Dynamique des communautés microbiennes des biofilms

phototrophes à différents niveaux d’intégration

biologique : des successions écologiques aux réponses à
l’exposition à un herbicide
Armelle Paule

To cite this version:

Armelle Paule. Dynamique des communautés microbiennes des biofilms phototrophes à différents
niveaux d’intégration biologique : des successions écologiques aux réponses à l’exposition à un her-
bicide. Biodiversité et Ecologie. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2012. Français. �NNT : �.
�tel-00741353�

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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
 i

Remerciements

Je voudrais tout d’abord remercier Messieurs Eric CHAUVET (Directeur de Recherche,

CNRS) et Jean Luc PROBST (Directeur de Recherche, CNRS), directeurs successifs d’Eco-
Lab (Laboratoire d’Ecologie fonctionnelle et Environnement), pour m’avoir accueillie au sein
de leur laboratoire à Toulouse.
Je tiens particulièrement à remercier mes directeurs de thèse, Messieurs Jean Luc ROLS
(Professeur, Université Paul Sabatier) et Etienne PAUL (Professeur, INSA de Toulouse)
qui m’ont offert l’opportunité de réaliser cette thèse et pour toute la confiance qu’ils m’ont
accordée.
Je tiens à remercier les personnes qui ont accepté d’évaluer ce travail : les rapporteurs
Messieurs Pierre CAUMETTE (Professeur, Université de Pau et des Pays de l’Adour, Pau)
et Bernard MONTUELLE (Directeur de recherche, IRSTEA, Thonon-les-Bains) qui ont tra-
vaillé dans un temps record, et les examinateurs Messieurs Eric CHAUVET (Directeur de
Recherche, CNRS Toulouse), Frédéric GARABETIAN (Professeur, Université de Bordeaux
1) et Sergi SABATER (Professeur, Université de Girone, Espagne).
Un grand merci à John LAWRENCE (chercheur Scientifique) pour m’avoir accueillie au
sein de son équipe d’Environnement Canada, à Saskatoon, dans le cadre d’un séjour ATUPS
de 2 mois. Merci de l’intérêt qu’il a porté à mon travail, sa confiance, la découverte de son
pays et la merveilleuse rencontre avec un hummingbird. Je remercie également le personnel
rattaché à cette équipe, George SWERHONE, pour sa disponibilité, ses cours d’initiation à
la microscopie confocale, et sa grande gentillesse ; Julie ROY, pour l’ensemble de ses conseils
« biomol », et nos nombreux fous rires, Vijay VAMBER, et toutes les personnes du « coffee
time » qui essayaient tant bien que mal de me faire comprendre leurs sujets de conversation.
Merci à Robert DURAN (Professeur, Université de Pau et des Pays de l’Adour) pour
m’avoir accueillie au sein de son équipe IBEAS du LCABIE à Pau, lors de mes séjours «
T-RFLP ». Une mention spéciale à Béatrice LAUGA (Maître de Conférences, Université
de Pau et des Pays de l’Adour), un grand merci pour ta disponibilité, ton investissement,
ton soutien et tes conseils. Je tenais également à remercier les autres membres de l’équipe,
Solange KARAMA pour sa gentillesse, et son aide technique, Magali, Pierre-Jo, Romain,
Yannick, Anne, Jean Philippe, Marion (biofilm power ) (merci de m’avoir intégrée dans vos
soirées), Florence, et Stéphanie. . . qui contribuent à la très bonne ambiance de ce laboratoire
si accueillant, que je retrouvais à chaque fois avec beaucoup de plaisir. Merci à tous !
Ce travail n’aurait pu être réalisé en totalité sans l’aide de François DELMAS (IRSTEA,
Bordeaux) et Vincent ROUBEIX (post-doctorant), notre collaboration fut un réel plaisir, je
tenais à les remercier pour leur grande disponibilité, et nos nombreuses discussions. Merci
Vincent pour ton grand professionnalisme et l’ensemble des analyses d’identification et de
comptage des diatomées que tu as réalisés. Et pour les analyses des pesticides je tiens à
remercier Georges MERLINA (EcoLab) et Hugues PREUD’HOMME (du LCABIE, Pau),
grâce à qui j’ai pu découvrir le monde complexe (enfin une partie) de la chimie analytique et
tout le jargon qui va avec.
 ii

Je tiens à remercier Jean Jacques BERTRAND (et toute son équipe) de la société ARIAS
(Toulouse), pour son professionnalisme, sa grande disponibilité, et son aide précieuse à la
suite du moindre de mes appels de détresse lors des premières utilisations du bioréacteur
annulaire rotatif.
Je tiens particulièrement à remercier Daniel DALGER (Ingénieur d’Etudes, CNRS) pour
sa contribution dans de nombreuses analyses, son investissement, sa disponibilité, la rigueur
analytique qu’il nous enseigne, la découverte de la chimie, et par-dessus tout sa joie de vivre,
et son sens sur l’humour, toujours à nous dépanner, et sur qui on peut toujours compter.
Après 4 années d’expériences, je comprends enfin tous tes jeux de mots du premier coup !
Merci à Yvan Nicaise, pour toutes ses connaissances de la biomol qu’il m’a transmises, et à
qui je dois mon premier bain non prévu dans une eau de rivière très froide, et oui le courant
c’est dangereux. Un grand merci à Loïc TEN-HAGE (Maître de Conférences, Université
Paul Sabatier) « monsieur algue » pour les conseils et l’analyse de mes échantillons et Jean-
Louis DRUILHE (Ingénieur d’Etudes, Université Paul Sabatier) pour la partie électronique
rattachée au bioréacteur. Je tiens également à remercier Asmaa BIAZ, Alexandre LAMY et
Elodie MAZEAU pour leur implication, leur motivation, et leur contribution à ce travail lors
de stages.
Une pensée particulière à Stéphanie BOULETREAU (post- doctorante, Université Paul
Sabatier) et Emilie LYAUTEY (Maître de Conférences, Université de Savoie) mes deux
grandes sœurs scientifiques, j’ai eu cette chance de pouvoir partager le même bureau que
vous ! Un grand MERCI pour votre gentillesse, votre bonne humeur, votre disponibilité,
votre soutien et pour tous vos conseils et connaissances qui m’ont été précieux.
Un grand merci à mes collègues du premier étage du bâtiment 4R3, présents ou passés,
pour votre soutien, votre aide, ou tout simplement merci pour tous ces petits moments du
quotidien passés avec vous dans ce grand bâtiment gris, les Freds, Arthur, Jessica, Clau-
dine, Aurélia, Emilie S., Anthony, Laurent, Amaia, Joséphine, Anne-Marie (merci pour les
chocolats), Sylvain grand buveur de café je te remercie pour ta disponibilité, et ta grande
gentillesse, toujours prêt à aider. . . et à ramener du biofilm tôt le matin ! ! Et enfin Aude la
bulldozer, hakuna matata n’est ce pas ! ! Un grand merci pour le soutien de ces derniers mois,
même jusqu’à 3 h du matin ; pour notre bonne résolution avec nos séances à la piscine. . .
j’espère le début d’une longue amitié ! A toi maintenant, fonce !
Mention spéciale aux abeilles du 3ème étage, Elodie, Fabien et Damien, merci pour ces
soirées passées avec vous. Merci à tous ceux qui ont participé de prés ou de loin à ces années
de thèse quand je n’étais pas au labo, merci pour leur présence, les toulousains, Tom et
Marianne (je vous remercie deux fois, à bientôt de l’autre côté de l’Atlantique), mes amis
« cheval », merci les filles pour tous ces moments de verdure, Audrey, Sandrine ; et les non
toulousains, ma famille Corse, Greg, Mathilde, Emilie (elles sont loin nos années sur les bancs
de la fac de Tours), Xavier et Alienor, mes lyonnais préférés.
J’adresse mes plus vifs et sincères remerciements à ma famille, mes parents, mes 3
stroumphs, Cla, Val et ptit’ la, pour leur soutien sans faille et leur encouragement, mal-
gré la distance.
 iii

Le dernier mot est pour toi Thierry, que te dire de plus que tu ne saches déjà, tu m’as
d’abord supportée (respect ! !), soutenue et aidée jusqu’à la dernière ligne de ce manuscrit. . . ,
et tout au long de cette thèse et bien plus. . . , tu connais le réacteur autant que moi. . . ! Promis
maintenant tout article récemment trouvé, hop direction endnote ! Je ne te remercierai jamais
assez pour tout ce que tu as fait pour moi ! Tu es le premier doctorant de neurobiologie aussi
calé en biofilm, tout simplement merci. . . à toi maintenant la dernière ligne droite.
Une petite pensée pour les compagnons à 6 pattes du 4R3. . .
 iv

Résumé

La recherche de relations entre la biodiversité et le fonctionnement de communautés au

sein d’écosystèmes est l’un des enjeux majeurs de l’écologie contemporaine de ces dix dernières
années. D’un point de vue environnemental, la biodiversité structurelle et/ou fonctionnelle,
véritable force motrice des écosystèmes, est à l’origine de leur fonctionnement, de leur sta-
bilité et de leur résilience. Les écosystèmes aquatiques, reconnus pour offrir un éventail de «
services écologiques » à la société, sont fortement exposés par l’utilisation massive de pes-
ticides, à l’origine d’une possible érosion de leur biodiversité. L’approche écotoxicologique
ne se limite pas à l’évaluation des risques de toxicité de pesticides sur les organismes, elle
s’élargit à la nécessité d’évaluer, à l’échelle de l’écosystème aquatique, les conséquences de
la perturbation sur les communautés et les descripteurs de bio-indication associés. Dans ce
contexte, les biofilms phototrophes d’écosystèmes aquatiques constituent un modèle d’étude
pertinent de par la complexité des structures de communautés microbiennes, leur dyna-
mique spatiale et temporelle, et la variété des fonctions hébergées. Une première expérience
a permis de mettre en évidence que des agrégats microbiens d’habitats différents (floc de
boues activés et biofilms phototrophes) présentent un potentiel comparable de biodégrada-
tion d’un herbicide, l’alachlore. Puis par une première approche écologique, la manipulation
de la structure de communautés microbiennes de biofilms phototrophes a été explorée en
conditions « naturelles » dans des rivières aux caractéristiques physico-chimiques différentes,
et en conditions « contrôlées » avec un prototype de bioréacteur photosynthétique à écoule-
ment hydrodynamique du type Taylor - Couette. Ces expériences soulignent que la structure
des communautés microbiennes résulte de processus de successions écologiques, gouvernés
par des facteurs allogènes et/ou autogènes en fonction de leur stade de maturation. Enfin par
une seconde approche écotoxicologique, les réponses structurelles et fonctionnelles de biofilms
phototrophes exposés à l’alachlore ont été évaluées. Ainsi, trois conditions expérimentales ont
été testées afin d’intégrer le stade de maturation (facteurs autogènes) et l’histoire (facteurs
allogènes) des biofilms phototrophes.
En considérant les biofilms phototrophes comme des agrégats dynamiques, ces travaux
nous ont permis d’appréhender l’approche écotoxicologique en intégrant le concept des succes-
sions écologiques au sein des communautés microbiennes. Les résultats désignent les biofilms
phototrophes comme des outils prometteurs en tant que bio-indicateurs de la qualité des
eaux lorsqu’ils sont caractérisés par une approche multi-métrique composée de descripteurs
fonctionnels et structurels.
Mots clés : biofilms phototrophes ; diatomées ; communautés bactériennes ; bioréacteur an-
nulaire rotating ; succession écologique ; approche écotoxicologique ; bioindication
 v

Abstract

The study of structure / function relationships in ecosystems is one of the current major
environmental challenges. In terms of ecology, the biodiversity and functioning of communities
drive ecosystem functioning, stability and resilience. The intensive use of pesticides causes
many disturbances in aquatic ecosystems, which are well known to offer a range of “ecological
services” for society. One of the consequences of this disturbance is the erosion of structural
and / or functional biodiversity.
In terms of ecotoxicology, environmental issue is not limited to the risk assessment of
a pollutant toxicity on organisms but it expands to the ability to assess, at the ecosystem
scale, the consequences of a disturbance and the use of bio-indicators. In this context, for
aquatic ecosystems, phototrophic biofilms provide a particularly relevant model, based on
their complex microbial community structures, spatial and temporal dynamics and variety
of functions.
In a first experiment our results suggested that microbial aggregates from different habi-
tats (activated sludge and phototrophic biofilm) are characterized by comparable potential
of an herbicide biodegradation : alachlor. Then using an ecological approach, a manipulation
of the structure of phototrophic biofilms microbial communities was explored in "natural"
conditions in rivers exhibiting different physicochemical characteristics, and in "controlled"
conditions with a photosynthetic bioreactor prototype (Taylor - Couette flow type). These
experiments suggested that the microbial community structures are driven by autogenic and
allogenic factors, depending upon maturation state. Finally using an ecotoxicological ap-
proach, structural and functional responses of phototrophic biofilms exposed to alachlor were
evaluated. Three experimental conditions were tested in order to integrate the maturation
stage (autogenic factors) and history (allogenic factors) of phototrophic biofilms.
Considering phototrophic biofilms as dynamic aggregates, this work allowed us to under-
take an ecotoxicological approach integrating the concepts of ecological succession in micro-
bial communities.
Our results demonstrate that phototrophic biofilms are promising tools as bio-indicators
of water quality when they are characterized by a multi-metric approach including functional
and structural descriptors.
Keywords : Phototrophic biofilms ; diatoms ; bacterial community ; rotating annular bio-
reactor ; ecological succession ; ecotoxicological approach ; bioindication
 Sommaire

Remerciements i

Résumé / Abstract iv

Introduction xx

I Synthèse bibliographique 1

I Modèle biologique d’étude : les biofilms phototrophes de milieux lotiques 2

II La problématique des pesticides dans l’environnement 24

III Etude de cas : l’alachlore 43

II Matériel et Méthodes 57

I Sites d’étude et stratégies d’échantillonnage 58

II Stratégies d’approche expérimentale 66

III Volet analytique 98

IV Analyses statistiques des données 117

III Etudes expérimentales 120

I Biodégradation d’un herbicide par des communautés bactériennes de bio-

films phototrophes : approche expérimentale en microcosme 121

II Comment appréhender les facteurs qui contrôlent les successions écolo-

giques des communautés microbiennes : cas des biofilms phototrophes 150

III Importance relative des facteurs allogènes et autogènes dans la réponse

de biofilms phototrophes à un herbicide – différentes approches expéri-
mentales en microcosmes 193
Conclusion générale et perpectives 284

Annexe 297

Bibliographie 301

Table des figures

Figure 1 Echelles d’observation de biofilms phototrophes naturels : à l’échelle

(A) du tronçon de rivière, (B) et (C) du substrat de type galet, (D) de
la loupe binoculaire (LEICA M212 avec une caméra LEICA DFC320),
(E) et (F) microscopique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Figure 2 Représentation en diagramme d’un biofilm phototrophe (ou périphy-
ton) selon Burns et Ryder (2001) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Figure 3 Exemple de différents aspects et apparences possibles des biofilms pho-
totrophes se développant sur des galets (biofilms épilithiques) (extrait
et modifié de Rols et Garabetian 2004) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Figure 4 Répartition type en micro-organismes présents au sein de biofilms épi-
lithiques (HDR, Garabétian 2006) (illustration du haut), exemple pour
des biofilms épilithiques de la Garonne (illustration du bas) (extrait
et modifié de cours M2R FEA UPS 2010) . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Figure 5 La zonation d’un hydrosystème fluvial (A, Garabetian 2009) et le
concept du continuum fluvial avec les conditions favorables pour le
développement de biofilm phototrophe (B, extrait de cours M2R FEA
UPS 2010) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Figure 6 Les différents facteurs influençant la croissance du biofilm phototrophe
(extrait de Burns et Ryders 2001) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Figure 7 L’influence de la vitesse du courant sur la structure tridimensionnelle
des biofilms phototrophes et leur résistance face à une perturbation
physique (extrait de Stevenson et al. 1996) . . . . . . . . . . . . . . . 12
Table des figures viii

Figure 8 Dynamique de la biomasse comme décrite par la chlorophylle a, la

MS (matière sèche) ou la MSSC (matière sèche sans cendre), selon le
modèle proposé par Biggs (1996) (A = extrait de Boulêtreau (2010) ;
Schéma conceptuel de l’évolution temporelle de la biomasse (B = ex-
trait de Sigee 2005 d’aprés Tuchman et al. 1996 ; Profil de l’évolution
temporelle de la biomasse microbienne le plus souvent observé en mi-
lieu naturel, avec présence de deux successions, primaire et secondaire
(C = extrait de Garabetian 2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Figure 9 Evolution temporelle du nombre d’espèces et de nouvelles espèces du-
rant les différentes phases de développement d’un biofilm phototrophe,
conceptualisée par Jackson et al. (2001) (extrait et amélioré de Jackson
et al. 2001) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Figure 10 Les différents mécanismes qui gouvernent la dispersion des pesticides

de la parcelle du sol vers les autres compartiments (extrait de Barriuso
et al. 1996) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Figure 11 Les différentes démarches et types de dispositifs possibles pour ap-
préhender les toxicités aiguës ou chroniques de polluants à différents
niveaux trophiques et différents niveaux de complexité et de réalisme
(extrait de Caquet et al. 1996) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Figure 12 La comparaison et la pertinence des différentes approches utilisables
lors des études écotoxicologiques (extrait de Laviale 2006) . . . . . . . 28
Figure 13 Schéma général d’exemples d’impact de plusieurs pesticides (carba-
ryl, lindane, chlorpyrifos, diazinon, des insecticides ; carbendazim, un
fongicide ; et acetochlor, metolachlor, glyphosate et 2,4-D, des herbi-
cides) sur les micro-organismes et les impacts possibles sur le reste de
la chaîne trophique durant des expérimentations en microcosmes (A,
extrait et modifié de Van den Brink et al. 2009 ; B, Van den Brink et
al. 2000 ; C, Mills et Semlitsch 2004 et D, Relyea 2009).R = Ressources 32
Figure 14 Les différents avantages à 3 échelles de représentation (espace, orga-
nisation et temps) d’utiliser les biofilms phototrophes comme modèles
d’études (extrait de Laviale 2006) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Figure 15 Différents descripteurs utilisables pour évaluer l’impact d’un polluant
sur les biofilms, en fonction de la sensibilité des descripteurs, et des
effets étudiés, à court ou long terme (extrait de Sabater et al. 2007) . . 36
Table des figures ix

Figure 16 Les différentes réponses possibles des communautés face à une pertur-
bation (extrait de Clements et Newman 2002) . . . . . . . . . . . . . . 38
Figure 17 Impacts potentiels d’un polluant sur le fonctionnement général d’un
écosystème (extrait de Boudou et Ribeyre 1997) . . . . . . . . . . . . 42

Figure 18 Formule chimique développée (A) et caractéristiques physico-chimiques

de l’alachlore (B). Kow représente le coefficient de partage octanol /
eau et Koc représente le potentiel de rétention de l’alachlore sur la
matière organique du sol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Figure 19 Corrélation entre les valeurs de log Kow et EC50 pour 8 chloroacéta-
nilides : 1, butachlore ; 2, prétilachlore ; 3, acétolachlore ; 4, alachlore ;
5, propachlore ; 6, métazachlore ; 7, diméthachlore, et 8, métolachlore
(extrait de Junghans et al. 2003) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Figure 20 Voies potentielles de dégradation de l’alachlore dans le sol (extrait de
Field et Thurman 1996) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Figure 21 Localisation géographique des 3 sites d’échantillonnage des biofilms

phototrophes (complété de Paule et al. 2009). Nomenclature des sta-
tions : M : Le Montoussé à Auradé, S : La Save à Larroque, G : La
Garonne à l’Aouach. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Figure 22 Photographies des trois sites d’échantillonnage M (Auradé, à gauche),
S (Larroque, au milieu) et G (Aouach, à droite) prises au printemps
(Photographie de droite de S. Teissier). . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Figure 23 Qualité des eaux en 2005 à différentes stations du bassin versant
Adour-Garonne, selon leurs concentrations en nitrates (mg.L−1 )(extrait
et modifié de Debenest 2007, source www.adourgaronne.fr). . . . . . . 61
Figure 24 (A) Concentrations en herbicides des eaux de surface non filtrées à dif-
férents points de prélèvement en amont et aval de l’agglomération de
Toulouse, en mars 2005 (extrait de Devault 2007). (B) valeurs cumu-
latives des plus fortes concentrations totales en herbicides à différents
points de prélèvement, en 2005 et 2006 (extrait et modifié de Debenest
2007). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Figure 25 Concentrations en pesticides d’échantillons d’eau non filtrée prélevés
au niveau de l’exutoire de bassin versant d’Auradé, au même empla-
cement que le site M mais à des dates différentes (extrait de Taghavi
et al. 2010) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Table des figures x

Figure 26 Dispositifs de production et de collecte de biofilms phototrophes in

situ : (A) avec les lames de verre disposées à raison de 4 par cagette
(1 lame = 1 réplicat) et (B) avec les plaques en polyéthylène disposées
à raison de 40 sur support métallique (1 plaque = 1 réplicat) . . . . . 65
Figure 27 Dispositifs de collecte de biofilms phototrophes in situ avec les plaques
en polyéthylène (A), avec les lames de verre (B), maintenues dans la
colonne d’eau ici du site M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Figure 28 Plan expérimental de l’étude réalisée in situ sur les sites M et S à

l’aide de lames de verre disposées en cagettes. M : Le Montoussé à
Auradé (A) et S : La Save à Larroque (L). . . . . . . . . . . . . . . . 67
Figure 29 Photographie du dispositif expérimental : incubation en bouteilles pla-
cées sur agitateurs magnétiques par lots de 6 et disposés dans une
enceinte thermostatée. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Figure 30 Schéma (A) et photographies (B) du dispositif expérimental d’incu-
bation de plaques de polyéthylène, préalablement colonisées en milieu
naturel (photographies d’A. Lamy) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Figure 31 Photographie du dispositif expérimental comprenant 5 microcosmes
dans une enceinte thermostatée (photographies d’A. Lamy). . . . . . . 73
Figure 32 Plan expérimental de chaque expérimentation en microcosmes (ex-
trait de Lamy 2010) : 5 modalités (ou conditions) expérimentales
différentes : Microcosme Biofilm NE (coupons colonisés en absence
d’alachlore), Microcosme Biofilm 10E (coupons colonisés exposés à 10
µg.L−1 d’alachlore), Microcosme Biofilm 30E (coupons colonisés expo-
sés à 30 µg.L−1 d’alachlore), Microcosme Sans biofilm 10E (coupons
vierges exposés à 10 µg.L−1 d’alachlore), Microcosme Sans biofilm 30E
(coupons vierges exposés à 30 µg.L−1 d’alachlore). . . . . . . . . . . . 74
Figure 33 Schéma simplifié d’un bioréacteur annulaire rotatif à écoulement de
type Taylor-Couette : R1 et R2 les rayons des cylindres internes et
externes, e l’entrefer, h la hauteur du bioréacteur, et Ω la vitesse de
rotation du cylindre interne (Extrait de Coufort 2004). . . . . . . . . . 75
Table des figures xi

Figure 34 Organisation du bioréacteur (Rotating Annular Bioreactor, RAB). (A)

représentation en 3D des différentes parties qui composent le bio-
réacteur avec a le cylindre externe, b le cylindre interne et c le cy-
lindre étanche qui contient les néons ; (B) photographie du bioréac-
teur ; (C) schéma détaillé du bioréacteur et (D) ses caractéristiques
géométriques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Figure 35 Photographies d’un support de colonisation, (gauche) en vue de face
(le trou correspond au lieu de passage de la vis de fixation qui se visse
sur le cylindre externe du RAB) et (droite) en vue dorsale (la face
arrière et les bords sont recouverts de bande adhésive) . . . . . . . . . 78
Figure 36 Photographie de l’emplacement des plaques de polyéthylène sur la face
interne du cylindre externe (A et B) et détail du système de fixation
des plaques (B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Figure 37 Le dispositif d’éclairage, capacité de 8 néons protégés par un cylindre
étanche en plexiglass (A et B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
Figure 38 Spectres lumineux et principales caractéristiques des néons « Fluora »
(spectre de gauche) et « Lumière du jour » (spectre de droite) utilisés
lors des cultures en RAB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Figure 39 Transitions des écoulements dans un réacteur à comportement hydro-
dynamique du type Taylor-Couette (D’après Andereck 1986, extrait
de Coufort 2004). T ac : Nombre de Taylor critique. . . . . . . . . . . . 82
Figure 40 Ecoulement de type vortex turbulent similaire à celui recherché au
niveau de l’entrefer du prototype RAB. Avec ω = vitesse de rotation
angulaire du cylindre interne (extrait de Ohmura et al. 1997). . . . . . 83
Figure 41 Schéma du dispositif expérimental de réalisation de la DTS (a), et
photographie du dispositif mis en place en sortie de bioréacteur pour
les mesures de conductivité (b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Figure 42 Photographie du canal expérimental du laboratoire . . . . . . . . . . . 89
Figure 43 Dispositifs annexes d’inoculation de la culture C1 (A) et de la culture
C2 (B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
Figure 44 Photographies de l’étape de collecte d’un coupon. Les coupons blancs
ou partiellement recouverts correspondent aux coupons remplacés suite
à un échantillonnage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Figure 45 Photographie de la cellule de mesure positionnée en sortie de bioréacteur. 92
Table des figures xii

Figure 46 Photographie du dispositif expérimental des tests écotoxicologiques

dans l’enceinte thermostatée. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Figure 47 Schéma du protocole expérimental des tests écotoxicologiques réalisés
dans des béchers (500 mL) avec des biofilms phototrophes cultivés
dans le RAB : utilisation de la biomasse sous forme biofilm fixé sur le
coupon, ou mise en suspension dans le milieu, en présence d’une lame
de verre vierge. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Figure 48 Photographies d’un mini-bioréacteur (A) et du dispositif expérimental
(B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

Figure 49 Schéma récapitulatif des analyses réalisées au cours de ces travaux de

thèse sur les différents types de supports de colonisation utilisés . . . . 104
Figure 50 Différentes approches moléculaires utilisées pour l’étude des commu-
nautés microbiennes (extrait de Dorigo et al. 2005) . . . . . . . . . . . 107
Figure 51 Présentation et comparaison du déroulement de deux méthodes de ty-
page moléculaire, la T-RFLP et la DGGE (d’après Okubo et Sugiyama
2009). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
Figure 52 Exemple de profils obtenus à partir de la T-RFLP (A) et de la DGGE
(B). En bleu un échantillon = un ensemble de pic = un profil = une
communauté, et en rouge le standard interne (TAMRA 500). En abs-
cisse = taille des pics, et en ordonnées = fluorescence des pics = des
T-RFs. Une bande = un OTU, une piste sur le gel correspond à une
communauté. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Figure 53 Détail du positionnement des 31 sources de carbone (A). Photogra-
phie (A. Lamy) d’une microplaque Ecoplate à l’issue de 96 h d’incu-
bation (B). Les puits colorés en violet illustrent une consommation de
la source de carbone présente dans le puits. . . . . . . . . . . . . . . . 116

Figure 54 Exemple d’une représentation graphique de ln(Ct/C0) en fonction du

temps du métolachlore pour MAS (microbiologically active soil) et SS
(sterilized soil). DT50 (en jour) correspond à la demi-vie du métola-
chlore calculée pour les deux traitements (extrait de Caracciolo et al.
2005). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
 Figure 55 Aires de chaque pic (un composé) correspondant à l’alachlore, l’ESA,
l’OA sur les spectres de masse des échantillons en début (T0) et fin
d’incubation (T final) pour les sites G, M et W et une concentration
initiale en alachlore de 20 µg.L−1 . Les seuils de détection sont de : 4
pg g−1 pour l’alachlore, 9 pg.g−1 pour ESA et 20 pg.g−1 pour OA . . . 127

Figure 56 Modèle de successions écologiques illustrées à travers l’évolution de

nombre d’OTUs observée durant l’établissement de différents types de
biofilms comparés au modèle proposé par Jackson (2003). Graphe du
haut : nombre total d’OTUs, Graphe du bas : nombre de nouveaux
OTUs (extrait de l’HDR, F. Garabetian 2006) . . . . . . . . . . . . . . 152
Figure 57 Evolution temporelle de l’épaisseur du biofilm phototrophe durant l’ex-
périence de la culture 1 (loupe binoculaire, LEICA M212, avec une
caméra LEICA DFC320, grossissement x 6) observée sur la tranche
d’un coupon de colonisation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

Figure 58 Moyenne des valeurs d’activités de la GST selon les différents traite-
ments expérimentaux pour l’expérience avec le biofilm collecté au site
M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Figure 59 Schéma simplifié des interactions complexes entre biodiversité et fonc-
tionnement d’un écosystème (extrait de Boulêtreau et al. 2010c) . . . . 284
Figure 60 Les concepts et leurs relations abordées dans le cadre de ce travail de
recherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296

Liste des tableaux

Tableau 1 Synthèse comparative de quelques travaux sur les dispositifs d’investi-

gation des biofilms phototrophes. LxlxP = Longueur x largeur x Pro-
fondeur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Tableau 2 Exemple d’un panel de mode d’action de différentes familles de pesticides 25

Tableau 3 Exemples d’études d’évaluation de l’impact de pesticides sur les éco-
systèmes aquatiques à différents niveaux de réalisme écologique . . . . 30

Tableau 4 Temps de demi-vie de l’alachlore dans différents environnements . . . 47

Liste des tableaux xiv

Tableau 5 Concentrations en alachlore des eaux de surface selon différentes loca-

lisations et périodes de détection. (nd = donnée non disponible) . . . . 52
Tableau 6 Toxicité de l’alachlore sur différents organismes basée sur des para-
mètres d’écotoxicologie (EC50 et dans certains cas LC50 ). (nd = donnée
non disponible) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Tableau 7 Principales caractéristiques des sites d’échantillonnage M, S et G (nr

c
= non répertorié, : source : http ://www.hydro.eaufrance.fr). . . . . . 59

Tableau 8 Valeurs d’intensité lumineuse en fonction du nombre de néons (pour

chaque cas, il y a autant de néons Fluora que de néons Luminux) . . . 80
Tableau 9 Tableau reliant les plages de vitesse de rotation du cylindre interne
aux types d’écoulement au niveau de l’entrefer du RAB (∗ : T ac = 43,3). 83
Tableau 10 Tableau reliant les vitesses tangentielles à la surface des coupons et à la
paroi externe du cylindre interne en fonction de la vitesse angulaire du
cylindre interne. Cette relation est basée sur des résultats de travaux
antérieurs qui soulignaient que la vitesse tangentielle entre le cylindre
interne et la surface des coupons est atténuée d’environ 50 % (Coufort
2004). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Tableau 11 Quelques exemples de concentrations en nutriments dosés dans l’eau
du réseau utilisée comme base du milieu d’alimentation du RAB. Avec
nm : non mesuré, nd : non détecté et COD : Carbone Organique Dissous. 87
Tableau 12 Comparaison des principales caractéristiques des deux types de bio-
réacteurs annulaires rotatifs utilisés dans le cadre de cette étude :
Mini-bioréacteurs d’Environment Canada et prototype RAB d’EcoLab. 96

Tableau 13 Récapitulatif de chaque expérience et des analyses réalisées . . . . . . 100

Tableau 14 Comparaison du comportement des chloroacétanilides en milieu aqua-

tique suivant les principales caractéristiques des conditions opératoires.nd
= donnée non disponible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Tableau 15 Comparaison des principales caractéristiques entre les RAB décrits

dans la littérature et le RAB expérimenté pour la première fois dans
le cadre de cette étude. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
Liste des tableaux xv

Tableau 16 Liste des molécules de pesticides recherchés et leurs principales ca-

ractéristiques physico-chimiques. Koc désigne le coefficient de partage
carbone organique / eau. Il donne indication sur l’aptitude de la molé-
cule à s’adsorber sur la matière organique. NR = Donnée Non répertoriée298
 xvi

Listes des abréviations et des symboles

LES ABREVIATIONS

ACP ou PCA Analyse en Composantes Principales ou Principal Component

Analysis
ADNg ou DNA Acide Désoxyribo Nucléique génomique ou Deoxyribose Nucleic
Acid
IA ou AI Indice Autotrophique ou Autotrophic Index
ANOSIM Analysis of similarities
ANOVA Analysis of variances
APHA American public health association
ARISA Automated ribosomal intergenic spacer analysis
AWCD Average Well Color Development
BSA Bovine Serum Albumin
BDI Biological Diatom Index
CAS Chemical Abstracts Service
CFD Computational Fluid Dynamics
CLLP Community Level Physiological Profil
CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy ou microscopie confocale à
balayage laser
DCE ou WFD Directive Cadre Européenne ou Water Framework Directive
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DIREN Direction régionale de l’environnement

dNTP Désoxynucléotide triphosphate

DTS ou RDT Distribution des Temps de Séjour ou Residence Time Distribution
EcoLab Laboratoire d’Ecologie Fonctionnelle et Environnement
EPS Extracellular Polymeric Substances
ESA Ethane Sulfonic Acid
ESI Electrospray Ionization
 xvii

FEA Fonctionnement des Ecosystèmes et Anthropisation

FISH Fluorescence In Situ Hybridization
GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry
GST Glutathione S-Transférase
HPLC High Performance Liquid Chromatography
LCABIE Laboratoire de Chimie Analytique, Bio-inorganique et
Environnement.
LDE Laboratoire Départemental de l'Eau
LISPB Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des
Procédés
MA Millennium ecosystem Assessment
MS-MS Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
NMDS Non-Metric Multimodal Scaling
OA Oxanilic Acid
DO ou OD Densité Optique ou Optical Density
OTU Operational Taxonomic Unity
PAR Photosynthetically Active Radiation
Pb Paire de base
PB Peak of biomass
PCR Polymerase Chain Reaction
PEHD 300 PolyEthylene à Haute Densité 300
PICT Pollution-Induced Community Tolerance
PMMA Poly(methyl methacrylate)
POCIS Polar Organic Chemical Integrative Samplers
PVC Poly-Vinyl-Chlorure
RAB Rotating Annular Bioreactor ou bioréacteur annulaire rotatif
RE Reticulum Endoplasmique
RSM Reynolds Stress Model
SPI Specific Pollution sensitivity Index
TAE Tris-Acétate-EDTA
 xviii

T-RF Terminal-Restriction Fragment

T-RFLP Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
UPGMA Unweighted Pair Group Method using Mean Arithmetic
UPS Université Paul Sabatier
US EPA United States Environmental Protection Agency
UV Ultra-violet

LES SYMBOLES

Ai Absorbance du puits à 590 nm

c(0) et c(t) Concentrations du traceur aux temps 0 et t (mg.L-1)
Chl a Chlorophylle a ou Chlorophyll a (µg.mm2, µg.cm2 et mg.cm2)
COD ou DOC Carbone Organique Dissous ou Dissolved Organic Carbon (mg.L-1)
D Taux de dilution (h-1)
DBO5 Demande Biologique en Oxygène à 5 jours (mg.L-1)
Dh Diamètre hydraulique (m)
DO Dissolved Oxygen (mg.L-1)
e Entrefer ou annular gap (mm)
EC50 half maximal Effective Concentration (µg.L-1 ou M)
ID Inside Diameter (mm)
Koc Coefficient de partage carbone organique/eau
Kow Coefficient de partage octanol/eau
LD50 half maximal Lethal Dose (µg.L-1 ou µM)
LQ ou DL Limite de Quantification ou Detection Limit (µg.L-1 et pg.g-1)
MS ou DM Matière sèche ou Dry Mass (mg L-1)
MSSC ou AFDM Matière sèche sans cendre ou Ash Free Dry Mass (g.m-2 et mg.cm-2)
MVS Matière Volatile en Suspension (mg.L-1)
OD Outside Diameter (mm)
Ω/ω Vitesse angulaire ou de rotation du cylindre interne (rad.s-1 ou
trs.min-1)
 xix

Pt ou TP Phosphore total ou Total Phosphorus (µg.L-1 et mg.L-1)

Q Débit d'alimentation (mL.min-1)
re Rayon interne du cylindre externe ou outer cylinder radius (m et mm)
ri Rayon externe du cylindre interne ou inner cylinder radius (m et
mm)
θ Temps de Séjour (h)
U Vitesse tangentielle du cylindre interne (m.s-1)
υ Viscosité cinématique du fluide (m².s-1)
V Volume opérationnel du réacteur ou working volume (L)

NOMBRES ADIMENSIONNELS

Ta Nombre de Taylor
Tac Nombre de Taylor critique
Re Nombre de Reynolds
 Introduction

Contexte scientifique
L’année 2010 fût décrétée par les nations unies comme « l’année de la biodiversité ». En
effet, les pouvoirs publics ont pris conscience ces dernières années d’une réduction drastique
de la biodiversité, c’est-à-dire la variété des formes écologiques, biologiques et génétiques du
vivant, quel que soit l’écosystème considéré (Millenium Ecosystems Assessment, MA 2005).
A l’origine de cette perte, essentiellement les activités d’origine anthropique. Parmi les sys-
tèmes aquatiques évalués par la « Water Frame Directive » (au nombre de 252), 46 % des
systèmes sont victimes de différentes formes de pollution chimique (eutrophisation, acidifica-
tion, pollution par les métaux, par la matière organique, et les composés organiques), 10 %
d’une dégradation hydro-morphologique, et 4 % de l’utilisation des sols et de la modification
des flux d’eau (Millenium Ecosystems Assessment MA 2005). L’importance fonctionnelle de
la biodiversité n’est plus discutable, 4 rôles lui sont attribués par le « Millenium Ecosystems
Assessment » : (i) un rôle de support qui considère la biodiversité comme le pilier d’un éco-
système (diversité structurelle et fonctionnelle), (ii) un rôle de régulateur par l’influence
que joue la biodiversité sur la productivité, la stabilité et la résilience des écosystèmes, (iii)
un rôle culturel touchant à l’ensemble des bénéfices non matériels, et (iv) un rôle de
ressource par la production directe ou indirecte de nourriture.
Ainsi les écosystèmes fournissent de l’alimentation, des matériaux et de l’énergie, ils contri-
buent également à de nombreux processus biogéochimiques. Depuis quelques années, il y a
une reconnaissance croissante pour les écosystèmes qui offrent à la société un large éventail
de « services écologiques », découlant de leur fonctionnement normal (caractéristiques chi-
miques de l’atmosphère, productions végétale et animale, qualité et quantité de la ressource
en eau. . . ), et importants pour le bien-être humain et le développement durable (Millenium
Ecosystems assessment MA 2005). Dans ce contexte, un des enjeux environnemental majeur
est de se demander si un écosystème appauvri par rapport à son état initial à la suite de
pressions anthropiques, est susceptible de devenir moins efficace dans sa capacité à délivrer
des « services écologiques » à la société. Ainsi les débats scientifiques sur la relation biodiver-
sité – fonction ont pris place dans un contexte de biologie de la conversation. La protection
des fonctions réalisées par les écosystèmes est devenue un argument de poids pour justifier
la conservation des espéces, en assumant qu’une perte de la biodiversité suite à la présence
d’un polluant pourrait être à l’origine de la perturbation du fonctionnement global d’un
écosystème.
 xxi

Avec l’apparition de nouvelles techniques plus sophistiquées, en microscopie notamment,

l’appréciation de la diversité est de plus en plus précise. Malgré tout, Loreau (2010) cite
une phrase de Lawton (1999) sur l’état d’art des recherches en écologie des communautés,
que l’auteur considère encore comme d’actualité « Where there are a large number of cas
histories, and very little other than weak, fuzzy generalisations ». Il y a beaucoup d’étude à
ce sujet, mais il est difficile d’en tirer une généralité.
Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés à un exemple de perturbation
possible à l’origine du dysfonctionnement des écosystèmes aquatiques, la présence de pesti-
cides. Comme défini par la Directive Cadre Européenne, « L’eau n’est pas un bien marchand
comme les autres, mais un patrimoine qu’il faut protéger, défendre et traiter comme tel »,
en effet la qualité de l’eau peut devenir un problème en cas de pénurie. Dans ce contexte,
les milieux aquatiques, par leur volet politico-sociétal (santé humaine notamment) et leur
volet « écosystème récepteur » particulièrement exposé aux perturbations humaines (Barcelo
et Sabater 2010), présentent un intérêt d’étude particulier. En Europe, de nombreux cours
d’eau contiennent des concentrations en pesticides supérieures au seuil de potabilisation fixé
à 0,1 µg.L−1 par pesticide (Vryzas et al. 2009). C’est dans ce contexte que l’écotoxicologie,
définie comme l’étude des effets des polluants sur l’abondance, la diversité et la composition
des communautés ainsi que les interactions entre espèces (Clements et Rohr 2009), a vu le
jour pour tenter d’évaluer l’impact des polluants sur les organismes aquatiques. L’accroisse-
ment préoccupant des concentrations de divers pesticides dans les eaux laisse présager des
effets directs non létaux sur les organismes non-cibles et des effets indirects et différés sur les
réseaux trophiques, et ainsi une réduction possible de la biodiversité de ces milieux.
La Directive Cadre Européenne dans le domaine de l’eau (DCE 2000) a pour objectif
d’obtenir d’ici 2015 un état satisfaisant des eaux continentales. Ce « bon état » des eaux
concerne « l’état écologique et chimique ». L’état écologique se réfère à la structure et au
fonctionnement des écosystèmes aquatiques, et l’état chimique à des niveaux de concentration
établis sur des critères écotoxicologiques. L’impact des pesticides sur les communautés aqua-
tiques a largement été étudié ces quinze dernières années, selon une approche toxicologique et
à différents niveaux d’organisation biologique : individus, populations, communautés ou éco-
systèmes. A l’échelle de l’écosystème, de multiples effets prévisibles ont été observés (Kasai et
Hanazato 1995) : diminution de la diversité et augmentation de la dominance de certaines es-
pèces, altération de processus écologiques (par exemple dégradation de la matière organique),
etc... Les niveaux de pollution des cours d’eau sont délicats à apprécier pour des raisons de
capacités analytiques, de manque de connaissance du comportement des molécules, et de leur
biodisponibilité. Afin de définir le statut écologique des cours d’eau, des indices biologiques
 xxii

ont été développés à différents niveaux d’organisation biologique, les macrophytes, les di-
atomées des biofilms phototrophes, les invertébrés, les poissons (Geiszinger et al. 2009). Ces
indices, souvent basés sur la composition, sont généralement peu pertinents pour les polluants
du type pesticides, notamment parce que certains d’entre eux sont susceptibles d’affecter à la
fois la dimension fonctionnelle et taxonomique de ces différentes communautés. De plus ces
indices ne prennent pas en compte les phénomènes d’adaptation. Le deuxième enjeu majeur
environnemental ciblé dans le cadre de ce travail est donc la nécessité de développer des outils
méthodologiques pour évaluer le niveau de contamination, la sensibilité et la vulnérabilité
des écosystèmes aquatiques.
Jean Paul Sartre (1949) décrit le « blé mur comme un microcosme parce qu’il a fallu, pour
qu’il lève, le concours du soleil, des pluies et du vent ; un épi, c’est à la fois la chose la plus
naturelle et la chance le plus improbable ». Cette image s’adapte aux biofilms phototrophes
de rivière, communautés microbiennes composées de micro/meio-organismes hétérotrophes
et de micro-organismes photo-autotrophes enchâssés dans une matrice d’exopolymères. Leur
structure est contrôlée par une multitude de facteurs allogènes ou autogènes dont la prédo-
minance varie en fonction de l’âge de maturation de l’agrégat (Lyautey 2005). Ce qui rend
délicat l’évaluation des effets des pesticides sur les communautés, difficiles à distinguer des
autres effets engendrés par les autres facteurs environnementaux.
Les biofilms phototrophes sont des agrégats fonctionnels clefs des écosystèmes aquatiques.
Ils se situent à la base de la chaine trophique, par leur rang de producteur primaire, ils sont
ubiquistes, et leur vitesse de croissance leur confère une intégration rapide des changements
environnementaux, à l’origine du qualificatif de « early warning pollution indicators » (Sa-
bater et al. 2007). Les biofilms phototrophes se composent d’une vaste biodiversité et de
processus biologiques et physico-chimiques générant une multitude de fonctions intimement
liée au fonctionnement des écosystèmes aquatiques (production primaire, contribution aux
cycles biogéochimiques) dont certaines qualifiées de « services écologiques » (adsorption des
pesticides et des métaux, biodégradation des polluants organiques, dénitrification, etc. . . ).
Cette biodiversité structurelle et fonctionnelle est susceptible de varier sensiblement et diffé-
remment suite à des perturbations d’origine anthropique (Barranguet et al. 2004 ; McClellan
et al. 2008) aboutissant à un panel d’effets indirects ou directs possibles, de natures différentes
(fonctionnelle et structurelle).
Dans un contexte visant à l’identification de la relation biodiversité /structure des commu-
nautés et fonctionnement global des écosystèmes, les communautés microbiennes des biofilms
phototrophes constituent des modèles d’étude intéressants.
 xxiii

Il est important de considérer les biofilms phototrophes comme des agrégats dynamiques
dont la maturation se traduit par un épaississement (Biggs et Stokseth 1996) associé à des
successions de populations algales (Stevenson et al. 1996) et bactériennes (Lyautey 2005)
aboutissant à des trajectoires bien précises. Avec l’épaississement du biofilm, des micro-
gradients (pH, oxygène, nitrate, etc...) se forment et sont à l’origine de la diversification
des niches écologiques engendrant ainsi de nouvelles fonctions. Pour la plupart des études
écotoxicologiques appliquées aux biofilms phototrophes, la maturation est rarement considé-
rée (Guash et al. 1997 ; Duang et al. 2010) et la distinction se fait plus généralement à une
échelle saisonnière.

Les objectifs et l’organisation de l’étude

Dans ce contexte scientifique, cette étude vise à améliorer les connaissances dans les do-
maines de l’écologie (concept de successions écologiques et de relation structure / diversité
et fonctionnement) et de l’écotoxicologie (effet d’un herbicide, bio-indication) et de combiner
ces deux domaines afin de mieux appréhender les conséquences d’une perturbation d’origine
anthropique (présence d’un herbicide) sur la structure/biodiversité d’un compartiment fonc-
tionnel clef (biofilm phototrophe) des écosystèmes aquatiques. Deux grands objectifs sont
proposés :
i) Approfondir nos connaissances en ce qui concerne les effets potentiels d’un herbicide
sur les communautés de biofilms phototrophes dans une dimension structurelle et fonc-
tionnelle, dans une optique de les utiliser comme bio-indicateurs de pollution des cours
d’eau,
ii) Intégrer davantage d’écologie dans l’écotoxicologie, en prenant en compte dans la ré-
ponse des biofilms à une exposition à un herbicide, l’évolution des communautés liée
aux successions écologiques, et donc au degré de maturation du biofilm.
Pour aborder l’ensemble de ces points, ce manuscrit se structure en 3 parties :

La première partie concerne une synthèse bibliographique sur un état des lieux de la
pollution des écosystèmes aquatiques par les pesticides, ainsi que la présentation des modèles
chimiques (alachlore, herbicide de la famille des chloroacétanilides) et biologiques (biofilm
phototrophe de rivière) utilisés dans le cadre de ce travail et la justification du choix de ces
deux modèles.
La deuxième partie présente le volet expérimental de l’étude et les sites naturels. Cette
partie vise à justifier le choix des différentes stratégies expérimentales utilisées dans ce travail,
 xxiv

l’ensemble de la méthodologie biologique et chimique, et les types d’approches (fonctionnelle

et structurelle) utilisées pour évaluer les effets écotoxicologiques et appréhender les succes-
sions écologiques.
La troisième partie expose en trois chapitres les résultats obtenus, chaque chapitre faisant
l’objet de publications parues ou à paraître.

Chapitre 1, une relation structure - fonction : un exemple de « service écolo-

gique »
Trois suspensions de communautés microbiennes issues d’habitats différents, deux communau-
tés de biofilms phototrophes, et une communauté de flocs de boues activées, ont été exposées à
l’alachlore en microcosmes. Ces deux types de communautés (biofilms phototrophes et boues
activées) sont bien connues dans la littérature pour participer à la dissipation des pesticides
via des phénomènes de biodégradation ou d’adsorption (Lawrence et al. 2001 ; Stasinakis et
al. 2009) au sein des écosystèmes aquatiques. Par leur exposition à l’alachlore réalisée en
microcosmes, nous souhaitons vérifier si (i) le processus de biodégradation prédit la chimio-
dynamique environnementale de l’alachlore en milieu aquatique et si (ii) la β-diversité des
communautés microbiennes naturelles d’habitats différents peut expliquer les différences de
potentiel de biodégradation de l’alachlore.

Chapitre 2, une approche écologique : le concept de successions écologiques

Le reste de l’étude s’est focalisée sur les communautés de biofilms phototrophes, car comme
développé plus haut, leur nature en tant que producteurs primaires, compartiment fonction-
nel clef, et leur variété structurelle et fonctionnelle, font de ce type de communautés un outil
particulièrement intéressant dans l’étude des relations structure - fonction, thématique en
plein essor des enjeux de l’écologie contemporaine. La structure des biofilms phototrophes
à l’origine de leur panel de fonctions est contrôlée par deux types de facteurs, les facteurs
allogènes, associés aux facteurs externes environnementaux (lumière, température, etc. . . )
et les facteurs autogènes, liés à la maturation du biofilm, qui s’épaissit pour créer des mi-
croenvironnements et s’orienter vers un déterminisme autogène. Ainsi, pour appréhender la
relation structure - fonction au sein de ces communautés, il est indispensable de comprendre
les mécanismes par lesquels les facteurs allogènes et autogènes contrôlent le développement
et la trajectoire de successions écologiques des biofilms. A travers une étude in situ, intégrant
une étape de transplantation, l’importance relative des facteurs autogènes versus les facteurs
environnementaux sur la structuration des communautés est analysée. Le phénomène de
 xxv

transplantation nous a permis de vérifier s’il était possible de modifier la structure des com-
munautés microbiennes et leurs dynamiques temporelles. La deuxième partie de ce chapitre
a été réalisée à l’aide d’un prototype de bioréacteur annulaire rotatif, présenté et utilisé pour
la première fois dans le cadre de ce travail, sous des conditions environnementales mainte-
nues stables afin d’évaluer la part du déterminisme autogène sur la structuration des biofilms.

Chapitre 3, de l’écologie à l’écotoxicologie. . .

Dans ce chapitre, nous avons souhaité associer aux études écotoxicologiques classiques,
nos connaissances sur les successions écologiques qui apparaissent lors de la structuration du
biofilm, afin ne pas assimiler le biofilm à un agrégat statique dépourvu de dynamique intrin-
sèque mais de le considérer comme un agrégat présentant une structure que l’on peut qualifier
d’image transitoire d’une dynamique temporelle prise à un moment donné en tenant compte
de trois paramètres : 1) son stade de maturation, 2) son état structurel et 3) son histoire.
Chaque paramètre testé fait l’objet d’expériences en microcosmes associées à des stratégies
expérimentales bien particulières et des approches analytiques multimétriques afin d’intégrer
des niveaux d’organisation biologique différents et des aspects fonctionnels et structurels.
Dans un contexte écologique actuel de perte drastique de la biodiversité, ce travail se
propose de contribuer à l’amélioration des connaissances des concepts de successions écolo-
giques en les appliquant à l’écotoxicologie, et tenter de rapprocher l’écologie des communautés
avec les fonctionnalités des écosystèmes, visant à évaluer les conséquences potentielles sur le
fonctionnement global des écosystèmes.
 xxvi

©/¶DYHQLUQHVHUDSDVFHTXLYDDUULYHUPDLVFHTXHQRXVDOORQVIDLUHª
+HQUL%HUJVRQ 
 Partie I

Synthèse bibliographique
 Chapitre I

Modèle biologique d’étude : les biofilms

phototrophes de milieux lotiques

I.1 Présentation
Dans un écosystème aquatique lotique, certains tronçons développent des conditions hy-
drodynamiques qui ne sont pas propices au développement de la biomasse microbienne sous
forme planctonique : les flux de masse d’eau sont tels que le phytoplancton est continuelle-
ment « lessivé » vers l’aval (Reynolds et al. 1994). Ces tronçons se caractérisent alors par des
biomasses microbiennes agrégées et fixées sur des supports de natures organiques (macro-
phytes. . . ) ou minérale (sédiments, roches et galets. . . ), créant une interface entre le substrat
et la colonne d’eau (Costerton et al. 1995 ; Nikolaev et Plakunov 2007). Cette fraction mi-
crobienne fixée peut représenter jusqu’à 90 % de la biomasse microbienne totale contenue
dans ce tronçon (Pyl’nik et al. 2007). Par exemple, Lock et al. (1984) a mesuré une biomasse
bactérienne dans un ruisseau de l’ordre de 6x106 à 2x108 cellules fixées cm−2 sur les substrats
contre seulement 2,4x105 à 1,6x106 cellules planctoniques mL−1 dans la colonne d’eau.
Ces assemblages microbiens (Figure 1) sont composés de divers micro et méso-organismes
procaryotes et eucaryotes, autotrophes et hétérotrophes, enchevêtrés dans une matrice d’exo-
polymères (Wetzel 1993), et contiennent de façon transitoire des macro-organismes (oligo-
chètes, larves d’insectes aquatiques) (Figures 2 et 4). Ces communautés fixées sont tradi-
tionnellement désignées sous le terme de « périphyton », après avoir longtemps été nommées
en Europe sous le terme de « Aufwuchs » qui signifie en allemand « se développer ». Le terme
« périphyton » est souvent employé par les auteurs pour ne se référer le plus souvent qu’au
compartiment algal de l’assemblage microbien ne considérant ainsi que son rôle de producteur
primaire (par exemple : Stevenson et al. 1996). Par la suite, à partir des travaux de Lock et
al. (1984), le « périphyton » est étudié et considéré dans toute sa dimension microbiologique
(e.g. Romani et Sabater 2000 ; Battin et al. 2003a ; Olapade et Leff 2005).
Le concept générique de « biofilm » a été introduit et proposé par Costerson et al. en 1987,
qu’il qualifie alors « de simples cellules ou de micro-colonies de cellules sœurs toutes enchâssées
dans une matrice hautement hydratée principalement anionique d’exopolymères bactériens
 I.1. Présentation 3

Figure 1 – Echelles d’observation de biofilms phototrophes naturels : à l’échelle (A) du tronçon de

rivière, (B) et (C) du substrat de type galet, (D) de la loupe binoculaire (LEICA M212 avec une
caméra LEICA DFC320), (E) et (F) microscopique

Figure 2 – Représentation en diagramme d’un biofilm phototrophe (ou périphyton) selon Burns et
Ryder (2001)
I.1. Présentation 4

et piégées dans des macro-molécules externes ». Il faut reconnaître que ces communautés,
composées d’une à plusieurs espèces, sont souvent associées à des enjeux sociétaux, car elles
sont retrouvées dans différents environnements (lacs, rivières, réseaux de distribution d’eau
potable, échangeurs thermiques. . . ), et sur une multitude de supports (macrophytes, galets,
dents, canalisations, coques de bateau. . . ). Wimpenny et al. (2000) qualifient les biofilms de
« ville microbes » ou de « vie en société » (Fletcher et Marshall 1982). Comme souligné
par Boulêtreau (2007), « la complexité structurelle et fonctionnelle de l’agrégat est associée
à l’idée de biofilm ». Ainsi pour la suite de l’étude, le terme de « périphyton » si souvent
employé dans la littérature sera remplacé par le terme « biofilm phototrophe ».
Les biofilms phototrophes qui se développent aux interfaces substrat / colonne d’eau au
sein des écosystèmes aquatiques sont un type particulier de biofilms observés quand certaines
conditions sont réunies, dépendant de la couche limite (Rasmussen et Lewandowski 1998),
la lumière, la vitesse de courant, la hauteur d’eau, les nutriments, et la présence de support
de colonisation. Ces biofilms sont constitués d’une forte composante de micro-organismes
photo-autotrophes qui leur confère une coloration variant du vert au brun et associée à
une variété d’aspects d’un feutrage plus ou moins filamenteux (Figure 3). Ces agrégats
peuvent donc prendre différentes apparences selon la composition des espèces, la lumière et
l’hydrodynamique (Wetzel 1983). En effet, une communauté d’organismes photo-autotrophes
peut représenter jusqu’à 30 % de la masse en carbone de biofilms phototrophes (biofilms
épilithiques, Lyautey 2005). De plus, dans les eaux « claires », la production microbienne
totale peut résulter d’une contribution des biofilms phototrophes jusqu’à 77 % supérieure à
celle du phytoplancton (Liboriussen et Jeppesen 2003).
Les termes « biofilm phototrophe » ou « périphyton » désignent « des communautés
attachées » sans qualifier le type de support sur lequel se fixe l’assemblage. Un terme plus
spécifique est attribué à chaque type de substrat (Aloi 1990 ; Townsend et Gell 2005) :
galet et aux autres surfaces minérales : épilithon ou biofilm épilithique, sédiment : épipelon,
macrophyte : épiphyton ou biofilm épiphytique, bois : épixylon et sable : épipsammon.
Ce mode de vie sessile est reconnu pour être majoritaire dans les milieux naturels (Watnick
et Kolter 2000) et peut être considéré comme une stratégie de développement. Les biofilms
sont des communautés où les micro-organismes interagissent entre eux (Davey et O’Toole
2000), et à l’intérieur desquels « les propriétés des communautés sont plus importantes et
plus variées que la somme des propriétés de chacun des micro-organismes » (Sutherland
2001). En effet, les biofilms phototrophes sont à considérer comme un système complexe
et non seulement comme la somme des espèces présentes, parce que les micro-organismes
I.1. Présentation 5

Figure 3 – Exemple de différents aspects et apparences possibles des biofilms phototrophes se

développant sur des galets (biofilms épilithiques) (extrait et modifié de Rols et Garabetian 2004)

interagissent et se développent de manière inter-dépendante (Barranguet et al. 2004). Quel

que soit l’environnement, ce mode de vie apporte de nombreux avantages :
– Protection contre les changements environnementaux et toutes autres perturbations ;
– Possibilité de réaliser du « Quorum sensing », qui correspond à des mécanismes de
synchronisation de l’expression (ou de la répression) de gènes particuliers. Un signal
moléculaire appelé auto-inducteur est libéré dans l’environnement de la cellule, suite à
ce signal l’expression de certains gènes est induite (Redfield 2002) ;
– Grande efficacité pour capter les nutriments, dégrader certains composés (Jefferson
2004 ; Lawrence et al. 2001) ;
– Nombreuses interactions : protection, mutualisme, compétition (MacLeaod et al. 1990 ;
Paerl et Pinckney 1996) ;
– Stabilisation de la communauté (Jefferson 2004) ;
– Présence d’un grand nombre de gradients, pour l’oxygène, le pH. . . permettant ainsi
une diversité importante des micro-habitats physiques, donc des niches écologiques ;
– Agencement vertical favorisant les échanges horifontaux du matériel génétique (Ghigo
2001) ;
– La présence des exopolymères (EPS pour « extracellular polymeric substances » en
anglais) constituant la matrice organique du biofilm. Les EPS, qui sont composés de
polysaccharides et de protéines, et dans la plupart des cas d’acides nucléiques, de li-
pides et autres biopolymères (Flemming et Wingender 2001), confèrent de nombreux
avantages aux biofilms, quelle que soit leur nature (Vu et al. 2009). Les EPS améliorent
l’attachement des micro-organismes sur les supports (Costerton et al. 1987), présentent
un rôle de barrière de diffusion (Freeman et Lock 1995), et favorisent l’atténuation des
stress environnementaux (Flemming 1995 ; Davies 2000). Ils sont le siège de liaisons
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 6

possibles de colloïdes, de composés inorganiques et organiques (Wolfaardt et al. 1995 ;

Romani et al. 2004), particulaires ou dissous, de leur bioaccumulation (Wang et al. 2002)
pouvant mener à leur métabolisation progressive par des enzymes extracellulaires, et
une protection contre les organismes brouteurs (Lawrence et al. 2002 ; Barranguet et
al. 2005). Les EPS contiennent une grande quantité d’enzymes extracellulaires. Pour
des biofilms jeunes, les enzymes des EPS représentent 65 à 81 % de l’activité totale
des enzymes du biofilm contre 13 à 37 % pour des biofilms plus matures (Romani et
al. 2008). En réalité, cette capacité à créer des liaisons est un moyen de se protéger
de la présence de polluant, comme la présence de métaux lourds (Kucera et al. 2008).
Cette matrice agit également sur la structuration, l’architecture (Battin et al. 2003b)
et apporte une certaine stabilité à l’agrégat (Flemming et al. 2000).
Au sein des biofilms phototrophes, il existe d’étroites interactions entre les algues et les
bactéries (Rier et Stevenson 2002 ; Gao et al. 2005 ; Romani et al. 2004 ; Carr et al. 2005).
Ces interactions peuvent être de différentes natures, compétition, synergie, prédation, etc. . . .
Les organismes autotrophes peuvent utiliser les nutriments provenant de la matière orga-
nique dégradée par les hétérotrophes. Ces derniers peuvent utiliser les exsudats des algues
mortes ou de la lyse cellulaire (Romani et Sabater 2000). Il y a une inter-dépendance entre
hétérotrophie et autotrophie. Le long d’un écosystème aquatique lotique, il y a des modifi-
cations des conditions amont-aval avec des différences d’un point de vue nutriments, type de
substrats, apports de pollutions anthropiques. . . à l’origine d’une mosaïque d’habitats avec
des gradients verticaux (Stanford et Ward 1988) ou horizontaux (Junk et al. 1989). D’après
le concept de continuum fluvial proposé par Vannote et al. (1980), les conditions favorables
pour le développement des biofilms phototrophes en milieu lotique sont rencontrées dans
les cours d’eau de tailles intermédiaires (de l’ordre de 3 à 7 selon le classement de Strahler
(1957)) (Figure 5).

I.2 Le développement d’une entité structurelle et fonc-

tionnelle dynamique

I.2.1 Les facteurs influant le développement des biofilms photo-

trophes
Les biofilms phototrophes sont influencés par deux grands groupes d’effets, les effets dits
primaires et secondaires (Fechner 2010). Les effets primaires sont observés à courts termes,
parmi ces effets nous pouvons citer la présence de ressources qui peuvent engendrer des mo-
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 7

Figure 4 – Répartition type en micro-organismes présents au sein de biofilms épilithiques (HDR,

Garabétian 2006) (illustration du haut), exemple pour des biofilms épilithiques de la Garonne (illus-
tration du bas) (extrait et modifié de cours M2R FEA UPS 2010)
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 8

Figure 5 – La zonation d’un hydrosystème fluvial (A, Garabetian 2009) et le concept du continuum
fluvial avec les conditions favorables pour le développement de biofilm phototrophe (B, extrait de
cours M2R FEA UPS 2010)

difications au niveau de la croissance, des activités enzymatiques, ou même de l’intégrité

physique de cellules (Stevenson et al. 1996). Les effets secondaires sont observés à une plus
grande échelle des écosystèmes lotiques, parmi ces facteurs nous pouvons citer l’hydrologie,
l’occupation des sols (Biggs et Thomsen 1995 ; Biggs 2000). Au sein des effets primaires,
il existe deux familles de facteurs qui influencent la structuration et le fonctionnement des
biofilms phototrophes, les facteurs abiotiques et biotiques. Les facteurs abiotiques regroupent
les conditions environnementales, la lumière, le pH, la température, le type de substrats, les
conditions hydrodynamiques, etc. Les facteurs biotiques regroupent les interactions intrin-
sèques au biofilm, comme la prédation, la compétition, l’allélopathie, etc. L’ensemble des
effets et des facteurs est représenté par Burns et Ryder (2001) (Figure 6). Suivant leurs
natures et s’ils peuvent être sources ou non de perturbations, ils peuvent engendrer soit une
phase d’accrétion en favorisant la croissance (lumière, nutriments), soit une perte de biomasse
(broutage, épisode de crue). L’ensemble de ces facteurs modifie la balance et l’équilibre entre
les microorganismes autotrophes et hétérotrophes (Lock et al. 1984). Réaliser une description
exhaustive de l’ensemble des facteurs qui participent au contrôle de la structure et du fonc-
tionnement des biofilms phototrophes serait longue et inutile ici. Par la suite, nous détaillerons
uniquement les quelques facteurs pris en considération durant les approches expérimentales
en laboratoire.
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 9

Figure 6 – Les différents facteurs influençant la croissance du biofilm phototrophe (extrait de Burns
et Ryders 2001)
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 10

I.2.1.1 La lumière

Un des facteurs les plus importants, elle constitue une ressource indispensable qui per-
met la présence du compartiment phototrophe au sein du biofilm. Bothwell en 1993 qualifie
même ce paramètre de « critical factor » des études en microcosme qui traitent des biofilms
phototrophes et Janssen et al. (2003) l’ont désigné comme jouant un rôle clef au sein des
photo-bioréacteurs. La quantité et la qualité de la lumière contrôlent la composition et les
proportions des communautés algales (Mosisch et al. 2001 ; Roberts et al. 2004). Les diato-
mées prédominent dans les ruisseaux ombragés alors que les algues vertes vont prédominer
dans les ruisseaux plus ouverts (Guasch et al. 1995 ; Sekar et al. 2002). Les effets de la lumière
sont souvent associés à des formes de croissance différentes (Steinman et al. 1992). Ces para-
mètres sont influencés par la profondeur d’immersion des supports de colonisation (hauteur
de la colonne d’eau), la turbidité, le couvert végétal, etc (Ricart et al. 2009). La relation entre
l’intensité lumineuse et la photosynthèse ne suit pas une relation linéaire, elle se caractérise
par une augmentation, une saturation puis une inhibition, bien que la saturation semble être
un mécanisme relativement rare (Hillebrand 2005).
Une corrélation positive entre la photosynthèse et l’intensité lumineuse a été enregistrée
pour des gammes d’intensité lumineuse comprises entre 100 et 400 µmol.m−2 .s−1 (Boston et
Hill 1991) et pour des valeurs > 500 µmol.m−2 .s−1 , un effet inhibiteur était observé (Guasch
et al. 1995). Une intensité lumineuse faible génère souvent une quantité de biomasse plus
faible (Guasch et al. 1995 ; Sultana et al. 2004 ; Zippel et al. 2007), associée également à un
taux de croissance plus lent (Zippel et Neu 2005). Hill et al. (1995) obtiennent une quantité de
biomasse 1,3 fois supérieure sur un site plus éclairé. La lumière est un facteur important dans
le sens où elle agit directement sur les mécanismes de la photosynthèse (transformation de
l’énergie lumineuse en source de carbone organique), conditionne le caractère de producteur
primaire des biofilms phototrophes et ainsi confère des impacts sur l’ensemble du réseau
trophique (Dodds et al. 1996 ; Hill et al. 1995) aussi bien qu’au niveau des mécanismes de
rétention du phosphore (Steinman et al. 1995) et du carbone organique dissous (Romani et
al. 2004). De même, des études ont pu montrer que la lumière pouvait influencer la réponse
du biofilm phototrophe à une contamination par des pesticides (Guasch et Sabater 1998).
L’intensité lumineuse est susceptible d’affecter indirectement la structure des communautés
bactériennes (Lyautey 2005 ; Rier et al. 2006) et les relations entre les compartiments algal
et bactérien (Ylla et al. 2009). De même, Roeselers et al. (2007) ont suggéré que l’influence
de la l’intensité lumineuse était plus importante durant la phase initiale du développement
du biofilm. Ils observent en produisant du biofilm phototrophe dans un canal que (i) sous
de fortes conditions lumineuses, les espèces colonisatrices sont majoritairement des algues
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 11

vertes (affiliées au genre Scenedesmus) et que (ii) sous de faibles conditions lumineuses, les
espèces colonisatrices sont majoritairement des bactéries hétérotrophes (affiliées à la classe
des Betaproteobacteria) ce qui augmente la durée de la phase initiale de colonisation. Ainsi, la
durée de la phase initiale de colonisation augmente avec la diminution de l’intensité lumineuse
(Zippel et Neu 2005).

I.2.1.2 Les teneurs en nutriments

Tout comme l’intensité lumineuse, une relation positive entre les nutriments et la biomasse
est souvent observée (Dodds et al. 2002). De nombreuses études décrivent une augmentation
des niveaux de biomasse (MS ou chlorophylle a) et de la productivité des biofilms avec une
augmentation des teneurs en N et P (Biggs et Close 1989 ; Dodds et al. 1997). D’ailleurs
il a été mis en place un classement des milieux lotiques et lentiques suivant leurs niveaux
de concentration en P, basé sur les seuils de concentration des biofilms phototrophes en
chlorophylle a (mésotrophe, eutrophe et oligotrophe, Dodds (2003)). Il apparait que la taille
des cellules d’algues change en relation avec le niveau trophique. Dans un environnement
riche en nutriments, la proportion d’algues qui présentent de grandes tailles cellulaires est
plus importante, avec une relation positive entre la taille moyenne des cellules algales et les
teneurs en phosphore total (Fechner 2010). Le ratio des nutriments influence la composition
des communautés algales (Hillebrand et Sommer 2000a). Un enrichissement en nutriment
est susceptible de diminuer la richesse de nombre de taxa algaux en favorisant la dominance
d’une seule espèce (Hillebrand et Sommer 2000b).
L’assimilation des nutriments par les micro-organismes du biofilm est fortement liée à
la couche limite (en anglais, « diffuse boundary layer »), c’est l’interface entre le biofilm et
l’eau avoisinante du biofilm (Rasmussen et Lewandowski 1998). Cette même couche limite
est d’autant plus fine que la vitesse de cisaillement au contact du biofilm est forte, résultant
de vitesses de courant élevées sur un radier plat.

I.2.1.3 Les conditions hydrodynamiques

L’hydrodynamique a une grande influence sur la biomasse, elle peut entraîner des modi-
fications physiques (Biggs et Close 1989), voire même des détachements partiels ou complets
de la biomasse. Ces processus sont parfois à l’origine d’une réinitialisation du cycle de la
biomasse (Biggs 1996 ; Boulêtreau et al. 2006) et contrôlent la composition en espèces algales
et bactériennes (Biggs et Thomsen 1995 ; Battin et al. 2003b ; Francoeur et Biggs 2006). Des
valeurs élevées de vitesse de courant peuvent engendrer des réductions de biomasse soit par
des effets de cisaillement (Biggs et Thomsen 1995) soit par des phénomènes d’abrasion dus
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 12

à la présence de matières en suspension (Francoeur et Biggs 2006). Des études montrent

qu’une vitesse de courant importante engendre (i) une croissance plus rapide de la biomasse,
(ii) des activités métaboliques plus élevées et (iii) une couche limite de diffusion plus fine
(Biggs et Thomsen 1995). Une variation au niveau des régimes hydrodynamiques ou une
hétérogénéité spatiale de l’écoulement facilitent également une grande diversité (Singer et al.
2010 ; Villeneuve et al. 2011b) avec l’apparition de nombreuses niches écologiques. Il semble-
rait qu’un biofilm qui se développe sous des conditions de vitesse de courant faible, présente
un assemblage plus ouvert et moins compact et une sensibilité à une perturbation provenant
de la colonne d’eau plus importante (Figure 7) (Stevenson et al. 1996). De même, ils sont
plus épais, riches en diatomées avec une sinuosité de surface plus importante, que les biofilms
colonisés sous des conditions de fort courant (Battin et al. 2003b).

Figure 7 – L’influence
de la vitesse du cou-
rant sur la structure tri-
dimensionnelle des bio-
films phototrophes et
leur résistance face à
une perturbation phy-
sique (extrait de Steven-
son et al. 1996)

Les barrages par exemple atténuent l’amplitude des variations du régime hydrologique, et
ainsi l’hétérogénéité des habitats physiques (= micro-habitats), ce qui engendre une réduction
de la diversité (Licursi et Gomez 2009). La vitesse du courant n’a pas que des effets sur les
algues (Biggs et Stokseth 1996 ; Ghosh et Gaur 1998 ; Besemer et al. 2007) mais également
sur les bactéries, en terme de diversité, de composition ou de structure (Battin et al. 2003b ;
Villeneuve et al. 2010).
Pour conclure ce facteur ne fait pas que contrôler la diversité et la structure, il influence
également l’architecture du biofilm phototrophe (Battin et al. 2003b).

I.2.1.4 La température

La température va influencer principalement la croissance du biofilm dans le sens où

ce paramètre agit sur les cinétiques des réactions biochimiques, incluant la dégradation de
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 13

la matière organique (Kirchman et Rich 1997). Les variations de température sont souvent
liées à des changements saisonniers (Vis et al. 1998 ; Brümmer et al. 2003). Il a été montré
que des températures comprises entre 0 et 25˚C augmentaient la richesse spécifique et des
températures supérieures à 30˚C la diminuaient (DeNicola 1996). Parmi les facteurs abiotiques
qui peuvent affecter la structure des biofilms phototrophes, nous pouvons citer la salinité, le
pH, la présence de molécules toxiques (Stevenson et al. 1996). L’impact de ces facteurs sur
les communautés de biofilms phototrophes comme ceux précédemment cités, dépend de la
tolérance et des conditions optimales de développement de chaque espèce.

I.2.1.5 Les substrats de colonisation

Des études montrent que la nature des supports de colonisation, naturelle ou artificielle,
influence fortement la quantité de biomasse et la composition du compartiment algal. Cer-
tains auteurs observent des différences entre les biofilms développés sur des supports naturels
ou artificiels, illustrées par des richesses spécifiques plus faibles pour des biofilms provenant
de supports artificiels (Barbiero 2000), des abondances différentes de cyanobactéries, d’algues
vertes (Cattaneo et Amireault 1992) et de diatomées (Barbiero 2000), ou des textures à une
échelle microscopique différente (Murdock et Dodds 2007). Des résultats contradictoires sont
observés entre des supports naturels et artificiels pour des communautés de diatomées (Eulin
et Le Cohu 1998). La taille et la nature (Danilov et Ekelund 2001) du substrat sont égale-
ment importantes, les substrats fins comme le sable produisent des biofilms plus compacts,
dominés par des diatomées motiles et des cyanobactéries, et des quantités de biomasse moins
importantes, alors que les substrats plus grossiers comme les galets supportent la croissance
de biofilms plus riches en biomasse et plus aérés et dominés par des algues filamenteuses
(Cattaneo et al. 1997). Par contre, la taille moyenne des algues semble indépendante de la
taille du substratum (Cattaneo et al. 1997).
L’utilisation de substrat artificiel est très appréciée lors des investigations sur les biofilms
phototrophes de milieux lotiques pour plusieurs raisons :
– Limiter l’hétérogénéité intra-site (Cattaneo et Amireault 1992). Les biofilms ont la
particularité d’être très hétérogènes lorsqu’ils se développent sur les substrats naturels
(Townsend 1989 ; Lear et al. 2008) ;
– Faciliter les prélèvements in situ, le surfaçage des supports et leur transport jusqu’au
laboratoire ;
– Maîtriser le temps de production des biofilms phototrophes et ainsi en connaître l’âge
et le degré de maturation (Meier et al. 1983).
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 14

Généralement, les supports artificiels sont très souvent utilisés pour disposer directement
dans les micro/mésocosmes des supports préalablement colonisés par du biofilm phototrophe
en milieu naturel (Pérès et al. 1996 ; Schmitt-Jansen et Altenburger 2005). Murdock et Dodds
(2007) ont révélé l’importance de l’orientation et de la rugosité du substrat comme un facteur
influençant le développement du biofilm. D’un point de vue global, la position verticale des
supports engendre des biomasses plus faibles de 35 % par rapport aux substrats positionnés
à l’horizontale. De plus, la biomasse algale est plus faible sur des substrats avec des surfaces
plus lisses telles que le verre (30 % de biomasse en moins par rapport au galet de rivière).
Ainsi les supports plus rugueux (Clifford et al. 1992 ; Sanson et al. 1995) et placés à l’horizon-
tale (Knott et al. 2004 ; Kralj et al. 2006) permettent une accumulation plus importante de
biomasse algale comme observée également pour d’autre types de substrats (Vandermeulen
et Dewreede 1982). La quantité de biomasse algale peut également être liée à la taille du sup-
port (Watermann et al. 1999 ; Luttenton et Baisden 2006) ainsi qu’à sa stabilité (Cattaneo
et al. 1997). Il arrive souvent que l’accumulation de biomasse se fasse dans un premier temps
sur les frontières plutôt que dans la surface intérieure du substrat (Murdock et Dodds 2007).

I.2.1.6 Les facteurs biotiques

Parmi les nombreux facteurs biotiques susceptibles d’influencer la structure et le fonc-

tionnement des biofilms phototrophes, nous pouvons citer :
– Le broutage (Lawrence et al. 2002 ; Wellnitz et Rader 2003) qui souvent est responsable
d’une perte de biomasse, susceptible d’engendrer des micro-habitats vacants et donc de
nouvelles niches écologiques ;
– Les produits allélochimiques qui sont sécrétés par les micro-organismes phototrophes
comme moyen de défense, agissant comme un moyen de dissuasion, une toxine, ou
un inhibiteur. Ces produits sont appelés composés allélopathiques quand ils inhibent
les concurrents et composés allélochimiques quand ils sont libérés pendant le pâturage
(Leflaive et al. 2008) ;
– La lyse virale (Lyautey 2005) qui peut avoir des effets sur la mortalité bactérienne
et affecter ainsi l’abondance, la diversité et la densité bactérienne, et l’intégrité de la
matrice d’EPS. Des virus ont été enregistrés comme spécifiques aux algues.
Il est important de garder à l’esprit qu’aucun de ces facteurs n’est prépondérant, c’est
l’ensemble des conditions environnementales et les interactions au sein même du biofilm
(liées à la composition), qui contrôlent la structure des biofilms phototrophes. Les effets
engendrés par ces facteurs vont dépendre de l’intensité des changements et de la tolérance
des communautés, c’est-à-dire des conditions optimales de croissance de chaque espèce. De
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 15

nombreuses études essayent d’appréhender les effets de couplage de plusieurs facteurs afin
d’être le plus réaliste possible (Villeneuve et al. 2010 et 2011c).
Il est délicat de vouloir dissocier ces deux types de facteurs biotiques et abiotiques, comme
souligné par Boulêtreau (2007), il est préférable de parler « d’un double contrôle sur la struc-
ture et le fonctionnement des communautés » par des facteurs allogènes, considérés comme
extrinsèques aux biofilms (broutage, lumière, température, nutriments, hydrodynamique. . . )
et prédominant sur un biofilm jeune, et les facteurs autogènes intrinsèques au biofilm (brou-
tage, compétition, allélopathie. . . ) et prédominant sur un biofilm mature. Le stade mature
des communautés peut être qualifié d’ « isolement physique » vis-à-vis de la colonne d’eau.
Les processus internes au biofilm peuvent parfois avoir plus d’importance en termes d’effets
comme l’observe Schmid-Araya et Schmid (2000) pour le broutage, et Romani et Sabater
(2000) pour les nutriments.

I.2.2 Le concept de succession écologique

Comme précisé par Fierer et al. (2010), les successions écologiques se définissent par « la
manière un peu ordonnée et prévisible par laquelle les communautés changent avec le temps
suite à la colonisation d’un nouvel environnement ». Nous pouvons rajouter à cette définition
comme précisé par Lyautey (2005) que ces changements temporels « conduisent à un équilibre
de la communauté nommé climax ». Les recherches sur la compréhension de ces successions se
sont focalisées dans un premier temps sur les macro-organismes terrestres (macrophytes par
exemple, Clements 1916 ; Prach et Walker 2011). Des limites d’ordre méthodologique rendent
difficile la compréhension des successions microbiennes en milieu aquatique, vu leur haute
diversité et leur capacité à répondre très rapidement à tout changement environnemental.
Avec le développement d’outils moléculaires, la tendance s’est inversée (Fierer et al. 2010).

I.2.2.1 Dynamique temporelle de la biomasse

Le suivi de l’évolution temporelle de la biomasse des biofilms phototrophes peut s’appré-

hender à court (< 2 mois) ou long terme (> 2 mois) (Biggs et Stokseth 1996). Dans le cadre
de notre travail, nous nous focalisons uniquement sur la dynamique à cours terme. Cette
dynamique a été conceptualisée par Biggs (1996) via son modèle d’évolution temporelle de
la biomasse (matière sèche, matière sèche sans cendre, et chlorophylle a) (Figure 8A et B).
Classiquement, la croissance des biofilms se produit en deux étapes, une phase d’accrétion sui-
vie d’une phase d’érosion. La phase d’accrétion se caractérise par la colonisation d’un substrat
vierge (croissance horizontale), puis par la croissance exponentielle de la biomasse du biofilm
associée à son épaississement (croissance verticale) (Biggs et Stokseth 1996). Les niveaux de
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 16

biomasse atteints par les biofilms sont très variables spatialement (Dodds et al. 1998). Cette
quantité de biomasse est souvent liée au niveau trophique et la lumière (Biggs 2000). Le
temps nécessaire pour atteindre des pics de biomasse est le plus souvent de l’ordre de 4 à 6
semaines, mais il dépend également des facteurs environnementaux et de la composition du
biofilm. Des biofilms riches en algues vertes présentent souvent des taux de croissance plus
rapides (Zippel et Neu 2005). Vient ensuite la phase d’érosion qui se matérialise par une perte
rapide de biomasse engendrée soit par une perturbation (crue ou broutage, par exemple), soit
par des phénomènes d’auto-détachement causés par un passage de l’autotrophie vers une hé-
térotrophie (Boulêtreau et al. 2006). L’auto-détachement ne se produit que très rarement en
milieu naturel (Boulêtreau et al. 2006) (Figure 8C).
Ce concept de succession d’espèces a été appliqué aux biofilms phototrophes pour les frac-
tions algale (Setenson et Peterson 1991 ; McCormick et Stevenson 1991 ; Biggs et al. 1998 ;
Wellnitz et Rader 2003) et bactérienne (Jackson 2003 ; Lyautey et al. 2005a). Ces successions
s’expliquent en partie par les propriétés des espèces impliquées (mode de reproduction, taille
des organismes et stratégies énergétiques, Lyautey et al. 2005). Les premières espèces à co-
loniser un support vierge sont souvent de petite taille avec des taux de croissance rapides,
elles sont qualifiées d’espèces à stratégie R. Ces colonisateurs vont modifier l’environnement
afin de favoriser les développements d’espèces de taille plus grosse avec des vitesses de crois-
sance plus lentes. Ces populations présentent des stratégies C et K (Biggs et al. 1998). Ainsi
les successions des populations sont influencées par des interactions biologiques. Ces inter-
actions deviennent de plus en plus prédominantes avec la maturation du biofilm associée à
une épaisseur telle que les échanges avec la colonne d’eau sont limités (Watnick et Kolter
2000 ; Wimpenny et al. 2000 ; Martiny et al. 2003). A ce stade de la croissance du biofilm,
les successions suivent un déterminisme autogène (Lyautey 2005).
Les espèces bactériennes colonisatrices de stratégie R, au taux de croissance rapide, pré-
sentent les traits d’adaptions suivants : elles sont aérobies, présentent des propriétés d’adhé-
sions actives, et sont qualifiées de généralistes et d’ubiquistes (Lyautey et al. 2005a). Par
opposition, les espèces compétitrices, de stratégie K, au taux de croissance lent, sont des
espèces aérobies facultatives à anaérobies strictes, qualifiées de recycleurs et de producteurs
d’agent antimicrobiens. Associé à ces différentes stratégies de développement, les biofilms
jeunes se caractérisent par de nombreuses interactions avec les eaux oxygénées, de nombreux
espaces libres et une alimentation en nutriment par l’eau, et les biofilms plus matures se
caractérisent par une diffusion de l’oxygène limitée, l’apparition de micro-gradients sur la
hauteur du biofilm.
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 17

Figure 8 – Dynamique de la biomasse comme décrite par la chlorophylle a, la MS (matière sèche)

ou la MSSC (matière sèche sans cendre), selon le modèle proposé par Biggs (1996) (A = extrait
de Boulêtreau (2010) ; Schéma conceptuel de l’évolution temporelle de la biomasse (B = extrait de
Sigee 2005 d’aprés Tuchman et al. 1996 ; Profil de l’évolution temporelle de la biomasse microbienne
le plus souvent observé en milieu naturel, avec présence de deux successions, primaire et secondaire
(C = extrait de Garabetian 2009)
I.2. Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique 18

I.2.2.2 Dynamique temporelle du compartiment algal

Pour le compartiment algal, des études montrent que typiquement les espèces qui viennent
coloniser en premier le substrat vierge sont les algues de petites tailles, très mobiles et sou-
vent des diatomées (Eulin et Le Cohu 1998) (stratégie R). Mais cette tendance peut varier,
Szlauer-Lukaszewska (2007) observaient une dominance des diatomées au sein de leurs bio-
films matures (> 12 semaines) colonisés sur des supports artificiels. Notons que la phase de
colonisation est un processus aléatoire. La colonisation se poursuit, facilitée par les premiers
colonisateurs, par la fixation d’espèce d’algues avec des cellules plus grosses, moins mobiles
et présentant des stratégies C, tels que les chlorophycées, puis arrivent les cyanobactéries sui-
vant les conditions environnementales. Après la phase de colonisation, le nombre d’espèces
diminue (Guasch et al. 1997 ; Hillebrand et Sommer 2000b) puis l’installation d’un stade
climacique (Biggs 2000) apparait.

