Cette espèce appartient à la famille des Enterobacteriaceae, cette famille

comporte un caractère indispensable qui est la fermentation du glucose et
comme E. coli est capable de fermenter le glucose il est donc un membre de
cette famille. Le genre auquel il appartient présente des caractères
déterminants que sont l’ONPG et le lactose, E. coli respecte l’appartenance à
ce groupe. Il est le seul à répondre aux caractères suivants : Urée (-), Indole
(+), ce sont ses caractères d’espèces. [13]
Tous ces caractères ont pu être identifiés déjà à la 8éme heure, l’Indole
fait partie des caractères qui nécessitaient l’ajout de réactif de révélation à la
24éme heure. Seul l’ONPG n’a pu être identifié cela s’explique par la lenteur
de la réaction, il n’a pu être révélé qu’après 24h. Le test à l’ONPG est encore
appelé test à la β galactosidase, ce test est indispensable lorsque le lactose ne
peut être révélé. Le retard dans l’identification de l’ONPG s’explique par le
fait que : la β Gal est une enzyme inductible et le test se réalise en deux
temps. Il faut d’abord une induction de l’enzyme par du lactose, ce qui va
permettre à l’enzyme d’agir sur le substrat pour donner l’ortho-nitro-phénol.
Des études antérieures ont montré que pour favoriser l’élution des disques, il
fallait les immerger dans une solution de lactose de 10% [4]. Nous avons pu
le révéler, 24 heures après parce que notre milieu d’isolement le CLED
contient 10% de lactose.

100
 Nous avons pu avoir jusqu'à 93% de caractères concordants au profil de
référence avec des inocula de 7,65 106 UFC/ml, de 1,75 107 UFC/ml et 1,4
108 UFC/ml.

3.2. Klebsiella pneumoniae

Cette espèce appartient également à la famille des Enterobacteriaceae

car comme E. coli elle est capable de fermenter le glucose. Comme espèce
elle présente des caractères indispensables qui sont le VP (+),
l’ODC (-), l’Indole (-). Le VP et l’Indole n’ont pu être identifiés qu’après 24h
car leur révélation nécessitait l’ajout de réactifs, ils ont répondu positivement
aux normes d’identification de l’espèce. Seul l’ODC a présenté des caractères
discordants. Ce caractère est négatif pendant les 12h d’incubation ce qui s’est
avéré correct, c’est à la lecture de 24h que ce caractère est devenu positif ce
qui est anormal. En effet l’ODC est une enzyme qui scinde l’acide aminé
présent dans le milieu, ce milieu contient du glucose et un indicateur coloré.
La souche après avoir été ensemencé dans le milieu et que celle-ci soit
capable de fermenter le glucose, il va y avoir une acidification du milieu cela
va permettre à l’enzyme de la souche de scinder l’acide aminé présent dans le
milieu pour donner une amine. Ainsi la présence de l’amine va alcaliniser le
milieu et entrainer le virage de l’indicateur coloré [13].
L’explication qu’on pourrait avancer sur la positivité de ce caractère
serait une mutation de la souche car la souche de Klebsiella pneumoniae ne
possède pas cette décarboxylase et donc n’aurait pu scinder l’acide aminé
présent dans le milieu.
Les lectures qui ont été faites à 4h et à 8h aux différents inocula n’ont
pas donné de bons résultats, nous n’avons pas pu bien identifier la souche de
K. pneumoniae. L’identification n’a été possible qu’à la 12éme et à la 24éme
heure, nous avons obtenu des pourcentages variant entre 80% à 83%.

101
 3.3. Salmonella paratyphi A [13, 32]

