UE BIO 232: TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE

Année académique Semestre 2-2024/2025

TP N°4 : PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES ACIDES AMINÉS, PEPTIDES ET
PROTÉINES : RÉACTIONS COLORÉES

Quelques Rappels: Molécules présentes chez les êtres vivants

1- Composés inorganiques  Protéines (10-20%).

 Lipides (1-5%).
 (Eau) 70-80%.  Acides nucléiques (1-2%).
 Glucides (0,2-2%).

2- Composés organiques

Les acides aminés sont les unités constitutives des protéines. Ils possèdent tous (à l’exception de la proline)
au moins deux fonctions caractéristiques : carboxylique α-COOH et aminée α-NH2. Certains acides aminés
possèdent en plus dans le radical R d’autres groupements ionisables (Asp, Arg, Glu, Lys, Tyr, etc). Généralement
une séquence peptidique possède deux extrémités libres α-NH2 et α-COOH. Par convention, cette séquence
s’écrit en plaçant à gauche l’extrémité α-NH2 et à droite l’extrémité terminale α-COOH.
Les acides aminés en solution sont toujours sous formes chargées. Cette charge dépend du pH, de la force
ionique et des constantes de dissociation de leurs fonctions.
Les protéines sont des macromolécules constituées d’acides aminés liés les uns aux autres par des liaisons
amides substituées appelées liaisons peptidiques.
Les sucres, encore appelés glucides ou hydrates de carbone Cn(H2O)n, sont des composés comportant de
nombreux groupements hydroxyles (-OH) responsables de leur caractère très hydrophile. La présence de
groupement carbonyle (-C=O), aldéhyde ou cétonique leur confère un caractère réducteur. Ils peuvent être
divisés en deux groupes : les oses (monosaccharides) et les osides (polysaccharides).
Les lipides sont en général des esters d’alcool et d’acides gras. La nature de l’alcool est variable et les acides
gras sont saturés ou insaturés, parfois substitués par de l’acide phosphorique et une base azotée
(phospholipides). Les graisses sont généralement riches en acides gras saturés et les huiles en acides gras
insaturés. Ce sont les longues chaînes paraffiniques des acides gras qui confèrent aux lipides leur insolubilité
dans l’eau et leur solubilité dans les solvants organiques.

3- Les éléments chimiques dans une cellule :

 Oxygène (56-75%), Carbone (15-18%), Hydrogène (8-10%) et Azote (1,5-3%) représentent 98%
environ.
 Potassium, Soufre, Phosphore, Chlore, Magnésium, Sodium, Calcium, Fer représentent 2% environ.
 Zinc, Cuivre, Iode et Fluor représentent des traces.
4- Les groupements :
 Le groupe Méthyle (-CH3) est hautement ionisable dans l'eau. La chaîne aliphatique ne forme pas de
ponts hydrogène.
 Le groupe Hydroxyle (-OH) est soluble dans l'eau et peut former des ponts hydrogène.
 Le groupe Carboxyle (-COOH) est chargé négativement à pH physiologique et forme des ponts
hydrogène.
 Le groupe Amine (-NH2) zwittérion à pH physiologique, forme des ponts hydrogènes.
 Le groupe Phosphate (PO4--), toujours chargé négativement, est très soluble dans l'eau et forme des
ponts hydrogène.
 Les groupes Carbonyle (>CO), Aldéhyde (RHCO) et Cétone (R2CO) forment des ponts hydrogène
1
 avec l'eau.
 Le groupe Amide (-CONH2) forme des ponts hydrogène.

 Le groupe Sulfhydryle (thiol, -SH) forme des ponts hydrogènes, des liaisons thioesters (C-S-CO) et
des ponts dissulfures (S-S).

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A- RÉACTIONS COLORÉES DES ACIDES AMINÉS, PEPTIDES ET PROTÉINES
Les réactions colorées des protides (acides aminés, peptides et protéines) sont dues soit à leurs structures, soit
à la présence dans celle-ci d’un résidu d’aminoacide (AA) particulier.
I- Réactions colorées générales
1- Réaction à la Ninhydrine (Réaction générale des acides aminés)
Caractérise: La présence des groupements -NH2 libre.
Principe: Traités par un excès de ninhydrine et à chaud, les AA et protéines subissent une désamination
oxydative avec libération de CO2 et NH3. La ninhydrine réduite formée réagit avec une molécule de ninhydrine
non réduite et l’ammoniaque pour former un complexe bleu-violet.
Les AA proline et hydroxyproline donnent avec la ninhydrine une coloration jaune.