I.2.2.3 Dynamique temporelle du compartiment bactérien

Des études montrent que les bactéries sont également de très bonnes colonisatrices (Lyau-
tey et al. 2005a ; Roeselers et al 2007). Les colonisateurs primaires modifient le milieu et
rendent favorable l’installation des autres espèces (Sigee 2005) (par exemple avec la produc-
tion de mucilage, Stevenson 1983).
Ce concept de succession s’appuie essentiellement sur un modèle d’évolution temporelle de
la diversité des communautés qui révèle la disparition ou l’apparition de taxons (ou d’OTUs)
au cours du développement des communautés (Jackson 2003). Lors des premiers stades de
développement, les bactéries colonisent un substrat vierge, le nombre de taxons augmente
dans le temps. Suite à l’établissement du biofilm, les échanges avec la colonne d’eau dimi-
nuent, entrainant ainsi l’apparition de mécanismes de compétition entre les taxons pour les
ressources ou l’habitat, ce qui engendre une diminution du nombre de taxons et une réduc-
tion d’apport de nouvelles espèces depuis la colonne d’eau (Jackson 2003) (Figure 9). En
poursuivant la maturation du biofilm, de nouvelles niches écologiques apparaissent à l’inté-
rieur de l’agrégat, ce qui favorise l’installation de nouvelles populations associées parfois à de
nouvelles fonctions telle que la dénitrification (Lyautey 2005).
I.3. Les biofilms phototrophes : compartiment fonctionnel clef des milieux
lotiques 19

Figure 9 – Evolution temporelle du nombre d’espèces et de nouvelles espèces durant les différentes
phases de développement d’un biofilm phototrophe, conceptualisée par Jackson et al. (2001) (extrait
et amélioré de Jackson et al. 2001)

I.3 Les biofilms phototrophes : compartiment fonctionnel

clef des milieux lotiques
Les biofilms phototrophes constituent un compartiment fonctionnel clef des milieux lo-
tiques (Woodruff et al. 1999 ; Romani et Sabater 2000 ; Sabater et al. 2002). Ils contribuent
au fonctionnement général et la structure des écosystèmes par :
– Leur position à la base des réseaux trophiques (Lamberti 1996 ; Dahm et al. 1998 ; Bat-
tin et al. 2003) qui fait de cet assemblage une source de nourriture pour les invertébrés
(Cattaneo et Kalff 1980 ; Burns et Ryder 2001 ; Munoz et al. 2001 ; Azim et al. 2005).
Les biofilms représentent une part importante de la production primaire totale dans un
écosystème lotique (Wetzel 1983) ;
– La participation au déroulement des cycles biogéochimiques (Kostel et al. 1999 ; Battin
et al. 2003a), par exemple au niveau du cycle du carbone (production primaire) (Romani
et al. 2006), de l’azote (Teissier et al. 2002) ou du phosphore (Dodds 2003). Les biofilms
sont le siège de réactions auto et hétérotrophes (Augspurger et al. 2010 ; Ziegler et
Lyon 2010 ; Flipo et al. 2007 ; Romani et al. 2004), comme le recyclage de la matière
(Wanatabe 2001) et la transformation d’un état organique à un état minéral. La matière
organique peut être d’origine autochtone (formée par les autotrophes) ou allochtone
(provenant du courant et des détritus) (Garland 1997) ;
– Leur rôle de refuge pour les invertébrés (Kostel et al. 1999) ;
– Leur capacité à adsorber et ou dégrader des molécules, dans une optique de biorémé-
diation (Singh et al. 2006 ; Roeselers et al. 2007) telles que les pesticides (Lawrence et
al. 2001) ou les métaux (Dynes et al. 2006 ; Duong et al. 2009 ; Hitchcock et al. 2009
pour le nickel). Cette adsorption liée principalement à la présence des EPS peut varier
en fonction de l’âge du biofilm (Duong et al. 2010) et la saison (Pokrovsky et al. 2010).
I.4. Les biofilms phototrophes : un outil pour la Directive Cadre Européenne20
?

Des études ont pu montrer que cette capacité de se lier aux molécules pouvait être en
réalité une capacité à se protéger de ces mêmes molécules.
Il est intéressant de noter que les biofilms phototrophes sont utilisés dans le traitement
des eaux usées (Guzzon et al. 2008) via des « systèmes à filtres ». Pour des conditions de
faibles temps de séjour hydraulique, ces types de biofilms sont plus efficaces que des boues
activées, surtout quand les réactions concernent des individus avec de faibles taux de crois-
sance (bactéries méthanogènes, nitrifiantes). Les biofilms présentent souvent des structures
filamenteuses favorisant ainsi l’augmentation du rapport surface/ volume et le transfert de
matière (Boulêtreau 2006). Cette capacité peut engendrer des services écologiques, ainsi les
biofilms phototrophes peuvent contribuer à l’auto-épuration des eaux naturelles. Il est impor-
tant de souligner que ce métabolisme peut varier avec la maturation du biofilm phototrophe.
Des études ont montré que le fonctionnement des biofilms peut évoluer au cours du temps.
Garabétian (HDR 2006) parle « d’équilibre entre l’assimilation nécessaire à une croissance
de la partie active du biofilm et la reminéralisation ou relarguage d’une fraction sénescente
/ détritique ». En d’autres termes, lorsque le biofilm est jeune et peu épais, les échanges
avec la colonne d’eau sont prédominants, il est dans une programmation de croissance, ce qui
a comme conséquence d’absorber de grandes quantités de nutriments provenant des masses
d’eau. A l’inverse, lorsque le biofilm est mature et très épais, des processus hétérotrophes
(ammonification, dénitrification) dominent, et sont à l’origine du relarguage d’une partie de
l’azote récupérée, via la réaction de dénitrification. Ces observations sont consistantes avec
les taxons dominants détectés au sein des biofilms épais impliqués dans des processus de
dénitrification (Lyautey 2005). Pour exemple, 25 g.m−2 de MS de biofilm épilithique permet-
traient dans un volume d’eau correspondant à 10-50 litres, de produire chaque jour entre 15
à 70 mg de N-N2 (Teissier et al. 2002)

I.4 Les biofilms phototrophes : un outil pour la Directive

Cadre Européenne ?
Les biofilms phototrophes sont souvent décrits comme « des témoins de la qualité de l’eau
», ils intègrent des flux d’eau et d’éléments dissous importants. Par exemple, Sabater et al.
(2007), en décrivant les biofilms, les qualifient de « early warning systems » et Montuelle et
al. (2010) de « sentinelles des rivières ». Ceci est dû principalement à leur capacité à intégrer
des changements environnementaux sur du long terme présent ou passé, essentiellement grâce
à leur mode de vie sous une forme sessile. Les biofilms, par leurs natures ubiquistes (Lowe et
al. 1996), leur temps de renouvellement rapide, et leur structure tridimensionnelle complexe
I.4. Les biofilms phototrophes : un outil pour la Directive Cadre Européenne21
?

à l’origine d’une variété de niches écologiques, de structure et de profils physiologiques, ont

cette capacité à intégrer rapidement les changements des conditions environnementales au
cours du temps, et la simplicité de leur collecte et de leur transport font d’eux de très bons
candidats comme bio-indicateurs (Montuelle et al. 2010). La complexité et la diversité de ces
assemblages engendrent une variété de réponses possibles (Newman 1996) à une perturbation
et non une simple réponse du type « tout ou rien » (Lowe et al. 1996).
En effet, les communautés de biofilms phototrophes répondent aux critères de la définition
d’un bio-indicateur établie par Dale et Beyeler (2001) et reprise par Montuelle et al. (2010) :
être facilement mesurable, être sensible à un stress, répondre à ce stress de façon prédictible,
et avoir une faible variabilité de réponse pour un même stress.
Pour utiliser les biofilms comme bio-indicateurs, il faut tenir compte de l’influence pos-
sible des variations saisonnières (Leira et Sabater 2005 ; Duong et al. 2008), du temps de
colonisation du substrat (Hoagland et al. 1982), de l’évolution temporelle du biofilm et de
divers facteurs biotiques ou abiotiques (Stevenson et al 1996 ; Brümmer et al. 2003) sur la
composition et le fonctionnement du biofilm, c’est pourquoi il est difficile de vraiment associer
un effet à une cause particulière. Il existe deux moyens d’évaluer la réponse des communautés
à un stress environnemental, soit par une approche structurelle (diversité, composition, bio-
masse), soit par une approche fonctionnelle souvent mesurée via des activités métaboliques
(production primaire, respiration, activités enzymatiques. . . ). Les descripteurs possibles pour
évaluer l’effet d’un stress sur les communautés de biofilms phototrophes sont nombreux. Le
choix du descripteur est très important, il peut être basé sur (i) la structure et la diversité
des communautés, (ii) l’aspect fonctionnel ou (iii) l’évaluation de la tolérance du biofilm.
Le descripteur basé sur l’acquisition de la tolérance est appelé le concept de PICT (« Pol-
lution Induced Community Tolerance », se rapporter à la thèse de doctorat de Tlili 2010).
Ce concept est basé sur la notion d’adaptation des organismes, il considère que des commu-
nautés biologiques déjà exposées à un polluant acquièrent une tolérance à ce polluant. Cette
différence de tolérance est mise en évidence par des tests de courte durée (Blanck 2002)
(mesure de l’activité photosynthétique par exemple). Cette approche a l’avantage de relier
facilement la pollution à un effet (Tlili 2010). En terme de bio-indicateurs, les composants
algaux sont pour le moment les plus utilisés (Prygiel et Coste 1993 ; McCormick et Cairns
1994), notamment les communautés de diatomées (Debenest 2007). Mais certaines études
se sont focalisées sur l’utilisation des bactéries comme bio-indicatrices des changements des
conditions environnementales (Lyautey 2005 ; Lear et Lewis 2009). Les communautés de di-
atomées sont largement utilisées comme bio-indicatrices de la qualité des eaux, notamment
des pollutions d’acidification ou d’eutrophisation, basées essentiellement sur l’abondance, la
I.5. Les dispositifs d’investigation des biofilms phototrophes 22

composition et la forme des diatomées. Cette mesure d’altérations est à l’origine de la mise
en place d’indices standardisés tels que le BDI (« Biological Diatom Index ») (Coste et al.
2009) et le SPI (« Specific Polluosensitivity Index ») (Coste 1982) dans le but d’évaluer et
comparer la qualité d’un cours d’eau à l’autre (Debenest 2007). Pour le moment, de tels
indices ne peuvent être utilisés pour une pollution par des pesticides (Dorigo et al. 2004).
Même si quelques études ont déjà suggéré que les diatomées pouvaient être particulièrement
sensibles aux pesticides (Morin et al. 2008 et 2010 ; Roubeix et al. 2010).

I.5 Les dispositifs d’investigation des biofilms phototrophes

En réponse aux difficultés rencontrées face aux expériences réalisées in situ, de nombreux
systèmes ont été développés dans la littérature (Tableau 1), parmi lesquels des canaux à
petite (exemple, Zippel et al. 2007) ou grande échelle (exemple, Battin et al. 2003b) qui sont
des systèmes ouverts et qui miment particulièrement bien les conditions naturelles d’un milieu
lotique. Par leur capacité à reproduire le fond des rivières, ces systèmes sont très attractifs.
D’autres systèmes sont également utilisés, les aquariums (exemple, Debenest et al. 2009),
et les bioréacteurs annulaires rotatifs (en anglais « rotating annular bioreacteur » ou RAB)
(Lawrence et al. 2000). Zippel et al. (2007) retiennent quatre points majeurs à prendre en
compte lors de la conception d’un microcosme :
– Ajustement et contrôle des conditions extérieures (lumière, température, oxygène dis-
sous, vitesse de courant. . . ) ;
– Mise en place d’une procédure d’échantillonnage facile permettant la récupération d’un
biofilm non déstructuré ;
– Une hétérogénéité spatiale faible d’un substrat colonisé à l’autre ;
– Un faible coût d’achat et de maintenance.
Le paramètre le plus important étant la présence d’une source de lumière. Les différents
dispositifs se différencient par leur taille, la nature des supports de colonisation, le niveau de
contrôle des conditions environnementales, leur réalisme, mais également suivant les objectifs
de l’étude (Tableau 1).
Malgré d’importants efforts dans le développement de dispositifs expérimentaux pour
la production de biofilms phototrophes, associés au contrôle des conditions expérimentales,
générer des biofilms de manière tout à fait reproductible (Roeselers et al. 2007) demeure
toujours un défi.
 I.5. Les dispositifs d’investigation des biofilms phototrophes

Tableau 1 – Synthèse comparative de quelques travaux sur les dispositifs d’investigation des biofilms phototrophes. LxlxP = Longueur x
largeur x Profondeur
23
 Chapitre II

La problématique des pesticides dans

l’environnement

II.1 La contamination des milieux aquatiques par les pes-

ticides : origines du problème
Il existe de nombreuses sources de pollutions inorganiques ou organiques des milieux aqua-
tiques, parmi lesquelles, la présence des métaux lourds (Liang et al. 2004), l’eutrophisation
(Mainstone et Parr 2002 ; Schwarzenbach et al. 2006) et les pesticides qui représentent la
majorité des polluants organiques (Downing et al. 2004 ; Konstantinou et al. 2006 ; Dorigo et
al. 2007 ; Rabiet et al. 2010).
Les pesticides sont des molécules naturelles ou de synthèses utilisées pour lutter contre
des nuisances biologiques. Suivant le type d’organismes visés, le nom de la molécule sera
différent, ainsi nous avons les termes « herbicides » pour des plantes, « insecticides » pour
les insectes, « fongicides » pour les champignons, etc. Ces molécules sont également classées
suivant leurs structures chimiques (triazines, organochlorés, etc.) associées généralement à des
modes d’action différents (Tableau 2). La pollution des eaux de surface par les pesticides
peut avoir une origine agricole ou urbaine (Planas et al. 1997). La majorité des pesticides
détectés au sein des écosystèmes aquatiques sont des herbicides (Kreuger 1998).
Les pesticides, une fois appliqués sur une parcelle de sol, peuvent se disperser vers d’autres
compartiments, les eaux souterraines, l’atmosphère, les eaux de surface.(Figure 10) par dif-
férents mécanismes incluant la volatilisation, le ruissellement, l’infiltration. (Payraudeau et
al. 2009). La dominance de l’un ou l’autre des mécanismes dépend des propriétés des milieux
rencontrés ainsi que des caractéristiques physico-chimiques, des propriétés des molécules, du
climat... (Barriuso et al. 1996). Les pesticides détectés dans les eaux de surface peuvent éga-
lement provenir des usines de traitements des eaux usées (Gerecke et al. 2002 ; Blanchoud et
al. 2004).
La thèse de Devault (2007) décrit bien ces différents mécanismes qui aboutissent à la
dispersion des pesticides après leur application sur une parcelle de sol. De nombreux méca-
 II.1. La contamination des milieux aquatiques par les pesticides : origines du
problème 25

Classe Mode d'action Famille Exemple

S-Triazines Atrazine
Inhibiteur de la photosynthèse
Urées substituées Diuron / Isoproturon
Herbicides
Inhibiteur de l’élongation des acides gras Chloroacétanilides Alachlore / Métolachlore
Inhibiteur de la synthèse des acides aminés Sulfonylurées Glyphosate
Inhibiteur de la biosynthèse des lipides Triazoles Tebuconazole
Fongicides Inhibition de la chaine respiratoire Hétérocycles azotés Azoxystrobine
Inhibiteur de la germination des spores Carbamates Thirame
Néonicotinoïdes Imidaclopride
Insecticides Neurotoxicité
Organosphosphorés Lindane

Tableau 2 – Exemple d’un panel de mode d’action de différentes familles de pesticides

Figure 10 – Les différents mécanismes qui gouvernent la dispersion des pesticides de la parcelle du
sol vers les autres compartiments (extrait de Barriuso et al. 1996)
II.1. La contamination des milieux aquatiques par les pesticides : origines du
problème 26

nismes sont à l’origine de la dissipation des pesticides, le lessivage, l’adsortion, la volatilisation

(Perfect 1980 ; Majewski et al. 2000 ; Foreman et al. 2000), la photodégradation (Lanyi et
Dinya 2005), la biodégradation (Katagi et al. 2010), l’hydrolyse ou l’oxydation (Guimon
2005). Parmi ces mécanismes, la biotransformation est un des mécanismes prépondérant qui
permet d’atténuer la pollution des pesticides dans l’environnement (Katagi 2006 ; Sorensen
et Aamand 2003 ; Giacomazzi et Cochet 2004). Ces processus ne peuvent se faire que sur la
fraction extractible à l’eau, en d’autres termes non adsorbée.
A titre d’exemple, la volatilisation peut aller jusqu’à 15 % de perte de la quantité appliquée
à la parcelle (Gouy et al. 2001) souvent rencontrée soit à partir du sol même, soit à partir
de la plante (20 à 22 %). Les phénomènes de volatilisation sont accrus sous des conditions
thermiques élevés (Perfect 1980). La dispersion vers les milieux aquatiques, eaux de surface ou
eaux souterraines via des phénomènes de lessivage et de lixiviation dépendent de la nature du
sol, de l’adsorption de la molécule et des conditions climatiques (Gish et al. 1995 ; Taghavi et
al. 2010). Le pourcentage de pesticides lessivé peut hautement varier, des études enregistraient
des valeurs de 2 %, de 0,5 à 30 %, parfois même jusqu’à 90 % (Devault 2007). Les sols
peu travaillés qui sont plus riches en micro-organismes, peuvent favoriser les processus de
biodégradation mais induire également beaucoup d’aération et favoriser ainsi les mécanimes
de drainage (Elliott et al. 2000). Cette présence de la pédofaune est susceptible d’augmenter
l’hétérogénéité spatiale et structurelle et d’augmenter ainsi la capacité de rétention de l’eau
(Binet et al. 2006). De même, en fonction de la profondeur du sol, la biodégradation n’aura
pas le même rendement, par exemple l’isoproturon est mieux dégradé à la surface du sol
(Madrigal et al. 2007). Une exposition répétée dans le sol va créer une pression de sélection
sur la communauté, et est susceptible de rendre la communauté apte à utiliser le pesticide
comme source de carbone (Pesce et al. 2009b). Cette dégradation peut être sensible aux
valeurs de température (Palmisano et al. 1991).
L’adsorption au niveau des sols et des sédiments peut être considérée comme un stockage
des polluants, retarde leurs mouvements, et les rend moins biodisponibles pour les micro-
organismes (Abate et Masini 2005 ; Schwab et al. 2006) et moins sujet à des phénomènes de
ruissellement.
Seule une petite fraction des pesticides utilisés dans l’agriculture et l’urbanisme se dé-
placent avec les eaux de ruissellement vers les écosystèmes aquatiques, les rivières, lacs
(Chèvre et al. 2008 ; Hoagland et al. 1996 ; Solomon et al. 1996), ou les eaux souterraines
(kolpin et al. 2000). Habituellement, moins de 2 % des pesticides appliqués sur les récoltes
finissent dans les ruisseaux (Battaglin et Fairchild 2002). Seulement 10 % des rivières Euro-
péennes peuvent être considérées comme « très propres » en termes de pollution chimique
II.2. Impact des pesticides sur les organismes aquatiques en milieu lotique 27

(Loos et al. 2009). Cette contamination s’avère dépendante des pratiques agricoles (Huber
et al. 2000), des variations saisonnières, des compétences analytiques, des propriétés de la
molécule, de la typologie du bassin versant (Neuman et al. 2003), de la taille de la rivière
(Dorigo et al. 2004) et des conditions climatiques (Taghavi et al. 2010). Le challenge réside à
évaluer et prédire la persistance d’une molécule afin de connaître les risques potentiels sur les
organismes aquatiques. Dans ce contexte, de nombreux outils et modèles sont mis en place
pour évaluer les risques environnementaux liés à ces molécules, leurs effets sur les organismes
biologiques et leurs persistances dans l’environnement (Gardenas et al. 2006 ; Ansara-Ross et
al. 2008).

II.2 Impact des pesticides sur les organismes aquatiques

en milieu lotique

II.2.1 Différentes approches utilisées en écotoxicologie

Les différentes approches utilisées lors de l’évaluation de la toxicité d’un polluant sur un
organisme ou un groupe d’organismes doivent répondre à plusieurs critères : la sensibilité,
la fiabilité, la précision et la robustesse, tout en se rapprochant d’un réalisme écologique
(Laviale 2006). Chaque approche répondra plus ou moins bien aux différents critères suivant
son objectif de départ, par exemple suivant s’il s’agit de travailler sur un ou plusieurs ni-
veaux trophiques, sur une contamination chronique ou aiguë, d’étudier les effets à court ou
long terme ou suivant la nature de la pollution. La plupart des études en écotoxicologie sont
conduites en laboratoire sur des organismes isolés des autres espèces et de son environne-
ment abiotique, ce qui rend difficile la détection d’effets indirects (Kapustka et al. 1996). En
dehors des approches en bio-essais sur une seule espèce, de nombreuses études in situ (Fri-
berg–Jensen et al. 2003) ainsi qu’une multitude de dispositifs expérimentaux de laboratoire
(microcosmes, mésocosmes et macrocosmes) ont été développés (Figure 11). Ces trois types
d’approche se distinguent par leurs représentativités, les niveaux d’organisation biologique
qu’ils intègrent (organismes, populations ou communautés), et leurs capacités à reproduire
la réalité (Figure 12).
La difficulté des études in situ, malgré leurs fortes représentativités, réside dans la diffi-
culté à différencier la variabilité naturelle de celle liée aux polluants. Il est difficile in situ de
prédire le début, la durée et l’intensité de l’exposition au polluant recherché, en effet tous ces
paramètres sont conditionnés par le temps de transfert du polluant vers le milieu aquatique,
le type d’application, les caractéristiques du bassin versant, les conditions climatiques, et
 II.2. Impact des pesticides sur les organismes aquatiques en milieu lotique 28

Figure 11 – Les différentes démarches et types de dispositifs possibles pour appréhender les toxicités
aiguës ou chroniques de polluants à différents niveaux trophiques et différents niveaux de complexité
et de réalisme (extrait de Caquet et al. 1996)

Figure 12 – La comparaison et la
pertinence des différentes approches
utilisables lors des études écotoxico-
logiques (extrait de Laviale 2006)
II.2. Impact des pesticides sur les organismes aquatiques en milieu lotique 29

les propriétés physico-chimiques du polluant. Une des démarches, souvent utilisée lors des
études in situ, est de travailler sur des gradients de pollution, en amont – aval de la source
de pollution et / ou d’utiliser une stratégie de transplantation (par exemple : Dorigo et al.
2010a ; Morin et al. 2010). Inversement, les bio-essais en laboratoire sur des organismes isolés
(e.g. Walker et al. 2006) et souvent planctoniques pour les algues (e.g. Fairchild et al. 1997)
permettant de prédire les impacts des pesticides sous des conditions hautement contrôlées et
standardisées (lumière, milieu riche, température, Nyholm et Kallqvist (1989)), constituent
une approche traditionnelle en écotoxicologie, malgré le manque de réalisme d’un point de
vue environnemental (Cairns 1983) où le nombre de taxa est plus important (Fleeger et al.
2003 ; Van Wijngaarden et al. 2005). Cette approche a l’avantage de présenter de fortes repro-
ductibilités, d’être facile à réaliser, peu coûteuse, et répétable, avec une grande quantité de
réplicats, mais ne peut être considérée comme représentative des milieux naturels. En effet,
ce genre d’approche ne tient pas compte des interactions existantes inter et intra espèces
au sein d’un même niveau trophique ou entre deux niveaux, des variations des conditions
environnementales, de l’importance de la fraction fixée des micro-organismes au sein des sys-
tèmes lotiques, des phénomènes de compensation (via succession d’espèces) ou d’adaptation
possibles (Blanck et Wangberg 1988 ; Admiraal et al. 2000). Dans la plupart des cas, des
bio-essais sur une ou plusieurs espèces permettent l’estimation d’une variété de paramètres
écotoxicologiques, EC50 (la concentration en polluant inhibant 50 % du descripteur étudié,
tel que la croissance), LD50 (la concentration en polluant nécessaire pour tuer 50 % des indi-
vidus de la population testée). Pour le cas des algues, la réponse des organismes à un même
polluant est en effet très variable d’une espèce à l’autre (Satoh et al. 2005). Par exemple,
pour les bio-essais de Pavlic et al. (2006) sur des monocultures d’algues vertes exposées à dif-
férentes concentrations en alachlore, les valeurs de EC50 étaient de 15, 32 et 995 µg.L−1 pour
Pseudokirchneriella subcapitata, Chlorella kessleri et Desmodesmus subspicatus, respective-
ment. Certaines espèces communément retrouvées dans le milieu naturel ne sont pas toujours
cultivables une fois isolées (Andersen et Kawachi 2005). De plus, il est préférable d’utiliser
des communautés in situ plutôt que des cultures d’algues car la sélection génétique in vitro
altère la sensibilité des algues aux polluants (Peterson et al. 1997).
L’approche en microcosmes et mésocosmes peut être considérée comme le meilleur com-
promis entre la complexité des expériences in situ et le manque de réalisme écologique des
bio-essais sur des organismes isolés (Villeneuve et al. 2011a). Cette variété de dispositifs se dif-
férencie par leur dimension, leur représentativité, et leur degré de simplification (Tableau 3).
Ces dispositifs reconstituent d’une manière plus ou moins complexe les chaînes trophiques
des écosystèmes lotiques suivant leurs degrés de simplification et de contrôle des conditions
II.2. Impact des pesticides sur les organismes aquatiques en milieu lotique 30

environnementales, mais également suivant leurs tailles. D’après Odum (1985), un disposi-
tif de taille inférieure à 15 m est considéré comme un microcosme et un dispositif de taille
supérieure à 15 m considéré comme un mésocosme.
Certes les micro- et mésocosmes ne constituent pas une copie parfaite des écosystèmes
mais permettent le contrôle de certaines variables afin de simplifier le système et d’identifier
les relations causes-effets. Ils ont l’avantage en fonction de leurs tailles et de leurs complexités
d’intégrer des niveaux d’organisation différents (Tableau 3). Villeneuve (2008) qualifie ces
dispositifs « de maillon entre les bio-essais en monoculture et les expériences in situ » (Caquet
et al. 2000).

Unité Les niveaux

Contaminant Dimension Référence
d’expérimentation d’organisations
Libellule
Atrazine/Endosulfan Têtard 40,6x 28,5 x 77,5 cm
Mésocosme Rohr et Crumrive 2005
(herbicide) Escargot Volume: 11,3 L
Périphyton
Macro invertébrés
Atrazine/ Lindane Zooplancton Longueur: 110 cm
Microcosme interne Van den Brink et al. 2009
(herbicide) Phytoplancton Profondeur: 70 cm
Periphyton
Zooplancton
Macrophytes 1,1 x 1,1 x 0,7 m
Linuron (herbicide) Microcosme interne Van den Brink et al. 1997
Phytoplancton Volume: 600 L
Périphyton
5 insecticides + Zooplancton
5 herbicides Mésocosme externe Phytoplancton Volume: 1000 L Relyea, 2009
Périphyton

Zooplancton Diamètre: 0,75 m

Microcosme externe
Linuron (herbicide) Phytoplancton Hauteur: 0,65 m Daam et al. 2009
(tank circulaire)
Périphyton Volume d’eau: 250 L

Zooplancton
Métazachlore Mésocosme externe 2,48 x 1,65 x 1,25 m
Phytoplancton Noack et al. 2003
(herbicide) (bassin rectangulaire) Volume: 5 m3
Périphyton

Tableau 3 – Exemples d’études d’évaluation de l’impact de pesticides sur les écosystèmes aquatiques
à différents niveaux de réalisme écologique

II.2.2 Cibles biologiques potentielles des pesticides

En accord avec la définition de Butler (1978) (Boudou et Ribereyre 1997), « l’écotoxicolo-
gie concerne les effets toxiques des agents chimiques et physiques sur les organismes vivants,
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 31

spécialement sur les populations et les communautés à l’intérieur des écosystèmes ; ceci inclue
les voies de transfert de ces polluants et leurs interactions avec l’environnement ».
Comme abordé au début de ce chapitre, les pesticides par différents moyens de dissipation
se retrouvent dans les eaux de surface (Devault 2007). Ces molécules présentent donc une
source de pollution potentielle pour ces milieux, notamment pour les organismes aquatiques
qui ne sont pas la cible première de leur usage, avec des risques pour la santé humaine en
ce qui concerne la potabilisation de l’eau (seuil fixé à 0,1 µg.L−1 pour l’exemple de l’Eu-
rope). Il a été répertorié un grand nombre d’effets directs ou indirects (Friberg-Jensen et al.
2003), positifs ou négatifs sur les organismes aquatiques à différents niveaux d’organisation
biologique, des producteurs primaires (phytoplancton, biofilm phototrophe, macrophytes),
aux prédateurs (poisson. . . ) en passant par les herbivores (zooplancton, poisson. . . ) (cf. les
revues bibliographiques de DeLorenzo 2001, Relyea et Jason 2006 et Ricciardi et al. 2009).
Les effets directs d’un polluant induisent habituellement une réduction de l’abondance de
la part de l’organisme, alors que les effets indirects souvent mènent à une augmentation ou
une diminution de l’abondance (cf. revue bibliographique de Fleegler et al. 2003). Fleegler
et al. (2003) ont observé que les effets indirects sont prédominants. La figure 13 présente 4
exemples d’études écotoxicologiques qui ont évalué l’impact de pesticides au sein d’écosys-
tèmes aquatiques. Ainsi, à terme, une pollution par des pesticides peut donc engendrer des
changements à de plus grandes échelles, perte de la biodiversité par une sélection d’espèces ré-
sistantes, homogénéisation des biotopes, prolifération d’espèces opportunistes... D’après ces 4
exemples, le compartiment des biofilms phototrophes (= périphyton) semble être un compar-
timent clef dans l’évaluation de la toxicité d’un pesticide et son impact sur le fonctionnement
d’un écosystème.

II.3 Interactions biofilms phototrophes-pesticides en mi-

lieux lotique

II.3.1 L’importance des biofilms phototrophes en écotoxicologie

L’utilisation des biofilms phototrophes est largement préconisée dans l’évaluation de la
toxicité d’un polluant (Sabater et al. 2007) au sein des systèmes lotiques (Figure 14) pour
différentes raisons (cf. partie I, chapitre 1 Synthèse bibliographique).
D’un point de vue écologique :
– Sa position de 1er maillon dans la chaîne trophique de la plupart des écosystèmes
lotiques (Flipo et al. 2007) et sa complexité structurelle et fonctionnelle permettant
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 32

A B

Al
gae-

C D
Chl
orpyr
if
os Di
azi
non

Per
iphyt
on Per
iphyt
on

i
Per on
phyt i
Per on
phyt

Figure 13 – Schéma général d’exemples d’impact de plusieurs pesticides (carbaryl, lindane, chlor-
pyrifos, diazinon, des insecticides ; carbendazim, un fongicide ; et acetochlor, metolachlor, glyphosate
et 2,4-D, des herbicides) sur les micro-organismes et les impacts possibles sur le reste de la chaîne
trophique durant des expérimentations en microcosmes (A, extrait et modifié de Van den Brink et
al. 2009 ; B, Van den Brink et al. 2000 ; C, Mills et Semlitsch 2004 et D, Relyea 2009).R = Ressources
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 33

d’intégrer différents niveaux d’organisations biologiques : organisme, population, com-

munauté et écosystème ainsi que leurs interactions ;
– Leur participation à une grande partie de la production primaire (Stevenson et al.
1996 ; Navarro et al. 2008), et leur participation aux cycles biogéochimiques (Battin et
al. 2003a) ;
– La fraction microbienne des écosystèmes d’eau douce se trouve principalement sous une
forme fixée (Pyl’nik et al. 2007) ;
– Son utilisation comme bio-indicateur de la qualité de l’eau (Coste et al. 2009) notam-
ment pour des pollutions trophiques (Debenest 2007) ou des pollutions par les métaux
(Morin 2006) ;
– Contrairement aux communautés du phytoplancton, les biofilms ne sont pas unique-
ment contrôlés par des facteurs allogènes tels que la température, l’hydrodynamisme,
l’intensité lumineuse, etc. . . , mais également par les interactions existantes au sein
même de l’agrégat, liées à la dynamique temporelle du biofilm (facteurs autogènes) ;
– Le caractère sessile du biofilm fait qu’il n’est pas capable d’éviter le polluant (Sabater
et Admiraal 2005).
D’un point de vue temporel :
– Une gamme importante de paramètres structuraux et fonctionnels, ce qui permet d’ap-
préhender les effets du polluant à court ou long terme (Stevenson et Pan 1999) ;
– La particularité des biofilms à intégrer rapidement les changements environnementaux
durant de longues périodes.
D’un point de vue spatial :
– Sa capacité à coloniser une variété de substrats différents, même artificiels, ce qui per-
met une batterie d’études, allant de simples bio-essais sur des organismes isolés à des
expériences plus complexes in situ.
Les communautés microbiennes lotiques sont les premières à interagir avec les pesticides.
D’un point de vue écologique, parce que ces agrégats se placent à la base de la chaîne tro-
phique aquatique, les perturbations affligées aux biofilms phototrophes peuvent se répercuter
sur l’ensemble des organismes de la chaîne trophique et ainsi modifier le fonctionnement gé-
néral d’un écosystème. Les biofilms phototrophes se caractérisent par leur hétérogénéité, leur
organisation tridimensionnelle et les fonctions qui en découlent. Il est possible dans certains
cas de réaliser une certaine standardisation par :
– L’utilisation de substrats artificiels, ceci réduit la variabilité naturelle des substrats à
l’échelle des communautés bactériennes (Lear et al. 2008) ou algales (Stevenson 1997),
réduit le temps d’échantillonnage, augmente la possibilité d’avoir une quantification des
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 34

Figure 14 – Les différents avantages à 3 échelles de représentation (espace, organisation et temps)

d’utiliser les biofilms phototrophes comme modèles d’études (extrait de Laviale 2006)

échantillons, mime au mieux l’attachement du biofilm. Les substrats en verre sont les
plus utilisés en écotoxicologie (Aloi 1990) ;
– Une meilleure définition du temps de colonisation du biofilm avant son utilisation.
Blanck et Dahl (2002) conseillent des biofilms jeunes pour limiter le problème lié à
leurs épaisseurs.
Les biofilms phototrophes se composent d’une fraction importante de micro-organismes
phototrophes (pour un biofilm épilithique en rivière : jusqu’à 30 % de la masse de carbone,
Lyautey 2005). Vu leur ressemblance physiologique avec les plantes terrestres, pour la suite de
ce chapitre, nous nous intéresserons principalement aux études écotoxicologiques concernant
les herbicides.

II.3.2 L’impact des pesticides sur les biofilms autotrophes

II.3.2.1 Comment évaluer la réponse du biofilm phototrophe ?

Il existe de nombreux paramètres possibles pour évaluer l’impact d’un polluant sur les
biofilms phototrophes, tout en intégrant les deux compartiments, algues et bactéries. Ces
paramètres sont de deux types, les descripteurs structuraux et fonctionnels (Figure 15)
(Sabater et al. 2007).
Choisir l’un ou l’autre de ces paramètres dépend de l’effet potentiel du polluant (réversible
ou pas, phénomène de résilience, Culp et al. 2000) et de son mode d’action (Vinten et al. 2011)
(pour les inhibiteurs de la photosynthèse comme le diuron ou l’isoproturon, la stratégie est de
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 35

mesurer l’activité de la photosynthèse ou la production primaire). Les effets aigus sont souvent
bien détectés par des paramètres physiologiques plus ou moins spécifiques (photosynthèse,
activités enzymatiques...) alors que les effets persistants ou chroniques sont détectés par des
paramètres plus structuraux comme les teneurs en chlorophylle a ou la composition en espèces
(Sabater et al. 2007). Il a été montré que coupler des descripteurs structuraux et fonctionnels
permettait au mieux d’évaluer les effets potentiels des pesticides (Foley et al. 2008 ; Lawrence
et al. 2003 ; Montuelle et al. 2010).
Lors de leurs expériences écotoxicologiques, Ricart et al. (2009) ont montré que cer-
tains paramètres répondent mieux aux pesticides, tels que la chlorophylle a et l’activité
photosynthétique (capacité et efficacité) particulièrement pour les herbicides inhibiteurs de
la photosynthèse. Il est important de considérer la sensibilité de chaque paramètre mesuré.
Par exemple les descripteurs de biomasse comme exprimés en termes de matière sèche sans
cendre ne sont pas toujours considérés comme de très bons indicateurs de la qualité chimique
de l’eau (Montuelle et al. 2010). Ces descripteurs sont très influencés par les conditions hy-
drodynamiques et l’intensité lumineuse (Villeneuve et al. 2010).
De même, les méthodes de typage moléculaire telles que la DGGE et T-RFLP intègrent
uniquement les taxons les plus dominants de la communauté bactérienne avec une part asso-
ciée à des taxons d’Eucaryotes pour les couples d’amorces choisies dans cette étude (Lyautey
et al. 2005b ; Cole et al. 2009). Pour les paramètres basés sur des méthodes de culture (Biolog),
il est important de se rappeler que seulement 1 % des espèces bactériennes sont cultivables
(Amann et al. 1995).
Parmi les descripteurs structuraux utilisés durant les expériences écotoxicologiques, nous
pouvons citer l’évaluation de la biomasse (exemple, Noack et al. 2003 ; Roubeix et al. 2011a),
l’analyse des pigments (e.g. Dorigo et Leboulanger 2001), l’épaisseur du biofilm (Lawrence et
al. 2008), la composition, la structure, la forme de vie des diatomées, la forme de leur frus-
tule et leur métabolisme... (Debenest et al. 2010), la structure des communautés Eucaryotes
(DGGE 18S, Villeneuve et al. 2011c) et bactériennes (DGGE 16S, Pesce et al. 2009a ; T-
RFLP 16S, Vercraene-Eairmal et al. 2010 ; FISH, Pesce et al. 2006 ; Grenni et al. 2009), et la
composition des EPS (Lawrence et al. 2008 ; Ricart et al. 2009). Les descripteurs fonctionnels
prennent en compte l’état physiologique des communautés comme la production bactérienne
(Pesce 2006), la production primaire par une mesure de la photosynthèse (par exemple, Nys-
tröm et al. 2000 ; Bérard et al. 2008 ; Tlili et al. 2008), les profils physiologiques au niveau
des communautés (CLPP, Community Level Physiological Profil, Ecoplate, Foley et al. 2008),
diverses activités enzymatiques (Ricart et al. 2009 ; Bonnineau et al. 2010), la présence ou
non de gènes de dégradation de certains pesticides principalement utilisés pour le moment
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 36

Figure 15 – Différents descripteurs utilisables pour évaluer l’impact d’un polluant sur les biofilms,
en fonction de la sensibilité des descripteurs, et des effets étudiés, à court ou long terme (extrait de
Sabater et al. 2007)
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 37

pour des communautés bactériennes de sol (De Liphtay et al. 2002 ; Lee et al. 2005 ; Gonod
et al. 2006), et diverses autres fonctions (nitrification, Chénier et al. 2003 ; Dorigo et al. 2002
et 2005).
La composition taxonomique au moment de la contamination semble être un facteur im-
portant dans la sensibilité de réponse du biofilm (Villeneuve et al. 2011a). Il semblerait que les
biofilms peu diversifiés ne présentent pas forcément plus de sensibilité vis-à-vis d’un herbicide
(Villeneuve et al. 2010). McCann (2000) a introduit l’hypothèse de la « Biodiversité-stabilité
», en accord avec les mécanismes de résilience et résistance des écosystèmes qui augmentent
avec le nombre d’interactions à l’intérieur d’une communauté. Mais une biodiversité impor-
tante ne signifique pas forcément une diversité fonctionnelle importante dû à une présence
possible d’espèces redondantes. De même l’arrivée d’une nouvelle espèce n’apporte pas for-
cément de nouvelle fonction à la communauté. Lors d’une étude (Wicke et al. 2008), les
biofilms les moins diversifiés étaient les plus denses, ainsi les biofilms se suffisent-ils à eux
même comme barrière de protection pour empêcher la diffusion des pesticides ?

II.3.2.2 Une variété de réponses possibles

Dans la littérature, il existe une multitude de systèmes utilisables pour des études écotoxi-
cologiques qui se différencient essentiellement par leur volume et leur niveau de complexité
biologique (de quelques espèces à quelques niveaux trophiques) suivant les objectifs du dé-
part :
– L’étude est-elle réalisée à cours ou long terme ? Dans ce dernier cas, il est important de
tenir compte de la dynamique des organismes, du recyclage des éléments, des processus
écologiques (Guckert 1993) ;
– L’étude est-elle réalisée à partir d’une exposition aiguë, chronique, quelle est l’origine
de l’exposition ? Il est donc important de tenir compte de la chimiodynamique et de la
persistance du polluant (Rand et al. 2000 ; Belanger et al. 2002) ;
– Tenir compte des effets directs et indirects engendrés par le polluant liés au type d’or-
ganisme et à la nature du polluant ; et de la possibilité de résilience de la part des
communautés (Culp et al. 2000).
Vu la multitude de facteurs qui influencent les biofilms phototrophes ((cf. partie I,
chapitre 1, Synthèse bibliographique), il est difficile d’évaluer la part des effets des
polluants, des autres facteurs (Geiszinger et al. 2009). Comme discuté par Culp et al. (2000),
il est difficile de différencier un stress bien particulier d’un autre, et de vraiment connaître
la causalité des effets obtenus (Dorigo et al. 2009). Il faut neutraliser certains facteurs de
confusion d’où l’intérêt de travailler en milieu contrôlé. L’adjonction de plusieurs herbicides,
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 38

triazines par exemple, peut engendrer une coopération et produire un effet plus important
(Faust et al. 2001). Guasch et al. (1998) ont montré une synergie d’effet entre le phosphore
et l’atrazine.
Face à une pollution, les communautés agissent de deux manières, elles sont soit tolé-
rantes, soit sensibles avec un continuum de réponses, suivi par une possible adaptation ou
une résilience dans le cas d’une courte perturbation (Figure 16). La réponse structurelle
ou fonctionnelle (sensibilité ou tolérance) de la part des communautés dépend de nombreux
facteurs abiotiques : lumière (Guash et Sabater 1998 ; Laviale et al. 2010), hydrodynamique
(Sabater et al. 2002 ; Villeneuve et al. 2010), disponibilité des nutriments (Wendt-Rasch et
al. 2004 ; Guash et al. 2007 ; Tlili et al. 2010), variations saisonnières (Guash et al. 1997 ;
Pesce et al. 2009a), nature de l’exposition (Kasai 1999 ; Tlili et al. 2008, 2011 ; Vallotton et
al. 2008), nature du polluant (Debenest et al. 2009) et des facteurs biotiques : composition
du biofilm (Leboulanger et al. 2001 ; Seguin et al. 2001), pression des brouteurs (Lopez-Doval
et al. 2010 ; Munoz et al. 2011). Par l’influence de l’ensemble de ces facteurs biotiques et
abiotiques qui peuvent interagir avec le polluant, il existe une variété d’effets directs ou indi-
rects, de natures transitoires ou réversibles sur les communuatés algales ou bactériennes des
biofilms phototrophes (Sabater et al. 2007).
Les biofilms sont des systèmes dynamiques, avec une physiologie qui évolue suivant les
processus de succession écologique. Un biofilm phototrophe qui présente une structure un
peu distendue, souple, est plus sensible à un pesticide qu’un biofilm plus compact (Guasch
et al. 2003).

Figure 16 – Les différentes ré-

ponses possibles des communautés
face à une perturbation (extrait de
Clements et Newman 2002)

Par la diversité des facteurs biotiques et abiotiques susceptibles d’influer sur les bio-
films phototrophes, les pesticides peuvent engendrer une multitude d’altérations, dont voici
quelques exemples :
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 39

– Perturbation de la production primaire, souvent observée pour des herbicides inhibi-

teurs de la photosynthèse (Pesce et al. 2006 durant une exposition au diuron ; Guasch
et al. 1998 durant une exposition à l’atrazine) ;
– Modification de la biomasse mesurée à travers les paramètres suivants : chlorophylle a,
matières sèches sans cendre et composition des pigments (Navarro et al. 2008 ; Roubeix
et al. 2011a). Par exemple, certains auteurs obtiennent un niveau de biomasse plus
faible en présence de glyphosate (Vera et al. 2011), alors que Austin et al. (1991)
observent un comportement contraire, avec une amélioration de la biomasse et de la
densité algale en présence de glyphosate. Dans la plupart des expositions à un herbicide,
une inhibition de la croissance des communautés algales est observée (Tang et al. 1997 ;
LeBoulanger et al. 2001 ; Tlili et al. 2011), pouvant être expliquée par une épaisseur du
biofilm ou une adhésion au substrat plus faibles (Morin et al. 2010). Pour les herbicides
inhibiteurs de la photosynthèse, une augmentation de la chlorophylle a associée à une
incorporation plus forte de carbone (Tlili et al. 2011, inhibiteur de la photosynthèse :
diuron ; Debenest et al. 2010 ; Roubeix et al. 2011b) a pu être observée dans certains
cas, ce phénomène reflète le « greening » (Pratt et Barreiro 1998). Les microorganismes
phototrophes sont capables d’ajuster leurs pigments intracellulaires durant des périodes
d’éclairage (tels que la chlorophylle a) pour maintenir un niveau de conversion d’énergie
en énergie chimique toujours efficace en réponse à une inhibition. Mais au bout d’un
moment, ce système d’adaptation n’est plus efficace, ainsi avec une augmentation du
temps d’exposition, la toxicité du polluant devient plus importante (Vallotton et al.
2008) ;
– Changements dans la composition des espèces algales. De par leurs caractéristiques phy-
siologiques proches avec les plantes terrestres, les algues sont susceptibles de subir des
impacts directs des herbicides. Une exposition aux herbicides peut mener à une sélec-
tion d’espèces tolérantes au détriment des espèces les plus sensibles (Dahl et Blanck
1996 ; Pérès et al. 1996 ; De Lorenzo et al. 1999 ; Ricart et al. 2009). Ces changements
d’espèces dominantes sont susceptibles d’engendrer un déséquilibre entre les espèces
et modifier ainsi les interactions au sein du biofilm ou vis-à-vis de la chaîne trophique
aquatique. Certaines études ont pu observer que les espèces venant d’un site pollué
présentent une tolérance plus importante (Dorigo et al. 2007). Des auteurs ont souli-
gné une sensibilité des diatomées plus importante que les cyanobactéries (Lurling et
Roessink 2006, metribuzin ; Vera et al. 2010, glyphosate). Inversement, d’autres études
ont montré que suite à une contamination par des triazines, les chlorophycées, souvent
de grandes cellules filamenteuses, sont remplacées par de petites diatomées (Gurney
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 40

et Robinson 1989 ; Kasai 1999), associé parfois à une diminution des cyanobactéries
(Dahl et Blanck 1996 ; Dowing et al. 2004). Ces changements de structure sont rendus
possibles soit par une dominance d’espèces tolérantes, soit par un changement dans
la composition de la communauté (Pérès et al. 1996 ; Nyström et al. 2000 ; Tlili et al.
2008 ; Ricart et al. 2009 ; Villeneuve et al. 2011a) sans que ce soit forcément associé à
des changements de proportion (Guasch et al. 1998) ;
– Changements dans la composition des espèces bactériennes. Ces changements peuvent
être induits par des effets directs (Pesce et al. 2006) ou indirects à la suite de chan-
gements de structure de la communauté des Eucaryotes (Gao et al. 2005 ; Barranguet
et al. 2003 pour les métaux) cela dépend en partie du mode d’action de l’herbicide.
La densité bactérienne apparaît plus importante en présence du contaminant dans cer-
taines études, souvent suite à une baisse de l’activité algale engendrant une baisse de la
compétition et un meilleur accès aux ressources nutritives (DeLorenzo et al. 1999). Une
étude met en évidence une augmentation de la diversité bactérienne (Pratt et al. 1988)
alors qu’une autre observe une diminution (Hamala et Kollig 1985). Sur des biofilms
bactériens, des altérations sur la composition des EPS ont pu être observées (Onbasli
et Aslim 2009). Lors de leur étude, Pesce et al. (2009a) ont montré que les effets du
polluant (diuron) sont plus importants lors d’une exposition chronique suggérant une
adaptation progressive des communautés. Parfois, les modifications de structure des
communautés bactériennes engendrent le développement et la dominance d’espèces ca-
pables de dégrader le polluant (Pesce et al. 2006 ; Tlili et al. 2008) ;
– Changements du mode trophique des algues. Ce processus de survie a été rencontré
plus particulièrement pour les herbicides inhibiteurs de la photosynthèse sur certaines
espèces de diatomées et dans certaines conditions (Goldsborough et Robinson 1986 ;
Pérès et al. 1996) ;
– Altérations de l’activité métabolique des microorganismes hétérotrophes. Ces modifica-
tions d’activités peuvent être ou non associées à des modifications de la composition en
espèces. Les activités métaboliques des communautés bactériennes qui sont souvent uti-
lisées comprennent l’incorporation d’acide nucléique radioactif (Admiraal et al. 1999),
des activités extracellulaires (Nyström et al. 2000), l’activité de la phosphatase (Kloeke
et Geesey 1999) ou de la peptidase, une autre enzyme extracellulaire (Bonnineau et al.
2011), ou certaines fonctions telles que la nitrification (suite à une exposition au gly-
phosate, Enrich–Prast 2006). Parfois, les effets sur la production primaire peuvent être
masqués par une forte influence de la température (Pesce et al. 2008). En contact avec
un herbicide, une stimulation de la croissance est susceptible d’être engendrée (Fran-
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 41

queira et al. 1999 ; Prado et al. 2009). Cette stimulation peut être provoquée par (i)
l’utilisation du polluant ou de ses métabolites de dégradation comme source d’énergie
sous forme de carbone, phosphore ou nitrate (Wong 2000 ; Stamper et Tuovinen 1998),
(ii) une diminution de la compétition avec les algues (DeLorenzo et al. 1999), ou (iii)
par l’utilisation de matériel issu de la mort des algues (Ricart et al. 2009) ;
– Changement dans la communauté des diatomées. Durant certaines études, l’herbicide
provoque l’apparition d’espèces de diatomées dominantes comme Diatoma vulgaris et
Encyonema minutum ou Fragilaria capucina (Villeneuve et al. 2011a), au détriment
d’espèces plus sensibles (Dahl et Blanck 1996 ; Pérès et al. 1996). Seguin et al. (2001)
n’observent pas d’effet sur la structure des communautés diatomiques, ce que les au-
teurs expliquaient par la composition initiale des communautés qui est dominée par
des diatomées de petites tailles et colonisatrices, comme Achnanthidium minutissimum
considérée souvent comme tolérante aux herbicides (Stevenson et Bahls 2002). Souvent
les espèces pionnières (par exemple, Achnanthidium minutissimum sensu lato, Amphora
pediculus) présentent une résistance plus importante que les espèces motiles, espèces
de diatomées mobiles associées à des mouvements très rapides (Navicula sensu lato et
Nitzschia sensu lato) (Rimet et al. 2011). Cette tendance a souvent été observée durant
des pollutions par les métaux (Sabater et al. 2002 ; Guasch et al. 2004). La taille (Van
de Brink et al. 1997), la forme des frustules (Roubeix et al. 2011a) et le nombre (Pérès
et al. 1996 ; Schmitt-Jansen et Altenburger 2005) peuvent s’avérer être affectés par la
présence du contaminant. Les déformations de frustules sont soit un dommage du pes-
ticide, soit un mécanisme de défense pour limiter les transports de diffusion (Pérès et
al. 1996).
Après une contamination, il semble que les phénomènes de résilience soient d’une longueur
temporelle variable suivant l’âge du biofilm (de 1 à 2 mois) (Rimet et al. 2005 ; Dorigo et al
2010 ; Morin et al. 2010). Une des explications donnée par les auteurs était l’âge important du
biofilm qui est de ce fait essentiellement dominé par des facteurs autogènes (Lyautey 2005)
ou par la présence de processus d’immigration et d’émigration (Stevenson et Peterson 1989
et 1991).
D’un point de vue écologique, toutes ces altérations (sur le compartiment bactérien ou
algal) susceptibles d’engendrer des modifications de fonctions et de structure, peuvent (i)
provoquer des modifications au niveau des interactions bactéries / algues au sein même de
l’agrégat, et (ii) entraîner de plus grandes conséquences à l’échelle des écosystèmes, de part
leur position à la base du réseau trophique des milieux lotiques, leurs contributions aux cycles
II.3. Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique 42

biogéochimiques et leurs influences dans la chimiodynamique des polluants (biodégradation,

adsorption) (Brock et al. 2004) (Figure 17).

Figure 17 – Impacts potentiels d’un polluant sur le fonctionnement général d’un écosystème (extrait
de Boudou et Ribeyre 1997)

Il est donc difficile de distinguer l’impact des pesticides et des autres facteurs environne-
mentaux. Par exemple, il a été souligné que dans certains cas, les pesticides et les nutriments
ont des effets antagonistes (Lozano et Pratt 1994). De même, un ensemble de pesticides peut
présenter des effets antagonistes ou synergiques. Par exemple, des herbicides comme l’ala-
chlore (Carder et Hoagland 1998) et le chlorothalonil (DeLorenzo et Serrano 2003) agissent
en synergie avec l’atrazine.
L’impact d’un pesticide sur les biofilms dépend également de sa biodisponibilité (Serra et
al. 2009), c’est à dire de sa répartition soit dans la matrice du biofilm, soit dans la colonne
d’eau. La biodisponibilité d’un pesticide est conditionnée par les propriétés de la molécule
mais également par les conditions physico-chimiques (Nikkila et al. 2001). Il est nécessaire de
mesurer la fraction du pesticide qui est absorbée par le biofilm (Lawrence et al. 2001 ; Bohuss
et al. 2005 ; Tlili et al. 2008).
 Chapitre III

Etude de cas : l’alachlore

III.1 Présentation de la molécule d’alachlore

L’alachlore (C4 H2 0ClNO2 ) est un herbicide de pré-émergence de la famille des chloroacé-
tanilides. Il est utilisé comme inhibiteur de la plupart des herbes annuelles, et à larges feuilles,
sur des cultures de pré-émergence de maïs et de soja. Il se présente sous la forme d’un solide
cristallin inodore. Les caractéristiques physico-chimiques de la molécule sont présentées dans
la Figure 18.

A B

Figure 18 – Formule chimique développée (A) et caractéristiques physico-chimiques de l’alachlore

(B). Kow représente le coefficient de partage octanol / eau et Koc représente le potentiel de rétention
de l’alachlore sur la matière organique du sol

Devault (2007) qualifie ces herbicides de pré-levée des « plus critiques des herbicides »
car ils sont utilisés souvent sur des sols nus avant la germination des semences. Ils sont ainsi
particulièrement exposés aux processus de transport des matières organiques, de la parcelle
de sol aux milieux aquatiques notamment lors de fortes précipitations, surtout durant la
période printanière. D’un point de vue législatif, l’alachlore est interdit au Canada depuis
1975 et en France depuis 1998. La concentration maximale permise pour la présence d’un
seul pesticide et de ses métabolites dans les eaux destinées à la consommation est de 0,1
µg.L−1 selon la DCE, et aux USA, le seuil limite est de 2 µg.L−1 .
III.2. Mode d’action de l’alachlore 44

Parmi la grande famille des chloroacétanilides (butachlore, alachlore, acétolachlore, mé-

tazachlore et métolachlore, propachlore, dimethachlore. . . ), l’alachlore, le métolachlore et
l’acétolachlore présentent des structures physiques similaires.
Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne, la molécule de l’alachlore est classée
comme « substance prioritaire » par la commission européenne (Directive 2000/60/EC (De-
benest 2007)) et qualifiée de cancérigène (classe 2) par l’US EPA 1993. Cette molécule est
un des principes actifs du produit commercialisé, Lasso.

III.2 Mode d’action de l’alachlore

La famille des Chloroacétanilides regroupe un ensemble d’herbicides inhibiteurs cytoso-
liques des « élongases » ou « synthétases » qui sont des enzymes de la molécule nodale de
la synthèse des acides gras à longues chaînes, des terpénes, des terpénoïdes et des protéines
(Devault 2007) chez les plantes et les algues (Böger et al. 2003). Ces herbicides vont affecter
la stabilité et la perméabilité de la membrane plasmique et les fonctions nécessaires pour
la division et l’élongation des cellules, ce qui va engendrer une inhibition de la croissance
et de la division cellulaire et parfois la mort des plantes suivant les quantités. Le processus
engendré par ces enzymes « élongases » est un processus métabolique vital. Les enzymes ont
été localisées dans les membranes du réticulum endoplasmique, un environnement lipophile.
Junghans et al. (2003) ont comparé la toxicité (EC50 ) de plusieurs herbicides de la famille des
chloroacétanilides en fonction de leurs valeurs de log Kow . Ils observent une relation linéaire
entre le caractère lipophile et la toxicité des molécules (Figure 19).

Figure 19 – Corrélation entre les

valeurs de log Kow et EC50 pour
8 chloroacétanilides : 1, butachlore ;
2, prétilachlore ; 3, acétolachlore ; 4,
alachlore ; 5, propachlore ; 6, méta-
zachlore ; 7, diméthachlore, et 8, mé-
tolachlore (extrait de Junghans et
al. 2003)

Les auteurs émettent l’hypothèse que cette corrélation peut refléter principalement les dif-
férences de propriétés des herbicides à passer dans les membranes cellulaires et à s’accumuler
dans la phase lipidique de la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Cependant une
III.2. Mode d’action de l’alachlore 45

augmentation de 1000 fois du Kow n’engendre qu’une augmentation de moins de 50 fois du

1/EC50 . D’après les auteurs, la possibilité qu’une répartition hydrophobe dans la membrane
du RE qui ne soit pas le seul pré-requis pour l’interaction de l’herbicide avec l’enzyme, pour-
rait expliquer ce décalage. L’affinité au domaine de liaison de l’enzyme ciblée doit également
être un facteur crucial, et semble être gouvernée également par des propriétés électroniques
et stériques de la molécule en question. Le panel de valeurs d’EC50 observées pour l’ensemble
des herbicides de cette même famille peut s’expliquer par leurs différences de caractère lipo-
phile. Une étude sur l’algue verte Scenedesmus actus montre une rétention de l’acétate plus
faible liée à une diminution de l’incorporation à l’intérieure des lipides acyl lorque que les
cellules sont en contact avec l’alachlore (Weisshaar et boger 1987).
Une étude a montré que 30 minutes est le temps nécessaire à la fixation du métozachlore à
la synthétase (ou élongase) des acides gras à chaînes longues. Il s’est avéré que cette fixation
est irréversible (Mohr et al. 2008), suggérant un effet des chloroacétanilides à l’échelle des
cellules irréversible comme ceux induits par les herbicides inhibiteurs de la photosynthèse
(Vallotton et al. 2008).
Vallotton et al. (2008) ont cherché à évaluer à quel moment du développement d’une
algue verte Scenesdesmus, le S-métolachlore a le plus d’effet. Le cycle de développement de
l’algue verte Scenesdesmus se déroule en deux phases, de la façon suivante : une phase de
croissance cellulaire qui se déroule durant la période d’éclairage et une phase de division
cellulaire qui se déroule durant la phase d’obscurité du cycle. Etant donné que les processus
de formation des acides gras à longues chaînes se déroulent pendant la phase d’éclairage
(Cedergreen et al. 2005), les auteurs concluent que c’est durant la phase de division cellulaire
que le chloroacétanilide est susceptible de présenter le plus de perturbations. Cette inhibition
se matérialise par une inhibition de la reproduction ou division cellulaire, étape qui arrive
en fin de phase de croissance et qui se matérialise par une augmentation du volume des
cellules. Fedike (1982) observe également une inhibition de la division cellulaire sur l’algue
verte Chlamydomonas durant son exposition à l’alachlore. Une étude enregistrait des effets
négatifs du métolachlore pour les algues vertes alors que les diatomées et les cryptophytes
semblaient insensibles (Rohr et al. 2006). Les teneurs et compositions en acides gras des algues
peuvent varier en fonction des conditions environnementales (température, concentration en
nutriment, intensité lumineuse, etc...) (Mohr et al. 2008). Par exemple Rohr et al. (2006)
observaient une sensibilité vis à vis du métolachlore plus importante de la part des algues
vertes en comparaison aux diatomées et aux cryptophytes. Des études ont pu montrer que
certaines espèces sont capables de remplacer les acides gras à longues chaines constituant leur
membrane ou paroi, par d’autres composés (Couderchet et al. 1995 ; SchmalfuB et al. 1998).
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 46

Ainsi, ce sont les espèces qui contiennent de très grandes quantités d’acides gras à longues
chaînes qui risquent de présenter de fortes sensibilités aux chloroacétanilides.

III.3 Chimiodynamique de l’alachlore

Comme souligné précédemment, l’alachlore une fois appliqué au sol va être soumis à
une combinaison de processus (biotransformation, photodégradation, adsorption, volatilisa-
tion. . . ) qui vont contrôler sa persistance, sa biodisponibilité au sein des écosystèmes aqua-
tiques (eaux de surfaces ou souterraines) et sa toxicité sur les organismes (Stamper et Tuo-
vinen 1998). Suivant les écosystèmes considérés (sols, eaux de surface ou eaux souterraines),
le temps de demi-vie de l’alachlore varie (Tableau 4). La persistance de l’alachlore est plus
grande dans les environnements les plus saturés (aquifères, Novick et al. 1986 ; Pothuluri et al.
1990 ; Cavalier et al. 1991), et la biotransformation de l’alachlore apparaît être généralement
plus lente dans les eaux, peut être dû à un contenu plus faible en micro-organismes.
L’alachlore est considéré comme relativement mobile dans le sol. Albanis et al. (1998)
considèrent que le pouvoir lessivable de l’alachlore au vu de ses propriétés est relativement
faible sans pour autant être absent (Fava et al. 2000). La mobilisation augmente avec la
quantité de matière organique et d’argile dans le sol (Guo et al. 1993). Weber et Peter (1982)
observent une fixation du calcium dans l’argile avec les groupements carboxyles de l’alachlore.
L’adsorption des chloroacétanilides augmente avec la diminution de la température. Le pH, à
des valeurs inférieures à 7, a peu d’effet sur l’adsorption des chloroacétanilides, par contre pour
des valeurs de pH supérieures, l’adsorption augmente, donc le lessivage diminue (Chesters et
al. 1989).
La volatilisation dans le sol dépend de la pression de vapeur saturée, de la solubilité dans
l’eau, du contenu en eau du sol, de la porosité, de la densité, des matières organiques, de la
température, de la présence d’argile, de la vitesse du vent, de l’humidité, et de la précipitation
(Chesters et al. 1989 ; Gish et al. 1995). L’alachlore, avec une constante de Henry de 1,3.10−6 ,
est considéré comme peu volatile (Chesters et al. 1989). Toutefois, dans certaines conditions,
les processus de volatilisation peuvent apparaitre au niveau du sol lorsque que celui-ci est
humide et associé à un vent fort (Clay et al. 2004).
La biodégradation de l’alachlore a été détectée plusieurs fois dans le sol (Sun et al. 1990 ;
Thurman et al. 1996 ; Rodriguez-Cruz et Lacorte 2005), bien que l’alachlore soit très peu
minéralisé (Alkhabib et al. 2002). Des bactéries et des champignons isolés montrent une
capacité à dégrader les chloroacétanilides (Sette et al. 2004). Cette biodégradation dépend à
la fois de la concentration en herbicide, de la température du sol (Selim et al. 2002 ; Sette
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 47

Temps de demi-vie
Milieu Explication de la variabilité Références
(en jours)
"large" microcosme (202 litres) 47,2
"petit" microcosme (0,78 litres) 18,8
"large" microcosme (202 litres) + sédiment 22,8 Laabs et al 2001

"petit" microcosme (0,78 litres) + sédiment 4,9

21 Graham et al 2000
Anaérobie 9,7
Aérobie 21
Gradient d'oxygène + riche en nutriment 22 Graham et al 2000
Les eaux de surfaces

Gradient d'oxygène + pauvre en nutriment 46

oligotrophe 86
mésotrophe 56
Knapp et al 2003
oligotrophe 36
Hypereutrophe 22
grande et moyenne quantité de lumiére 5 à 60
Ensz et al 2003
obscurité > 180
7 à 14 Chester et al 1989
15 à 30 Leonard, 1988
40 à 70 Teissier et al 2005
15 à 30 Kolpin et al 1996
7,8 Ramesh et al 2004
8 Aga et Thurman 2001
Diverses caractéristiques des sols
5,2 Fava et al 2000
Sol
Rodriguez-Cruz et Lacorte 2005
6,5 Locke et al 1996
4 à 50 Clay, 2004
11 Chirnside et al 2007
sous climat tempéré 14 à 49
Laabs et al 2002
sous climat tropical 1à6
teméprature/ concentration initiale en
808 à 1518 Cavalier et al 1991
alachlore / profondeur
Les eaux souterraines
400 Perry, 1990
aérobie ou anaérobie 23 à 66 Pothuluri et al 1990

Tableau 4 – Temps de demi-vie de l’alachlore dans différents environnements

III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 48

et al. 2004 ; Wang et al. 2009) et de la complexité de la communauté microbienne (Wang et

al. 2008). Par exemple, Wang et al. (2008) observent qu’une température de 30˚C est la plus
favorable.
La photodégradation n’est pas le mécanisme prédominant de la dissipation de l’alachlore
du sol ou du milieu aquatique (Graham et al. 2000b ; Ryu et al. 2003). La dégradation par
voie chimique dans le sol apparaît être un processus susceptible d’être significatif suivant les
caractéristiques physico-chimiques du sol (Chesters et al. 1989). En ce qui concerne la pho-
todégradation indirecte de la molécule (Miller et al. 2005), les matières organiques dissoutes,
les teneurs en nitrates et le type d’eau sont des facteurs importants car ils absorbent la lu-
mière (Bahena et al. 2006). Lors d’une étude réalisée par Chiron (2005), avec une solution
de 4 mg.L−1 de substances humiques, la demi-vie de l’alachlore est de 84 à 150 minutes pour
une irradiation d’intensité 550 W.m−1 et de spectre de 300 à 800 nm. Tissier et al. (2005)
trouvent un temps de demi-vie de 2 heures à 239 jours pour l’alachlore.
De nombreux produits de dégradation biotiques ou abiotiques ont été mis en évidence
(Chesters et al. 1989 ; Galassi et al. 1996 ; Stamper et Tuovinen 1998 ; Fava et al. 2000) dans
le sol comme en milieu aquatique. Parmi les plus détectés, l’alachlore ESA (Ethane Sulfonic
Acid ) et OA (Oxanilic Acid ) font l’objet de nombreuses études (par exemple Graham et
al. 1999 ; Kalkhoff et al. 1998), et présentent des toxicités relativement faibles (Heydens
et al. 2000). D’autres produits de dégradation des chloroacétanilides ont été montrés comme
possédant une toxicité similaire voire supérieure aux molécules mères (Osano et al. 2002). Les
OA et ESA métabolites résultent d’un enlèvement de l’atome de chlore associé à l’arrivée d’un
groupe fonctionnel acide sulfonique (Figure 20). Généralement ces molécules métabolites
sont plus stables, avec des poids moléculaires plus faibles que la molécule mère (alachlore =
270) ou très proche (ESA = 314) et sont oxydés, leur donnant une plus grande solubilité et
un plus grand potentiel de lessivage (Potter et Carpenter 1995), ce qui explique leur présence
dans les eaux de surface, parfois sous de plus fortes concentrations que l’alachlore (Kolpin et
al. 1998 ; Kalkhoff et al. 1998).
Quel que soit le type de milieux considéré (sol ou aquatique), l’alachlore semble principa-
lement être dégradé via des processus biologiques comme l’ont observé entre autres Stamper
et Tuovinen (1998) pour le sol, et Knapp et al. (2003) en milieu aquatique. Knapp et al.
(2003) ont constaté que 90 % de l’alachlore est dégradé uniquement par voies biotiques. La
minéralisation complète de cette molécule est également rare en milieu aquatique (Novick et
Alexander 1985 ; Graham et al. 1999). Pour le cas de l’acétolachlore qui présente une struc-
ture similaire à l’alachlore, Brohuss et al. (2005) enregistrent sur une dissipation totale de la
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 49

molécule (45 %) : 1,3 % de disparition associée à la photodégradation, 0,64 % à l’adsorption

et 96 % à la biodégradation.
Des études ont montré que l’alachlore est transformé très rapidement en ESA ou OA
alachlore, via la Glutathione S-Transférase (GST) qui entraine la disparition de l’atome de
chlore affaiblissant le caractère toxique de la molécule d’origine et qui augmente son potentiel
de transport par ruissellement (par ajout d’une structure ionique). Ce processus a été observé
dans le sol (Thurman et al. 1996) mais également dans les eaux de surface (Graham et al.
2000b) et souterraines (Fields et Thurman 1996). L’alachlore est associé à un tripeptide (le
glutathione), qui va former un pont avec l’alachlore au niveau de son sulfure catalysé par
la GST, formant des métabolites sulfonés. Le glutathione est un tripeptide ubiquiste qui,
en réagissant avec un composé électrophile exogène ou endogène, peut former un produit
de dégradation moins toxique et plus soluble dans l’eau. Ces réactions sont catalysées par
les enzymes GST (Thurman et al. 1996 ; Vuilleumier 1997). Elles sont retrouvées dans la
plupart des organismes : plantes, animaux, protozoaires, champignons et bactéries (Thurman
et al. 1996 ; Field et Thurman 1996). Ces réactions sont réalisées au cours d’un processus
de détoxication des molécules (Vuilleumier 1997). L’apparition de la GST est liée à des
phénomènes de résistances et d’adaptations à différents stress chimique ou physique dans
l’environnement (Field et Thurman 1996) tels qu’une exposition à un herbicide (Feng et al.
1991), un hydrocarbure polycyclique aromatique (Lyoyd-Jones et al. 1997). Actuellement, de
nombreuses études ont pu mettre en évidence ces réactions de conjugaison : chez les plantes
pour des voies de détoxication aux herbicides (par exemple : Labrou et al. 2005 dans le maïs)
chez les algues et chez les microorganismes du sol (champignons ou bactéries) (Zablotowic et
al. 1995).
Certaines études montrent que la biotransformation de cette molécule se fait par co-
métabolisme (Novick et Alexander 1985 ; Ensz et al. 2003). La présence d’une autre source
de carbone comme le glucose ou le saccharose permet d’améliorer cette biodégradation. L’uti-
lisation de l’alachlore comme source d’azote n’a pas été fermement démontrée (Stamper et
Tuovinen 1998).
Le tableau 4 montre bien la diversité des temps de demi-vie dans les eaux de surface,
associée à une grande variabilité des conditions environnementales. La biotransformation de
l’alachlore en milieu aquatique dépend de plusieurs paramètres :
– La teneur en phosphore total (Pt). En effet dans les milieux aquatiques les valeurs de
Pt sont souvent limitantes, ce qui peut réduire l’activité microbienne. La biodégradation
s’est avérée plus efficace dans un système aquatique riche en nutriments (Novick et
Alexander 1985 ; Graham et al. 2000b ; Knapp et al. 2003 ) ;
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 50

Figure 20 – Voies potentielles de dégradation de l’alachlore dans le sol (extrait de Field et Thurman
1996)
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 51

– .Les microorganismes présents. Knapp et al. (2003) observent que la dégradation de

l’alachlore est plus efficace lorque les « Bacteria » et « Eucaryote » sont actifs. En
effet, si l’on suit l’hypothèse de Graham et al. (2000b) et Thurman et al. (1996) sur la
biodégradation, les GSTs sont des enzymes communes aux deux domaines (Vuilleumier
1997) ;
– .La teneur en carbone autochtone. Il pourrait se produire deux phénomènes simultanés,
premièrement une dégradation du carbone de fort poids moléculaire par les bactéries
et deuxièmement une dégradation du carbone de faible poids moléculaire issu de la
production primaire (Ensz et al. 2003). Le rajout de glucose par Novick et Alexander
(1985) a entraîné dans son milieu d’étude un taux de dégradation plus important ;
– .L’intensité lumineuse. Ensz et al. (2003) font varier l’intensité lumineuse dans leurs
microcosmes aquatiques. Une réduction de la lumière (de 1200 à 240 µE.m−2 .s−1 ) sur
la colonne d’eau provoque une diminution de la production de carbone disponible au-
tochtone limitant ainsi le taux de dégradation.
– Le contenu en oxygène et des teneurs en nutriments. Le taux de biodégradation en condi-
tion anaérobie est plus élevé (Graham et al. 2000b). Il existe donc une corrélation im-
portante entre la teneur en nutriments (phosphore total, nitrates et carbone organique)
de la colonne d’eau et le taux de dégradation de la molécule d’alachlore uniquement
sous un fort éclairage (Graham et al. 1999). Le carbone organique dissous présent dans
la colonne d’eau ne joue pas seulement le rôle de surface d’adsorption comme pour la
plupart des composés hydrophobes, mais également le rôle de source de carbone pour
la croissance et pour le co-métabolisme des micro-organismes
– Les concentrations initiales en alachlore. Galassi et al. (1996) observent une biodégra-
dation d’autant plus grande que la concentration en alachlore est faible ;
– La taille des microcosmes. Laabs et al. (2007) montrent que les temps de demi-vie sont
plus faibles d’un facteur 2 dans les microcosmes de plus petite taille (0,78 L) par rapport
aux microcosmes de plus grande taille (202 L).
En plus de ces facteurs, nous pouvons supposer que le ratio biomasse sur la quantité en
alachlore ainsi que la composition en espèce, dans une hypothèse où la capacité de biodégra-
dation de l‘alachlore est un mécanisme non ubiquiste, sont susceptibles d’influencer les taux
de biodégradation de l’alachlore.
III.3. Chimiodynamique de l’alachlore 52

Concentration (µg.L-1)
Date d'échantillonnage Rivière d'étude Pays Référence
Moyenne Min Max

Nov 1999-Mars 2000 Stream Brésil nd 0,004 0,009 Laabs et al. 2002

Nov 1999-Mars 2000 River Brésil nd 0,003 0,016 Laabs et al. 2002

Nov 1999-Mars 2000 Surface waters Brésil nd 0,007 0,019 Laabs et al. 2002

1981-1987 Sydenham river Canada 2 0,9 3,4 Kimbrough et al. 1996

Printemps-Automne 2005-2006 Llobrega river bassin Espagne nd 0,0922 0,0171 Ricart et al. 2010

2004-2006 Ebro river Espagne nd 0,005 0,272 Navarro et al. 2010

Mai à Aout 2005 Ebro river Espagne 15,8 nd 62,9 Kuster et al. 2008

Octobre 1997 Surface waters Espagne 6,13 0,06 20,9 Sanchez-Camazano et al. 2005

Avril 1998 Surface waters Espagne 7,95 0,09 31,9 Sanchez-Camazano et al. 2005

Octobre 1998 Surface waters Espagne 2,35 0,63 8,5 Sanchez-Camazano et al. 2005

Juin 1998-Décembre1998 Guarena, Almar rivers Espagne nd 0,09 0,16 Garabias-Martinez et al.. 2000

Mars 2008-Mars 2009 Save river France 0,007 - 0,05 Taghavi et al. 2011

1999-2007 Evros bassin Gréce nd nd < 1,2 Vryzas et al. 2009

Mai 1996-Avril 1997 Central Macedonia Gréce 0,005 - 0,023 Albanis et al. 1998

Mai 1996-Avril 1997 Central Macedonia Gréce 0,002 - 0,037 Albanis et al. 1998

Mai 1996-Avril 1997 Central Macedonia Gréce 0,02 - 0,265 Albanis et al. 1998

1993-1994 Axios river Grèce nd - 0,26 Papadopoulou-Mourkidou 2004

1997-1998 Axios river Grèce nd - 0,031 Papadopoulou-Mourkidou 2004

1998-1999 Kalamas river Grèce nd - 0,939 Albanis et al. 2004

1998-1999 Louros river Grèce nd - 1,026 Albanis et al. 2004

1994 Po et Olona river Italie nd nd 0,007 Galassi et al.1996

Mars 1998- Aout 1998 Nzoi river Kenya nd 0,02 0,35 Osano et al. 2003

1996-1998 Scheldt river Pays-Bas nd 0,002 0,1 Konstantinou et al. 2006

Juin 2004 Vela Lake Portugal 1,13 à 3,26 nd nd Abrantes et al. 2010

Octobre 2004 Vela Lake Portugal 1,68 à 7,61 nd nd Abrantes et al. 2011

Avril à Juillet 1999 River Portugal nd 0,02 5,4 De Almeida et al. 2000

1990-1993 Midwestern rivers and reservoir USA < 0,05 nd nd Thurman et al. 1996

1990-1991 Minnesota river USA nd nd 2,4 Schottler et al. 1994

Mars 1999-Mai 2000 Mississippi river USA nd 0,05 0,18 Rebich et al. 2004

1998 Midwestern streams and rivers USA nd 0,045 17,2 Battaglin et al. 2000

2002-2003 Ground water Southwest Georgia USA nd - 0,521 Dalton et Frick 2008

Avril 1991 - Décembre 1997 Mississippi river USA nd nd 2 Clark et Goolsby 2000

1989 Midwestern streams USA 1,9 nd nd Scribner et al. 2000

1995 Midwestern streams USA 0,13 nd nd Scribner et al. 2000

1998 Midwestern streams USA 0,05 nd nd Scribner et al. 2000

1991-1998 White river, Indiana USA nd nd 3 Crawford 2001

Tableau 5 – Concentrations en alachlore des eaux de surface selon différentes localisations et

périodes de détection. (nd = donnée non disponible)
III.4. Contamination des eaux de surface par l’alachlore 53

III.4 Contamination des eaux de surface par l’alachlore

L’alachlore appliqué à un sol, sera soit transporté vers les eaux souterraines par infil-
tration, soit vers les eaux de surface (lotique et lentique) par ruissellement (Postle et al.
2001). Dans cette partie, nous nous focalisons uniquement sur la contamination des eaux
de surface par l’alachlore. Le tableau 5 montre bien la répartition mondiale d’utilisation
de l’alachlore. Dans la plupart des études, les auteurs n’enregistrent que de faibles concen-
trations (< 30 µg.L−1 ) dans les écosystèmes aquatiques d’eau douce. Différents paramètres,
incluant la proximité entre le site d’application et l’eau de surface, le type de terrain et le
sol, les pratiques agricoles, la pluviométrie, la période d’étude... peuvent expliquer ces écarts
de concentrations inter et intra sites d’étude.
Parmi les produits de dégradation de l’alachlore (biotique ou abiotique), OA et ESA sont
les plus recherchés (par exemple Thurman et al. 1996 ; Rebich et al. 2004 ; Sanchez-Camasano
et al. 2005).

III.5 Impact de l’alachlore au sein des milieux aquatiques

Généralement le potentiel toxique d’un pesticide est évalué à partir de tests écotoxico-
logiques le plus souvent monospécifiques et réalisés sur du cours terme. Lors de ces tests,
la toxicité potentielle de la molécule est basée sur le calcul de l’EC50 , correspondant à la
concentration qui engendre 50 % d’inhibition des individus de la population. Comme nous
le montre le tableau 6, de nombreux tests ont été réalisés afin d’évaluer la toxicité de l’ala-
chlore sur des vertébrés, des invertébrés et des producteurs primaires. Parmi les producteurs
primaires, les tests sont généralement utilisés sur les algues vertes (Scenedesmus et Chlorella)
et beaucoup moins sur les cyanobactéries ou les diatomées. Ces données soulignent bien les
différentes valeurs d’EC50 qui ont été enregistrées. La toxicité varie en fonction des espèces,
mais également du design expérimental tels que la taille des microcosmes, la durée de l’expé-
rience, la mesure de l’EC50 (chlorophylle a, nombre de cellules. . . ) et le groupe taxonomique
de l’espèce (Pavlic et al. 2006). Par exemple pour des tests sur l’algue verte Scenedesmus
capricornutum, Fairchild et al. (1998) observent des valeurs d’EC50 comprises entre 4 et 9
µg.L−1 alors que Pavlic et al. (2006) observent des valeurs comprises entre 12 et 15 µg.L−1 .
A notre connaissance, peu de données sont disponibles dans la littérature en ce qui
concerne la toxicité des principaux produits de dégradation (OA et ESA). Bian et al. (2009)
enregistraient une valeur d’EC50 (à 96 h) sur des espèces d’algues vertes de 0,019 à 0,037
µg.L−1 pour l’alachlore contre des valeurs d’EC50 > 1000 µg.L−1 pour ESA alachlore, sug-
gérant une toxicité plus faible de la part du métabolite. Les quelques études à ce sujet
III.5. Impact de l’alachlore au sein des milieux aquatiques 54

Temps
Valeur moyenne
Types d'organismes Espèces d'exposition Paramètres mesurés Référence
EC50 (µg.L-1)
(heures)
Daphnia sp. 48 nd 13 (LC50) Abrantes et al. 2010
Activité non spécifique de
0,75 1,49.105 (LC50)
Tetrahymena pyriformis l'estérase
Bonnet et al. 2007
Invertébrés Taux de croissance de la
12 8,9
population
Daphnia sp. 48 nd 53,06 Ansara-Ross et al. 2008
Chironomus riparius 96 Luminescence 1,7.104 (LC50) Osano et al. 2002
Lemna gibba nd nd 340 Battaglin et Fairchild 2002
Lemna minor 96 Quantité de biomasse 198 Fairchild et al. 1997
Ceratophyllum demersum 85
Plantes aquatiques Najas sp. 584
Lemna minor 336 Chlorophylle 482 Fairchild et al. 1998
Elodea canadensis > 3000
Myriophyllum heterophyllum > 3000
Chlamydomonas eugametos 48 Chlorophylle totale 2700 Hess 1980
Selenastum capricornutum 10
Chlorella vulgaris 26
Chlamydomas reinardih 460
Scenedesmus quadricauda 1328 Fairchild et al. 1998
Microcyctis sp. 96 Chlorophylle > 3000
Anabaena flosque > 3000
Ceratophyllum 85
Pseudokirchneriella subcapitata 10 Fairchild et al. 1998
Pseudokirchneriella subcapitata nd Tomlin 2000
Scenedesmus vacuolatus 24 Reproduction 37,8 Junghans et al. 2003
Producteurs 12 (bioessai en bécher)
Pseudokirchneriella subcapitata
primaires 15 (en microplaque)
880 (en bécher)
Desmodesmus subspicatus 72 Densité Pavlic et al. 2006
995 (en micoplaque)
22 (en bécher)
Chlorella kessleri
32 (en microplaque)
Scenedesmus obliquus 96 Croissance 27 Bian et al. 2009
Chlorella vulgaris nd nd 5,54.103 Yang et al. 2004
Scenedesmus capricornutum nd nd 1,64 US EPA
Scenedesmus capricornutum 96 Quantité de biomasse 6 Fairchild et al. 1997
Assimilation 7,5.104
Scenedesmus subspicatus 24 Zagorc-Koncan 1996
Croissance 3,5.103
Scenedesmus vacuolatus 24 Reproduction 0,14 µM Junghans et al. 2006
0,5 1,28.105
Inhibition de la Bonnet et al. 2007
Bactérie Vibrio fischeri 0,25 2,06.105
bioluminescence
0,25 589 Osano et al. 2002

Tableau 6 – Toxicité de l’alachlore sur différents organismes basée sur des paramètres d’écotoxico-
logie (EC50 et dans certains cas LC50 ). (nd = donnée non disponible)

suggèrent que ESA et OA alachlore sont moins toxiques que l’alachlore (Bian et al. 2009).
Les métabolites des chloroacétanilides sont souvent considérés comme non mutagènes et non
génotoxiques bien que certains ont été soulignés plus tératogènes que leurs molécules mères
(Tessier et Clark 1995 ; Heydens et al. 2000).
Les valeurs d’EC50 mesurées sont souvent nettement supérieures aux concentrations en
alachlore détectées dans les eaux de surface. Sur la base de ces tests standardisés monospé-
cifiques, l’alachlore présente une toxicité chronique modérée pour les vertébrés et invertébrés
aquatiques et globalement peu toxique pour les producteurs primaires (algues ou plantes)
(US EPA 1997). Une étude réalisée dans un lac du Portugal a détecté des concentrations
importantes d’alachlore dans des tissus de poissons, 0,16 et 0,08 µ.g.kg−1 de tissus de Mi-
III.6. L’alachlore et les biofilms phototrophes 55

cropterus salmoides, en octobre 2004 et juin 2004, et 0,19 µ.g.kg−1 de tissus de Cyprinus
carpio (Abrantes et al. 2010). Les différents habitats et stratégies d’alimentation peuvent
expliquer les quantités différentes d’alachlore accumulées dans les tissus des deux espèces
de poissons. M. salmoides est un poisson prédateur appartenant à des niveaux trophiques
supérieurs. Dans un environnement aquatique, la présence de ces poissons contaminés peut
engendrer des effets sur la santé humaine et des phénomènes de bioaccumulation d’un échelon
à l’autre de la chaîne trophique.