Contrairement aux deux autres souches celle-ci appartient à la famille

des Enterobacteriaceae mais ne fermente pas le lactose. Elle présente des
caractères d’espèce qui sont négatifs ce qui permet de la distinguer des autres
espèces de Salmonella, il y a le LDC, le CS et le H2S. [10] Le seul caractère
discordant que nous ayons rencontré c’est la fermentation du lactose, il s’est
avéré être positif pour les inocula de 4 105 UFC/ml et de 1,2 106 UFC/ml aux
heures de lecture de 4h, 8h et 12h ; pour l’inoculum de 1,42 106 UFC/ml aux
heures de lecture de 4h et 8h enfin pour les inocula de 3,5 10 6 UFC/ml et de
1,2 107 UFC/ml pour la première lecture.
Selon Robert FASQUELLE nous pouvons avancer des explications
1plausibles. Il faudrait tout d’abord que nous parlions de l’isolement de la
souche, en effet celle-ci a été ensemencée dans la gélose CLED qui contient
10% de lactose. Les bactéries qui fermentent le lactose possèdent d’une part
l’enzyme nécessaire à la pénétration du lactose dans la bactérie, il s’agit de la
β-galactoside perméase et d’autre part l’enzyme scindant la molécule de
lactose en glucose et en galactose, il s’agit de la β-galactosidase qui est une
enzyme induite par le lactose. Si toutefois la souche avait subi plusieurs
isolements et par conséquent avait acquis un mutant perméase (+), cette
dernière pourrait faire pénétrer le lactose dans la cellule bactérienne. Ainsi la
fermentation pourrait avoir lieu et le milieu lactosé serait acidifié avec virage
du milieu. L’identification de la souche a été excellente avec des pourcentages
de l’ordre de 86% à 100%.

3.4. Acinetobacter [13]

Acinetobacter appartient aux bacilles Gram négatifs non fermentaires.

Ce genre bactérien fait parti d’un groupe qui ne possède pas d’oxydase ce qui
les différencie des autres BGNNF comme les Pseudomonas. Il a des

102
caractères indispensables mais ceux-ci varient en fonction de l’espèce. Nous
n’avons pas observé de discordance dans les caractères de Acinetobacter.
Pour les différents inocula les concordances montrent que Acinetobacter a pu
être très bien identifié avec des pourcentages variant entre 85% et 100%.

IV. LA VALIDATION

Toute méthode d’analyse doit être validée pour prouver qu’elle

correspond bien à l’usage pour lequel, elle est prévue. Pour cela nous avons
utilisé la droite de régression qui est un diagramme de dispersion qui montre
l’existence d’une relation linéaire en vue d’une prédiction. Nous avons tenté
d’établir une relation entre les concordances des caractères et les inocula qui
ont servi à leur obtention. Pour les quatre souches étudiées nous avons obtenu
les résultats suivants :

E. coli : y’ = 0,040x + 0,613

K. pneumoniae : y’ = 0,039x + 0,444
S. para typhi A : y’ = 0,051x + 0,648
Acinetobacter : y’ = 0,078x + 0,376

Nous pouvons constater que les valeurs de a obtenu sont supérieurs à

zéro, la corrélation est donc positive. A partir de ces droites une corrélation a
été établi avec comme coefficient de corrélation des deux variables étudiées :

E. coli : r = 0,614
K. pneumoniae : r = 0,725
S. paratyphi A : r = 0,74
Acinetobacter : r = 0,85

103
 La valeur des coefficients de corrélation trouvée permet de dire que nos
droites sont plutôt fiables. Elle permet également de conclure que la relation
entre les deux variables tend vers la linéarité dans la mesure où la plupart des
coefficients de corrélation r sont bons. Néanmoins il faudrait préciser qu’une
très bonne corrélation devrait avoir un coefficient de corrélation égale à 1 ou
proche de 1.

104
 Les infections humaines à entérobactéries et à bacilles Gram négatif non
fermentaires occupent une place importante en pathologie infectieuse en
raison de leur fréquence et de leur gravité, tant au niveau de l’hôpital qu’au
sein des populations.
Le diagnostic microbiologique et le traitement de ces infections imposent
l’identification correcte de l’agent étiologique en cause pour une bonne prise
en charge thérapeutique.
C’est dans cette perspective que l’unité de recherche et de
biotechnologie microbienne du laboratoire de bactériologie-virologie de
l’hôpital Aristide Le Dantec a élaboré une technique d’identification reposant
sur l’utilisation de mini galeries à savoir les microplaques CSB. L’efficacité,
la fiabilité et la spécificité de celles-ci ont été prouvées et améliorées par des
études antérieures. De plus, leur moindre coût a permis leur accessibilité au
niveau certaines couches sociales. Leur seule contrainte se situe au niveau de
leur compétitivité par rapport à d’autres méthodes d’identification telles que
les galeries API qui ont réussi à réduire leur temps d’incubation.
C’est dans cette optique que nous avons cherché à identifier des bacilles
Gram négatifs avec un inoculum adéquat et en un temps réduit.
Cette étude a eu lieu au laboratoire de recherche de l’UCAD II du
Professeur BOYE entre Janvier et Juin 2008. Elle a porté sur quatre souches à
savoir :
 Escherichia coli ATCC 25922,
 Klebsiella pneumoniae,
 Salmonella Paratyphi A
 Acinetobacter