Δ
Ninhydrine AA Complexe coloré
Mode opératoire:
 À 1 mL de la solution d’AA dans chacun des tubes, ajouter 1 mL d’une solution fraîchement préparée de
ninhydrine à 2%.
 Porter au bain marie pendant 5 min.
 Observer, noter la coloration et interpréter.

2- Réaction du Biuret (Réaction générale des peptides et protéines)

Caractérise: La présence de la liaison peptidique ; s’applique à l’analyse quantitative des peptides et protéines.
Principe: En milieu alcalin et en présence des ions Cu2+, les peptides ayant au moins 5 AA et protéines
donnent une coloration variant du rose-violet (protéine à courte chaine) au bleu-violet (protéine à longue
chaine). Il y a formation des liaisons de coordinence avec Cu2+.
+
Cu2

Liaisons peptidiques Complexe Bleu-violet

Mode opératoire:
 Introduire dans un tube à essai de 1 mL de solution protéique et environ 0,5 mL de lessive de soude
(solution de soude à 40%).
 Mélanger, puis laisser couler (goutte à goutte) 10 gouttes de sulfate cuivrique à 1% le long de la paroi.
 Mélanger et noter la coloration.
NB : Eviter d’ajouter trop de sulfate cuivrique car au contact de la soude, il se forme de l’hydroxyde cuivrique bleu foncé
qui par sa couleur propre peut masquer la réaction.

II- Réaction colorées spécifiques

Les réactions spécifiques d’un aminoacide ou d’un groupe d’aminoacides seront effectuées sur des solutions
d’aminoacides avant d’être appliquées à la solution protéique.

1- Réaction du Soufre
Caractérise: La présence du groupement thiol (-SH) et les ponts disulfures (-S-S-).

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 Principe: En milieu alcalin, la protéine chauffée libère du soufre sous forme de sulfure de sodium (Na2S), qui
donne en présence de l’acétate de plomb du sulfure de plomb (PbS) noir.
-SH + Pb(CH3COO) 2
+ NaOH ======> ==============> PbS
-S-S- Δ

Mode opératoire :
 Mettre dans chaque tube à essai 2 mL de la solution de cystéine, cystine ou de méthionine à 2% ou de blanc
d’oeuf à 5%, et ajouter 15 gouttes de soude à 40%.
 Bien homogénéiser et faire bouillir pendant 5 min, noter la coloration.
 Ajouter trois gouttes de solution d’acétate de plomb neutre à 10%, mélanger et observer.

2- Réaction d’Arnold
Caractérise: Les AA ou protéines ayant un groupement thiol (–SH) libre.
Principe : En milieu ammoniacal, l’addition du nitroprussiate de sodium (Na2[Fe(CN)5NO]) à un composé
ayant un-SH libre fait apparaître une coloration rose-vif.
Mode opératoire :
 Introduire dans chaque tube à essai 1 mL d’une solution de méthionine 2%, de cystéine et de blanc d’oeuf à
5% et y ajouter 5 gouttes d’ammoniaque (NH4OH, 2N) et noter la coloration.
 Ajouter ensuite une petite pincée de nitroprussiate de sodium cristallisé et noter immédiatement la
coloration, observer et interpréter.

3- Réaction Xanthoprotéique
Caractérise: Les groupements aromatiques des AA et des protéines.
Principe : En présence de l’acide nitrique et à chaud, il se forme un dérivé nitré benzénique jaune qui vire à
l’orange en présence de la soude.
Mode opératoire :
 Mettre dans chaque tube à essai, 2 mL de la solution de tyrosine, de tryptophane ou de phénylalanine et de
blanc d’oeuf à 5%.
 Ajouter 0,5 mL d’acide nitrique concentré et noter la coloration ; chauffer 5 min et noter la coloration.
 Ajouter 40 gouttes de NaOH à 40%, noter la coloration et interpréter.