III.6 L’alachlore et les biofilms phototrophes

Peu d’études se sont intéressées à l’impact de l’alachlore sur les biofilms phototrophes
à l’échelle des communautés (Krieger et al. 1988 ; Spawn et al. 1997 ; Carder et Hoagland
1998...), en comparaison aux herbicides inhibiteurs de la photosynthèse (e.g. Debenest et al.
2009). De nombreux auteurs observent des dommages plus marqués de la part des inhibiteurs
de la photosynthèse, comparés aux dommages engendrés par les herbicides de la famille des
chloroacétanilides (exemple Debenest et al. 2009). Cette différence vient probablement des
modes d’actions différents de ces deux types de famille et la fonction de détoxication des
chloroacétanilides par les organismes via la GST. Globalement une exposition à des concen-
trations importantes en alachlore (5 µg.L−1 ) induit une réduction des teneurs en chlorophylle
a, et de la densité algale (Carder et Hoagland 1998 ; Spawn et al. 1997). Pour des concentra-
tions plus élevées (> 30 µg.L−1 ), la composition algale peut être affectée (Carder et Hoagland
1998). Certaines espèces se présentent comme directement tolérantes à l’alachlore, c’est le cas
de F. crotonensis (diatomée) ou de Chlorella vulgaris (algue verte), et d’autres semblent plus
sensibles comme M. varians (diatomée) ou Cladophora glomerata (algue verte) (Carder et
Hoagland 1998 ; Mohr et al. 2008). Mohr et al. (2008) suggéraient que la faible sensibilité de
C. vulgaris à une exposition au métozachlore pouvait venir de sa faible quantité en acides
gras à longues chaînes.
Vu les fortes similarités du mode d’action des chloroacétanilides, nous pouvons nous ba-
ser sur les impacts engendrés par les autres chloroacétanilides sur les biofilms phototrophes.
Noack et al. (2003) et Debenest et al. (2009) obervaient pour des concentrations de 5 et 30
µg.L−1 , que le métolachlore et le métazachlore engendrent des inhibitions de la croissance
du biofilm illustrées par des teneurs en chlorophylle a plus faibles que les contrôles alors que
Roubeix et al. 2011a n’observaient pas d’effet sur la biomasse pour des biofilms phototrophes
exposés à 5 et 30 µg.L−1 de métolachlore. Les impacts sur la composition taxonomique des
diatomées ou des algues vertes sont espèces dépendantes, certaines espèces étant tolérantes
III.7. Les arguments du choix de l’alachlore 56

(Melosira varians, Nitzschia dissipata et Cocconeis placentula), d’autres sensibles (Eolimna

minima et Navicula reichardtiana). Certaines études ont pu montrer qu’à de fortes concen-
trations en métolachlore (environ 30 µg.L−1 , il est possible d’observer des déformations de
diatomées ou d’algues vertes (Liu et Xiong 2009 ; Roubeix et al. 2011a).
Il est important de rappeler le pouvoir adsorbant des biofilms vis-à-vis des métaux (Duong
et al. 2011) mais également vis-à-vis des herbicides (Lawrence et al. 2001, pour l’atrazine),
qui dépend du Koc du polluant (Junghans et al. 2003). Nous ne connaissons pas d’étude
focalisée sur l’adsorption de l’alachlore par les biofilms phototrophes. Bohuss et al. (2005)
observent seulement 1,3 % d’adsorption de l’acétolachlore par un biofilm. Il faut noter que
cette adsorption est susceptible de modifier la toxicité de l’alachlore vis-à-vis du biofilm. En
effet, la mobilité d’un herbicide dépend de sa distribution entre les phases liquide et solide,
ce qui va également agir sur sa biodisponibilité.

III.7 Les arguments du choix de l’alachlore

L’ensemble de ce travail a été réalisé autour d’un chloroacétanilide, l’alachlore, pour dif-
férentes raisons :
– Son mode d’action : l’alachlore est susceptible d’avoir des effets directs et indirects sur
les bactéries et sur les algues de nos communautés au sein des biofilms phototrophes ;
– C’est une molécule souvent détectée dans les eaux de surface, certes le plus souvent à
de faibles concentrations mais suivant une large répartition géographique. Ce qui peut
poser des problèmes (i) écotoxicologiques pour les organismes aquatiques autochtones
et (ii) de contamination de l’eau à potabiliser et des organismes aquatiques devenus
impropres à la consommation ;
– La présence des produits de dégradation notamment OA et ESA, détectés parfois en
plus fortes concentrations ;
– Les connaissances analytiques de nos collaborateurs ‘
 Partie II

Matériel et Méthodes
 Chapitre I

Sites d’étude et stratégies

d’échantillonnage

I.1 Choix des sites

Dans le cadre de cette thèse, trois sites d’échantillonnage ont été retenus pour la produc-
tion in situ sur des supports naturels ou artificiels et la collecte de biofilms phototrophes.
Ces trois sites présentent des caractéristiques environnementales spécifiques liées notamment
à leurs caractéristiques hydrauliques contrastées et leurs qualités chimiques de l’eau. Ils sont
localisés dans la région de Midi-Pyrénées, dans le sud-ouest de la France (Figure 21), au sein
du bassin versant de la Garonne qui s’étend sur 56 000 km2 . La stratégie a été de choisir des
sites d’étude les plus diversifiés possibles, en termes de faciès, de vitesse de courant, de statut
trophique, d’usage de pesticides, de type de substrats, etc. . . afin d’avoir un panel varié de
conditions environnementales. Au-delà de leurs caractéristiques morphologiques et physico-
chimiques différentes, d’autres critères ont été pris en compte : leur bonne accessibilité, la
possibilité de fixer facilement des supports artificiels et des distances raisonnables d’un site
à l’autre.

Figure 21 – Localisation géo-

graphique des 3 sites d’échan-
tillonnage des biofilms photo-
trophes (complété de Paule et
al. 2009). Nomenclature des
stations : M : Le Montoussé
à Auradé, S : La Save à Lar-
roque, G : La Garonne à
l’Aouach.
I.2. Présentation des sites 59

Caractéristiques des sites d’échantillonnage

Station M S G

Nom Le Montoussé La Save La Garonne

Type Ruisseau Rivière Fleuve

Localisation Auradé (32) Larroque (31) Aouach (31)

Coordonnées (43°33’55.06’N-01°03’30.92’E) (43°11’43.77’N-00°36’28.59’E) (43°23’N - 01°18’E)

Ordre de Strahler 1 6

Largeur (m) 1,5 6,7 100

Débit moyen (m3.s-1) nr nr 200c

Substrat Sédiment Banc de galets Banc de galets

Bassin Agricole Forestier

Pesticide Forte Faible Faible

Tableau 7 – Principales caractéristiques des sites d’échantillonnage M, S et G (nr = non répertorié,

c : source : http ://www.hydro.eaufrance.fr).

I.2 Présentation des sites

Les sites d’échantillonnage se situent sur des cours d’eau de différentes importances, au
niveau :
– d’un ruisseau, Le Montoussé (station annotée M),
– d’une rivière, La Save (station annotée S),
– et d’un fleuve, La Garonne (station annotée G).
Les principales caractéristiques des sites retenus sont résumées dans le tableau 7.

Le site d’échantillonnage M sur Le Montoussé (Figure 22, gauche), un ruisseau affluent

de La Save, est localisé à l’exécutoire d’un bassin versant agricole expérimental (328 hectares,
www.agriculteur-aurade.fr) en amont immédiat du village d’Auradé (Gers, France) situé à 40
km de la ville de Toulouse (Sud-ouest, France). Ce bassin versant est dominé par un paysage
agricole dont les principales cultures sont le tournesol et le blé (Taghavi et al. 2010). Il a fait
l’objet d’un suivi des concentrations en nitrates et en produits phytosanitaires durant une
décennie (Rapports de 1996 à 2006 de l’Association des Agriculteurs d’Auradé ; Debenest
2007). Le lit du ruisseau est sédimentaire (pas de substrat naturel du type rocher ou galet),
I.2. Présentation des sites 60

confiné (1,5 mètres de large) et très boisé. La profondeur de l’eau est au maximum de 50 cm
et la vitesse du courant, hors période de crue, était de 0,045 m.s−1 au moment de l’ensemble
de nos expériences (courantomètre, Flow-Mate model 2000, Marsh-McBirney Inc., USA).

Le site d’échantillonnage S sur La Save (Figure 22, milieu), une rivière affluent de La
Garonne, est localisé dans le bassin versant situé en amont des Gorges de La Save, à 2 km
en amont du village de Larroque (Haute-Garonne, France) et 80 km de la ville de Toulouse.
Le bassin est dominé par un paysage forestier avec la présence de pâturages. Le lit de la
rivière est très rocailleux et large de 6,7 mètres. La Save présente des périodes d’étiage avec
des profondeurs moyennes de 50 cm et une vitesse de courant de 1 m.s−1 en basses eaux et
3 m.s−1 en hautes eaux.

Le site d’échantillonnage G sur La Garonne (Figure 22, droite) est localisé au niveau du
village de L’Aouach (Haute-Garonne, France) situé à 36 km en amont de la ville de Toulouse.
De par son régime pluvionival, La Garonne a deux périodes d’étiage, une estivale et une hiver-
nale, avec des débits inter-annuels moyens de 200 m3 .s−1 (à la station de Portet-sur-Garonne,
Boulêtreau et al. 2006). Durant les périodes de basses eaux, le lit du fleuve a une largeur
de 100 mètres avec des profondeurs de moins de 1,5 mètres et une vitesse de courant de 0,5
m.s−1 à proximité du rivage. Son lit est constitué de graviers et galets, conditions favorables
au développement de biofilms phototrophes.

Figure 22 – Photographies des trois sites d’échantillonnage M (Auradé, à gauche), S (Larroque,

au milieu) et G (Aouach, à droite) prises au printemps (Photographie de droite de S. Teissier).
I.3. Caractéristiques physico-chimiques des stations 61

I.3 Caractéristiques physico-chimiques des stations

Le choix de ces trois sites d’échantillonnage a été influencé également par les connaissances
que nous avions sur leurs caractéristiques physico-chimiques grâce à des études réalisées anté-
rieurement. Ces sites présentent des niveaux trophiques et de contamination par les produits
phytosanitaires différents.

La figure 23 présente le degré de pollution en 2005 des eaux de surface par les nitrates
suivant la qualification de SeQeau (Debenest 2007). Notre station S se trouve à quelques
kilomètres en amont de la station « Gorges » (entourée sur la carte). Ce site S peut être qua-
lifié comme étant de bonne, voire de très bonne qualité, en terme de contamination des eaux
par les nitrates. Par contre, le site M (repéré sur la carte par Auradé) présente une qualité
mauvaise, voire très mauvaise, avec une eau ayant des concentrations en nitrates pouvant
dépasser le seuil de potabilité (50 mg.L−1 ).

Station M

Station S

Figure 23 – Qualité des eaux en 2005 à différentes stations du bassin versant Adour-Garonne,
selon leurs concentrations en nitrates (mg.L−1 )(extrait et modifié de Debenest 2007, source
www.adourgaronne.fr).

Les sites d’échantillonnage présentent également de fortes différences en ce qui concerne

les teneurs en pesticides. Lors de deux études réalisées en 2005, les analyses en pesticides dans
des échantillons d’eau non filtrés révèlent peu (non détectable) ou pas d’herbicides à proximité
I.3. Caractéristiques physico-chimiques des stations 62

des sites d’échantillonnage G et S (Figure 24A et B), alors qu’elles révèlent des concentra-
tions légèrement plus importantes au niveau du site d’échantillonnage M (Figure 24B).

Figure 24 – (A) Concentrations en herbicides des eaux de surface non filtrées à différents points
de prélèvement en amont et aval de l’agglomération de Toulouse, en mars 2005 (extrait de Devault
2007). (B) valeurs cumulatives des plus fortes concentrations totales en herbicides à différents points
de prélèvement, en 2005 et 2006 (extrait et modifié de Debenest 2007).

Sur le site M, les herbicides ne sont pas les seuls pesticides à être détectés dans les eaux
de surface : un suivi de 1996 à 2006 révèle également la présence de fongicides avec une forte
disparité d’une année à l’autre (Jankowski 2007). Vue la géomorphologie de cette station,
des études ont pu montrer de plus fortes concentrations en pesticides lors d’épisodes de crue
(Figure 25) (Taghavi et al. 2010).

Les résultats de qualité chimique de l’eau des sites présentés ici proviennent d’études
réalisées durant des années différentes de celles auxquelles nous avons effectué nos expériences.
D’une année sur l’autre, suivant les pratiques agricoles ou les conditions météorologiques, les
niveaux de contamination en pesticides peuvent varier. Même s’il est difficile dans ce genre
d’étude de définir un site de « référence » (Dermont 2002), dans le cadre de nos différentes
approches expérimentales, les sites G et S correspondent à nos points de « référence » en
terme de qualité chimique de l’eau en opposition au site M qui correspond au site susceptible
d’être le plus contaminé par les pesticides et les nitrates.
I.4. Dispositifs de collecte des biofilms phototrophes 63

Figure 25 – Concentrations en pesticides d’échantillons d’eau non filtrée prélevés au niveau de l’exu-
toire de bassin versant d’Auradé, au même emplacement que le site M mais à des dates différentes
(extrait de Taghavi et al. 2010)

I.4 Dispositifs de collecte des biofilms phototrophes

Dans le cadre de cette thèse, les biofilms phototrophes ayant colonisé des supports ar-
tificiels ou naturels sont collectés sur les sites d’étude présentés ci-dessus. L’utilisation de
supports artificiels s’est avérée très utile car le site M ne présentait aucun support naturel
pour le développement de biofilms phototrophes. D’une manière plus générale, l’utilisation
de substrats artificiels présente de nombreux autres avantages :
– faciliter les prélèvements in situ, le surfaçage des supports et leur transport jusqu’au
laboratoire,
– maîtriser le temps de production des biofilms phototrophes et ainsi en connaître l’âge
et le degré de maturation,
– limiter l’hétérogénéité intra-sites (Cattaneo et Amireault 1992).
La littérature rapporte de nombreux types de supports artificiels pour la production de
biofilms phototrophes (Aloi 1990), le plus utilisé étant des lames de verre (par exemple Morin
et al. 2008) que ce soit pour des études in situ (par exemple Dorigo et al. 2009 ; Duong et
al. 2010) ou en laboratoire (par exemple Bonnineau et al. 2010) parfois sablées, (Sabater et
al. 2002) ou dépolies (Dorigo et al. 2009) pour faciliter l’adhésion des micro-organismes. Il
est également utilisé des tuiles en céramique (Smucker et al. 2009), en argile cuites (Belanger
I.4. Dispositifs de collecte des biofilms phototrophes 64

et al. 1996), des briques, plaques ou billes de polystyrène, des fils de nylon, des bouées de
navigation (Vis et al. 1998), des substrats diffusant des nutriments (nutrient diffusive sub-
strate) (Hoch 2008), des supports en polyéthylène (Szlauer-Lukaze 2007), en polypropylène
(Jobger et al. 2005), en polycarbonate (Lawrence et al. 2000) et en polyuréthane (Boulêtreau
et al. 2010). Généralement les supports artificiels sont très souvent utilisés pour disposer
directement dans les micro/mésocosmes des supports préalablement colonisés par du biofilm
phototrophe en milieu naturel (par exemple Pérès et al. 1996 ; Schmitt-Jansen et Altenburger
2005 ; Debenest et al. 2009).

Dans le cadre de notre étude, suivant l’utilisation des substrats collectés que nous en
avons faite, pour des aspects pratiques, deux types de dispositifs de collecte associés à deux
types de substrats ont été utilisés :
i) un premier dispositif de collecte (nommé « cagette ») adapté des dispositifs de Morin
et al. (2008) et constitué de lames de verre (L x h : 244 x 78 mm) (Figure 26A) maintenues
verticalement sur leur largeur par des baguettes à relier, et disposées à l’intérieur de cagettes
en matière plastique ajourées (L x l x h : 400 mm x 300 mm x 100 mm ; volume : 12 L).
Chaque cagette contient quatre lames de verre et est recouverte d’un grillage de maille 5
mm pour limiter l’accumulation de sédiments et de débris plus grossiers transportés par la
colonne d’eau (Aloi 1990).
ii) un deuxième dispositif de collecte (nommé « coupons ») constitué de plaques en poly-
éthylène à haute densité (PEHD 300) (L x l x h : 100 mm x 50 mm x 5 mm) fixées par des
vis en inox sur des barres d’inox (Figure 26B). Ce dispositif contient 4 séries de 10 plaques
placées en parallèle les unes par rapport aux autres.
Les lames de verre et les plaques en polyéthylène sont disposées de telle sorte qu’elles soient
positionnées à la verticale de manière à limiter les dépôts sédimentaires, et parallèlement au
courant pour reproduire sur leurs surfaces les vitesses de courant qui agissent sur le fond du
cours d’eau. Ces dispositifs de collecte sont ainsi maintenus dans la colonne d’eau des sites
d’échantillonnage à environ 10 cm en dessous de la surface (Figure 27), attachés par des
ficelles soit aux arbres des berges soit à des piquets métalliques plantés dans les sédiments
du fond. Ils sont entourés par un grillage de maille 5 mm de manière à limiter l’abrasion par
l’accumulation de débris transportés par le courant (Figure 27).
A la fin de la période choisie de production des biofilms phototrophes sur les sites, les
dispositifs sont prélevés et transportés au laboratoire dans des glacières en polystyrène (700
mm x 500 mm x 400 mm), disposés à l’intérieur de sacs poubelle hydratés.
I.4. Dispositifs de collecte des biofilms phototrophes 65

A B

5cm 10cm

Figure 26 – Dispositifs de production et de collecte de biofilms phototrophes in situ : (A) avec les
lames de verre disposées à raison de 4 par cagette (1 lame = 1 réplicat) et (B) avec les plaques en
polyéthylène disposées à raison de 40 sur support métallique (1 plaque = 1 réplicat)

A B

Figure 27 – Dispositifs de collecte de biofilms phototrophes in situ avec les plaques en polyéthylène
(A), avec les lames de verre (B), maintenues dans la colonne d’eau ici du site M
 Chapitre II

Stratégies d’approche expérimentale

II.1 Approche expérimentale in situ

II.1.1 Objectif de l’étude

Une première expérience a été réalisée entièrement in situ sur les sites M et S du 22 mars
au 30 avril 2007 (période de stage de mon Master) pour recouvrir la période d’application
des pesticides sur le site M et la période où les débits d’eau rendent l’accès possible au site
S. L’objectif de ce travail était (i) d’évaluer les changements temporels d’une structure de
communautés bactériennes durant le développement in situ de biofilms phototrophes, (ii) de
comparer la structure entre deux sites d’étude différents et enfin (iii) d’évaluer l’influence
d’un processus de transplantation croisé entre ces deux sites réalisé durant le développement
des biofilms. La transplantation permettait de tester l’influence relative des facteurs auto-
gènes et allogènes durant le développement d’un biofilm. L’exploitation et la valorisation de
ces travaux ont été réalisés durant ma première année de thèse, en parallèle des étapes de
fiabilisation du réacteur annulaire rotatif.

II.1.2 Déroulement de l’étude

Cette étude s’est déroulée de la façon suivante (Figure 28) : à T0 , un lot de trois dis-
positifs de collecte de type « cagette » (12 lames de verre au total) a été positionné sur
chacun des deux sites M et S. Les cagettes sont positionnées en travers du lit de telle sorte
qu’elles soient dans des conditions de courant similaires. A l’issue d’une première phase de
production d’une durée de 3 semaines, pour chaque site, 4 des 12 lames sont prélevées au
hasard pour analyses du biofilm au laboratoire, 4 autres (également prélevées aléatoirement)
sont assemblées dans une nouvelle cagette, elle-même placée sur l’autre site d’étude (c’est le
processus de transplantation), et les 4 dernières lames restent sur place (Figure 28). Puis
une seconde phase de poursuite de développement des biofilms d’une durée de 2,5 semaines
a lieu au bout de laquelle toutes les lames sont récupérées et analysées au laboratoire (cf.
chapitre III). Notre choix de fixer la durée des deux phases consécutives de production du
biofilm à 5,5 semaines s’est basé sur la dynamique de croissance des biofilms phototrophes
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 67

connue en rivières (Boulêtreau et al. 2006) nous permettant de nous situer dans la période
d’accrétion du biofilm (Biggs 1996).

Site M (A)
M-M biofilms (AA)
M-biofilms
S-M biofilms (LA)
Site S (L)
M-S biofilms (AL)
S-biofilms
S-S biofilms (LL)

Temps d’échantillonnage (semaines)

0 3 5,5
3 semaines 2,5 semaines

Translocation
Figure 28 – Plan expérimental de l’étude réalisée in situ sur les sites M et S à l’aide de lames de
verre disposées en cagettes. M : Le Montoussé à Auradé (A) et S : La Save à Larroque (L).

Pour résumer, cette étude se compose de six conditions expérimentales différentes : deux
sites d’étude M et S aux caractéristiques physico-chimiques contrastées, deux temps d’incu-
bation de 3 et 5,5 semaines et une transplantation croisée durant le développement du biofilm
(M, S, MM, SS, MS et SM) (Figure 28).
Durant toute la période des 5,5 semaines de développement des biofilms phototrophes,
des prélèvements d’eau (100 mL) ont été effectués hebdomadairement sur les deux sites
d’étude pour un suivi physico-chimique, chaque fois en début de matinée pour limiter les
variations journalières. Les analyses réalisées ainsi que les protocoles utilisés sont décrits dans
les paragraphes suivants (cf. chapitre III). En parallèle, la conductivité, la température, les
teneurs en oxygène dissous ainsi que le pH sont mesurés in situ par l’utilisation de sondes
spécifiques (cf. chapitre III).

II.2 Approches expérimentales en microcosmes

Pour l’ensemble des expériences présentées ci-après et traitant de l’impact ou de la biodé-
gradation d’un herbicide, la molécule utilisée est l’alachlore, pour des raisons déjà énoncées
dans la partie « Synthèse bibliographique » (cf. Partie I). Quel que soit le microcosme
considéré, la contamination se déroule toujours de la même manière. L’alachlore sous forme
de poudre (pureté 99%, Sigma-Aldrich ou pureté 98%, Chem Service, Inc. USA), est dissout
dans un solvant organique, acétone (analytic grade,VWR) ou méthanol (analytic grade, Fi-
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 68

sher scientific, Nepean, ON, Canada) suivant l’étude considérée, pour produire une solution
stock d’alachlore concentrée. A partir de cette solution stock homogénéisée quelques minutes
dans un bac à ultrason, un aliquot est réalisé et rajouté aux microcosmes au volume permet-
tant d’obtenir la concentration finale souhaitée. La concentration finale de solvant rajouté
dans chaque microcosme pour chaque expérience est inférieure à 0,005 % v / v.

II.2.1 Capacité de biodégradation d’un herbicide par des suspen-

sions de biofilms phototrophes
II.2.1.1 Objectif de l’expérience

L’étude a été menée dans le but d’évaluer le devenir de l’alachlore en phase dissoute
exposé à 3 suspensions de communautés microbiennes issues de 3 agrégats différents, eux-
mêmes originaires d’habitats distincts. Ces 3 agrégats se composent initialement de 2 types de
biofilms phototrophes et d’un extrait de boues activées. Vu leurs rôles clefs au sein des stations
d’épuration, les boues activées sont des modèles d’étude très utilisés dans la littérature lors de
tests de biodégradation des polluants (Stanislakas et al. 2009), et présentent souvent de fortes
capacités à biodégrader ces molécules. Ainsi, ces communautés provenant de boues activées
seront considérées comme un « référentiel » pour la biodégradation. La phase expérimentale
a été réalisée par A. Biaz dans le cadre d’un stage de Master en 2008 et un complément
d’analyse, l’exploitation des résultats et la valorisation ont ensuite été réalisées dans le cadre
de la thèse.

II.2.1.2 Déroulement de l’expérience

L’expérience s’est déroulée en deux phases :

i) une première phase de production et de collecte de biofilms phototrophes in situ sur
deux sites d’étude, sites M et G,
ii) une deuxième phase d’incubation en microcosmes de 10 jours où les biofilms collectés
sont mis en suspension et exposés à deux concentrations en alachlore (1 et 20 µg.L−1 ).
Ces seuils de concentration ont été choisis pour reproduire des valeurs de concentration
détectées dans les eaux de surface (Battaglin et al. 2000 ; Sanchez-Camazano et al.
2005).
La production de biofilm sur le site M (ruisseau Le Montoussé) s’est effectuée du 22
février au 3 avril 2008 pour recouvrir la période d’application des pesticides au niveau de ce
site. Les biofilms sont collectés à l’issue de 6 semaines de développement sur lames de verre
disposées en cagettes. Pour le site G (fleuve La Garonne), les biofilms phototrophes sont
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 69

collectés par prélèvement direct de galets. Les biofilms collectés sur les galets représentent
une communauté dite « naturelle » dont ni l’histoire ni la durée d’incubation ne sont connues
alors que les biofilms collectés sur des supports artificiels représentent une communauté «
sélectionnée » dont on connait la durée d’incubation mais pas l’histoire.
Les caractéristiques physico-chimiques de l’eau ont été analysées pour les deux sites durant
la période de développement in situ des biofilms sur le site M.
Pour le site « station d’épuration » W, les boues activées ont été collectées dans la station
de traitement des eaux usées de Toulouse (Usine de dépollution de Ginestous, Sud Ouest,
France). Les paramètres chimiques ont été analysés seulement le jour du prélèvement des
boues activées. Ces boues activées ont été prélevées sur la boucle de recirculation des boues
du clarificateur vers le bassin d’aération de la tranche fonctionnant à forte charge massique
appliquée de 0,9 kgDBO5 .kgMVS−1 .j−1 (DBO5 : demande biologique en oxygène à 5 jours
d’incubation et MVS : matières volatiles en suspension), ainsi qu’un temps de séjour hydrau-
lique de 1 à 5 heures et un âge de boues de 3 jours. Le choix de ce type de boues activées a
été motivé à partir d’une étude réalisée sur le potentiel de biodégradation de molécules orga-
niques par des boues activées opérant à forte charge massique appliquée (Vazquez-Rodriguez
et al. 2003 et 2007). Les auteurs ont montré que ce type de boues présente une capacité
de biodégradation plus importante que les boues activées fonctionnant à moyenne ou faible
charges massiques appliquées.
Les galets et les lames de verre ont été échantillonnés aléatoirement. Un réplicat représente
soit un lot de deux lames de verre prélevées parmi les trois dispositifs de collecte type « cagette
», soit un lot de trois galets, l’ensemble étant transporté au laboratoire dans des glacières.
Durant le transport vers le laboratoire, les galets sont placés individuellement dans des sacs
de congélation humidifiés et les lames de verre maintenues fixées à leurs supports et placées
dans des sacs poubelle également humidifiés. Les biofilms sont détachés par grattage des
supports naturels ou artificiels (cf. chapitre III Préparation des biofilms). Pour chaque
réplicat, les biofilms sont mis en suspension dans 250 mL d’eau du réseau filtrée sur filtre de
0,22 µm (acétate de cellulose, Whatman) et homogénéisés (13 500 tpm, Ultra Turrax, T25).
Une fois les boues activées collectées, seul le surnageant, après une décantation de 30 min, est
utilisé. Chaque homogénat de suspension de biofilms ou de boues activées est subdivisé en
deux aliquots : un aliquot de 200 mL pour une caractérisation des biomasses (cf. chapitre
III Analyses biologiques) et un aliquot de 50 mL pour inoculer les microcosmes.
Les microcosmes consistent en des bouteilles en verre ambré de 500 mL (Figure 29).
Chaque bouteille est remplie avec 450 mL d’eau collectée sur le site G et filtrée sur filtre de
0,22 µm (acétate de cellulose, Whatman), le site G étant considéré dans cette étude comme
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 70

le moins pollué en termes de pesticides. Les concentrations initiales en nutriments sont de

−
N-NH+ −1 −1 −1
4 = 0,053 mg.L , N-NO3 = 0,7 mg.L , Ptotal = 0,012 mg.L , COD = 2,1 mg.L
−1

(COD : carbone organique dissous), et pH = 7,5.

Trois expérimentations ont été réalisées pour chaque type d’inoculum, incluant les boues
activées et les deux types de biofilms. Pour chacune, deux traitements y sont associés, et
menés en triplicat : les microcosmes sont inoculés et traités avec 1 ou 20 µg.L−1 d’alachlore.
En parallèle, des microcosmes témoins, dépourvus d’inoculum microbien et traités aux deux
mêmes concentrations d’alachlore, sont mis en œuvre (évaluation de la disparition d’origine
abiotique de la molécule).
Les bouteilles, stérilisées au préalable par autoclavage, sont incubées pendant 5 heures
avant le début de l’expérience associé à l’inoculation des suspensions microbiennes, pour ob-
tenir des conditions physico-chimiques stables et homogènes dans chaque bouteille et entre
les bouteilles (e.g. température, concentration en alachlore). Toutes les bouteilles sont fer-
mées par un bouchon en coton stérile pour maintenir une ambiance aérobie et maintenues à
l’obscurité et sous agitation (agitateurs magnétiques multi-postes, Inductive stirring system,
Oxitop IS 6, WTW) dans une enceinte thermostatée à 25˚C.
A l’issu de 1, 5 et 10 jours d’incubation, des échantillons d’eau de 100 mL sont prélevés
pour évaluer la concentration résiduelle en alachlore ainsi que les concentrations des deux
métabolites OA et ESA (cf. chapitre III).

Figure 29 – Photographie
du dispositif expérimental :
incubation en bouteilles pla-
cées sur agitateurs magné-
tiques par lots de 6 et disposés
dans une enceinte thermosta-
tée.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 71

II.2.2 Réponse des communautés microbiennes de biofilms photo-

trophes à une exposition à un herbicide
II.2.2.1 Objectif de l’expérience

L’objectif de cette expérience est d’évaluer, à l’échelle des communautés, la réponse à une
contamination chronique à l’alachlore, de biofilms phototrophes qui présentent des traits de
vie différents et des lieux de production aux propriétés potentiellement toxiques et trophiques
distinctes. La phase expérimentale a été réalisée par A. Lamy dans le cadre de son stage de
Master en 2010, et un complément d’analyses, l’exploitation et la valorisation ont ensuite été
réalisés dans le cadre de la thèse.

II.2.2.2 Déroulement de l’expérience

Deux expérimentations ont été effectuées sur une période de 8 semaines chacune, com-
prenant une période de colonisation in situ de 4 semaines sur des supports artificiels de type
« coupons » (24 plaques en polyéthylène sur chaque site) sur les sites M et S, suivie par des
expériences en microcosmes de 30 jours. Chaque expérience en microcosme se déroule de la
manière suivante : une phase d’acclimatation de 7 jours suivie par une phase d’exposition à
l’alachlore de 23 jours.
La première expérience a été réalisée du 2 février au 1 mars 2010 sur le site S (rivière
La Save) et la deuxième du 8 mars au 8 avril 2010 sur le site M (ruisseau Le Montoussé).
Des études antérieures ont montré que ces 4 semaines permettent d’obtenir un biofilm avec
suffisamment de biomasse et produit sous influence des facteurs environnementaux, sans être
rentré complètement dans un fonctionnement autonome marqué par l’influence des facteurs
autogènes (Dorigo et al. 2007).
Les microcosmes, adaptés des microcosmes de Debenest et al. (2009), sont constitués de
réservoirs en verre (300 mm x 200 mm x 200 mm), chacun séparé en trois compartiments par
des plaques de verre d’une hauteur de 190 mm et 180 mm (Figure 30. Chaque microcosme
est rempli avec 9,6 ± 0,1 L d’eau de rivière autoclavée provenant du lieu de collecte des
biofilms. L’utilisation d’eau de rivière a pour but de réduire le stress du biofilm lors de son
transfert du milieu naturel vers le microcosme. Une circulation en boucle fermée est maintenue
dans le réservoir avec une pompe immergée (Proflow 600, JBL) connectant les deux petits
compartiments (Figure 30). L’eau circule dans le compartiment central du microcosme par
écoulement gravitaire à une vitesse de courant de 0,5 cm.s−1 , ce qui permet d’y réduire les
turbulences pouvant contribuer à l’érosion en surface des biofilms tout en y favorisant son
développement (Biggs et Close 1989). Un tube de néon est placé 40 cm au-dessus de chaque
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 72

microcosme (tube fluorescent TL-15E 14W, 5500 K, Zoomed Aquatic). Cet éclairage artificiel
est programmé pour une photopériode de 12 h de lumière, 12 h d’obscurité pour reproduire
le cycle nycthéméral de la saison. L’homogénéité de l’éclairement a été contrôlée par mesure
de l’intensité lumineuse, sous forme de radiations photosynthétiques actives avec l’aide d’une
sonde plate reliée à un quantamètre (Li-189, Li-Cor). L’ensemble des microcosmes a été
maintenu à température constante de 20˚C en enceinte ventilée. Les plaques colonisées par
du biofilm sont fixées sur des rampes en inox (soit 7 plaques par microcosme) et placées dans
le compartiment central.

A B

Figure 30 – Schéma (A) et photographies (B) du dispositif expérimental d’incubation de plaques

de polyéthylène, préalablement colonisées en milieu naturel (photographies d’A. Lamy)

Pour chaque expérimentation, un nombre de 5 microcosmes correspondant à 5 conditions

différentes sont nécessaires (Figure 31) :
– deux microcosmes en présences de plaques colonisées pour évaluer les effets des deux
concentrations d’exposition à l’alachlore (10 et 30 µg.L−1 ),
– un microcosme en présences de plaques colonisées pour évaluer les effets de la période
d’incubation sur le biofilm en absence d’alachlore,
– deux microcosmes en présence de plaques vierges afin d’évaluer le devenir abiotique de
l’alachlore dans les deux conditions de concentration.
Un à trois coupons sont prélevés par tirage aléatoire dans chaque microcosme aux trois
dates suivantes (Figure 32), échantillonnages effectués à la même heure, soit le matin dans
le cadre de cette étude :
– à T−7 : après 4 semaines de colonisation in situ,
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 73

Figure 31 – Photographie du
dispositif expérimental comprenant
5 microcosmes dans une enceinte
thermostatée (photographies d’A.
Lamy).

10cm

– à T0 : après 7 jours d’incubation dans les aquariums sans contamination à l’alachlore

(phase d’adaptation), la contamination par l’alachlore est alors réalisée à des concen-
trations de 10 et 30 µg.L−1 ,
– à T12 : après 12 jours d’incubation en présence d’alachlore,
– à T23 : après 23 jours d’incubation en présence d’alachlore.
A chaque prélèvement, la biomasse de chaque coupon collecté est mise en suspension dans
50 mL d’eau du réseau au préalable filtrée sur filtre de 0,22 µm (acétate de cellulose, Wat-
man). Cette solution est homogénéisée (13 500 tpm, Ultra Turrax T25) avant les différentes
analyses (cf. chapitre III Analyses biologiques). Dans cette étude, un coupon représente
un réplicat.
Des dosages de l’alachlore sont effectués dans l’eau d’incubation à T0 afin de contrôler
l’apport en polluant pendant l’expérimentation. Des mesures de pH, température, conducti-
vité, et concentration en oxygène dissous ont été effectuées à intervalles de temps réguliers
avec l’aide de sondes spécifiques (cf. chapitre III Analyses chimiques). En parallèle (une
fois par semaine et les jours de prélèvement) des échantillons d’eau (100 mL) sont prélevés
pour les dosages de l’alachlore, du COD (Carbone Organique Dissous) et des nutriments
additionnés au départ (10 mg.L−1 de silice, 0,7 mg.L−1 d’orthophosphates, 15 mg.L−1 de
nitrates) (cf. chapitre III Analyses chimiques).

II.2.3 Bioréacteurs annulaires rotatifs

Par définition, un bioréacteur annulaire rotatif ("Rotating Annular Bioreactor ", RAB en
anglais) est constitué par deux cylindres concentriques, un cylindre interne en rotation et un
cylindre externe fixe (Figure 33). Le fluide circule alors dans l’entrefer formé par l’espace
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 74

Prélèvements pour analyse

Sans biofilm 30E

Sans biofilm 10E

Biofilm NE Biofilm 30E

Biofilm NE Biofilm 10E

Biofilm NE Biofilm NE

Colonisation en rivière Acclimatation Exposition

T-37 T-7 T0 T12 T23

on rêt tio
n
ati ore
rtu
r b
hl Ar enta
Pe l’alac rim
pé
par ex

Figure 32 – Plan expérimental de chaque expérimentation en microcosmes (extrait de Lamy 2010) :

5 modalités (ou conditions) expérimentales différentes : Microcosme Biofilm NE (coupons colonisés
en absence d’alachlore), Microcosme Biofilm 10E (coupons colonisés exposés à 10 µg.L−1 d’ala-
chlore), Microcosme Biofilm 30E (coupons colonisés exposés à 30 µg.L−1 d’alachlore), Microcosme
Sans biofilm 10E (coupons vierges exposés à 10 µg.L−1 d’alachlore), Microcosme Sans biofilm 30E
(coupons vierges exposés à 30 µg.L−1 d’alachlore).
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 75

entre les deux cylindres. Dans un RAB à écoulement de type Taylor-Couette, la vitesse de
rotation du cylindre interne et les rayons des deux cylindres définissent le type d’écoulement
du fluide dans l’entrefer. Ainsi différentes combinaisons sont possibles entraînant différents
types d’écoulements (Guyon 2001).
Au cours de cette thèse, deux types de RAB ont été utilisés : un prototype au dévelop-
pement duquel nous avons contribué dans le cadre des relations EcoLab et LISPB (INSA de
Toulouse), et une batterie de mini-RABs accessibles au sein d’Environment Canada.

Figure 33 – Schéma simplifié d’un bio-

réacteur annulaire rotatif à écoulement de
type Taylor-Couette : R1 et R2 les rayons
des cylindres internes et externes, e l’en-
trefer, h la hauteur du bioréacteur, et Ω
la vitesse de rotation du cylindre interne
(Extrait de Coufort 2004).

II.2.3.1 Prototype de bioréacteur annulaire rotatif (RAB) à écoulement de type

Taylor-Couette

II.2.3.1.1 Présentation et description générale

Un prototype de RAB à écoulement de type Taylor-Couette a été conçu par la société

ARIAS (Toulouse, Sud Ouest, France) et expérimenté au sein du laboratoire EcoLab pour la
première fois dans le cadre de cette thèse. La conception de ce prototype est inspirée des RABs
développés au LISPB en tant que procédés de dépollution des eaux usées (Coufort 2004).
Notre RAB intègre une source lumineuse modulable interne dont on peut faire varier le spectre
lumineux et son intensité. Cette particularité oriente le choix de la matière du cylindre interne,
à savoir un matériel transparent ne filtrant pas la lumière. Le développement et l’utilisation de
ce prototype a nécessité un certain nombre d’adaptations techniques et méthodologiques au
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 76

cours de la première année de thèse (étanchéité, évacuation de gaz produit par photosynthèse,
adaptation de capteurs oxygène et pH, test de sources lumineuses, etc.). Des schémas du
bioréacteur ainsi que ses caractéristiques sont présentés dans la Figure 34. Ce prototype de
RAB possède trois particularités :
– un cylindre contenant la source lumineuse interne avec une capacité d’accueil de 8
néons. Ce cylindre, en plexiglass sur la partie haute (interne au RAB) et en PVC sur la
partie basse (externe au RAB), est fermé aux deux extrémités dont la partie haute est
étanche et la partie basse démontable pour accéder aux néons, et fixé sur le châssis ;
– un cylindre interne transparent en plexiglas, venant se reposer axialement sur le cylindre
contenant les néons, avec un espace entre ces deux cylindres inférieur à 2 mm. Le volume
d’eau contenu dans ce pseudo-entrefer sera négligé par la suite, du fait de son faible
renouvellement (connectivité avec l’entrefer réduite). Le cylindre interne est accouplé
par le haut avec un moteur équipé d’un variateur de vitesse permettant de couvrir la
gamme 0 à 200 trs.min−1 . Le réacteur est muni d’un tachymètre permettant la mesure
de la vitesse de rotation du cylindre interne ;
– un cylindre externe en PVC gris permettant de générer entre les deux cylindres interne
et externe un entrefer de 18,5 mm. Ce cylindre externe est fixé sur le châssis par
vissage, pour assurer l’étanchéité du RAB, tout en le rendant démontable. Il contient
sur sa face interne les coupons sur lesquels se développera le biofilm phototrophe. La
surface servant de logement des coupons a été creusée de manière à avoir une continuité
de surface entre la partie contenant les coupons et la partie exempte de coupon.
Avant la mise en fonctionnement du réacteur, l’ensemble du matériel a été rincé plusieurs fois
avec de l’eau déminéralisée afin de limiter la présence de molécules chimiques ou minérales
suite à l’usinage.

II.2.3.1.2 Choix des conditions expérimentales

II.2.3.1.2.1 Support de colonisation

Des plaques en polyéthylène (L x l x e : 100 mm x 50 mm x 5 mm) ont été utilisées comme

support pour la colonisation et le développement des biofilms phototrophes. Les plaques sont
fixées chacune individuellement avec une vis sur la face interne du cylindre externe dans
la partie centrale et creusée du cylindre pour limiter les effets bords. Deux rangées de 16
plaques sont positionnées, ce qui fournit potentiellement 32 coupons échantillonnables pour
une surface globale de colonisation de 0,117 m2 (Figure 35). Chaque plaque est recouverte sur
sa face adossée au cylindre externe et sur les côtés d’une bande adhésive de manière à limiter
la production de biofilm sur les parties autres que la face exposée à l’entrefer (Figures 35
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 77

Figure 34 – Organisation du bioréacteur (Rotating Annular Bioreactor, RAB). (A) représentation

en 3D des différentes parties qui composent le bioréacteur avec a le cylindre externe, b le cylindre
interne et c le cylindre étanche qui contient les néons ; (B) photographie du bioréacteur ; (C) schéma
détaillé du bioréacteur et (D) ses caractéristiques géométriques.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 78

et 36) (Derlon 2008). Ce matériau a été sélectionné pour ces propriétés plastiques lui conférant
la possibilité d’être incurvé (moule en inox chauffé à 120˚C) pour suivre la courbure du
cylindre externe. Afin de s’affranchir de problèmes liés au relarguage de substances issues de
la fabrication, les plaques ont été immergées dans de l’eau du réseau durant plusieurs jours
avant leur première utilisation. Par la suite, entre chaque expérience et avant d’être placées
dans le RAB, les plaques sont nettoyées au détergent (Décon dilué) puis rincées plusieurs fois
à l’eau déminéralisée.

Figure 35 – Photographies d’un support de colonisation, (gauche) en vue de face (le trou correspond
au lieu de passage de la vis de fixation qui se visse sur le cylindre externe du RAB) et (droite) en
vue dorsale (la face arrière et les bords sont recouverts de bande adhésive)

II.2.3.1.2.2 Source lumineuse interne

L’éclairage est assuré par la présence de néons de longueur standard 438 cm (contrainte
imposée par la hauteur du RAB) positionnés au cœur du dispositif (Figure 37). Le RAB
peut contenir un nombre de néons de 1 à 8 fournissant des valeurs d’intensités lumineuses de
130 à 283 µmol.m−2 .s−1 (Tableau 8). L’intensité lumineuse était mesurée comme une valeur
du niveau des radiations photosynthétiques actives (ou "photosynthetically active radiation",
en anglais PAR) par l’utilisation d’une sonde de quantamétre (model LI-189, LI-COR, Inc
- Lincoln - Nebraska). La mesure est réalisée à l’air, à une distance du cylindre interne
équivalente à l’entrefer. De manière à distribuer le plus homogènement possible la lumière
dans le RAB, un cylindre plein en plexiglass est placé au centre du dispositif sur toute la
hauteur des néons. Notre choix s’est porté sur 2 et 4 néons, qui est un bon compromis entre :
– une distribution homogène de l’éclairage : moins il y a de néon utilisé et plus l’éclairage
est hétérogène ;
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 79

A C

Figure 36 – Photographie de l’emplacement des plaques de polyéthylène sur la face interne du

cylindre externe (A et B) et détail du système de fixation des plaques (B)
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 80

Nombre Intensité lumineuse

de néons (µmol.m-².s-1)
Tableau 8 – Valeurs d’inten-
8 283 ± 20 sité lumineuse en fonction du
nombre de néons (pour chaque
6 265 ± 16 cas, il y a autant de néons
Fluora que de néons Luminux)
4 180 ± 10
2 130 ± 20

– une trop forte élévation de température dans l’entrefer qui peut constituer une pression
de sélection vis-à-vis des microorganismes (le RAB n’est pas thermostaté). La tempé-
rature était de 16 à 21˚C avec 2 néons, de 16 à 23˚avec 4 néons et de 17 à 28˚avec 8
néons ;
– d’après Bothwell (1993), l’activité photosynthétique des communautés algales ben-
thiques, qu’elles soient intactes ou déstructurées, est saturée entre 100 à 400 µmol.m−2 .s−1 .

A B

10cm 10cm

Figure 37 – Le dispositif d’éclairage, capacité de 8 néons protégés par un cylindre étanche en

plexiglass (A et B)
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 81

Puissance électrique Intensité lumineuse Longueur

Néon Désignation Teinte
(Watt) (Lumen) (mm)
Fluora L15W / 77 77 15 400 438
Luminux L15W / 865 438 15 900 438

Figure 38 – Spectres lumineux et principales caractéristiques des néons « Fluora » (spectre de

gauche) et « Lumière du jour » (spectre de droite) utilisés lors des cultures en RAB

II.2.3.1.2.3 Conditions hydrodynamiques

L’écoulement dans un réacteur de type Taylor-Couette est caractérisé par deux nombres
sans dimension : le nombre de Taylor (T a) et le nombre de Reynolds (Re).
Le nombre de Reynolds détermine l’importance du flux convectif par rapport au flux
diffusif. Ces deux flux représentent les deux mécanismes de transport possibles lors de l’écou-
lement d’un fluide. Pour caractériser l’écoulement dans un entrefer annulaire, ce nombre est
donné par l’équation suivante :

Re = (r.Ω.e)/υ

avec r le rayon externe du cylindre interne (m), Ω la vitesse angulaire du cylindre interne
(rad.s−1 ), e l’entrefer (m) et υ la viscosité cinématique du fluide, en l’occurrence ici l’eau du
réseau d’eau potable (υ = 10−6 m2 .s−1 à 20˚C).
Suivant la valeur du nombre de Reynolds, le régime d’écoulement dans un système du
type conduite est caractérisé de :
– régime laminaire pour Re < 2000,
– régime transitoire pour 2000 < Re < 4000,
– régime turbulent pour Re > 4000.
Le nombre de Taylor représente la transition turbulente de l’écoulement d’un fluide. Pour
un fluide mis en mouvement par un cylindre en rotation, il est donné par l’équation suivante
(Mehel 2006) :
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 82

T a = Re.(e/r)1/2

Suivant la vitesse de rotation du cylindre interne, le nombre de Taylor sera différent et

permettra de décrire les 5 types de régimes possibles (de l’écoulement stable à l’écoulement
pleinement turbulent, voir Figure 39 et 40) dans l’espace annulaire du réacteur (Coufort
2004). La plage de variation du nombre de Taylor est réduite par la valeur du nombre de Taylor
critique correspondant à l’apparition de la première instabilité, Tac = 43,3 (développement
des cellules de Taylor dans l’espace annulaire).
D’après le nombre de Taylor (Mehel 2006), la vitesse angulaire du cylindre interne est
donnée par l’équation suivante :

T a.υ
Ω=
e3/2 .r1/2
Les 5 régimes d’écoulement sont mis en regard des plages de variation du nombre de Taylor
et des vitesses correspondantes de rotation du cylindre interne de notre RAB (Tableau 9).
Le choix du régime pleinement turbulent a été fait avec une vitesse de rotation du cylindre
interne de notre RAB de 80 trs.min−1 pour avoir :
– une vitesse de rotation du cylindre interne suffisante pour éviter les phénomènes de
décantation des particules en suspension et d’accumulation dans la partie basse de
l’entrefer ;
– une absence d’ondulation (comme observée pour les écoulements entre 1,27 et 40.Tac
selon le référentiel de Coufort (2004)) (voir Figure 39) ;
– une périodicité spatiale sur toute la hauteur de l’entrefer (pouvant laisser penser à une
homogénéité de colonisation du biofilm sur les coupons).

Figure 39 – Transitions des

écoulements dans un réacteur
à comportement hydrodyna-
mique du type Taylor-Couette
(D’après Andereck 1986, ex-
trait de Coufort 2004). T ac :
Nombre de Taylor critique.

Aucune expérience n’a été effectuée à des vitesses de rotation du cylindre interne supé-
rieures à 80 trs.min−1 , car d’après des travaux antérieurs (Coufort 2004) pour un réacteur
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 83

Figure 40 – Ecoulement de
type vortex turbulent simi-
laire à celui recherché au ni-
veau de l’entrefer du proto-
type RAB. Avec ω = vitesse de
rotation angulaire du cylindre
interne (extrait de Ohmura et
al. 1997).

Vitesse de rotation
Type d’écoulement Nombre de Taylor (Ta)
du cylindre interne (trs.min-1)

Tourbillonnaire Tac* à 1,15.Tac

0,49 à 0,53
(« Vortex flow ») (43,3 à 49,6)

Tourbillonnaire ondulant 1,15.Tac à 6,14.Tac

0,53 à 3
(« Wavy vortex flow ») (49,6 à 266)

Taylor turbulent 6,14.Tac à 16,17.Tac

3à8
(« Turbulent vortex flow ») (266 à 700)

16,17.Tac à 30.Tac
Turbulence naissante 8 à 14,9
(700 à 1300)

Pleinement turbulent > 104.Tac

> 51,5
(Turbulent flow) (> 4500)

Tableau 9 – Tableau reliant les plages de vitesse de rotation du cylindre interne aux types d’écou-
lement au niveau de l’entrefer du RAB (∗ : T ac = 43,3).
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 84

similaire au nôtre, avec des proportions géométriques identiques, la vitesse tangentielle entre
le cylindre interne et la surface des coupons est atténuée d’environ 50 %, ainsi cela nous
donnait une vitesse tangentielle au niveau du cylindre interne de 0,9 m.s−1 et une vitesse
au niveau de la paroi de 0,45 m.s−1 (Tableau 10). Au delà de 80 trs.min−1 , la vitesse tan-
gentielle à la surface des plaques pouvait présenter des conditions très sélectives vis-à-vis
des micro-organismes. Le cylindre interne est caractérisé par deux valeurs de vitesse : la vi-
tesse tangentielle (U ) et la vitesse angulaire (Ω). Ces deux vitesses sont reliées par l’équation
suivante :

U =Ω×r

avec r le rayon externe du cylindre interne en m, Ω la vitesse angulaire (en rad.s−1 ) et U

la vitesse tangentielle (en m.s−1 )

Tableau 10 – Tableau reliant les vitesses tangentielles à la surface des coupons et à la paroi externe
du cylindre interne en fonction de la vitesse angulaire du cylindre interne. Cette relation est basée
sur des résultats de travaux antérieurs qui soulignaient que la vitesse tangentielle entre le cylindre
interne et la surface des coupons est atténuée d’environ 50 % (Coufort 2004).

Afin de se rapprocher des vitesses de courant du milieu naturel à la surface du biofilm,

nous avons à considérer une gamme de valeurs de vitesse de 0,1 à 1 m.s−1 , la plus élevée
étant représentative de phénomènes de crue. D’après Biggs et Stokseth (1996), la biomasse
augmente proportionnellement avec la vitesse du courant entre 0,2 et 0,5 m.s−1 . De même
Horner et Welch (1990) trouvent une vitesse du courant optimale pour un biofilm colonisé
sur un substrat dans une rivière pauvre en nutriment autour de 0,5 m.s−1 , et dans un ca-
nal Horner et al. (1990) obtiennent une biomasse maximale pour 0,6 m.s−1 . Afin de bien
connaîitre les conditions de mise en oeuvre du RAB, l’hydrodynamique a été caractérisée
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 85

expérimentalement à l’échelle du bioréacteur via une méthode de traçage et les propriétés

locales du flux ont été étudiées via une simulation numérique.

II.2.3.1.2.3.1 Distribution des temps de séjours

Le comportement général du mélange dans le RAB a été caractérisé expérimentalement

en utilisant la méthode de traçage par impulsion afin de déterminer la distribution des temps
de séjour (DTS). Dix mL d’une solution de NaCl de concentration 0,16 g.mL−1 est injectée en
entrée de réacteur par impulsion. L’expérience est réalisée pour deux vitesses de rotation du
cylindre interne, 80 et 170 trs.min−1 et le débit d’alimentation (de l’eau du réseau maintenue
à 20˚C) est de Q = 26 mL.min−1 pour un volume opérationnel dans le bioréacteur de V
= 5,04 L (volume de l’entrefer). La conductivité de l’eau est mesurée en sortie pendant 15
heures avec une sonde spécifique (conductivity meter 524, CRISON, SELI, temps de réponse
de la sonde de 2 s) localisée dans une cellule de mesure de 30 mL positionnée après la valve
de sortie du RAB (Figure 41). Cette période expérimentale de 15 heures correspond à 5
fois le temps de séjour moyen, ce qui permet d’atteindre un régime stationnaire à la sortie
du réacteur en fin d’expérimentation. L’expérience est réalisée en absence de biofilm et sans
éclairage afin de limiter les variations de température.
Les courbes de DTS sont définies à partir des valeurs de conductivité en sortie du réacteur
comme la concentration sans dimension (E(θ)) en fonction du temps sans dimension (θ) :

c(t)
E(θ) =
c(0)
avec θ qui est donné par le ratio t/τ , avec τ = V /Q, et c(t) et c(0) sont respectivement
les concentrations du traceur aux temps t et 0 pour lequel c(0) serait obtenue si le traceur
injecté était instantanément mélangé.
Les courbes expérimentales de DTS sont comparées à des courbes DTS théoriques obte-
nues à partir de modèles mathématiques de réacteurs infiniment mélangés et placés en série
comme décrit par Sugiharto et al. (2009).

II.2.3.1.2.3.2 Simulations numériques de l’écoulement

Les simulations numériques ont été réalisées pour évaluer le comportement hydrodyna-
mique à l’intérieur de l’entrefer et les caractéristiques de l’écoulement à l’échelle des turbu-
lences. Les forces de cisaillement moyennes à la paroi sur le cylindre externe et les profils de
vitesse axiale moyenne dans l’entrefer ont été extraites de ces simulations. Les simulations
ont été réalisées en utilisant le logiciel Fluent CFD (version 6.2) aux deux vitesses de rotation
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 86

A B

Figure 41 – Schéma du dispositif expérimental de réalisation de la DTS (a), et photographie du

dispositif mis en place en sortie de bioréacteur pour les mesures de conductivité (b)

du cylindre interne 80 et 170 trs.min−1 . La première étape consiste à représenter le volume

de l’entrefer par un maillage à deux dimensions en utilisant le pré-processeur Gambit R de
Fluent. Les simulations sont lancées comme décrit par Coufort et al. (2005) à savoir les
équations de Navier-Stokes en moyenne de Reynolds combinées avec le modèle k-ε RSM («
Reynolds Stress Model ») et le modèle 2D-axisymmetric sous des conditions stables. Ces si-
mulations ont été réalisées par E. Mazeau dans le cadre d’un stage 3ème année INSA sous la
responsabilité de J. Morchain.

II.2.3.1.2.4 Inoculum et eau d’alimentation

Plusieurs sources d’inocula sont proposées dans la littérature pour les dispositifs de mi-
crocosmes : eau de rivière (Lawrence et al. 2000), suspension de biofilm naturel (Pesce et al.
2006), suspension de biofilm artificiel (Hayashi et al. 2010), ou de biofilm intact (Vercraene-
Eairmal et al. 2009). De même, plusieurs sources d’eau d’alimentation sont proposées, celles-ci
présentent des contraintes et des avantages :
– l’eau de rivière : source d’inoculation continue, mais très variable d’une saison à l’autre
en termes de température, de nutriments et de micro-organismes. De plus, ce type
d’alimentation nécessite le stockage de grandes quantités d’eau. Cette source est caren-
cée en nutriment particulièrement en phosphates et souvent source de limitation de la
croissance du biofilm (Bothwell 1985),
– l’eau du réseau : carencée en nutriments, et peut contenir des produits de traitements
des eaux (dont le chlore). Elle a l’avantage d’être facile d’accès, sans nécessiter un
stockage,
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 87

– un milieu de culture synthétique : ce type de milieu fournit une très bonne reproducti-
bilité, mais demande de nombreuses heures de préparation et de produits et ne favorise
que la croissance d’un certain type d’algues.
Pour des raisons pratiques et être le plus reproductible possible, nous avons finalement
décidé d’utiliser l’eau du réseau, après avoir dosé ponctuellement les nutriments sur quelques
échantillons (1999 et 2007, en hiver et printemps) dont les concentrations sont présentées
dans le Tableau 11. Le but étant de favoriser la croissance des biofilms phototrophes dans
le bioréacteur, il s’est avéré indispensable de faire des ajouts en éléments N, P et silice.

Tableau 11 – Quelques
Madigou et Nos 1er dosages
Dosages exemples de concentrations en
Caveda 1999 (12/2007)
nutriments dosés dans l’eau
NO3- (mg.L-1) 3,7 2,9±0,2
du réseau utilisée comme base
N-NH4+(mg.L-1) 1,1 0,016±0,014 du milieu d’alimentation du
P-PO43- (mg.L-1) 0,01 nd RAB. Avec nm : non mesuré,
SiO2 (mg.L-1) nm 2,9±0,05 nd : non détecté et COD : Car-
COD (mg.L-1) nm 0,63±0,03 bone Organique Dissous.

Pour déterminer les concentrations finales et le débit au sein de notre réacteur, nous nous
sommes basés sur une étude réalisée au sein du laboratoire (Madigou et Caveda 1999) pour
la culture de biofilms phototrophes avec de l’eau du réseau sur des plans inclinés et en circuit
fermé.
Lors de la première expérimentation avec le bioréacteur, les concentrations ont été choisies
selon 2 critères : nous voulions (i) des concentrations plus élevées que celles mesurées dans les
eaux de rivière où les nutriments sont souvent limitant, notamment les orthophosphates et (ii)
un ratio N : P de 16, conforme au ratio de Redfield. Il a été décidé d’apporter l’azote sous la
forme nitrate, cette forme est la plus assimilable par les algues. La silice est indispensable à la
croissance des algues et particulièrement des diatomées ; pour limiter les éventuelles carences,
un ajout en silice est effectué. Les nitrates sont apportés sous forme de NaNO3 (concentration
finale de 7 mg.L−1 en N), les phosphates sous forme de K2 HPO4 (concentration finale de 0,44
mg.L−1 en P) et la silice sous forme de Na2 SiO3 , 9H2 0 (concentration finale de 6,5 mg.L−1
en SiO2 ).
Ainsi, pour l’ensemble de nos expériences, le bioréacteur est alimenté par de l’eau du
réseau enrichie en nutriments (silice, orthophosphates et nitrates) et fonctionne en circuit
ouvert et exceptionnellement en circuit fermé lors de la phase d’ensemencement (pompe
d’alimentation péristaltique, 520S/R2 220 T/MN pump avec des tuyaux en silicone, ID x
OD = 1,6 x 2,4 mm). Le réservoir d’eau est un tank à lait en inox (150 L, model CV 150,
Japy) d’une contenance de 150 litres, agité à l’aide d’une pale et thermostaté à 4˚C. Le
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 88

brassage de l’eau dans le tank est programmé de manière discontinue à des intervalles de
temps de 5 min. Le tank subit entre chaque expérimentation un nettoyage à l’eau de javel,
suivi par un nettoyage au Decon (détergent) et des rinçages successifs à l’eau déminéralisée
(ou eau du réseau).
Le taux de dilution dans le bioréacteur est donné par l’équation suivante :

D = Q/V = 1/θ

avec D le taux de dilution en (h−1 ), Q le débit d’alimentation (en L.h−1 ), V le volume de

l’entrefer (en L) et θ le temps de séjour (en h).
Pour définir le taux de dilution de notre réacteur, nous nous sommes basés sur les condi-
tions mises en oeuvre par Madigou et Cavada (1999) au prorata de la surface de substrat à
coloniser. Nous avons choisi un taux de dilution D = 0,32 h−1 , soit un temps de séjour θ =
3,125 h.

II.2.3.1.2.5 Entretien du bioréacteur : nettoyage complet et partiel

Les matériaux choisis imposent des contraintes en ce qui concerne les produits de nettoyage
à utiliser. Entre chaque expérience et lors de sa première utilisation, le bioréacteur subissait
un nettoyage complet. Toutes les composantes du bioréacteur sont nettoyées avec du liquide
vaisselle suivi par du détergent dilué (Decon, 10 %) pour les plaques, le cylindre externe et
les vannes de sortie, ou du peroxyde d’hydrogène (30 %) pour les cylindres internes (rotatif et
néons) et en utilisant un chiffon doux pour ne pas rayer le plexiglass. Chaque partie est ensuite
rincée plusieurs fois à l’eau déminéralisée. Avant le commencement des cultures, l’ensemble
est ensuite rincé pendant 3 jours à l’eau du réseau avec une vitesse de rotation du cylindre
élevée (170 trs.min−1 ) pour éliminer les dernières particules.

II.2.3.1.3 Validation de la capacité du bioréacteur à produire du biofilm photo-

trophe

Afin de vérifier la capacité du bioréacteur à produire du biofilm phototrophe, et évaluer

la dynamique de croissance de celui-ci, deux expérimentations ont été réalisées à un an
d’intervalle, la première du 11 juin au 30 juillet 2008 (culture nommée C1 par la suite) et
la deuxième du 23 juillet au 16 septembre 2009 (culture C2). Ces deux cultures présentaient
des procédures d’inoculation et des valeurs d’intensité lumineuses différentes.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 89

II.2.3.1.3.1 Phase d’inoculation

Etant donné la nature du milieu de culture (l’eau du réseau), le démarrage d’une culture
nécessite obligatoirement l’apport externe de biomasse. Durant cette phase d’inoculation,
le bioréacteur fonctionne en circulation fermée, en boucle avec un aquarium contenant une
suspension de biofilm épilithique. Deux procédures d’inoculation différentes ont été dévelop-
pées. La première procédure (culture C1) est réalisée avec un inoculum constitué de biofilms
collectés sur des lames de verre et des galets disposés dans le canal expérimental de notre
laboratoire (Figure 42) et la seconde procédure (culture C2) est réalisée avec un inoculum
constitué de biofilms collectés sur des galets dans différentes rivières. Les supports (galet et
lame de verre) sont grattés (cf. chapitre III Volet analytique ) et la biomasse est mise en
suspension dans 10 litres d’eau du réseau au préalable autoclavée et enrichie en nutriments
(avec des quantités similaires au milieu de culture du bioréacteur), homogénéisée (13 500
tpm, Ultra Turrax, T25) pour broyer la macrofaune et dilacérer les agrégats macroscopiques,
puis filtrée sur filtre de 250 µm puis 100 µm (VWR) pour éliminer une partie des débris
sédimentaires et de la macrofaune. Cette suspension de 10 litres est subdivisée en 2 aliquots,
avec un aliquot transféré dans une « annexe » (un aquarium ou une bouteille de 10 litres),
et l’autre aliquot transféré dans l’entrefer du bioréacteur. Durant ces phases d’inoculation, le
bioréacteur fonctionne en circulation fermée, relié uniquement à l’annexe (Figure 43). Les
annexes sont agitées et éclairées par des lampes fluorescentes comprenant une lampe cool
daylight (F18W/GRO, Sylvania, Allemagne) et une lampe fluora (F18W/54, Grande Bre-
tagne), donnant une intensité lumineuse de 32 ± 3 µmol.m−2 .s−1 avec une photo-période
jour / nuit de 16 h / 8 h. A l’issue de cette phase, qui correspond au T0 des expériences, le
bioréacteur fonctionne de nouveau en circulation ouverte et les processus de croissance sont
sensés prévaloir sur les processus d’immigration pour expliquer la croissance du biofilm et la
structuration des communautés.

Figure 42 – Photographie du canal

expérimental du laboratoire

10cm
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 90

La première procédure d’inoculation (culture C1) (Figure 43A) a lieu durant 48 h en

circuit fermé. La seconde procédure (culture C2) (Figure 43B) est réalisée en deux phases
d’inoculation de 48 h chacune, séparées par une phase en circulation ouverte à l’aide du tank
pendant 24 h. Cette stratégie permet une première installation des micro-organismes pionniers
suivie par leur croissance pour ensuite favoriser l’arrivée des organismes non pionniers lors
de la deuxième phase d’inoculation. La deuxième phase d’inoculation a été réalisée avec une
nouvelle suspension fraîche de biofilms provenant des mêmes sites.

A B

5cm 5cm

Figure 43 – Dispositifs annexes d’inoculation de la culture C1 (A) et de la culture C2 (B)

II.2.3.1.3.2 Echantillonnage des coupons

A chaque pas d’échantillonnage, 3 coupons sont prélevés au hasard dans le réacteur, et

remplacés par des coupons vierges propres afin de ne pas perturber les conditions hydro-
dynamiques. Les coupons déjà échantillonnés au cours d’une même expérience sont exclus
pour le reste des échantillonnages. La procédure d’échantillonnage nécessite l’ouverture du
réacteur pour l’accès aux coupons, précédé donc par une vidange de l’eau de l’entrefer qui
est gardée pour être réutilisée une fois la collecte des échantillons terminée. Cette étape de
collecte se réalise en 15 minutes maximum, durant laquelle le biofilm humide reste à l’air.
Les plaques, une fois dévissées (Figure 44), sont détachées de manière précautionneuse du
cylindre externe, puis stockées à 4˚C avant traitement dans des récipients en plastique de 90
mL, avec un fond d’eau, dans les 4 heures qui suivent le prélèvement.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 91

Figure 44 – Photographies de l’étape de collecte d’un coupon. Les coupons blancs ou partiellement
recouverts correspondent aux coupons remplacés suite à un échantillonnage

Les mesures d’accumulation / production de biomasse au niveau des supports artificiels

ont été complétées par des mesures de biomasse en suspension dans l’eau (associé au déta-
chement de biomasse des coupons ou la croissance de biomasse planctonique).

II.2.3.1.3.3 Analyses physico-chimiques

En sortie de bioréacteur, il a été placé une cellule dite de mesure (Figure 45), d’une
contenance de 30 mL, laquelle contient une sonde pH et température (sentix H 8481 HD,
SCHOTT) et une sonde oxygène (trioxmatic 701, WTW). Les sondes étaient reliées à un
oxymètre (oxy 296, WYW) et pH-mètre (pH mètre 296, WTW), eux mêmes reliés à un boîtier
électrionique (METRA HIT) qui enregistrait en continu (toutes les secondes) les valeurs des
paramètres. Tous les 15 jours, les données étaient récupérées via un logiciel (METRA View).
Ce système a été mis en place par J-L Druilhe (Ingénieur d’études en électronique, UPS
EcoLab).
En parallèle, à intervalles de temps réguliers, matin et soir des échantillons d’eau (100
mL) sont récoltés en sortie du réacteur et dans l’eau d’alimentation située dans le tank pour
des mesures de conductivité, et de dosage des nitrates, orthophosphates et silice. Ces analyses
permettent de vérifier que ces derniers ne sont pas limitant pour la croissance du biofilm.
Après avoir démontré la capacité de ce prototype à produire du biofilm phototrophe, il
est possible de l’utiliser soit comme nourrice à biofilm soit comme microcosme. C’est dans ce
contexte que deux études ont été réalisées, une première étude où le bioréacteur est utilisé
comme une nourrice, le biofilm étant utilisé durant des expérimentations d’écotoxicologie
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 92

Figure 45 – Photographie de la cellule

de mesure positionnée en sortie de bioréac-
teur.

ultérieures, et une seconde étude où le bioréacteur est utilisé comme microcosme afin d’évaluer
la capacité de biodégradation d’un herbicide par le biofilm en développement.

II.2.3.1.4 Bioréacteur prototype RAB, une nourrice à biofilms phototrophes

II.2.3.1.4.1 Objectif de l’expérience

La configuration biofilm permet aux micro-organismes de se protéger du milieu ambiant.

Les stades précoces (premières semaines) de développement de biofilms phototrophes (faible
biomasse) sont caractérisés par des interactions fortes avec la colonne d’eau. Ces interactions
sont moins importantes rapportées à la biomasse pour un biofilm plus mature (forte biomasse,
quelques semaines).

II.2.3.1.4.2 Déroulement de l’expérience

A partir de biofilms phototrophes collectés dans le RAB au cours de la culture C2 pré-

sentée ci-dessus, deux expériences d’écotoxicologie ont été réalisées avec des coupons d’âges
de biofilm de 1,6 et 4,4 semaines. Les deux expériences sont réalisées en microcosme durant
15 jours en été 2009 : la première du 09/08 au 24/08, la seconde du 29/08 au 15/09. Chaque
expérience représente donc un stade de maturation du biofilm différent. Les microcosmes
consistent en des béchers de 500 mL, remplis d’eau du réseau autoclavée au préalable et
enrichie en nutriments (silice, nitrates et orthophosphates) dans des quantités plus impor-
tantes que dans le réacteur qui a produit les biofilms pour ne pas être en carence pendant la
phase d’incubation. Les béchers sont positionnés aléatoirement sur des agitateurs magnétiques
multi-postes (Figure 46). A chaque stade de maturation (1,6 et 4,4 semaines), l’expérience
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 93

se déroule de la façon suivante (Figure 47) : 9 coupons colonisés sont échantillonnés du RAB
de manière aléatoire à la date souhaitée et utilisés comme suit :
– 6 coupons sont gardés intacts et positionnés à la verticale dans les béchers à raison de 1
coupon par bécher. Sur les 6 béchers, 3 sont contaminés avec de l’alachlore (= 3 répli-
cats) à 10 µg.L−1 et 3 sans alachlore servent de référence. Ces microcosmes permettent
d’évaluer l’effet d’une exposition de biofilms phototrophes intacts à l’alachlore dans des
conditions favorables de poursuite de croissance.
– 3 coupons colonisés sont grattés et la biomasse mise en suspension dans un volume
connu (250 mL) d’eau du réseau filtrée sur filtre de 0,22 µm (membrane en acétate de
cellulose, Whatman) et homogénéisée. Sur ces 250 mL, une fraction est utilisée pour
les analyses biologiques et le reste est subdivisé en 6 aliquots identiques répartis dans 6
béchers qui contiennent chacun une lame de verre nettoyée au préalable au détergent.
Sur ces 6 béchers, 3 sont contaminés avec 10 µg.L−1 d’alachlore (= 3 réplicats) et 3
servent de contrôle. Ces microcosmes permettent d’évaluer l’effet d’une exposition à
l’alachlore de biomasse issue de biofilms phototrophes déstructurés, pendant la phase
de colonisation d’un support vierge, les lames de verre.
Les coupons ou lames de verre sont maintenus par des baguettes en plastiques et immergés
dans le milieu. Les microcosmes sont incubés dans une enceinte thermostatée à 20˚C, éclairés
par le dessus par 8 néons "Lumière du jour" (F18W/GRO, Sylvania, Allemagne) pendant 15
jours (photo-période : 16 h jour /8 h nuit).

Figure 46 – Photographie
du dispositif expérimental des
tests écotoxicologiques dans
l’enceinte thermostatée.

Au bout de 5 et 15 jours d’incubation, des échantillons d’eau sont prélevés (100 mL)
pour des analyses physico-chimiques (pH, température, oxygène dissous, nitrates, silice, or-
thophosphates, COD), ainsi que la détermination des concentrations résiduelles en alachlore
et de deux de ses métabolites de biodégradation OA et ESA. Les biofilms sont caractéri-
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 94

RAB

Figure 47 – Schéma du protocole expérimental des tests écotoxicologiques réalisés dans des béchers
(500 mL) avec des biofilms phototrophes cultivés dans le RAB : utilisation de la biomasse sous forme
biofilm fixé sur le coupon, ou mise en suspension dans le milieu, en présence d’une lame de verre
vierge.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 95

sés fonctionnellement (Biolog) et structurellement (descripteurs de biomasse, PCR-DGGE,

composition algale) avant incubation et en fin d’incubation à 15 jours.

II.2.3.1.4.3 Mini-bioréacteurs annulaires rotatifs de laboratoire

II.2.3.1.4.3.1 Description

Au laboratoire Environment Canada, J.R. Lawrence et ses collaborateurs ont développé

des bioréacteurs annulaires rotatifs (Lawrence et al. 2000) pour la culture de biofilms pho-
totrophes (Figure 48). De plus petite taille que notre prototype RAB, ces réacteurs ont
l’avantage de permettre la culture de biofilm, sous conditions hydrodynamiques maîtrisées,
en réplicats (batterie de plusieurs mini-bioréacteurs en parallèles) et ainsi de pouvoir aborder
facilement l’impact d’une variété de facteurs environnementaux ou de contaminants sur la
croissance du biofilm, sa structure et ses fonctionnalités (Lawrence et Neu 2003). Le point
faible de ces réacteurs réside dans le fait que la source lumineuse qui soutient l’activité photo-
trophe est externe au réacteur et que le cylindre interne en rotation (130 trs.min−1 ) supporte
les coupons (12 unités d’échantillonnage), faisant subir une force centrifuge au biofilm qui s’y
développe. La quantité de biomasse obtenue ainsi que le nombre d’échantillons possible sont
bien plus faibles que pour notre prototype RAB (Tableau 12).

A B

1.
2cm 10cm

Figure 48 – Photographies d’un mini-bioréacteur (A) et du dispositif expérimental (B)

II.2.3.1.4.3.2 Objectif de l’expérience

Au cours d’un stage de deux mois, financé par une bourse ATUPS de l’UPS, j’ai eu
l’opportunité de pouvoir travailler avec J.R. Lawrence au sein de son laboratoire Environment
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 96

Types de bioréacteur Mini-bioréacteurs Bioréacteur prototype

Diamètre externe du
64 220
cylindre interne (mm)
Diamètre interne du
85 257
cylindre externe (mm)
Surface des coupons(mm2) 1100 5000
et nombre 12 (polycarbonate) 32 (polyéthylène HD)
Entrefer (mm) 11 18,5
Hauteur du réacteur (mm) 115 297
Volume utile (L) 0,45 5,1
Contôle de la lumière aucun Spectre et photo-période
Taux de dilution (h-1) 0,046 0,32
Inoculum Eau de rivière Suspension de biofilm
Eau du réseau +
Milieu de culture Eau de rivière
nutriments

Tableau 12 – Comparaison des principales caractéristiques des deux types de bioréacteurs annu-
laires rotatifs utilisés dans le cadre de cette étude : Mini-bioréacteurs d’Environment Canada et
prototype RAB d’EcoLab.
II.2. Approches expérimentales en microcosmes 97

Canada. Il m’a permis d’accéder à une batterie de mini-bioréacteurs pour pouvoir tester
l’effet de l’alachlore et du méthanol (solvant de préparation des solutions mères d’alachlore)
sur les communautés de biofilms phototrophes, dans des conditions de fonctionnement se
rapprochant des conditions naturelles (eau de rivière, apport continu de micro-organismes
par l’alimentation). L’objectif a donc été de réaliser une étude écotoxicologique en conditions
maîtrisées avec des réplicats.

II.2.3.1.4.3.3 Déroulement de l’expérience

Lors de cette expérimentation, 12 mini-bioréacteurs ont été utilisés pendant 5 semaines

du 10 Mai au 15 Juin 2010, alimentés par de l’eau de rivière comme source d’inoculum
microbien et de nutriments et maintenus dans une pièce thermostatée à 21 ± 2˚C avec
éclairage en continu (Figure 48). Quatre traitements sont testés, chacun avec 3 bioréacteurs
pour réaliser des triplicats : une culture sans contaminant rajouté, une exposition à 1 µg L−1
d’alachlore (Chem Service, Inc. USA, purity 98 %), une exposition à 10 µg.L−1 d’alachlore et
une exposition à 0,0025 % (v/v) de méthanol (analytic grade, Fisher Scientific, Nepean, ON,
Canada). Chaque mini-bioréacteur est alimenté par l’eau de rivière à raison de 500 mL.j−1 ,
donnant un temps de séjour moyen de 24 h.
Au niveau de l’alimentation de chaque mini-bioréacteur (Figure 48), deux tuyaux se
rejoignent :
– un tuyau connecté à un bac réfrigéré à 4˚C contenant l’eau de rivière via une pompe
péristaltique multicanaux (Watson Marlow, Wilmington, MA),
– un tuyau relié à une bouteille de 2 L remplie d’eau déminéralisée préalablement auto-
clavée et contenant les concentrations correspondantes pour des solutions stocks d’ala-
chlore, de méthanol ou sans contaminant rajouté suivant le traitement considéré. Le
liquide de la solution stock, préparée tous les 15 jours, alimente les mini-bioréacteurs via
une pompe péristaltique multicanal (Watson Marlow, Wilmington, MA). Chaque bou-
teille alimente 3 mini-bioréacteurs qui correspondent à 3 réplicats, elles sont maintenues
fermées sur des agitateurs magnétiques, et recouvertes de papier d’aluminium pour les
bouteilles contenant de l’alachlore afin de limiter les processus de photodégradation.
A l’issue des 5 semaines de colonisation, l’ensemble des supports est échantillonné de
chaque mini-bioréacteur et analysé par une approche multiphasique soit immédiatement
(la Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM), la chlorophylle a et les Community
Level Physiological Profil (CLPP)).
 Chapitre III

Volet analytique

L’ensemble des expérimentations avec les différentes analyses réalisées sont présentées
dans le Tableau 13. Il permet de synthétiser et comparer les différentes approches méthodo-
logiques et analytiques.
Au cours des travaux de thèse, que ce soit durant la colonisation in situ de biofilms
sur des supports naturels ou artificiels ou durant les différentes approches expérimentales en
microcosmes, les propriétés physico-chimiques de l’eau ont été caractérisées. Pour les eaux des
différents sites d’étude, la température, la conductivité, la concentration en oxygène dissous,
ainsi que le pH étaient mesurés en utilisant des sondes spécifiques in situ. Les valeurs de
pH et de conductivité étaient mesurées avec un conductimètre (Hanna HI 99 1300) et un
pH-mètre (320 WTC associé à une sonde sentix 41, WTV), et l’oxygène dissous était mesuré
avec l’aide d’un oxymètre (oxi 323 associé à une sonde oxical-S) et les valeurs de température
étaient représentées par la moyenne des valeurs données par le pH et l’oxymètre.
En parallèle, des échantillons d’eau étaient collectés (environ 100 mL) quelle que soit
leur origine (rivières et microcosmes), pour analyser les paramètres suivants : les concen-
trations en nitrates (N-NO− + 3−
3 ), ammonium (N-NH4 ), orthophosphates (P-PO4 ), phosphore
total (Pt), et silice (SiO2 ). Ces paramètres étaient mesurés par une méthode classique de co-
lorimétrie (Secoman, Uvi Light, XT5), en accord avec les méthodes standard (APHA 1992).
L’ensemble de ces paramètres n’était pas systématiquement mesuré, cela dépendait de l’ex-
périence (Tableau 13). Les concentrations en ammonium étaient déterminées dans les 10
jours qui suivaient la collecte de l’eau et les concentrations en orthophosphates dans la se-
maine. Pour les dosages d’ammonium, de silice, d’orthophosphates, de nitrates et de COD,
les échantillons étaient préalablement filtrés sur 0,45 µm (membrane en acétate de cellu-
lose, 25 mm diamètre, Whatman) et stockés à 4˚C jusqu’à analyse. Les concentrations en
carbone organique dissous (COD) étaient analysées en utilisant un catalyseur de platine à
650˚C (Shimadzu, Model TOC 5000, Kyoto, Japon). Pour les dosages du phosphore total, les
échantillons étaient stockés directement à 4˚C sans subir d’étape de filtration.
III.1. Analyses physico-chimiques 99

III.1 Analyses physico-chimiques

Toutes ces mesures (in situ ou collecte d’échantillons d’eau) ont été réalisées à des in-
tervalles de temps réguliers et à des moments identiques de la journée afin de limiter la
variabilité des mesures au cours de la journée. Les échantillons d’eau étaient transportés au
laboratoire dans des glacières. La matière en suspension était mesurée par pesée d’un filtre
séché à l’étuve (105˚C, 4 h) après filtration sur membrane à 0,45 µm de seuil de coupure
(membrane en acétate de cellulose, 47 mm diamètre, Whatman).
Expérience Un exemple de "service écologique" Une approche écologique De l'écologie à l'écotoxicologie
Bioréacteur Taylor - Couette Microcosme Microcosme Mini-bioréacteur annulaire
Dispositif Microcosme In situ
(2 cultures) "petit" (Bécher) "moyen" (aquarium) rotatif (Canada)
Diamètre interne du cylindre
Diamètre interne du cylindre externe :
L : 30 cm externe : 85 mm
257 mm
l : 20 cm Largeur de l'entrefer : 11 mm
Dimensionnement Bouteille ambrée de 450 mL Largeur de l'entrefer : 18,5 mm Bécher de 500 mL
h : 20 cm Hauteur du bioréacteur : 115
Hauteur du bioréacteur : 297,5 mm
Volume d'eau :10 litres mm
Volume d'eau: 5,04 litres
Volume d'eau: 0,45 litres
Durée 10 jours 5 semaines 8 semaines en continue 15 jours 30 jours 5 semaines
Site d'échantillonnage G, M et W M et S - - M et S South Saskatchewan River
Descripteurs physiques
Eclairage (µmol.m-2 .s-1) NON naturel (mars-avril) artificiel : 130 (C1) et 180 (C2) artificiel (37) artificiel (44) artificiel
T°C 20 (enceinte thermostatée) x - - 20 (enceinte thermostatée) 20 (salle climatisée)
Vitesse du courant (m.s-1) - x 0,3 - - 0,44
Débit d'entrée - - 26 mL.min-1 - - 500 mL.jour-1
Descripteurs chimiques
Conductivité - x x x x -
III.1. Analyses physico-chimiques

pH - x x x x -
N-NO3 - x x x x -
SiO2 - x x x x -
P-PO4 - x x x x -
COD (carbone organique dissous) - x x x -
Analyse multi-résidues des pesticides - x - - -
Alachlore x - x x x
Métabolites de l'alachlore x - x - -
Stratégies d'échantillonnage (Prélèvement et préparations des échantillons)
Nature des supports expérimentaux NON lame de verre polyéthylène polyéthylène polycarbonate
Origines des biofilms Suspension de biofilm naturel - Suspension de biofilm naturel Bioréacteur eau de rivière
50 ("suspension") ou
Volume suspensions initiale (mL) - 50 (C1) ou 90 (C2) 50 -
90 ("plate")
Descripteurs biologiques (Volume prélevé)
Structuraux
Chlorophylle a - x x x x x
Matière sèche sans cendre x x x x x x
Microscopie confocale - - - - x
Diversité bactérienne (DGGE 16S) - x x - x -
Diversité bactérienne (T-RFLP) - - - x - x
Diversité algale (observation) - - x x (diatomées) x (diatomées) x (diatomées)
Diversité dees Eucaryotes (DGGE 18S) - - x - - -
Fonctionnels
BIOLOG - - - x x x
Production bactérienne - - - - - -
Activité de la Glutathione S-transférase (GST) - - - - x -
Chapitre de la partie 3 "Etudes expérimentales" CHAPITRE 1 CHAPITRE 2 CHAPITRE 3

Tableau 13 – Récapitulatif de chaque expérience et des analyses réalisées

100
III.2. Analyse des pesticides 101

III.2 Analyse des pesticides

III.2.1 Analyses de l’alachlore et de deux de ses métabolites de bio-

dégradation
La collecte des échantillons d’eau destinés à l’analyse des pesticides (volumes variables
en fonction des molécules et des recommandations du laboratoire d’analyse) était réalisée
avec du matériel en verre et l’eau conservée dans des bouteilles en verre ambré pour limiter
les processus d’adsorption et bio/photodégradation jusqu’à analyse. Pour les analyses de
l’alachlore, les échantillons d’eau étaient filtrés sur des GF/F (0,7 µm de seuil de coupure). Les
analyses étaient effectuées au Laboratoire Département de l’Eau (LDE, Toulouse, France), en
utilisant une HPLC couplée à un spectromètre de masse en tandem (HPLC-MS-MS, Thermo
Fisher, model E-Quan TSQ Quantum ultra), avec une source d’ionisation par électrospray
(« Electrospray Ionization », ESI, en anglais) équipé d’une colonne de pré-concentration
(Thermo Fisher Hypersil GOLD C18, taille des particules 12 µm, 20 x 2,1 mm). L’analyse se
faisait par une injection directe de 2 mL d’échantillon. La séparation de l’alachlore est permise
par l’utilisation d’une colonne Thermo Fisher Hypersil GOLD C18 (taille des particules 3 µm,
50 x 2,1 mm). La limite de quantification (LQ) était de 0,005 µg.L−1 . Pour mettre en évidence
une biodégradation potentielle de l’alachlore, les deux métabolites principaux connus dans la
littérature pour être issus de processus de biodégradation OA (Oxanilic Acid ) et ESA (Ethane
Sulfonic Acid ) ont été analysés par H. Preud’homme (Ingénieur, LCABIE à Pau). Pour ces
analyses, les échantillons d’eau (2 mL) étaient filtrés sur membrane à 0,22 µm de seuil de
coupure des tubes SpinX à filtre et à centrifugation (10 000 g, 10 min) (Sigma-Aldrich), puis
transférés dans des vials (Agilent Technologies) et stockés à -20˚C jusqu’à analyse. L’analyse
se faisait en mode directe en utilisant une UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)
couplée à un spectromètre de masse en tandem (UPLC-MS/MS) avec une source d’ionisation
par électrospray (ESI) (Protocole détaillé en Annexe). En parallèle des dosages de OA et
ESA et en plus du dosage réalisé par le LDE, l’alachlore était de nouveau analysé.