105
 Escherichia coli

Dès la 8éme heure, l’analyse a révélé une identification acceptable de E.

coli avec des pourcentages de l’ordre de 80%. Cependant la meilleure
identification, tout en restant bien entendu dans l’idée de la réduction du
temps d’incubation, a été obtenue à la 12éme heure de lecture de la plaque
Micro-CSB Entérobactéries. Le pourcentage des caractères obtenu à cette
heure de lecture ont variés entre 86% et 93% pour différents inocula à savoir :
5,5 106 UFC/ml, 6,85 106 UFC/ml, 7,65 106 UFC/ml, 1,75 107 UFC/ml et 1,4
108 UFC/ml.

Klebsiella pneumoniae

Avec l’espèce K. pneumoniae, l’identification n’a été acceptable qu’à la

12éme heure de lecture pour les inocula de 1,5 10 8 UFC/ml, de 3,45 108
UFC/ml et de 1,75 109 UFC/ml avec une concordance de 80%.

Salmonella Paratyphi A

Avec la souche de S. paratyphi A l’identification a été excellente. Ainsi

dès la 4éme heure la concordance était à 86% avec un maximum de 100% à la
12éme heure de lecture des plaques pour les inocula de 1,42 10 6 UFC/ml, de
3,5 106 UFC/ml et de 1,2 107 UFC/ml.

Acinetobacter

Acinetobacter a très tôt pu être identifié, avec à la 4éme heure un

pourcentage de 85% et un maximum de 100% à la 12éme heure pour des
inocula de 3,85 107 UFC/ml et de 8 107 UFC/ml.

106
 Dans le cas général nous avons pu établir une identification acceptable
des souches étudiées avant 24 heures.

En plus d’être une exigence réglementaire, la validation doit également

être une exigence de la part du laboratoire lui-même, dans un souci de qualité,
de sécurité et de meilleure maîtrise des procédés. C’est dans ce cadre qu’une
relation linéaire acceptable a pu être établie entre les deux variables (x et y) à
savoir la concordances et les inocula. Les équations de droite de régression
ont permis de faire des estimations acceptables.

Par ailleurs, dans une perspective de rendre la recherche plus exhaustive,

il serait intéressant d’apprécier la répétabilité ainsi que la reproductibilité de
la méthode; mais également d’explorer l’effet du changement de certains
paramètres (pH, température, activité enzymatique) sur l’identification.

107
1. API 20 E
Système d’identification des entérobactéries
Bio Mérieux S. A. France, 2002.

2. Association des Enseignants de Microbiologie et d’Immunologie

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Bactériologie clinique.
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Bactériologie médicale : Techniques usuelles.
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Application d’une présentation par objet des connaissances de
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Microbiologie prévisionnelle : Un outil pour estimer la durée de vie
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32. Article de Wikipedia
Entérobacteriaceae :
« http : //[Link]/wiki/Enterobacteriaceae».

33. Article de Wikipedia

Droite de corrélation :
[Link]

113
 SERMENT DE GALIEN

Je jure, en présence des maîtres de la faculté, des

conseillers de l’ordre des pharmaciens et de mes
condisciples :

D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de

mon art et de leur témoigner ma reconnaissance en
restant fidèle à leur enseignement ;

D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma

profession avec conscience et de respecter non seulement
la législation en vigueur, mais aussi les règles de l’honneur,
de la probité et du désintéressement ;

De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs

envers le malade et sa dignité humaine.

En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes

connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et
favoriser des actes criminels.

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à

mes promesses.

Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes

confrères si j’y manque.

114
 VU VU
LE PRESIDENT DU JURY LE DOYEN

VU ET PERMIS D’IMPRIMER
LE RECTEUR DE L’UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

115