4- Réaction de Sakaguchi
Caractérise : Le groupement guanidium de l’arginine.
Principe : En présence de l’𝛼-naphtol et en milieu basique, il se forme un complexe rouge lors de l’addition
de l’hypochlorite de sodium (ClO4Na).
Mode opératoire :
 Mettre dans chaque tube à essai 2 ml de solution d’arginine et de blanc d’oeuf à 5%, 0,5 mL de soude à
40%, 1 mL de solution alcoolique d’𝛼-naphtol à 0,3% et mélanger.
 Ajouter 15 gouttes de la solution d’hypochlorite de sodium (eau de javel 48).

B- PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES : PRÉCIPITATION DES PROTÉINES

1- Dénaturation
L’ensemble des états conformationnels très voisins que peut présenter une protéine biologiquement active
constitue ce que l’on appelle l’état natif. Cette structure est fragile et est facilement perdue, l’activité biologique
disparait alors, les propriétés chimiques et physico-chimiques changent. La protéine passe de sa structure
initiale (l’état natif) à l’état dénaturé.
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La limite entre la structure native et la structure dénaturée de la protéine correspond à la perte de son activité
biologique (activité catalytique des enzymes, complexant des anticorps, etc.). Si elle ne correspond qu’à une
modification structurale restreinte, elle est peut être réversible après suppression des agents qui l’ont provoqués
; cependant elle est plus souvent irréversible. En générale, les protéines dénaturées précipitent et ne peuvent plus
repasser en solution après précipitation.
a) Précipitation des protéines par les métaux lourds
C’est une dénaturation irréversible avec formation des mercaptides (réaction des métaux avec -SH) et
chélates (réaction avec -S-S-).
Mode opératoire :
 Introduire dans chaque tube à essai 1 mL de la solution protéique et d’aminoacide.
 Ajouter (goutte à goutte) 15 gouttes d’une solution aqueuse de AgNO3 à 1%.
 Noter l’intensité du précipité et ajouter un excès de AgNO3.
 Observer, puis ajouter de 2mL H2O et/ou de l’eau en excès.
NB: Refaire la même opération en remplaçant AgNO3 par une solution aqueuse de CuSO4 à 1%.

b) Précipitation par les acides organiques

Les acides organiques réagissent avec les résidus polaires des protéines. Ceci entraine la rupture des liaisons
hydrogènes et ioniques et par conséquent une dénaturation irréversible.
Mode opératoire : Tester l’effet d’une solution aqueuse d’acide trichloroacétique à 5% sur de la solution
protéique et un aminoacide.

c) Coagulation par la chaleur

Quand on porte 1 mL de solution protéique à l’ébullition, il y a augmentation de l’agitation moléculaire, rupture
des liaisons hydrogène et hydrophobe. Qu’observe-t-on à la redissolution du précipité obtenu dans de l’eau
distillée? De quel type de dénaturation s’agit-il?

2- Relargage
Dans une solution d’électrolyte, la solubilité des protéines varie avec la concentration en électrolytes, chaque
protéine a un maximum de solubilité pour une concentration de l’électrolyte. Au-delà de cette concentration
optimale, la protéine précipite : c’est le relargage des protéines. La précipitation par relargage ne dénature pas
les protéines ; ces dernières peuvent passer à nouveau en solution si on diminue la concentration de l’électrolyte
par addition d’eau.
Précipitation par le sulfate d’ammonium : Le sulfate d’ammonium (sel neutre) augmente la solubilité des
protéines jusqu’à un maximum (Salting in). Au-delà d’une certaine concentration en sel, on observe une
déshydratation de la protéine, puis précipitation (Salting out), sans rupture des liaisons qui stabilisent la protéine.
L’addition d’eau au précipité amène à sa redissolution : la précipitation est dite réversible, c’est le relargage.
Mode opératoire :
 Introduire dans chaque tube à essai 1 mL de la solution protéique et d’aminoacide.
 Ajouter 1 mL d’une solution aqueuse saturée de SO4 (NH4)2.
 Attendre 5 min à basse température, puis essayer de redissoudre le précipité dans de l’eau distillée (5mL).
Observer. Interpréter.