III.2.2 Dosage des pesticides

Durant l’approche expérimentale in situ uniquement, afin de caractériser ponctuellement
le niveau de pollution en pesticides aux deux sites d’études (M et S), trois échantillons d’eau
de 3 L ont été prélevés sur chaque site et transportés dans des bouteilles en verre préalable-
ment autoclavées. Ces prélèvements ont été réalisés à trois dates clefs de l’étude : le 27 Mars
2007, soit une semaine après la mise en place des cagettes ; le 18 mars, qui correspond au jour
III.3. Analyses biologiques des biofilms 102

de prélèvement d’eau utilisée pour remplir les microcosmes du test 1 de biodégradation de

l’alachlore, et le 26 Avril, qui correspond au jour de prélèvement d’eau utilisée pour remplir
les microcosmes du test 2. Pour chaque échantillon, 1,5 L sont filtrés (« eau filtrée ») sur des
filtres en acétate de cellulose de seuil de coupure 0,45 µm et stockés avec 10 mL de dichloro-
méthane en chambre froide (4˚C). L’autre moitié (« eau brute ») est également stockée avec
10 mL de dichlorométhane (qualité pesticide, VWR) en chambre froide. Les échantillons sont
ensuite préparés par extraction au dichlorométhane comme décrit par Devault et al. (2007)
avant leur passage à la GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). L’extraction des
molécules de pesticides se faisait par une méthode d’extraction liquide-liquide, en utilisant le
dichlorométhane comme solvant organique. Les 1,5 L d’eau échantillonnés sont placés dans
une ampoule à décanter. L’extraction se déroule en trois phases. Une première extraction
avec 70 mL de dichlorométhane. Aprés avoir agité très fortement le mélange, laisser décanter
et récupérer le dichlorométhane (phase la plus dense) qui contient les molécules de pesticides.
Il faut recommencer cette étape 2 autres fois avec 60 mL de dichlorométhane.
L’extrait obtenu est séché par un passage sur du sulfate de sodium anhydre puis passé
à l’évaporateur rotatif (à une température de 40˚C). Une fois l’extrait complètement séché,
il est dilué dans 2 mL d’acétonitrile (qualité pesticide, VWR), passé aux ultrasons pour
homogénéiser le mélange. Les échantillons sont prêts à être injectés et séparés par chromato-
graphie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse (GC-MS Thermo Fisher, Model
Trace DSQ) selon Devault et al. (2007). Un total de 33 pesticides (Tableau 16 en Annexe),
communément utilisés dans le sud ouest de la France, sont recherchés dans les échantillons.
Parmi ces 33 pesticides, 17 herbicides (Aclonifen, Atrazine, Atrazine desethyl, Chlorotoluron,
Cyanazine, Hexazinone, Imazathabenz-methyl, Isoproturon, Linuron, Metazachlor, Metola-
chlor, Metoxuron, Monolinuron, Sebuthylazine, Simazine, Terbuthylazine, Trifluralin) et 6
fongicides (Cyproconazol, Epoxiconazol, Fenpropimorph, Flusilazol, Pendimethalin, Tebuco-
nazol) ont été quantifiés à 3 temps durant le développement du biofilm.

III.3 Analyses biologiques des biofilms

III.3.1 Préparation des échantillons de biofilms

Les galets ou les supports artificiels (lames de verre, coupons en polyéthylène ou en PVC)
colonisés par du biofilm phototrophe étaient collectés et transportés au laboratoire dans des
caisses en bois (700 mm x 300 mm x 400 mm). Les substrats collectés n’étaient pas transportés
dans de l’eau de rivière pour éviter les phénomes d’arrachage du biofilm par des mouvements
d’eau. Chaque galet était maintenu durant le transport dans un sac de congélation fermé, et
III.3. Analyses biologiques des biofilms 103

les substrats artificiels étaient maintenus fixés sur leurs dispositifs de manière à éviter tout
dommage sur le biofilm et placés dans des sacs poubelle humidifiés. Arrivés au laboratoire,
tous les supports étaient gardés à 4˚C jusqu’aux traitements ou stockages systématiquement
effectués dans les 4 heures qui suivaient le prélèvement.
Les biofilms étaient détachés des supports artificiels ou naturels par grattage soit avec
l’aide d’une brosse à dent préalablement traitée avec une solution de NaOH à 1N pour enlever
toute trace d’ADN (pour les supports naturels), soit avec une lame en verre de microscopie
préalablement nettoyée à l’alcool (pour les supports en verre et en polyéthylène), soit avec
un morceau de silicone stérile maintenu par une pince préalablement autoclavée (pour les
supports en polycarbonate) (Figure 49). Cette étape de récupération de la biomasse est une
étape critique et souvent une source de sur ou sous estimation de la biomasse, c’est pourquoi
à chaque type de substrat, le matériel utilisé pour récupérer la biomasse était adapté aux
dimensions des supports. Plusieurs études ont montré l’efficacité relative du brossage ou du
grattage des galets (Jones 1974 ; Cattaneo et Roberge 1991), et ils ont observé l’existence
d’une quantité importante d’algues perdue après le nettoyage des supports (Murdock et
Dodds 2007). Les biofilms étaient mis en suspension (annotée « suspension initiale ») dans un
volume (volume variable suivant la quantité de biomasse et le nombre d’analyses à réaliser)
d’eau de rivière ou du réseau au préalable filtrée (sur 0,22 µm, membrane en acétate de
cellulose, Whatman) et/ou autoclavée, puis homogénéisée (13 500 tpm, Ultra Turrax, T25,
1 min). Cet homogénat de suspension de biofilm est par la suite aliquoté pour les différentes
analyses biologiques présentées dans le paragraphe suivant. Les analyses biologiques étaient
de deux types : les descripteurs fonctionnels ou structurels (Figure 49).

III.3.2 Descripteurs structurels

III.3.2.1 Descripteurs de biomasse

III.3.2.1.1 Matière sèche et matière sèche sans cendre

La matière sèche (M S) en mg.mL−1 était mesurée par pesée d’un culot sec (24 h à 110˚C
ou 36 h à 80˚C), d’un aliquot de la suspension de biofilm initiale centrifugé à 3 500 g pendant
15 minutes (Heraeus Function Line) suivant la formule suivante :

p2 − p1
MS =
v
avec p1 le poids de la coupelle sèche et sans culot (en mg), p2 le poids de la coupelle avec
culot et après le passage à l’étuve (en mg) et v le volume de l’aliquot (en mL).
III.3. Analyses biologiques des biofilms 104

Descr
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Bi
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Di
versi
té/composi
ti
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ti
on
al
gal
e,DGGE,T-RFLP

Figure 49 – Schéma récapitulatif des analyses réalisées au cours de ces travaux de thèse sur les
différents types de supports de colonisation utilisés
III.3. Analyses biologiques des biofilms 105

Le culot a été par la suite carbonisé à 550˚C pendant 8 h pour fournir la matière sèche
sans cendre (M SSC) en mg.cm−2 donnée par l’équation suivante :

p3 − p2 V
M SSC = ×
v S
avec p3 le poids de la coupelle après calcination (en mg), S la surface du support de
colonisation (en cm2 ), V le volume de la suspension initiale (en mL) et v le volume de
l’aliquot (en mL).
La matière sèche sans cendre représente à la fois la composante des autotrophes et hété-
rotrophes ainsi que le carbone détritique.

III.3.2.1.2 Chlorophylle a

La teneur en chlorophylle a des échantillons de biofilm est mesurée au spectrophotomètre

(663, 645 et 630 nm) à partir des équations trichromatiques (Jeffrey et al. 1997) après extrac-
tion à l’acétone 90 % (4 h, à l’obscurité et à température ambiante) du culot homogénéisé (13
500 trs.min−1 , Ultra Turrax T25) et désagrégé (Sonde à Ultra Son, 1 min). La chlorophylle
a représente la composante des autotrophes (Biggs et Close 1989).

III.3.2.1.3 Index autotrophique et ratio MSSC / MS

L’index autotrophique ("autotrophic index " en anglais AI) défini comme le ratio entre
la MSSC et la chlorophylle a, indique l’importance relative des organismes autotrophes par
rapport aux organismes hétérotrophes et aux détritus (Biggs et Close 1989). Une valeur
d’index autotrophique jusqu’à 100 indique généralement une communauté dominée par des
algues, et supérieure à 400 une communauté dominée par des organismes hétérotrophes et/ou
des détritus organiques. De même, pour chaque échantillon le rapport entre MSSC et MS a
été calculé pour fournir une indication des proportions de la fraction organique au sein du
biofilm.

III.3.3 Analyse de la composition algale

Pour les deux expériences en bioréacteur prototype RAB, ce travail a été réalisé par L. Ten-
Hage (Maître de conférences à l’UPS, EcoLab) pour la détermination des 3 groupes de micro-
algues (Diatomées, Chlorophytes et Cyanobactéries) sur un pool de 3 réplicats d’un volume
de suspension (5 mL), préservé dans une solution formolée à 3 %, stockée dans le noir et à
4˚C jusqu’à comptage et identification. La densité totale et le pourcentage d’abondance ont
été déterminés avec un microscope inversé (Axiovert 10, Zeiss, West Germany) comme décrit
III.3. Analyses biologiques des biofilms 106

par Utermöhl (1958). Pour les échantillons qui proviennent des expériences sur la réponse
du biofilm à l’alachlore, seule la détermination des diatomées a été réalisée par V. Roubeix
(Post-doctorant du Cemagref de Bordeaux). Un volume connu d’un aliquot de la suspension
initiale de biofilm homogénéisé (5 mL) de chaque condition d’exposition est fixé avec 3 %
de formaldéhyde puis transféré au Cemagref de Bordeaux pour analyses. Les échantillons
ont été digérés dans du peroxyde d’hydrogène porté à ébullition (le ratio échantillon total /
peroxyde d’hydrogène était de 2/3 v/v) pour digérer les composés organiques cellulaires, puis
centrifugés (2500 g, 10 min), puis le culot est récupéré et rincé avec de l’eau déminéralisée
(2 fois). Une fois rincé, le culot est resuspendu dans de l’eau distillée, et un sous-échantillon
de 200 µL est pipeté, puis monté sur lame de microscope avec une résine possédant un
indice de réfraction élevé (1,73) (Naphrax c , Brunel Microscopes Ltd UK). L’identification
et le comptage des diatomées ont été effectués au microscope (grossissement x 1000, Leica
Microsystems GmbH, Wetzlar, G) au nombre de 400 frustules par échantillon et au niveau
de l’espèce à partir de la littérature taxonomique de l’Europe Centrale (Krammer et Lange-
Bertalot 1986-1991) et des dernières nomenclatures en date.

III.3.4 Microscopie confocale à balayage laser

Seuls les échantillons provenant de l’expérience réalisée en mini-bioréacteurs ont été ana-
lysés par microscopie confocale. Chaque coupon extrait de chaque mini-réacteur était coupé
en morceaux de 1 cm2 et fixé dans le couvercle d’une petite boîte de Pétri par l’utilisation de
silicone dépourvu d’acide (Dow Corning # 3140 acid-free silicone, WPI, Inc., Sarasota, FL).
Chaque morceau ainsi fixé, était marqué puis analysé comme décrit en détail par Lawrence et
al. (2004). L’analyse d’image numérique de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM,
Confocal Laser Scanning Microscopy), réalisée en fines sections, a été utilisée pour déter-
miner des paramètres tels que la profondeur du biofilm, la biomasse bactérienne, la masse
des exopolymères, la biomasse des cyanobactéries, et la biomasse photosynthétique totale à
différentes profondeurs.

III.3.5 Structure des communautés bactériennes (DGGE et T-RFLP)

Les techniques de cultures traditionnelles ne permettent pas d’estimer correctement la
diversité et la structure des communautés microbiennes, en effet seulement 0,1 % des mi-
croorganismes sont cultivables (Azam et al. 1983). L’utilisation de cultures, en plus de sélec-
tionner les microorganismes cultivables, sont susceptibles de sélectionner la structure globale
des communautés, en favorisant par exemple les individus à taux de croissance rapide et
III.3. Analyses biologiques des biofilms 107

capables de se développer sur des milieux plus ou moins riches. L’observation au microscope
pour les procaryotes permet de réaliser un comptage mais non une identification, pour les
eucaryotes l’identification est possible, cependant pour certaines espèces, vu la taille et les
caractéristiques morphologiques parfois très proches (Stevenson et al. 1996) ceci reste délicat,
et engendre une sous estimation de la diversité.
Les approches moléculaires, disponibles depuis une quinzaine d’années, ont permis une
meilleure connaissance de la biodiversité et de la structure des communautés de micro-
organismes (Von Wintzingerode et al. 1997). Il existe deux types d’approches moléculaires,
intégrant ou pas une étape d’amplification par PCR (réaction en chaîne par polymérase, en
anglais « Polymerase Chain Reaction »). Parmi les techniques qui reposent sur une étape
d’amplification, deux groupes se distinguent, les méthodes de typages moléculaires (« finger-
printing methods », en anglais) et les méthodes de clonage / séquençage plus coûteuses, plus
longues et difficiles à réaliser (Figure 50). Les méthodes de typages moléculaires présentent
une forte robustesse, et une rapidité d’utilisation pour des analyses comparatives de diffé-
rentes communautés ou des analyses pour évaluer la dynamique de l’évolution temporelle des
communautés.

Figure 50 – Différentes approches moléculaires utilisées pour l’étude des communautés microbiennes
(extrait de Dorigo et al. 2005)
III.3. Analyses biologiques des biofilms 108

Malgré quelques biais techniques, apportés par ces approches moléculaires basées sur
des amplifications de gènes cibles (Miralles 2007), Morris et al. (2002) soulignaient que ces
biais sont de moindre importance en milieu aquatique face à l’ensemble des biais associés
aux différentes stratégies d’échantillonnage et d’analyse de données (Fromin et al. 2002 ;
Blackwood et al. 2003).
Dans le cadre de ce travail de thèse, deux méthodes de typage moléculaire ont été utili-
sées, une avec l’étape de digestion enzymatique, la T-RFLP (« Terminal Restriction Fragment
Length Polymorphism », en anglais) et l’autre sans cette étape, la DGGE (« Denaturing Gra-
dient Gel Electrophoresis », en anglais) (Figure 50). Ces deux techniques sont les plus utilisés
dans la littérature de ces 10 dernières années dans le domaine de l’écologie microbienne. Ces
deux méthodes sont utilisées aussi bien pour des communautés procaryotes du sol (T-RFLP :
Dunbar et al. 2000 ; DGGE : Enwall et Hallin 2009) ou en milieu aquatique avec les pro-
caryotes (T-RFLP : Moss et al. 2006 ; Anderson-Glenna et al. 2008 ; Vercraene-Eairmal et
al. 2010 ; DGGE : Massieux et al. 2004 ; Dorigo et al. 2008 ; Villeneuve et al. 2010) et les
eucaryotes (DGGE : Villeneuve et al. 2010) (Figure 51).

'**( 75)/3
3&5

'LJHVWLRQDYHF
HQ]\PHGH
&KDQJHPHQW UHVWULFWLRQ
*&

3ULQFLSH Figure 51 – Présentation et

comparaison du déroulement
GHOD
de deux méthodes de typage
(OHFWURSKRUqVH

PpWKRGH moléculaire, la T-RFLP et la

DGGE (d’après Okubo et Su-
giyama 2009).

6pSDUDWLRQ 6pTXHQFHV
7DLOOHVGHV75)V
EDVpHVXU &*$7

Il existe un débat important sur la question de la meilleure méthode de typage molécu-

laire (Gao et Tao 2011). De nombreux travaux comparent ces deux méthodes de T-RFLP et
DGGE, que ce soit en milieu terrestre ou aquatique (par exemple : Spiegelman et al. 2005 ;
Enwall et Halin 2008 ; Chen et al. 2010 ; Carballa et al. 2011). Comme décrit par Fechner
(2010), pour l’ensemble de ces types de méthode, les étapes d’extraction d’ADNg et d’ampli-
fication par PCR apportent déjà des biais. L’ADN extrait ne peut pas être considéré comme
III.3. Analyses biologiques des biofilms 109

parfaitement représentatif de l’échantillon, de plus suivant la nature de l’échantillon, mais

également suivant la technique utilisée, les rendements peuvent être différents (Lear et al.
2010). En parallèle de ces biais liés aux étapes d’extraction et d’amplification, chacune des
méthodes présente des avantages et des inconvénients propres à chacune d’elle (Gao et Tao
2011). Parmi de nombreuses différences, nous pouvons citer :
– le coût : la DGGE globalement est une technique moins onéreuse, avec beaucoup moins
d’étapes que la T-RFLP,
– d’un point de vue technique : la séparation des bandes sur le gel de polyacrylamide est
très sensible aux conditions de l’électrophorèse ainsi que du choix des amorces (Okubo
et Sugiyama 2009) et la comparaison gel-gel est très délicate (Marsh 1999 ; Moeseneder
et al. 1999). De plus, la méthode de T-RFLP permet de comparer par gel ou « run »
un nombre plus important d’échantillons. Pour la T-RFLP, la présence d’un standard
taille interne à l’intérieur de chaque échantillon facilite la comparaison des échantillons
entre eux (inter ou intra « run »).
– l‘identification des micro-organismes : un des points forts de la DGGE réside dans la
possibilité d’obtenir des informations taxonomiques par excision d’une bande d’un gel,
sa ré-amplification, et son séquençage (exemple dans Lyautey et al. 2005b). La T-RFLP
rend possible l’attribution phylogénétique à partir de la taille des T-RFs en utilisant
des bases de données (Kent et al. 2003).
– la sensibilité : avec une technique comme la DGGE, la limite de détection pour une
espèce est d’environ 1 % de la population totale, ce qui signifie qu’en-deça de cette
limite, l’espèce ne peut pas être détectée ; avec la T-RFLP, le seuil de détection se situe
entre 0,1 et 1 % (Luna et al. 2006). En effet malgré des séquences différentes, certains
fragments peuvent migrer ensembles et être considérés comme des OTUs identiques, ce
qui exclue la mise en évidence d’OTUs rares (Vallaeys et al. 1997).
En comparant la résolution des deux méthodes, la plupart des études enregistraient des
résolutions plus importantes pour la méthode de T-RFLP (par exemple Horz et al. 2001 ;
Nunan et al. 2005) voir similaires entre elles (Moeseneder et al. 1999 ; Smalla et al. 2007). A
l’inverse, une étude comparative entre la DGGE et la T-RFLP sur l’analyse des communautés
dénitrifiantes, révélait une résolution légèrement plus importante pour la DGGE que pour la
T-RFLP (Enwall et Hallin 2008) lorsque les analyses combinaient les résultats des 3 enzymes
de restriction utilisées. Dans le cadre de ce travail, pour chaque échantillon, 3 enzymes de
restrictions étaient testées, Hpa, HaeIII, et HinfI, les profils qui permettaient au mieux de
discriminer les échantillons étaient conservés. L’augmentation du nombre d’enzymes de res-
III.3. Analyses biologiques des biofilms 110

triction peut augmenter la résolution (Moss et al. 2006) mais engendrer une augmentation
du bruit de fond par la suite au cours des analyses statistiques.
Il est important de préciser qu’à travers l’utilisation de la T-RFLP ou de la DGGE, pour
les amorces qui seront utilisées dans le cadre de ce travail, les deux méthodes sont susceptibles
de cibler des OTUs ou T-RFs affiliés aux Cyanobactéries, ce qui mène à une surestimation
de la diversité des bactéries non photosynthétiques (Cole et al. 2009 pour la T-RFLP, et
Lyautey et al. 2005 pour la DGGE).
Plusieurs auteurs soulignaient que la méthode de T-RFLP est un outil pertinent et ap-
proprié à des communautés de niveaux faibles ou intermédiaires en termes de diversité, et
la DGGE pouvait être une technique appropriée à des communautés plus complexes, hau-
tement hétérogènes et riches en microorganismes (Engebretson et Moyer 2003 ; Okubo et
Sugiyama 2009). Toute technique, quelle qu’elle soit, présentera toujours des avantages et
des inconvénients, il est important d’en être conscient et de maitriser au mieux les différentes
sources d’erreur possibles et de bien comparer les échantillons qui ont subi les mêmes traite-
ments (Schloss et al. 2003). Malgré ces inconvénients, ces techniques apportent de nombreuses
informations et ont permis de révolutionner notre vision et notre compréhension de la biodi-
versité microbienne et l’influence de facteurs environnementaux, sur ces mêmes communautés
aquatiques et terrestres (Yannarell et Triplette 2005 ; Loisel et al. 2006).

III.3.5.1 Préparation des échantillons

Après centrifugation d’un aliquot compris entre 20 et 50 mg de MS de la suspension initiale

du biofilm (Lyautey et al. 2005b) (12 000 g à 4˚C pendant 20 min, Heraeus Multifuge), le
culot a été stocké à -80˚C jusqu’aux analyses.

III.3.5.2 Extraction de l’ADN génomique total (ADNg)

Au cours de ces travaux, suivant les expériences, les ADN génomiques totaux n’ont pas
été extraits par l’utilisation du même kit d’extraction. Trois kits d’extraction commerciaux
ont été utilisés : le kit d’extraction Ultra Clean TM Soil DNA (MoBio Laboratories, Inc.,
Carlsbad, CA, USA), le kit d’extraction DNeasy Plant mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)
et le kit Power Soil DNA (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA). Les extractions
étaient réalisées en accord avec le protocole du fournisseur (Qiagen Laboratories, Mobio
Laboratoire). Dans tous les cas à l’issue de l’extraction, l’intégrité et la concentration des
ADN génomiques extraits ont été vérifiées et calculées soit par migration des échantillons sur
un gel d’agarose 1 % (Sigma-Aldrich), pendant 25 min à 100 V, dans du tampon TAE 1X avec
l’utilisation d’un marqueur de masse (Biorad) comme décrit par Lyautey et al. (2005), soit par
III.3. Analyses biologiques des biofilms 111

quantification avec marquage au SYBR Green (Sigma Aldrich) par fluorimétrie (Fluoroscan
Ascent, Labsystem) en se référant à une courbe étalon, et enfin soit au nanodrop.

III.3.5.3 Amplification par PCR

Pour chaque amplification, de l’ADN témoin (Escherichia coli) a été utilisé comme réfé-
rence positive et de l’eau milli-Q stérile comme référence négative. Pour chaque échantillon,
un rendement d’amplification est calculé.

III.3.5.3.1 La T-RFLP

Le gène ARNr 16S a été amplifié par PCR comme décrit ultérieurement par Bruneel et al.
(2006) avec quelques modifications. Les amorces marquées FAM8F (5’-6-carboxy-fluorescein-
phosphoramidite-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) (Eurogentec, 295 Liege, Belgium)
(Lane 1991) et HEX 1489R (5’-hexa-chloro-fluorescein-phosphoramidite- TAC CTT GTT
ACG ACT TCA-3’) (Invitrogen, Carlsbad, USA) (Marchesi et al. 1998) sont décrites comme
universelles des domaines bactériens. Le milieu réactionnel pour l’amplification était de 50
µL contenant 30 ng d’ADN template, 25 µL AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied Bio-
systems) et 0,5 µL de chaque amorce. L’étape d’amplification a été réalisée en utilisant un
thermocycleur (Applied Biosystems) avec le programme suivant : 5 min hot start à 95˚C, suivi
par 35 cycles de dénaturation (45 s à 95˚C), annealing (45 s à 55˚C), une étape d’extension
(1 min à 72˚C), et une extension finale à 72˚C pendant 10 min. Une fois amplifiée, les ADNg
étaient purifiés par utilisation de kit commercial de purification GFX DNA (GE, Healthcare)
en suivant le protocole du manuel d’utilisation. Le produit PCR purifié était récupéré dans
30 µL d’eau ultra pure. Par une migration sur gel d’Agarose 1,0 % dans du tampon TBE et
le gel visualisé avec une caméra CCD avec l’aide du marqueur de masse Smartladder (200-
10000 pb)(Eurogentec), la quantité et l’intégrité des produits PCR ont été analysées. Une
quantité de 100 ng a été digérée avec les enzymes de restriction, HaeIII, HinfI ou Hpa (New
England Biolabs, Promega) suivant les expériences à 37˚C pendant 3 h. Des premiers tests
sont effectués pour le choix des enzymes de restriction, l’enzyme choisie est celle qui permet
au mieux de discriminer les échantillons, celle qui apporte le plus de polymorphisme. Les
produits digérés seront passés au séquenceur après une étape à 95˚C pour séparer les deux
doubles brins d’ADN.

III.3.5.3.2 La DGGE

L’ADN extrait a été quantifié par comparaison à un marqueur de masse (10 µL / puits ;
Fermentas, réf. : SM1263) après électrophorèse sur gel d’agarose 1 % contenant du bromure
III.3. Analyses biologiques des biofilms 112

d’éthidium à 5 µg.mL−1 (Sigma Aldrich, réf. E1510). Les bandes ont été révélées par UV tran-
sillumination, puis une image a été capturée avec une caméra CCD et le logiciel BIOCAPT
(Vilbert Lourmat). Une courbe étalon a été réalisée à chaque quantification sur l’intensité re-
lative des bandes du marqueur par le logiciel d’analyse d’imagerie Bio1D (Vilbert Lourmat).
Une quantité définie de l’ADN extrait (30 ou 50 ng suivant les expériences) a été utilisée
pour la PCR d’après le protocole de Lyautey et al. (2003). La région variable V3-V5 (500
pb), universelle au domaine bacteria, de l’ADNr 16S a été amplifiée en utilisant les amorces
341-F (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) et 907F (5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’)
(Proligos). L’amorce 341-F possède un clamp G-C de 40 nucléotides à l’extrémité 5’ dans le
but d’améliorer la résolution de la séparation des fragments sur DGGE (Muyzer et Smalla
1998). L’amplification a été réalisée avec le Mastercycler (Eppendorf) sur un volume final
de 50 µL contenant 1x de tampon de réaction, 2,5 mM de MgCl2 (Promega, réf. : M8301),
0,3 mg.mL−1 d’albumine sérique bovine, 0,48 µM de chaque amorce, 200 µM de désoxy-
nucléotides tri-phosphate et 2,5 U de Taq polymerase (Promega, réf. : M8301). Chaque PCR
a été conduite avec un témoin positif (Escherichia Coli, 1 ng.L−1 ) et négatif (eau milliQ).
La concentration d’ADN amplifié a été déterminée suivant la méthode décrite précédemment
après migration sur gel d’agarose 1,65 %. La DGGE a été réalisée verticalement en utilisant
le D-Code Universal Mutation Detection System (BioRad). Une quantité de 500 ng de l’ADN
amplifié a servi à la séparation sur gel contenant un gradient de 30 à 70 % de dénaturant (où
100 % de dénaturant correspond à 7 M d’urée et 40 mL de formamide déionisée). La migration
a été effectuée durant 18 h à 100 V et à 60˚C. Après l’électrophorèse, le gel a été marqué avec
du SYBR Green I (Sigma Aldrich, dilution 1 : 20 000) puis visualisé selon la méthode décrite
précédemment. Dans le but d’éviter les biais induits par la variabilité méthodologique des
gels, les DGGE (20 échantillons / gel) ont été lancées avec des échantillons communs servant
de référence et permettant la comparaison des profils obtenus depuis les trois différents gels.
La présence ou absence d’une bande (définie comme une unité taxonomique opérationnelle
OTU) pour chaque échantillon, à une distance de migration donnée, a été marquée dans une
matrice par 1 ou 0, respectivement.

III.3.5.4 Exploitation et interprétation des profils

L’exploitation des profils consiste à évaluer le nombre de bandes ou de pics, leur intensité
relative ainsi que l’absence ou la présence des pics. Les résultats de la migration par capillarité
(la T-RFLP) sont exploités dans un premier temps par l’intermédiaire d’un logiciel, GeneScan,
ce qui permet d’obtenir un électrogramme en convertissant le temps de migration associé à
chaque fragment de restriction ou pic de fluorescence (également appelé T-RFs) en nombre
III.3. Analyses biologiques des biofilms 113

de paire de bases, par l’intermédiaire d’un marqueur de taille standard qui a co-migré avec
les échantillons (GeneScan-500 TAMRA Size Standard, Applied Biosystems) (Figure 52a).
Chaque électrogramme ou profil est associé à une communauté. Par la suite, il est nécessaire
d’aligner les profils via l’utilisation du logiciel T-Align avec un intervalle de confiance de 0,5
comme décrit par Smith et al. (2005). A l’issue de cette alignement, des matrices d’abondance
ou de présence / absence de T-RFs sont engendrées. Le type de matrice pour la suite de
l’analyse est choisi pour sa capacité à discriminer le plus les échantillons et à présenter
des réplicats les plus homogènes possibles. Dans tous les cas, les T-RFs qui présentent une
différence de taille < à 0,5 paire de bases sont considérés comme identiques. Le choix du seuil
est basé en accord avec la méthode décrite par Osborne et al. (2006), réalisée sur chaque
matrice exploitée.
Pour la DGGE les profils obtenus sont sous la forme de bandes sur gel (= OTUs)
(Figure 52b). Deux stratégies ont été utilisées pour l’exploitation des gels. Dans le cas où
la comparaison de plusieurs gels n’est pas nécessaire, l’analyse du gel s’est faite sans logiciel
et dans le cas où la comparaison de plusieurs gels était nécessaire, dû au nombre important
d’échantillons, l’analyse se faisait via le logiciel BioNumerics 5.1 (Applied Maths, Saint-
Martens-Latem, Belgium) par l’intermédiaire de marqueurs externes et internes facilitant la
comparaison inter et intra gel.
Une matrice de présence / absence des bandes est mise en place pour la suite de l’ex-
ploitation des profils. Les techniques de biologie moléculaire permettent d’obtenir des profils
génétiques caractéristiques de chaque communauté. L’objectif consiste à comparer l’ensemble
de ces profils correspondant à une communauté pour évaluer la dynamique et l’effet d’un fac-
teur environnant. L’exploitation des profils consiste à évaluer le nombre de bandes ou de pics,
leur intensité relative ainsi que l’absence ou la présence des pics. A l’issue de cette migration,
nous obtenons des courbes qui présentent l’évolution de l’intensité de fluorescence en fonc-
tion du temps et du nombre de base, chaque pic = T-RF = un groupe de fragment de même
longueur. Cette technique semble plus sensible (Dahllof 2002), avec possibilité de détecter
des espèces rares.
L’analyse des profils T-RFLPs (Figure 52a) nécessite au préalable l’alignement des T-RFs
réalisé avec le logiciel en ligne T-Align (Smith et al. 2005), après une mise en forme particulière
demandée par le programmateur. La valeur de l’intervalle de confiance pour l’alignement avec
T-Align était fixée à 0,5. Plusieurs essais sont réalisés et l’alignement conservé est celui qui
donne un résultat le plus proche de l’observation des profils.
Pour l’interprétation de résultats obtenus via des méthodes de typage moléculaire telles
que la DGGE et la T-RFLP, plusieurs stratégies peuvent être utilisées (Portillo et Gonza-
III.3. Analyses biologiques des biofilms 114

lez 2008) : l’utilisation d’indices de similarité ou de diversité (exemple Shannon, Simpson)

et l’utilisation d’analyses multivariées (Ramette 2007). Ces techniques de typage molécu-
laire permettent, contrairement à celle du clonage / séquençage, de comparer rapidement
des échantillons entre eux et de détecter tout changement des communautés soit au cours
du temps (par exemple Araya et al. 2003), soit sous un traitement ou des conditions envi-
ronnementales différentes (Duineveld et al. 1998 ; McCaig et al. 2001 ; Portillo et Gonzalez
2008).

Figure 52 – Exemple de profils obtenus à partir de la T-RFLP (A) et de la DGGE (B). En bleu
un échantillon = un ensemble de pic = un profil = une communauté, et en rouge le standard interne
(TAMRA 500). En abscisse = taille des pics, et en ordonnées = fluorescence des pics = des T-RFs.
Une bande = un OTU, une piste sur le gel correspond à une communauté.

III.3.6 Descripteurs fonctionnels

III.3.6.1 Etat physiologique du biofilm

L’analyse des profils physiologiques à des niveaux des communautés ("Community level
Physiological Profil ", CLLP, en anglais) a été effectuée avec l’aide de microplaques com-
merciales BIOLOG EcoPlate de 96 puits (Biolog, Inc., Hayward, CA). Cette technique est
bien connue pour permettre la différenciation de communautés suivant les effets d’un fac-
teur environnemental (sol ou aquatique, Lawrence et Neu 2003) ou d’un habitat différent
(Garland et Mills 1991), d’évaluer la dynamique de la communauté au niveau du sol ou
au niveau aquatique, et de fournir des indications sur la diversité fonctionnelle et l’état
III.3. Analyses biologiques des biofilms 115

physiologique de la communauté (Konopka et al. 1998). Comme toute méthode, elle pré-
sente des inconvénients déjà cités dans un certain nombre d’articles (par exemple Konopka
et al. 1998 ; Preston-Mafham 2002) : la sélection des micro-organismes cultivables et ca-
pables de se développer sur des milieux de culture riches, la présence souvent d’une forte
hétérogénéité. . . Sur chaque microplaque, 31 sources de carbones et un blanc contenant de
l’eau milli-Q stérile sont testées simultanément en triplicat. (Figure 53A). Chaque puits
contient également le tétrazolium qui, lorsqu’il est réduit en formazan par la respiration
bactérienne, forme une coloration violette (Figure 53B).Chaque puits est inoculé avec 100
µL de la suspension initiale de biofilm phototrophe, préalablement filtrée (sur membrane en
polycarbonate, 0,3 µm de seuil de coupure, GS 25 mm, Whatman c ) ou non suivant l’ex-
périence considérée. Les microplaques ont été incubées à 20˚C à l’obscurité durant 7 jours.
La densité optique (DO) de cette coloration a été mesurée toutes les 24 h à 590 nm par
un lecteur de microplaque et soustrait à celle du blanc (Spectro Max plus 384, Molecular
Device, ou Metertech) (Garland et Mills 1991 ; Leflaive et al. 2005). Suivant l’expérience
considérée, l’analyse se faisait soit sur les données non normalisées, c’est à dire, les données
d’absorbances, auxquelles l’on soustrait la DO du blanc (qualifiées d’absorbances nettes) soit
sur les données normalisées par la division des données d’aborbances nettes par les AWCD
("Average Well Color Development", la moyenne de l’ensemble des absorbances nettes de
l’ensemble des puits). Pour certaine expériences, les différents substrats ont ensuite été re-
groupés pour l’analyse en 7 grandes fonctions (guildes de substrats) : ester (méthylpyruvate),
polymères (tween 40, tween 80,α-cyclodextrine, glycogène), carbohydrates (D-cellobiose, α-D-
lactose, β-D-méthylglucoside, D-xylose, i-erythritol, D-mannitol, N-Acétyl-D-glucosamine),
produits chimiques phosphorylés (glucose-1-phopshate, D, L-α-glycérolphosphate), acides
carboxyliques (acide D-glucosaminique, acide D-galactonic γ-lactone, D-acide galacturonique,
acide 2-hydroxybenzoïque, acide 4-hydroxybenzoïque, acide γ-hydroxy-butyrique, acide ita-
conic, acide α-ketobutyrique, acide D-malique), amino acides (L-arginine, L-asparagine, L-
phénylalanine, L-sérine, L-thréonine, acide glycyl-L-glutamic) et amines (phényléthyl-amine,
putrescine).

III.3.6.2 Productions bactériennes

Il existe plusieurs méthodes pour analyser la production bactérienne. Soit l’analyse est
basée sur la mesure de la fréquence de division cellulaire, sur la détermination du taux de
synthèse de l’ADN bactérien par incorporation de thymidine tritiée, soit sur la détermination
du taux de synthèse protéique, dans ce cas c’est l’incorporation de la leucine tritiée qui est
réalisée (Pesce 2006). Les deux premières techniques permettent d’obtenir une estimation du
III.3. Analyses biologiques des biofilms 116

Figure 53 – Détail du positionnement des 31 sources de carbone (A). Photographie (A. Lamy)
d’une microplaque Ecoplate à l’issue de 96 h d’incubation (B). Les puits colorés en violet illustrent
une consommation de la source de carbone présente dans le puits.

taux de division bactérienne alors que la troisième mesure un accroissement de la biomasse

bactérienne. Dans le cadre de cette étude, la méthode choisie pour évaluer la production
bactérienne a été l’incorporation de la thymidine radioactive suivant le protocole de Robarts
et Wicks (1989) réalisé par V. Tumber d’Environment Canada. Tous les contrôles se voyaient
ajouter une concentration finale en formaldéhyde à 0,4 % pour tuer l’ensemble des bactéries.
Un morceau du support artificiel (5 cm) où s’est développé le biofilm avec 4 morceaux de
supports par conditions traitées, ce qui correspond à 3 réplicats et un contrôle.

III.3.6.3 Mesure de l’activité enzymatique de la GST

Après centrifugation d’un aliquot de la suspension initiale du biofilm de volume variable

suivant la quantité de MS de l’échantillon (12 000 g à 4˚C pendant 20 mn, Heraeus Multifuge),
le culot a été stocké à -20˚C jusqu’aux analyses. Les mesures de l’activité enzymatique de la
Glutathione S-transférase (GST), réalisées par A. Lamy à EcoLab, se déroulaient en deux
étapes : une extraction et un dosage de l’ensemble des protéines de chaque échantillon suivant
le protocole de Bonnineau et al. (2010), suivie par la mesure de l’activité de la Glutathione S-
transférase réalisé via le kit Glutathion S-Transferase Fluorescent Activity Kit (Assay Design,
Stressgen) en accord avec le protocole du fournisseur.
 Chapitre IV

Analyses statistiques des données

IV.1 Les analyses univariées

Les comparaisons de l’ensemble des données physico-chimiques, des descripteurs de bio-
masse, des densités optiques (DO), des abondances des diatomées, des valeurs de productions
bactériennes, et le nombre d’OTUS ou de T-RFs se sont faites par l’utilisation des tests de
Man Whitney, de Kriskall Wallis, ou d’ANOVA suivant la normalité (paramétrique ou non
paramétrique), le nombre d’échantillons et leurs appariements (données appariées ou non ap-
pariées). Les analyses statistiques concernant les données non paramétriques étaient réalisées
à partir du logiciel SPSS 15.0 pour Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les analyses
statistiques à partir des données paramétriques étaient réalisées avec le logiciel Mini Tab
(State College, PA).

IV.2 Le calcul du temps de demi-vie de l’alachlore durant

les expériences en microcosmes
La demi-vie représente le temps pour lequel la concentration initiale d’un composé di-
minue de moitié. Lorsque la courbe de disparition du polluant suit une diminution de type
exponentielle décroissante au cours du temps, alors un modèle de réaction de premier ordre
est utilisé pour estimer sa vitesse de disparition et sa demi-vie, la démarche étant décrite par
Stasinakis et al. (2009). Une réaction de premier ordre est décrite comme :
 
Ct
ln = −k × t
C0
avec Ct qui représente la concentration résiduelle d’alachlore au temps d’incubation t, C0
représente la concentration initiale d’alachlore, et k (j−1 ) est le coefficient de disparition. La
demi-vie de l’alachlore est calculée comme le rapport de ln(2) sur le coefficient de disparition
k. La régression linéaire faite à partir de ce modèle permettait de déterminer le coefficient
de disparition correspondant au coefficient de corrélation et de calculer les demi-vies de
IV.3. Les analyses multivariées 118

l’alachlore (Figure 54). La même démarche est appliquée aux courbes exponentielles, dans
ce cas là croissantes, d’apparition des deux produits de dégradation de l’alachlore dosés ici.

Figure 54 – Exemple d’une repré-

sentation graphique de ln(Ct/C0) en
fonction du temps du métolachlore
pour MAS (microbiologically active
soil) et SS (sterilized soil). DT50 (en
jour) correspond à la demi-vie du
métolachlore calculée pour les deux
traitements (extrait de Caracciolo et
al. 2005).

IV.3 Les analyses multivariées

Dans le cadre de cette thèse, 3 analyses multivariées ont été utilisées en fonction des
propriétés et de la nature des données, (i) l’ACP, une analyse en composante principale
(exemple, Lawrence et al. 2009 ; Vercraene-Eairmal et al. 2010) , (ii) le NMDS (« Non-
metric Multidimensional Scaling »), c’est une représentation en 2 dimensions des distances
de similarités entre les échantillons, où les différences de structure des communautés peuvent
être interprétées comme des distances. Plus les points sont proches en terme de structure,
plus leurs distances seront petites sur la représentation. Les échantillons les plus proches sur
la représentation graphique sont les échantillons les plus proches en termes de structure (en
utilisant une valeur de stress inférieure à 0,1) (Araya et al. 2003) et la représentation en
cluster (exemple, Duong et al. 2010). Les analyses multivariées ont été conduites sur :
i) les matrices binaires (présence / absence), ou d’abondances des profils des OTUs et T-
RFs, après une transformation des données en matrice de similarité, soit à partir de l’indice de
Jaccard (J = c/(a+b+c)) où a est le nombre de bandes trouvées seulement dans l’échantillon
A, b est le nombre de bandes trouvées seulement dans l’échantillon B, et c le nombre de bandes
partagées entre les échantillons A et B), soit à partir de l’indice de Bray Curtis.
(ii) les matrices d’abondances comme décrit par Leflaive et al. (2005) sur les valeurs de pi
est défini comme la somme des densités optiques de chaque guilde multiplié par un facteur
de correction et subdivisé par la somme de tous les guildes. Auparavant les densités optiques
des substrats étaient regroupées par guildes suivant leur structure chimique (Choi et Dodds
1999) : polymères, carbohydrates, acides carboxyliques, acides aminées, amines et composés
phénoliques.
IV.3. Les analyses multivariées 119

Pour certaines matrices d’abondances, notamment quand les données présentent de fortes
variations d’un échantillon à l’autre avant la réalisation d’une analyse multivariée, les données
subissaient une transformation, afin de les normaliser, par la transformation log avec le logiciel
Primer v6 (PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom).
Après chaque analyse multivariée, un test de similarité était analysé, l’ANOSIM, cette
analyse teste la proximité ou la similarité entre les groupes ou traitements. Cette similarité
est calculée à travers le chiffre R noté R-global. Cette valeur se définit comme le rapport
de (moyenne des distances de rang entre groupes - moyenne des distances de rang intra-
groupes) / (le nombre de rang / 2). La valeur de R est considérée comme statistiquement «
utilisable » au seuil de p < 0,05. Si R-ANOSIM > 0,75 les groupes sont bien séparés ; 0,5 <
R-ANOSIM < 0,75 les groupes sont considérés comme séparés mais légèrement chevauchant ;
0,25 < R-ANOSIM < 0,5 séparés mais fortement chevauchant ; R-global < 0,25 groupes non
séparés. Les ANOSIM ont été réalisés soit avec le logiciel PAST 2.06 (Hammer et al. 2001),
soit Primer v6 (PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom).
 Partie III

Etudes expérimentales
 Chapitre I

Biodégradation d’un herbicide par des

communautés bactériennes de biofilms
phototrophes : approche expérimentale
en microcosme

ou l’exemple de l’étude d’une relation structure des communautés – fonction d’intérêt

écologique.

Questions :
– Le processus de biodégradation assuré par différentes communautés microbiennes natu-
relles permet-il de prédire la chimiodynamique environnementale d’un herbicide tel que
l’alachlore ?
– La β-diversité de communautés microbiennes naturelles peut-elle expliquer les différences
de potentiel de biodégradation de l’alachlore ?

Ce chapitre présente l’analyse de la capacité de biodégradation d’un herbicide en micro-

cosmes, l’alachlore, par 3 communautés microbiennes issues d’habitats différents. Deux des
3 communautés consistent en des communautés de biofilms phototrophes provenant soit d’un
ruisseau soit d’un fleuve, produits sur des supports artificiels ou naturels. La troisième com-
munauté provient d’un échantillon de boues activées de station d’épuration urbaine. Ce cha-
pitre fait l’objet de la préparation d’un article pour une soumission à la revue Chemosphere
(Article 1).
I.1. Contexte de l’étude 122

Résumé du projet d’article intitulé « Fate of the herbicide alachlor exposed to

different microbial consortia in aquatic systems » par A. Paule, A. Biaz, J.R.
Lawrence, H. Preud’homme, B. Lauga, E. Paul et J-L. Rols. (Article 1)

I.1 Contexte de l’étude

Pour les eaux de surface, la notion de préservation des processus fonctionnels fondamen-
taux est au cœur du concept d’état écologique. Dans les cours d’eau, par exemple, ces proces-
sus assurent en grande partie la réversibilité des perturbations naturelles (crues, étiages,. . . )
et anthropiques (aménagements hydrauliques, pollutions ponctuelles ou diffuses,. . . ). Ce suivi
conduit au devoir d’identification des sources de pollution, leur persistance et leur effet sur la
structure et le fonctionnement des écosystèmes. Une grande partie des polluants organiques
retrouvés dans les écosystèmes aquatiques sont des pesticides (Kreuger 1998).
Parmi les nombreux mécanismes de transformation tels que l’adsorption, la volatilisation,
l’hydrolyse, et la photodégradation (par exemple : Chesters et al. 1989 ; Stamper et Tuo-
vinen 1998 ; Katagi 2010) la transformation microbienne est souvent considérée comme le
mécanisme prépondérant (Calvet et al. 2005). Prenons l’exemple de diuron, un herbicide de
la famille des Phényl-urées, sa biodégradation a été démontrée au sein d’habitats contrastés
(cours d’eau, sols, sédiments,. . . ) Il est à noter que d’un point de vue qualitatif, des agré-
gats microbiens de diversité variée et résultant de conditions environnementales différentes
et subies, expriment finalement une même fonction d’intérêt écologique, ici la biodégradation
d’un pesticide.
Les communautés microbiennes résultent de processus complexes basés sur des succes-
sions écologiques dont la trajectoire globale est fortement associée à la typologie de l’habitat
et aux facteurs environnementaux. Il est intéressant de se questionner sur les processus et les
conditions selon lesquels ces communautés bactériennes, si différentes, peuvent se comporter
de la même manière face à un polluant, alors que ce potentiel de biodégradation peut tem-
porellement évoluer au sein d’un même habitat. Comme Cavigelli et Robertson (2000) lors
de leur étude sur la fonction de dénitrification réalisée par des communautés bactériennes
de différents sols, il est important de se demander si « la régulation du fonctionnement des
écosystèmes est influencée par les micro-organismes et si le fonctionnement des écosystèmes
reflète la composition des communautés et des groupes fonctionnels ». Dans ce travail, les bio-
films phototrophes sont utilisés comme modèle d’étude pour plusieurs raisons comme citées
préalablement (cf. partie I Synthèse bibliographique) :
I.2. Approche expérimentale 123

– dans les cours d’eau, les biofilms phototrophes sont le siège de réactions de transforma-
tion des cycles biogéochimiques (production primaire, minéralisation. . . ). A ce titre, ils
en constituent un compartiment fonctionnel clef (Sabater et al. 2007) ;
– ces agrégats sont les premiers à interagir avec les pesticides qui peuvent endommager
une partie de la communauté microbienne et modifier le fonctionnement global de
l’écosystème aquatique ; l
Parallèlement à l’utilisation du modèle « biofilm phototrophe », des communautés mi-
crobiennes de boues activées provenant d’une station d’épuration urbaine sont également
utilisées dans le cadre de cette étude. Les boues activées sont des biomasses épuratrices
floculées, particulièrement efficaces, notamment pour la dégradation des pesticides (Forney
et al. 2001 ; Stasinakis et al. 2009). Elles constituent ici un cadre de référence de par leur
potentiel de biodégradation.

I.2 Approche expérimentale

Afin d’évaluer la pertinence de l’origine des communautés bactériennes et de leur composi-
tion pour une fonction d’intérêt écologique, nous avons exposé un herbicide, l’alachlore, dans
des conditions opératoires identiques à des biomasses de trois communautés microbiennes ré-
sultant d’habitats différents. Ces communautés sont issues pour deux d’entre elles de biofilms
phototrophes et la troisième de boues activées de station d’épuration urbaine. Les biofilms
sont produits in situ, soit sur substrat naturel (des galets) récolté dans le fleuve La Garonne
(nommé site G, cf. partie II Matériel et méthodes), soit sur substrat artificiel (des lames
de verre) récolté après une phase d’incubation de 4 semaines dans le ruisseau Le Montoussé
(nommé site M, cf. partie II Matériel et méthodes). Les communautés du site G sont
considérées comme « naturelles », dont l’histoire n’est pas connue (âge du biofilm) et les
communautés du site M sont considérées comme « sélectionnées » de par le choix du support
incubé. Les flocs de boues activées sont collectés au niveau du bassin d’aération fonctionnant
à forte charge massique appliquée de la station d’épuration Ginestous traitant les eaux usées
de Toulouse (nommée site W, cf. partie II Matériel et méthodes). Elles sont mises à
décanter 30 minutes dans une éprouvette et le surnageant est utilisé pour ensemencer les mi-
crocosmes. La molécule modèle choisie est l’alachlore, qui présente certains avantages dans le
cadre de ce travail (Partie I Synthèse bibliographique). C’est une molécule relativement
soluble dans l’eau (solubilité = 170,3 mg.L−1 à 20˚C, pH 7, Tomlin 1995) et dont la prin-
cipale voie de transformation est microbienne (Graham et al. 2000b). L’alachlore s’adsorbe
très peu (coefficient de partage log Kow = 3,09, Laabs et al. 2007) et a été détecté dans les
I.3. Principaux résultats et discussion 124

eaux de surfaces de nombreux pays du monde (par exemple, Battaglin et al. 2000 ; Osano et
al. 2003 ; Navarro et al. 2010). Les 3 agrégats échantillonnés sont caractérisés à travers leur
structure microbienne (par PCR-DGGE), leur quantité de matière sèche sans cendre (MSSC),
et leur capacité à dégrader différentes sources de carbones (Biolog) (cf. partie II Matériel
et méthodes). Ces agrégats sont mis en suspension et incubés pendant 10 jours dans de
petits microcosmes (cf. partie II Matériel et méthodes), à l’obscurité, sous agitation,
en présence d’alachlore à deux concentrations différentes, 1 et 20 µg.L−1 (détails de l’étude,
cf. partie II Matériel et méthodes). La cinétique de disparition de l’alachlore ainsi que
les cinétiques d’apparition des deux principaux métabolites (Oxanilic acide, OA et Ethane
Sulfonic Acid, ESA) de biodégradation de l’alachlore (Thurman et al. 1996) sont réalisées,
en phase aqueuse avec un échantillonnage à 1, 3 et 10 jours d’incubation (cf. partie II Ma-
tériel et méthodes pour l’analyse). A l’heure actuelle, seule une partie des échantillons a
pu être analysée pour le dosage d’OA et d’ESA. Les analyses des autres échantillons sont en
cours.

I.3 Principaux résultats et discussion

Les biofilms phototrophes échantillonnés dans le site M présentent des niveaux de MSSC
plus faibles (0,19 mg.cm−2 ) que les biofilms échantillonnés dans le site G (0,97 mg.cm−2 ). Le
surnageant des boues activées (après décantation 30 min) présente des valeurs de MSSC de
l’ordre de 8,3 mg.L−1 . Les trois communautés se distinguent par leur structure, leur diversité
(valeurs moyennes 23, 36 et 32 OTUs pour les sites G, M et W respectivement), les types
de substrats utilisés comme source de carbone, et le nombre d’espèces qui compose leurs
communautés de diatomées (37 pour le site G et 10 pour le site M). Les faibles valeurs de
MSSC et de la diversité des diatomées observées au sein des biofilms collectés dans le site M
peuvent s’expliquer par :
– une adhésion limitée des espèces de diatomées due à l’utilisation de supports artificiels
(Cattaneo et Amireault 1992 ; Lane et al. 2003). Cattaneo et Amireault (1992) précisent
que les substrats artificiels supportent des biomasses nettement plus faibles que les
substrats naturels, et surtout pour des périodes de colonisation courtes (< 60 jours) ;
– une disponibilité moindre des nutriments (Dodds et al. 1997) ;
– les conditions hydrodynamiques bien connues pour contrôler la composition des espèces
algales (Biggs et Stokseth 1996).
Pour l’ensemble des microcosmes « contrôle » (en absence de biomasse microbienne, ex-
position à l’alachlore à 1 et 20 µg.L−1 ), les concentrations en alachlore restent constantes
I.3. Principaux résultats et discussion 125

pendant la période d’incubation, preuve d’une absence de volatilisation, d’hydrolyse ou d’ad-

sorption sur les parois des microcosmes. De plus, quelles que soient les concentrations initiales
en alachlore et les types d’agrégats microbiens considérés, nous observons une disparition de
la molécule au cours du temps plus ou moins rapide. Pour les sites W et M, le temps de
demi-vie de l’alachlore est du même ordre de grandeur en moyenne de 16,3 à 30,8 jours,
quelles que soient les concentrations initiales considérées. Les microcosmes avec les biomasses
du site G présentent des taux de dissipation de la molécule les plus forts aux deux concentra-
tions testées, avec des valeurs de temps de demi-vie de 3,9 et 8 jours. Les seuls mécanismes
susceptibles d’être à l’origine de cette disparition sont l’adsorption sur la biomasse et / ou
la transformation par voie microbienne. Plusieurs éléments laissent supposer à une prédomi-
nance de la biodégradation :
– le taux de disparition de l’alachlore est continu au cours du temps alors que l’adsorption
est un phénomène souvent instantané ;
– les temps de demi-vie enregistrés pour les 3 communautés bactériennes se situent dans
les rangs de valeurs données dans la littérature en présence de biodégradation (par
exemple, Graham et al. 1999, 2000b ; Ensz et al. 2003 ; Knapp et al. 2003 ; Daam et al.
2009) ;
– il n’est pas observé de phénomène de relarguage pourtant souvent présent après une
adsorption (mort des cellules) ;
– il est détecté une apparition et augmentation au cours de l’incubation des deux mé-
tabolites de dégradation de l’alachlore : ESA et OA, comme montré par les résultats
complémentaires partiels dans le paragraphe suivant.
Il a été montré que les biofilms phototrophes pouvaient jouer un rôle dans l’adsorption
et l’accumulation des polluants, incluant les métaux (Duong et al. 2010), et les pesticides
(Headley et al. 1998 ; Lawrence et al. 2001 ; Bohuss et al. 2005 ; Tlili et al. 2008). Ces études
montrent qu’il existe une grande quantité de liaisons des métaux soit au sein de la matrice
formée par les EPS, soit à la surface des cellules, soit au niveau des particules organiques
piégées par le biofilm (Hill et al. 2000). L’influence du stade de maturation des biofilms sur les
quantités de métaux accumulés a également été étudié (Duong et al. 2010). L’accumulation
des métaux s’est avérée se dérouler en deux temps, une première phase de sorption rapide,
processus qualifié de « biosorptive », suivie par une phase active plus lente (Hill et al. 2000).
Les structures algales et bactériennes étant différentes entre les différentes communautés
testées, nous pouvons supposer que la nature des exopolymères (EPS) l’est également. Même
si les communautés, en suspension, ne présentent plus de structures tridimensionnelles, des
changements dans la composition des EPS sont susceptibles d’indure des changements dans
I.4. Résultats complémentaires à l’article 1 126

les sites de liaisons et présentent alors des capacités d’adsorption et d’accès du polluant aux
cellules différentes.

I.4 Résultats complémentaires à l’article 1

Afin de vérifier l’hypothèse de transformation de l’alachlore par voie microbienne, deux
métabolites OA et ESA bien connus pour être des produits de biodégradation en milieu
terrestre (Thurman et al. 1996) et aquatique (Graham et al. 2000b) sont recherchés dans
les échantillons d’eau des microcosmes. Les résultats présentés ici sont préliminaires, les «
quantités » de chaque molécule ne sont pour le moment pas exprimées en concentration mais
en aire de chaque pic sur les spectres de masse des échantillons. A ce jour, seul un réplicat
sur trois a été analysé, les réplicats restants sont en cours d’analyses.
D’après la Figure 55, en début d’expérience, les échantillons d’eau ne contiennent aucune
trace de OA et ESA pour les seuils de détection fournis par cette méthode, quel que soit le
site d’étude. A l’issue des 10 jours d’incubation, les eaux des microcosmes contiennent des
teneurs résiduelles en alachlore qui ont subi une diminution de 50, 11 et 23 % pour les
sites G, M et W, respectivement. Malgré un protocole de dosage de l’alachlore différent
par rapport aux dosages réalisés par le LDE (Figure 3 de l’article 1), les tendances sont
similaires. L’alachlore présente des valeurs de temps de demi-vie les plus faibles en présence
de la biomasse collectée au site G. Malgré des comportements différents d’un site à l’autre, les
concentrations résiduelles en OA et ESA semblent identiques d’une biomasse à l’autre, avec
une présence plus importante du métabolite ESA. Cette observation n’est pas cohérente avec
les résultats de Graham et al. (1999 et 2000b) qui soulignaient une dominance du métabolite
OA par rapport au métabolite ESA et cela, quelles que soient les teneurs en oxygène dissous
de la colonne d’eau dans leurs microcosmes. Cette différence peut s’expliquer tout simplement
par des seuils de détection très différents entre les deux métabolites (9 pg.g−1 pour ESA et
20 pg.g−1 pour OA).
Malgré des concentrations résiduelles proches en OA et ESA pour les biomasses des 3
sites, les concentrations résiduelles d’alachlore sont beaucoup plus faibles pour la biomasse
du site G que pour les biomasses provenant des sites M et W. Cette différence peut venir
soit :
– d’une plus grande quantité d’alachlore adsorbée par les matières en suspension (débris
d’algues et de sédiments). L’absence de relarguage montre que le mécanisme serait irré-
versible, et ce malgré les conditions d’obscurité maintenues tout au long de l’incubation
qui auraient pu être à l’origine de la mort très rapide des algues et par conséquent d’une
I.5. Conclusion et perspectives
$LUGXSLFGXVSHFWUHGHPDVVH
127

7 7 7

Figure 55 – Aires de chaque pic (un composé) correspondant à l’alachlore, l’ESA, l’OA sur les
spectres de masse des échantillons en début (T0) et fin d’incubation (T final) pour les sites G, M
et W et une concentration initiale en alachlore de 20 µg.L−1 . Les seuils de détection sont de : 4 pg
g−1 pour l’alachlore, 9 pg.g−1 pour ESA et 20 pg.g−1 pour OA

désorption de l’alachlore. Vu les valeurs de temps demi-vie de l’alachlore en contact avec

la biomasse du site G, les mécanismes d’adsorption ne se sont pas produit instantané-
ment en début d’expérience ;
– d’une biodégradation ou adsorption des deux métabolites OA et ESA. Souvent les
métabolites présentent des propriétés plus hydrophiles que les molécules parentes, ce
qui rend les produits de dégradation plus solubles et moins susceptibles d’être adsorbés.
Cette propriété est une des causes de leur occurrence au sein des eaux de surface presque
plus importante que celles des composés parents (Thurman et al. 1996).

I.5 Conclusion et perspectives

A partir de trois habitats microbiens différents (ruisseau, fleuve et station d’épuration),
trois structures de communautés microbiennes différentes sont obtenues. Il est important de
noter que ces trois structures sont des images transitoires d’une dynamique temporelle des
communautés prises à un moment donné. En effet, la structure des communautés bacté-
riennes ou algales résulte de processus plus ou moins complexes de successions écologiques
menant à des trajectoires particulières propres à chaque habitat. Les premières questions qui
se posent : Comment est-il possible à partir de 3 communautés structurellement différentes
et résultant de processus de successions différents d’observer des comportements similaires
vis-à-vis d’une fonction ? Les mécanismes de biodégradation de l’alachlore sont-ils réalisés par
des micro-organismes ubiquistes ? Présents au sein d’habitats différents et quelles que soient
l’histoire et les caractéristiques des communautés ? Nous pouvons nous interroger sur la ma-
nière dont ces processus de successions écologiques sont réalisés pour aboutir à ces images
de structures transitoires : Quels sont les facteurs qui conditionnent ces successions ? Est-il
possible de modifier leurs trajectoires ? En milieu aquatique ou terrestre, des études sur la
I.5. Conclusion et perspectives 128

biotransformation de l’alachlore ont suggéré que cette molécule est co-métabolisée en OA

et ESA via une réaction catalysée par une glutathione-S-transférase (GST) non spécifique
(Ferrer et al. 1997 ; Knapp et al. 2003). Ces enzymes sont présentes chez les procaryotes et les
eucaryotes. Chez les plantes supérieures, elles participent à des mécanismes de détoxication
vis-à-vis de chloroacétanilides (Rossini et al. 1996). C’est une hypothèse à vérifier, même si la
biodégradation n’est pas le seul mécanisme susceptible d’influencer le comportement de l’ala-
chlore en solution, l’adsorption semble également jouer un rôle, particulièrement au sein des
microcosmes exposés aux biomasses du site G. Pour les 3 types de biomasses, aucune phase
de latence n’est observée, comme dans le cas d’expériences antérieures menées sur l’alachlore
(Graham et al. 1999 ; Knapp et al. 2003). Mais la structure de la communauté microbienne
ne semble pas être le seul facteur susceptible d’influencer le comportement de l’alachlore. Le
métolachlore et l’alachlore présentent des structures moléculaires et des modes d’action très
similaires. Une étude de Graham et al. (1999) suggère pour ces deux chloroacétanilides bio-
dégradés en ESA et OA (dans des proportions différentes), des voies de transformation dans
des eaux de rivières similaires et semblables aux voies de transformation de l’acétolachlore
dans les sols (Aga et Thurman 2001). Debenest et al. (2009) enregistrent une diminution du
s-métolachlore au sein de leurs aquariums en contact avec du biofilm. A l’inverse, Roubeix
et al. (2011a) n’observent aucune disparition du métolachlore durant l’incubation de leurs
biofilms au sein de leurs microcosmes. Ainsi le comportement, voir la biodégradation des
chloroacétanilides, ne semble pas dépendre uniquement de la présence ou pas de certaines
espèces ubiquistes ni de la présence seule de la GST, sinon quelles que soient les conditions
opératoires utilisées durant les expériences, les chloroacétanilides disparaitraient au cours du
temps (Tableau 14). Le ratio entre la quantité de biomasse et la quantité d’alachlore, l’aspect
agrégé ou en suspension de ces biomasses qui induit des surfaces de contacts micro-organismes
/ alachlore différentes, ainsi que la taille des microcosmes (Laabs et al. 2007), pourraient par-
ticiper au contrôle du comportement des chloroacétanilides en milieu aquatique. L’histoire
des contaminations rencontrées par les communautés microbiennes peut également gouverner
le comportement d’un polluant.
I.5. Conclusion et perspectives 129

Comportement de la
Concentration initiale / Organismes
Référence Molécule Type de dispositif molécule (% de disparition ou
durée de l'expérience présents
temps de demi-vie)

12,4 g.L-1 Biofilms

Bohuss et al. 2005 Acétolachlore Aquarium de 6 litres 44 % de diminution
14 jours phototrophes

Temps de demi-vie (en jours) :

Cylindre en fibre de verre 11,3 86 (oligotrophe)
25 g.L-1
Knapp et al. 2003 Alachlore m3, 3,2 m de diamétre et 1,4 56 (mesotrophe) Phytoplancton
42 jours
m de profondeur. 35 (eutrophe)
22 (hypertrophi)
Biofilms
Roubeix et al. 2011 Métolachlore 5 et 30 g.L-1 Canaux: 6 * 10 cm (40 litres) aucune diminution significative
phototrophes
Microcosme en verre de deux
compartiments:
5 et 30 g.L-1 Biofilms
Debenest et al. 2009 Métolachlore (650 mm * 270 * 210 mm) et 70% de diminution
6 jours phototrophes
(50 mm * 270 mm et 210
mm), (51,5 litres)
Temps de demi-vie (en jours) :
Métolachlore 97,6 (petite taille) Phytoplancton
Microcosme en verre:
15 g.L-1 26,7 (grande taille)
Laabs et al. 2007 bécher de 0,78 L (petite taille)
50 jours Temps de demi-vie (en jours) :
58 * 58 * 60 cm (grande taille)
Alachlore 18,8 (petite taille) Phytoplancton
47 (grande taille)
Temps de demi-vie (en jours) :
10 et 25 g.L-1
Métolachlore Cylindre en fibre de verre: 46,2 (à 10 µg /L)
21 jours
Graham et al 1999 diatmétre de 3,2 m et 33 (à 25 µg /L) Phytoplancton
3
25 g.L-1 profondeur de 1,4 m (11,3 m ) Temps de demi-vie (en jours) :
Alachlore
21 jours 21
Temps de demi-vie :
Phytoplancton /
5, 20, 80 et 200 g.L-1 Bassin avec 100 t de sable: 27 à 44,2 (stream)
Mohr et al. 2008 métazachlor Zooplancton et
140 jours 690 * 325 * 250 cm) Temps de demi-vie :
Macrophytes
38,3 à 47,9 (pond)
Biofilm
32, 100, 320 et 10000 g.L-1 Bassin en polyéthyléne: 20 à 60% de diminution selon
Noack et al. 2003 métazachlore phototrophes et
49 jours 2,48 * 1,65 * 1,25 m la concentration
Zooplancton

Tableau 14 – Comparaison du comportement des chloroacétanilides en milieu aquatique suivant

les principales caractéristiques des conditions opératoires.nd = donnée non disponible
I.6. Article 1 130

I.6 Article 1
 131

Fate of the herbicide alachlor exposed to different microbial consortia in aquatic systems

Armelle Paule1,2, Asmaa Biaz1,2, John R Lawrence3, Hugues Preud’homme4, Etienne Paul4 and Jean Luc Rols1,2

1
Université de Toulouse, UPS, INP, EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle), 118 route de Narbonne, F- 31062
Toulouse, France
2
CNRS, EcoLab, F-31062 Toulouse, France
3
Université de Pau et des Pays de l’Adour, LCABIE, CNRS, IPREM, BP1155, F-64000 Pau, France
4
Environment Canada, Saskatoon, Saskatchewan, Canada
5
Université de Toulouse, INSA, LISBP (Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés), 135 Avenue de
Rangueil, F-31077 Toulouse, France
Abstract
In the aquatic environment, microbial processes are the main cause of pesticide degradation. The structure and
function of microbial communities are influenced by a number of environmental parameters in their habitats.
This work explored the influence of different microbial consortia on the behaviour of the herbicide alachlor. To
assess this influence, field experiments were performed using small size microcosms (450 mL) at two alachlor
environmental concentrations (1 and 20 µg L-1) with or without suspended microbial inoculum, monitored for 10
days. Alachlor levels were evaluated over time for all experimental treatments (1, 5 and 10 days). The microbial
consortia from different habitats included activated sludge from a waste water treatment plant and natural
epilithic biofilms from two distinct river environments. At the first incubation site, located in an agricultural
watershed (Aurade, France), epilithic biofilm were cultivated in situ on artificial substrates placed vertically and
parallel to river water flow over 5 weeks. At the second site, located on the mid-slope of the River Garonne,
upstream of the city of Toulouse (south-west, France), epilithic biofilms were sampled from pebbles whose
incubation time and history were not known. In this study, a multiphasic approach was used to characterize the
structure of the different microbial consortia. Comparison of biomass levels, bacterial structures measured by
PCR-DGGE of 16S rDNA fragments and functional diversity measured by the use of the Ecoplate system,
revealed differences according to habitat types and incubation sites among microbial consortia. The
disappearance curves of water soluble alachlor were exponential, thus a first-order model was used to estimate
the rate of disappearance and the half-life of alachlor. Decay coefficients were similar between the 20 µg L-1 and
1 µg L-1 treatments for communities from activated sludge but differed significantly for communities from
epilithic biofilms with the greatest decrease for 20 µg L-1 treatments. For both treatments, the lowest half-lives
were observed for experiments with biofilms from the river Garonne (3.9 and 8 days) followed by biofilms from
agricultural watershed (16.3 and 30.8 days) and then, by activated sludge (21.6 and 21.8 days). This study
confirmed the influence of habitat type and thus environmental conditions on the structure of microbial
communities. The behaviour of water soluble chemical such as alachlor can be affected by the environmental
parameters such as biomass levels, habitat type, structure of microbial communities, and initial concentrations.
Keywords
Alachlor; fate; activated sludge; epilithic biofilm; microbial community
1. Introduction
The objective of the European Water Framework Directive (WFD, European Commission, 2000) is to
implement an assessment of “good chemical and ecological status” for all European river bodies by 2015. This
monitoring leads to the identification of sources of pollution, their persistence and effect on the structure and

1
 132

functioning of ecosystems. Pesticides are one of the causes of pollution in aquatic environments. Residual
pesticides migrate from agricultural lands to surface and ground waters by mechanisms such as leaching,
draining and surface run-off (Papadopoulou-Mourkidou et al., 2004).
The persistence of pesticides in aquatic ecosystems can be mediated by different mechanisms such as
photodegradation (Bahena and Martinez, 2006), volatilisation (Dailey, 2004), biodegradation (Stamper and
Tuovinen, 1998) and adsorption (Katayama et al., 2010). All these mechanisms are present but often difficult to
predict and quantify and will influence the toxicity of the chemical of concern. Most studies which have
evaluated pesticide behaviour used microbial communities, such as those in activated sludge (Stasinakis et al.,
2009), surface water (Graham et al., 2000) and soil (Sarmah et al., 2009). The efficiency of micro-organisms in
pollutant degradation appears to depend on several parameters (e.g. Briceno et al., 2007; Das et al., 2008)
including, compound properties (Sabljic et al., 2001), inoculum types (Forney et al., 2001) and environmental
conditions (such as light, dissolved organic carbon levels (e.g. Ensz et al., 2003) , dissolved oxygen (Graham et
al., 2000) and temperature (e.g. Daam et al., 2009; El Sebai et al., 2010).
Alachlor [2-chloro-N-(2, 6-diethylphenyl)-N-(methoxymethyl) acetamide] is extensively used as a pre-
emergence herbicide applied to corn and soybeans worldwide and known to inhibit the transformation of very
long chain fatty acids in plants and algae (Böger et al., 2000). This molecule is classified as highly toxic by US
EPA (Graham et al., 2000) and has been included in a list of 33 priority substances by the EU Water Framework
Directive (EU, 2001). As a consequence of its extensive use, alachlor is commonly detected in surface and
ground waters. For example, in irrigated areas dedicated to corn cultivation in Spain, surface water
concentrations ranged from 0.06 to 31.9 µg L-1 and ground water concentrations ranged from 0.05 to 4.85 µg L-1
(Dalton and Frick, 2008). Alachlor is relatively non-persistent in soil with half-life values ranging from 3 to 14
days (Stamper and Tuovinen, 1998; Chirnside et al., 2007) which is consistent with its low adsorption (partition
coefficient, log Kow = 3.09) and high water solubility (170.3 mg L-1 at 20°C, pH 7) (Sabljic et al., 1995). In
surface waters, alachlor half-lives ranged from 9.7 to 122 days reflecting the dependence of fate and attenuation
on specific environmental conditions (Galassi et al., 1996; Graham et al., 2000; Ensz et al., 2003; Laabs et al.,
2007). It was previously suggested that biodegradation of alachlor in aquatic environments mainly proceeds by
co-metabolism catalyzed via a non-specific glutathione-S-transferase (GST) (Thurman et al., 1996), however,
complete mineralization is rarely observed (Stamper and Tuovinen, 1998).
In river ecosystems, the epilithic biofilm, a microbial aggregate consisting of heterotrophic micro- and meio-
organisms and phototrophic micro-organisms (Lock et al., 1984), constitutes a functional key compartment.
Epilithic biofilms are involved in primary production (Dodds, 2006), mineralization and element recycling
processes (Sabater et al., 2007) and biodegradation of pollutants (Lawrence et al., 2001). Because of its
ubiquitous character, short generation time, sessile nature and rapid response to changes in environmental
conditions (Paule et al., 2009), epilithic biofilm is widely used as a bioindicator of water quality in lotic systems
(Burns and Ryder, 2001). Changes in the structure and diversity of the microbial consortia in epilithic biofilms
are mediated by abiotic factors such as nutrient availability (Della Bella et al., 2007), light (Boston and Hill,
1991), substratum types (Acs et al., 2008), hydrodynamics (Battin et al., 2003), and by biotic interactions such as
competition (Jackson et al., 2001).
In the present work, in situ development of microbial communities followed by experiments in aquatic
microcosms were conducted to investigate the influence of different microbial consortia, including communities

2
 133

from activated sludge and natural epilithic biofilms, on the behaviour of alachlor. Epilithic biofilms were
sampled at sites representing contrasting environmental conditions, different colonization substrata and
incubation times. Analyses focused on examining differences in structure or functional diversity in microbial
communities inhabiting different environments, using a combination of culture-dependent and independent
methods as well as physico-chemical analysis.
2. Material and methods
2.1. Microbial consortia
2.1.1. Sampling sites
Three sites (sites G, M and W) representing different microbial habitats and environmental physico-chemical
parameters were chosen to sample three different types of bacterial communities. These different microbial
habitats included (i) epilithic biofilms collected at both sites G and M, and (ii) activated sludge collected at site
W. Site G on the mid-slope of the River Garonne is located 36 km upstream of the city of Toulouse (south-west,
France) which corresponds to a 6th-order shallow river. The mean daily discharge is 200 m3 s-1 (from DIREN
Midi-Pyrénées, in Boulêtreau et al. 2006). During the low water period, the bed is 100 m wide, less than 1.5 m
deep with a mean flow velocity on the riverbed of 0.5 m s-1. These conditions favour the development of epilithic
biofilms on pebbles (diameter about 12 cm) on the river bottom. This site is known to have minor herbicide
pollution in surface water (Devault et al., 2007). Site M on the Montoussé stream is located in an experimental
agricultural watershed outlet (328 ha) of the city of Auradé (south-west, France). The area is dominated by an
agricultural landscape (wheat and sunflower) and reported as highly contaminated by pesticides (Taghavi et al.,
2010) and nitrate (Debenest, 2007). However alachlor is not detected in this stream. The river bed is
sedimentary, confined (2 m wide), and shady. Water depths (50 cm) and flow velocity (0.045 m s-1) were
constant during the biofilm development period. Moreover, no natural substrate (pebbles, rocks) was available at
site M to allow the development of epilithic biofilms. Cleaned and smooth glass slides (244 × 78 mm) were
chosen as uniform artificial substrates, as described by Paule et al. (2009).
The activated sludge material was sampled from the wastewater treatment plant of Toulouse (site W) operating
at high massic loading rates of 0.9 kgBOD5 kgVSS-1 d-1 (BOD5 is biological oxygen demand after 5 days and
VSS are volatile suspend solids), a hydraulic retention time of 1 to 5 hours and a sludge age of 3 days.
2.1.2. Sample collection
Biofilm in situ colonization at site M was carried out between February 22 and April 3, 2008 to cover the
pesticide application period in the experimental agricultural watershed. Epilithic biofilms were collected after 5
weeks of colonisation on artificial supports. Biofilms from site G were sampled from pebbles whose incubation
period length and history were not known. After collection, glass slides and pebbles were transported to the
laboratory within moisturized bags. One replicate represented two slides sampled randomly or a mixing of 3
pebbles for the epilithic biofilm from artificial and natural substrates respectively. The scrubbed surface area of
the pebbles was traced on tracing paper and its area (m²) calculated from the mass of the tracings. Biofilm was
removed from artificial or natural substrates by scraping with a toothbrush or a microscope slide, previously
treated with NaOH 1N in order to avoid all trace of DNA. For each replicate, biofilm was suspended in 250 mL
of filter sterilized river water (0.2 µm pore size filter, cellulose acetate membrane, Whatman) and homogenised
(13,500 rpm, Ultra Turrax, T25). The activated sludge was collected from the aeration tank of the wastewater
treatment plant. After sampling of sludge, only the supernatant was used after settling for 30 min. Each epilithic

3
 134

biofilm or activated sludge homogenates (250 mL) were subdivided into aliquots, a 50 mL subsample as
inoculum source for the microcosm study, and a 200 mL subsample for biomass descriptors, DGGE analyses and
carbon utilization assays of microbial consortia.
2.1.3. Sampling sites physico-chemical characteristics
Water physico-chemical characteristics were estimated for both biofilm sampling sites during the in situ biofilm
development period at sites G and M. For site W, the chemical parameters analyses were conducted only when
the activated sludge was sampled. Water conductivity and pH values were measured with a conductimeter Hanna
HI 99 1300 and a pH meter 320 (sentix 41 probe). Dissolved oxygen (DO) concentration was determined with an
oxi 323 oxymeter (cellox 325 probe) and temperature values were represented by the mean values that were
determined by the pH meter and oxymeter. In parallel, water samples were collected to assess the water quality
using the following parameters: nitrate (NO3--N), total phosphorus (TP) and ammonium (NH4+-N)
concentrations. For measures of nitrate and ammonium concentrations, water samples previously were filtered in
the field using 0.45 µm pore size acetate cellulose membranes. These parameters were measured by classic
colorimetric methods (Secoman, Uvi Light, XT5) according to standard methods (APHA, 1992). Ammonium
concentrations were determined within 10 h following sampling. Dissolved organic carbon (DOC)
concentrations were measured as described by Paule et al. (2009). All sampling and measurements were
performed in the morning to provide consistency between samples. Water samples were refrigerated during
transport to the laboratory.
2.1.4. Microbial consortium characteristics
Biomass descriptors. From an aliquot of initial biofilm or activated sludge homogenates, the dry mass (DM)
(aliquot of 10 mL), the ash free dry mass (AFDM) and the chlorophyll a (aliquot of 10 mL) (for biofilm samples
only) was measured as described by Paule et al. (2009). Autotrophic index (AI) was defined as the ratio between
AFDM and chlorophyll a, and indicates the relative importance of autotrophic organisms versus heterotrophic
organisms and detritus (Biggs and Close, 1989). For each sample, the ratio between AFDM and DM was
determined to indicate the relative importance of the organic fraction in the biomass.
Microbial community structure. After centrifugation (12,000 g at 4°C for 20 min, Heraeus Multifuge) of an
aliquot of 10 mL of the initial biofilm or activated sludge homogenates, the pellet was stored at -80°C until
further analysis. Genomic DNA extraction was performed on the pellet using the DNeasy Plant Mini Kit
according to the manufacturer’s protocol (Qiagen Laboratories). The extracted DNA integrity was checked on a
1 % agarose gel (Eurogentec), staining ethidium bromide and using the precision Molecular Mass Ruler
(Fermentas) and quantified as previously described by Paule et al. (2009).
The 16S rRNA genes were amplified by PCR following a protocol described elsewhere (Lyautey et al., 2005a)
using 50 ng of extracted DNA as template for the PCR. Amplified product concentrations were quantified on a
1.65 % agarose gel (Eurogentec) using precision the Molecular Mass Ruler (Fermentas) as described previously
(Lyautey et al., 2005a). DGGE was realized following the protocol previously described by Paule et al. (2009).
Carbon source utilization profiles. Community level analysis of carbon source utilization profiles for the three
different microbial habitats were evaluated by using commercial Eco-plates (Biolog, Hayward, CA, USA)
(Konopka et al., 1998). Each microplate was inoculated with 100 µL of an aliquot of initial sludge and biofilm
homogenate previously diluted (10-2) and then incubated in the dark at 20°C for 10 days. One plate was used for
each replicate. The absorbance was measured every day at 590 nm using a multi well plate reader (Metertech)

4
 135

until a stable value was obtained. For every absorbance value, the controls were subtracted. For statistical
analysis, the net absorbances at 48 hours of incubation were used.
The substrates were grouped by guild following their chemical structure (Choi and Dobbs, 1999): polymers,
carbohydrates, carboxylic acids, amino acids, amines and phenolic compounds. As described by Leflaive et al.
(2005), a Principal Component Analysis (PCA) was conducted on the “pi” values defined as the sum of optical
density (OD) of each guild previously multiplied by a correcting factor, and subdivided by the sum of all guilds.
This correcting factor corresponded to the number of substrates in the largest guild divided by the number of
substrates of each guild and allowed standardization of the weighting of the different guilds.
2.2. Microcosm experimental procedure
Microcosm study was monitored to assess the fate of water soluble alachlor exposed to microbial communities
from different habitats. The microcosms consisted of amber glass bottles of 500 mL. Each bottle was initially
filled with 450 mL of water from site G (NH4+-N = 0.053 mg L-1, NO3--N = 0.7 mg L-1, TP = 0.012 mg L-1, DOC
= 2.1 mg L-1, and pH = 7.5), considered as the least polluted previously filtered through a 0.2 µm pore size filter
(cellulose acetate membrane, Whatman). For each inoculum source, epilithic biofilms (site G and M) and
activated sludge (site W), treated microcosms with alachlor were designed to evaluate the disappearance of
alachlor at two initial concentrations of 1 and 20 µg L-1. Control microcosms without microbial inoculum were
established to evaluate the abiotic disappearance of alachlor at two initial concentrations. Experiment was
monitored for 10 days in triplicate. Bottles were incubated for 5 hours to obtain stable water column chemical
conditions in the microcosms before inoculation with biomass obtained from the homogenates of epilithic
biofilms or settled activated sludge (50 mL). All the bottles were closed by sterile cotton cloth plugs and
maintained in the dark, on a rotory shaker (Inductive stirring system, Oxitop IS 6, WTW), at 25°C. Alachlor
purchased from Sigma-Aldrich (purity 99 %) was dissolved in acetone to make a stock alachlor solution.
Aliquots of this stock solution were then added to microcosms to obtain tested final concentrations which
represent a range of environmental concentrations (Dalton and Frick, 2008). The final concentration of solvent
added in each microcosm was less than 0.005 % (v/v). After 1, 5 and 10 days of incubation, water samples (100
mL) from each microcosm were collected to evaluate the residual concentration of alachlor. The samples were
filtered through Whatman GF/F glass fibre filters (0.7 µm pore size) and analyzed at “Laboratoire Départemental
de l’Eau” (Toulouse, France), using high performance liquid chromatography coupled tandem to mass
spectrometry (HPLC-MS-MS, Thermo Fisher, model E-Quan TSQ Quantum ultra) with ionization electron
spray source and equipped with a pre-concentration column (Thermo Fisher Hypersil GOLD C18, 12 µm
particle size, 20 x 2.1 mm), by a direct sample injection. The sample volume was 2 mL. The alachlor separation
was monitored using a Thermo Fisher Hypersil GOLD C18 (3 µm particle size, 50 x 2.1 mm) column.
2.3. Data analysis
DGGE bands (defined as operational taxonomic units [OTUs]) were scored as present or absent from DGGE gel
analysis. To assess changes in the microbial community function and structure for each inoculum source, the
similarity of carbon source utilization profiles and DGGE patterns was assessed by a Principal Component
Analysis (PCA) with R.2.2.1 software for windows using the ade4 package. Statistical analyses of PCA were run
using an analysis of similarity (ANOSIM) via PRIMER v6 software (PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom) on
Bray Curtis similarity matrices generated from binary data. The analysis of similarity reports global R and p-
values. A global R close to 1 indicates a significant effect of incubation site and the p value reflects the statistical

5
 136

significance of the global R (Clarke, 1993). The statistical significance of the global R was considered at p <
0.05. The difference in physico-chemical characteristics and in biomass descriptors, the number of bands on
DGGE banding patterns between sampling sites, and alachlor concentration during microcosm experiments were
assessed with the Mann Whitney test using SPSS 15.0 software for Windows. Results were considered
statistically different at p ≤ 0.05.
3. Results
3.1. Water physico-chemical parameters
Physico-chemical characteristics of sampling sites are summarized in Table 1. Higher NH4+-N
(47.8 mg L-1), TP (13.4 mg L-1), and DOC (20.9 mg L-1) concentrations were recorded for
samples from the wastewater treatment plant (site W) relative to both biofilm sampling sites
(sites G and M). Whereas NO3--N values measured at site M (8.1 mg L-1) were higher than at
site G (0.64 mg L-1) and at site W (0.2 mg L-1) (p < 0.05). Values were very similar at site G
and at site M for water temperature (8.8 and 8.6°C), dissolved oxygen concentration (11.2 and
9.9 mg L-1), and pH (7.5 and 7.8) values (p > 0.05). Conductivity values were lower at site G
(299 µS cm-1) than at site M (984 µS cm-1) (p = 0.032). All water physico-chemical
parameters remained constant over time for both sites G and M.
+ -
NH4 -N NO3 -N TP DOC Temp DO Conductivity
-1 -1 -1 -1 -1 -1
(mg L ) (mg L ) (mg L ) (mg L ) (°C) (mg L ) pH (µS cm )
Site G (n = 3) 0.08 ± 0.02 0.64 ± 0.03 0.024 ± 0.010 1.8 ± 0.4 8.8 ± 0.5 11.2 ± 0.5 7.5 ± 0.2 299 ± 28
Site M (n = 4) 0.03 ± 0.02 8.1 ± 0.8 0.008 ± 0.003 2.3 ± 0.1 8.6 ± 1.9 9.9 ± 0.6 7.8 ± 0.2 984 ± 6
Site W (n = 1) 47.8 0.2 13.4 20.9 na na na na

Table 1: Physico-chemical characteristics of sampling sites (mean ± SD). Measures were

determined during the period of in situ site M biofilm colonization (between February 22 and
April 3, 2008). TP, total phosphorus; DOC, dissolved organic carbon; Temp, temperature; and
DO, dissolved oxygen concentration. na: not available.

3.2. Microbial consortium characteristics

3.2.1. Biomass descriptors
Epilithic biofilms from river site (site G) exhibited AFDM values significantly higher (0.97
mg cm-2) than AFDM values at stream site (site M) (0.19 mg cm-2) (p = 0.05) (Table 2). The
autotrophic index (AI) revealed values of 176 and 46, and AFDM/DM ratio values of 8 and
20 %, for site G and M respectively. Low values reveal epilithic biofilms rich in detritus and
sediment particles. The larger standard deviation values obtained for site G resulted from a
strong heterogeneity that typically occurs on natural substrates (Rolland et al., 1997). Dry
mass value recorded for activated sludge sample was 8.3 mg L-1.

6
 137

AFDM AFDM / DM AI
-2 -1
(mg cm ) (%) (g AFDM g Chl a )
Site G (n = 3) 0.97 ± 0.54 8±2 176 ± 23
Site M (n = 3) 0.19 ± 0.05 20 ± 1 46 ± 12

Table 2: Ash free dry mass (AFDM), Ash free dry mass / dry mass ratio (AFDM / DM), and
autotrophic index (AI) for epilithic biofilm samples from sites G and M.

3.2.2. Bacterial community structure

DGGE banding patterns revealed a total of 62 OTUs. The average numbers (n = 3) of OTUs
(± SD) per sample were 23.3 ± 3, 36 ± 1 and 32.3 ± 1, for communities from site G, M and W,
respectively. The three different bacterial communities shared 18 common OTUs. Among a
total of 62 OTUs, 2 bands were specific to site G, 5 for site M and 8 for site W.
PCA analysis was carried out on the presence absence matrix for DGGE gels (Figure 1). The
two axes accounted for 31.4 and 24.6 % of the variance, respectively. The plot revealed an
important similarity between the replicates of each site. The analysis of similarity (ANOSIM)
showed influence of site on the bacterial structures (R = 0.885, p = 0.004), with differences
between the bacterial community structure from site G and the other bacterial communities
from site M and W (global R = 1, p < 0.001). However no significant difference was detected
between bacterial communities from M and W (R = 0.556, p < 0.001). The test revealed
significantly different bacterial structure according to microbial sources (epilithic biofilm
versus activated sludge) and their incubation sites for the epilithic biofilms.
PCA 2 (24.6%)

PCA 1 (31.4%)

Figure 1: Results of the Principal Component Analysis carried out on DGGE banding
patterns from the gel analyzed in the present work for bacterial communities from sampling
sites G, M and W. Squares represent the gravity center of the plot for each group. Circles
correspond to a similarity of 60% based on the hierarchical cluster analysis of on Bray Curtis
similarity matrices.

7
 138

3.2.3. Sole-carbon source utilization profiles

No difference was observed in the total number of carbon sources used by the different
bacterial communities, site G (27 ± 2.01), site M (28 ± 1) and site W (26.7 ± 1.2) (p = 0.486).
No carbon source was preferentially used by epilithic biofilms from sites G and M (p = 0.32)
whereas microbial communities of site W appeared to preferentially use carbohydrate (p =
0.001). A PCA was performed on the guild categorization of total activity of different
microbial communities (Figure 2). The two axes accounted for 52.3 % and 21.8 % of the
variance, respectively. Plots were grouped according to sampling sites. As was the case for
other analyses site G presented greater heterogeneity between replicates. A fraction of
replicates of biofilm sampling at site M exhibited optical density values drastically lower than
other replicates suggesting that a methodological problem occurred with these replicates. Data
from these replicates were thus not included in the analysis. PCA revealed two distinct
groups, the bacterial communities from activated sludge and microbial communities from
epilithic biofilms. This distinction resulted from the different utilization of specific carbon
sources. For example, the microbial community from activated sludge was in particular
associated with the utilization of carbohydrate substrates. The ANOSIM analysis of PCA (for
pairwise comparison) showed significantly different carbon source utilization profiles
according to the nature of the microbial community source (R = 0.527; R = 0.924, p< 0.001,
respectively for W/G and W/M), however, there was not a significant difference between
either epilithic biofilm samples (R = 0.052, p < 0.001, for G/M).

A
PCA 2 (21.8 %)

B
c

aa
ac
p
a
pc

PCA 1 (52.3%)

8
 139

Figure 2: Results of the Principal Component Analysis carried out on the carbon source
group of net optical density at 48 h for the three microbial samples (A). Plots were grouped
according to the sampling sites G, M and W. Projection of the variables (carbon source guild)
on the component planes (B) with a, amine; aa, amino acid; c, carbohydrate; ac, carboxylic
acid; p, polymer; pc, phenolic compound. Squares represent the gravity center of the plot for
each group.

3.3. Alachlor disappearance

Alachlor disappearance curves and half-life and decay coefficient values for the three
sampling sites and for the two alachlor concentration treatments are shown in Figure 3 and
Table 3. The curves in Figure 3 indicated an exponential disappearance of alachlor over time,
thus a first-order model was used to estimate the rate of disappearance and the half-life of
alachlor (Stasinakis et al., 2009). The equation of the first order reaction was:
ln (Ct C 0 ) = − k × t
Where Ct is the residual alachlor concentration at incubation time t (day), C0 is the initial
alachlor concentration and k (day-1) is the decay coefficient. The half-life was calculated as
half-life = ln (2) / k. For all disappearance curves, the linear regression (R2) values ranged
from 0.76 to 0.99.
Decay coefficients (k) ranged from 0.025 to 0.185 day-1 and half-lives ranged from 3.9 to 30.8
days in the different microcosms. Values of k and half-life presented large standard deviation.
Decay coefficients differed significantly between the 1 µg L-1 and 20 µg L-1 treatments for
site G (p = 0.05) and M (p = 0.05), whereas they were similar for site W (p = 0.658). For the
two alachlor concentration treatments, half-life values were of the same order of magnitude at
site M (p = 0.05) and W (p = 0.05). The highest rates of decay were observed at site G (3.9
and 8 d) for both alachlor concentration treatments.

Alachlor concentration 1 µg L-1 20 µg L-1

-1 -1
k (d ) Half-life (d) k (d ) Half-life (d)
Site G 0.185 ± 0.046 3.9 ± 1 0.087 ± 0.004 8 ± 0.4
Site M 0.043 ± 0.005 16.3 ± 2 0.025 ± 0.009 30.8 ± 12.1
Site W 0.045 ± 0.033 21.8 ± 14.5 0.032 ± 0.003 21.6 ± 1.9

Table 3: Average ± SD values of decay coefficient k and half-live for both alachlor treatment
concentrations for three sampling sites G, M and W

9
 140

1,4
A Control
Alachlor concentration (µg L )

Site G
-1

1,2
Site M
Site W
1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12

Time (Days)

25
B Control
Alachlor concentration (µg L )

Site G
-1

Site M
20 Site W

15

10

0
0 2 4 6 8 10 12

Time (Days)

Figure 3: Alachlor disappearance curves for both alachlor treatment concentrations, at 1 µg L-

1
(A) and 20 µg L-1 (B) initial alachlor concentrations for three sampling sites G, M and W.
Each time point represents the mean of three replicats. Errors bars refer to the SD (n = 3).

4. Discussion
The main objectives of this work were to evaluate, in aqueous phase, the behaviour of an
organic contaminant, such as alachlor, exposed to different microbial consortia and thus
examine the impact of microbial community structures on the fate of alachlor. The microbial
consortia included suspended communities from epilithic biofilms and activated sludge
samples.

10
 141

4.1. Differences among microbial inocula

The choice of the activated sludge community was based on studies involving the
biodegradation potential of activated sludge operating at various massic loading rates (MLR)
(Vazquez-Rodriguez et al., 2003, 2007). The result of these studies suggested that activated
sludge treatment operating at high MLR exhibited a greater capacity for biodegradation than
activated sludge systems operating at small or medium MLR. Previous studies have suggested
that substrate properties (surface roughness or hydrophobicity) and substrate types (natural or
artificial) can influence bacterial community structure (Anderson-Glenna et al., 2008) and
algal production of epilithic biofilms (Cattaneo and Amireault, 1992). Thus, in the site G, the
pebbles represent the “natural” community present in the river, whereas the incubation site M
represents a selected community.
Activated sludge and epilithic biofilms developed in habitats with both imposed and
intrinsically different environmental conditions (trophic states, light, hydrodynamics…). The
aeration tank of the wastewater treatment plant used for activated sludge sampling (site W)
was characterized by high concentrations of DOC, TP and NH4+-N, supporting extensive
bacterial growth. Epilithic biofilm community development occurred in two separate aquatic
environments characterized by different in situ hydrodynamics and environmental conditions.
For example, site M, located in an agricultural watershed basin, presented high conductivity
and nitrate concentrations, whereas site G was characterized by high flow velocity.
Epilithic biofilms exhibited AFDM values which were consistent with those previously
recorded in the literature (0.7 to 290 g AFDM m-², Biggs and Price, 1987). Epilithic biofilm
from site G exhibited higher AFDM values than those from site M. The lower AFDM value
within site M biofilms could be explained by (i) a reduced adhesion of species due to the use
of artificial substrates (Cattaneo and Amireault, 1992; Lane et al., 2003), (ii) differences of
nutrient availability (Dodds et al., 1997) and hydrodynamic conditions (Biggs and Stokseth,
1996) or (iii) the shorter growth period length (6 weeks) as opposed to previous studies (11
weeks, Biggs and Price, 1987). Low values of AFDM / DM ratios recorded for both epilithic
biofilms from site G and M, suggested biofilms dominated by sedimentary particles. These
particles were probably imported by a flood event observed at site G and by the presence of
sediments on the river bed at site M. The autotrophic index (AI) indicates the relative
importance of autotrophic versus heterotrophic organisms and detritus. With AI values of 46,
the epilithic biofilm from site M essentially was constituted by algae whereas with AI values
of 176, the epilithic biofilm from site G was stable and constituted by equivalent proportions
of photoautotrophic and heterotrophic microorganisms (Biggs and Close, 1989).

11
 142

Microbial structure of different microbial consortia were compared using 16S rDNA based
PCR-DGGE. Principal Component Analysis (PCA) of DGGE patterns revealed distinct
groups according to the habitat type and the incubation sites of the biofilm.
Methodological biases (chimera and heteroduplex formation, template annealing detection of
the dominant populations) are well known and have been widely discussed in the literature
(Lyautey et al., 2005a). With a number of OTUs ranging between 23 and 36, epilithic biofilm
communities exhibited values similar to previous studies of this type of community (19.5
OTUs, Araya et al., 2003a; 36 OTUs, Lyautey et al., 2005b). Interestingly, in previous
studies, the activated sludge communities were considered to be highly complex, exhibiting
more complex DGGE banding patterns than the patterns obtained during the current study
(Boon et al., 2002). This lower OTUs number could be explained by a reduction of the
biomass composition during the step of activated sludge settling. In the natural environment,
it was apparent that environmental factors such as pH, temperature, nutrient availability
(Hullar et al., 2006), and turbulent flow (Besemer et al., 2007) influenced microbial
community structure. The DGGE analysis of structure and composition is a powerful tool to
characterize and to compare microbial communities, but not differentiate them on their
functional potentialities.
Therefore, we assayed carbon source utilization spectra of communities by the use of
commercial Eco-plates. Limits of this approach (inoculum density, bacterial physiological
states, metabolic redundancy, inability of growth in nutrient-rich medium, and detection of
rapid bacterial growth) were well reviewed in the literature (Preston-Mafham et al., 2002).
However, the ability of this method to distinguish microbial communities within similar
habitats (Forney et al., 2001) or from different habitats (Garland and Mills, 1991, soil versus
river samples), has been widely verified. Our results suggested discrimination between
samples from disparate habitats (activated sludge and river). These different profiles may be
associated with different biodegradation potential and bacterial activities consistent with
different functional diversity (Konopka et al., 1998). The data obtained in this and previous
studies showed that activated sludge communities preferentially use carbohydrate sources
(Paixao et al., 2006).
Epilithic biofilm from site G exhibited a greater heterogeneity among replicates consistent
with intra-site variation associated with the use of natural substrates (Rolland et al., 1997) or
Biolog system which can present large variation between replicates as recorded by Baath et al.
(1998).

12
 143

As observed by Foley et al. (2008), the data obtained in this study support the importance of
complementary method combinations. Each method described a different aspect of the overall
microbial communities. DGGE revealed a dominant subset of the total community
membership (Lyautey et al., 2005a), while carbon source utilization spectra analysis revealed
a subset of the overall community which rapidly grew on specific substrates (Preston-Mafham
et al., 2002).
4.2. Alachlor disappearance rate
Pesticide concentration and type of molecules detected in surface waters are affected by
several factors such as the season, the physico-chemical properties (persistence, solubility)
and the topography of the drainage basin (Carabias-Martinez et al., 2003). In the aquatic
environment, microbial processes are the main cause of disappearance of alachlor however,
mineralization is rarely complete (Stamper and Tuovinen, 1998). Most studies which have
evaluated alachlor disappearance used microbial assemblages such as activated sludge
(Lapertot and Pulgarin, 2006), surface water (Graham et al., 2000; Ensz et al., 2003),
groundwater (Schwab et al., 2006b) and soil (Hildebrandt et al., 2007). Activated sludges are
very often used because many contaminants enter the environment through waste water
treatment facilities (Forney et al., 2001). Activated sludges exhibited highest reproducibility
and cell biomass (Struijs and Van den Berg, 1995) and higher and wider capacity for
biodegradation (Thouand et al., 1996; Vazquez-Rodriguez et al., 1999). Our results showed a
significant disappearance of alachlor for all treatments. With a half-life from 16.3 to 30.8 days
for activated sludge and epilithic biofilm from site M samples, values were consistent with
previous results recorded in the aquatic environment for inoculum from surface water
(Graham et al., 1999; Graham et al., 2000; Ensz et al., 2003), but lower than those recorded in
ground water (808 to 1518 days, Cavalier et al.,1991) and higher than in soil (3 to 7 days,
Stamper and Tuovinen, 1998; 5.2 days, Aga and Thurman, 2001). This broad range of half-
lives can be explained by the highly variable environmental conditions in these studies.
Previous studies showed that environmental parameters such as nutrient and dissolved organic
carbon level (Ensz et al., 2003), light intensity (Graham et al., 1999), and temperature (Daam
et al., 2009) affected the fate and behaviour of alachlor in aquatic environments. These studies
showed a positive correlation between nutrient quantity and light, and the decay of alachlor in
aquatic systems. The nutrient and the light stimulated the algal and bacterial activities with the
production of autochthonous, dissolved organic carbon, stimulating the high co-metabolism of
alachlor and its degradation. Knapp et al. (2003) observed the highest alachlor decay in
hypereutrophic waters (half-life = 16 days, total phosphorous > 80 µg L-1) as opposed to

13
 144

oligotrophic waters (half-life = 122 days, TP < 12 µg L-1). Finally, under the experimental
conditions used for the current study, darkness, low nutrient (total phosphorous = 12 µg L-1)
and low dissolved organic carbon levels (2 mg L-1 as opposed to 11.9 mg L-1 in Ensz et al.,
2003), alachlor would be predicted to be more persistent in our microcosms. These
differences could be explained by several reasons. Laabs et al. (2007) compared the
persistence of pesticides in small (0.75 L) and large (200 L) microcosm systems, and showed
shortened half-life times by a factor from 1.5 to 5.3 in the smaller microcosm. The smaller
size of microcosm could permit shorter distances between chemical and degraders and a
higher ratio of biomass to water phase favouring degradation. Finally, the origin of inoculum
also could affect the fate of the xenobiotic; Araya et al. (2003b) showed that bacteria from
epilithic biofilm degraded N-Methylaniline more rapidly than bacteria of planktonic origin.
Interestingly, with half-life times of 3.9 to 8 days, site G clearly exhibited the lowest alachlor
persistence. In the literature, values in this range were generally associated with soil
environments (Aga and Thurman, 2001). This lower persistence of alachlor could be
explained by several reasons: (i) a high percentage of potential degraders (Van Ginkel et al.,
1995), (ii) an increased adsorption due to a high amount of suspended particles, (iii) an
adapted bacterial community due to the longer term in situ development of the biofilms at site
G. Site G presented lower values of nitrogen, TP and DOC compared to sites M and W,
typically these might be limiting factors for bacterial growth. It has been suggested that
inoculum acclimatization to environmental conditions during field experiments enhanced their
xenobiotic biodegradability potential (Thouand et al., 1996). The data obtained on AFDM
values of both epilithic biofilms hypothetically revealed mature biofilms at site G. Biofilm
maturation can ultimately promote the occurrence of micro-niches (Jackson et al., 2001)
within the aggregates that will favour the development of populations involved in processes
such as biodegradation which is consistent with our observation for biofilms at site G.
At site M pesticide-pollution of surface water was a more important issue than for site G.
Thus epilithic biofilm from site M could exhibit an adaptation to herbicides and show higher
herbicide biodegradation potential as observed by Pesce et al. (2009) for epilithic biofilm
from a herbicide-treated wine-growing watershed, or Celis et al. (2008) who studied activated
sludge that was herbicide-acclimated for 30 days. The fact that site G exhibits lower half-lives
than site M could suggest the importance of exposure of the bacteria to the herbicide or
related compounds in the adaptation phenomena and herbicide biodegradation potential.
According to our operating conditions, photodegradation was not a factor, the absence of
alachlor removal in control microcosms rules out other abiotic mechanisms (in absence of

14
 145

inoculum amendment) and the low value of Henry Law constant suggested no volatilization
occurred (Lapertot and Pulgarin, 2006). Hypothetically, with a solubility value in water at
25°C of 239 mg L-1 and moderate octanol-water partition coefficient (log Kow) of 3.52
(Lapertot and Pulgarin, 2006), alachlor is considered to be relatively water soluble, thus its
adsorption on suspended particles appeared to be a minor mechanism governing its water
removal. Laabs et al. (2007) only recorded 1 % of the applied alachlor under went sorption to
suspended particles. A previous study showed that quantities of acetochlor (similar family of
alachlor) sorbed by a structured epilithic biofilm amounted to 0.63 % of losses against 96.2 %
caused by biodegradation mechanisms (Bohuss et al., 2005).
Except in the case of activated sludge, the highest rate of alachlor disappearance appeared at
the lowest initial alachlor concentration. Various studies demonstrated that biodegradability
potential was affected by the initial concentration of the target chemical (Novick and
Alexander, 1985; Kawai et al., 1998). In sewage and lake water, Novick and Alexander
(1985) observed that metabolic rate was proportional to amended alachlor and propachlor
concentrations contrary to conclusions by Galassi et al. (1996) which were consistent with our
results for the epilithic biofilms. High concentrations of alachlor (50 mg L-1) may inhibit
degradation as shown for activated sludge by Lapertot and Pulgarin (2006).
Alachlor biodegradation is known to occur by co-metabolism catalyzed via non-specific
glutathione-S-transferase (GST) (Thurman et al., 1996). Earlier studies demonstrated that
amendment with other easily degraded carbon sources (or primary substrates) such as, acetate,
glucose (Wilber and Wang, 1997) or humic substances (Badriyha et al., 2003) could enhance
the biodegradability potential of alachlor by microorganisms. Consequently, alachlor was not
used as a primary carbon source by microorganisms (Stamper and Tuovinen, 1998) and its
biotransformation requires access to primary substrates. This behaviour has also been shown
for demeton-S-methyl (Girbal et al., 2000). Thus, in our microcosms, exudates, exopolymers
and algal biomass may have been used by the bacteria as primary carbon sources facilitating
degradation.
4.3. Conclusion
This study confirmed that allogenic factors control the microbial community structure within
each microbial habitat. Complementary methods proved to be powerful tools to discriminate
bacteria community function and diversity. The comparative analyses of different microbial
communities can increase knowledge regarding the structure / function relationships at the
scale of microbial aggregates. Field experiments reveal that the fate of alachlor in aquatic
medium depends on the bacterial community origin, biomass levels and chemical

15
 146

concentrations. Our results suggest that suspended biomasses obtained from epilithic biofilms
can be used to predict the environmental fate of a chemical based on biodegradability tests.
However more information about the influence of experimental conditions, such as the
composition of the medium and aqueous phase metabolites levels would increase the value of
such experiments. Further investigation will be required to identify the degrader populations
within the native bacterial community. Alachlor is known to be degraded by co-metabolism
and catalyzed by non-specific GST (Noack et al 1985; Thurman et al 1996), it could be
interesting to explore the occurrence and expression of genes coding for this enzyme in order
to better understand alachlor biodegradation pathways in aquatic environments.
Acknowledgements
This work was supported by the “Conseil Régional Midi-Pyrénées”. We thank D. Dalger for
the water chemistry analysis and J. Leflaive for sole-carbon source utilization profiles statistic
analysis. We also thank the “Association des Agriculteurs d’Auradé” and “Véolia Company”
for the access to site M and W respectively.
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19
 Chapitre II
Comment appréhender les facteurs qui
contrôlent les successions écologiques des
communautés microbiennes : cas des biofilms
phototrophes

ou de l’expérimentation en milieu naturel à une tentative de contrôle en bioréacteur

innovant.

Questions :
– Quelle est l’importance relative des facteurs autogènes versus les facteurs environnemen-
taux sur la structuration des communautés durant le développement des biofilms photo-
trophes ?
– Est-il possible de modifier la structure de communautés microbiennes benthiques et sa
dynamique temporelle ? Exemple d’une expérience de transplantation en milieu naturel.
– Quel est la part du déterminisme autogène sur la structuration et la dynamique des com-
munautés microbiennes benthiques ? Approche expérimentale en bioréacteur.

Ce chapitre se déroule en deux sous-parties : dans une première partie, nous proposons
une approche expérimentale in situ pour analyser la structuration temporelle des communau-
tés bactériennes selon le concept de succession écologique et évaluer la possibilité d’en modifier
la trajectoire par une expérience de transplantation. Dans une seconde partie, nous présen-
tons un prototype de bioréacteur photosynthétique à écoulement de type Taylor – Couette,
et nous discutons de sa capacité prometteuse à l’amélioration de nos connaissances sur les
successions écologiques. Ce chapitre fait l’objet de deux articles parus dans les revues Annales
de Limnologie – Int. J. Lim. (Article 2) et Water Research (Article 3).
II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 151

II.1 Importance des facteurs allo- et autogènes sur les

communautés bactériennes durant le développement
de biofilms phototrophes
Résumé de l’article intitulé "Autogenic versus environmental control of river bio-
film" par A.Paule, E. Lyautey, F. Garabetian et JL. Rols (2009). Annales de
Limnologie-Int.J.Lim. 45 :1-10. (Article 2)

II.1.1 Contexte de l’étude

Comme déjà évoqué précédemment, les communautés bactériennes des biofilms photo-
trophes de rivière, comme pour d’autres types d’habitats (lac, réseau d’eau potable, station
d’épuration,. . . ) (Figure 56), sont structurées selon des processus de succession de popula-
tions (Jackson et al. 2001). Ce concept de succession s’appuie essentiellement sur un modèle
d’évolution temporelle de la diversité des communautés qui révèle la disparition ou l’appari-
tion de taxons (ou d’OTUs) au cours du développement du biofilm (Jackson et al. 2001). Lors
des premiers stades de développement, les bactéries colonisent un substrat vierge, le nombre
de taxons augmente dans le temps. Suite à l’établissement du biofilm, les échanges avec la
colonne d’eau diminuent, entrainant ainsi l’apparition de mécanismes de compétition entre
les taxons pour les ressources ou l’habitat, ce qui engendre une diminution du nombre de
taxons et une réduction d’apport de nouvelles espèces depuis la colonne d’eau (Jackson 2003)
(Figure 56). Avec la maturation du biofilm, de nouvelles niches écologiques apparaissent à
l’intérieur de l’agrégat, ce qui favorise l’installation de nouvelles populations associées parfois
à de nouvelles fonctions telle que la dénitrification (Lyautey et 2005).
Le chapitre précédent confirmait l’importance d’intégrer l’existence des processus de suc-
cessions écologiques dans l’expression de fonctions (la biodégradation d’un herbicide) au sein
des communautés, celle-ci étant rendue possible par la typologie de leur structure. Cette
observation nous amène à nous interroger sur la manière dont ces processus de successions
écologiques sont réalisés pour aboutir à des structures particulières. Quels sont les facteurs
qui conditionnent ces successions ? Est-il possible de modifier leurs trajectoires ? Pour tenter
de répondre à ces questions, une stratégie d’approche in situ via une expérience de trans-
plantation a été réalisée. Le biofilm phototrophe, par son caractère ubiquiste, son temps de
génération court et son intégration rapide des changements des conditions environnementales,
se présente comme un candidat particulièrement intéressant pour appréhender ces concepts
de successions écologiques et leurs mécanismes.
 II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 152

Figure 56 – Modèle de
successions écologiques illus-
trées à travers l’évolution de
nombre d’OTUs observée du-
rant l’établissement de diffé-
rents types de biofilms com-
parés au modèle proposé par
Jackson (2003). Graphe du
haut : nombre total d’OTUs,
Graphe du bas : nombre de
nouveaux OTUs (extrait de
l’HDR, F. Garabetian 2006)

Ces processus de succession sont également connus pour les communautés algales ben-
thiques. La colonisation d’un substrat vierge commence le plus souvent par l’installation
d’espèces colonisatrices de diatomées (exemple Nitzschia palea), souvent de petite taille et
présentant des vitesses de croissance très rapide (stratégie R) (Eulin et Le Cohu 1998). Ces
espèces vont pouvoir favoriser en cascade l’installation des autres espèces (Stevenson 1983).
Cependant, certaines conditions environnementales peuvent favoriser l’installation initiale
d’algues vertes ou de bactéries hétérotrophes (Roeselers et al. 2007). Ce dernier aspect ne
sera appréhendé que durant la deuxième partie de ce chapitre.
Le principal objectif de cette étude est d’évaluer l’importance relative des facteurs au-
togènes versus les facteurs allogènes durant le dévelopement des biofilms phototrophes. De
récentes études ont utilisé la technique de transplantation principalement lors d’études éco-
toxicologiques avec des pesticides en transférant les biofilms d’un site pollué à un site non-
pollué (e.g. Vercraene-Eairmal et al. 2010 ; Dorigo et al. 2010a ; Rotter et al. 2011). Leur
développement sur des supports fixes rend les biofilms phototrophes particulièrement bien
adaptés à ce genre d’approche, qui présente tous les avantages d’un travail in situ.

II.1.2 Approche expérimentale

La dynamique des communautés bactériennes des biofilms phototrophes est suivie durant
leurs développements in situ durant 3 et 5,5 semaines sur des substrats artificiels placés sur
deux sites, M et S (cf. partie II Matériel et méthodes) aux caractéristiques physico-
chimiques différentes en terme de faciès, de niveau de nitrates et de pesticides, de pH et de
vitesse courant, (cf. détails partie II Matériel et méthodes). A l’issue de 3 semaines
d’incubation, une partie des substrats est collectée dans chaque site et transposée dans le
II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 153

second site pour une durée d’incubation supplémentaire de 2,5 semaines. Les quantités de
biomasses des biofilms collectés à 3 et 5,5 semaines, ainsi que la structure de leurs commu-
nautés bactériennes analysée par typage moléculaire (PCR-DGGE) de la molécule d’ADNr
16S sont évaluées et comparées.

II.1.3 Principaux résultats et discussion

Au cours des 5,5 semaines de développement des biofilms in situ, un suivi des paramètres
physico-chimiques est réalisé toutes les semaines dans chaque site. Seules les valeurs de tem-
pérature et de concentration en oxygène dissous évoluent au cours de l’incubation. Le site
M présente des valeurs de pH, de concentration en nitrates et de conductivité plus élevées
que le site S, résultant de caractéristiques propres à ce site (sol alcalin, pollution par les
nitrates. . . ). A l’inverse, le site S présente de plus fortes concentrations en phosphore total
que le site M, assimilées à des événements de crue observés durant la période d’étude. Les
deux sites présentent des niveaux de pollution identiques en termes de pesticides (sur 23 pes-
ticides recherchés dont les concentrations sont > 1 µg.L−1 ). Les niveaux de biomasse estimés
par la MSSC atteignent après 3 semaines de développement des valeurs similaires d’un site à
l’autre (en moyenne 1,4 ± 0,22 g.m−2 ). Par contre à l’issue de 5,5 semaines de développement,
les niveaux de MSSC sont significativement différents d’un site à l’autre. Une perte de bio-
masse est observée pour le site M (de 1,4 à 0,18 g.m−2 ), assimilée à la présence de brouteurs
(Bithynia). A l’inverse, les niveaux de MSSC augmentent au niveau du site S suggérant une
croissance du biofilm (de 1,4 à 2,6 g.m−2 ). Les quantités de biomasse observées à 5,5 semaines
sont plus faibles que les valeurs de biomasse obtenues dans la littérature (entre 15 et 25,6
g.m−2 dans Biggs 1996) expliquées par l’utilisation de substrats artificiels qui peuvent limiter
la fixation des micro-organismes. La dynamique d’évolution des communautés bactériennes
analysée par la méthode de typage moléculaire PCR-DGGE de l’ADNr 16S, révèle un total
de 40 et 55 OTUs (suivant le gel de DGGE analysé, cf. détails partie II Matériel et mé-
thodes). Ce nombre de taxons reste constant tout au long de la maturation du biofilm pour
les deux sites avec ou sans transplantation. Les disparitions ou les apparitions de nouvelles
espèces au cours du temps suggèrent des changements au sein des communautés en accord
avec le modèle de succession écologique développé par Jackson (2003) pour les communautés
bactériennes. L’expérience de transplantation induit également une apparition de nouvelles
espèces, en moyenne 12,5 au site M et 10 au site S. Les communautés provenant des biofilms
matures de 5,5 semaines transplantés ou pas, partagent 6 taxons communs. L’analyse NMDS
des similarités entre les communautés bactériennes de l’ensemble des échantillons révèle un
regroupement des communautés en 2 grands clusters :
II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 154

– un cluster qui regroupe les échantillons en fonction de leur site d’incubation d’origine,
et cela quel que soit le temps de développement. A l’intérieur de chaque cluster, une
distinction apparait entre les communautés, suivant leur état de maturation ;
– un cluster qui regroupe les échantillons après transplantation et cela quel que soit le sens
du transfert, suggérant bien une modification des trajectoires de succession écologique
suite à cette expérimentation.
Ces résultats permettent de mettre en évidence deux phénomènes importants qui gou-
vernent la structuration des communautés bactériennes : les conditions environnementales et
les successions écologiques liées à la croissance et la maturation du biofilm.
Il est intéressant de noter que certains taxons à 5,5 semaines sont communs (6 OTUs)
aux communautés bactériennes des biofilms transplantés ou non transplantés. La présence
de ces taxons peut venir soit :
– de taxons qui, à 3 semaines de développement, présentent des niveaux de détection
trop faibles et qui sont devenus dominants à la suite de processus de compétition ou
d’apparition de niches écologiques qui leur sont spécifiques. Il faut noter que la mé-
thode de PCR-DGGE ne permet de mettre en évidence que les taxons dominants au
sein des communautés (Muyzer et al. 1997). Dans ce cas, nous pouvons parler d’une
prédominance des facteurs autogènes ;
– de l’arrivée de nouvelles espèces présentes dans le site d’accueil. Dans ce cas, nous
pouvons parler d’une influence de la part des facteurs allogènes.
Ainsi les deux types de facteurs allogènes et autogènes ont pu contrôler fortement la
structuration des communautés transplantées, avec une légère prédominance pour les fac-
teurs autogènes, sinon les biofilms transplantés présenteraient des structures identiques à
celles des biofilms non transplantés. Les temps de génération extrêmement courts des bac-
téries auraient dû induire cette ressemblance structurelle entre les biofilms transplantés et
non transplantés. Le degré de maturation des biofilms transplantés à 3 semaines, une très
forte interdépendance associée à une proximité physique entre les algues et les bactéries ainsi
qu’une période d’incubation après la transplantation pas suffisamment longue, pourraient ex-
pliquer cette absence de ressemblance. Avec la maturation, les biofilms deviennent de plus en
plus épais et réalisent de moins en moins d’échanges avec la colonne d’eau. Les communautés
bactériennes se retrouvent ainsi principalement contrôlées par les facteurs autogènes comme
la compétition pour les ressources. Certains auteurs ont pu montrer que l’intervalle de temps
nécessaire pour atteindre cette ressemblance peut varier de 14 à 60 jours (e.g. Rimet et al.
2005 ; Dorigo et al. 2010a et b ; Rotter et al. 2011). Ces résultats suggèrent peut être une durée
trop longue des 3 premières semaines de développement des biofilms. Vu l’étroite relation et
II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 155

les interactions existant entre les algues et les bactéries au sein d’un biofilm phototrophe, le
suivi de la dynamique des eucaryotes par l’utilisation de la méthode de PCR –DGGE basée
sur l’ADNr 18S aurait pu être envisagée. Les 2,5 semaines qui ont suivi la transplantation
nous ont tout de même permis de bien intégrer les changements des communautés des bio-
films transplantés sans pour autant atteindre une structure identique à celle de biofilms non
transplantés.
La pression exercée par les brouteurs dans le site M ainsi que les événements de crues
rencontrés dans le site S ont pu entrainer un impact sur la biomasse et ainsi provoquer
l’apparition de nouveaux habitats, favorisant soit l’installation de nouvelles espèces, soit la
dominance d’espèces déjà présentes au sein des biofilms.

II.1.4 Conclusion et perspectives

Cette étude révèle que :
– les facteurs allogènes apparaissent prédominants lors des premiers stades de dévelop-
pement des biofilms, engendrant des structures bien différentes d’un site à l’autre et à
l’origine de l’orientation de la succession écologique menant à une trajectoire particu-
lière. Avec la maturation du biofilm, les facteurs autogènes deviennent progressivement
prédominants ;
– cette trajectoire de successions peut être modifiée par des changements des conditions
environnementales illustrés par l’expérience de transplantation.
Travailler in situ apporte de nombreux avantages, notamment celui de se rapprocher des
conditions environnementales réelles d’un écosystème. Mais un certain nombre de facteurs
n’y est pas maitrisé, comme par exemple les variations saisonnières, la présence de brouteurs
ou d’épisodes de crue. Ces facteurs peuvent être source de stress et de perturbations pou-
vant être à l’origine d’une modification ou d’une interruption des successions et entrainer la
réinitialisation de la dynamique des communautés (Biggs et Thomsen 1995) à ces échelles
spatio-temporelles faibles (5,5 semaines) ou même masquer ces processus. Ces perturbations
peuvent rendre difficile l’appréciation de l’importance relative des facteurs autogènes vis-à-vis
des facteurs allogènes durant la dynamique de croissance des communautés bactériennes des
biofilms.
Une nouvelle stratégie expérimentale consisterait à aborder ces concepts plus simplement
en travaillant sous des conditions environnementales stables et à une échelle temporelle plus
importante.
II.1. Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés
bactériennes durant le développement de biofilms phototrophes 156

II.1.5 Article 2
Les sites annotés A et L de l’article correspondent aux sites M et G du manuscrit dans
son ensemble.
 157

Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10 Available online at:

Ó EDP Sciences, 2009 www.limnology-journal.org
DOI: 10.1051/limn/09007

Autogenic versus environmental control during development

of river biofilm

Armelle Paule1,2, Émilie Lyautey1,2, Frédéric Garabetian1,2 and Jean-Luc Rols1,2*

1
Université de Toulouse; UPS, INP; EcoLab (Laboratoire d’Écologie Fonctionnelle); 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse,
France
2
CNRS; EcoLab; 31062 Toulouse, France

Received 17 June 2008; Accepted 1st February 2009

Abstract – In the natural environment, microbial community structure of river biofilm is controlled by biotic
and abiotic factors. This study explored the capacity to manipulate the structure of microbial communities by
modifying environmental conditions during the course of biofilm development. River epilithic biofilm was
cultivated in situ on artificial substrates placed parallel to river water flow. Substrates were incubated for 3
and 5.5 weeks in river to allow natural biofilm development, at two sites with contrasting physico-chemical
characteristics. The first site (Auradé, Gers, France) was located in an agricultural watershed basin and the
second site (Larroque, Haute-Garonne, France) was located in a forested watershed basin. After 3 weeks of
biofilm development, a subset of substrates was collected from one site and transplanted to the second site
where they remained for 2.5 further weeks. Epilithic bacterial community structure (at 3 weeks from each site
and at 5.5 weeks from biofilms with and without transplantation) was assessed using PCR-DGGE of
16S rDNA fragment. Biofilm biomass was estimated using ash free dry mass (AFDM). After 3 weeks of de-
velopment, biofilms from the two sites exhibited comparable AFDM values (average of 1.4 ¡ 0.2 g.mx2).
A difference between the two sites was observed after 5.5 weeks of development: AFDM decreased for bio-
films from the agricultural watershed basin (from 1.4 to 0.18 g.mx2) as a consequence of grazing pressure
(Bithynia), and increased for biofilms from the forested agricultural watershed (from 1.4 to 2.6 g.mx2).
Microbial community analyses revealed a differentiated community structure between biofilms from the differ-
ent sites and exhibited a change of microbial community structure after 5.5 weeks of biofilm development.
These observations confirm a process of ecological succession in microbial communities. Changing the
incubation site during biofilm development modified the trajectory of these ecological successions, suggesting
that site characteristics mainly conditioned the structure of these microbial communities.

Key words: Colonization experiment / community structure / grazing / microbial ecology / succession

Introduction represent a major compartment involved in primary

production (Dodds, 2006), mineralization and element
Epilithic biofilms are microbial aggregates constituted recycling processes (e.g., dissolved organic carbon dyna-
by heterotrophic micro- and meio-organisms (e.g., bac- mics, Romani et al., 2004) and participate in auto-
teria, protozoan) and phototrophic micro-organisms (e.g., epuration (Sabater et al., 2002; Teissier et al., 2007) and
diatoms, cyanobacteria), embedded in a exopolymeric biodegradation of pollutants in aquatic environments
substances matrix secreted by the microorganisms (Lock (Lawrence et al., 2001; Sabater et al., 2007).
et al., 1984). Epilithic biofilm development occurs at the Epilithic biofilm functioning is conditioned by the
interface between river bed substrates (pebbles) and the community structure and diversity. Overall, epilithic bio-
water column where hydrodynamics, light and geomor- film structure can be influenced by (i) abiotic parameters
phological characteristics favor the development of a such as water temperature (DeNicola, 1996), nutrient
sessile biomass (Wetzel, 1983). Typically, epilithic biomass availability (Bothwell, 1993; Della Bella et al., 2007),
is dominated by the algal component of the commu- substrate types (Murdock and Dodds, 2007), hydrody-
nity (Peterson, 1996). In lotic systems, epilithic biofilms namics (Biggs, 1996; Battin et al., 2003), light (Wetzel,
1983; Boston and Hill, 1991; Hill, 1996) or pollutants
*Corresponding author: [email protected] (Lawrence et al., 2005; Tornes et al., 2007; Morin et al.,

Article published by EDP Sciences

 158

2 A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10

2008; Tlili et al., 2008); and by (ii) biotic interactions such bacterial community structure changes during biofilm
as predation and competition (Bourassa and Cattaneo, development; (ii) compare bacterial community structures
1998; Jackson et al., 2001). at two contrasting sites; and (iii) evaluate the influence of a
Epilithic biofilm development was demonstrated to be transplantation during biofilm development on bacterial
associated with population succession processes, both for communities. The transplantation process was intended to
the algal and the bacterial compartments. Colonization of assess the relative influence of autogenic (succession) and
bare substrates is completed by early-colonizing diatoms allogenic (environmental conditions) parameters on epi-
which will modify the microenvironment and favour lithic bacterial communities.
the settlement and colonization of other communities
(Stevenson, 1983). However, some environmental con-
ditions can favour initial colonization of green algae (high Materials and methods
light intensities) or of heterotrophic bacteria (low light
intensities) (Roeselers et al., 2007). After initial coloniza- Study sites
tion, succession of diatom populations associated with the
biofilm development was recorded (Eulin and Le Cohu, Two sites (sites L and A) exhibiting different physico-
1998). Succession processes were also demonstrated for chemical parameters were chosen to carry out in situ
epilithic bacterial communities and were associated to epilithic biofilm cultures (Fig. 1). Site L on the Save River
biofilm maturation (Manz et al., 1999; Jackson et al., 2001; is located in a forested watershed basin. The study site is
Araya et al., 2003). Biofilm maturation can ultimately located upstream of Save Gorges and at 2 km of the city
promote the occurrence of micro-niches within the ag- of Larroque (France) (43x110 43.7700 N/00x360 28.5900 E). The
gregate that will favour the development of populations basin is dominated by forested and pasturage landscapes.
involved processes such as denitrification (Lyautey et al., The river bed is very rocky and wide 6.7 m. During biofilm
2005a). According to a succession model, late develop- development, the average water depth was of 50 cm and
ment stages are associated with a decrease of the ex- the flow velocity (flow velocity meter, Flo-mate model
changes between the water column and the biofilm, and 2000) was about 1 m.sx1 during low water periods
with an increase of species interaction within the aggregate and 3 m.sx1 during high water periods. Site A on the
(Jackson, 2003). The main interaction is competition, Montoussé stream is located in an experimental agri-
which results in a decrease of the number of new species cultural watershed basin outlet (328 ha) of Auradé city
added to the community in late development stages (France) (43x330 55.0600 N/1x30 30.9200 E). The area is domi-
(Santegoeds et al., 1998; Jackson, 2003; Lyautey et al., nated by an agricultural landscape and reported as highly
2005a). contaminated by pesticides and nitrate. The main culti-
Because of its ubiquitous character, short generation vated crops are wheat and sunflower. The river bed is
time, sessile nature, and rapid response to changes in en- sedimentary, confined (1.5 m wide), and woody. Water
vironmental conditions, epilithic biofilms are widely used depths (50 cm) and flow velocity (0.045 m.sx1) were
as bioindicators of water quality in lotic systems (Burns constant during the biofilm development period.
and Ryder, 2001). The algal compartment, and more es-
pecially diatoms, is used to assess water quality using the
Diatoms Biological Index (Prygiel and Coste, 1993). Experimental protocol and sample collection
Bacteria are also sensitive to environmental or human-
induced perturbations. A spatial heterogeneity of bacterial Biofilm in situ colonization was carried out between
communities was recently reported along an upland river March 22 and April 30, 2007 to cover the pesticide
gradient, and was related to temperature and pH vari- application period in the experimental agricultural water-
ations (Anderson-Glenna et al., 2008). Seasonal variations shed basin. Artificial substrates were immersed in river
of environmental parameters proved to cause recurrent water to allow in situ epilithic biofilm colonization and
changes in community structure (Hullar et al., 2006). development. The use of artificial substrates permitted (i)
Anthropic perturbations also proved to influence bacterial to reduce the subjectivity of sample collection; (ii) to ease
community structures (Lyautey et al., 2003; Brümmer biofilm scraping; and (iii) to compare two stations with
et al., 2004). different physico-chemical characteristics (Cattaneo and
In the present work, we conducted a 5.5 weeks col- Amireault, 1992). Moreover, no natural substrate was
onization experiment: epilithic biofilm development was available at site A. Cleaned and smooth glass slides (244r
carried out on artificial substrates at two sites presenting 78 mm) were chosen as uniform artificial substrates. Glass
contrasting environmental conditions. After 3 weeks of slides were supported vertically within plastic trays
development, epilithic biofilms were either left for 2.5 more (400r 300r 100 mm) and recovered by a 5-mm mesh wire
weeks at the same site, or were transplanted to the other fence, as described by Morin et al. (2008). Every tray was
study site where they were left for 2.5 more weeks of made up of four glass slides which represented four
development. Bacterial community composition was as- replicates. Plastic trays were submerged about 20 cm
sessed using 16S rDNA based PCR-DGGE on 3 and below the water surface, and placed parallel to water flow,
5.5 weeks old biofilms from transplanted and unmoved in order to avoid sedimentary deposit on glass slides and
communities. The objectives of this study were to (i) assess to promote micro-organisms fixation. Biofilm colonization
 159

A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10 3

Fig. 1. Location of the two sites (black dots) chosen for in situ epilithic biofilm cultures. Site L is located in a forested watershed and
site A is located in an agricultural watershed.

was performed as follows: three glass slide tray tracks were conductimeter Hanna HI 99 1300 and a pH meter 320 WTV
placed at each of the two sites. For each site, four glass (electrodes Sentix41), respectively. Dissolved oxygen con-
slides were sampled randomly after 3 weeks of biofilm centration values were determined with an Oxi323 oxy-
development, and four glass slides were sampled after meter (electrodes oxical-S) and temperature values were
5.5 weeks of biofilm development. The last set of four glass represented by the mean values that were determined by
slides for which biofilm has initially developed for 3 weeks pH meter and oxymeter. In parallel, water samples were
at one site were removed from their site of origin and collected to assess the water quality using the following
transplanted in the other site where biofilm was left for parameters: nitrate (NO3x ), total phosphorus and ammo-
2.5 further weeks of development. In summary, experi- nium (N-NH4+ ) concentrations. These parameters were
mental conditions included two study sites with different measured by classic colorimetric methods (Secoman, Uvi
environmental conditions, two incubation period lengths Light, XT5) according to standard methods (APHA,
(3 and 5.5 weeks, A and AA for site A, and L and LL for 1992). Ammonium concentrations were determined within
site L, respectively) and a transplantation of the biofilms 10 h following sampling. Dissolved organic carbon (DOC)
during development (LA: from site L to site A, and AL : concentrations were determined in water filtered through
from site A to site L). After collection, glass slides were a 0.45 mm pore size filter (cellulose acetate membrane,
transported to the laboratory in cool bottles within moist- 25 mm diameter, Whatman) and analyzed using a plati-
urized garbage bags. Biofilm was removed from glass num catalyzer at 680 xC (Shimadzu, Model TOC 5000).
slides by scraping with a toothbrush, previously treated All measures and sampling were performed in the morning
with NaOH 1 N in order to avoid all trace of DNA and by to allow homogeneity between samples and once or twice a
scraping with a microscope blade. Biofilm was suspended week. Water samples were refrigerated during transport to
in 90 mL of river water previously filtered through a 0.2 mm the laboratory. Twenty three pesticides, commonly used in
pore size filter (cellulose acetate membrane, Whatman) the southwest of France, among which 17 herbicides
and homogenised (13 500 rpm, Ultra Turrax, T25). Bio- (Aclonifen, Atrazine, Atrazine desethyl, Chlorotoluron,
film suspension was aliquoted for further analyses. Cyanazine, Hexazinone, Imazathabenz-methyl, Isopro-
turon, Linuron, Metazachlor, Metolachlor, Metoxuron,
Monolinuron, Sebuthylazine, Simazine, Terbuthylazine,
Physico-chemical characteristics analysis Trifluralin) and six fungicides (Cyproconazol, Epoxicona-
zol, Fenpropimorph, Flusilazol, Pendimethalin, Tebuco-
Water physico-chemical characteristics of each study nazol) were quantified at three times during biofilm
site were estimated during the biofilm development period. development: T0 corresponds to the time of artificial
Temperature, conductivity, dissolved oxygen concentra- substrates positioning, T3 and T5 correspond to 3 and
tion and pH were measured in situ using specific electro- 5.5 weeks of colonization, respectively. Three liters of
des. Conductivity and pH values were measured with a water were collected in closed glasses bottles previously
 160

4 A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10

cleaned and sterilized by autoclaving. For every sample, acrilamide gel containing a gradient of denaturant ranging
10 mL of dichloromethane were added to 1.5 L of water. from 35 to 70% (100% denaturant is 7 M urea and
Then, samples were kept in a cold chamber at 4 xC. Pesti- 40% deionized formamide). For practical purposes (only
cides were extracted from water using dichloromethane, 20 samples can be processed on each DGGE gel), the four
and pesticides levels were quantified by Gas Chromato- replicates of the six samples were processed on two
graphy Mass Spectrometer (GC-MS, Thermo Fisher, different DGGE gels (two replicates of each sample on
Model Trace DSQ), according to Devault et al. (2007). each DGGE gel). The replicate 2 from 5.5 week biofilm
sample of site L (LL2) exhibited in the DGGE analysis a
number of bands drastically lower (< 10 OTUs) than the
Biomass determination three other replicates suggesting that a methodological
problem happened with this sample, either during DNA
Dry mass (DM) was measured by weighing the dried extraction or DNA amplification. Data from this sample
pellet (24 h at 80 xC) from an aliquot of 10 mL of biofilm were thus not included in the analysis. Electrophoresis was
suspension (centrifuged at 3500r g for 25 min, Heraeus performed at 100 V for 18 h at 60 xC. The gels were stained
Function Line). The pellet was subsequently combusted with SYBR Green (Sigma Aldrich) for 30 min. The gel
(8 h at 550 xC) to provide the ash free dry mass (AFDM). image was captured using a CCD camera and Biocapt
Another 10-mL aliquot of the biofilm suspension was Software (Vilbert Lourmat) and analyzed using Bio-
centrifuged (12 000r g, 20 min, 4 xC). After removing the Numerics 5.1 software (Applied Maths, Sint-Martens-
supernatant, Chlorophyll a content of the pellet was Latem, Belgium).
determined following an extraction in 90% acetone by
spectrophotometry according to SCOR-Unesco (1966).
Autotrophic index (AI) was defined as the ratio between Data analysis
AFDM and Chlorophyll a (APHA, 1992; Steinman and
Lamberti, 1996), and indicates the relative importance of In order to avoid methodological biases due to DGGE
autotrophic organisms versus heterotrophic organisms and intergel variability, each gel were analyzed separately.
detritus. For each sample, the ratio between AFDM and DGGE bands (defined as operational taxonomic units
DM was determined to indicate the relative importance of (OTUs)) were scored as present or absent from DGGE gel
organic fraction in the biofilm. analysis. A matrix was constructed from the Jaccard
similarity index (J = c/(a + b + c) where a, the number of
bands found only in sample A, b, the number of bands
Microbial community structure found only in sample B and c, the number of bands shared
between samples A and B). To assess changes in the
After centrifugation (12 000r g at 4 xC for 20 min, microbial community structure during biofilm develop-
Heraeus Multifuge) of an aliquot of 10 mL of the initial ment, DGGE patterns were analyzed by non-metric
biofilm suspension, the pellet was stored at x80xC until multidimensional scaling (NMDS) analysis as described
further analysis. Genomic DNA extraction was performed elsewhere (Van Hannen et al., 1999). NMDS analysis is a
on the pellet using Ultra Clean TM Soil DNA Isolation kit mathematical technique which provides a graphical rep-
according to the manufacturer’s protocol (Mobio Labora- resentation of every band pattern (sample) as one plot
tories). The extracted DNA concentration was quantified where relative changes in community structure can be
by fluorimetry (Fluoroscan Ascent, Labsystem) using interpreted as distances between the plots. The closer the
SYBR green (Sigma Aldrich). The 16S rDNA variable plots are to each other, the more similar are the DGGE
regions V3 to V5 were amplified using primers (Proligos) banding patterns. NMDS was carried out using SPSS 13.0
described as universal within the Bacteria domain: 341F software for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)
(50 -CCTACGGGAGGCAGCAG-30 ) with a 40 bp GC using a stress value < 0.1.
sequence clamped at its 50 end (50 -CGCCCGCCGCGC- The difference in physical chemical characteristics
CCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-30 ) and between stations and the difference in DM, AFDM,
907F (50 -CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-30 ) (Muyzer Chlorophyll a, number of bands on DGGE banding pat-
and Smalla, 1998). Amplification was carried out using terns between biofilm samples were assessed with the
an Eppendorf Mastercycleur following a protocol de- Kruskal Wallis test using SPSS 13.0 software for
scribed elsewhere (Lyautey et al., 2005b) using 20 ng of Windows. Differences were considered statistically differ-
extracted DNA as template for the PCR. Three replicate ent at P < 0.05.
amplifications were performed for each sample. Amplified
product concentrations were quantified on a 1.65%
agarose gel (Eurogentec) using precision Molecular Mass Results
Ruler (BioRad) as described previously (Lyautey et al.,
2005b). DGGE was carried out using D-Code Universal Water physico-chemical parameters
Mutation Detection System (BioRad). An amount of
700 ng (approximately 234 ng from each of the three For each site, water physico-chemical parameters
sample replicates) of PCR products were loaded onto an values presented below represent average value
 161

A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10 5

Fig. 2. Weekly evolution of dissolved oxygen concentrations and temperatures for site A (black dots) and site L (white dots) during the
period of in situ biofilm colonization. “ Week = 0 ” indicates the date where artificial substrates were placed in situ (March 22, 2007).

Table 1. Cumulated pesticide concentrations measured in river Thirteen of the 23 pesticides tested were detected with
water from study sites A and L for three dates (T0, T3, and a concentration above 0.1 mg.Lx1 at least once during
T5). T0 corresponds to the time of artificial substrates the study period. Cumulated pesticide concentrations are
positioning, T3 and T5 correspond to 3 and 5.5 weeks of presented in Table 1. Contamination levels by pesticides
colonization, respectively. All concentrations are expressed in on both sites were from 1 to 5 mg.Lx1 during biofilm
mg.Lx1. development. Concentrations were in the same order of
T0 T3 T5 magnitude for both sites at each period.
A 1.02 3.03 4.78
L 3.59 3.75 2.17
Biomass descriptors

(¡ standard deviation) from the eight water samples col- AFDM values ranged from 0.18 to 2.6 g.mx2 (Fig. 3).
lected during biofilm development (Fig. 2). Water tem- After 3 weeks of development, biofilms from sites L and A
peratures were comparable between site A (10.9 ¡ 3 xC) exhibited comparable AFDM values around 1.4 g.mx2
and site L (8.8 ¡ 2.8 xC) (P = 0.128). Dissolved oxygen (P = 0.773). After 5.5 weeks of development, biofilms from
concentrations measured at site A (12.3 ¡ 1 mg.Lx1) were site L (AL and LL) (up to 2.6 g.mx2) exhibited higher
significantly lower than at site L (13.7 ¡ 0.8 mg.Lx1) (P< AFDM levels than 5.5-weeks biofilms from site A (LA and
0.01). For both sites, temperature increased and dissolved AA) (down to 0.18 g.mx2) (P< 0.001). At site L, im-
oxygen concentrations decreased during the experimental portant biomass were consistent with the growth process
period, in accordance to seasonal variations. pH and and biofilm accretion, whereas the low biomass recorded
conductivity values remained constant for both sites over at site A were consistent with the occurrence of grazing
the sampling period, but were significantly different be- as revealed by the presence of several Bithynia molluscs
tween sites. pH values were above 7 for site A (7.6 ¡ 0.1) (Prosobranchia, Bithyniidae) on glass slides. AFDM/DM
and were lower for site L (6.2 ¡ 0.4) (P< 0.001). Con- ratio values ranged from 6.0 to 17.8%. Low values reveal a
ductivity was higher at site A (725 ¡ 8 mS.cmx1) than at biofilm rich in detritus and sedimentary particles. These
site L (128 ¡ 4 mS.cmx1) (P< 0.001). Site A is located in a sedimentary particles are likely to have been imported by
calcareous watershed basin which explained conductivity the two flood events observed in site L and by the presence
and pH values. Nitrate concentrations remained constant of sediments on river bed in site A. Important standard
over time for both sites with higher NO3x values recorded deviation values were caused by the presence of filamen-
for site A (41 ¡ 1.2 mg.Lx1) than for site L (7 ¡ 0.6 mg. tous algae which decreased the homogeneity of biofilm
Lx1) (P< 0.001). No difference was observed for N-NH4+ samples. The autotrophic index (AI) values ranged be-
concentration values between site A (16 ¡ 4 mg.Lx1) and tween 42 and 258. Three weeks old biofilms exhibited
site L (25 ¡ 12 mg.Lx1) (P = 0.382). Total phosphorus higher AI levels than 5.5 weeks old biofilms (P< 0.001),
concentrations were significantly lower for site A (17 ¡ indicating that late stages were essentially constituted by
5 mg.Lx1) than for site L (63 ¡ 34 mg.Lx1) (P< 0.001). autotrophic organisms.
Two flood events at site L were recorded during the
colonization period. DOC concentrations available were
obtained for site A in 2008 (from March to April, n = 10) Microbial community structure
and for site L in 2004 (from February to May, n = 6). DOC
concentrations were higher at site A (2.25 ¡ 0.07 mg.Lx1) The number of bands (OTUs) obtained for each ex-
than at site L (1.32 ¡ 0.08 mg.Lx1) (P< 0.05). perimental conditions are presented in Table 2. Analysis
 162

6 A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10

Fig. 3. Average ¡ SD value plots of ash free dry mass (AFDM), autotrophic index (AI, white bars) and AFDM/DM ratio (black bars)
for biofilm samples according to the different experimental conditions: A, L, AA, LA, AL and LL (refer to materials and methods for
the letters meaning).

Table 2. Number of bands (OTUs) obtained from DGGE

pattern analysis for different experimental conditions (A, L,
AA, LL, AL and LA, refer to materials and methods for the
letters meaning). Four replicates (numbers 1 to 4) were
analyzed for each condition.
A L AA LL AL LA
1 58 52 57 61 54 54
2 56 60 51 – 54 51
3 36 33 39 40 48 37
4 34 31 42 39 48 38

of DGGE banding patterns revealed a total of 66 and

94 OTUs for gel 1 (replicates numbers 3 and 4 of each
samples) and gel 2 (replicates 1 and 2), respectively. The
average number of OTUs per sample varied from 34 and Fig. 4. Two dimension representation plot of non-metric
56 for communities from 3-week biofilm to 40 and 55 for multidimensional scaling (NMDS) analysis of DGGE banding
5.5-week biofilm communities, for gel 1 and gel 2, re- patterns from the two gels analyzed in the present work for
spectively, indicating a constant richness along with bacterial communities from 3 and 5.5 week biofilms from site L
biofilm maturation (P = 0.371) and the transplanted ex- (white dots) and from site A (black dots) and from transplanted
periment (P = 0.752). Along with biofilm development biofilms (dark squares). Plots issued from the first DGGE gel
new species appeared in the communities. An average were rotated (45x counterclockwise – axis represented by dashed
of 15 OTUs appeared at site A between 3 week old and lines) to allow superposition of plots from gels 1 and 2. The
numbers 1, 2, 3 and 4 indicate replicates from one same
5.5 week old communities and an average of 12.5 OTUs
experimental condition.
appeared at site L. At the same time, the disappearance of
OTUs along with the aggregate development was ob-
served, with an average number of 9 OTUs disappearing communities from sites A and L exhibited differentiated
for both sites. The transplanted experiment also induced structures according mainly to the different incubation
the appearance of news OTUs: 12.5 at site A and 10 at sites and then to the state of maturation of the aggregate.
site L. Mature biofilms both from the transplanted com- Bacterial communities from the transplanted samples
munities and from the untransplanted biofilms only shared differed according to their site of origin (three first weeks
six common OTUs. of development) and of the site they were transplanted to.
NMDS analysis was carried out on the presence- NMDS analysis showed that differentiated bacterial
absence matrix separately for each DGGE gel following community structures were mainly mediated by the
by a superposition of both dimension representation plots environmental conditions.
(Fig. 4). NMDS takes the community-level similarity of
the samples. The stress values of final configuration were
0.123 and 0.105 and the proportions of variance explained Discussion
were 0.93 and 0.94. The proximity between replicates
on the plot revealed an important similarity of the The primary objectives of this work were to evaluate the
DGGE banding patterns. Three and 5.5 week old biofilm relative importance of development and of environmental
 163

A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10 7

conditions on epilithic biofilm bacterial community particles were likely imported by the two flood events
dynamics. observed in site L and by the presence of sediments on
The choice of the two study sites proved to be relevant river bed in site A. The autotrophic index indicates the
for the purpose of this work since different environmental relative importance of autotrophic versus heterotrophic
conditions were recorded during the study period. organisms and detritus. With values between 42 and 258,
Hydrodynamics, which discriminated the two sites, gen- epilithic biofilms described here were stable and consti-
erally causes substrate instability, and can generate a loss tuted by equivalent proportions of photoautotrophic and
of biomass during flood events (Biggs, 1996). To minimise heterotrophic microorganisms (Bourassa and Cattaneo,
the importance of this parameter and to homogenize 1998).
growth between our two study sites, biofilms were culti- Bacterial community composition was assessed using
vated on artificial substrates. Artificial substrates prevent 16S rDNA based PCR-DGGE. Methodological biases
the occurrence of biases due to intra- and inter-site (chimera and heteroduplex formation, template annealing,
variations during sampling. Although it has been sug- detection of the dominant populations) are well known
gested that substrate properties such as surface roughness and have been widely discussed in the literature (Muyzer
or hydrophobicity can influence bacterial community et al., 1993). Applied to epilithic biofilms, the use of
structure (Anderson-Glenna et al., 2008), it was shown Eubacteria-specific primers was proved to over-estimate
that artificial substrate support the development of algal bacterial richness by allowing the amplification of cyano-
community composition representative of natural com- bacteria and plastid DNA (Lyautey et al., 2005b). With
munities (Eulin and Le Cohu, 1998; Barbiero, 2000; averages of 40 (replicates 3 and 4) to 55 (replicates 1 and 2)
Lane et al., 2003). However, artificial substrate ability OTUs per sample of 5.5-week biofilm, bacterial richness
to reproduce natural communities remains controversial was higher than the richness observed for epilithic biofilm
(Cattaneo and Amireault, 1992). The water physico- grown on artificial substrates (Cody et al., 2000; Araya
chemical parameters of the two study sites were very et al., 2003; Dorigo et al., 2007), natural substrates
contrasted. Site A, located in an agricultural watershed (Lyautey et al., 2005a), and bacterial communities from
basin, was characterized by high levels of pH, conduct- phytoplankton in tropical water bodies (Dumestre et al.,
ivity, nitrate and DOC concentrations. Site L, located in a 2002) or in marine environment (Schauer et al., 2000). This
forested watershed basin, was mainly characterized by its could reflect limited niches and resource availability or
higher total phosphorus concentrations. Concerning pesti- much harsher environment caused by continual grazing
cides, the two sites presented similar levels of contami- and sloughing processes (Anderson-Glenna et al., 2008).
nation. On the basis of environmental factors, sites A and The use of artificial substrates did not seem to affect
L are clearly discriminated by their trophic states. bacterial community richness.
The choice of the incubation period length was based Dynamics of biofilm bacterial community were as-
on the dynamic of epilithic biofilm growth occurring in sessed at two sampling dates (at 3 and 5.5-week devel-
large rivers (Lyautey et al., 2005a; Boulêtreau et al., 2006). opment) which reveals constant richness values during
Epilithic biofilm growth is defined by an accretion phase biofilm maturation but the appearance or the disappear-
related to colonization and growth processes and charac- ance of species suggest changing bacterial communities
terized by an increase of AFDM resulting in a biomass and then a species succession consistent with theoretical
peak. Observed AFDM variations were consistent with models of biofilms succession (Jackson, 2003). Observed
previous experiments: at site L, epilithic biofilms presented succession is thus mostly driven by autogenic processes.
a biomass increase over time (colonization and growth) Allogenic factors also influence bacterial community
whereas at site A, a biomass decrease was observed after composition, and can explain the differences observed
three weeks. The presence of aquatic Bithynia molluscs between the two sampling sites. In freshwater environ-
(Prosobranchia, Bithyniidae) on glass slides suggests that ments, it was suggested that pH, temperature, and nutrient
the disturbance was due to a grazing event. The biomass availability were correlated with variations of structure
removal was more important for biofilms transplanted (Lyautey et al., 2003; Hullar et al., 2006). Turbulent flow
from site L to site A suggesting that they might have been was also demonstrated to influence bacterial community
more attractive for the invertebrates. The maximum composition during the biofilm initial growth phase, by
biomasses reached in the present work were slightly selecting the pioneer algal species that will create the
below those previously recorded in the literature (up to biofilm microenvironment (Besemer et al., 2007).
12 g AFDM.mx2 in Lyautey et al. (2003) and between 15 The transplant experiment was intended to assess
and 25.6 g AFDM.mx2 in Biggs (1996)). These lower bio- the relative influence of autogenic (succession) and allo-
masses could be explained by (i) a shorter growth period in genic (environmental conditions) parameters on epilithic
the present work (5.5 weeks) as opposed to up to 11 weeks bacterial communities. Epilithic biofilm community de-
in Biggs (1996); (ii) a limited adhesion of cells due to velopment initially occurred in two separate stream
nature of the substrates used; or (iii) a limited nutrient environments characterized by their proper trophic states,
availability (Dodds et al., 1997). The low AFDM/DM and then some of the biofilms were transplanted to the
values recorded in the present work suggest that biofilms second environment for further development. It appeared
were rich in detritus and sedimentary particles despite that transplantation contributed to modifications of the
artificial supports being parallel to flow. Sedimentary bacterial communities, and modified the trajectory of
 164

8 A. Paule et al.: Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 45 (2009) 1–10

the epilithic biofilm succession. However, the fact that stream water and biofilm from an urban river determined
some OTUs were commons between 5.5 week biofilms by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis.
with and without transplantation indicates that succession FEMS Microbiol. Ecol., 43, 111–119.
was also involved in the temporal differentiation process Barbiero R.P., 2000. A multi-lake comparaison of epilithic
by allowing common populations, either already present diatom communities on natural and artificial substrates.
at time 3 weeks but below detection level or inoculated Hydrobiologia, 438, 157–170.
from surface waters from both sites, to develop in the Battin T.J., Kaplan L.A., Newbold J.D. and Hansen C.M.E.,
2003. Contributions of microbial biofilms to ecosystem
aggregate. This implicates an influence of allogenic factors
processes in stream mesocosms. Nature, 426, 439–442.
over autogenic ones. Our results suggest that the three
Besemer K., Singer G., Limberger R., Chlup A.K., Hochedlinger
initial weeks of biofilm development were too long to
G., Hödl I., Baranyi C. and Battin T.J., 2007. Biophysical
already determine the bacterial community composition controls on community succession in stream biofilms. Appl.
and the 2.5 weeks of development following trans- Environ. Microbiol., 73, 4966–4974.
plantation allowed to modify the community. Hypotheti- Biggs B.J.F., 1996. Patterns in Benthic Algae of Stream. In:
cally, grazing might favour the addition of new species Stevenson R.J., Bothwell M.L., Lowe R.L. (eds.), Algal
by decreasing the number of competitive species or by Ecology – Freshwater Benthic Ecosystem, Academic Press,
increasing vacant microhabitats. However, such a pheno- San Diego, 31–56.
menon was not observed, probably because the period Boston H.L. and Hill W.R., 1991. Photosynthesis-light relations
of time between grazing and sample collection was too of stream periphyton communities. Limnol. Oceanogr., 36,
short to allow the initiation of a secondary ecological 644–656.
succession. Bothwell M.L., 1993. Algal-nutrient dynamics. J. N. Amer.
The present work confirmed that bacterial community Benthol. Soc., 12, 313–333.
structure was initially controlled by allogenic factors and Boulêtreau S., Garabetian F., Sauvage S. and Sanchez-Pérez
then followed a succession pattern dominated by auto- J.M., 2006. Assessing the importance of a self-generated
genic factors. Transplantation modified the structure and detachment process in river biofilm models. Freshwat. Biol.,
dynamics of epilithic bacterial communities that revealed 51, 901–912.
the importance of allogenic factors on bacterial commu- Bourassa N. and Cattaneo A., 1998. Control of periphyton
nity successions. It could have been of interest to link the biomass in Laurentian streams (Quebec). J. N. Amer.
Benthol. Soc., 17, 420–429.
functional diversity with bacterial community structure
Brümmer I.H.M., Felske A.D.M. and Wagner-Döbler I., 2004.
during epilithic biofilm development and following trans-
Diversity and seasonal changes of uncultured Plancto-
plantation, by identifying the populations that appeared in mycetales in river biofilms. Appl. Environ. Microbiol., 70,
the community. A minimal number of species is respon- 5094–5101.
sible for stability and function in ecosystem processes, Burns A. and Ryder D.S., 2001. Potential for biofilms as
and all changes in this biodiversity could cause processes biological indicators in Australian riverine systems. Ecol.
changes (Chapin et al., 2000; Loreau et al., 2001). Manage. Restor., 2, 53–63.
According to the experimental design used, it could be Cattaneo A. and Amireault M.C., 1992. How artificial are
hypothesized that bacterial community structure changes artificial substrata for periphyton? J. N. Amer. Benthol. Soc.,
would reflect variations of functional diversity. Epilithic 11, 244–256.
biofilm could thus represent a powerful model to study Chapin F.S., Zavaleta E.S., Eviner E.S., Eviner V.T., Naylor
relationships between structure and function in aquatic R.L., Vitousek P.M., Reynolds H.L., Hooper D.U., Lavorel
ecosystem. S., Sala O.E., Hobbie S.E., Mack M.C. and Diaz S.,
2000. Consequences of changing biodiversity. Nature, 405,
234–242.
Acknowledgements. We thank D. Dalger and G. Merlina for Cody D.G., Heath R.T. and Leff L.G., 2000. Characterization of
water chemistry analysis, J.L. Probst for DOC values and benthic bacterial assemblages in a polluted stream using
Y. Nicaise for PCR-DGGE analysis. We also thank the denaturing gradient gel electrophoresis. Hydrobiologia, 432,
“ Association des Agriculteurs d’Auradé ” for the access to site A. 207–215.
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in a small river. Aquat. Toxicol., 87, 252–263. eukaryotic community structure after mass lysis of filamen-
Tornes E., Cambra J., Goma J., Leira M., Ortiz R. and Sabater tous cyanobacteria associated with viruses. Appl. Environ.
S., 2007. Indicator taxa of benthic diatom communities: a Microbiol., 65, 795–801.
case study in Mediterranean streams. Ann. Limnol. - Int. J. Wetzel R.G. (ed.), 1983. Periphyton of freshwater ecosystem,
Lim., 43, 1–11. Dr W. Junk, Boston.
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 167

II.2 Part du déterminisme autogène sur la structuration

et la dynamique des communautés microbiennes ben-
tiques par une approche en bioréacteur
Résumé de l’article intitulé « A photosynthetic rotating annular bioreactor (Taylor-
Couette type flow) for phototrophic biofilm cultures » par A. Paule, B. Lauga, L.
Ten-Hage, J. Morchain, R. Duran, E. Paul et J.L. Rols, (2011) Water Research,
45 (18) : 6107 – 6118. (Article 3)

II.2.1 Contexte de l’étude

La première partie de ce chapitre II abordait l’influence des facteurs allogènes sur les com-
munautés bactériennes de biofilms phototrophes benthiques, illustrée par des structures de
communautés différentes entre deux sites. Parmi nos conclusions, nous indiquions la probable
influence des facteurs autogènes, dont l’action est associée au degré de maturation du biofilm,
sur la structuration de ces communautés. En absence de perturbation, ce qui est rarement le
cas dans une rivière (Biggs 1996) où le cycle du développement des biofilms est souvent réini-
tialisé par des changements hydrauliques (épisodes de crue), les successions écologiques qui
contrôlent la dynamique et la structuration des communautés bactériennes sont caractérisées
par un déterminisme autogène.
Dans cette deuxième partie du chapitre II, nous nous sommes donc intéressés à l’analyse
des facteurs responsables du changement temporel des structures de communautés bacté-
riennes sous des conditions environnementales stables. Dans ce contexte, l’approche la plus
judicieuse reste donc l’utilisation de dispositifs à l’échelle du laboratoire simulant les condi-
tions environnementales à différents niveaux de contrôle expérimental. Une grande variété
de dispositifs de plus ou moins grandes tailles (microcosmes et mésocosmes) est décrite dans
la littérature pour un panel d’études des biofilms phototrophes (cf. Partie I Synthèse
bibliographique).
Parmi ces dispositifs, nous pouvons citer un exemple de bioréacteurs particulier : les
bioréacteurs annulaires rotatifs (en anglais « Rotating Annular Bioreactor » ou RAB) qui
se sont révélés être de bons outils pour appréhender les différents impacts des changements
environnementaux sur le développement des biofilms bactériens ou phototrophes (cf. Partie
I Synthèse bibliographique). Characklis (1990) concevait ces RAB comme des systèmes
hautement homogènes en tout point du volume de l’entrefer de par leur géométrie. Ces
bioréacteurs se caractérisent donc par des forces de cisaillement constantes à la paroi de la
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 168

face interne du cylindre externe sur laquelle le biofilm se développe, ainsi qu’un écoulement
de type turbulent.
Il y a quelques années, Lawrence et al. (2000) ont développé un RAB destiné à la culture
de biofilms phototrophes, pour analyser l’influence de certains facteurs environnementaux
sur la dynamique de croissance du biofilm (Chénier et al. 2003 ; Lawrence et al. 2004). Ce
RAB présente deux inconvénients, sa petite taille (volume utile de l’ordre de 0,45 litres) qui
limite le nombre possible de réplicats (coupons colonisés échantillonnables) et d’analyses, la
croissance du biofilm étant réalisée sur la face externe du cylindre interne, condition pour
laquelle le biofilm subit une force centrifuge associée à la rotation du cylindre interne.
Dans ce contexte, l’expérimentation de notre étude a été réalisée dans un nouveau pro-
totype de RAB pour maintenir stable et spatialement homogène l’ensemble des variables
environnementales et favoriser la croissance du biofilm en choisissant des valeurs élevées d’in-
tensité lumineuse, de concentration en nutriments et de température.

II.2.2 Approche expérimentale

Dans un premier temps, nous présentons le prototype de RAB à écoulement de type
Taylor-Couette conçu par la société ARIAS (Toulouse, Sud Ouest, France) et expérimenté
au sein du laboratoire EcoLab pour la première fois dans le cadre de cette thèse. Le prototype
est décrit en détail dans la partie II Matériel et méthodes. La capacité de ce prototype à
produire des biofilms phototrophes est évaluée à travers la réalisation de deux expériences de
cultures de biofilms phototrophes d’une durée de 6,7 et 7 semaines chacune sous des conditions
d’éclairage et avec des procédures d’inoculation différentes. Vu l’importance de la géométrie
d’un tel système et les conséquences que cela peut avoir sur la croissance d’un biofilm, les
caractéristiques hydrauliques de l’écoulement au sein du prototype RAB sont étudiées via
deux approches, une approche expérimentale à l’échelle du bioréacteur par une méthode de
traçage (DTS), et une approche par simulation de l’hydrodynamique du fluide à une échelle
plus locale (cf. détails partie II Matériel et méthodes).
Le bioréacteur fonctionne en circulation ouverte alimentée via une pompe péristaltique
à un débit de 26 mL.min−1 d’eau du réseau enrichie en nitrates, silice et orthophosphates,
pour favoriser la croissance des algues benthiques, et stockée à 4˚C dans un tank à lait ré-
frigéré de contenance 150 L (cf. détails partie II Matériel et méthodes). Le démarrage
d’une culture nécessite un apport extérieur de biomasse durant une phase d’inoculation du
RAB. Durant cette phase, le RAB fonctionne en circulation fermée, en boucle avec un aqua-
rium contenant une suspension de biomasse issue de biofilms phototrophes. Deux procédures
d’inoculation ont été testées (cf. détails partie II Matériel et méthodes).
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 169

II.2.3 Principaux résultats et discussion

Les conditions expérimentales au sein du RAB sont stables au cours des deux expériences
de culture. Nous avons choisi pour la deuxième culture d’enrichir l’eau d’alimentation avec
une quantité moindre de nitrates et d’ajuster son pH à 7 (cf. détails partie II Matériel
et méthodes). Les valeurs de pH, de température et de concentration en oxygène dissous
évoluent avec les variations journalières associées aux processus associés de la photosynthèse.
L’étude du comportement hydrodynamique du RAB est réalisée pour 2 vitesses de rota-
tion du cylindre interne (80 et 170 trs.min−1 ), montrant des résultats similaires quelle que soit
l’approche (expérimentale ou par simulation). Comme déjà précisé dans la partie méthodolo-
gique du RAB, pour une rotation du cylindre interne de 80 trs.min−1 , le nombre de Reynolds
Re = ri Ω(re − ri )/υ = 17040, et le nombre de Taylor Ta = Re[(re − ri )/ri ]1/2 = 6970, avec Ω
la vitesse de rotation du cylindre interne (rad.s−1 ), ri le rayon du cylindre interne (m), re le
rayon du cylindre externe (m), et υ la viscosité cinématique du fluide (Pa.s−1 ). Ces ordres de
grandeur sont caractéristiques d’un régime d’écoulement tourbillonnaire turbulent (Ochoa et
al. 2007).
La modélisation de l’écoulement à l’intérieur de l’entrefer permet de simuler les profils
de vitesses et de contraintes de cisaillement à la paroi. Le profil de vitesses met en évidence
l’apparition de gradients de vitesses différents à la paroi des deux cylindres due à la présence
de tourbillons (ou tores) engendrant ainsi des gradients de contraintes de cisaillement à la
paroi du cylindre externe où se développera le biofilm. Au sein de l’entrefer, il existe donc une
périodicité spatiale, selon l’axe vertical, correspondant à un empilement de tores de section
globalement carrée et de dimension de celle de l’entrefer (18,5 mm). La présence des vortex
conforte bien l’installation d’un écoulement de type turbulent avec des vortex toroïdaux. La
contrainte est maximale lorsque le tourbillon est au contact de la paroi du cylindre externe,
et presque nulle dans la zone séparant deux tourbillons consécutifs. L’ordre de grandeur de la
vitesse tangentielle est le m.s−1 , contre 10−4 m.s−1 pour la vitesse axiale et 10−1 à 10−2 m.s−1
pour la vitesse radiale. Les vitesses radiale et axiale peuvent être considérées négligeables
devant la vitesse tangentielle. Le profil des vitesses tangentielles à la paroi entre les cylindres
interne et externe indique une diminution de cette vitesse pour atteindre une vitesse à la
paroi des coupons de 0,3 m.s−1 pour une rotation du cylindre interne de 80 trs.min−1 . Les
profils cinétiques de croissance corroborent le modèle de Biggs (1996), montrant une première
phase d’accrétion (colonisation du support et épaississement du biofilm) jusqu’à l’obtention
d’un pic de biomasse (Figure 57). En 6,7 et 7 semaines de culture, les biomasses sous forme
de MSSC atteignent des valeurs de 2,5 à 3 mg.cm−2 . Durant les premiers stades de chaque
culture, la colonisation par l’inoculum apparait préférentiellement sur les bords des supports
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 170

(ou coupons). En effet, la présence d’un espace à la jonction entre deux coupons induit
une recirculation du flux. Cette zone stationnaire favoriserait l’accumulation de biomasse en
augmentant le temps de contact entre les microorganismes et le support. Le biofilm mature,
riche en algues vertes de la culture 2, atteint son pic de biomasse plus rapidement, suivi par
une perte de biomasse associée à un détachement autogène (Boulêtreau et al. 2006).

5mm

Figure 57 – Evolution temporelle de l’épaisseur du biofilm phototrophe durant l’expérience de la

culture 1 (loupe binoculaire, LEICA M212, avec une caméra LEICA DFC320, grossissement x 6)
observée sur la tranche d’un coupon de colonisation.

Un total de 35 T-RFs différents a été identifié par culture pour l’ensemble des échantillons.
Le nombre moyen de T-RFs estimé par échantillon est de 12 à 25 et de 12 à 23 pour les cultures
1 et 2, respectivement. Ces valeurs sont du même ordre de grandeur que celles données dans la
littérature pour des biofilms phototrophes ayant colonisé des substrats naturels ou artificiels,
à partir d’enzymes de digestions identiques (une moyenne de 16 T-RFs, dans Anderson-
Glenna et al. (2008) ; 11 à 25 T-RFs, dans Szabo et al. (2008)). Comme nous l’avons souligné
dans la partie méthodologique sur la technique de T-RFLP, une partie des T-RFs identifiés
est associée à des cyanobactéries (Cole et al. 2009), pouvant mener à une surestimation de
la richesse en espèces bactériennes non phototrophes. L’analyse en composante principale
(ACP) sur les structures bactériennes révèle des variations temporelles similaires aux deux
cultures puis se stabilisent à partir de 3-4 semaines pour les deux cultures quels que soient
le type d’inoculum, les conditions d’éclairement et la procédure d’inoculation utilisés. Les
communautés bactériennes, influencées par des processus de successions écologiques, suivent
des trajectoires propres à chaque culture.
Comme nous l’attendions, la composition et la diversité des communautés algales des 2
inocula utilisés lors de cette étude sont bien distinctes :
– l’inoculum de la culture 1 (suspension de biofilm du canal du laboratoire) est dominé
par des cyanobactéries à 95,4 % (dont Leptolyngbya spp. à 88,5 %),
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 171

– l’inoculum de la culture 2 (suspension de biofilms de rivière) est dominé essentiellement

par des diatomées à 86,3 % dont Navicula tripunctata (O.F. Müller) Bory (23,2 %),
Nitzschia spp. (19,4 %) et Achnanthes spp. (12,3 %).
L’inoculum de la culture 1 se caractérise par un nombre d’espèces d’algues plus faible (7)
que l’inoculum de la culture 2 (27). Durant la culture 1, le nombre d’espèces reste constant
et faible (de 5 à 7) alors que le nombre d’espèces de la culture 2 diminue au cours du temps
(de 27 à 7). Malgré un nombre d’espèces identique au sein des communautés algales en fin
de culture, leurs compositions montrent des différences :
– la culture 1 est dominée essentiellement par des diatomées à 98,6 % dont 92,6 % de
Nitzschia palea (Kutz.) W. Smith,
– la culture 2 est dominée par des algues vertes à 95,5 % dont Scenedesmus à 74,9 % et
Ankistrodesmus/Monoraphidium à 9,9 %.
L’utilisation d’un inoculum au départ plus diversifié et d’une phase d’inoculation plus
longue pour la culture 2 ne nous a pas permis d’enrichir la communauté algale. A l’issue
des deux cultures, quelles que soient la procédure d’inoculation et l’intensité lumineuse, le
nombre d’espèces algales au sein des biofilms les plus matures est de 6-7 espèces. Ce nombre
est-il le seuil minimal pour la préservation de l’intégrité d’un biofilm ou correspond-il à
un équilibre final entre espèces suite à des processus de compétition (facteurs autogènes) ?
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cette faible diversité algale :
– une durée de la période d’inoculation qui n’est pas suffisante. Durant ces phases d’ino-
culation, il se produit une sélection des espèces pionnières et colonisatrices qui pré-
sentent souvent des taux de croissance rapides (une stratégie R). Comme déjà énoncé,
les premières espèces à coloniser un substrat vierge sont typiquement les bactéries hé-
térotrophes et les algues de petites tailles à taux de croissance rapides, souvent des
diatomées (Eulin et Le Cohu 1998 ; Roeselers et al. 2007), suivies par la colonisation
d’espèces d’algues de grandes tailles à taux de croissance beaucoup plus lents (une stra-
tégie K) (Biggs et al. 1998 ; Sekar et al. 2004). Les cyanobactéries sont souvent considé-
rées comme des espèces colonisatrices tardives, ce qui pourrait expliquer la réapparition
des cyanobactéries en fin de l’expérience 1, suite à des conditions de compétition leur
devenant favorable en fin de culture. Il est intéressant de noter que les temps de gé-
nération des algues et des bactéries sont relativement différents : de quelques heures
pour les bactéries (Smits et Riemann 1988) et de quelques heures à quelques jours pour
les algues (Stevenson et Pan 1999). Durant cette étape d’inoculation, la période sous
forme planctonique subie par les algues a pu également être une source de sélection ;
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 172

– les conditions expérimentales choisies dans cette étude (fortes valeurs de température
et de pH, milieu de culture très enrichi) peuvent être sélectives (DeNicola 1996 ; Hille-
brand et Sommer 2000a et b). Hillebrandt et Sommer (2000b) ont observé la dominance
d’une espèce favorisée par un enrichissement du milieu. La présence du genre Scene-
desmus et de l’espèce Nitzschea palea, espèces eutrophes, révèle bien une influence du
milieu de culture riche en nutriments, avec de fortes valeurs de conductivité, sur les
communautés algales (facteurs allogènes). Les fortes valeurs de température, de niveau
d’intensité lumineuse, des concentrations en nutriments et la photopériode sont des
facteurs susceptibles de favoriser et stimuler la croissance du biofilm. Des travaux ont
pu montrer qu’un taux de croissance rapide est responsable de la formation de biofilms
peu diversifiés (Zippel et Neu, 2005) ;
– le choix d’utiliser des conditions expérimentales stables entraîne une absence de per-
turbation. Certains auteurs ont souligné que l’absence de perturbation (broutage, hy-
drodynamique, pollution organique. . . ) pouvait engendrer la formation de biofilms très
peu diversifiés, où les mécanismes de compétition prédominent, sélectionnant ainsi des
espèces particulièrement compétitrices. Une perturbation peut provoquer des pertes
de biomasse, laissant des habitats vacants, favorisant ainsi l’arrivée et l’installation de
nouvelles espèces ;
– cette faible diversité peut être attribuée au choix du type d’analyse utilisée dans ce
travail. Il a été réalisé une analyse taxonomique basée sur les morphotypes. Certaines
espèces à la morphologie très proches peuvent sous – estimer la richesse spécifique de
la communauté.
Malgré une communauté algale peu diversifiée pour les deux cultures, une des fonctions
principales d’intérêt écologique, la production primaire, a bien été effectuée correctement
(pour preuve la quantité de biomasse produite). Cela nous amène à nous interroger sur l’effet
d’une faible diversité algale sur la production de biomasse et autres fonctions du biofilm
phototrophe. Un défi majeur de ces dernières années est de comprendre la relation entre
la perte de la diversité ou de la composition des communautés et le fonctionnement des
écosystèmes (Loreau et al. 2001). Cet intérêt qui a mené à de nombreuses recherches à la
frontière entre l’écologie des communautés et l’écologie des écosystèmes a subi un grand essor
depuis une quinzaine d’années (Chapin et al. 2000 ; Loreau et al. 2001), mais l’idée qu’une
diversité importante de plantes induit une productivité de biomasse plus importante date
de Darwin (Loreau 2010). Etudier les conséquences d’une perte de biodiversité a suscité un
grand intérêt afin d’évaluer les conséquences écologiques potentielles du fort déclin actuel de
la biodiversité. Cette perte est une conséquence de l’augmentation des activités humaines
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 173

sur les écosystèmes (Chapin et al. 2000). Il est maintenant reconnu que les écosystèmes
fournissent un panel de « services écologiques » qui sont cruciaux au bien être des humains
et au développement durable (Millenium Ecosystem Assessment, MA 2005). Ces services
écologiques sont une conséquence directe du fonctionnement normal des écosystèmes. Il est
alors pertinent de se demander si les écosystèmes appauvris peuvent, pour certaines fonctions,
devenir moins efficaces que les systèmes les plus riches en espèces, et donc perdre par la suite
leur capacité à délivrer des services écologiques.
Une des premières études montrant la relation entre la biodiversité et le fonctionnement
des écosystèmes fut lors d’une expérience aux USA qui montrait qu’une diminution du nombre
d’herbacées sur une parcelle engendrait une utilisation moins efficace des nutriments du sol,
aboutissant à une faible quantité de biomasse produite par les plantes (Tilman et al. 1996).
De très nombreux auteurs ont étudié cette possible relation biodiversité - fonctionnement des
écosystèmes en milieu terrestre ou aquatique, aussi bien sur les plantes, que sur les cham-
pignons, les bactéries. . . (Cardinale et al. 2006a et b ; Tachlowicz et al. 2007). Le résultat
général qui en ressort est qu’une diminution de la diversité réduite expérimentalement dimi-
nue l’efficacité des communautés à capter les ressources et à les convertir en nouveau tissu
biologique. Il existe donc une relation positive entre la biodiversité et la productivité d’un
écosystème. Cette relation est suggérée être engendrée via quatre mécanismes primaires : (i)
l’effet « sampling », qui propose que la production de biomasse augmente avec la richesse
spécifique à cause de la probabilité d’augmenter le nombre d’espèces hautement productives,
(ii) la facilitation (dans le cas où des espèces modifient un environnement, ce qui va faciliter
l’installation d’une autre espèce), (iii) la complémentarité des niches (dans le cas où deux
espèces ne partagent pas les mêmes ressources, menant à de très faibles compétitions entre
elles (Vanelslander et al. 2009) et (iv) l’effet « sélection » de trait fonctionnel particulier qui
affecte la capacité compétitive de certaines espèces (Loreau et al 2001).
Concernant les communautés algales, à partir de différentes combinaisons de biodiversité
dans des communautés de diatomées benthiques (de 1 à 8 espèces), Vanelslander et al. (2009)
observent un effet hautement positif de la biodiversité sur la production que les auteurs
attribuent en partie à des effets de complémentarité positive (facilitation et complémentarité
des niches). Par exemple, ils observent qu’une espèce de diatomée, Cylindrotheca closterium,
présente une augmentation de sa production de biomasse en réponse à une substance sécrétée
par une autre espèce de diatomée. Inversement, lors d’une étude en canal expérimental, malgré
une faible diversité algale, les communautés de biofilm présentent des valeurs de productivité
similaires aux pics de biomasse enregistrés pour les biofilms colonisés in situ (Boulêtreau
et al. 2010). Une étude propose une relation positive de la production de biomasse avec la
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 174

diversité des espèces au sein de bassins versants fréquemment perturbés (Cardinale et al.
2005). La relation diversité - fonction est donc reliée également au type d’habitat. Passy et
Legendre (2006) observent un pic du biovolume des algues pour des niveaux de diversité
intermédiaires au sein de communautés benthiques alors que ce pic ne s’observe qu’à de
faibles niveaux de diversité au sein des communautés planctoniques. Certaines études ne
montrent aucune relation entre la biodiversité et la production d’algues au sein de biofilm
(Hillebrand 2003). Passy et Legendre (2006) suggérent que ce manque de relation est lié à
l’utilisation de supports artificiels qui sous-estiment et qui sont non représentatifs des biofilm
naturels. Cette relation peut également varier avec l’échelle spatiale mais également l’histoire
de la communauté, tous ces paramètres pouvant générer une variété de relations biodiversité
- fonction (unimodale, linéaire etc. . . ) (Passy et Legendre 2006). Matthiessen et al. (2010)
trouvent une corrélation positive entre la richesse et la biomasse algale au premier stade de
succession. Ces variations de la nature de la relation biodiversité - productivité peuvent être
une conséquence de la variété des paramètres utilisés pour la mesure de la productivité (Passy
et Legendre 2006).
U

II.2.4 Conclusion et perspectives

Ce travail expérimente, à notre connaissance, le premier prototype de RAB qui présente
une source lumineuse modulable interne pour la production de biofilm phototrophe. Ce sys-
tème supporte de nombreux autres avantages par rapport aux RAB actuellement décrits
dans la littérature : une meilleure connaissance des conditions hydrodynamiques, un nombre
et une surface des coupons relativement importante (0,16 m2 ) permettant ainsi une quantité
importante d’analyses et de production de biomasse (Tableau 15).
Malgré tout, ce prototype présente quelques points faibles :
– la présence des néons dans un cylindre étanche provoque des variations importantes de
température (de 20 à 30˚C). Une maîtrise de la température à l’intérieur du cylindre
contenant les néons nous semble nécessaire, assuré par exemple grâce à un dispositif de
renouvellement de l’air depuis la partie inférieure du cylindre ;
– l’absence de contact entre le milieu de culture et l’atmosphère et un temps de résidence
de l’eau de quelques heures occasionnent parfois des conditions extrêmes en oxygène
(sursaturation) et en carbone inorganique (fortes valeurs de pH). Pour s’affranchir de
ces problèmes, un réservoir externe avec recirculation de l’eau contenue dans l’entrefer
permettrait de dégazer l’oxygène dissous et de réguler le pH (il faut éviter de rajouter
des capteurs dans l’entrefer, sous peine d’y perturber l’écoulement).
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 175

Neu et Lawrence Lawrence et al.

Type de bioréacteur Gjatelma et al. 1994 Paule et 2011 (cette étude)
1997 2000
Diamètre externe du cylindre
100,5 100 64 220
interne (mm)
Diamètre interne du cylindre
116,6 112,5 85 257
externe (mm)
Surface d'un support de
3196 3150 1000 5000
colonisation (mm²)
Nombre de supports de 12 lames de 12 lames de 12 lames de 32 lames de polyéthylène à
colonisation polycarbonate polycarbonate polycarbonate haute densité
Entrefers (mm) 8,05 6,25 11 18,5
Hauteur du bioréacteur
192,5 205 115 297
(mm)
Volume utile (L) 0,67 0,650 0,500 5,04
Intensité et quaité de la
NON NON NON OUI
lumiére modulables
Taux de dilution (h-1) 3 19,4 28 0,32
Stock de Pseudomonas
aeruginos, Thiosphaera Suspension filtrée de
Inoculum Eau de rivière Eau de rivière
pantotropha et / ou biofilms phototrophes
Pseudomomas pickettii

Tableau 15 – Comparaison des principales caractéristiques entre les RAB décrits dans la littérature
et le RAB expérimenté pour la première fois dans le cadre de cette étude.

En résumé, l’utilisation d’un tel dispositif de RAB nous a permis de suivre la dynamique
de la structure des communautés bactériennes et algales en absence de perturbation, sous
des conditions expérimentales stables dans un souci d’évaluer la part du déterminisme auto-
gène dans la dynamique des biofilms phototrophes. Dans les premiers jours de culture, plus
particulièrement durant la phase d’inoculation, la colonisation, un mécanisme aléatoire, est
supposée être influencée par les conditions environnementales (facteurs allogènes). Ceci est
illustré partiellement par la présence d’espèces algales typiques de milieu riche en nutriments.
Une identification des taxons bactériens reliée à leur autoécologie aurait pu nous permettre
de vérifier cette influence des facteurs allogènes sur les communautés bactériennes durant la
phase d’inoculation. Très rapidement après cette phase d’inoculation, les successions écolo-
giques sont contrôlées uniquement par les facteurs autogènes.
En ce qui concerne les communautés bactériennes, malgré des structures d’inocula au dé-
part différentes, avec des intensités lumineuses (130 et 180 µmol.m−2 .s−1 ) et des procédures
d’inoculation différentes, la trajectoire des successions écologiques suit la même tendance,
comprenant une évolution temporelle de la trajectoire suivie par une stabilisation des commu-
nautés à environs 3-4 semaines de développement associée à un nombre de taxons identiques.
Est-ce le modèle classique suivi par les communautés bactériennes en absence de perturba-
II.2. Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés
microbiennes en bioréacteur 176

tion ? Quelles que soient la composition et la diversité des communautés algales, et malgré
une forte interdépendance physique et des interactions entre ces deux compartiments ?
En ce qui concerne les communautés algales, quelles que soient la procédure d’inoculation
et l’intensité lumineuse, le nombre d’espèces algales au sein des biofilms les plus matures est
de 6 à 7 espèces. Ce nombre est-il le seuil minimal pour la préservation de l’intégrité d’un
biofilm ou correspond-il à un équilibre final entre espèces suite à des processus de compétition
et, dans ce cas là, suit un modèle de déterministe autogène ?

II.2.5 Article 3
 Author's personal copy
177

w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8

Available online at www.sciencedirect.com

journal homepage: www.elsevier.com/locate/watres

A photosynthetic rotating annular bioreactor (TayloreCouette

type flow) for phototrophic biofilm cultures

A. Paule a,b, B. Lauga c, L. Ten-Hage a,b, J. Morchain d,e,f, R. Duran c, E. Paul d,e,f, J.L. Rols a,b,*
a
Université de Toulouse, UPS, INP, EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle et environnement), 118 route de Narbonne,
F-31062 Toulouse, France
b
CNRS, EcoLab, F-31062 Toulouse, France
c
Equipe Environnement et Microbiologie, Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l’Environnement et les Matériaux - IPREM,
UMR 5254 CNRS/UPPA, IBEAS, Université de Pau et des Pays de l’Adour, BP1155, F-64013 Pau, France
d
Université de Toulouse, INSA, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France
e
INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France
f
CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

article info abstract

Article history: In their natural environment, the structure and functioning of microbial communities from
Received 11 April 2011 river phototrophic biofilms are driven by biotic and abiotic factors. An understanding of the
Received in revised form mechanisms that mediate the community structure, its dynamics and the biological
1 September 2011 succession processes during phototrophic biofilm development can be gained using
Accepted 3 September 2011 laboratory-scale systems operating with controlled parameters. For this purpose, we
Available online 14 September 2011 present the design and description of a new prototype of a rotating annular bioreactor
(RAB) (TayloreCouette type flow, liquid working volume of 5.04 L) specifically adapted for
Keywords: the cultivation and investigation of phototrophic biofilms. The innovation lies in the
Rotating annular bioreactor presence of a modular source of light inside of the system, with the biofilm colonization
TayloreCouette type flow and development taking place on the stationary outer cylinder (onto 32 removable poly-
T-RFLP ethylene plates). The biofilm cultures were investigated under controlled turbulent flowing
Phototrophic biofilm conditions and nutrients were provided using a synthetic medium (tap water supple-
Microbial community mented with nitrate, phosphate and silica) to favour the biofilm growth. The hydrodynamic
Photobioreactor features of the water flow were characterized using a tracer method, showing behaviour
corresponding to a completely mixed reactor. Shear stress forces on the surface of plates
were also quantified by computer simulations and correlated with the rotational speed of
the inner cylinder. Two phototrophic biofilm development experiments were performed
for periods of 6.7 and 7 weeks with different inoculation procedures and illumination
intensities. For both experiments, biofilm biomasses exhibited linear growth kinetics and
produced 4.2 and 2.4 mg cm
2 of ash-free dry matter. Algal and bacterial community
structures were assessed by microscopy and T-RFLP, respectively, and the two experiments
were different but revealed similar temporal dynamics. Our study confirmed the perfor-
mance and multipurpose nature of such an innovative photosynthetic bioreactor for
phototrophic biofilm investigations.
ª 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

* Corresponding author. Université de Toulouse, UPS, EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle et environnement), 118 route de
Narbonne, F-31062 Toulouse, France. Tel.: þ33 0 6 24 38 19 04; fax: þ33 0 5 61 55 60 96.
E-mail address: [email protected] (J.L. Rols).
0043-1354/$ e see front matter ª 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.watres.2011.09.007
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1. Introduction 2. Material and methods

Environmental phototrophic biofilms are microbial aggre- 2.1. Experimental setup

gates occurring on solid substrates and consisting of
heterotrophic micro- and meio-organisms and phototrophic Phototrophic biofilm culture experiments were conducted in
micro-organisms embedded in an extracellular polymeric a new prototype of a photosynthetic rotating annular biore-
substance matrix. The structure and functioning of microbial actor (RAB) with TayloreCouette type flow (Arias, Toulouse,
communities from phototrophic biofilms are mediated by France).
abiotic factors such as nutrient availability (Hillebrand and
Sommer, 2000a), light (Boston and Hill, 1991), substrate 2.1.1. RAB characteristics
types (Murdock and Dodds, 2007), hydrodynamics (Battin The RAB consisted of two concentric cylinders, a stationary
et al., 2003), and by biotic interactions such as competition outer cylinder made of polyvinyl chloride and a rotating inner
(Jackson et al., 2001) or predation (Bourassa and Cattaneo, cylinder made of poly(methyl methacrylate) (PMMA) (Fig. 1A
1998). Biofilm development has been demonstrated to be and B). A schematic diagram and the geometric characteristics
associated with population succession processes over bio- of the RAB are given in Fig. 1C and D, respectively. This
film maturation, both for the algal (McCormick and prototype presents the specificity of having (i) a modular
Stevenson, 1991) and the bacterial (Jackson et al., 2001; source of light inside the system, protected by an internal
Lyautey et al., 2005) compartments. water-tight cylinder made of PMMA and adjusted by changing
To understand how the abiotic and biotic factors (alone or the quality and number of the fluorescent tubes (1e8) and the
combined) influence the microbial community structure, its frequency of light/dark cycles, and (ii) a flow generated in the
dynamics and the biological succession processes during annular gap (width 18.5 mm) through the rotation of the inner
phototrophic biofilm development, the best approach is to use cylinder modulated by different motor speeds. The inside of
laboratory-scale systems simulating environmental condi- the external cylinder supports 2 rows of 16 removable poly-
tions under different levels of experimental control. ethylene plates or sampling units (l  h ¼ 50  100 mm; 5 mm
Various large and small-scale laboratory systems designed wide) for biofilm sampling. The total surface available for the
to investigate phototrophic biofilms are described in the biofilm colonization of plates in the RAB is 0.16 m2. To limit the
literature (e.g. Battin et al., 2003; Singer et al., 2006). Among occurrence of edge effects on the development of biofilm, the
them, rotating annular bioreactor (RAB) designs have been rows of plates were positioned at half height in the bioreactor.
suggested as a powerful tool to study the effects of environ- The plates were curved to avoid perturbation of the flow. To
mental change on biofilm development (Neu and Lawrence, prevent biofilm growth on the back, upper part and leading
1997). It has been shown that the hydrodynamic conditions edge of the plates, these surfaces were covered by adhesive
at local level influence the composition and the structure of bands during the experiments which were removed before the
biofilms (Besemer et al., 2007). The geometry of RABs allows to biofilm analyses. All bioreactor components were cleaned,
provide a constant shear stress distribution and cultivation of with diluted detergent (Decon, 10%) for the plates, the outer
biofilm under turbulent flow environments (Characklis, 1990). cylinder and the port, or with hydrogen peroxide (30%) for the
While RABs are described as completely mixed reactors for the inner cylinders, and then rinsed with demineralized water. To
liquid phase, a previous study showed heterogeneity in the prevent unwanted biofilm formation that could attenuate the
growth of biofilm related to reactor geometry (Gjaltema et al., light intensity and modify its spectrum, the surfaces of the
1994). In the last decade, Lawrence et al. (2000) have developed rotating inner and internal water-tight cylinders were cleaned
a RAB (liquid working volume of 0.5 L) for the cultivation of manually once a week. This step of 15 min required to collect
phototrophic biofilms, used to investigate the various effects the liquid contained in the RAB before opening, and allowed, if
of environmental change occurring in a river (Chénier et al., necessary, to collect some plates for biofilm analyses. Once
2003; Lawrence et al., 2004). The main shortcomings of this finished, the bioreactor was closed and refilled with the
RAB are its small size which limits the number of possible collected liquid.
analyses and replicates, the external illumination, and the
biofilm growing on the rotating inner cylinder. 2.1.2. RAB hydrodynamic behaviour
The objectives of our study were (i) to design and describe The RAB was operated at 80 rpm, which corresponds to
a new prototype of RAB (TayloreCouette type flow) specifi- a Reynolds number Re ¼ ri.U.(re
ri)/y ¼ 17,040 and Taylor
cally intended for the cultivation and investigation of photo- number Ta ¼ Re.[(re
ri)/ri]1/2 ¼ 6970 where ri is the inner
trophic biofilms adapted from an RAB design for biological cylinder radius (m), re is the outer cylinder radius (m), U is the
waste water treatment (Coufort et al., 2005), (ii) to assess the angular speed (rad s
1) of the inner cylinder, and y is the
applicability of this prototype in phototrophic biofilm cinematic viscosity of the fluid (m2 s
1) (tap water). According
production and (iii) to analyze the phototrophic biofilm to the literature, this value of Taylor number indicates
dynamics. Innovations of our modified RAB were the presence a turbulent vortex flow with stacked axisymmetric toroidal
of a modular source of light inside the system and the biofilm vortices (Desmet et al., 1996). Bioreactor with TayloreCouette
colonization on the stationary outer cylinder. Two cultivation type flow exhibits different flow regimes (e.g. Couette, vortex
experiments were performed for periods of 6.7 and 7 weeks flow, turbulent vortex flow, turbulent flow.) depending on
with different inoculation procedures and illumination the rotational speed of the inner cylinder. In the RAB designed
intensities.
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Fig. 1 e Setup of the photosynthetic rotating annular reactor (RAB) with TayloreCouette type flow. (A) 3D representation of
different parts composing the RAB, a : the stationary outer cylinder, b : the rotating inner cylinder and c : the light source
protected by an internal water-tight cylinder, (B) photograph of RAB, (C) schematic diagram of RAB and (D) geometric
characteristics of RAB.

for the present work, the objective was to work with turbulent to determine the residence time distribution (RTD). The
vortex flow with spatial periodicity and rotational speed of the experiment was conducted for two different rotational
inner cylinder high enough to avoid the settling of micro- speeds, 80 and 170 rpm, and the inlet throughput (tap water at
organisms in the annular gap. In this context, the rotational 20  C) was supplied at Q ¼ 26 mL min
1 for a working volume
speed of the inner cylinder was set to at least 80 rpm. The RAB in the RAB of V ¼ 5.04 L. The conductivity of the fluid was
hydrodynamic was studied experimentally at the reactor recorded at the outlet for 15 h (corresponding to 5 times the
scale by the tracer method and local flow properties were average residence time) with a specific probe (conductivity
obtained through computational fluid dynamics (CFD) meter 524, CRISON, SELI, probe response time of 2 s) located in
simulation. an agitated cell (30 mL) positioned at the outlet valve, in
absence of biofilm and without illumination in the RAB.
2.1.2.1. Residence time distribution. The general mixing RTD curves, defined as dimensionless concentration (E (q))
behaviour in the RAB was investigated experimentally using versus dimensionless time (q), were obtained from the outlet
the pulse tracer method (10 mL of NaCl solution at 0.16 g mL
1) conductivity concentration data:
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EðqÞ ¼ cðtÞ=cð0Þ (1) 2.2.2. Experimental conditions

The experiment design used a thermostated reservoir (150 L,
where q is given by the ratio t/s with s ¼ V/Q, c(t) and c(0) are
model CV 150, Japy) at 4  C, equipped with a peristaltic pump
respectively the tracer concentrations at time t and time 0 for
(520S/R2 220 T/MN pump with silicon tubes
which c(0) results from an instantaneous mixing of the
ID  OD ¼ 1.6  2.4 mm) which fed the RAB continuously with
injected tracer. The experimental RTD curves were compared
a synthetic culture medium. The inlet throughput was
with the RTD curve obtained from a mathematical model of
26 mL min
1, which corresponded to a hydraulic residence time
reactor as described by Sugiharto et al. (2009).
in the RAB of 3.23 h. The synthetic culture medium consisted of


tap water supplemented with nutrients (SiO2, PO3
4 and NO3 ) to
2.1.2.2. Computational study of hydrodynamics. Numerical
favour the growth of biofilm and avoid nutrient limitation.
simulation was performed to evaluate the flow pattern within
Nutrient concentrations were measured as described by Paule
the annular space and the characteristic turbulent scales. The
et al. (2009). The physical-chemical parameters (temperature,
mean wall shear stress on the external cylinder and the axial
pH and dissolved oxygen concentration) were recorder using
average velocity profiles in the annular gap were extracted
probes located in the agitated cell (30 mL) positioned at the
from the simulations. The computational study was per-
outlet valve of the reactor. Temperature and pH were measured
formed using the CFD software Fluent (6.2) at the rotational
with a pH meter 296 WTW (electrodes sentix H 8481 HD,
speeds of 80 and 170 rpm. The first step was to draw the grid
SCHOTT). Dissolved oxygen concentrations were measured
and mesh the two-dimensional domain using the Fluent pre-
with an oxy 296 oxymeter WTW (trioxmatic 701 sensor, WTW).
processor Gambit. The simulations were run as described by
Dissolved organic carbon (DOC) concentrations were measured
Coufort et al. (2005), i.e. Reynolds Averaged NaviereStokes
on acidified water samples (4 mL of HCl 6N) and analyzed using
equations combined with the k-ε Reynolds Stress Model, 2D-
a carbon analyser at 680  C (Shimadzu, Model TOC 5000H).
axisymmetric model in the steady state.
Table 1 summarizes the chemistry of the feed waters for both
cultures. For culture 2, the pH of the culture medium was
2.2. Experimental design adjusted to 7.0 using sulphuric acid (95%).
The inside of the RAB was illuminated by fluorescent lamps
Initially, the bioreactor was run in batch culture mode for including cool daylight (Osram L15W/865 Luminux, Germany)
a seeding period to allow the micro-organisms to become and fluora (Osram L15W/77, Germany) tubes in equal
attached before the continuous culture mode started. proportions, with light/dark periods of 16 h/8 h. Fluora tubes
emit in the visible red, which enhances photosynthesis. At the
2.2.1. Seeding procedures center of the cylinder containing neon tubes, a cylinder of
The two biofilm cultures were achieved using two different PMMA is positioned to improve the distribution of the light.
seeding procedures. Seeding was conducted for 48 h, once for Two neon tubes were used for culture 1 and 4 for culture 2.
culture 1 and twice for culture 2. For culture 2, the two seeding The illumination was measured as air photosynthetically
phases were separated by a 24-hour period where the RAB active radiation (PAR) irradiance level by using a flat quantum
operated in continuous culture mode. During the seeding sensor (model LI-189, LI-COR, Inc - Lincoln - Nebraska) and
phases, the bioreactor ran in closed recirculation, connected to average recorded values were 130  20 and
an aquarium (10 L) where the inoculum was incubated. The 180  10 mmol s
1 m
2 for cultures 1 and 2 respectively. The
aquarium was illuminated by fluorescent lamps including one PAR irradiance level was measured in the air because of the
cool daylight (F18W/GRO, Sylvania, Germany) and one fluora small size of the annular gap, and at a distance from the
(F18W/54, Gt Britain) tubes, supplying average illumination rotating inner cylinder equivalent to the annular gap. The
values of 32  3 mmol s
1 m
2 with light/dark periods of 16 h/8 h. values of illumination were chosen in this study in response to
The inoculum was obtained by removing epilithic biofilms by two constraints. The number of neon tubes (2 and 4) is a good
scraping with a toothbrush, previously treated with NaOH 1N, compromise to maintain illumination homogeneity (the fewer
from (i) glass slides as previously described (Paule et al., 2009) lamps are used, the less uniform the light field is) and to
placed in the experimental channel of our laboratory for culture prevent an increase of temperature generated by the presence
1 or (ii) various river stones for culture 2. Biofilm suspensions of neon tubes (the RAB is not thermostated).
were homogenized (tissue homogenizer at 13,500 rpm, Ultra
Turrax, T25) and filtered through a 250 mm and then 100 mm pore 2.2.3. Biofilm characterization
size filter (VWR) to reduce the part of the macro fauna and The development of biofilm was monitored for 6.7 (culture 1)
coarse sediments from the natural biofilms. The end of seeding and 7 (culture 2) weeks. Biofilm cultures were carried out
phase was defined as the start of the experiment (day 0). between June 11 and July 30, 2008 for culture 1 and between

Table 1 e Physical-chemical characteristics of the synthetic water used to feed the rotating annular bioreactor during
cultures 1 (C1) and 2 (C2). DOC [ dissolved organic carbon concentration.
PO3

1
4 eP (mg L ) NO

1
3 eN (mg L ) SiO2 (mg L
1) Conductivity (mS cm
1) DOC (mg L
1) pH

C1 0.357  0.03 6.3  0.1 13.1  0.7 311  29 0.6  0.2 8.0  0.5
C2 0.356  0.02 4.2  0.2 10.9  2.9 368  5 1.1  0.3 7.1  0.2
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July 23 and September 16, 2009 for culture 2. At each sampling previously described by Smith et al. (2005) with the confidence
date, 3 plates were randomly sampled to follow the biofilm interval of 0.5. Peaks, defined as Terminal Restriction Frag-
development. Access to the plates required opening the ments (T-RFs), were scored as present or absent from T-RFLP
bioreactor and removing working fluid. Biofilms were profiles. The difference in physical-chemical characteristics
removed from plates by scraping with a microscope slide and the difference in AFDM, chlorophyll a and the number of
previously treated with alcohol. Each plate represented one T-RFs between biofilm samples were assessed with the Mann
replicate. Biofilms were suspended in 50 mL (culture 1) or Whitney test using SPSS software 13.0. Differences were
90 mL (culture 2) of tap water previously filtered through considered statistically significant at p  0.05.
a 0.2 mm pore size filter (cellulose acetate membrane, What- To assess changes over time in the bacterial community
man) and homogenized (tissue homogenizer at 13,500 rpm, structure from each culture, a Principal Component Analysis
Ultra Turrax, T25). Biofilm suspension was aliquoted for the (PCA) was performed from the T-RF binary data for each
analyses of biomass descriptors, algal diversity and bacterial biofilm culture using Primer v6 software (PrimerE, Ltd, Lut-
community structure by T-RFLP. Sampled plates were ton, United Kingdom). Peaks < 0.5% of the total area were
substituted by clean plates in the RAB and the newly placed excluded from the analysis and T-RFs that differed in size by
plates were excluded from the following samplings. 0.5 bp or less were considered to be identical. This baseline of
0.5% was defined in accordance with the approaches of
2.2.3.1. Biomass descriptors. From an aliquot of initial biofilm Osborne et al. (2006).
suspension, the dry mass (DM) (aliquot of 30 mL), the ash-free Statistical analyses of PCA were run using an analysis of
dry mass (AFDM) and the chlorophyll a (aliquot of 10 mL) were similarity (ANOSIM) via Past software 2.06 (Hammer et al.,
measured as described by Paule et al. (2009). 2001) on Bray Curtis similarity matrices generated from
binary data. This analysis generates a global R value in the
2.2.3.2. Algal diversity. Algal diversity was estimated from range from 0 (completely random pattern) to 1 (completely
a pool of 3 aliquots of 5 mL of homogenized biofilm suspension separated groups) (Clarke, 1993). The global R value was
that was preserved in formalin solution (3%) and kept in considered statistically significant at p < 0.05 uncorrected.
darkness at 4  C until counting and identification. The total
density and abundance percentages were determined with an
inverted microscope (Axiovert 10, Zeiss, West Germany) 3. Results
(Utermöhl, 1958).
3.1. Biofilm culture conditions
2.2.3.3. Microbial community structure. After centrifugation
(12,000 g at 4  C for 20 min, Heraeus Multifuge) of an aliquot of Throughout the experiments and associated with daily vari-
20e50 mg dry mass of the initial biofilm suspension (Lyautey ations and photosynthetic processes, the temperature, pH and
et al., 2005), the pellet was stored at
80  C until further dissolved oxygen concentration values ranged from 19 to
analysis. Genomic DNA extraction was performed on the 30  C, from 7.5 to 10, and from 4 to 18 mg L
1, respectively.
pellet using a DNeasy Plant Mini Kit according to the manu- According to residual nutrient concentration values
facturer’s protocol (Qiagen Laboratories). The integrity of the measured at the outlet of the RAB (data not shown), nutrients
extracted DNA was checked as described by Paule et al. (2009). added in the synthetic culture medium were sufficient to
The 16S rRNA genes were amplified by PCR and the support biofilm growth.
bacterial community structure was studied by T-RFLP as
described by Bruneel et al. (2006) with slight modifications. 3.2. RAB hydrodynamic behaviour
The fluorescent labelled primers FAM 8F (50 -6-carboxy-fluo-
rescein-phosphoramidite-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-30 ) This section describes the characterization of the hydrody-
(Eurogentec, 295 Liege, Belgium) (Lane, 1991) and HEX 1489R namic behaviour of the flow in the annular space between the
(50 -hexa-chloro-fluorescein-phosphoramidite- TAC CTT GTT inner and outer cylinders through both experimental and
ACG ACT TCA-30 ) (Invitrogen, Carlsbad, USA) (Weisburg et al., numerical studies, performed at two rotational speeds: 80 and
1991), described as universal within the bacterial domain, 170 rpm. Similar results were observed for both rotational
were used. The reaction mixture for PCR was made in a 50 mL speeds and only the data corresponding to 80 rpm are pre-
volume containing 30 ng of template DNA, 25 mL AmpliTaq sented here.
Gold 360 Master Mix (Applied Biosystems) and 0.5 mL of each
primer. Amplification was carried out using an Applied Bio- 3.2.1. RTD experiment
systems thermocycler with the following sequence: a 5 min Fig. 2 compares the RTD curves obtained with experimental
hot start at 95  C, followed by 35 cycles consisting of dena- data and predicted model simulation for one completely
turation (45 s at 95  C), annealing (45 s at 55  C) and extension mixed reactor. The experimental and predicted model curves
(1 min at 72  C), and a final extension at 72  C for 10 min. are similar. The experimental mean residence times were
Restriction digestion was performed with HinfI. 209.9 and 220.8 min for rotational speeds of 80 and 170 rpm
respectively.
2.3. Data analysis
3.2.2. Computational study of hydrodynamics
T-RFLP profiles from the two cultures were compared by For the rotational speed of 80 rpm, Fig. 3 shows a contour plot
a web-based tool, T-Align (http://inismor.ucd.ie/wtalign/) as of local velocity in the annular space computed at the scale of
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6112 w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8

Fig. 2 e Comparison between experimental (black dots)

and predicted (white dots) Residence Time Distribution
(RTD) curves at 80 rpm rotational speed and 26 mL minL1
inlet flow. Predicted curve corresponds to model with
a completely mixed reactor.

two vortices, together with the outer cylinder wall shear stress
for the same conditions (the dotted curve in Fig. 3). The
presence of vortices produced a gradient of velocity at local
scale on the walls of the cylinders. Consequently, the wall
shear stress, which is directly related to the velocity gradient,
was clearly non-uniform along the plate. In the zone of
convergence of two vortices near the plate, the shear stress
was maximal and a radial flow formed from plate to inner Fig. 3 e Contour plot of velocity magnitude field (m sL1) in
cylinder. The two vortices separated near the plate and the the annular space between inner (left) and outer (right)
shear stress was minimal when the radial flow reached the cylinders computed by CFD at rotational speed of 80 rpm,
plate. and the corresponding wall shear stress along plates
The diameter of an individual vortex is approximately placed inside the outer cylinder (e is the width of the
equal to the annular gap and thus the number of stacked annular gap).
vortices was 5.4 across the height of one plate. The magnitude
of the wall shear stress along plates increased with the rota-
tional speed of the inner cylinder (r2 ¼ 0.99). The mean values
of shear stress were calculated as described by Coufort et al.
(2005) and were found to be 1.11 and 4 Pa at rotational
speeds of 80 and 170 rpm respectively.
Fig. 4 presents the average tangential velocity profile at
a rotational speed of 80 rpm. The profile shows a decrease in
tangential velocity across the inner and outer cylinders, which
is characteristic of a turbulent vortex flow (Coufort et al.,
2005). As a result, tangential velocity is about 0.3 m s
1 at
the plate wall when rotational speed is 80 rpm and 0.7 m s
1
for 170 rpm (data not shown).

3.3. Biofilm analyses

3.3.1. Biomass descriptors

Fig. 5 illustrates the biofilm colonization of plates over both
experiments. The first colonization states occurred on the Fig. 4 e Profile of tangential velocity along a line of constant
ridges of plates. Biofilm biomass as expressed by AFDM and height in the annular space between the inner (left) and
chlorophyll a presented similar linear growth patterns, giving outer (right) cylinders computed by CFD for a rotational
a biomass peak of 4.2 and 2.4 mg AFDM cm
2 and 0.05 and speed of 80 rpm.
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Fig. 5 e Photographic images of colonized plates on the internal surface of the external cylinder of the RAB during culture 1
(A) and culture 2 (B). Each plate has dimensions 50 3 100 mm2. Numbers indicate biofilm age in weeks. White and partially
colonized plates correspond to newly placed plates after sampling.

0.03 mg chlorophyll a cm
2 after 6 and 4.4 weeks of incubation 3.3.2. Algal diversity
for cultures 1 and 2 respectively (Figs. 6 and 7). This growth Two seeding procedures were tested using inocula of different
phase was followed by a plateau (Mann Whitney p > 0.05), origins. The inoculum from artificial biofilm (experimental
then, for culture 2, by a slight loss of biomass (visible on the channel) used for culture 1 presented lower species richness (7
illustration of Fig. 5) (Mann Whitney, p < 0.05). Both variables species) than the inoculum from natural biofilm (river) used
(AFDM and chlorophyll a) were significantly correlated for the for culture 2 (27 species). Moreover, the two inoculum types
two cultures (C pearson ¼ 0.95, p < 0.01 and C pearson ¼ 0.93, had different algal community compositions (Fig. 7). Inoculum
p < 0.01, for cultures 1 and 2 respectively). The AFDM/DM ratio from artificial biofilm was dominated by Cyanobacteria
ranged from 39.5 to 62.1%, indicating biofilms poor in detritus (95.4%) composed essentially of Leptolyngbya spp. (88.5%), and
and sedimentary particles (data not shown). inoculum from natural biofilm was dominated by Diatoms
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6114 w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8

35 different T-RFs per culture for all sample times were

identified with an average number per sample ranging from 12
to 25 and 12 to 23 T-RFs, for cultures 1 and 2 respectively.
Principal component analysis (PCA) was performed on the T-
RF binary data for each biofilm culture (Fig. 8). The two axes
accounted for 21.2 and 18.6% of the total variance for culture 1,
and 30.6 and 18.1% for culture 2. Good homogeneity was
observed among replicates, particularly for culture 2, sug-
gesting little spatial variability during the culture course in the
bioreactor. This analysis was strengthened by the similar
trends observed with PCAs built with the first and third axes.
The first three axes accounted for 65.5 and 50.2% of the vari-
ation of T-RFLP patterns for cultures 1 and 2 (data not shown)
respectively.
During both cultures, the bacterial community structure
changed according to colonization time, based on sample
clustering corresponding to a similarity of 55% (circle from
Fig. 6 e Temporal evolution of photosynthetic biofilm
Fig. 8) (culture 1 : global R ¼ 0.776 and pairwise R ranged from
biomass expressed as mg cmL2 of ash-free dry mass
0.63 to 0.8, p < 0.05; culture 2 : global R ¼ 0.998 and pairwise R
(AFDM) during the growth period in bioreactor for culture 1
ranged from 0.997 to 1, p < 0.05), followed by a stable phase
(black dots) and culture 2 (white dots).
after 3 weeks for culture 1 (global R ¼ 0.435, p < 0.05) and 4.4
weeks for culture 2 (global R ¼ 0.51, p < 0.05). Bacterial
community composition rapidly diverged from the initial
(86.3%), composed essentially of Navicula tripunctata (O.F. bacterial community (global R ¼ 0.895 and 0.754, for cultures 1
Müller) Bory (23.2%), Nitzschia spp. (19.4%) and Achnanthes spp. and 2 respectively, p < 0.05). A PCA including T-RF of cultures 1
(12.3%). and 2 showed that the profiles were distributed along the first
The species richness was relatively low and constant axis (28.9%) according to the origin of the inoculum (data not
during culture 1 (from 5 to 7) although the species richness shown). PCA showed similar temporal variations of bacterial
decreased over time during culture 2 (from 27 to 8). The 6.7- community structures during the biofilm development irre-
week mature biofilm from culture 1 was mainly composed spective of the inoculum type.
of Diatoms (98.6%), especially Nitzschia palea (Kutz.) W. Smith
(92.6%) and the mature biofilm from culture 2 was essentially
composed of green algae (95.5%) especially Scenedesmus 4. Discussion
(74.9%) and Ankistrodesmus/Monoraphidium (9.9%). Six of the
ten Chlorophyceae that composed the biofilm of culture 2 are 4.1. Growth dynamics of phototrophic biofilms
known to present planktonic ecotypes.
In environmental phototrophic biofilms, growth basically
3.3.3. Bacterial community structure occurs through, firstly, an accretion phase related to coloni-
The dynamics of the bacterial community structure were zation and growth processes (increase of AFDM resulting in
determined by T-RFLP throughout the experiments. A total of a biomass peak) and, secondly, an ageing phase (Biggs, 1996).

Fig. 7 e Temporal evolution of algal taxa number and their percentage abundance, and chlorophyll a as mg cmL2 of
chlorophyll a during the biofilm growth period in RAB for cultures 1 (A) and 2 (B). The species richness is given for each
sample at the bottom of each bar.
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Fig. 8 e Changes in bacterial community structure over time assessed by Principal Component Analysis (PCA) based on the
T-RFLP data for (A) culture 1 and (B) culture 2. Circles correspond to a similarity of 55%.

In the present experiments, linear growth phases were that initial high diversity is caused by the arrival of new micro-
observed to reach AFDM peaks of 4.2 and 2.4 mg cm
2 after 6 organisms, while ensuing competition decreases diversity in
and 4.4 weeks for cultures 1 and 2 respectively, followed by an late successional stages (Sekar et al., 2002). In our RAB, the
ageing phase for culture 2. During the first step of each absence of arrival of new micro-organisms throughout
experiment, the colonization by suspended biomasses pref- experiment may have caused competition processes even
erentially occurs on the substrate ridges. At the junction during the first steps of colonization. In microcosm studies,
between two plates, the presence of gap was responsible for the continuous seeding processes enable the natural condi-
a recirculating flow near the solid surface. This stationary tions to be reproduced but can interact with the disturbance
zone can act as a trap where biomass can accumulate, which under study (Tlili et al., 2008).
could favour biofilm growth. The settings of the variables (temperature, light intensity,
Typically, the first species to colonize the substrate are nutrient content, and flow rate), chosen to favour the growth
heterotrophic bacteria and algal with fast growth rate and of biofilms can be very selective for some species. For instance
small cells, followed by the settlement and colonization of temperatures between 0 and 25  C increased species richness
slow growth and large cells species (Biggs et al., 1998; Sekar and diversity and temperatures above 30  C decreased species
et al., 2002; Roeselers et al., 2007). Thus, Cyanobacteria are richness (DeNicola, 1996). Moreover, previous studies have
considered as late colonizers, with a slow growth rate (Sekar shown that nutrient ratios (N, P and Si) greatly influence the
et al., 2002). This could explain their fast disappearance composition of algal communities (Hillebrand and Sommer,
during both cultivations and their recurrence in the 6.7-week- 2000b) and that the enrichment of the medium favours the
old biofilm during culture 1. The use of a more diversified dominance of single species (Hillebrand and Sommer, 2000a).
inoculum (natural) and longer seeding phase for culture 2 did End-of-experiment biofilms were strongly dominated
not seem to enrich the algal community. As observed in most either by N. palea (Kutz.) W. Smith. or Scenedesmus genus for
experiments performed at laboratory scale (Boulêtreau et al., culture 1 and culture 2, respectively. N. palea (Kutz.) W. Smith.
2010), biofilms at the end of the experiment exhibited poor and the Scenedesmus genus are eutrophic and polysaprobic
algal specific richness, of 6 and 7 species for cultures 1 and 2 species, which reveal nutrient-rich waters with strong
respectively. As a result, the minimal number of algal species conductivity (Tison et al., 2004; Peña-Castro et al., 2004). This
to preserve an integral biofilm in this RAB seemed to be a final is consistent with the physical-chemical characteristics of the
number of 6 or 7 species. The use of a single short seeding culture medium used. Scenedesmus genus is a planktonic
phase in the present work (48 h or twice 48 h) may have species and the seeding phase conducted in suspension could
limited the adhesion of micro-organisms or only selected have induced its selection. The time taken to reach the AFDM
pioneer algal species and could thus be inherent to this poor peak was shorter for culture 2 than for culture 1 and was
diversity. The choice of constant experimental conditions followed by a slight biomass removal leading to the ageing
during biofilm development did not favour environmental phase. Zippel and Neu (2005) concluded that green-algal-
changes as observed in a natural environment (Biggs, 1996). It dominated biofilms presented a less stable and compact
is known that, in an undisturbed environment (e.g. constant structure caused by a faster growth rate. The authors observed
hydrodynamic conditions), autogenic processes appear and that fast development induced the formation of poorly
the more competitive species dominate (competitive exclu- diversified biofilms, probably explained by an economy and
sion), which can explain the poor algal diversity and lead to partition of resources (Zippel and Neu, 2005). One possible
self detachment (Boulêtreau et al., 2006) as observed during reason why algal diversity is small can be attributed to tax-
culture 2 at 4.4 weeks of colonization. It has been suggested onomical analyses based on morphotypes. Many different
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186

6116 w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8

species can fall into the same category and can induce an applicable to the growth of bacterial (Yu et al., 2010) or pho-
under-estimation of specific richness. totrophic (Szlauer-Lukaszewska, 2007) biofilms. Their plastic
Bacterial communities from both cultures changed mark- nature and flexibility made them easy to curve so as to fit the
edly over the development of the biofilms. Despite differences external cylinder geometry, thus limiting the disturbance on
in the inoculum communities, the succession was similar for the flow. The plate fixation design allowed quick and easy
both cultures associated with different trajectories. Since sampling without destruction of the sampled biofilms.
there was no addition of micro-organisms after the seeding The geometry, current velocity and continuous culture
phase, the temporal changes for algal and bacterial commu- mode of our prototype made it possible (i) to limit the devel-
nities observed in the present study do not correspond to opment of phytoplankton and thus the competition processes
ecological succession processes occurring over natural biofilm between phototrophic biofilm and planktonic biomass, (ii) to
maturation for either the algal (McCormick and Stevenson, limit potential erosion from recirculation of particle or
1991) or bacterial (Lyautey et al., 2005) compartments but are sloughed biofilm fragments, and (iii) to avoid the settling of
related to different algal species and T-RF dominance larger biofilm grazers in such an environment with fast rota-
variations. tion of the water column.
The primers used in this study have been designed to
target specifically the Bacteria domain. Our in silico searches 4.2.2. Shortcomings and potential improvements
using the RDP database (Cole et al., 2009) indicated that both The design of our RAB prototype leads to particular operating
primers (8F and 1489R) can potentially target Cyanobacteria. conditions for the phototrophic biofilm development. First,
Among the in silico targeted organisms, around 5% corre- flow on the plates is produced by the rotation of the inner
sponded to cyanobacteria. Hence, the use of these primers in cylinder, and not directly by the circulation of the water
the current study could over-estimate non phototrophic through the system. The consequence is the RAB functioning
bacteria richness. as a partial closed flow through system without water contact
with atmosphere, and with a water residence time of a few
4.2. Rotating annular bioreactor hours. The uncoupling between flow velocity on plates and
medium flow rate gives unnatural operating conditions. For
4.2.1. Improvements and advantages compared to other RAB example, increases of pH (up to 10) or dissolved oxygen
Previous studies have suggested that the rotating annular concentration (up to oversaturation of 200%) were obtained
bioreactor (RAB) can be an appropriate system to study the with daily variations and photosynthetic processes. These
effects of various environmental factors on biofilm develop- conditions may cause temporary inorganic carbon limitation,
ment (e.g. Neu and Lawrence, 1997; Chénier et al., 2003). reactive oxygen damage, and selection of algal and bacterial
Considering all critical points associated with RAB presented species. To circumvent these shortcomings, a new version of
in the literature, the objective of this work was first to design the RAB must integrate pH control and oxygen stripping, for
an innovative bioreactor having a modular light source inside example with an external loop to prevent the modification of
the system and second to have a good knowledge of hydro- the flow pattern in the bioreactor. Second, the temperature is
dynamic conditions as assessed using the numerical not controlled inside the bioreactor, and values up to 30  C
approach. Computer simulations allow us to confirm a turbu- were obtained at the end of a diurnal period, or when the
lent vortex flow inside the annular gap with the presence of number of neon tubes was increased. Our RAB contains 3
stacked vortices. We observed shear stress and velocity cylinders, so the best way to control the temperature would be
gradients at the scale of the vortices, and the distribution of to thermoregulate the atmosphere inside the cylinder con-
shear stress described a periodic variation along the height of taining the neon tubes. Third, it can be suspected that
the bioreactor. As observed by Desmet et al. (1996), the pres- a heterogenous distribution of light inside the RAB occurred,
ence of these vortices allows a faster real axial dispersion the total number of neon tubes being small and including two
process than the plug-flow hydrodynamic type, which leads to types of fluorescent lamps. This technical flaw can be cir-
well mixed liquid phase without of nutriment concentration cumvented by using opaque material placed inside the
gradients inside the annular gap, as verified by the tracer internal water-tight cylinder and in front of the lamps.
method. Variability between plates (n ¼ 3) for the same
sampling time was relatively low (30%) for biomass analysis, 4.2.3. Towards a promising tool
and their percentage of homology was 60% for T-RFLP In spite of some improvements needed on this prototype, our
analysis, indicating low spatial variability of biofilm coloni- study presents the applicability and the performance of a new
zation and growth inside the RAB. prototype of rotating annular bioreactor (TayloreCouette flow
In ecological research, it is necessary to use controlled type) which can be considered as a highly suitable tool for the
experiments with large replication to correct for the well cultivation, investigation and understanding of a variety of
known heterogeneity within biofilms (Wimpenny et al., 2000). ecological concepts, including the specific richnesseresist-
Our prototype was therefore designed with numerous, large ance relationship, or the coupling between hydrodynamic
supports associated with a large liquid working volume level/chemical compounds and structure/function of photo-
(5.04 L). In fact, the 32 plates provided a total colonization trophic biofilms.
surface of 0.16 m2 in the present study as against the 12 plates As recorded in a previous study in microcosm (Boulêtreau
providing 0.0132 m2 of colonization surface in Lawrence et al. et al., 2010), despite a poorly diversified algal community,
(2000), or the 20 plates with 0.00187 m2 in Declerck et al. (2009). the phototrophic biofilm exhibited high biomass production.
We used plates made of polyethylene, suggested to be This leads us to wonder about the effect of poor algal diversity
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187

w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8 6117

on the biomass production of phototrophic biofilm. A major for field assistance, and E. Mazeau for the computational
challenge of the last decade has been to understand the study of hydrodynamics. We also thank D. Dalger and T. Louis
relationship between diversity loss and ecosystem processes for bioreactor handling assistance, and E. Lyautey for revising
(Loreau et al., 2001). Numerous studies have shown that the correcting English of the manuscript.
species-rich communities produce more biomass than
species-poor communities (Zhang and Zhang, 2006). In future
experiments, it could be interesting to assess the stability and
references
resistance of these poorly diversified algal communities ob-
tained in the prototype when a disturbance (e.g. toxic pollut-
ants) is imposed on them. Various works have observed
Battin, T.J., Kaplan, L.A., Newbold, J.D., Cheng, X., Hansen, C.,
greater sensitivity to disturbance for poorly diversified 2003. Effects of current velocity on the nascent architecture of
communities (Zhang and Zhang, 2006). stream microbial biofilms. Applied and Environmental
Generally, it is difficult to individualize the main factors Microbiology 69 (9), 5443e5452.
influencing epilithic biofilm development and several sources Besemer, K., Singer, G., Limberger, R., Chlup, A.-K.,
of stresses can have synergistic effects or the inverse. This Hochedlinger, G., Hödl, I., Baranyi, C., Battin, T.J., 2007.
Biophysical controls on community succession in stream
prototype can bring new perspectives for characterizing the
biofilms. Applied and Environmental Microbiology 73 (15),
effect of a single factor (e.g. hydrodynamic). Through the
4966e4974.
ability to modulate the experimental conditions, and by the Biggs, B.J.F., 1996. Patterns in benthic algae of stream. In:
choice of a particular parameter adapted to algal ecology, the Stevenson, R.J., Bothwell, M.L., Lowe, R.L. (Eds.), Algal Ecology.
prototype can permit future investigations for the formation Freshwater Benthic Ecosystem. Academic Press, San Diego,
and cultivation of artificial biofilms as has recently been re- pp. 31e56.
ported in the literature (Hayashi et al., 2010). Biggs, B.J.F., Stevenson, R.J., Lowe, R.L., 1998. A habitat matrix
conceptual model for stream periphyton. Archiv Für
Hydrobiologie 143 (1), 21e56.
Boston, H.L., Hill, W.R., 1991. Photosynthesis-light relations of
5. Conclusion stream periphyton communities. Limnology and
Oceanography 36 (4), 644e656.
Boulêtreau, S., Garabétian, F., Sauvage, S., Sánchez-Pérez, J.-M.,
We propose an improved RAB featuring an embedded
2006. Assessing the importance of a self-generated
modular source of light and the possibility to accurately
detachment process in river biofilm models. Freshwater
control the hydrodynamic conditions. These characteristics Biology 51 (5), 901e912.
ensure better control of the operating conditions in compar- Boulêtreau, S., Sellali, M., Elosegi, A., Nicaise, Y., Bercovitz, Y.,
ison with other RABs. Additionally, the larger size of the Moulin, F., Eiff, O., Sauvage, S., Sánchez-Pérez, J.-M.,
bioreactor permits numerous samples of biomasses to be Garabétian, F., 2010. Temporal dynamics of river biofilm in
taken along the course of experiments to ensure replicates constant flows: a case study in a riverside laboratory flume.
International Review of Hydrobiology 95 (2), 156e170.
and long term cultures. Further improvements of our RAB
Bourassa, N., Cattaneo, A., 1998. Control of periphyton biomass in
version would be beneficial however, including technical
Laurentian streams (Québec). Journal of the North American
solutions for temperature control, homogenous distribution Benthological Society 17 (4), 420e429.
of light inside the system, pH control and oxygen stripping, Bruneel, O., Duran, R., Casiot, C., Elbaz-Poulichet, F.,
and operating conditions with a less selective culture medium Personné, J.-C., 2006. Diversity of microorganisms in FeeAs-
and a continuous supply of biomass inoculum. Still, our RAB rich acid mine drainage waters of Carnoulès, France.
may be useful for the cultivation and experimental study of Applied and Environmental Microbiology 72 (1), 551e556.
Characklis, W.G., 1990. Laboratory biofilm reactor. In:
phototrophic biofilms. This approach is complementary to
Characklis, W.G., Marshall, K.C. (Eds.), Biofilms. John Wiley
experimental and observational studies carried out at more and Sons, New York, pp. 55e89.
complex and realistic scales such as ‘open’ channel and in situ Chénier, M.R., Beaumier, D., Roy, R., Driscoll, B.T., Lawrence, J.R.,
investigations. Hence, RAB-based experiments can make Greer, C.W., 2003. Impact of seasonal variations and nutrient
a significant contribution to our understanding of the mech- inputs on nitrogen cycling and degradation of hexadecane by
anisms which mediate the structure and functions of photo- replicated river biofilms. Applied and Environmental
Microbiology 69 (9), 5170e5177.
trophic biofilm communities.
Clarke, K.R., 1993. Non-parametric multivariate analyses of
changes in community structure. Australian Journal of
Ecology 18 (1), 117e143.
Cole, J.R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R.J.,
Acknowledgements Kulam-Syed-Mohideen, A.S., McGarrell, D.M., Marsh, T.,
Garrity, G.M., Tiedje, J.M., 2009. The ribosomal database
This work was funded by the French National Programme project: improved alignments and new tools for rRNA
EC2CO e Environmental Microbiology - and by the Midi-Pyr- analysis. Nucleic Acids Research 37 (suppl 1), D141eD145.
énées Council Programme of the Pyrenean working commu- Coufort, C., Bouyer, D., Liné, A., 2005. Flocculation related to local
hydrodynamics in a TayloreCouette reactor and in a jar.
nity. We are grateful to the ARIAS (Toulouse) company,
Chemical Engineering Science 60 (8e9), 2179e2192.
especially J.-J.Bertrand, for manufacturing the rotating
Declerck, P., Behets, J., Margineanu, A., van Hoef, V., De
annular bioreactor. We thank J.-L. Druilhe for the electrical Keersmaecker, B., Ollevier, F., 2009. Replication of Legionella
device for continuous physical-chemical measurement, S. pneumophila in biofilms of water distribution pipes.
Karama for assistance with the T-RFLP method, S. Mastrorillo Microbiological Research 164 (6), 593e603.
 Author's personal copy
188

6118 w a t e r r e s e a r c h 4 5 ( 2 0 1 1 ) 6 1 0 7 e6 1 1 8

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threshold and confidence estimates for terminal restriction biofilms under controlled light conditions. Water Science and
fragment length polymorphism analysis of complex bacterial Technology 52 (7), 203e209.
II.3. Conclusions du chapitre 189

II.3 Conclusions du chapitre

Ce chapitre nous a permis d’apprécier l’importance relative des facteurs environnemen-
taux versus les facteurs autogènes sur la structuration des communautés bactériennes durant
le développement des biofilms phototrophes à travers l’étude in situ de la première partie
de ce chapitre. Le contrôle par les facteurs environnementaux prédomine durant les premiers
stades de développement du biofilm suivi par une prédominance des facteurs autogènes. Ces
deux types de facteurs vont contrôler les successions écologiques des espèces menant à une
trajectoire particulière propre à chaque agrégat. Cette trajectoire peut toutefois être mo-
difiée avec la modification des facteurs environnementaux, observée ici par l’expérience de
transplantation sans pour autant « retrouver » complètement la trajectoire des biofilms au-
tochtones : soit parce que l’état de développement du biofilm était d’un état d’avancement
tel que les facteurs autogènes prédominaient déjà sur les facteurs environnementaux, signi-
fiant que les 3 semaines de colonisation initiales permettaient le développement d’un biofilm
« mature » du point de vue des communautés bactériennes, soit parce que la période de
post-transplantation (2,5 semaines) était trop courte pour permettre une ressemblance par-
faite avec les communautés autochtones. Ce design expérimental, basé sur une expérience
de transplantation, est aujourd’hui de plus en plus utilisé pour apprécier la résilience des
communautés après une perturbation (pollution par des pesticides ou des métaux, Dorigo et
al. 2010a et b ; Rotter et al. 2011). Comme nous avons pu l’observer durant cette étude, les
expériences in situ sont délicates, et présentent quelques limites car de nombreux paramètres
coexistent ensembles et notamment l’évolution temporelle et l’état de maturation du biofilm
rarement pris en compte durant les expériences. Il est important dans ce type d’expérimen-
tation de réaliser une très bonne caractérisation biologique et physique des sites d’études,
mais également d’intégrer le biofilm dans sa globalité, et à différents niveaux d’organisations
biologiques, algues, bactéries, brouteurs, etc. . . (Lawrence et al. 2002).
Les caractéristiques physico-chimiques des sites d’études sont très contrastées, ainsi le
transfert d’un site à l’autre que subit le biofilm durant l’expérience de transplantation peut
être considéré comme un stress. Ce design expérimental peut être utilisé dans un objectif
d’évaluation des différentes réponses possibles des communautés face à une perturbation
(résistance, adaptation. . . ), en fonction des différents stades de développement, c’est-à-dire
de l’importance relative des facteurs environnementaux versus les facteurs autogènes, dans un
contexte d’étude de la relation structure des communautés - fonctionnement des écosystèmes.
Lors de la deuxième partie de ce chapitre, nous avons cherché à évaluer le déterminisme
autogéne exercé sur les communautés de biofilms. Dans ce contexte, un prototype de RAB
a été développé et des conditions environnementales stables ont été appliquées. Par ce choix
II.3. Conclusions du chapitre 190

expérimental, nous cherchions à limiter l’influence des facteurs allogènes sur la croissance
du biofilm. La stabilité des conditions opératoires était accentuée par l’utilisation d’un sys-
tème fermé pour limiter les relations avec l’atmosphère, l’utilisation de supports artificiels,
l’alimentation par de l’eau du réseau, l’absence de recirculation de l’eau pour limiter les phé-
nomènes d’immigration et d’émigration et d’abrasion. Les biofilms présentaient une faible di-
versité des communautés algales ainsi qu’une stabilité rapide des communautés bactériennes
(3 semaines) et Eucaryotes (1,7 semaines). Ces résultats sont cohérents avec une phrase de
Villeneuve et al. (2010) « The physical heterogeneity inherent to streams promotes biodiver-
sity ». De fortes quantités de biomasse sont observées à l’issue des deux cultures malgré les
compositions algales et bactériennes différentes. La productivité de biomasse ne semble donc
ni sensible à la composition en communautés, ni liée au nombre d’espèces comme souvent
souligné (Loreau et al. 2001). Ceci pourrait-il être expliqué, comme le suggèrent Passy et
Legendre (2006), par l’utilisation de supports artificiels qui sélectionnent les espèces entrai-
nant ainsi un biais ? Des études complémentaires d’autres fonctions plus spécifiques (exemple,
dénitrification, biodégradation d’une molécule organique) autre que la production primaire
pourraient être intéressantes. Le nombre de 6-7 espèces algales par culture en fin de croissance
peut-il être considéré comme le nombre d’espèces minimal pour le maintien de l’intégrité d’un
biofilm, quelles que soient la composition des communautés et les conditions opératoires ?
Ce prototype de bioréacteur RAB, malgré quelques modifications techniques (citées plus
haut) à adapter présente de nombreux avantages :
– une capacité à produire du biofilm phototrophe, en grande quantité, pour réaliser de
nombreuses analyses ;
– une possibilité ultérieurement de jouer sur l’importance relative des facteurs allogènes
versus autogènes, et d’améliorer nos connaissances sur les mécanismes de succession
écologiques ;
– l’utilisation du RAB couplé à des descripteurs fonctionnels pour relier les successions
écologiques à des fonctions, par exemple des fonctions pouvant rendre des services
écologiques, et analyser la relation biodiversité - fonction ;
– un des points forts de notre RAB est le contrôle des conditions hydrodynamiques et la
bonne connaissance des caractéristiques de l’écoulement (profils de vitesse et contraintes
de cisaillement à la paroi). L’hydrodynamique contrôle la structure physique du bio-
film, un biofilm qui se développe sous un environnement présentant de fortes vitesses
de courant est souvent très adhérent au support de colonisation et d’épaisseur fine, il
est considéré également résistant aux perturbations (Stevenson et al. 2006). Ainsi ce
type de bioréacteur permettra d’approcher les corrélations entre l’hydrodynamique et
II.3. Conclusions du chapitre 191

la structure physique du biofilm (épaisseur, compacité, élasticité, comparaison des acti-

vités des couches superficielles et des couches profondes) et entre l’hydrodynamique et
les processus de maturation du biofilm (trajectoires de succession écologique, sensibilité
aux polluants et potentiel de dégradation des polluants). Une perspective de recherche
consisterait à développer une série de mini-bioréacteurs en intégrant les propriétés de
notre prototype.
Les deux études de ce chapitre confirment bien les résultats de travaux antérieurs sur les
biofilms épilithiques (Lyautey 2005) montrant l’intérêt des concepts de successions écologiques
pour décrire les variations temporelles et la structuration des communautés bactériennes et
algales des biofilms phototrophes.
Comme cela est souligné dans la partie « Synthèse bibliographique », les pesticides
constituent une source de pollution diffuse qui contamine toutes les eaux continentales (Kons-
tantinou et al. 2006). Les biofilms phototrophes, par leur ressemblance physiologique avec
les plantes, sont des cibles possibles des herbicides. Connaissant le rôle fonctionnel clef des
biofilms par leurs nombreuses contributions au fonctionnement général des écosystèmes aqua-
tiques (production primaire, minéralisation de la matière, biodégradation de polluants orga-
niques. . . ), affecter l’intégrité des biofilms revient à endommager le fonctionnement général
des écosystèmes aquatiques, d’où l’importance de comprendre l’influence potentielle des her-
bicides sur les biofilms phototrophes. De plus, les biofilms phototrophes, particulièrement
la fraction diatomique, sont utilisés comme bio-indicateurs de l’état écologique des écosys-
tèmes en termes de pollution organique (métaux et niveau trophique) (Coste et al. 2009).
Des études récentes ont pu fournir des résultats encourageant suggérant la pertinence des
diatomées comme outil d’évaluation des risques de pollution par les herbicides (Roubeix et
al. 2011b ; Rimet et Bouchez 2011).
Un herbicide aura-t-il plus d’effet lorsque l’influence des facteurs allogènes est prédo-
minante sur la structuration des communautés ou durant des degrés de maturation plus
importants qui sont influencés principalement par les facteurs autogènes ? A quel moment du
développement du biofilm est-il plus pertinent de l’utiliser comme bio-indicateur ? D’après
les conclusions des deux sous parties du chapitre 2, la logique voudrait que le biofilm pho-
totrophe soit le plus sensible lors de ces premiers stades de développement, au moment où
les micro-organismes interagissent principalement avec la colonne d’eau. Dans ce cas là, nous
pouvons nous interroger sur la pertinence de l’utilisation des biofilms phototrophes dans la
bio-indication d’une exposition à des pesticides.
Parmi les grandes questions écologiques, une concerne la nature de la relation entre la
stabilité d’un écosystème et la biodiversité d’une communauté (MacCann 2000). Il est gé-
II.3. Conclusions du chapitre 192

néralement souligné qu’une grande richesse en espèces permettrait une plus grande stabilité
de la communauté et une résistance plus importante face à une perturbation. Dans ce cas,
pour les biofilms phototrophes peu diversifiés cultivés dans le RAB, quel serait leur niveau
de tolérance face à une perturbation telle que l’exposition à un pesticide ? Zhang et Zhang
(2006) enregistrent une résistance plus importante à une variation de température lorsque la
communauté algale est la plus diversifiée. A l’inverse, Villeneuve et al. (2010) n’observent pas
de résistance particulière pour leurs communautés de biofilms les moins diversifiées vis-à-vis
d’une contamination par les herbicides.
Il nous semble donc important d’intégrer les concepts de successions écologiques et de bio-
diversité abordés dans le chapitre précédent aux études écotoxicologiques et de bio-indication,
ce qui fera l’objet de notre prochain chapitre.
 Chapitre III

Importance relative des facteurs

allogènes et autogènes dans la réponse de
biofilms phototrophes à un herbicide –
différentes approches expérimentales en
microcosmes

Questions :
- Les réponses structurelles et fonctionnelles des communautés microbiennes de biofilms pho-
totrophes à l’exposition à un herbicide tel que l’alachlore dépendent-elles de l’histoire du
biofilm ? Rôle des facteurs allogènes et du degré de maturation du biofilm (du stade précoce
au stade mature).

Ce chapitre se déroule en trois sous-parties, chacune correspondant à une des trois straté-
gies expérimentales différentes en microcosmes. Dans les deux premières parties, nous avons
étudié la toxicité de l’alachlore, soit sur des biofilms phototrophes « matures » cultivés in
situ et d’origines différentes, soit sur des biofilms phototrophes « jeunes », durant leurs pre-
miers stades de développement, cultivés en mini-bioréacteurs photosynthétiques. Dans une
troisième partie, la toxicité de l’alachlore a été évaluée cette fois en intégrant à la fois les
premiers stades de développement des biofilms phototrophes ainsi que des niveaux de matura-
tion plus avancés. Cette dernière partie est réalisée avec des biofilms phototrophes cultivés en
bioréacteur prototype RAB. Ce chapitre fait l’objet de trois articles en préparation (Articles
4, 5 et 6).
III.1. Contexte scientifique 194

III.1 Contexte scientifique

Comme souligné dans le chapitre « Synthèse bibliographique », les pesticides consti-
tuent une source de pollution diffuse importante qui contamine une bonne partie des milieux
lotiques du monde entier (par exemple Konstantinou et al. 2006). Pour les nombreuses raisons
citées auparavant, affecter l’intégrité des biofilms phototrophes au sein des milieux lotiques
peut revenir à endommager le fonctionnement général de ces écosystèmes. Dans ce contexte,
il est essentiel d’évaluer la toxicité des pesticides sur les biofilms phototrophes à l’échelle des
communautés et de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les réponses structurelles
et fonctionnelles de ces communautés microbiennes. D’autre part, de récentes études ont pu
fournir des résultats encourageant suggérant la pertinence des diatomées comme outil d’éva-
luation révélateur d’une exposition aux herbicides (Roubeix et al. 2011b ; Rimet et Bouchez
2011). Nous disposons donc là de processus et d’indicateurs dont il faut évaluer les possibles
corrélations.
Le chapitre précédent confirmait les résultats de travaux antérieurs sur les biofilms épi-
lithiques naturels (Lyautey 2005) montrant l’intérêt du concept de successions écologiques
pour décrire les variations temporelles de structuration des communautés bactériennes et
algales des biofilms phototrophes. Ces résultats, comme souligné par Lyautey (2005), ont pu
« montrer l’importance des facteurs environnementaux et l’occurrence de successions écolo-
giques au cours du développement d’un biofilm phototrophe, car la structure du biofilm est
également gouvernée par le temps et la maturation de l’agrégat ». Le stade de maturation
du biofilm est donc bien un facteur prédominant qui résulte de trajectoires d’évolution de
la structure des communautés (histoire du biofilm en lien avec son environnement). Il a été
montré lors d’études antérieures, que l’installation de certaines fonctions (nitrification et dé-
nitrification) dans le biofilm est fortement corrélée à la biomasse (Teissier et Torres 2002),
laissant penser à une installation programmée, spécifique d’un degré de maturation du biofilm
(apparition de niches écologiques favorables) et alors indépendante des facteurs extérieurs au
biofilm (Lyautey 2005).
Les processus de maturation sont liés à des changements de la structure et de la composi-
tion des communautés de biofilms, avec apparition de différents microhabitats et de gradients
physico-chimiques.
Qu’en est-il de la réponse des communautés d’un biofilm phototrophe et de leur sensibilité
vis-à-vis d’un herbicide ? Un herbicide aura-t-il plus d’effet lorsque l’influence des facteurs
allogènes est prédominante sur la structuration des communautés ou durant des degrés de
maturation plus importants qui sont influencés principalement par les facteurs autogènes ?
Guasch et al. (1997) observaient des changements saisonniers dans la réponse des biofilms
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 195

phototrophes en présence d’atrazine, un inhibiteur de la photosynthèse (famille des triazines).

En hiver, sous des conditions environnementales la toxicité de l’atrazine était inversement re-
liée à l’âge du biofilm, alors qu’en été cette relation n’était plus observée. Une des explications
proposée par les auteurs à cette absence de relation en été, était la présence de fluctuations
des conditions environnementales (température d’eau, oxygène dissous) associées aux varia-
tions des flux d’eau qui pouvaient masquer les effets de l’herbicide. Dans ce contexte, à quel
moment du développement du biofilm est-il plus pertinent de l’utiliser comme bio-indicateur ?
D’après les conclusions des deux sous-parties du chapitre précédent, la logique voudrait que
le biofilm phototrophe soit le plus sensible lors de ces premiers stades de développement, au
moment où les micro-organismes agrégés interagissent principalement avec la colonne d’eau.
C’est ce que nous nous proposons de tester à l’aide de différentes stratégies expérimentales
en microcosmes.

III.2 Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et

fonctionnelle de biofilms phototrophes post-exposés
à l’alachlore
Résumé de l’article intitulé « Structural responses of natural phototrophic biofilms
to alachlor exposure in microcosms » par A. Paule, A. Lamy, V. Roubeix, F.
Delmas, E. Paul et J.L. Rols. (Article 4)

III.2.1 Approche expérimentale

Cette étude comprend une première phase de culture de biofilms phototrophes in situ
suivie par une approche écotoxicologique en microcosmes. Pour la phase de culture in situ,
des supports artificiels (coupons en polyéthylène) sont positionnés durant 4 semaines sur
deux sites d’étude M et S (cf. partie I Matériel et méthodes), aux caractéristiques
physico-chimiques différentes. en termes de facies, pollution par les phytosanitaires, vitesse de
courant etc. . . (cf. partie I Matériel et méthodes). Le choix s’est porté sur des supports
artificiels principalement pour contrôler le degré de maturation des biofilms. A l’issue des
4 semaines de culture in situ, les communautés de ces biofilms se définissent comme une
image transitoire de processus écologiques contrôlés par des facteurs autogènes et allogènes,
résultant de trajectoires différentes et propres à chaque site d’étude. Une fois collectés, les
coupons sont transférés à l’intérieur de microcosmes pour les tests écotoxicologiques. Deux
tests identiques sont réalisés pour les biofilms des deux sites à des périodes décalées. Durant
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 196

les expériences en microcosmes, les biofilms subissent une première phase d’acclimatation
de 7 jours (cf. partie I Matériel et méthodes), suivie par une phase de contamination
avec 10 ou 30 µg.L−1 d’alachlore durant 23 jours. Trois coupons (3 réplicats) sont prélevés
régulièrement dans les microcosmes afin de caractériser structurellement (MSSC, chlorophylle
a, PCR-DGGE) et fonctionnellement (Biolog) les communautés algales et bactériennes des
biofilms et rechercher un effet associé à la présence de l’alachlore.

III.2.2 Principaux résultats

Durant les 4 semaines d’incubation des supports artificiels in situ, les deux sites M et S
présentent bien des différences physico-chimiques, associées à des niveaux de concentrations
en nitrates et en silice, et des valeurs de conductivité plus élevés pour le site M. Les biofilms
du site S se caractérisent par des quantités de matières sèches sans cendre plus élevées (0,4
mg.cm−2 ) que les biofilms du site M (0,31 mg.cm−2 ), mais inversement avec des teneurs en
chlorophylle a plus faibles (respectivement 4,3 et 6,7 µg.cm−2 ). Malgré un problème technique
lors de la préparation des solutions nutritives additionnées au milieu aqueux des microcosmes,
les conditions physico-chimiques restent identiques durant une même expérience.
La phase d’acclimatation de 7 jours n’engendre pas de modification significative au niveau
des concentrations en MSSC et chlorophylle a, signifiant une absence de croissance de la
part des biofilms, et cela malgré le confinement en microcosme, susceptible de stimuler la
croissance, en présence de fortes concentrations en nutriments et une température plus élevée
que lors des conditions in situ. Nous pouvons supposer que les biofilms collectés in situ
peuvent être considérés comme « matures » et contrôlés principalement par des facteurs
autogènes. Ces observations sont cohérentes avec ce que suggéraient Dorigo et al. (2010a), la
colonisation d’un support vierge ainsi que l’établissement d’une communauté dite « mature
», en équilibre avec son environnement chimique peut prendre de 2 (Hoagland et al. 1982) et
4 semaines (Eulin et Le Cohu 1998).
La toxicité de l’alachlore est évaluée à travers différents paramètres (descripteurs struc-
turels), à deux temps d’incubation de 12 et 23 jours.
. Les effets sur les descripteurs de biomasse : Pour le biofilm provenant du site M, aucun
impact de l’alachlore sur les teneurs en MSSC et chlorophylle a n’est observé. Pour le biofilm
provenant du site S, nous obtenons des niveaux de MSSC plus faibles aux deux concentrations
d’alachlore testées (10 et 30 µg.L−1 ).
.Les effets sur la structure bactérienne évaluée par la méthode de typage moléculaire, la
PCR-DGGE : Le nombre d’OTUs moyen au cours des différentes conditions de l’expérience
en microcosmes est de 18 à 25 pour le biofilm issu du site M et de 20 à 33 pour celui
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 197

issu du site S. La diversité bactérienne, évaluée par le nombre d’OTUs, ne présente pas
de variation au cours de l’expérience correspondant au site M. Alors qu’une diminution de
la diversité est perceptible à l’issue de 12 jours d’incubation pour l’expérience du site S
révélant un effet de l’alachlore aux deux concentrations testées. Si nous comparons par site
les différentes structures de l’ensemble des traitements par une analyse de NMDS (cf. partie
II Matériel et méthodes), il apparaît que deux facteurs ont pu influencer la structuration
des communautés au sein des microcosmes : le temps d’incubation associé aux variations
temporelles du biofilm et la présence de l’alachlore.
.Les effets sur les communautés de diatomées évaluées par comptage au microscope puis
révélés par une analyse en composante principale (ACP) : Les communautés de diatomées
des biofilms du site M ne présentent pas de modification induite par la présence de l’ala-
chlore en termes de structure ou de composition, mais elles sont fortement influencées par
le facteur temps d’incubation. Il en va de même pour le site S, avec une exception pour
les échantillons exposés à 30 µg.L−1 qui sont caractérisés à l’issue de 23 jours d’incubation
par une augmentation significative de l’abondance de l’espèce de diatomées Achnanthidium
minutissimum (ADMI), ainsi que du nombre de déformations au sein de cette population
(22 %). La diatomée A. minutissimum est une espèce pionnière et indicatrice d’une bonne
qualité d’eau (Coste et al. 2009), elle est connue pour être généralement tolérante aux pol-
lutions trophiques (Roubeix et al. 2011a) et aux herbicides du type triazines (Munoz et al.
2001 ; Seguin et al. 2001).
.Les effets sur les profils d’utilisation des différentes sources de carbones : Pour les com-
munautés bactériennes issues du site M, nous observons une augmentation non significative
du nombre de sources de carbone utilisées pour les biofilms traités avec 30 µg.L−1 d’alachlore,
à 23 jours d’incubation (d’une moyenne de 12,5 ± 0,8 à 19,3 ± 2,5 sources de carbone). In-
versement, les communautés bactériennes issues du site S ne présentent pas de variation dans
le nombre de sources de carbone utilisées. Par une comparaison par site des profils d’utilisa-
tion de différentes sources de carbone regroupées par guildes via une analyse en composantes
principales, il est mis en évidence une influence prépondérante des variations temporelles
du biofilm associées au temps d’incubation plutôt qu’une influence associée à la présence de
l’alachlore.
Le comportement de l’alachlore durant les deux expériences M et S n’est pas le même.
Au cours de l’expérience M, la courbe de concentrations de l’alachlore au cours du temps suit
une disparition exponentielle décroissante , ce qui a permis d’utiliser un modèle de premier
ordre afin d’estimer un temps de demi-vie de la molécule entre 13 et 13,5 jours pour les
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 198

microcosmes avec ou sans biofilm contaminés à 10 µg.L−1 et 12,5 et 7,5 pour les microcosmes
avec ou sans biofilms à 30 µg.L−1 , respectivement.
Pour l’expérience S, le comportement de l’alachlore était identique pour l’ensemble des
traitements, microcosmes avec ou sans biofilm, à 10 ou 30 µg.L−1 . Les premiers jours de
contamination, les concentrations en alachlore diminuaient, suivi par une augmentation puis
de nouveau une disparition (Figure 3, Article 4). Ce type d’évolution ne permettait pas
d’estimer des valeurs de temps de demi-vie. Les analyses de l’alachlore au sein des échantillons
d’eau de rivière utilisée pour remplir les microcosmes sont en cours.

III.2.3 Résultats complémentaires

La Glutathione S-Transférase (GST), comme déjà précisé, est une enzyme de phase II
présente chez les Procaryotes et les Eucaryotes et qui participe à la détoxication de divers
polluants (cf. partie I Synthèse bibliographique). Les GST catalysent des réactions de
conjugaison du Glutathione, un tripeptide. Les GST catalysent la réaction de conjugaison
entre une molécule endogène et un toxique aboutissant à sa détoxication. Cette enzyme a été
suggérée comme contribuant à la biodégradation des herbicides de la famille des chloroacé-
tanilides dans les sols et les eaux de surface (Field et Thurman 1996 ; Knapp et al. 2003).
Dans le cadre de cette étude, son activité a été mesurée dans les biomasses des échantillons
de biofilms issus de l’expérience du site M uniquement (Figure 58) (pour l’expérience du
site S, les mesures sont en cours de réalisation) afin d’évaluer les conséquences de la présence
de l’alachlore sur l’activité de la GST. D’après la (Figure 58), l’activité de la GST est plus
importante pour les échantillons de biofilms exposés à une plus forte concentration en ala-
chlore (30 µg.L−1 ). L’activité de cette enzyme semble être dose dépendante, car pour une plus
faible concentration en alachlore (10 µg.L−1 ), l’activité de la GST est significativement plus
faible comparée au traitement à 30 µg.L−1 d’alachlore. La résistance des communautés des
biofilms phototrophes est-elle reliée à la capacité des communautés à augmenter la synthèse
et l’activité de leur GST ? Nous pouvons supposer qu’une augmentation de l’activité de la
GST engendre une biotransformation de l’alachlore au sein du biofilm. En milieux aquatique
et terrestre, la GST est connue pour catalyser des réactions de conjugaison qui métabolisent
l’alachlore en produits de dégradation, OA et ESA, notamment. Il serait intéressant de croiser
cette augmentation de l’activité de la GST avec des dosages d’OA et ESA. Cette augmenta-
tion de l’activité de GST pourrait donc expliquer en partie la résistance des communautés
des biofilms phototrophes du site M, pour l’ensemble des descripteurs mesurés dans le cadre
de cette étude. Dans ce contexte, nous pouvons nous demander pourquoi les communautés de
site S exposées à l’alachlore sont-elles moins résistantes que celles de l’expérience avec le site
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 199

M, vu que les GST sont des enzymes présentes dans la plupart des organismes terrestres et
aquatiques ? La capacité à résister ou non à un herbicide de la famille des chloroacétanilides
ne serait-elle pas uniquement due à la possible détoxication du polluant par les GST ? La
résistance des communautés du biofilm collecté au site M est-elle liée à une forte activité de
métabolisation liée à l’activité GST, ce qui diminue la biodisponibilité de l’herbicide et ainsi
sa toxicité ?
Dans la littérature, une étude compare l’activité de la GST de plusieurs espèces d’algues
vertes suite à une exposition au pyrène. Les auteurs observaient que l’intensité de l’activité
de la GST était espèce-dépendante (Lei et al. 2003). Parmi les 4 espèces d’algues vertes
étudiées, une diminution importante de l’activité de GST était observée pour Scenedesmus
quadricauda, l’espèce la plus sensible au pyrène. Inversement, l’activité des GST augmentait
significativement avec la concentration en pyrène pour les espèces Scenesdesmus platydiscus
et Selenastrum capricornutum. Ces deux espèces se trouvaient être les plus résistantes au
pyrène et présentaient une efficacité plus importante dans la métabolisation du pyrène.

Figure 58 – Moyenne des va-

leurs d’activités de la GST se-
lon les différents traitements
expérimentaux pour l’expé-
rience avec le biofilm collecté
au site M

T0 T12 T23

Ceci demanderait des informations supplémentaires au sujet de l’impact d’un herbicide de

la famille des chloroacétanilides sur les enzymes GST, mais l’intensité de l’activité des GST
pourrait être un bio-marqueur non spécifique d’une contamination (Cairrao et al. 2004).

III.2.4 Conclusion et perpectives

L’objectif principal de cette étude était d’évaluer la réponse d’une exposition à l’ala-
chlore de deux biofilms naturels d’origines et d’histoires différentes, se caractérisant par une
composition, une structure et des valeurs de biomasse différentes. Au cours de la phase d’in-
cubation en microcosmes, les teneurs en MSSC des deux types de biofilms n’augmentent pas
de manière significative, et ce malgré la présence de fortes concentrations en nutriments et
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 200

de températures élevées. Aussi pouvons-nous supposer que les biofilms collectés après 4 se-
maines de culture in situ sont « matures » ? Avec un tel degré de maturation, les biofilms ne
présenteraient alors que très peu d’interactions avec la colonne d’eau. Ainsi les changements
susceptibles d’être observés au niveau des communautés ne devraient être le résultat que de
successions autogéniques.
Malgré des degrés de maturation identiques, ces deux biofilms réagissent différemment
à la présence de l’herbicide. Le biofilm phototrophe provenant du site M, connu pour être
globalement le plus pollué en termes de pesticides et nitrates, semble être le moins influencé
par la présence de l’alachlore en microcosmes. Alors que le biofilm provenant du site S,
considéré le moins pollué, semble plus réactif à l’alachlore. Plusieurs hypothèses peuvent
expliquer cette différence de réponse :
. L’épaisseur et la structure physique du biofilm. Les deux sites de collecte présentent des
valeurs de vitesses de courant différentes, de 0,045 m.s−1 pour le site M à en moyenne 2 m.s−1
pour le site S, durant la période de production in situ sur les supports artificiels. La vitesse
de courant influence la structure physique du biofilm, en d’autres termes son architecture
(Battin et al. 2003b) mais également la quantité de biomasse et l’épaisseur. A de faibles
vitesses de courant, les biofilms présentent des architectures plus ouvertes et moins compacts
par rapport à des vitesses de courant plus fortes (Stevenson et al. 1996). Il a été montré que
des biofilms de rivières épais sont plus résistants à l’effet toxique du cuivre, du zinc et du
cadmium que les biofilms plus jeunes et donc plus fins (Admiraal et al. 1999 ; Ivorra et al.
2000). Une accumulation limitée du zinc au sein de biofilms épais semble être associée à une
variation des conditions de pH et une diminution du nombre de liaisons entre les exsudats du
biofilm et les métaux (Sabater et al. 2002), ainsi l’épaisseur du biofilm peut être considérée
comme une barrière protectrice face à la toxicité des métaux lourds.
. La présence d’espèces tolérantes. Cette hypothèse prévaut pour le site M qui est exposé
à des cycles de pollution par les pesticides, ce qui peut induire une sélection d’espèces. Une
des difficultés rencontrée lors des expériences écotoxicologiques est de connaître l’état de
contamination par des pesticides, souvent un mélange de molécules (Chèvre et al. 2006) de
l’environnement dans lequel les biofilms ont été produits avant de tester les effets potentiels
d’un polluant (Chèvre et al. 2006 ; Knauer et al. 2010). En effet, comme décrit par le concept
de PICT (Tlili 2010), des communautés qui sont en contact avec une molécule peuvent acqué-
rir une tolérance vis-à-vis de celle-ci ou d’une molécule de la même famille. Une des approches
possibles pour combiner les expériences écotoxicologiques avec l’identification des risques de
contaminations des eaux par un mélange de pesticides est l’utilisation d’outils spécifiques
pour la réalisation d’échantillonnages passifs (Vercraene-Eairmal 2010 ; Pesce et al. 2011).
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 201

Parmi ces échantillonnages passifs, les POCIS (« Polar Organic Chemical Integrative Sam-
plers ») sont des outils qui permettent d’évaluer la présence de polluants polaires organiques
dans les eaux douces, qui présentent un log Kow allant de 0 à 4, et pouvant appartenir à
différentes classes (hormones, détergents ioniques, etc. . . ).
Ces deux premiers points sont liés à l’histoire du biofilm, c’est-à-dire à la trajectoire qu’il a
suivi durant son développement, et qui est contrôlée par un ensemble de successions allogènes
et/ou autogènes, pour aboutir à une structure ou image transitoire particulière et propre à
chaque site.
Lors de cette étude, seulement la composition des communautés de diatomées a été ana-
lysée. Or il a été suggéré que les algues vertes étaient plus sensibles à des contaminations par
des pesticides que les diatomées et les cyanobactéries comme observé durant des expositions à
une seule molécule par Nyström et al. 2002 pour les triazines et par Mohr et al. 2008 pour les
chloroacétanilides. Ce qui montre l’importance d’intégrer lors d’expériences écotoxicologiques
le plus grand nombre de descripteurs de natures et de niveaux d’intégrations biologiques dif-
férents. Les biofilms collectés sur le site M contiennent un plus grand nombre de diatomées
que ceux du site S, que l’on suppose lié aux caractéristiques physico-chimiques du site. Le
facteur lumière est un paramètre important lors du développement du biofilm, certains au-
teurs ont suggéré que sous des conditions de plus faibles intensités lumineuses, les biofilms
étaient dominés par les diatomées (Sekar et al. 2002). Le site M présente un facies beaucoup
plus fermé avec une canopée de part et d’autre du ruisseau beaucoup plus développée qu’au
niveau du site S, ce qui a pu favoriser le développement des diatomées. Cela reste à vérifier
mais il est possible d’expliquer que la tolérance des biofilms à l’alachlore pourrait provenir
de la dominance des diatomées au sein de la fraction phototrophe.
. Les conditions opératoires des microcosmes. Ces conditions présentent quelques simili-
tudes avec les caractéristiques physico-chimiques du site M, notamment les fortes concentra-
tions en nitrates et la vitesse de courant faible. La structure physique du biofilm collecté au
site S a pu être fragilisée, le rendant ainsi plus vulnérable à une perturbation, ici l’exposition
à un herbicide, malgré la phase d’acclimatation.
D’un point de vue général, quelle que soit l’origine du biofilm phototrophe, l’évolution
temporelle liée à la maturation du biofilm au cours de sa production in situ a joué un rôle
prépondérant durant nos expériences en microcosmes. Il est très difficile d’évaluer correcte-
ment les causes des effets que l’on mesure, du fait des contributions concomitantes entre les
conditions environnementales et les variations temporelles dans la structuration des biofilms
phototrophes. Même s’il est possible de réduire les variations environnementales en travaillant
sous des conditions opératoires plus ou moins contrôlées, limiter les interactions au sein du
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 202

biofilm reste impossible. Il est important de considérer d’une manière précise ces interactions
lors des études écotoxicologiques, qui sont susceptibles d’interagir ou de masquer les effets
d’une perturbation, comme observé dans cette étude pour la structure des communautés
bactériennes et les profils d’utilisation de différentes sources de carbone.
Il est intéressant de noter que les paramètres mesurés dans le cadre de cette étude pré-
sentent des sensibilités différentes. Par exemple, pour le biofilm collecté sur le site S, les effets
sur les descripteurs de biomasse sont détectables dès 12 jours pour l’exposition à 10 µg.L−1 ,
alors que les effets sur les diatomées ne sont détectables qu’à partir de 23 jours et seulement
à la plus forte concentration en alachlore (30 µg.L−1 ). Une analyse par typage moléculaire
des Eucaryotes aurait pu être intéressante, afin d’évaluer leurs comportements face à la pré-
sence de l’alachlore. Il est primordial de considérer les deux types de paramètres structurels
et fonctionnels.
. Le comportement de l’alachlore. Les différences de comportement de l’alachlore durant
les deux expériences font que globalement les concentrations atteignent des niveaux plus
faibles et plus rapidement lors de l’expérience M, ce qui pourrait également expliquer leur
plus haute tolérance observée au cours de l’exposition, malgré les concentrations en alachlore
identiques en fin d’exposition (Figure 3, Article 4). Ces résultats suggèrent que les biofilms
collectés au site S présentent une plus grande capacité d’adsorption de l’alachlore que les
biofilms du site M. Inversement les biofilms collectés sur le site M semblent présenter une
plus grande capacité de biodégradation que les biofilms collectés sur le site S. Ces hypothèses
sont à vérifier notamment par le dosage des métabolites de l’alachlore en phase aqueuse et le
dosage de l’alachlore dans la matrice des biofilms. Ces deux fonctions sont étroitement liées à
la composition algale et bactérienne et des EPS ainsi qu’à la structure physique des biofilms,
elles-mêmes liées aux conditions physico-chimiques de leurs sites d’incubation, en d’autres
termes gouvernées par leurs propres histoires. L’adsorption et la biodégradation sont deux
des multiples processus qui gouvernent la persistance des pesticides. Un polluant adsorbé ou
biodégradé perd de sa biodisponibilité et de sa toxicité. Ainsi, ces deux mécanismes peuvent
également expliquer la variété de réponses des communautés de biofilm observés dans le cadre
de cette étude, exposées à un même herbicide.
Les diatomées sont communément utilisées comme bio-indicateurs des pollutions tro-
phiques mais des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre la sensibilité des
diatomées aux polluants comme les pesticides et leur utilisation comme bio-indicateurs de ce
type de pollution (Roubeix et al. 2011b ; Rimet et Bouchez (2011). Dans le cadre de notre
étude, l’utilisation des diatomées comme descripteurs ne semble pas être pertinente. Basé sur
la composition et la taxonomie des diatomées, aucun effet de l’alachlore n’a été détecté. Au
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 203

cours de cette étude, la composition de la communauté de diatomées est gouvernée principa-

lement par l’évolution temporelle de l’agrégat ce qui est cohérent avec les observations faites
par Rimet et Bouchez, 2011. Il semble d’après les résultats de cette étude qu’une contami-
nation à l’alachlore montre des effets pertinents sur la forme des frustules plutôt que sur la
composition des espèces. Les travaux de Roubeix et al. (2011a) enregistraient des change-
ments des communautés des diatomées exposées au métolachlore, associés notamment à une
diminution significative de l’abondance relative d’A. minutissimum pour de fortes concen-
trations en métolachlore (30 µg.L−1 ), alors que son abondance avait tendance à augmenter
lors de notre étude pour des concentrations identiques en alachlore. Les chloroacétanilides
sont des herbicides qui vont altérer la membrane cellulaire par l’inhibition de l’élongation des
acides gras (Böger et al. 2000). Etant donné que la formation des frustules des diatomées
nécessite une vésicule intracellulaire spéciale et l’exocytose de la silice biogénique (Roubeix et
al. 2011a), toute modification de la membrane des cellules peut se répercuter sur la formation
des frustules. Roubeix et al. (2011a) détectaient également un nombre de déformations plus
important lors d’une exposition de 21 jours à 30 µg.L−1 de métolachlore.
Il est intéressant de noter que le descripteur structurel lié à la forme des frustules (i) est
peu sensible parce que les déformations apparaissent seulement à de fortes concentrations
en alachlore (30 µg.L−1 , niveau en alachlore rarement détecté dans les eaux de surface) et
à l’issue de 23 jours d’exposition, et (ii) ne semble pas applicable à tous les morphotypes
d’une même espèce comme le cas dans cette étude, le morphotype d’A. minutissimum du
biofilm provenant du site S présente des déformations contrairement au morphotype d’A.
minutissimum du biofilm provenant du site M. Des études antérieures ont pu affirmer que
l’apparition de diatomées qui présentent des déformations au niveau de leurs frustules peut
être liée soit à une carence en silice (Debenest et al. 2010), soit souvent associée à des
contaminations par les métaux lourds (Cattaneo et al. 2004 ; Morin et al. 2008). Cependant
les études reliant une contamination par un herbicide à l’apparition de frustules déformées
sont encore rares (Debenest et al. 2008 ; Schmitt-Jansen et Altenburger 2005 ; Morin et al.
2010 ; Roubeix et al. 2010). Malgré tout, l’apparition de diatomées aux frustules déformées a
pu être associée à la présence d’herbicides qui présentent différents modes d’action, inhibition
de l’élongation des acides gras (métolachlore, Roubeix et al. 2011a), de la photosynthèse
(Debenest et al. 2008) ou de l’expression des gènes (maleique hydrazide, Schmitt-Janssen et
Altenburger 2005).

III.2.5 Article 4
III.2. Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de
biofilms phototrophes post-exposés à l’alachlore 204
 205

Structural responses of natural phototrophic biofilms to alachlor exposure in

microcosms

A. Paule1,2, A. Lamy1,2, V. Roubeix3, F. Delmas3, E. Paul4,5,6 & J.L. Rols1,2*

1
Université de Toulouse; UPS, INP; EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle et environnement); 118 route
de Narbonne, F-31062 Toulouse, France
2
CNRS; EcoLab; F-31062 Toulouse, France
3
Cemagref, UR REQE, 50 avenue de Verdun, F-33612 Cestas, France
4
Université de Toulouse; INSA; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France
5
INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France
6
CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

Abstract
Ecotoxicological experiments have been performed in laboratory-scale microcosms to investigate the
community-level responses of natural phototrophic biofilms to long term herbicide exposure. The phototrophic
biofilms were initially cultivated with artificial substrates placed in situ in rivers for 4 weeks at two sites with
contrasting physical-chemical characteristics. The first site M (Auradé, stream Le Montoussé, Gers, France),
considered as the polluted site, was located in an agricultural watershed basin, and the second site S (Larroque,
river La Save, Haute-Garonne, France), considered as the unpolluted reference site, was located in a forest
watershed basin. After an acclimatization phase of 7 days in microcosms, the natural phototrophic biofilms were
exposed under controlled conditions to alachlor contamination at 10 and 30 µg L-1 during 23 days. Alachlor
effects were monitored at different biological organization levels by the combination of biomass descriptors (ash
free dry mass, chlorophyll a) and structural molecular fingerprinting methods and diatom species composition.
Alachlor inhibited the growth of phototrophic biofilms previously cultivated in site S. The structural and
functional effects on bacterial communities and diatom species were less visible due to the presence of temporal
evolution of biofilm during microcosm experiment. An exception was observed after 23 days for the diatoms of
biofilms from site S exposed to 30 µg L-1, marked by the dominance of Achnanthidium minutissimum (K-z.)
Czarnecki diatom species and an occurrence of abnormal forms of this specie.
The results suggested that the biofilms collected at our polluted site M seemed to be less sensitive to the
herbicide exposure than the biofilms collected at our reference site S. The fate of alachlor in microcosms
exhibited different profiles in according to the cultivation site of biofilm, with a possible dissipation of the
molecule with biofilms from site M. Our work confirms the difficulty to distinguish the changes induced by the
stress occurred by the pesticide toxicity of those induced by the natural temporal evolution of microbial
communities in phototrophic biofilms. This study also provides additional knowledge on the promoting use of
diatoms as bio-indicators of pesticide contamination.
Keywords: Alachlor ; phototrophic biofilms ; bacterial community ; diatoms ; biological succession

1. Introduction
The objective of the European Water Framework Directive (WFD, European Commission, 2000) is to
implement an assessment of “good chemical and ecological” status for all European river bodies by 2015. This

1
 206

monitoring leads to the identification of sources of pollution including the pesticides, their persistence and
effects on the structure and functioning of aquatic ecosystems. Phototrophic biofilms (aggregates of photo-
autotrophic and heterotrophic micro-organisms enchased in exopolymer matrix) are key functional
compartments of lotic medium, by their contribution to primary production and food for invertebrates (Wetzel
1975), food source for aquatic grazers (Feminella and Hawkins 1995), mineralization and element recycling
processes (Battin et al. 2003), absorption (Lawrence et al. 2001), and biodegradation of chemical contaminants
(Vercraene-Eairmal et al. 2010)
Microbial community structure, responsible of the biofilm functioning, is controlled by allogenic and autogenic
factors (Paule et al. 2009). The relative importance of these factors is different in according to their maturation
levels. For thin biofilms, the allogenic factors (temperature, pH, light and hydrodynamic…) are predominant,
although for thick biofilms, the autogenic factors are predominant (competition to resources, grazing…). These
factors monitor the succession of species, resulting in a trajectory and structure particular for each aquatic sites
and biofilm maturation level. These different trajectories generate different sensitivity to perturbations.
Numerous studies, mainly with photosynthesis inhibitors, show that the responses of phototrophic biofilms to
pesticide contamination are of different types (tolerance, resistance, sensitive) (Clement and Newman 1992) and
are depending on several factors, such as light historic (Guasch and Sabater 1998), pollution composition
(Wendt-Rasch et al 2004), and type of pesticide application (acute or chronic) (Tlili et al. 2011).
The model of toxic molecule used in the present work was alachlor [2-chloro-N-(2, 6-diethylphenyl)-N-
(methoxymethyl) acetamide] which is extensively used as a pre-emergence chloroacetanilide herbicide applied
to corn and soybeans. This molecule is detected worldwide in surface waters (e.g. Konstantinou et al. 2006;
Sanchez-Camazano et al 2005). Chloroacetanilide herbicides are known to inhibit the elongation of very long
chain fatty acids in plants and algae (Böger et al. 2000) resulting in impaired cell development and division
(Junghans et al. 2003; Vallotton et al. 2008). In our knowledge, the toxicity of alachlor is mainly assessed from
single-species acute toxicity test on green algae (Fairchild et al. 1997), cyanobacteria (Singh and Datta 2005),
bacteria and protozoa (Bonnet et al. 2007). A small number of studies showed the response of phototrophic
biofilm communities (Spawn et al. 1997; Carder and Hoagland 1996).
The objective of this work was to compare the sensitivity of two phototrophic biofilms to 23 days non-inhibitor
photosynthesis herbicide exposure in microcosm experiments. The strategy consisted to monitor the experiment
with natural phototrophic biofilms cultivated in situ at both sites with contrasting physical-chemical
characteristics, and generate biofilms exhibiting different histories and biological trajectories. During the
microcosm experiments, before the alachlor contamination, an acclimatization phase was performed to limit the
bias induced by any stress on biofilm due to changes of environmental conditions. The response of biofilms was
evaluated throughout exposure experiment (at 12 and 23 days) by the use of biomass descriptors (AFDM,
chlorophyll a), diatom community composition and bacterial community structure (PCR-DGGE).
2. Material and methods
2.1. In situ phototrophic biofilms collection
2.1.1. Sampling site characteristics
Two sites were chosen to carry out in situ phototrophic biofilm cultures. Site M on the Montoussé stream is
located in an experimental agricultural watershed basin outlet of 328 ha (Auradé city, South West France,
43x33055.0600N/1x3030.9200E) and site S on the Save River is located in a forested watershed basin (Larroque

2
 207

city, South West France, 43x11043.7700N/00x36028.5900E). As described by Paule et al. (2009), the two
sampling sites exhibit different physical-chemical parameters in terms of chemical quality of water, river bed
type, flow velocity, and average water depth. Site M is reported as highly contaminated by pesticides (Taghavi et
al. 2010) and nitrate (Debenest 2007). However alachlor is not used in this agricultural watershed basin. In the
present study, site S is considered as the unpolluted reference site as opposed to the site M considered as the
polluted site.
2.1.2. Phototrophic biofilms cultures

For the experimental convenience with the microcosm studies, in situ cultures on both sites were achieved during
different periods. Biofilm in situ cultures were carried out during 4 weeks from February 2 to March 1st, 2010 at
the site S and from March 8 to April 8, 2010 at the site M, to cover the pesticide application period in the
experimental agricultural watershed basin (Taghavi et al. 2010). Artificial substrates were immersed in river
water to allow in situ phototrophic biofilm colonization and development. The use of artificial substrates
permitted (i) to reduce the subjectivity of sample collection, (ii) to ease biofilm scraping, and (iii) to compare
two study sites with different physical-chemical characteristics (Cattaneo and Amireault 1992). Moreover, no
natural substrate was available at site M. Cleaned and smooth polyethylene plates (50 * 100 * 5 mm) were
chosen as sampling units (1 plate = 1 replicate). Plates were fixed on stainless–steel ramps encircled by a 5-mm
mesh wire fence (Figure 1). Each ramp supported 8 plates placed vertically and individually fixed by screw on
stainless–steel racks. Three ramps were positioned per sampling site (a total of 24 plates per site), submerged
about 20 cm below the water surface, and placed parallel to water flow, in order to avoid sedimentary deposit on
the polyethylene plates and to promote micro-organisms fixation.

Figure 1: Artificial substrates (polyethylene plates) used for in situ production and collection of natural
phototrophic biofilms (site M on the photography).

2.2. Microcosm study

2.2.1. Experimental setup
Microcosms, adjusted from microcosms described by Debenest et al. (2009) with slight modifications, were
constituted of glass tanks (300 mm × 200 mm × 200 mm), each of them subdivided into three compartments by
vertically glass slides (height: 190 and 180 mm) (Figure 2, front view and top view). Each microcosm was filled
with 9.6 L of river water from the corresponding biofilm sampling sites, previously autoclaved and
supplemented with nutrients (SiO2 at 10 mg L-1, PO43- at 0.7 mg L-1 and NO3- at 15 mg L-1) to favour the biomass
growth and avoid nutrient limitation during the incubation.
A pump (Proflow 600, JBL) was immerged in the last compartment and sent water back in the first compartment
to maintain continuous and homogeneous water circulation. Two stainless-steel racks containing a total of 7
colonized polyethylene plates were immersed in the main compartment (Figure 2). The polyethylene plates were

3
 208

exposed to an overall water velocity of 0.5 cm s-1. The artificial illumination was supplied by the presence of one
neon tube (fluorescent tube TL-15E 14w, 5500 K, Zoomed Aquatic) positioned at 40 cm above of each
microcosm and operated with light / dark period of 12 hours / 12 hours by the use of timer switches. The
illumination was measured as air photosynthetically active radiation (PAR) irradiance level by a flat quantum
sensor (model LI-189, LI-COR, Inc - Lincoln - Nebraska) at a distance from 40 cm, and average recorded values
were 43.4 ± 1.5 µmol m-2 s-1. All microcosms were placed in thermostated chamber at 20 °C.

Figure 2: Schema of one microcosm subdivided into three compartments by vertically glass slides. Water
recirculation is realized with a submerged pump. The polyethylene plates (number of 7 plates) are positioned in
the main compartment.

2.2.2 Experimental design

The microcosms experiment was performed to assess the effect of two nominal different alachlor concentrations,
10 and 30 µg L-1 on natural phototrophic biofilms previously collected in situ. These alachlor concentrations
simulate the sudden increase in river pesticide concentration during flooding events (Spawn et al. 1997). Two 30
days microcosm experiments named S (from March 1st to March 30, 2010) and M (from April 8 to May 7, 2010),
were conducted after in situ biofilm production at sites S and M, respectively. For each microcosm experiment:
(i) two alachlor treated microcosms were designed to assess the effect of alachlor exposure at 10 and 30 µg L-1
on the phototrophic biofilms (two conditions called “A10” and “A30”, respectively), (ii) two alachlor treated
microcosms without biofilm were designed as controls to assess the abiotic fate of alachlor at 10 and 30 µg L-1
(two conditions called “C10” and “C30”, respectively), and (iii) one untreated microcosm with biofilm was
designed as control (C0). This present study did not induce microcosm replications, but pseudo-replications
inside each microcosm (Villeneuve et al. 2010). The microcosm experiments were conducted into two phases, an
acclimatization phase of biofilm plates for 7 days (from T-7 to T0) to limit the bias induced by any stress on

4
 209

biofilm due to changes of environmental conditions, followed by an alachlor exposition phase for 23 days (from
T0 to T23). At time T0, alachlor was added in the four microcosms for treatment at appropriated nominal
concentrations and one microcosm was used as control (no added alachlor). The loss of water volume by
evaporation in microcosms was compensated by addition of distilled water twice a week.
2.2.3. Contamination phase
Alachlor purchased from Sigma-Aldrich (PESTANAL, purity 99%) was dissolved in acetone (NORMAPUR,
VWR) to make a stock solution of alachlor (1 g L-1). Aliquots of this stock solution were then added to
microcosms to obtain tested final concentrations. The final concentration of acetone added in each microcosm
was less than 0.005 % (v/v).
2.2.4. Biofilm sampling procedure
For each microcosms experiment M and S, polyethylene plates were randomly sampled at 4 dates throughout
microcosms, at the start of experiment before (1 plate at T-7) and after (1 plate at T0) the acclimatization phase, at
12 days after the start of the alachlor exposition phase (3 plates / replicates at T12), and at 23 days corresponding
to the end of microcosm experiment (3 plates / replicates at T23). Biofilms were removed from plates by scraping
with a microscope blade previously treated with alcohol. Biofilms were suspended in 50 mL of tap water
previously filtered through a 0.2 µm pore size filter (cellulose acetate membrane, Whatman) and homogenized
(tissue homogenizer at 13,500 rpm, Ultra Turrax, T25). Biofilm suspension was aliquoted for the analyses of
biomass descriptors, diatom diversity, and bacterial community structure by PCR-DGGE.
2.3. Physico-chemical analysis
Water samples were collected to check the physico-chemical characteristics throughout river phototrophic
biofilm cultures and microcosm studies. Temperature, pH, and conductivity values were measured in situ with
specific probes as described by Paule et al. (2009). Nutrient concentrations (SiO2, PO43- and NO3-) were
measured as described by Paule et al. (2009). For the alachlor residual concentrations, the samples were filtered
through Whatman GF/F glass fibre filters (0.7 µm pore size) and analyzed at “Laboratoire Départemental de
l’Eau” (Toulouse, France), using high performance liquid chromatography coupled tandem to mass spectrometry
(HPLC-MS-MS, Thermo Fisher, model E-Quan TSQ Quantum ultra) with ionization electron spray source and
equipped with a pre-concentration column (Thermo Fisher Hypersil GOLD C18, 12 µm particle size, 20 x 2.1
mm), by a direct sample injection. The sample volume was 2 mL. The alachlor separation was monitored using a
Thermo Fisher Hypersil GOLD C18 (3 µm particle size, 50 x 2.1 mm) column.
2.4. Biofilm characterization
2.4.1. Biomass descriptors
From an aliquot of initial biofilm suspension, the dry mass (DM) and the ash free dry mass (AFDM) (aliquot of
20 mL), and chlorophyll a (aliquot of 5 mL) were measured as described by Paule et al. (2009).
2.4.2. Diatom community composition
Diatom composition was estimated from an aliquot of 5 mL of the initial biofilm suspension homogenized and
preserved in formalin solution (3 %) and stored in the dark until analysis at “Cemagref” (Bordeaux, France).
Identification and counting of diatoms of 400 frustules were performed as described previously Roubeix et al.
(2011).
2.4.3. Microbial structure analysis

5
 210

After centrifugation (12,000 g at 4°C for 20 min, Heraeus Multifuge) of an aliquot of 20 to 50 mg dry mass of
the initial biofilm suspension, the pellet was stored at -80°C until further analysis (Lyautey et al. 2005). Genomic
DNA extraction was performed on the pellet using the DNeasy Plant Mini Kit according to the manufacturer’s
protocol (Qiagen Laboratories) and the extracted DNA integrity was checked as described by Paule et al. (2009)
using the precision Molecular Mass Ruler (Fermentas). The 16S rDNA was amplified using primers 341F-GC
and 907R (Muyzer et al. 1997) designed to be specific to most bacteria (Muyzer et al. 1997). Amplification was
carried out using an Eppendorf Mastercycleur following a protocol described elsewhere (Lyautey et al. 2005)
with slight modifications. PCR amplification was conducted in a 50 µL reaction volume containing 0.48 µM of
each primer, 2.5 U Taq DNA polymerase (Promega) 1x PCR buffer, 2.5 mM MgCl2 (Promega), and 200 µM
dNTP (Promega) and 50 ng of extracted DNA as template. Amplified product concentrations were quantified as
described previously using precision the Molecular Mass Ruler (Fermentas) (Lyautey et al. 2005). Denaturing
gradient gel electrophoresis (DGGE) was carried out as described by Paule et al. (2009) using 500 ng of PCR
products and a gradient of denaturant ranging from 30 to 70 % (100 % denaturant is 7 M urea and 40 %
deionised formamide). For practical purposes (only 20 samples can be processed on each DGGE gel), the 3
replicates of each sample were shared on two different DGGE gels, using common samples between different
gels. After electrophoresis, the gel was stained and the gel image captured and analyzed as described previously
(Paule et al. 2009).
2.4. Data analysis
Biomass inhibition (I) and the specific growth rate (µ) were calculated for each experimental condition in
according to Debenest et al. (2009). Matrix of diatom abundance data and binary data of DGGE profiles were
constructed from the Bray-Curtis similarity index and analyzed by non-metric multidimensional scaling (NMDS)
analysis as described elsewhere (Paule et al. 2009) with slight modifications. NMDS analyses were performed
using Primer v6 software (PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom). Previously, a log-transformation (log) was
applied on diatom abundance data. In order to avoid methodological biases due to DGGE inter-gel variability,
each gel were analyzed separately. DGGE bands (defined as operational taxonomic units [OTUs]) were scored
as present or absent from DGGE gel analysis.
Statistical analyses of NMDS were run using an analysis of similarity (ANOSIM) via PRIMER v6 software
(PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom). The analysis of similarity reports global R and p- values. A global R
close to 1 indicates a significant effect of incubation site and the p value reflects the statistical significance of the
global R (Clarke, 1993). The statistical significance of the global R was considered at p < 0.001.
The richness value (S) was calculated as the number of OTUs for each sample from DGGE data or the number
of diatom species from each sample.
After checking of the homogeneity of variances and normality of the data, the difference in physico-chemical
parameters between microcosm were tested by ANOVA (confidence interval 95 %), followed by comparison
with HSD turkey-test. The difference in biomass descriptors and the number of OTUs among samples during
experiments were detected with the Mann Whitney test using SPSS 15.0 software for Windows. Results were
considered statistically different at p ≤ 0.05.

6
 211

3. Results
3.1. Physico-chemical parameters
Physico-chemical parameters of river water from both sites (M and S) are summarised in
Table 1. Site M recorded higher nitrate and silica concentrations and conductivity values than
site S (p < 0.05). The temperature, pH and orthophosphate concentrations were similar for
both sites M and S (p > 0.05).

Site Temperature Conductivity NO3- PO43- SiO2

pH
(°C) (µS cm-1) (mg L-1) (µg L-1) (mg L-1)
A 7.7 ± 2.8 7.8 ± 0.3 859.1 ± 13.2 43.2 ± 0.8 16.3 ± 28.3 8.4 ± 0.9
L 6.2 ± 2.4 7.8 ± 0.3 144.6 ± 5.2 9.9 ± 2.4 4.8 ± 4.2 4.5 ± 1

Table 1: Physical-chemical characteristics (mean ± SD, n = 3) of river water for both sites M
and S, during the periods of in situ phototrophic biofilm cultures.

Comparison of physico-chemical parameters (Tableau 2) between microcosms at the initial

state (T-7) revealed low difference (p < 0.05) intra and inter both M and S microcosms
experiments. A technical problem in the preparation of nutrient solution induced some no
significant difference (p > 0.2) of silica concentrations during the S microcosms experiment.

Microcosm Temperature Conductivity NO3- PO43- SiO2

pH
experiment (°C) (µS cm-1) (mg L-1) (µg L-1) (mg L-1)
A 21.6 ± 0.8 8.3 ± 0.1 499.2 ± 28.9 46.7 ± 2.4 570 ± 89.4 10.5 ± 0.3
L 19.6 ± 0.5 8.6 ± 0.2 182.7 ± 11.6 15.7 ± 0.5 671 ± 90.4 35.6 ± 16.9

Table 2: Mean (SD) of physical-chemical parameters values of water samples collected at the
beginning of the experiment (T-7) within the five microcosms for each M and S microcosm
experiments.

3.2. Residual alachlor level

Residual alachlor level curves in microcosms for the two sampling sites and for the two
alachlor concentration treatments are shown in Figure 3A and B. The curves in Figure 3A
indicated an exponential disappearance of alachlor over time for the M experiment, thus a
first-order model was used to estimate the rate of disappearance and the half-life of alachlor
(Stasinakis et al. 2009). At alachlor 10 µg L-1, the half-lives of alachlor was 13.5 and 13 days
for control (without biofilm) and treated microcosms, respectively. At 30 µg L-1, the half-lives
of alachlor were 12.5 and 7.5 days for control and treated microcosms, respectively. Figure

7
 212

3B showed an erratic evolution of alachlor concentrations over time for S experiments. The
profiles of alachlor fate were identical for all conditions control and treated, associated to
different alachlor levels. The residual alachlor concentrations firstly show an increase and
then a disappearance. The residual alachlor concentrations at the end of the incubation period
were closed between the experiments M and S, control and treated, and comprised between
3.8 to 5.8 µg L-1 and 4.9 to 9.9 µg L-1 for treatments at 10 and 30 µg L-1, respectively.

40 40
C10 C30
A C30 B C10
Alachlor concentration (µg L-1)

Alachlor concentration (µg L-1)

A10 A10
30 A30 30 A30

20 20

10 10

0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25

Time (day) Time (day)

Figure 3: Evolution of residual alachlor concentrations within control (alachlor without
biofilm, C10 and C30) and treated (biofilms with alachlor, A10 and A30) microcosms over
experiments M (A) and S (B), at sampling dates from 0 to 22 days (T0, T7, T10, T16 and T22).
T0 indicated the start of the alachlor exposure. Detection limit: 0.005 µg L-1.

3.3. Biomass descriptors

After 4 weeks of river in situ development, biofilms from site S exhibited higher AFDM
levels (0.4 mg cm-2) than biofilms from site M (0.31 mg cm-2) (p > 0.05) (Figure 4).
Conversely, biofilms collected at site M exhibited higher chlorophyll a levels (6.7 µg cm-2)
than biofilms collected at site S (4.3 µg cm-2) (p > 0.05). The acclimatization phase in
microcosms didn’t induce significant change of biomass descriptors regardless of experiments
considered (M and S) (p > 0.05).

8
 213

Figure 4: Average ± SD values (n = 3) plot ash free dry mass (AFDM) and chlorophyll a
during the incubation period for both M (A) and S (B) microcosms experiments for
phototrophic biofilm samples collected before the acclimatization phase (day -7) and
throughout microcosm experiments at 0, 12 and 23 days of incubation within control
(biofilms without alachlor, C0) and alachlor treated (A10 and A30) microcosms. T-7 indicated
the end of river in situ culture and the start of the acclimatization phase and T0 indicated the
start of the alachlor exposure. Parameters indicated by different letters are significantly
different (p ≤ 0.05).

No significant variation induced by alachlor treatment and microcosm incubation period was
observed on the chlorophyll a and AFDM levels for M microcosm experiment. Both variables
(AFDM and chlorophyll a) were not correlated (C pearson = -0.544, p = 0.011) during this
experiment.
Inversely, for the S microcosms experiment, differences were only observed for both
chlorophyll a and AFDM levels at 23 days of incubation (p < 0.001) for both alachlor
concentrations tested (10 and 30 µg L-1). Biomass growth inhibitions were observed for
chlorophyll a (55 and 75 % for 10 and 30 µg L-1, respectively) and AFDM (27 and 74 % for
10 and 30 µg L-1, respectively) (data not shown). Both variables (AFDM and chlorophyll a)
were correlated (C pearson = -0.445, p = 0.011).

9
 214

3.4. Bacterial community structure

After 4 weeks of river in situ development, bacterial community structure of biofilms from
sites M and S exhibited 50 % of homology (data not shown) associated to closed average
number of OTUs (24 and 25.3, respectively).
For microcosm experiments, analysis of DGGE banding patterns revealed an average of 47
bands (OTUs) per DGGE gel. The number of OTUs obtained for each experimental
conditions are presented in Table 3. The average number of OTUs per sample varied from 33
to 18 and 25 to 18 during the M and S microcosm experiments, respectively. The number of
OTUs observed on the DGGE profiles revealed significant effect of alachlor at 12 days for the
S experiment (p > 0.05).

Microcosm
Condition T-7 T0 T12 T23
experiment
A C0 24.0 ± 0.0 18.3 ± 0.6 21.0 ± 1.0 23.7 ± 1.2
A10 23.7 ± 1.2 20.7 ± 1.5
A30 22.0 ± 0.0 21.3 ± 1.5
L C0 25.3 ± 0.6 20.0 ± 1.7 30.3 ± 0.6 20.3 ± 0.6
A10 28.6 ± 0.6 31.7 ± 0.6
A30 20.3 ± 1.2 31.3 ± 2.1

Table 3: Number of bands (OTUs) obtained from DGGE pattern analysis (mean ± SD, n = 3)
for bacterial communities from biofilms collected at the beginning of the experiment (T-7) and
throughout M and S microcosms experiments at 0, 12 and 23 days of incubation (T0, T12 and
T23) within control (C0) and alachlor treated (A10 and A30) microcosms. T-7 indicated the
end of river in situ culture and the start of acclimatization phase and T0 indicated the start of
alachlor exposure.

NMDS analysis carried out on the binary data from DGGE profiles revealed that bacterial
communities for both M and S microcosm experiments were structured by the incubation time
(ANOSIM, global R = 1, p = 0.001; global R = 0.98, p = 0.002, for both M and S experiments,
respectively) and alachlor treatment (ANOSIM, global R = 1, p = 0.001; global R = 1, p =
0.001, for both M and S experiments, respectively) (Figure 5). The stress values of final
configuration were 0.09 for both experiments. The proximity between replicates on the plot
revealed an important similarity of the DGGE banding patterns. NMDS analysis showed that
differentiated bacterial community structures were strongly mediated by both incubation
period and alachlor treatment.

10
 215

Figure 5: Two dimensions representation plot of non-metric multidimensional scaling

(NMDS) analysis of DGGE banding patterns for bacterial communities from biofilms
collected at the beginning of the exposition period (T0) and throughout M (A) and S (B)
microcosm experiments at 12 and 23 days of incubation (gray color for T12 and black color
for T23) within control (C0) and alachlor treated (A10 and A30) microcosms. T-7 indicated the
end of river in situ culture and the start of acclimatization phase and T0 indicated the start of
alachlor exposure. Thick circles correspond to a similarity of 80 %. The letters a, b and c
indicate replicates from same experimental condition.

3.5. Diatom community structure

A total of 18 diatom species were identified occurring at more than 3 % relative abundance in
at least one sample, in all the samples (Table 4) and were considered as characteristic of each
developed diatom community.

Microcosm
Day Condition ADMI NLAN SBRE ENMI FCVA NGRE NPAL UULN FCAP GMIC CPLA PTLA NDIS MVAR ADBI NRCH PLFR GPUM
experiment
A -7 84.0 _ _ _ 0.1 _ _ 3.4 0.1 3.4 3.1 1.9 0.3 _ _ _ _ 2.0
0 83.3 _ 0.1 _ 0.1 _ _ 4.3 _ 1.3 5.0 1.3 1.0 _ _ _ _ 1.6
12 C0 90.1 _ _ _ _ _ _ 2.8 _ 1.3 2.0 2.4 0.3 _ _ _ 0.1 0.5
A10 89.3 _ _ _ _ _ _ 3.8 _ 0.8 1.4 2.1 0.6 _ _ _ 0.1 0.9
A30 88.6 _ _ _ 0.1 _ 0.1 2.6 _ 1.4 2.4 1.4 0.5 _ _ _ _ 1.5
23 C0 89.8 _ _ _ _ _ 0.1 3.8 _ 0.5 1.4 2.3 0.1 _ _ _ _ 0.8
A10 88.3 _ _ 0.1 _ _ 0.1 4.5 _ 1.4 1.9 1.4 0.3 _ _ _ _ 0.9
A30 89.6 _ 0.1 _ 0.1 _ _ 2.6 _ 1.3 1.8 1.9 _ _ _ _ _ 1.1
L -7 3.2 (0.4) 24.4 (0.2) 12.1 (0.2) 7.4 (2.3) 7.3 (3.5) 6.4 (1.2) 4.5 (2.1) 1.5 (1.4) 5.0 (1.1) 1.8 (0.4) 0.9 (0.2) 0.5 (0.0) 1.5 (0.0) 2.4 (0.2) 1.8 (1.8) 2.6 (0.5) 0.9 (0.2) 0.1 (0.2)
0 7.1 (1.6) 17.4 (2.7) 8.8 (0.7) 8.6 (0.5) 6.8 (1.1) 6.4 (0.9) 8.5 (1.4) 0.3 (0.4) 5.8 (3.2) 2.3 (1.1) 1.3 (0.4) 1.3 (0.7) 2.8 (1.1) 2.6 (0.9) 2.9 (0.5) 2.0 (0.0) 1.3 (0.7) 0.4 (0.2)
12 C0 5.9 (1.2) 16.6 (1.9) 8.8 (1.4) 11.5 (3.5) 6.8 (1.4) 6.9 (2.7) 2.8 (2.5) 1.3 (0.4) 4.6 (1.6) 4.0 (1.1) 1.0 (0.0) 0.5 (0.0) 3.4 (1.2) 2.4 (0.2) 2.0 (1.4) 3.4 (0.5) 2.0 (0.4) 0.5 (0.7)
A10 9.5 (1.1) 19.0 (2.8) 14.3 (0.0) 6.5 (0.4) 6.8 (1.4) 4.8 (0.0) 5.0 (0.7) 1.8 (0.0) 5.1 (1.2) 1.9 (0.2) 0.8 (0.4) 0.9 (0.5) 2.1 (0.9) 2.1 (0.2) 2.3 (0.7) 1.4 (0.9) 1.8 (0.0) 0.3 (0.4)
A30 5.1 (0.9) 17.9 (2.3) 11.4 (0.2) 7.0 (0.7) 6.9 (2.3) 7.0 (3.9) 6.0 (2.1) 1.4 (0.2) 5.3 (0.7) 2.1 (0.2) 0.5 (0.4) 1.9 (1.9) 2.1 (0.5) 2.9 (0.5) 2.3 (1.1) 2.4 (0.5) 1.6 (0.9) 0.4 (0.5)
23 C0 8.6 (0.9) 17.1 (0.5) 11.9 (2.3) 6.0 (0.7) 4.5 (1.1) 6.8 (1.4) 4.8 (2.1) 2.1 (0.2) 5.6 (1.2) 2.4 (0.9) 0.8 (0.4) 0.4 (0.2) 2.1 (0.5) 1.8 (1.8) 3.1 (0.5) 1.6 (0.9) 3.3 (1.1) 0.5 (0.4)
A10 5.0 (0.7) 21.8 (1.4) 11.0 (3.9) 11.0 (3.2) 6.3 (0.4) 3.6 (0.9) 5.3 (0.4) 3.4 (0.5) 4.3 (1.4) 1.9 (0.9) 1.3 (1.1) 1.3 (0.0) 1.4 (0.9) 3.5 (0.4) 2.6 (0.2) 1.1 (0.9) 1.6 (0.9) 0.0 (0.0)
A30 38.5 (12.4) 12.4 (3.0) 5.4 (0.9) 5.4 (3.0) 4.1 (2.3) 3.8 (1.1) 4.8 (1.4) 1.5 (0.7) 2.8 (2.5) 2.0 (0.4) 0.8 (0.4) 0.8 (0.4) 0.8 (0.7) 1.4 (1.6) 0.8 (0.4) 0.6 (0.2) 1.0 (0.7) 0.0 (0.0)

Table 4: Mean (SD) relative abundance of dominant species representing more than 3%
relative abundances in at least one sample, in the diatom communities of biofilms collected at
the beginning of the experiment (T-7) and throughout M and S microcosms experiments at 0,
12 and 23 days of incubation (T0, T12 and T23) within control (C0) and alachlor treated (A10

11
 216

and A30) microcosms. T-7 indicated the end of river in situ culture and the start of
acclimatization phase and T0 indicated the start of alachlor exposure.
ADMI: Achnanthidium minutissimum (K_z.) Czarnecki; NLAN: Navicula lanceolata
(Agardh) Ehrenberg; SBRE: Surirella brebissonii Krammer & Lange-Bertalot var.brebissonii
; EMIN: Eunotia minor; FCVA: Fragilaria capucina Desmazieres var.vaucheriae (Kutzing)
Lange-Bertalot; NIGR: Nitzschia gracilis Hantzsch ; NPAL: Nitzschia palea; UULN: Ulnaria
ulna (Nitzsch.) Comp_e; FCAP: Fragilaria capucina Desmazieres var.capucina; GMIC:
Gomphonema micropus K_zing var. micropus; CPLA: Cocconeis placentula; PTLA:
Planothidium lanceolatum (Brebisson ex K_zing) Lange-Bertalot; NDIS: Nitzschia dissipata
(Kutzing) Grunow var.dissipata; MVAR: Melosira varians Agardh; ADBI: Achnanthidium
biasolettianum (Grunow in Cl. & Grun.) Lange-Bertalot; NRCH: Navicula reichardtiana
Lange-Bertalot var. reichardtiana; PLFR: Planothidium frequentissimum (Lange-Bertalot)
Lange-Bertalot; GPUM: Gomphonema pumilum (Grunow) Reichardt & Lange-Bertalot.

Overall, the diatom communities from S experiment exhibited higher dominant specie number
(18 diatom species) (with relative abundance > 3% at least one sample) (Table 4) than the
diatom communities from M experiment (13 diatom species). The diatom community from S
experiment was dominated by Navicula lanceolata (Agardh) Ehrenberg (NLAN) (24.4 %)
and Encyonema minutum (Hilse in Rabh.) D.G. Mann (ENMI) (7.4 %), although the diatom
community from M experiment was mainly dominated by Achnanthidium minutissimum (K-z)
Czarnecki (ADMI) (84 %). ADMI diatom species observed in the samples of both M and S
experiments exhibited different morphotypes and were considered as different in the NMDS
analysis. For the M experiment, dominant diatom species composition and proportions did not
differ significantly between control and treated biofilms (Figure 6) (ANOSIM, global R = -
0.389, p = 0.667). Similarly, diatom community didn’t present temporal variations (ANOSIM,
global R = -0.333, p = 0.92) with the dominant presence of ADMI (Achnanthidium
minutissimum (Kütz.) Czarnecki) (relative abundance average of 89 % over study) (Table 4).
For communities from S experiment, diatom structure seemed to be conditioned by both the
age of maturation during the incubation and alachlor treatment (ANOSIM, incubation time:
global R = 0.389, p = 0.018; alachlor treatment: global R = 0.583, p = 0.074). Similar results
were observed for the S experiment with the presence of Achnanthidium minutissimum (K_z.)
Czarnecki (ADMI), Navicula lanceolata (Agardh) Ehrenberg (NLAN), Surirella brebissonii
Krammer & Lange-Bertalot var.brebissonii (SBRE), Eunotia minor (ENIM), Fragilaria
capucina Desmazieres var.vaucheriae (Kutzing) Lange-Bertalot (FCVA), Nitzschia gracilis
Hantzsch (NIGR) and Nitzschia palea (NPAL), excepted after 23 days of incubation for the
initial 30 µg L-1 alachlor concentration which tended to shift the structure (Figure 6). These
communities were characterised by increasing abundances of ADMI (38.5% average) (Table

12
 217

4 and Figure 6) and the occurrence of higher proportion of abnormal forms of ADMI diatom
frustules (19.1 ± 2.7 %).

Figure 6: Results of Principal Component Analysis (PCA) with projection of the variables
(diatom species) on the component planes (blue circle and write) carried out on log-
transformed diatom abundance data from biofilms collected at the beginning of the
experiment (T-7) and throughout M and S microcosms experiments at 0, 12 and 23 days of
incubation (T0, T12 and T23) within control (C0) and alachlor treated (A10 and A30)
microcosms. T-7 indicated the end of river in situ culture and the start of acclimatization phase
and T0 indicated the start of alachlor exposure. Specie identifications: refer to caption of Table
4 for the letters meaning. The letters a, b and c indicate replicates from same experimental
condition.

4. Discussion
The objective of the present study was to evaluate the response of natural phototrophic
biofilms with different histories and origins to alachlor contamination in microcosm. Biofilms
were produced in situ on artificial supports (polyethylene plates) for 4 weeks at two sites with
contrasting physical-chemical characteristics. The choice of the two study sites proved to be
relevant for the purpose of this work since different environmental conditions were recorded
during the in situ incubation period. Site M, located in an agricultural watershed basin, was
characterized by high levels of pH, conductivity, and nitrate concentrations. Site S, located in
a forested watershed basin, was mainly characterized by its higher total phosphorus
concentrations, as reported previously by Paule et al. (2009). The natural biofilms collected in
situ exhibited similar biomass levels (AFDM and chlorophyll a) and number of OTUs but
different profiles of bacterial community structure, and diatom specie composition. The

13
 218

AFDM and chlorophyll a levels in this study are consistent with levels recorded on glass slide
supports at both same sites in a previous study (Paule et al. 2009). Artificial supports made of
polyethylene were preferentially chosen for the in situ production of biofilm (Paule et al.
2011) to limit the occurrence intra-site heterogeneity (Townsend 1989), to facilitate the
collect of biofilms, their transfer and their fixation in the microcosms and to control the
maturation and the age of biofilms.
In river, the occurrence of the chemical exposure and physical perturbation and the complex
interactions between the biofilm and its environment (Geiszinger et al. 2009) suggest the
necessity of laboratory approaches to evaluate the response of biofilm to perturbation.
Jurgensen and Hoaglang (1990) observed that the changes of hydrodynamic conditions were
the predominant factor influencing the phototrophic biofilm structure compared to pulse
atrazine exposure. Lynch et al. (1985) showed similar results for seasonal variations
compared to atrazine contamination.
The ecotoxicological experiment has been preferentially realized in microcosm under stable
and controlled experimental conditions to limit the variations of environmental conditions
which may interfere with the response of phototrophic biofilms exposed to alachlor. The
choice of the exposure period length (23 days) was based half-life values in aquatic medium
(e.g. in Graham et al. 2000; Ensz et al. 2003). During the period of incubation in the
microcosms, the maintaining of physical-chemical characteristics for each experiment
revealed that the changes observed within biofilms may be probably caused by the herbicide
exposure. The initial river water used was characterized by high concentrations of phosphates
(>500 µg L-1 of PO43-) and nitrogen levels (> 15 mg L-1 of N03-), which could be considered
as eutrophic trophic level (Dodds et al. 1998). The physical-chemical conditions were
reproducible both over time and between units of common and different treatments. Residual
alachlor concentrations detected within control microcosm revealed the presence of alachlor
in the river water from both sites M and S, despite the absence of alachlor use in the
agricultural watershed basin of site M and the low pesticide contamination well known at site
S (Debenest 2007).
4.1. No microbial response during the acclimatization phase
Some authors observed a lower response of biofilms to perturbation if communities have
previously been perturbed by a stress (Kasai 1999; Niderlehner and Cairns 1992; Tlili et al.
2008). In this context, the strategy was to monitor an acclimatization phase to limit the bias
induced by any biofilm stress due to changes of environmental conditions. Pesce et al. (2006)
observed no significant biofilm response to the herbicide presence during the first six days.

14
 219

The authors supposed that this latency phase reflected the time for acclimatization of biofilm
to new experimental conditions. In the present study, no change of biofilm was recorded in
terms of biomass (AFDM and chlorophyll a) despite the confinement of biofilm in the
microcosms with high nutrient concentrations and temperature values which could stimulate
the growth and to lead to modifications of interaction between prokaryotic and eukaryotic
micro-organisms, such as competition for the resources (Caron 1994). This absence of
modification during the acclimatization phase could indicate that the biofilms collected in situ
exhibited mature development state and, then mainly controlled by autogenic factors.
4.2. Alachlor contamination during the microcosm experiment
Initial alachlor concentrations measured in the microcosms were closed to nominal
concentrations. Despite an identical finality of the alachlor levels, the comportment and
kinetic profiles were different between the both experiments M and S.
For the M experiment, alachlor concentrations followed similar profiles of removal whatever
treatments and initial concentrations associated to different kinetics. The removal of alachlor
observed in the microcosm without biomass (C10 and C30) exhibited half-lives of 13.5 and
12.5 days, which could reflect photodegradation, adsorption to microcosm material, and
volatilization mechanisms (Chesters 1989). Spawn et al. (1996) with the 21-day exposure
duration observed a declining of alachlor concentration. The authors underline that this
observation was consistent with the 15 days hydrolysis half-life of alachlor (Chiron et al.
1995). Loss of alachlor in microcosms without biofilm are unlikely not due to biodegradation
mechanisms because the river water used for the microcosms were previously autoclaved. At
alachlor 30 µg L-1, the difference observed between the treatments with and without biomass,
indicated an impact of the presence of biofilm on the fate of alachlor, with lower half-lives of
7.5 days. This loss detected in presence of biofilm may be caused by biodegradation and
adsorption mechanisms. In aquatic medium, alachlor is well known to be mainly transformed
by micro-organisms. Moreover no change of the amount of biomass was detected over time.
No difference was recorded for the 10 µg L-1 initial concentration, the half-life values were
closed with or without biomass in the microcosms, reflecting no effect of the presence of
biofilm on the chimiodynamic of alachlor.
For the S experiment, the fate of alachlor in absence of biofilm followed identical profiles
over time whatever the concentration tested. After the addition of alachlor, we observed an
increase, then decrease. The dramatic decrease may illustrate adsorption mechanism of
alachlor by the biofilm and the phase of increase which was not observed for the M
experiment may reflect the mix between the added alachlor (nominal concentration of 10 and

15
 220

30 µg L-1) and the initial alachlor concentration from river water (5 µg L-1) and the release of
alachlor by biofilms. This release by the biofilm could be associated to detachment of
biomass as observed on value plot of ash free dry mass. At alachlor 10 µg L-1, the difference
with or without biofilms are only recorded the first days supposing adsorption mechanisms,
and at alachlor 30 µg L-1, the residual alachlor levels are continuously lower over time in
presence of biofilm than the residual alachlor level in absence of biofilm. The decrease of
residual alachlor levels in the first days of contamination may reflect adsorption phenomena.
The supposed biodegradation over time should be verified by the analysis of metabolites such
as OA (Oxanilic Acid) and ESA (Ethane Sulfonic Acid), well known in the literature as
transformation products by micro-organisms (Graham et al. 2000). The results seem to
suggest that the biofilms collected at site S presented higher absorption capacity than the
biofilms from site M. Inversely the biofilms collected at site M seemed to present a higher
biodegradation capacity than the biofilms from site S. The capacity of adsorption may be
induced by several parameter including physical structure, compactness, composition of
exopolymer… (Duong et al. 2010), and the biodegradation capacity may depend on
composition of species. This high absorbent power may hypothetically improve the toxicity of
alachlor by closer contact between micro-organisms and polluants. The fate and the partition
of herbicide are very important in potential toxicity of polluant.
4.3. Impact at community-level of alachlor on phototrophic biofilms
Our result suggested that the AFDM of biofilm from only site S was damaged by the alachlor
presence at both tested concentrations observed at 12 and 23 days. This result is in coherence
with previously studies (Spawn et al. 1997) which recorded lower chlorophyll a levels at
alachlor concentrations of 10 µg L-1 and inhibition of growth. The nature of effect is
associated to the action mode of alachlor (Böger et al. 2003).
In this work, bacterial and diatom specie communities are controlled by both biofilm
maturation and alachlor presence. It is difficult to distinguish the effects caused by these two
factors. Alachlor didn’t induce change in the diatom specie composition excepted for the
alachlor 30 µg L-1 treatments at 23 days, which is characterized by an increase of
Achnanthidium minutissimum (ADMI) diatom abundance accompanied by the increase of
abnormal frustule forms. ADMI diatoms are colonisers and motile life-forms, indicators of
good water quality, and known to be tolerant to herbicide at low herbicide concentrations and
sensitive to high herbicide concentrations level (Pérès et al. 1996; Morin et al. 2009; Roubeix
et al. 2011), as observed in the present study. Moreover, in consistence with our results,
Roubeix et al. (2011) observed significant abnormal frustule forms number at higher alachlor

16
 221

contamination levels. It is interesting to note that the ADMI diatom specie detected in the
samples of biofilms collected to site M, exhibited different morphotypes and tolerant to
alachlor. Thus, it seems important to consider the different morphotypes of diatom species in
the ecotoxicological studies and their use as bio-indicators of pesticide pollution.
In the present work, despite maturation levels supposed similar, the biofilms of two sites M
and S presented different responses to alachlor presence. The biofilm from site M, with a poor
water quality, seemed to be less influenced by the presence of alachlor. Inversely, the biofilm
from site S, with a good water quality, seemed to be the most reactive to alachlor. Moreover,
the chimiodynamic of alachlor was different in according to site of incubation.
Several hypotheses could explain this difference : (i) the composition, thickening, cohesion,
composition of EPS, (ii) the presence of tolerant species, and (iii) the operating conditions
which were similar between site M and microcosms (as indicated by the flow and nitrogen
concentrations). The presence of alachlor and the pesticide pollution such as metolachlor
(similar herbicide family to alachlor) well known at site M could induce co-tolerance
processes to alachlor during our experiments assigned to PICT (pollution-induced community
tolerance) concept as described by previous studies, driving to a selection of tolerant species
(Pesce et al. 2010). The physical structure and the presence or not of tolerant species are
linked to the trajectory of biological evolution in biofilms followed during their developments
leading to a structure influenced by autogenic and allogenic factors. Previous studies showed
that biofilms produced under fast current, as the case of biofilm from site S, were highly
compact and often more resistant to perturbations (Stevenson 1996).
In the present study, the sensitivity of descriptors was different. For the S experiment, the
effects on the biofilm growth are detected via the descriptors of biomass at 12 days and for
both concentrations. The effects of alachlor on the diatom communities are detected at 23
days and at higher alachlor levels. No change on species composition was revealed although
experiment which could be explained by the decrease of residual alachlor concentration over
time.
5. Conclusion
As most of long term ecotoxicological experiments, it is difficult to distinguish the effects of
natural maturation and growth of the effects of perturbation. In the present study, the response
of biofilm seems to depend on the trajectory and history of biofilms, but it is impossible to
associate the response to contrasting physical-chemical characteristics. This study shows the
importance of operating conditions and experimental design during ecotoxicological
experiment in microcosms. Moreover, this work improves complementary data in the use of

17
 222

diatoms as bio-indicator of pesticide pollution, and the interest to consider the different
morphotypes of species. In according to Sabater et al. (2007), descriptors of biomass are
generally more pertinent to visualize the short term effect, although descriptors of structure
preferentially revealed the long term effects. To evaluate the toxicity of polluant, it is
important to associate combinations of descriptors of different biological organization levels
(organisms, populations and communities), integrating histories, the fate of herbicide and the
action mode of molecule.
Acknowledgements
This work was funded by the French National Programme EC2CO – Environmental
Microbiology - and by the Midi-Pyrénées Council Programme of the Pyrenean working
community. We thank J. Ferriol and D. Dalger for assistance with the DGGE and water
chemistry analysis, respectively. We also thank the “Association des Agriculteurs d’Auradé”
for the access to site M.

18
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 223

III.3 Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide du-

rant ses premiers stades de développement
Résumé de l’article en préparation « Comparative responses of river biofilms at
the community-level to common organic solvent and herbicide exposure » par A.
Paule, V. Roubeix, G.D.W. Swerhone, B. Lauga, R. Duran, F. Delmas, E. Paul,
J.R. Lawrence et J.L. Rols. (Article 5)

III.3.1 Approche expérimentale

Des cultures de biofilms ont été réalisées en mini-bioréacteurs photosynthétiques du type
bioréacteur annulaire rotatif durant 5 semaines. Ces mini-bioréacteurs, présentés dans la
partie II Matériel et méthodes, sont bien connus pour être de très bons outils dans
l’évaluation des effets d’un stress sur le développement du biofilm de rivière (Lawrence et al.
2000). Trois conditions différentes ont été testées, en triplicats (cf. partie II Matériel et
méthodes), un contrôle (sans exposition à l’alachlore) et deux expositions à 1 et 10 µg.L−1
d’alachlore durant toute la culture, y compris durant la première phase de colonisation des
supports. Les mini-bioréacteurs sont alimentés en continu avec de l’eau de rivière (South
Saskatchewan River, Canada) à un débit de 500 mL.j−1 à l’aide de pompes péristaltiques.
A l’issue des 5 semaines de culture, les biofilms sont analysés d’un point de vue structurel
(microscopie confocale, biomasse, chlorophylle a, DGGE et T-RFLP, composition en diato-
mées) et fonctionnel (Biolog, production primaire). Le choix des 5 semaines pour la durée de
l’expérimentation est fondé sur une étude antérieure (Lawrence et al. 2000), et sur l’étude
précédente qui laisse penser que cet âge de biofilm permet d’atteindre sa maturité.
Pour la mise en œuvre d’expérimentations en écotoxicologie, de part leurs propriétés
souvent hydrophobes, les pesticides sont dans la plupart des cas dissous dans un solvant
organique (méthanol, acétone...). C’est ce mélange pesticide et solvant organique qui est
ensuite additionné au milieu de culture utilisé lors des expériences. Peu d’études intègrent,
parmi les conditions testées en parallèle, un traitement avec le solvant organique seul. La
présence du solvant peut ainsi engendrer différents effets sur les communautés, antagonistes
ou synergiques, et biaiser ou même masquer les effets d’un polluant (Stratton 1985 ; El Jay
1996a). La plupart des études sur les solvants organiques se focalisent sur les effets induits sur
des monocultures d’algues (algues bleu-vertes, Stratton 1985 ; algues vertes, El Jay 1996b,
Ma et Chen 2005) des communautés phytoplanctoniques (Bérard 1996). Ces études sont
souvent associées à des mesures de valeurs d’EC50 , et très rarement réalisées à l’échelle des
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 224

communautés. A notre connaissance aucune étude n’a été faite sur l’impact du méthanol à
cette concentration là sur les biofilms phototrophes à l’échelle des communautés.
Durant cette étude, en parallèle des traitements à l’alachlore, certains mini-bioréacteurs
sont contaminés avec 25 µg.L−1 (0,025 % v/v) de méthanol. Les conditions expérimentales
restent par ailleurs les mêmes que pour le traitement avec l’alachlore. De même, les coupons
des mini-bioréacteurs sont prélevés à 5 semaines pour caractériser les biofilms phototrophes.

III.3.2 Principaux résultats et discussion

L’alachlore engendre des effets concentration-dépendantes sur les communautés comme
préalablement souligné lors de précédentes études (Spawn et al. 1997) :
. A 1 µg.L−1 , la présence de l’alachlore induit une réduction significative de la biomasse to-
tale. L’ensemble des autres paramètres, qu’ils soient fonctionnels ou structurels, ne présentent
pas de changement ;
. A 10 µg.L−1 , les communautés d’algues, de bactéries et de cyanobactéries présentent
des abondances relatives plus faibles tout en gardant des proportions entre elles similaires
aux biofilms non traités. Concernant l’analyse des 5 lectines, les proportions sont différentes
laissant suggérer des changements dans la composition (Neu et al. 2005). Malgré tout, aucun
effet significatif de l’alachlore n’apparait sur la structure des communautés bactériennes (par
DGGE ou T-RFLP), ni aucune perte ou gain de groupes fonctionnels (Biolog). La disparition
ou l’apparition d’espèces redondantes ou le manque de sensibilité de ce paramètre de mesure
(De Lipthay et al. 2004) pourraient expliquer cette absence de changement dans le profil
d’utilisation des sources de carbone.
La quantité de biomasse algale, de cyanobactéries et les niveaux de chlorophylle a sont
légèrement plus faibles pour les biofilms traités au méthanol par rapport aux biofilms non
traités (contrôle). Inversement, le compartiment bactérien semble répondre positivement à
la présence du méthanol, illustré par une production bactérienne et des quantités de bio-
masses bactériennes plus importantes. Cette stimulation des bactéries peut être causée par
une diminution de la compétition avec les algues impactées par le solvant, ou tout simplement
en réponse à une augmentation du niveau de carbone organique, par rapport aux niveaux
contenus dans les eaux de rivière. Un changement de la composition dans le cadre de ces 5
lectines décrites ici, est observé dans les biofilms traités pour converger vers une dominance
d’Ulex europeae. La structure bactérienne ne subit pas de changement significatif, malgré une
tendance qui montre une divergence des communautés entre les biofilms traités au méthanol
et les biofilms contrôles ou traités à l’alachlore. En ce qui concerne les profils d’utilisation
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 225

des sources de carbone, seul un substrat (β-méthyl-D-glucoside) est affecté significativement

par la présence du méthanol.
D’un point de vue écologique, le méthanol au même titre que l’alachlore peut engendrer
des modifications au niveau de la qualité du biofilm comme source de nourriture des biofilms.
Les modifications au niveau des lectines peuvent par exemple provoquer des changements
dans la capacité des biofilms à se protéger, à adsorber ou dégrader des molécules.
Les deux types de perturbations étudiées dans le cadre de ce travail, l’exposition conti-
nuelle à l’alachlore ou au méthanol, semblent engendrer des communautés microbiennes dif-
férentes. Leurs trajectoires d’évolution ont divergé, aboutissant à des structures différentes.
Ainsi, la présence d’un solvant peut donc interférer avec l’herbicide testé lors d’expériences
écotoxicologiques. Il aurait été intéressant de caractériser les biofilms à des temps intermé-
diaires, afin de définir le moment à partir duquel les communautés divergent dans leurs
structures.

III.3.3 Conclusion et perspectives

Cette étude tente d’évaluer les effets potentiels de l’alachlore à deux concentrations dif-
férentes sur la croissance du biofilm phototrophe, de son stade précoce jusqu’à sa maturité.
L’alachlore présente un effet concentration-dépendante avec une inhibition préférentielle pour
les communautés bactériennes quelle que soit la concentration considérée. L’alachlore semble
affecter la croissance des biofilms sans en modifier la structure et les proportions relatives
entre communautés algales et bactériennes. Il nous est impossible d’évaluer l’impact de l’ala-
chlore en termes de successions écologiques, car une seule caractérisation du biofilm a été
faite à l’issue des 5 semaines d’incubation. Vu la convergence des communautés, il semblerait
que les trajectoires d’évolution soient identiques en présence ou en absence d’alachlore.
Les espèces de diatomées dominantes retrouvées dans l’ensemble de nos échantillons sont
Diatoma tenuis (DITE) et Fragilaria tenera (FTEN). Ces espèces, dites espèces « coloniales
», ont été répertoriées par Rimet et Bouchez (2011) pour appartenir aux guildes « High-
profile ». Ce guilde regroupe les espèces de diatomées à haute stature, incluant des espèces
filamenteuses, ramifiées, formant des chaines, des tubes, ou pédonculées. A l’opposé de nos
observations, Rimet et Bouchez (2011) montraient que les diatomées qui appartiennent à
ce groupe voyaient leur abondance diminuer au sein des microcosmes contaminés. Les taxa
de ce groupe sont connus pour ne pas être adaptés à résister aux turbulences de l’eau ni
à une pression des brouteurs (Passy 2007), mais présentent une grande capacité à utiliser
les nutriments dissous de l’eau. L’eau alimentant (South Saskatchewan river Canada) les
mini-bioréacteurs présente de très faibles concentrations en nutriments (Chénier et al. 2003),
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 226

ce qui a pu induire une forte compétition entre les taxa favorisant ainsi les taxas les plus
aptes à utiliser les nutriments dissous. La composition en espèces des biofilms est également
influencée par les mécanismes d’émigration et d’immigration qui apparaissent sur le support
de colonisation (Stevenson et Peterson 1991). La présence de ces espèces au sein des com-
munautés planctoniques qui alimentent les mini-bioréacteurs via l’eau de rivière, et donc qui
ensemencent continuellement les biofilms, pourrait expliquer l’absence de modification au
niveau des communautés de diatomées des biofilms produits. Nous pouvons supposer que les
espèces de diatomées endommagées par l’alachlore ont pu se détacher des supports de coloni-
sation ou limiter leur adhésion. Cette hypothèse est cohérente avec les plus faibles épaisseurs
et quantités de biomasse mesurées dans les mini-bioréacteurs exposés à l’alachlore.
D’un point de vue écologique, un biofilm ayant une quantité de biomasse plus faible peut
modifier son appétence vis-à-vis des brouteurs. De même, les modifications de composition
des exopolymères, pour les 5 lectines utilisées, observées pour les biofilms traités à 10 µg.L−1
n’engendrent pas de modification dans leurs capacités à dégrader certaines sources de carbone,
mais peut être n’est ce pas le cas pour toutes les fonctions ? Il serait intéressant d’évaluer
l’impact de l’alachlore sur d’autres fonctions (production primaire, dénitrification...) réali-
sées par ces biofilms. Les algues peuvent être impactées soit directement, soit indirectement.
L’impact observé sur la composante algale peut être de nature indirecte à la suite d’une di-
minution de la biomasse bactérienne inhibée par l’alachlore, entrainant une diminution de la
compétition, et un accès facilité aux nutriments. Globalement, l’impact de l’alachlore semble
limité pour les paramètres mesurés dans le cadre de cette étude, de plus une contamination
en continu sur 5 semaines, à des concentrations de 1 et de 10 µg.L−1 , est rarement observée
dans un environnement lotique. Les concentrations de l’ordre de 10 µg.L−1 d’alachlore sont
détectées principalement suite à des épisodes de crues. Aussi se pose-t-il la question du véri-
table impact de l’alachlore sur le fonctionnement général d’un écosystème dans un contexte
lotique naturel.
Ainsi il est difficile de conclure, la molécule d’alachlore a-t-elle réellement très peu d’effet
ou la démarche expérimentale de cette étude est-elle à revoir ? De par leur mode d’action,
des études ont pu démontrer que les herbicides de la famille des chloroacétanilides présentent
une toxicité moins importante que pour certaines autres familles (Junghans et al. 2003 ;
isoproturon, Debenest et al. 2009). Le choix des descripteurs est très important lors des
études écotoxicologiques (Debenest et al. 2009). Les descripteurs utilisés dans le cadre de
cette étude, autres que les descripteurs de biomasse, ne sont peut-être pas adaptés au mode
d’action des chloroacétanilides.
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 227

Lors de cette étude, nous avons également rencontré des problèmes avec le comportement
chimiodynamique de l’alachlore. Cette molécule, de par ses caractéristiques (cf. partie I,
chapitre 3), est considérée comme relativement bien soluble et peu sujette à la photodégra-
dation et modérément adsorbée. Or malgré des concentrations en entrée des mini-bioréacteurs
proches des valeurs nominales (1 et 10 µg.L−1 ), les concentrations en alachlore enregistrées
en sortie des mini-bioréacteurs sont inférieures au seuil de détection de l’analyse (< 0,02
µg.L−1 , cf. partie II Matériel et méthodes) dans l’ensemble des mini-bioréacteurs en
présence ou non de biofilm. Ces résultats suscitent de nombreuses interrogations : quels sont
les mécanismes qui ont entrainé la disparition de la molécule entre l’entrée et la sortie des
mini-bioréacteurs ? La photodégradation, l’adsorption sur le biofilms (quantité de biomasse
faible dans cette étude) ou sur les dispositifs expérimentaux, l’hydrolyse ? En sachant que nos
dispositifs expérimentaux sont alimentés en continu et de ce fait contaminés en continu par
de l’alachlore et que le temps de séjour de l’eau au sein des dispositifs est très court de l’ordre
de 1 jour. L’adsorption est un mécanisme rapide de quelques heures mais la biodégradation
(Graham et al. 2000) et l’hydrolyse (Spawn et al. 1997) nécessitent souvent plusieurs jours.
La dissipation probable, mais pas totale car nous observons des effets sur la biomasse pour
les mini-bioréacteurs contaminés en alachlore, a pu limiter les effets, et finalement refléter
une contamination plus faible que celle attendue. Le dosage des deux métabolites OA et ESA
sur des échantillons à l’issue des 5 semaines de culture n’ont révélé aucune trace de ces deux
métabolites. La biodégradation n’est donc pas le facteur responsable de la disparation de la
molécule. Afin de vérifier les hypothèses d’un mécanisme de photodégradation ou d’adsorp-
tion, l’expérience (5 semaines) été de reproduite un an après avec les différentes conditions
suivantes : (i) un traitement sans micro-organisme à l’obscurité et à la lumière, (ii) un trai-
tement avec des micro-organismes. Les analyses du suivi de l’alachlore en entrée et en sortie
et de la qualité de l’eau d’alimentation utilisée sont en cours de réalisation.

III.3.4 Article 5
III.3. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers
stades de développement 228
 229

Comparative responses of river biofilms at the community-level to common organic

solvent and herbicide exposure

A. Paule1,2, V. Roubeix3, G.D.W. Swerhone4, B. Lauga5, R. Duran5, F. Delmas3, E. Paul6,7,8 , J.R. Lawrence4 &
J.L. Rols1,2*

1
Université de Toulouse; UPS, INP; EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle et environnement); 118 route
de Narbonne, F-31062 Toulouse, France
2
CNRS; EcoLab; F-31062 Toulouse, France
3
Cemagref, UR REQE, 50 avenue de Verdun, F-33612 Cestas, France
4
Environment Canada, Saskatoon, Saskatchewan, Canada
5
Equipe Environnement et Microbiologie, Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l’Environnement et les
Matériaux - IPREM, UMR 5254 CNRS/UPPA, IBEAS, Université de Pau et des Pays de l’Adour, BP1155, F-
64013 Pau, France
6
Université de Toulouse; INSA; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France
7
INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France
8
CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

Abstract
Ecotoxicological experiments have been performed at laboratory-scale under controlled conditions to investigate
the community-level responses of river biofilm to chloroacetanilide herbicide (alachlor) and organic solvent
(methanol) exposure through early stages of its development referenced to control. Triplicate rotating annular
bioreactors, inoculated by river water, have been used to cultivate the river biofilms under the influence of 1 and
10 µg L-1 of alachlor and 25 µg L-1 of methanol (0.025 % v/v). For this purpose, the functional (thymidine
incorporation and carbon utilization spectra) and structural responses of microbial communities were assessed
after 5 weeks of development. Structural aspects included biomass (chlorophyll a, confocal laser scanning
microscopy) and composition (fluor-conjugated lectin binding, molecular fingerprinting methods and diatom
species composition). The addition of alachlor resulted in a significant reduction of bacterial biomass (by
confocal analyses) at 1 µg L-1; and at 10 µg L-1 it induced a reduction of total lectin-binding, algal, bacterial and
cyanobacterial biomass (by confocal microscopy) without composition changes, altered biofilm thickness or
thymidine incorporation. In contrast, methanol treatment resulted in an increase of bacterial biomass and
thymidine incorporation as well changes in dominant lectin-binding suggested changes of the exopolymer
composition. Chlorophyll a and cyanobacterial biomass (by confocal microscopy) were also altered by methanol.
As observed for the alachlor treatments, the methanol didn’t induce change in community composition.
This study suggested that the concentration-dependent effect of alachlor mainly remains limited to biomass and
growth inhibition without apparent changes of ecological succession trajectories and functional characteristics.
Our work also establishes that the presence of methanol may hypothetically influence the results of
ecotoxicological bioassays by potential direct toxic effects on the river biofilm community or acting
antagonistically, synergically or masking the effects of the target compound.
Keywords: Rotating annular bioreactor; organic solvent; response to herbicide; community-level; molecular
fingerprinting; confocal microscopy.

1
 230

1. Introduction
In freshwater ecosystems, pesticides are one of the major sources of pollution (Kreuger 1998). Residual
pesticides applied to crops migrate from agricultural lands to surface and ground waters by mechanisms
including surface run-off (Papadopoulou-Mourkidou et al. 2004). This contamination can pose significant
toxicological risks to resident aquatic organisms (Battaglin and Fairchild 2002). River biofilms, microbial
aggregates composed of heterotrophic micro- and meio-organisms and phototrophic micro-organisms embedded
in an exopolymeric matrix, are the first aquatic non-target organisms which interact with pesticides. These
aggregates contribute to most of the primary production (Wetzel 1975), food source for aquatic grazers
(Feminella and Hawkins, 1995), mineralization and element recycling processes (Battin et al. 2003), absorption
(Lawrence et al. 2001), and biodegradation of chemical contaminants (Vercraene-Eairmal et al. 2010). Due to
their shared physiological characteristics with plants, the algae in river biofilms are susceptible to be biologically
and biochemically perturbed by herbicides, thus resulting in damage to overall ecosystem functioning.
A variety of studies including microcosms, mesocosms, and in situ (e.g. Dorigo et al. 2010; Tlili et al. 2008;
Rimet and Bouchez 2011) are available that consider the response of river biofilm communities to herbicide
exposure. Numerous direct or indirect effects have been recorded depending on the chemical and the structural
or functional endpoint observed (Villeneuve et al. 2011a), seasonal changes (Dorigo et al. 2004), community
composition (Guasch et al. 1997), herbicide level and frequency (Tlili et al. 2008 and 2011), nutrient available
(Tlili et al. 2010) and current velocity (Villeneuve et al. 2011b). Moreover, it is difficult to distinguish between
the response of communities to herbicide exposure and that of other environmental factors (Roubeix et al. 2010).
Alachlor [2-chloro-N-(2, 6-diethylphenyl)-N-(methoxymethyl) acetamide] is extensively used as a pre-
emergence chloroacetanilide herbicide applied to corn and soybeans, as a result it is detected worldwide in
surface waters (Konstantinou et al. 2006).
Chloroacetanilide herbicides are known to inhibit the elongation of very long chain fatty acids in plants and
algae (Böger et al. 2000) resulting in impaired cell development (Junghans et al. 2003; Vallotton et al. 2008).
Unlike herbicides which inhibit photosynthesis (e.g. triazines or phenylureases), the most commonly studied
chloroacetanilide herbicides (e.g. Dorigo et al. 2004; Villeuneuve et al. 2011a) can also have direct effects on
bacteria (Foley et al. 2008). The literature mainly provides EC50 values from single-species acute toxicity test on
green algae (Fairchild et al. 1997), cyanobacteria (Singh and Datta 2005), bacteria and protozoa (Bonnet et al.
2007). A small number of studies examined the effects of alachlor on aquatic benthic algae (Spawn et al. 1997;
Carder and Hoagland 1998).
Ecotoxicological experiments are the best way to apprehend the potential toxicity of pesticides on the river
biofilms. In most studies, the use of organic solvents to dissolve low solubility-water pesticides prior to addition
into experimental systems is often unavoidable. These solvents can affect the microbial communities and
antagonistically or synergically interact with the tested molecules and even mask their effects (e.g. Stratton 1985;
El Jay 1996a). Among the possible organic solvents, methanol is often considered as slightly or moderately toxic
(e.g. Cho et al. 2009). Most studies have focused on the acute toxicity of methanol in single-species bioassays,
including blue-green algae (Stratton 1985), green algae (El Jay 1996b; Okumura et al. 2001; Ma and Chen
2005), and on natural phytoplankton assemblages (Bérard 1996). The authors recorded various effects depending
on the species and operating conditions. El Jay (1996b) observed a decrease of Selenestrum capricornutum
biomass at 0.1 % (v/v) of methanol, although some authors recorded an increase of Chlorella species and

2
 231

Scenedesmus obliquus biomass when exposed to methanol at up to 0.1 % (Kotzabasis et al. 1999; Navakoudis et
al. 2007; Hunt et al. 2010). To our knowledge, there are no report concerning the potential toxicity of methanol
for river biofilm communities (integrating both bacterial and algal compartments), thus additional studies are
necessary to investigate consequences of organic solvent during ecotoxicological experiments.
In this context, our work consists to ecotoxicological experiments in a rotating annular bioreactor under
controlled conditions in order to (i) assess the community-level response to alachlor herbicide and methanol
exposure through the early stages of colonisation of river biofilm referenced to control communities, and (ii)
illustrate the potential consequences of herbicide exposure on ecosystem functioning and (iii) examine the risk of
interference between a herbicide and an organic solvent during ecotoxicological experiments. The response of
communities was assessed by multimetric approach including both structural (biomass and composition) and
functional descriptors.
2. Material and Methods
2.1 Microcosm Operation
The experimental set-up and reactor design for biofilm development has been described in detail previously
(Lawrence et al. 2000, 2004). Natural river water (South Saskatchewan River, Saskatoon, SK, Canada) was used
as inoculum and as a source of carbon and nutrients. Nutrient levels were assessed as described by Chénier et al.
(2003). The reactors (water volume of 500 mL) were maintained at 21 + 2oC. The water was pumped through the
reactors at a rate of 500 mL per day (giving a mean residence time of 24 h) via a multichannel peristaltic pump
(Watson Marlow, Wilmington, MA). Replicated (3X) treatments included addition of alachlor purchased from
Chem Service, Inc. (USA, purity 98 %) at 1 or 10 µg L-1 and methanol (analytic grade, Fisher Scientific, Nepean,
ON, Canada) at 25 µg L-1 (0.025 % v/v). Alachlor concentrations used were selected to be in the range detected
in river environments (Konstantinou et al. 2006). Alachlor was dissolved in methanol to make a stock alachlor
solution. Aliquots of this stock solution were used to contaminate reactors at tested final concentrations after
evaporation to dryness of organic solvent by placing the required amount on a clean glass slide with subsequent
dissolution in sterile river water in 2 L glass bottles connected to the reactors via a peristaltic pump. The bottles
were closed and maintained in the dark to avoid photodegradation processes, on a rotory shaker. Alachlor and
methanol were continuously added directly to the individual replicate reactors using a peristaltic pump from a
fresh 2L bottle prepared every 15 days. Control reactors were operated that received river water alone. Biofilms
were grown under treatment and control conditions in bioreactors for a period of 5 wks (from May 10, 2010 to
June 15, 2010), at which time coupons were removed for immediate analysis (CLSM, microscopic, radioisotope,
chlorophyll a and Biolog studies), frozen at -80°C and stored for subsequent DNA extraction and molecular
analyses.
2.2. Structural descriptors
Chlorophyll a analyses
Biofilms strips (10 cm²) were scraped using a sterile silicone rubber spatula to remove the biofilm, Chl a was
extracted using 90 % boiling ethanol (Nusch 1980) and analysed fluorometrically using a Turner Designs Model
10-AU digital fluorometer (Turner Designs, Sunnyvale,CA) (Waiser and Robarts 1997).
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and Image analysis
Examination of all stained and control materials was carried out with an MRC 1024 confocal laser scanning
microscope (formerly Bio-Rad, now Zeiss, Jena, Germany) attached to a Microphot SA microscope (Nikon,

3
 232

Tokyo, Japan). Slides from each of the replicate reactors were cut into 1 cm2 pieces and mounted in small Petri
dishes by using Dow Corning #3140 acid-free silicone (WPI, Inc., Sarasota, FL.) and then stained and analysed
as described in detail in Lawrence et al. (2004). Digital image analysis of the confocal laser scanning microscopy
(CLSM) optical thin sections was used to determine such parameters as biofilm depth, bacterial cell area
(biomass), exopolymer biomass, cyanobacterial biomass, and total photosynthetic biomass at various depths.
Exopolymer analyses
Lectins with fluorescein isothiocyanate or TRITC labeling were purchased from Sigma (St. Louis, MO.). Cy5
labeling was performed by using a commercial labeling kit according to the instructions (Research Organics,
Cleveland, OH.). The lectins Arachis hypogaea, Canavalia ensiformis, Glycine max, Triticum vulgaris and Ulex
europaeus were used alone or in combination for in situ analyses of polymer composition as described by Neu et
al. (2001). Image analyses and calculations of lectin binding volumes were carried out by using the equations of
Neu et al. (2001).
Diatom community Analyses
Relative abundance of diatom species enumerated, were estimated. Diatom composition was estimated from an
aliquot of 5 mL of the biofilm suspension homogenate, preserved in formalin solution (3 %) and stored in the
dark until analysis at “Cemagref” (Bordeaux, France). Identification and counting of diatoms of 400 frustules
were performed as described previously by Roubeix et al. (2011).
Community DNA extraction and amplification, and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
analyses
For each treatment bioreactor, two frozen (-80°C) polycarbonate strips were aseptically cut (2 cm2) and
transferred to a 50 mL polypropylene tube (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lanes, NJ.). Microbial cells
from the frozen biofilm samples were removed from the polycarbonate strip with a sterile metal scraper, and
total DNA was extracted using the Powersoil DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)
according to the manufacturer’s instructions with the following modifications. Briefly, the samples were put into
the bead beater three times for 30 s at 5.5 m s-1 and cooled for 10 min between each time beaten. Samples were
cooled again before centrifugation.
The 16S rRNA genes were amplified by PCR using the universal Bacteria primers 341F-GC and 907R (Muyzer
et al. 1997) to perform by DGGE as described by Lawrence et al. (2009) with slight modifications. PCR
amplification was conducted in a 50 µL reaction volume containing 3.5 µL of DNA template, 2µL of each
appropriate primer, 1.25 U Taq DNA polymerase (New England Biolabs Ipswich, MA.), 10x PCR buffer, 3 mM
MgCl2, 200 µM dNTP and 600 µg mL-1 BSA. A touchdown PCR program using the PTC-200 thermocycler
(Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON) consisted of an initial denaturation step of 94°C for 5 min, followed by
10 cycles of denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 66°C (decreasing in each cycle by 1°C) for 45 s, and an
elongation step of 72°C for 1 min. Following these steps, another 20 cycles of 95°C for 1 min, annealing at 56°C
for 1 min, and elongation at 72°C for 1 min, with a final elongation step of 72°C for 10 min, were performed.
The correctly-sized PCR product was verified by electrophoresis on agarose gels following a protocol described
elsewhere (Lawrence et al. 2009).
After the specificity and size of the amplified products were checked on agarose gels, the PCR product was
separated by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) using an Ingeny phorU2 system (Ingeny, Leiden,
the Netherlands) as described in Lawrence et al. (2009). Aliquots (50 µL) of PCR product were mixed with 4 µL

4
 233

of loading dye buffer and resolved on a 6 % (w/v) polyacrylamide gel in 1 x TAE buffer, using denaturing
gradients from 44 to 60 % (100% denaturant contains 7 M urea and 40 % deionized formamide). Electrophoresis
was carried out at 60V for 30 min, then 100 V for 18 h at 60°C. After electrophoresis, the gel was stained with
SYBR Green I (1:10000 dilution; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) for 15 min with gentle agitation and
photographed using the AlphaImager 3300 gel documentation and image analysis system (Alpha Innotech
Corporation, San Leandro, CA.).
Community DNA extraction and amplification, and terminal fragment length polymorphism (T-RFLP)
analyses
For each treatment bioreactor, two frozen (-80°C) polycarbonate strips were sampled and aseptically cut into
three pieces (3 cm²). Each piece (a total of 6 pieces by treatment bioreactor) was inserted into a 5 mL
PowerWater® Bead tube (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA), and total DNA from each piece was
separately extracted by using a Power Water DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)
according to the manufacturer’s instructions.
The 16S rRNA genes were amplified by PCR and the bacterial community structure was studied by T-RFLP as
described by Bruneel et al. (2006) with slight modifications. The fluorescent labelled primers FAM 8F (5'-6-
carboxy-fluorescein-phosphoramidite-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') (Eurogentec, 295 Liège,
Belgium) (Lane 1991) and HEX 1489R (5'-hexa-chloro-fluorescein-phosphoramidite- TAC CTT GTT ACG
ACT TCA-3') (Invitrogen, Carlsbad, USA) (Marchesi et al. 1998) described as universal within the Bacteria
domain, were used. Reaction mixture for PCR was performed in a 50 µL volume containing 5 µL of template
DNA, 25 µL AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied Biosystems) and 0.5 µL from each primer. Amplification
was carried out using an Applied Biosystems thermocycler by using the following: a 5 min hot start at 95°C,
followed by 35 cycles consisting of denature (45 s at 95°C), anneal (45 s at 55°C), and extension (1 min at 72°C)
and a final extension at 72°C for 10 min. Restriction digestion was performed with HaeIII and HinfI. T-RFLP
profiles were aligned by a web-based tool, T-Align (http://inismor.ucd.ie/~talign/) as previously described by
Smith et al. (2005) with the confidence interval of 0.5.
2.3. Functional descriptors
Carbon Utilization Spectra
Carbon utilization spectra were determined for biofilm subsamples from each replicate reactor (3 strips) using
commercial Eco-plates (Biolog, Hayward, CA) as described previously (Lawrence et al. 2004, 2009).
Radioisotope Analyses
Biofilm strips (5 cm²) were scraped using a sterile silicone rubber spatula to remove and suspend the biofilm.
Subsequently, incorporation of thymidine as a measure of bacterial production was realised using tritiated
thymidine following the standard protocol of Robarts and Wicks (1989). All negative controls were killed with
formaldehyde at 0.4 % final concentration.
2.4. Alachlor Analyses
Water samples were collected (5 mL) to confirm the concentration of alachlor in the reactor influent (in the
bottle) and effluent, and analysed by high performance liquid chromatography coupled tandem to mass
spectrometry (HPLC-MS-MS, Thermo Fisher, model E-Quan TSQ Quantum ultra) with ionization electron
spray source by a sample direct injection at “Laboratoire Départemental de l’Eau” (Toulouse, France) and
equipped with a pre-concentration column (Thermo Fisher Hypersil GOLD C18, 12 µm particle size, 20 x 2.1

5
 234

mm). The injection volume was 2 mL. The alachlor separation was monitored using a Thermo Fisher
Hypersil GOLD C18 (3 µm particle size, 50 x 2.1 mm) column. The residual concentration of alachlor was
evaluated every 15 days in both reactor influent and effluent.
2.5. Experimental Design and Statistical Analyses
The experimental design consisted of an untreated control (C0), alachlor at 1 (A1) and 10 (A10) µg L-1 and
methanol at 25 (M25) µg L-1 treatments. Each treatment had 3 identical replicate reactors randomly assigned to it
on the reactor bench (replications). Furthermore, each analysis was done on subsamples of randomly selected
biofilm coupons from among the 12 identical coupons in each replicate reactor. Confocal laser scanning
microscopy imaging was done at 5 random locations at 5 positions on transects across the 1 cm2 piece of the
biofilm coupon. Subsampling for other analyses (thymidine incorporation and carbon utilization) was also
carried out using randomly selected subsamples from among the 12 identical coupons in each replicate reactor.
The number of carbon sources utilized by the bacteria communities from untreated and treated-biofilms was
calculated as the sum of the number of wells exhibiting absorbance greater than 0.25 OD (Foley et al. 2008).
Analysis of variance (MiniTab, State College, PA) for the analyses of carbon utilization and the Mann Whitney
test (SPSS software 13.0) for the analyses of thymidine incorporation and chlorophyll a were used to detect
significant differences among sample means at p ≤ 0.05.
DGGE gels were processed by generating a band, defined as Operational Taxonomic Units (OTUs) matching
table as described in Lawrence et al. (2009). Peaks, defined as Terminal Restriction Fragments (T-RFs) were
scored as present or absent from T-RFLP profiles. Peaks < 0.5 % of the total area were excluded from T-RFLP
profiles analysis and the T-RFs that differed in size by 0.5 bp or less were considered to be identical. Baseline of
0.5% was defined in accordance with Osborne et al. (2006). The T-RFLP and DGGE binary data and diatom
species enumeration data were exported and analysed by Principal Component Analysis (PCA) with R.2.2.1
software for windows using the ade4 package. Statistical analyses of PCA scores generated from the first two
axes were run using an analysis of similarity (ANOSIM) via Past software 2.06 (Hammer et al. 2001) on Bray
Curtis similarity matrices generated from binary data. This analysis generates a global R value between 0
(completely random pattern) and 1 (completely separated groups) (Clarke 1993). The statistical significance of
the global R was considered at p < 0.05 uncorrected.
3. Results
3.1 Alachlor concentrations
Alachlor concentrations of reactor influents for both treatments at 1 and 10 µg L-1 were of
0.81 ± 0.02 and 8.4 ± 0.8 µg L-1, respectively. The values of alachlor measured were close to
the nominal concentrations for both tested treatment.
3.2 Effects of alachlor and methanol treatments on the structure and architecture of
river biofilm
A visual comparison of the response of biofilm to alachlor and methanol treatments is
presented in Figure 1. Control biofilm had cyanobacteria as a major component. In contrast
the cyanobacteria appeared to be fewer in the treated-biofilms in the presence of methanol at
25 µg L-1 or alachlor at 10 µg L-1. Methanol treated-biofilm was dominated by bacteria with a

6
 235

shift into a colony forming growth habit whereas biofilms in the presence of 1 µg L-1 of
alachlor exhibited fewer bacteria with a more diffuse distribution. No difference was apparent
for the algal component relative to control and between each treatment.

Figure 1: Representative CLSM photomicrographs of control, alachlor-treated at 1 or 10 µg

L-1, and methanol-treated at 25 µg L-1 river biofilm communities. The color wheel shows
bacteria (green), cyanobacteria (pink), and algae (blue).

Quantitative comparisons are summarised in Figure 2A. The addition of alachlor 1 µg L-1
(A1) only resulted in a reduction of the bacterial biomass (p < 0.05). The treated-biofilms
with alachlor 10 µg L-1 (A10) exhibited significantly lower amounts of bacterial, algal and
cyanobacterial biomass compared to control biofilms, and the other treatments (p < 0.05) (A1
and M25). No significant effect of methanol was observed compared to control (p > 0.05),
except a marginal change in the cyanobacterial biomass (p =0.013). The proportional analyses
presented in Figure 2B illustrate the general shift in heterotrophic and phototrophic
communities as a consequence of alachlor and methanol treatment. Untreated-biofilms
exhibited 42 % cyanobacteria with the remainder equally divided between algal and bacterial
biomass (27 and 31 %, respectively). The addition of 1 µg L-1 of alachlor resulted in a
reduction of bacterial biomass to 14 % with a concomitant increase in cyanobacteria (54 %).
The presence of methanol at 25 µg L-1 resulted in a slight increase of the bacterial biomass
percentage (39 %). Despite the trend of increased of bacterial biomass in the 25 µg L-1

7
 236

methanol treated-biofilms observed in the visual comparison (Fig.1) relative to other

conditions (treated and untreated), this difference was not significant in terms of quantitative
comparisons (Fig.2A).

Co a a a
Treatment

A1 a ac bd

Algae
A10 bc b cd Cyanobacteria
Bacteria

M25 ac bc a

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

Amount of biofilm component (µm3 µm-2)

B C0 A10
30%
27%

42%
41%

31% 29%

A1 M25
32%

41% 20%

14%
54%

39%

Figure 2: Results of image of confocal laser micrographs illustrating the effect of alachlor
and methanol on the amount of algae, cyanobacteria, and bacteria in the river biofilm
communities, by treatment: control (C0), alachlor 1 µg L-1 (A1), alachlor 10 µg L-1 (A10) and
methanol 25 µg L-1 (M25). (A) Parameters indicated by different letters are significantly
different (p ≤ 0.05). (B) Proportional illustration on the relative abundances of algae,
cyanobacteria, and bacteria.

The amount of chlorophyll a did not show a difference between alachlor treated-biofilms and
control biofilms (Figure 3). Values ranged from 3.32 to 4.45 µg mm-2 of chlorophyll a (10 µg
L-1, p = 0.513; 1 µg L-1, p = 0.127). The methanol treated-biofilms had a marginally lower

8
 237

amount of chlorophyll a relative to control biofilm (1.65 µg mm-2, p = 0.05) but exhibited
similar values relative to treated-biofilms at alachlor 10 µg L-1 (p = 0.127).
The biofilm thickness, grouped by treatment type were as follows: control, 61 ± 31 µm; at 1
µg L-1 of alachlor, 51 ± 24 µm; at 10 µg L-1 of alachlor, 44 ± 25 µm; and at 25 µg L-1
methanol, 60 ± 30 µm. The biofilm thickness at 10 µg L-1 alachlor was significantly different
from the control (p = 0.013) but not from the other treatments (p >0.05).

6
a
ac
Chlorophyll a (µg mm )
-2

4
a

2
bc

0
C0 A1 A10 M25

Figure 3: Average ± SD (n = 3) value plots of chlorophyll a for river biofilm communities

according to the different experimental conditions: control (C0), alachlor 1 µg L-1 (A1),
alachlor 10 µg L-1 (A10) and methanol 25 µg L-1 (M25). Parameters indicated by different
letters are significantly different at p ≤ 0.05.

3.3. Effects of alachlor and methanol treatments on the diatom community composition
A principal component analysis (PCA) was performed based on total diatom species
enumeration data for untreated and alachlor and methanol treated-biofilms (Figure 4). The
two axes accounted for 83.7 and 11.5 % of the total variance. This analysis is strengthened by
similar trends observed with PCAs built with the first and third axes. The first three axes
accounted for respectively 99.1 % of the variation. Methanol and alachlor treatments did
induce no significant changes in diatom composition (Global ANOSIM R = 0.1636 and
significance level p = 0.16).

9
 238

d = 50

PC2 (11.5%)
C0 A1
A10
M25

PC1 (83.7%)
Figure 4: Effects of treatments on diatomic community structure assessed by Principal
Component Analysis (PCA) based on the diatom species enumerated data. Experimental
conditions : control (C0), alachlor 1 µg L-1 (A1), alachlor 10 µg L-1 (A10) and methanol 25 µg
L-1 (M25).

The average species richness of treated and untreated-biofilms were 9.8 ± 0.4 species. No
significant difference in species richness was observed between experimental conditions
(p>0.05). Among a total of 21 diatom species identified, in each experimental condition, 5
dominant species had a relative abundance > 2 % and were considered as characteristic of
each developed diatom community. Dominant diatom species composition and proportions
did not differ significantly between treated or untreated-biofilms with the presence of
Achnanthidium minutissimum (Kütz.) Czarnecki (ADMI) (2.1 %), Diatoma tenuis Agardh
(DITE) (53.6 %), Fragilaria tenera (W.Smith) Lange-Bertalot (FTEN) (33.4 %), Fragilaria
(Ulnaria) ulna Sippen angustissima (Grun.) Lange-Bertalot (FUAN) (3.7 %), and Nitzschia
gracilis Hantzsch (NIGR) (4.7 %) (p > 0.05) (Figure 5). No significant abnormal frustule
morphologies were observed in response of alachlor or methanol treatments (data not shown).

10
 239

100

Diatom relative abundance (%)

80

60 ADMI
DITE
FTEN
FUAN
40
NIGR

20

0
C0 A1 A10 M25

Figure 5: Impact of alachlor and methanol on the relative abundance (%) (mean value, n = 3)
of major diatom species (> 2%) from each diatom communities, by treatment : control (C0),
alachlor 1 µg L-1 (A1), alachlor 10 µg L-1 (A10) and methanol 25 µg L-1 (M25).
ADMI: Achnanthidium minutissimum (Kütz.) Czarnecki, DITE: Diatoma tenuis Agardh,
FTEN: Fragilaria tenera (W.Smith) Lange-Bertalot, FUAN: Fragilaria (Ulnaria) ulna Sippen
angustissima (Grun.) Lange-Bertalot, and NIGR: Nitzschia gracilis Hantzsch.

3.4. Effects of alachlor and methanol treatments on the composition and structure of
bacterial community
The application of in situ lectin-binding analyses was used to examine changes in exopolymer
(EPS) composition in response to the addition of alachlor or methanol during river biofilm
development (Figure 6). No significant difference was observed for the binding pattern of the
five lectin panel between untreated-biofilms and treated-biofilms with 1µg L-1 of alachlor (p >
0.05). The presence of alachlor 10 µg L-1 resulted in a significant reduction of the amount of
binding of four-lectins (T. vulgaris, C. ensiformis, G. max and U. europaeus) (p < 0.05).
These changes result in different proportions of lectin binding relative abundance compared to
control biofilms as illustrated by Figure 6B. The addition of methanol resulted in a shift to
Ulex europaeus-dominated biofilms accompanied by a reduction of C. ensiformis and G. max,
although untreated-biofilms were dominated by lectin-binding with Glycine max. Lectin-
binding of Arachis hypogaea did not change regardless treatment.

11
 240

Treatment Co a a a a a

A1 ab a ab ac a

Triticum vulgaris
Arachis hypogaea
A10 b a b bc a Canavalia ensiformis
Glycine max
Ulex europaeus

M25 ab a c c
cb

0 2 4 6 8 10 12 14

Amount of biofilm component (µm3 µm-2)

Figure 6: Results of image of confocal laser micrographs illustrating the effect of alachlor and
methanol on river biofilm lectin-binding, determined by in situ lectin binding analyses, by
treatment: control (C0), alachlor 1 µg L-1 (A1), alachlor 10 µg L-1 (A10) and methanol 25 µg
L-1 (M25). (A) Parameters indicated by different letters are significantly different (p ≤ 0.05).
(B) Proportional illustration on the relative abundances of lectin-binding types.

12
 241

The response of bacterial communities to the addition of methanol or alachlor was assessed
by both DGGE and T-RFLP fingerprinting molecular methods.
DGGE banding patterns revealed a total of 38 OTUs. The addition of alachlor at both
concentrations did not affect the number of OTUs (p < 0.05) which exhibited an average
number of 21.3 ± 2. For methanol treated-communities, the average number of OTUs per
sample was significantly higher (28.3 ± 1.5) compared to the control and the other treatments
(p > 0.05). T-RFLP profiles revealed a total of 91 T-RFs irrespective the restriction enzyme
used. No effect of methanol and alachlor treatments was observed on the number of T-RFs (p
> 0.05) regardless of restriction enzyme used.
Principal component analyses (PCA) was performed on the OTUs or T-RFs binary data for
each fingerprinting molecular analysis to evaluate the change in bacterial communities in
response to alachlor and methanol exposure (Figure 7). The two axes accounted for 27.9 and
23.1 % of the total variance and 15.8 and 10.3 % for the DGGE and T-RFLP analysis,
respectively. These analyses were strengthened by the similar trends observed with PCAs
built with the first and third axes (data not shown). The first three axes accounted for
respectively 69.9 and 32.8 % of the variation of DGGE and T-RFLP.
Both PCAs revealed no significant difference between the bacterial community structures of
control and treated-biofilms (for DGGE analysis: Global ANOSIM R = 0.3735 and
significance level p = 0.0072; for T-RFLP analysis: Global ANOSIM R = 0.3374 and
significance level p = 0.0001). Based on sample clustering corresponding to a similarity of 60
%, for DGGE data, the samples were regrouped in a cluster composed of both bacterial
communities from untreated and treated-biofilms, whereas two distinct clusters were observed
for the PCA of T-RFLP data, methanol treated biofilms versus untreated and alachlor treated-
biofilms. Both PCAs showed similar patterns. Despite the absence of significant difference
and high similarity between control and treated-communities, the methanol treated-bacterial
communities appeared different from control and alachlor treated-communities.

13
 242

A B
d=1 d=1

A10
PC2 (23.1%)

PC2 (10.3%)
A10
A1

A1

M25
M25 Co

Co

PC1 (27.9%) PC1 (15.8%)

Figure 7: Effects of treatments on bacterial community structure assessed by Principal

Component Analysis (PCA) based on the DGGE data (A) and the T-RFLP data (B). Circles
correspond to a similarity of 60 %. Squares represent the gravity center of the plots for each
group. Experimental conditions : control (C0), alachlor 1 µg L-1 (A1), alachlor 10 µg L-1
(A10) and methanol 25 µg L-1 (M25).

3.5. Effects of alachlor and methanol treatments on physiological states of bacterial

community
Physiological states of untreated and treated-biofilm communities were assessed by the
determination of their production as measured by their thymidine incorporation rates and their
ability to utilize different carbon sources.
The biofilms treated with alachlor 1 µg L-1 did not show any change in their thymidine
incorporation rate relative to control (1.18 ± 0.23 and 1.07 ± 0.23 mg C m-2 d-1 respectively, p
= 0.513). Methanol treatment marginally stimulated the thymidine incorporation rate which
was 1.62 ± 0.02 mg C m-2 d-1 (p = 0.05). The incorporation rate for the alachlor treatment at
10 µg L-1 was lower compared to control biofilms and all other treatments (0.65 ± 0.15 mg C
m-2 d-1, p = 0.05).
Following 7 days of incubation, the untreated-biofilm as well as treated-biofilms used a
similar average number of carbon sources of 27.5 ± 0.5 (ANOVA, p > 0.05). Assessment of
carbon utilization spectra revealed no difference between alachlor treated-biofilms (1 and 10
µg L-1) relative to untreated (data not shown) (ANOVA, p > 0.05). For the methanol treated-
biofilm, the capacity to use the ß-methyl-D-glucoside (carbohydrate) compounds was
significantly different relative to control (ANOVA, p = 0.036).

14
 243

The addition of alachlor or methanol did not induced significant change in utilization
capacities of the carbon source guilds relative to control biofilms (p > 0.05) and all other
treatments (Mann Whitney, p > 0.05). In addition, no carbon source type was preferentially
used by either control or treated-biofilms.
4. Discussion
The primary objective of our study was to assess the response of developing river biofilm
communities to chronic alachlor exposure (5 weeks) at realistic levels of environmental
contamination (1 and 10 µg L-1) (Sanchez-Camazano, 2005). To limit the variations of
environmental parameters (light, hydrodynamic…) which may interfere with the response of
biofilm to herbicide exposure (e.g. Guasch et al. 1997; Guasch and Sabater 1998),
ecotoxicological experiments have been performed in rotating annular bioreactors. These
bioreactors have been suggested as a powerful tool to study the effects of environmental
changes on river biofilm development under stable and uniform environmental conditions
(Chénier et al. 2003; Lawrence et al. 2004). Inoculation by river water was continuous to
mimic the natural mechanisms of microbial emigration (Stevenson and Peterson 1991). The
South Saskatchewan River is known to exhibit minor pesticide pollution (0.153 and 0.974 µg
L-1 of cumulative herbicide concentrations to May and June 21, 2010, Environment Canada
2010). Alachlor is not registered for use in Canada since 1985 and thus is not supposed to
occur in South Saskatchewan River. Nevertheless, metolachlor, a chloroacetanilide compound
having similar structure and toxicological mechanisms to alachlor, was detected at average
concentrations of 23.7 ng L-1, in water samples from South Saskatchewan River (including
south of Saskatoon and near the confluence of the Red Deer River) during our bioreactor
experiments (Environment Canada 2010). It could induce co-tolerance processes to alachlor
during our experiments assigned to PICT (pollution-induced community tolerance) concept as
described by previous studies, driving to a selection of tolerant species (Pesce et al. 2010).
The choice of the experimental period length (5 weeks) was based on previous experiments to
produce biofilms amenable to all types of analyses (Lawrence et al. 2000). The exposure was
performed on the early stages of biofilm development during which the biofilm communities
are mainly influenced by allogenic factors, leading to strong exchanges with the water column
(Paule et al. 2009) and thus are likely more sensitive to chemicals.
Alachlor is an organic material, and may be used by organisms as a nutrient source. Some
studies have shown that alachlor may generate changes in microbial community composition
resulting in selection of bacteria able to metabolize the herbicide (Stamper and Tuovinen
1998). Knapp et al. (2003) hypothesised that the algal compartment could also have a capacity

15
 244

to degrade alachlor in freshwater environments. These mechanisms could influence the fate of
alachlor in the bioreactor.
4.1. Community-level response to herbicide exposure
The addition of alachlor at a concentration of 1 µg L-1 induced a reduction of bacterial
biomass relative to control. All other structural or functional descriptors didn’t seem to be
significantly affected at this concentration. In contrast, the 10 µg L-1 alachlor concentration
had a stronger influence on the development of river biofilms. The amount of phototrophic,
heterotrophic, and specific lectin-binding biomass as well as bacterial production were lower
relative to control and 1 µg L-1 alachlor. Despite this biomass reduction, relative abundance of
algae, bacteria and cyanobacteria exhibited proportions similar to the untreated-biofilms.
However, the treatment induced different proportions in the lectin-binding suggesting changes
in community composition. This marked concentration dependent effect is in agreement with
previous works. Spawn et al. (1997) stated that alachlor exposure for 21 days led to a
reduction of the algal biomass as a measured by chlorophyll a up to 10 µg L-1 and changes in
algal community structure and density up to 30 µg L-1. Foley et al. (2008) underlined that
acetochlor exposure (96 h), which has similar toxicological mechanisms to alachlor, did not
result in significant impact on bacterial community structure analysed by DGGE at
environmental concentrations (1 and 5 µg L-1).
Changes in lectin-binding patterns are consistent with changes observed in the amounts of
biofilm component biomass, and can indicate changes in bacterial community structure and
loss or gain of functional groups (Neu et al. 2005). In the current study, despite changes in the
lectin-binding pattern at 10 µg L-1 alachlor, no significant impact was observed on bacterial
structure (fingerprinting methods) and function (carbon utilization spectra), except for overall
metabolic potential as measured by the bacterial production rate. On the other hand, changes
in exopolymer composition in response to 10 µg L-1 alachlor contamination, could lead to
protection of bacteria through sorption of the pollutant, thus it retarded the penetration within
biofilms as supposed by Lawrence et al. (2006) in response to heavy metal contamination.
Alachlor may initially directly affect bacterial development and by a cascade of reactions
affect algal development at only higher concentrations (i.e., 10 µg L-1). In fact, close
relationships are well known between the bacterial and algal compartments (Haack and
McFeters 1982), or damages independently the both bacterial and algal developments. In this
case, algae could exhibit a higher tolerance level than bacteria. Vallotton et al. (2008) have
observed that exclusive dark light exposure during metolachlor contamination has no effect

16
 245

on algal reproduction and therefore essential processes for cell division occur already prior to
the dark phase.
In our study the reactors were continuously inoculated by river water, thus communities were
in close interaction with neighbouring micro-organisms via immigration and emigration
mechanisms (Stevenson and Peterson 1991). Arrival of new micro-organisms not previously
exposed to alachlor may settle and / or replace species already installed and probably affected
by alachlor. As a consequence, the community response to alachlor exposure may be masked
or mitigated.
Ecologically, this reduction of the amount of algal and bacterial biomasses could impair the
quality of biofilm as a food resource for the aquatic grazers. Furthermore, we observed a
reduction and modification of the exopolymer as indicated by the lectin binding assays, the
EPS is well known as a reservoir and buffer barrier (Congestri et al. 2006). Changes of the
EPS composition may alter the efficiency of biofilm to absorb various molecules such as
herbicides (Lawrence et al. 2001) or energetic carbon sources (Freeman and Lock 1995). In
addition, these changes may change the community contribution to mineralization and
element recycling and thus its role in the processes of water quality renewal, and increase its
sensitivity to perturbations.
Over all our results indicate that primarily alachlor appeared to slow the growth of biofilms
and preferentially inhibited the bacteria regardless of concentration. However, there was not a
significant impact on the trajectory of community development in terms of composition and
function as assessed by carbon utilization spectra and molecular analyses. Chloroacetanilide
herbicides are known to inhibit the elongation of very-long-chain fatty acids found in
membrane lipids of algae (Böger et al. 2000), and thus damage cell normal development, and
inhibit cell division.
Our results will lead us to wonder about the real impact of alachlor exposure on the
functioning of ecosystem at environmentally realistic concentrations.
4.2. Pertinence to use river biofilms associated to multimetric approaches as bio-
indicators
A multimetric approach was applied in these studies including structural, functional,
physiological, microscopic and molecular analysis to gain a better understanding of the
consequence of herbicide contamination on the colonization and development of river biofilm
communities. This type of approach is well known to be a powerful tool in the various
investigations on river biofilm communities (Foley et al. 2008; Montuelle et al. 2010). The
ability of each method to assess the response of river biofilm to contaminants and their

17
 246

experimental limits has well been established in the literature (e.g. Lawrence and Neu 2003;
Foley et al. 2008). Chlorophyll a is one of parameters most used to investigate the response of
algal biomass to pesticide exposure (e.g. Spawn et al. 1997). For our work, the microscopic
technique as a measure of biomass seems to be the possibly most sensitive for low biomass
amounts. Noack et al. (2003) preferentially used chlorophyll a as endpoint rather than
microscopic to assess the effects of metazachlor on river biofilm, because of potential bias
associated with the presence of biofilm tri-dimentional structure.
The results obtained by DGGE data were in accordance with those obtained by T-RFLP data.
As observed for numerous studies, T-RFLP method provided a greater sensitivity and
discrimination between samples than DGGE method (Okubo and Sugiyama 2009).
Our results indicated no impact of alachlor on functional activity, as measured by carbon
utilization spectra. Some works have reported a high variability between replicates, which
prevents the determination of significant effects of treatment (Baath et al. 1998). Research
progress will require application of additional functional descriptors, including the use of
newer molecular tools such as real time PCR to determine the expression of target genes
coding for enzymes implicated in various river biofilm functions (e.g., denitrification, Chénier
et al. 2003) or metatranscriptomic analyses (Yergeau et al. 2010).
Diatoms often constitute a major component of the algal communities of river biofilms (Blinn
et al. 1980), and are used to assess water quality in terms of organic and nutrient pollution by
a variety of biotic indices (Coste et al. 2009). Thus, we decided to observe only diatom
species in our river biofilm samples. Moreover, recent studies have provided encouraging
results suggesting that diatoms could be a pertinent tool in herbicide risk assessment (Roubeix
et al. 2010; Rimet and Bouchez 2011). In our study, diatom species observed are benthic. The
two most abundant diatoms, D. tenuis (DITE) and F. tenera (FTEN) both exhibit colonial life-
forms and are known to be a high-profile guild. Rimet and Bouchez (2011) observed that
these high-profile guilds tend to decrease as nutrient and organic loads increase and recorded
a reduction in their abundance in pesticide-contaminated mesocosms, which is not coherent
with our results. This leads us to wonder about the pertinence to use diatoms as bio-indicators
of pesticide pollution. A. minutissimum (ADMI), F. (Ulnaria) ulna Sippen angustissima and
N. gracilis are pioneer and motile life-forms exhibiting a tolerance to pesticide contamination
(Debenest et al. 2010). Characteristics of these diatoms could explain the absence of diatom
communities from treated-biofilms to alachlor. Responses of overall microbial communities
to herbicides are well known to be influenced by environmental factors (e.g. Guasch et al.
1997). Operating conditions of bioreactors as opposed to natural conditions of South

18
 247

Saskatchewan River could be a selection pressure stronger for micro-organisms than alachlor
contamination.
River biofilms are largely used as bio-indicators of organic pollution, and various studies
investigated on river biofilms as bio-indicators of pesticide contamination (Montuelle et al.
2011). As underlined by Montuelle et al. (2010), several points have to be identified to use
river biofilms as a power tool of bio-indicators, (i) the choice of metric, more or less sensitive,
and take into account different levels (structure, diversity, functional...), (ii) the choice of
microcosm and operating conditions, which could drive the response of biofilm and (iii)
exposure time and herbicide toxicological mechanisms. Our work may provide further data
about capacity of river biofilm to be used as bio-indicators.
4.2. Example of possible interferences between an herbicide and organic solvent in
ecotoxicological experiments
Methanol at 25 µg L-1 (0.025 % v/v) chronic exposure (5 weeks) aimed to investigate (i) the
potential toxicity of an organic solvent on bacterial and algal communities from river biofilms
and (ii) the consequences of its use during ecotoxicological experiments. To our knowledge,
no report concerning the potential toxicity of methanol has investigated using aquatic
communities integrating both bacterial and algal compartments.
Algal compartment in methanol treated-biofilms exhibited slight changes compared to
control. The addition of methanol induced negative impact on the chlorophyll a values and the
amount of cyanobacterial biomass. No effect was observed on diatom communities in contrast
to a review by Walsh and Merrill (1984), which underlined that freshwater green algae and
blue-green algae were generally the most tolerant and the diatoms the least tolerant to solvent
exposure. In contrast, the bacterial compartment responded positively to the presence of
methanol. This may be due to a reduction of competition from phototrophic micro-organisms
following a negative impact of methanol. The South Saskatchewan River is carbon limited,
and as a consequence, it has typically been highly responsive to additions of potential carbon
sources. In opposition, organic solvents have also been shown to cause progressive damage to
the cell walls of bacteria, reducing their long-term operational stability as biocatalyst (Vermue
et al. 1993). The exopolymer composition as determined by a four-lectin panel indicated a
shift to the predominance of Ulex europaea binding. However, this was associated with no
significant change in bacterial community structure and stimulation of bacterial production.
These changes can reflect selection of specific bacterial functional groups (Neu et al. 2005),
although we observed little impact on carbon source spectra, with an exception for a source of
carbohydrates.

19
 248

Similar to the effects of alachlor exposure, the changes caused by the methanol, may lead to
changes of quality of biofilm as food resource for aquatic grazers and absorption of carbon
source and contaminant.
Our results showed a divergence of microbial communities depending upon whether they
were exposed to alachlor or methanol treatments. The methanol exposure resulted in a
stronger trend to alter bacterial structure and exopolymer composition. This trend was
associated with a modification of the trajectory of ecological succession and stimulated
bacterial activity, although the alachlor preferentially affects the growth both algal and
bacterial biomasses. Nevertheless, some endpoints including cyanobacterial biomass
exhibited a reduction regardless of treatment.
5. Conclusion
In summary, our results indicated that effects of alachlor on river biofilm are concentration
dependent and appear limited at realistic environmental concentrations. At 1 µg L-1 of
alachlor, only the bacterial biomass was perturbed. At 10 µg L-1, alachlor inhibited
phototrophic, heterotrophic growth and quantity of EPS without apparently modifying the
trajectory of ecological succession. This study confirmed the necessity in herbicide risk
assessment to integrate the community-level, associated with numerous structural and
functional descriptors, the history of communities, its state of development, and the action
mode of chemical. Future research could provide a better knowledge and standardization of
the use of biofilms as bio-indicators (Pesce et al. 2010).
Our work also establishes the potential toxic effects of organic solvents on river biofilm in
ecotoxicological experiments and its potential antagonist effects against chemical effect.
Finally, it is important of minimize the effect of methanol in the ecotoxicological experiments
by using the drying technique is a good approach.
Pesticides are also frequently applied in conjunction with nutrient-rich fertilizers. More
research on the interactions between nutrient loadings from fertilizers and toxicity of various
pesticides are necessary.
Acknowledgements
This work was funded by a grant for foreign exchange (ATUPS) from the University Paul
Sabatier. We are grateful to Environment Canada. We thank S. Karama for assistance with the
T-RFLP method and J. Roy for assistance with the DGGE method. We also thank V. Tumber
for chlorophyll a and bacterial production analyses.

20
 249

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23
III.4. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de
maturation 252

III.4 Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide se-

lon son degré de maturation
Résumé de l’article en préparation « Changes in tolerance to herbicide toxicity
throughout development stages of phototrophic biofilms cultivated in rotating
annular bioreactor » par A. Paule, V. Roubeix, B. Lauga, R. Duran, F. Delmas,
E. Paul et J.L. Rols. (Article 6)

III.4.1 Approche expérimentale

L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la toxicité de l’alachlore à une concen-
tration de 10 µg.L−1 sur des communautés de biofilms phototrophes en relation avec leurs
niveaux de maturation et l’état structurel de leur biomasse. Pour cela, dans un premier
temps, la stratégie expérimentale fut de cultiver en bioréacteur annulaire rotatif (RAB) le
biofilm phototrophe (cf. partie II Matériel et méthodes) (culture C2 présentée dans le
chapitre 2), et de le collecter à deux temps de culture différents (1,6 et 4,4 semaines). Puis
ces biofilms subissent des tests écotoxicologiques d’une période de 15 jours. Pour chaque test,
des coupons colonisées par du biofilm sont collectés du RAB et transférés soit intacts dans
les microcosmes individuels, soit la biomasse est mise en suspension puis inoculée dans les
microcosmes en présence d’une lame de verre vierge (nouveau support de colonisation). A
l’issue des 15 jours d’exposition en microcosme, les biofilms (des coupons ou des lames) sont
collectés et analysés d’un point de vue structurel et fonctionnel.

III.4.2 Principaux résultats et discussion

Les deux états structuraux des biomasses (intact sur coupon ou en suspension) simulent
différents stades de développement, la phase de colonisation des supports artificiels (lames
de verre avec suspension de biofilm) et la phase de croissance et d’épaississement (coupons
avec biofilm intact). Comme présenté dans les résultats du chapitre 2, la culture en RAB
se déroule sous des conditions opératoires stables tout au long de l’expérience, favorisant
ainsi le contrôle de la structure des communautés par des facteurs autogènes et la formation
de biofilms peu diversifiés en algues (13 espèces à 1,6 semaines et 7 à 4,4 semaines). Les
deux temps de culture permettent d’obtenir des niveaux de biomasse différents : 1,12 ± 0,28
mg.cm−2 et 2,45 ± 0,30 mg.cm−2 de MSSC respectivement à 1,6 et 4,4 semaines de culture.
En termes de communautés bactériennes, les biofilms présentent également des structures
différentes. Les caractéristiques des biofilms collectés à 1,6 et 4,4 semaines de culture en RAB
III.4. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de
maturation 253

répondent pleinement à nos attentes, une perte de diversité avec le temps et des structures
bactériennes algales différentes. Un critère supplémentaire justifie également le choix des
4,4 semaines : une culture de biofilms en RAB avait été réalisée antérieurement (culture C2,
présentée dans le chapitre 2) dans des conditions identiques et enregistrait une communauté
bactérienne stable à partir de 3-4 semaines, signifiant un arrêt des variations temporelles
autogènes du biofilm. Cette phase de stabilité nous intéresse car lors de la phase d’exposition
postérieure en microcosme de la première étude de ce chapitre 3, article 4, les variations
temporelles liées aux successions autogéniques interféraient avec les modifications susceptibles
d’être engendrées par la présence de l’alachlore.
Durant les expériences écotoxicologiques en microcosmes, les conditions opératoires sont
maintenues constantes pour toutes les situations testées. Ainsi les changements au sein des
communautés microbiennes sont à mettre en relation avec la présence de l’alachlore. Au cours
de l’incubation dans les microcosmes, une disparition de la molécule de l’alachlore est systé-
matiquement observée, ce qui représente des temps de demi-vie de l’ordre de grandeur des
valeurs trouvées dans la littérature en milieu aquatique lorsque que la molécule est biodégra-
dée (Graham et al. 2000b).
Une exposition de 15 jours à l’alachlore n’engendre pas de modification en termes de
structure des communautés bactériennes et de diatomées. Seule la biomasse est visiblement
impactée, résultant en une forte inhibition pour les biofilms intacts collectés à 1,6 semaines.
Tout comme la précédente expérience (Article 5), l’impact observé sur la biomasse peut être
lié au mode d’action de la molécule qui engendre des dommages au niveau de la croissance des
cellules. Durant ces tests écotoxicologiques, deux facteurs paraissent influencer la trajectoire
d’évolution des communautés, l’alachlore et le degré de maturation du biofilm, de manière
plus ou moins équivalent.
En effet, pour les biofilms maintenus intacts lors de l’exposition, ceux-ci sont influencés
principalement par le temps d’incubation. Que que soit le paramètre observé (structurel ou
fonctionnel), la maturation du biofilm s’est poursuivie dans les microcosmes. Cette évolution
temporelle se matérialise par des niveaux de biomasse plus importants après les 15 jours
d’incubation, des structures bactériennes et des profils d’utilisation de source de carbone
différents, par contre aucune différence en ce qui concerne la composition des communautés
de diatomées. Les expériences avec un biofilm de 4,4 semaines ne montrent a priori aucune
influence de l’incubation en microcosmes pour les communautés bactériennes et de diato-
mées. Par contre, les niveaux de biomasse diminuent drastiquement avec ou sans alachlore.
Une phase de dégénérescence du biofilm peut expliquer cette diminution. Cette hypothèse
se confirme par les valeurs de matière sèche sans cendre des biofilms qui ont poursuivi leur
III.4. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de
maturation 254

développement dans le RAB au-delà des 4,4 semaines et qui présentent également une perte
de biomasse. Cette dégénérescence en termes de biomasse est plus importante dans les mi-
crocosmes que dans le RAB. Le changement d’environnement lors du passage du RAB aux
microcosmes a pu fragiliser le biofilm et accentuer ce phénomène. Si l’effet potentiel de l’ala-
chlore n’est pas observé à 4,4 semaines sur le biofilm intact mais uniquement à 1,6 semaines,
peut être est-il masqué par le détachement de la biomasse, ce qui revient à dire que l’influence
de la maturation du biofilm, c’est à dire des facteurs autogènes, a prédominé sur l’influence
de l’alachlore ? La phase de stabilité recherchée au départ a été certainement dépassée, il
aurait fallu collecter les biofilms dans le RAB vers 3 semaines de culture.
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer les effets observés uniquement sur la biomasse,
par rapport à des études antérieures sur l’alachlore ou d’autres molécules appartenant à la
même famille qui occasionnent des effets sur les algues et les bactéries :
. La concentration en alachlore choisie de 10 µg.L−1 , et le niveau de contamination qui
chute durant l’expérience. Par exemple Spawn et al. (1997) observent des effets de l’alachlore
sur les teneurs en chlorophylle a à partir de 30 µg.L−1 d’alachlore. Roubeix et al. (2011a)
enregistrent des modifications dans la composition des communautés de diatomées à partir
de concentrations à 30 µg.L−1 ;
. La présence d’espèces tolérantes, notamment au niveau des diatomées. Les espèces de
diatomées dominantes sont Nitzschia palea (NLAP) et Nitzschia amphibian Grunow f. amphi-
bia (NAMP), qui sont des espèces hyper-eutrophes, c’est à dire très tolérantes à des milieux
riches en nutriments (Roubeix et al. 2011a). NLAP appartient aux espèces motiles et ont été
décrites pour être tolérantes ou indifférentes aux pesticides (atrazine, Guasch et al. 1998 ; diu-
ron, azoxystrobin et tébuconazole, Rimet et Bouchez 2011). Bien que pour d’autres études,
elles semblaient sensibles au métolachlore mais à partir de 30 µg.L−1 (Roubeix et al. 2011a) ;
. La localisation des diatomées : leur emplacement situé au contact du coupon, dans les
couches inférieures du biofilm, rend leur accès difficile pour la molécule d’alachlore. Durant la
culture du biofilm dans le RAB, les analyses des communautés algales suggèrent que lors des
premiers stades de développement, les biofilms se composent principalement de diatomées.
Nous pouvons supposer que les diatomées se trouvent être les premières à coloniser le support
et à bien se développer pour favoriser par la suite l’installation et le développement des autres
espèces (algues vertes) ;
. De fortes vitesses de courant appliquées sur le biofilm durant son développement dans
le RAB, pouvant générer un biofilm très compact, limitant ainsi la diffusion de la molécule à
l’intérieur du biofilm ;
III.4. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de
maturation 255

. Le changement de milieu entre le RAB et les microcosmes, possible source de stress. De

nombreuses études ont pu montrer que si les communautés subissent un premier stress, alors
elles répondent plus faiblement au second (Niederleher et Cairns 1992 ; Tlili et al. 2008) ;
. La sensibilité plus ou moins importante de certains paramètres mesurés. Concernant les
tests écotoxicologiques réalisés sur les suspensions de biomasse, quels que soient l’âge du bio-
film collecté au niveau du RAB et le paramètre mesuré, aucun effet de l’alachlore n’est
observé. Noack et al. (2003) suggèrent que les effets d’une exposition à 30 µg.L−1 de métaza-
chlore sont masqués par l’habilité ou non à coloniser des substrats artificiels (lame de verre).
Roubeix et al. (2011a) trouvent que le métolachlore provoque des déformations au niveau des
diatomées. Il est possible que ces déformations confèrent à ces diatomées une incapacité à se
fixer. Ainsi, une sélection des espèces a pu se faire dans la colonne d’eau. Finalement, l’état
en suspension de la biomasse, s’est avéré être le plus résistant.

III.4.3 Conclusion et perspectives

Cette étude montre bien l’importante du design expérimental lors des tests écotoxicolo-
giques, la nécessité parfois de mettre en place une phase d’acclimatation avant de réaliser une
contamination, et de bien définir dès le début le type d’exposition (chronique ou aigüe). Il est
important d’intégrer le facteur croissance du biofilm lors de ses phases d’exposition, surtout
lorsque l’expérience se déroule sur plusieurs jours ; tenir compte de l’évolution temporelle
naturelle du biofilm est primordial. Il existe trois étapes clefs durant le développement d’un
biofilm : la colonisation d’un support vierge, l’épaississement et la phase de dégénérescence.
L’objectif de cette étude était d’évaluer la réponse du biofilm en fonction de l’étape de
son développement.
Les expériences écotoxicologiques réalisées sur des biofilms intègres d’âges 1,6 et 4,4 se-
maines permettent de déterminer l’influence du niveau de maturation entre un biofilm en
phase d’épaississement et un biofilm en fin de phase d’épaississement. Ces deux niveaux de
maturation se différencient par leurs compositions et diversités algales et bactériennes.
Les expériences écotoxicologiques réalisées sur des suspensions de biofilms permettent de
déterminer l’influence de l’alachlore sur les 15 premiers jours de colonisation des supports.
Niveau de maturation et stade de développement confondus, l’alachlore engendrait une per-
turbation uniquement sur la biomasse des biofilms intacts. En ce qui concerne les structures
bactériennes et diatomiques, l’influence prédominante est gouvernée par la dynamique de
croissance des biofilms que l’on suppose masquer les effets que pourraient avoir l’alachlore.
Cette dynamique de croissance s’exprime différemment suivant à quel stade les communautés
se trouvaient en début d’expérience : (i) soit par une augmentation de la quantité de bio-
III.4. Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de
maturation 256

masse associée à une évolution des communautés bactériennes, (ii) soit par une perte. Cet
impact sur la biomasse est cohérent avec le mode d’action de l’alachlore (Böger et al. 2000).
Finalement nous ne pouvons pas affirmer si l’alachlore a eu un effet sur les communautés et
de quelle intensité, car de nombreux scénarios se présentent à nous :
. l’alachlore présente réellement une source de perturbation qui a pu être masquée : dans ce
cas les effets potentiels ont pu être masqués soit par l’évolution temporelle des communautés,
soit par un premier stress affligé aux communautés lors du passage des biofilms du bioréacteur
aux dispositifs expérimentaux ou de la mise en suspension ;
. l’alachlore présente réellement une source de perturbation mais pour des niveaux et des
temps d’exposition plus importants.
. l’alachlore ne présente que très peu d’effet soit parce que les communautés sont tolérantes
(associé à l’idée de capacité de biodégradation) soit par son mode d’action peu toxique
(comparé aux inhibiteurs de la photosynthèse).
La composition des diatomées est largement utilisée comme indicateur de l’état écologique
de l’eau, en termes de pollution trophique. Rimet et al. (2009) enregistraient le temps de
colonisation comme facteur le plus influençant sur les communautés des diatomées lors de
leur étude en microcosme. Malgré tout, certaines études en microcosme ont pu montrer que la
composition des diatomées pouvait être affectée par les pesticides aussi bien en microcosmes
(Pérès et al. 1996 ; Schmitt-Jansen and Altenburger 2005) qu’in situ (Dorigo et al. 2004 ;
Morin et al. 2009).

III.4.4 Article 6
 257

Changes in tolerance to herbicide toxicity throughout development stages of

phototrophic biofilms cultivated in rotating annular bioreactor

A. Paule1,2, V. Roubeix3, B. Lauga4, R. Duran4, F. Delmas3, E. Paul5,6,7 & J.L. Rols1,2*

1
Université de Toulouse; UPS, INP; EcoLab (Laboratoire d’écologie fonctionnelle et environnement); 118 route
de Narbonne, F-31062 Toulouse, France
2
CNRS; EcoLab; F-31062 Toulouse, France
3
Cemagref, UR REQE, 50 avenue de Verdun, F-33612 Cestas, France
4
Equipe Environnement et Microbiologie, Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l’Environnement et les
Matériaux - IPREM, UMR 5254 CNRS/UPPA, IBEAS, Université de Pau et des Pays de l’Adour, BP1155, F-
64013 Pau, France
5
Université de Toulouse; INSA; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France
6
INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France
7
CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France

Abstract

Ecotoxicological experiments have been performed in laboratory-scale microcosms to investigate the sensitivity
of phototrophic biofilm communities to pesticides, in relation with the states of biofilm maturation (age of the
phototrophic biofilms) and biomass structure (intact biofilm versus suspension). The phototrophic biofilms were
initially cultivated in a prototype of rotating annular bioreactor (RAB) of Taylor-Couette type flow under
constant operating conditions and collected after 1.6 and 4.4 weeks of culture. Alachlor effects were monitored
at different biological organization levels by the combination of biomass descriptors (ash free dry mass,
chlorophyll a) and structural molecular fingerprinting methods and diatom species composition. The present
work indicates measurable effects of alachlor on phototrophic biofilm biomass in terms of ash dry free mass on
the intact biofilm accompanied by the inhibition of primary production. This effect was coherent with the action
mode of the molecule. The tridimentional structure didn’t specially confer to biofilm a particular protection as
barrier and alachlor did not perturb the biofilm during the first state of colonisation, despite strong interactions
with the water column well known at this state of development. The absence of change in the structure and
physiological states will indicate that the function of biofilm are not damaged resulting in unperturbed overall
ecosystem functioning. This study contributes to a better knowledge of polluants toxicity on the phototrophic
biofilm and its use as bioindicator of pesticide contamination of aquatic ecosystems.
Keywords

Phototrophic biofilm; microcosm; biological succession; structure and function; T-RFLP; alachlor; toxicity.

1. Introduction
Pesticides are one of the most important source of pollution for continental aquatic environments (Kreuger
1998). By mechanisms including surface run-off, residual pesticides applied to agricultural lands migrate to
surface and ground waters (Devault, 2007). In some surface waters, phototrophic biofilms, microbial aggregates

1
 258

composed of heterotrophic micro- and meio-organisms and phototrophic micro-organisms embedded in an

exopolymeric matrix, are the first aquatic non-target organisms which interact with pesticides. These aggregates
are considered as a key compartment of aquatic environment by their contribution to most of the primary
production (Wetzel 1983), food resource for aquatic grazers (Feminella and Hawkins, 1995), mineralization and
element recycling processes (Battin et al. 2003a), absorption (Lawrence et al. 2001), and biodegradation of
chemical contaminants (Vercraene-Eairmal et al. 2010). Due to their shared physiological characteristics with
plants, the algae in phototrophic biofilms are susceptible to be biologically and biochemically perturbed by
herbicides, thus resulting in damage to overall ecosystem functioning. By numerous studies, in field, microcosm
or mesocosm, the sensitivity of phototrophic biofilms has been recorded depending on the chemical and the
structural or functional endpoint observed (Villeneuve et al. 2010), the trophic status (Pratt and Barreiro 1998)
the seasonal changes (Dorigo et al. 2004), the community composition (Guasch et al. 1997), the exposition to
herbicide level and frequency (Tlili et al. 2008 and 2011a), the phosphorus gradient (Tlili et al. 2010) and the
current velocity (Villeneuve et al. 2010).
A major challenge of the last decade has been to understand the relationship between diversity loss and
ecosystem processes (Loreau et al. 2001). Numerous studies have shown that species-rich communities produce
more biomass than species-poor communities (Zhang and Zhang 2006). Moreover, in according to
“Biodiversity-stability hypothesis” (McCann 2000), more the community is diversified and more she is stable
against any stress and contains many interactions between organisms (Villeuneuve et al. 2011b). On the early
stages of the phototrophic biofilm development, the microbial communities are mainly influenced by allogenic
factors, leading to strong exchanges with the water column (Paule et al. 2009) and thus are likely more sensitive
to chemicals.
The model of toxic molecule used in the present work was alachlor herbicide [2-chloro-N-(2, 6-diethylphenyl)-
N-(methoxymethyl) acetamide] which is extensively used as a pre-emergence chloroacetanilide herbicide
applied to corn and soybeans. This molecule is detected worldwide in surface waters (e.g. Sanchez-Camazano et
al 2005; Konstantinou et al. 2006). Chloroacetanilide herbicides are known to inhibit the elongation of very long
chain fatty acids in plants and algae (Böger et al. 2000) resulting in impaired cell development (Junghans et al.
2003; Vallotton et al. 2008). In our Knowledge, the toxicity of alachlor is mainly assessed from single-species
acute toxicity test on green algae (Fairchild et al. 1997), cyanobacteria (Singh and Datta 2005), bacteria and
protozoa (Bonnet et al. 2007), and these studies provide EC50 values. A small number of studies showed the
response of phototrophic biofilm communities (Spawn et al. 1997; Carder and Hoagland 1998).
The main objectives of our work was to assess the sensitivity of phototrophic biofilm communities to pesticides,
in relation with the states of biofilm maturation (age of the phototrophic biofilms) and biomass structure (intact
biofilm versus suspension). Phototrophic biofilms were cultivated in a prototype of rotating annular bioreactor
(RAB) of Taylor-Couette type flow under constant operating conditions (Paule et al. 2011) and collected after
1.6 and 4.4 weeks of culture. It is known that, in an undisturbed environment (e.g. constant hydrodynamic
conditions), autogenic processes appear and the more competitive species dominate (competitive exclusion),
which can explain the poor algal diversity obtained. Ecotoxicological experiments were performed in
microcosms with intact biofilms or suspension in contact with alachlor. At the end of exposition period, the
response of communities was assessed by multimetric approach including both structural (biomass and
composition) and functional descriptors.

2
 259

2. Material and Methods

2.1. Phototrophic biofilm collection
Phototrophic biofilms have been produced in a laboratory prototype of rotating annular bioreactor (RAB) of
Taylor-Couette type flow, as firstly described by Paule et al. (2011). The RAB was operated at a rotational
speed of the inner cylinder of 80 rpm, and continuously fed with a synthetic culture medium consisting of tap
water supplemented with nutrients (N03--N = 4.2 ± 0.2 mg L-1, PO43--P = 0.356 ± 0.02 mg L-1, Si02 = 10.9 ± 2.9
mg L-1, DOC = 1.1 ± 0.3 mg L-1, pH = 7.1 ± 0.2, conductivity = 368 ± 5 µS cm-1, hydraulic residence time in
RAB = 3.23 h). The inside of the RAB was illuminated by fluorescent lamps including two cool daylight (Osram
L15W/865 Luminux, Germany) and two fluora (Osram L15W/77, Germany) tubes, giving an air
photosynthetically active radiation (PAR) irradiance level of 180 ± 10 µmol s-1 m-2 (flat quantum sensor, model
LI-189, LI-COR, Inc - Lincoln - Nebraska), with light / dark periods of 16 hours / 8 hours. Seeding procedure of
the removable polyethylene plates in the RAB integrated two seeding phases conducted each for 48 hours in
closed recirculation, connected to an illuminated aquarium (10 litres) where the inoculum was incubated
(suspension of natural phototrophic biofilms collected from various river stones and filtered through a 250 and
then 100 µm pore size filter (VWR). The two seeding phases were separated by a 24-hour period where the RAB
operated in continuous culture mode, fed with the synthetic culture medium. The end of seeding phase was
defined as the start of the phototrophic biofilm culture in RAB (week 0).
During the culture in RAB, a sampling of 9 colonized plates was realized after 1.6 and after 4.4 weeks of biofilm
development (experimental conditions called “1.6 and 4.4 weeks”). Among these 9 plates of each sampling time,
6 plates were used directly for the microcosm study (experimental condition called “Plates with intact biofilm”).
The last set of 3 plates was scraped with a microscope slide previously treated with alcohol 95 % in order to
avoid all trace of DNA and the biofilm from each plate was suspended in 90 mL of filter sterilized river water
(0.2 µm pore size filter, cellulose acetate membrane, Whatman) and homogenised (tissue homogenizer at 13,500
rpm, Ultra Turrax, T25). Each biofilm suspension homogenate was subdivided into aliquots, a first 45 mL
subsample for the analyses of biomass descriptors (AFDM and chlorophyll a), diatom abundance, T-RFLP and
carbon utilization assays (Biolog), and a second 45 mL subsample, centrifuged (12,000 g for 20 min at 4°C and
resuspended in a average volume of 3.5 mL) as inoculum source for the microcosm study (experimental
condition called “Slides with suspension”).
2.2. Microcosm setup
To assess the impact of alachlor on the microbial biomasses from phototrophic biofilms, experiments were
realized with microcosms containing sampling plates from RAB, exhibiting a structured three-dimensional
biofilm, or inoculated with a suspension from sampling plate biofilm. The microcosms system consisted of glass
beakers of 500 mL (VWR). Each beaker was initially filled with 300 mL of synthetic culture medium similar to
culture medium feeding the RAB but with a twice of each nutrients concentration to avoid nutrient limitation.
The choice of the same culture medium composition allowed to avoid nutrient limitation and to limit the stress
for the microbial communities. Some beakers were contaminated with a nominal concentration of 10 µg L-1 of
alachlor, a representative environmental concentration detected in surface water (Sanchez-Camazano et al 2005;
Kuster et al 2008), and the other untreated were kept as controls. Alachlor purchased from Sigma-Aldrich (purity
99%) was dissolved in acetone to make a stock alachlor solution. Aliquots of this stock solution were then added
to treated microcosms to obtain tested final concentration. The final concentration of solvent added in each

3
 260

beaker was less than 0.005 %. Before addition of biofilm or suspension, the beakers were incubated for 5 hours
to obtain stable water chemical conditions in the microcosms.
Experiment was monitored for 15 days in triplicates. All the beakers were maintained in thermostated chamber at
20°C on rotory shakers, and illuminated by 4 cool daylight fluorescent tubes (F18W/GRO, Sylvania, Germany),
which were positioned 30 cm above beakers. The system operated with 16 h light cycles by the use of timer
switches. The illumination was measured as air PAR irradiance level by a flat quantum sensor (model LI-189,
LI-COR, Inc - Lincoln - Nebraska) at a distance from rotory shakers equivalent to the mid-height of a beaker (50
cm from the fluorescent tubes), and average recorded values were 37 ± 4 µmol s-1 m-2.
2.3. Experimental schedule
To resume, experimental conditions during the microcosm study included two biofilm development period
lengths in the RAB (“1.6 weeks” and “4.4 weeks” giving different maturation levels of phototrophic biofilms)
and two biomass structural states (biofilm and suspension).
For each biofilm age, experimental design was conducted as follows: the 6 colonized plates were sampled from
the RAB and immediately transferred in 6 beakers. Moreover, each subsample of biofilm homogenate (10 mL)
was subdivided and equally inoculated (3-5 mL) in 6 other beakers which previously contained clean glass
slides. Thus the amount of biofilm homogenate inoculated by beaker was (data) mg AFDM L-1 for 1.6 and 4.4
weeks biofilm ages, respectively. For each experimental condition (biofilm and suspension), each group of 6
beakers included 3 replicate control beakers without alachlor and 3 replicates contaminated with alachlor 10 µg
L-1. All the beakers were closed by the lid of a Petri dish, with an opening for the path of glass slides and plates.
Plastic racks placed on the lid of Petri dishes kept the substrates completely immerged in the beakers. The size of
the beakers used allowed the positioning of one plate or one glass slide per beaker.
After 5 and 15 days of incubation, water samples (100 mL) from each microcosm were collected to evaluate the
alachlor residual concentrations and the physico-chemical characteristics. The loss of water volume by
evaporation was compensated by addition of distilled water. At the end of experiments, the totality of glass slides
and plates were sampled to assess the biofilm response to alachlor exposure. Each plate or slide represented one
replicate. Biofilms were removed from plates and slides by scraping with a microscope slide previously treated
with alcohol. Biofilms were suspended in 50 mL (biofilm from slides) or 90 mL (biofilm from plates) of tap
water previously filtered through a 0.2 µm pore size filter (cellulose acetate membrane, Whatman) and
homogenized (tissue homogenizer at 13,500 rpm, Ultra Turrax, T25). From these homogenates (50 or 90 mL),
aliquots were taken for analyses of biomass descriptors, diatom composition by microscopic counting, bacterial
community structure by T-RFLP, and carbon utilization assays.
2.4. Physico-chemical parameters
Water conductivity, temperature, dissolved oxygen concentration and nutrient concentrations including nitrates,
silica, and orthophosphates, and dissolved organic carbon (DOC) concentrations were measured as described by
Paule et al. (2011). For the measurement of residual alachlor concentrations, the samples (5 mL) were filtered
through Whatman GF/F glass fibre filters (0.7 µm pore size) and analyzed at “Laboratoire Départemental de
l’Eau” (Toulouse, France), using high performance liquid chromatography coupled tandem to mass spectrometry
(HPLC-MS-MS, Thermo Fisher, model E-Quan TSQ Quantum ultra) with ionization electron spray source and
equipped with a pre-concentration column (Thermo Fisher Hypersil GOLD C18, 12 µm particle size, 20 x 2.1

4
 261

mm), by a direct sample injection. The sample volume was 2 mL. The alachlor separation was monitored using a
Thermo Fisher Hypersil GOLD C18 (3 µm particle size, 50 x 2.1 mm) column.
2.4. Biofilm characterizations
2.5.1. Biomass descriptors
From the biofilm suspension homogenate, the dry mass (DM) and the ash free dry mass (AFDM) (aliquot of 5
mL or more), and chlorophyll a were measured as described by Paule et al. (2009).
2.5.2. Diatom composition
Diatom composition was estimated from an aliquot of 5 mL of the biofilm suspension homogenate, preserved in
formalin solution (3 %) and stored in the dark until analysis at “Cemagref” (Bordeaux, France). Identification
and counting of diatoms of 400 frustules were performed as described previously by Roubeix et al. (2011).
2.5.3 Carbon source utilization profiles
Community level analysis of carbon source utilization profiles for all experimental conditions were evaluated by
using commercial Eco-plates (Biolog, Hayward, CA, USA) (Konopka et al. 1998). Each microplate was
inoculated with 100 µL of an aliquot of biofilm suspension homogenate previously filtered on polycarbonate
filter (0.3 µm pore size, GS 25 mm, Whatman) and then incubated in the dark at 20°C for 7 days. Each
microplate was used for one experimental condition (3 replicates). The absorbance was measured every day at
590 nm using a multi well plate reader (Spectro Max plus 384, Molecular Device). For every absorbance value,
the controls were subtracted. For statistical analysis, the net absorbances at 168 hours of incubation were used.
The substrates were grouped by guild following their chemical structure (Choi and Dobbs 1999): amines, amino
acids, carbohydrates, carboxylic acids, polymers and phenolic compounds.
2.5.4. Bacterial community structure
After centrifugation (12,000 g at 4°C for 20 min, Heraeus Multifuge) of an aliquot of 20 to 50 mg dry mass of
the biofilm suspension homogenate (Lyautey et al. 2005b), the pellet was stored at -80°C until further analysis.
Genomic DNA extraction was performed on the pellet using a DNeasy Plant Mini Kit according to the
manufacturer’s protocol (Qiagen Laboratories). The integrity of the extracted DNA was checked as described by
Paule et al. (2009).
The 16S rRNA genes were amplified by PCR and the bacterial community structure was studied by T-RFLP as
described by Paule et al. (2011). Restriction digestion was performed with HaeIII, HinfI and Hpa. T-RFLP
profiles were aligned by a web-based tool, T-Align (http://inismor.ucd.ie/~talign/) as previously described by
Smith et al. (2005) with the confidence interval of 0.5.
2.6. Data analysis
The difference in physico-chemical characteristics and the difference in AFDM, chlorophyll a and the number of
T-RFs between biofilm samples were assessed with the Mann Whitney test using SPSS software 13.0.
Differences were considered statistically significant at p ≤ 0.05.
To assess changes in the bacterial community structure in microcosms, a Principal Component Analysis (PCA)
was performed from the log-transformed T-RF abundance data. A hierarchical cluster analysis was performed
based on the log-transformed diatom abundance date. PCA and hierarchical cluster analyses were realized on the
samples clustered following biomass structure state (intact biofilm versus suspension), using Primer v6 software
(PrimerE, Ltd, Lutton, United Kingdom). Peaks < 0.5 % of the total area were excluded from the analysis and T-
RFs that differed in size by 0.4 bp or less were considered to be identical. As described by Leflaive et al. (2005),

5
 262

a PCA was conducted on the “pi” values defined as the sum of optical density (OD) of each guild previously
multiplied by a correcting factor, and subdivided by the sum of all guilds. This correcting factor corresponded to
the number of substrates in the largest guild divided by the number of substrates of each guild and allowed
standardization of the weighting of the different guilds.
Statistical analyses of PCA were run using an analysis of similarity (ANOSIM) via primer v6 software on Bray
Curtis similarity matrices generated from T-RF abundance or “pi” value data. This analysis generates a global R
value in the range from 0 (completely random pattern) to 1 (completely separated groups) (Clarke 1993). The
global R value was considered statistically significant at p < 0.05 uncorrected.
3. Results
3.1. Characterisation of phototrophic biofilms collected in RAB
The number of T-RFs was 14.8 ± 4.4 and 10.7 ± 0.6 for 1.6 and 4.4 weeks-old biofilms,
respectively. The 1.6 weeks-old biofilm exhibited lower AFDM values (1.12 ± 0.28 mg cm-2)
than 4.4 weeks-old biofilm (2.45 ± 0.30 mg cm-2) (p > 0.05), but exhibited similar chlorophyll
a values of average 13 ± 3 µg cm-2 (Figure 1, for T0 conditions). The 1.6 weeks-old biofilm
was composed of 33 % Diatoms, 51.7 % Chlorophyceae, and 14.9 % Cyanobacteria with the
following dominant species: 31.5 % of Nitzchea, 28 % of Scenedesmus and Desmodesmus and
13 % of Lynbdya spp. In contrast, 4.4 weeks-old biofilm was composed of 4.1 % Diatoms
(only Nitzchia) and 95.5 % of Chlorophyceae with the dominant species 74.9 % of
Scenedesmus. Moreover the 1.6 weeks-old biofilm exhibited higher specific algal richness
(13) than the 4.4 weeks-old biofilm (7).
3.2. Physico-chemical parameters in microcosms
Physico-chemical parameters measured in water samples from control and alachlor treated
microcosms during both ecotoxicological experiments are presented in Table 1. Values of pH
and conductivity were relatively homogenous throughout the experiment irrespective of the
experimental conditions. For temperature, incidentally higher values were observed after 5
days of incubation in some microcosms, and were corrected immediately. Although, a
decrease of nitrate and orthophosphate levels was recorded, an increase in DOC was detected
throughout the times of incubation. Similarly, a residual alachlor concentration reduction was
observed over time. Observations are similar between the both experiments “1.6 weeks” and
“4.4 weeks”.

6
 263

Temperature Conductivity DO DOC NO3-N SiO2 PO4-P Alachlor

Biofilm age Sample Day pH (°C) (µS cm-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (µg L-1)

1.6 weeks Co-plate 5 10.6 21.1 401.3 17.2 4.6 5.6 24.1 0.009 n.a.
15 10.9 20.5 386 21.5 10.4 0.03 20.7 0.009 n.a.
A10-plate 5 10.4 23.1 385 16.6 4.4 5.1 21.8 0.006 5.7
15 10.5 20.2 334.7 19.6 11.1 0.01 20.2 0.008 0.25

Co-slide 5 11.1 28.2 422.3 n.a. 4.5 4.9 35.4 0.002 n.a.
15 10.0 21.4 420.3 n.a. 6.7 0.04 37 0.004 n.a.

A10-slide 5 11.3 27.8 395.3 n.a. 4.7 3.01 28.7 0.006 7.8
15 10.8 22 391 n.a. 7.4 0.09 33.5 0.004 0.69

4.4 weeks Co-plate 5 10.8 27.5 385.3 n.a. 6.9 1.9 18.7 0.002 n.a.
15 9 23 418 n.a. 15.1 0.1 40.8 0.009 n.a.

A10-plate 5 10.8 28 357.3 n.a. 6.1 2.4 11.5 0.022 7

15 9.6 21.1 379 n.a. 15.6 0.1 28.4 0.009 0.08

Co-slide 5 10.9 22.4 376.7 15.6 3.1 4.2 25.3 0.007 n.a.
15 10.4 20.3 371 17.6 5.4 0.02 26.7 0.004 n.a.

A10-slide 5 10.5 21.8 379 18.6 3.4 3.9 24.7 0.005 9.3
15 10.7 20.3 346 17.2 6.5 0.02 25.4 0.006 0.68

Table 1: Physico-chemical characteristics throughout ecotoxicological experiments (mean ±

SD) measured at 5 and 15 days of microcosms incubation for all different experimental
conditions (1.6 or 4.4 weeks biofilms, plates with intact biofilm from RAB or slides with
suspension of unstructured biofilm biomasses from RAB plates, control (Co) or treated by
alachlor 10 µg L-1 (A10)). DOC: dissolved organic carbon concentration; DO: dissolved
oxygen concentration; ESA: Alachlor ethanesulfonic acid and OA: Alachlor oxanilic acid.
Quantification limits: Alachlor 4 pg g-1, ESA 9 pg g-1, OA 20 pg g-1; n.a.: not analysed.

3.3. Phototrophic biofilms response to alachlor exposure in microcosms

3.3.1. Biomass descriptors
The Figure 1 presents the impact of alachlor exposure on the biomass descriptors (AFDM and
chlorophyll a) for the different experimental conditions. The biofilms sampled in the control
and alachlor treated microcosms at the end of both experiment “1.6 weeks” and “4.4 weeks”
exhibited AFDM values ranged from 0.25 to 1.75 mg cm-2 and from 0.15 to 0.45 mg cm-2, and
chlorophyll a values ranged from 9.5 to 13.5 µg cm-2, and from 0.05 to 0.1 µg cm-2 for the
experimental conditions called “Plates with intact biofilms” and “Slides with suspension”,
respectively. Alachlor induced significant effects on AFDM for the experimental conditions
“1.6 weeks and Plates with intact biofilm” (Mann Whitney, p < 0.05), associated to processes
of loss of biomass and/or inhibition of the growth (Figure 1A). No significant effect of
alachlor was observed on the chlorophyll a irrespective of the structural state of biomasses

7
 264

(biofilm or suspension) incubated at the start of experiment (Mann Whitney, p > 0.05) (Figure
1B). Biofilms of the experimental conditions “4.4 weeks and Plates with intact biofilm”
sampled at the end of the microcosm experiment exhibited high loss of biomass irrespective
of treated and control microcosms due to the microcosm incubation period (p < 0.05).
A B

3.0 25
d
2.5 a
Ash free dry mass (mg cm )

20
-2

Chlorophyll a (µg cm )
-2
b a
2.0 a
a
15
1.5 a
a a
10
1.0
c
e b 5
0.5 b
e aa
a a aa
0.0 T0 0
4.4 weeks 1.6 weeks 4.4 Co
1.6
1.6 weeks
weeks 4.4
4.4weeks
weeks 1.6
1.6weeks
weeks 4.4 weeks
weeks 1.6
1.6 weeks
weeks 4.4
4.4 weeks
4.4weeks 1.6
weeks 1.6 weeks
1.6weeks
weeks 4.4
4.4 weeks
weeks
A10
Plate
Biofilm
Biofilm Suspension
Slide
Suspension Plate Suspension
Slide
Suspension
Biofilm
Biofilm

Figure 1: Plots of AFDM (A) and chlorophyll a (B) values (± SD, n = 3) after 15 days of
incubation in the control (Co) and exposed to alachlor 10 µg L-1 (A10) microcosms according
to the different experimental conditions (1.6 and 4.4 weeks: ages of biofilms when collected
in the RAB, plates with intact biofilm from RAB or slides with suspension of unstructured
biofilm biomasses from RAB plates). “T0” indicated the date where fresh biofilm plates were
sampled after 1.6 and 4.4 weeks of biofilm development in the RAB.

3.3.2. Bacterial communities

The response of bacterial communities from phototrophic biofilms exposed to alachlor in
according to its level of maturation and structural state were determined by T-RFLP. The
three restriction enzymes used in this study provided an average number of T-RFs per sample
ranged from 70 to 97 for the bacterial communities from “Slides with suspension”.
No significant alachlor effect was observed on the T-RFs numbers irrespective the
experimental conditions (p > 0.05). Principal component analysis (PCA) was performed on
the T-RF log-transformed abundance data in according to the structural state of biomasses
incubated at the start of experiment (Figure 2). The two axes accounted for 44.4 and 17.8 %
of the total variance for the experimental condition “Plates with intact biofilm” (Figure 2A)
and for 54.8 and 12 % for the experimental condition “Slides with suspension” (Figure 2B).
This analysis was strengthened by the similar trends observed with PCAs built with the first
and third axes. The first three axes accounted for 74.7 and 71.5 % of the variation of T-RFLP

8
 265

patterns for both experimental conditions “Plates with intact biofilm” and “Slides with
suspension”, respectively (data not shown).
For the experimental condition “Plates with intact biofilm” (Figure 2A), PCA shows temporal
variations of bacterial communities from 1.6 weeks-old biofilm through microcosm study
(ANOSIM, global R = 1, p = 0.01). But no temporal variation was observed for the 4.4
weeks-old biofilm incubated on plates. For the experimental condition “Slides with
suspension” (Figure 2B), the profiles of bacterial community structure were distributed
according to the maturation level of biofilms incubated (1.6 versus 4.4 weeks) (ANOSIM,
global R = 0.981, p = 0.01).
No change of the bacterial community structure was induced by the alachlor exposure
compared to the control, irrespective of the maturation level (1.6 and 4.4 weeks) and
structural state of biomasses incubated at the start of microcosm experiment (Figure 2A,
ANOSIM, R = 0.122, p = 0.25) (Figure 2B, ANOSIM, global R = -0.093, p = 0.71).
5
A B
5
PC2 (12 %)
PC2 (17.8%)

0
0

-5 -5
-10 -5 0 5 -6 -4 -2 0 2 4 6
PC1 (44.4%) PC1 (54.8%)

Figure 2: Changes in the bacterial community structure assessed by Principal Component

Analysis (PCA) based on the T-RFLP data after 15 days of incubation in the control (white
symbols □ and ○) and exposed to alachlor 10 µg L-1 (black symbols ■ and ●) microcosms
according to the different experimental conditions (1.6 weeks (squares □ and ■) and 4.4
weeks (circles ○ and ●) biofilms, plates with intact biofilm from RAB (A) or slides with
suspension of unstructured biofilm biomasses from RAB plates (B). Symbols “star” and
“cross” in (A) design the results for fresh biomasses sampled after 1.6 and 4.4 weeks of
biofilm development in the RAB, respectively. Big circles correspond to a similarity between
samples of 70 %.

9
 266

3.3.3. Carbon source utilization profiles

PCAs were performed on the guild categorization of total activity of different microbial
communities in according to the structural state of biomasses incubated at the start of
experiment (Figure 3). The two axes accounted for 62.6 and 18.3 %, and 77.2 and 13.2 % of
the total variance for the “Plates with intact biofilm” and for the “Slides with suspension»,
respectively. This analysis was strengthened by the similar trends observed with PCAs built
with the first and third axes. The first three axes accounted for 90.2 and 95 % of the variation
of T-RFLP patterns for the conditions “Plates with intact biofilm” and “Slides with
suspension”, respectively (data not shown).
No significant effect of alachlor was observed on the carbon source utilization profiles
irrespective of the different experimental conditions considered (Figure 3A, ANOSIM, R =
0.093, p =0.2) (Figure 3B, ANOSIM, global R = 0.278, p = 0.9). For the biofilms of the
experimental condition “Slides with suspension”, the communities from 1.6 weeks-old
biofilm exhibited a tendency to use the carboxylic acids and carbohydrates although the
communities from 4.4 weeks-old biofilm preferentially seemed to use the amines and
phenolic compounds (Figure 3B).
As consistent with the analysis of bacterial community structure (Figure 2), the PCA in
according to the experimental condition “Plates with intact biofilm” showed temporal
variations of bacterial communities from 1.6 weeks-old biofilm through incubation
(ANOSIM, global R) accompanied by changes in the preferential utilization of carbon source
(Figure 3A) . Conversely, no significant temporal variation was observed for the bacterial
communities from 4.4 weeks-old biofilm.

10
 267

0.3
pc
0.2

PC2 (18.3%)
0.3
A 0.1

0 p cac aa
0.2 a
-0.1
PC2 (18.3%)

0.1 -0.2
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
PC1 (62.6%)
0

-0.1

-0.2
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
PC1 (62.6%)
0.2

0.1 aa ac
PC2 (13.2%)

c
0
pc
B a
0.2 -0.1
p
-0.2
0.1 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
PC1(77.2%)
PC2 (13.2%)

-0.1

-0.2
-0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
PC1 (77.2%)

Figure 3: Results of the Principal Component Analysis (PCA) carried out on the carbon
source group utilized (net optical density at 168 h) by microbial communities after 15 days of
incubation in the control (white symbols □ and ○) and exposed to alachlor 10 µg L-1 (black
symbols ■ and ●) microcosms according to the different experimental conditions (1.6 weeks
(squares □ and ■) and 4.4 weeks (circles ○ and ●) biofilms, plates with intact biofilm from
RAB (A) or slides with suspension of unstructured biofilm biomasses from RAB plates (B).
Symbols “star” and “cross” design the results for fresh biomasses sampled after 1.6 and 4.4
weeks of biofilm development in the RAB, respectively. Big circles correspond to a similarity
between samples of 70 %. For (A) and (B), projection of the variables (carbon source guild)
on the component planes with a: amines; aa: amino acids; c: carbohydrates; ac: carboxylic
acids; p: polymers; pc: phenolic compounds.

11
 268

3.3.4. Diatom communities

Among a total of 10 diatom species identified throughout the microcosm experiments, 10 and
7 dominant species had a relative abundance > 1 %, for the diatom communities from “Plates
with intact biofilm” and “Slides with suspension”, respectively, and were considered as the
characteristics of each diatom communities (Figure 4). The dominant species were similar
between the diatom community native to the “suspension and intact biofilms” (Figure 4A and
B). For the diatom communities of the experimental condition “Slides with suspension”
(Figure 4B), compositions were divergent depending on maturation level of biofilms
incubated (1.6 and 4.4 weeks) (ANOSIM, global R = 1, p = 0.01). The diatom communities
from 1.6 weeks-old biofilm were mainly composed by NPAL, NAMP and EMIN, and the
communities from 4.4 weeks-old biofilm were essentially composed by EMIN and NPAL
associated to different proportions (Table 2). Diatom communities which were collected at the
end of microcosm experiment exhibited no significant change induced by alachlor exposure,
irrespective of structural state and maturation level of biofilms incubated at the start of
microcosm experiment (experimental condition “Plates with intact biofilm”: ANOSIM, global
R = 0.185, p = 0.14) (experimental condition “Slides with suspension”: ANOSIM, global R =
0.074, p = 0.5).
For the experimental condition “Plates with intact biofilm”, no temporal variation was
observed through incubation, with diatom communities mainly composed of NPAL (82 to 87
%) (Table 2). For this experimental condition, the senescence quality of biofilms samples
from 4.4 weeks-old biofilm didn’t allow to count and identify the diatom species. Data from
these samples were thus not included in the analysis. No significant abnormal form of diatom
communities was observed in response to alachlor treatments (data not shown).

12
 269

Group average

1.6-T0a
A
1.6-T0b

1.6-T0c

1.6-A10c
Samples

1.6-Coa

1.6-A10a

1.6-A10b

1.6-Cob

1.6-Coc

100 95 90 85 80 75
GroupSimilarity
average (%)

1.6-Cob

1.6-A10a
B
1.6-Coa

1.6-Coc

1.6-A10b

1.6-A10c
Samples

4.4-A10a

4.4-Coc

4.4-A10c

4.4-A10b

4.4-Coa

4.4-Cob

100 80 60 40
Similarity (%)

Figure 4: Cluster of the similarity in taxonomic composition of diatom communities after 15

days of incubation in the control (Co) and exposed to alachlor 10 µg L-1 (A10) microcosms in
triplicates (a, b and c) according to the different experimental conditions (1.6 weeks (1.6) and
4.4 weeks (4.4) biofilms, plates with intact biofilm from RAB (A) or slides with suspension of
unstructured biofilm biomasses from RAB plates (B)). “T0” indicated the date where fresh
biofilm plates were sampled after 1.6 and 4.4 weeks of biofilm development in the RAB. The
senescence quality of biofilms samples from 4.4 week-old biofilm in (A) didn’t allow to count
and identify the diatom species. The letters a, b and c indicate replicates from same
experimental condition.

13
 270

Sample Biofilm age Condition NPAL NAMP EMIN GPAR EOMI ESBM DIAT MAPE GGRA NAPE CPLA GTRU

Plate 1.6 weeks T0 87.8 3.0 1.8 2.8 - 1.9 - 0.3 1.5 0.3 0.2 -
Co 82.8 2.6 6.5 1.8 - 3.4 2.3 - - 0.1 - 0.1
A10 82.2 5.2 5.6 2.0 - 2.3 1.6 - - 0.1 0.3 0.4
Slide 1.6 weeks Co 67.7 6.5 15 5.3 - 2.0 0.3 1.3 0.9 - 0.3 0.3
A10 71.2 6.6 8.8 6.3 - 3.2 0.8 0.3 0.2 1.5 0.2 0.2

4.4 weeks Co 32.5 58.0 - 1.3 6.0 - - 0.6 - - 0.3 0.1

A10 33.3 54.4 - 1.2 8.4 - - 0.6 0.3 - 0.3 -

Table 2: Mean (± SD) (n= 3) relative abundance of dominant species representing more than
1% relative abundances in all samples, of diatom communities after 15 days of incubation in
the control (Co) and exposed to alachlor 10 µg L-1 (A10) microcosms according to the
different experimental conditions (1.6 and 4.4 weeks biofilms, plates with intact biofilm from
RAB, slides with suspension of unstructured biofilm biomasses from RAB plates), NPAL:
Nitzschia palea; NAMP: Nitzschia amphibia; EMIN: Eunotia minor; GPAR: Gomphonema
parvulum; EOMI: Eolimna minima; ESBM: Eolimna subminuscula; DIAT: not identified;
MAPE: Mayamaea atomus; GGRA: Gomphonema gracile; NAPE: Navicula atomus; CPLA:
Cocconeis placentula; GTRU: Gomphonema truncatum. “T0” indicated the date where fresh
biofilm plates were sampled after 1.6 and 4.4 weeks of biofilm development in the RAB. The
senescence quality of biofilms samples from 4.4 weeks old biofilms didn’t allow to count and
identify the diatom species.

4. Discussion
The objectives of the present study were to assess the alachlor toxicity on microbial
communities of phototrophic biofilm in relation with its maturation level and biomass
structural states. In this context, phototrophic biofilm was cultivated in RAB, and collected at
two development period lengths, 1.6 and 4.4 weeks. Ecotoxicological experiments were
realized with microcosms which contained sampling plates from RAB, exhibiting a structured
three-dimensional biofilm, or inoculated with a suspension of biofilms from sampling plates.
Both structural states simulated different biofilm development stages, the phase of
colonization of micro-organisms on artificial substrates (Slides with suspension) and the
phase of biofilm growth and thickening (Plates with intact biofilm).
Phototrophic biofilm grown in RAB under stable operating conditions (Paule et al. 2011), was
preferred to the use of natural phototrophic biofilms collected in situ. Thus the growth of
biofilms was mainly drive by autogenic factors, and favoured the development of algal
poorly-diversified biofilm (13 and 7 species, respectively for 1.6 and 4.4 weeks-old biofilms).
In terms of bacterial communities, both biofilms cultivated in the RAB exhibited different
structure and function (carbon source utilization). The characteristics of phototrophic biofilms
used for the ecotoxicological experiments presented successful compared to our needs. The
choice of sampling dates (1.6 and 4.4 weeks) of phototrophic biofilm was based on the

14
 271

dynamic of phototrophic biofilm growth occurring in previous study in this RAB (Paule et al.
2011). The biofilm growth is defined by an accretion phase related to colonization and growth
processes and characterized by an increase of AFDM resulting in a biomass peak (Biggs
1996). Moreover, the bacterial community structure assessed by T-RFLP shifted according to
colonization time followed by a stable phase after 3 weeks of culture (Paule et al. 2011).
During the microcosm experiments, factors which influence the growth of phototrophic
biofilms were maintained constant (light, temperature, hydrodynamic), thus the difference
recorded between controls (Co) and alachlor-treated (A10) microcosms are supposed to be
caused by the presence of alachlor. Levels of alachlor in the treated microcosms decreased
over time at both experiments (“1.6 and 4.4 weeks”) (rajouter half-life time
microcosms/literature). In aquatic ecosystem, the fate of alachlor is influenced by different
mechanisms, volatilization, photodegradation (Chesters et al. 1989), biodegradation (Graham
et al. 1999), and rarely the adsorption (Laabs et al. 2007). The biotransformation is well
known to be the main factor mediating the persistence of alachlor in the natural environment
(Stamper and Tuovinen 1998). Diatoms often constitute a major component of the algal
communities of river biofilms (Blinn et al. 1980), and are used to assess water quality in terms
of organic and nutrient pollution by a variety of biotic indices (Coste et al. 2009). Thus, we
decided to observe only diatom species in our phototrophic biofilm samples. Moreover, recent
studies have provided encouraging results suggesting that diatoms could be a pertinent tool in
herbicide risk assessment (e.g. Roubeix et al. 2011b; Rimet and Bouchez 2011).
No significant change caused by the alachlor exposure for 15 days was observed in the
present study in terms of bacterial and diatom community structure. Only the biomass was
impacted for the conditions “1.6 weeks and Plates with intact biofilm” and “4.4 weeks and
Slides with suspension”, associated to processes of inhibition of the growth. This observation
is coherent with the mode of alachlor action. The chloroacetanilide herbicides are well known
to inhibit the elongation of unsaturated chain fatty acid in plants and algae (Böger et al. 2000),
thus to inhibit the cell development. Spawn et al. (1997) observed similar results on the
biomass, a significant negative effect by 21 days of 10 µg L-1 alachlor (chlorophyll a and
AFDM), accompanied of changes of dominant algae at higher level of alachlor (30 µg L-1).
In our knowledge, few studies have investigated the toxicity of alachlor at community –level
on phototrophic biofilms (e.g. Spawn et al. 1997; Carder and Hoagland 1996), whereas some
studies have explored the impact of metolachlor or acetochlor, other chloroacetanilide
herbicides (e.g. Roubeix et al. 2011a; Debenest et al. 2009; Noack et al. 2003).

15
 272

Tolerance of microbial communities to alachlor when structured in biofilms may be explain

by (i) the presence of tolerant species, (ii) the presence of other perturbation appeared during
the exposition, as observed by Tlili et al. (2008), communities which previously seem to have
been impacted by other stresses (here changes of operating conditions) often respond weakly
to second stress (Niederlehner and Cairns 1992; Tlili et al. 2008), (iii) a shorter exposure
period associated to the disappearance of alachlor level over time (iv) the thickness of biofilm
which may act as a protection barrier and limiting transfers (Wicke et al., 2008), and (v)
strong nutrient concentrations. Dominant diatom species, Nitzschia palea (NLAP) and
Nitzschia amphibian Grunow f. amphibia (NAMP) are well known to be hyper-eutraphentic
species and thus tolerant to rich-nutrient culture medium (Roubeix et al. 2011a et b). NLAP
exhibited to be a motile guild (Rimet et Bouchez 2011) was recorded resistant to atrazine
exposure (Guasch et al. 1998; Downing et al. 2004), exhibited an abundance increase with
pesticide contamination (diuron, azoxystrobin and tebuconazole, Rimet et al. 2011) and to
seem indifferent to diuron exposure in other study (Roubeix et al. 2011). Whereas, during a
metolachlor exposure, the authors underlined low abundance level for Nitzchia palea and may
be considered sensitive to metolachlor (Roubeix et al. 2011). Jurgensen and Hoaglang (1990),
observed that the changes of hydrodynamic conditions mainly influenced phototrophic
biofilms compared to pulse atrazine exposure. Lynch et al. (1985) showed similar results for
seasonal variations compared to atrazine contamination. It is difficult to distinguish between
the response of communities to herbicide exposure and that of other environmental factors
and stresses (Villeneuve et al. 2010). The low algal diversity of biofilms did not confer more
sensitivity to intact biofilm, and prevent to continue its growth illustrated by an increase of
AFDM values and temporal changes of bacterial community structure and function during the
incubation period for biofilm collected at 1.6 weeks.
Villeneuve et al. (2010) underlined that biofilm from their heterogeneous mesocosms were
not more resistant to herbicide than biofilms from their homogeneous mesocosms.
Intact biofilms from the experiment “4.4 weeks” were mainly affected by incubation period,
illustrated by a high loss of AFDM irrespective treatments (Co and A10), which could suggest
an aging phase occurred during the microcosm experiments (Biggs 1996) in according with
the senescence quality of samples. This aging phase could mask the effect induced by alachlor
in our study. During the dynamic of phototrophic biofilm growth, in absence of perturbation
(undisturbed conditions), the autogenic factors predominant appear and induce an autogenic
detachment (Boulêtreau et al. 2006) but rarely observed in natural environmental (Biggs
1996). In the most case, perturbations including hydrodynamic perturbations provoke this

16
 273

detachment. Pesticides occur most frequently during event of high flow. This leads us to
wonder about the effect relevance of alachlor on the phototrophic biofilm in natural condition.
Concerning the biofilm of slides from suspensions, a selection of alachlor tolerant species
before their fixation on glass slides can explain the absence of measurable effect. As observed
by Noack et al. (2003) during contamination experiments by metazachlor, we can supposed
that ability to growth on artificial substrates (glass slides) highly conditioned the structure and
function of biofilm compared to alachlor presence. Despite the algal poorly-diversified
communities from suspension inoculated in the microcosms and the contamination by
herbicide, the colonisation and growth of biofilms were achieved. Finally, state of
development the most sensitive to the water column seem here the less affected by the
presence of herbicide.
5. Conclusion
In conclusion, the present work indicates that exposure to alachlor miming contamination
level occurred during events in river of high water only induced measurable effects on
phototrophic biofilm biomass in terms of AFDM on the intact biofilm accompanied by the
inhibition of primary production. This effect was coherent with the action mode of the
molecule. The tridimentional structure didn’t specially confer to biofilm a particular
protection as barrier and alachlor did not perturb the biofilm during the first state of
colonisation, despite strong interactions with the water column well known at this state of
development. Ecologically, this reduction of the amount of algal biomasses could impair the
quality of biofilm as a food resource for the aquatic grazers. Furthermore, the absence of
change in the structure and physiological states will indicate that the function of biofilm are
not damaged resulting in unperturbed overall ecosystem functioning. Future research could be
realized for the study of additional functional descriptors, including the use of newer
molecular tools such as real time PCR to determine the expression of target genes coding for
enzymes implicated in various river biofilm functions (e.g., denitrification, Chénier et al.
2003). It will be interesting to investigate the effect of herbicide exhibiting different action
mode (isoproturon, diuron) on similar design experiment.
Our results showed the difficult to distinguish the impact of pesticide and that of other
perturbations, such as operating conditions, age of biofilm. In natural environment, the
occurrences of herbicide can often to be accompanied by other perturbations including to high
nutrient level or hydrodynamic perturbations. Thus, in the ecotoxicological experiment, it is
essential to integrate the presence of stress during pesticide contamination.

17
 274

This study contributes to a better knowledge of polluants toxicity on the phototrophic biofilm
and its use as bioindicator of pesticide contamination of aquatic ecosystems. A multitude of
effects induced by the pesticides are observed in the literature and it is necessary to have a
better standardization (Sabater et al. 2007).
Acknowledgements
This work was funded by the French National Programme EC2CO – Environmental
Microbiology - and by the Midi-Pyrénées Council Programme of the Pyrenean working
community. We thank J- L. Druilhe for the electrical device for continuous physico-chemical
measurement in RAB, S. Karama for assistance with the T-RFLP method and S. Mastrorillo
for field assistance. We also thank D. Dalger and T. Louis for bioreactor handling assistance.

18
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 275

III.5 Conclusion et perspectives du chapitre 3

Ce chapitre est plus axé sur une approche « écotoxicologique » alors que le précédent
était axé sur une approche « écologique ». Les notions de dynamique de croissance et de
successions écologiques qui s’installent durant la maturation d’un biofilm, ont été explorées
dans le sous-chapitre 2 et ont constitué le fil conducteur des 3 expériences écotoxicologiques
réalisées dans le cadre de ce chapitre. D’une manière générale, cette approche écotoxicologique
nous a permis de formuler les conclusions suivantes :
(i) ce chapitre confirme d’un point de vue analytique la nécessité d’intégrer une ana-
lyse à différents niveaux d’organisation biologique (organismes, populations, communau-
tés. . . ) associée à une combinaison de paramètres structurels et fonctionnels, et en intégrant
l’histoire du biofilm, son stade de maturation, et la persistance et l’action du polluant testé.
Le choix des paramètres de mesure sont à adapter en fonction du mode d’action de la mo-
lécule et des effets que l’on souhaite observer, effets réversibles ou non par exemple. Comme
souligné par Sabater et al. (2007), les descripteurs de biomasse sont les plus pertinents pour
observer les effets à court terme alors que les descripteurs structurels sont souvent révélateurs
des effets à long terme. Ce chapitre nécessiterait la mesure de descripteurs fonctionnels et
structurels supplémentaires pour certaines expériences, incluant par exemple la mesure de
la structure des Eucaryotes (par DGGE ou T-RFLP sur du 18S), le comptage et la déter-
mination des algues, certaines fonctions qualifiés de « service écologique » (e.g. production
primaire, biodégradation. . . ), pour une discussion écologique plus pertinente. Augmenter le
nombre et la diversité des descripteurs peut permettre l’amélioration de la détermination
et de la distinction des effets de l’alachlore par rapport aux effets engendrés par les autres
facteurs externes et les successions temporelles des populations. En effet, les périodes d’expo-
sition à l’alachlore durant les deux expériences réalisées en batch (23 et 15 jours) (Articles
4 et 6) sont telles que l’évolution temporelle des biofilms s’est poursuivie, masquant ainsi les
effets potentiels engendrés par l’herbicide. D’après les descripteurs mesurés, si nous essayons
de déterminer le stade de développement au moment de l’exposition des biofilms testés, en
se basant sur le modèle de l’évolution de la biomasse élaboré par Biggs (1996), (1) pour
l’article 6, les biofilms de 1,6 semaines se situent au niveau de la phase exponentielle du
modèle, gouvernée principalement par des facteurs allogènes, (2) toujours pour l’article 6,
les biofilms de 4,4 semaines entamaient leur phase d’autodétachement et (3) pour l’article
4, nous supposons avoir des biofilms « matures » qui ont également atteint leur niveau de
biomasse maximum. Quelle que soit l’expérience et le biofilm considéré, l’influence tempo-
relle est prépondérante sur les changements de structure des communautés bactériennes et
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 276

des communautés de diatomées. Chacun de ces biofilms cités plus haut ont poursuivi leur
maturation.
Ce chapitre confirme bien la pertinence des études en microscopie confocale, ce qui permet
d’obtenir une évolution de la biomasse plus affinée que les analyses de chlorophylle a et de
matière sèche sans cendre. Les inconvénients d’une telle technique résident dans le biais ap-
porté par une fraction phototrophe trop importante et dans la nécessité d’analyser un biofilm
peu épais. Cette étude suggère que pour une molécule de la famille des chloroacétanilides, en
accord avec leur mode d’action, les paramètres de biomasse qualifiés de descripteurs globaux
sont en phase avec leur mode d’action. Ces descripteurs présentent une grande sensibilité dans
la réponse à une exposition à un chloroacétanilide (Spawn et al. 1997 ; Debenest et al. 2009),
par rapport à des expositions aux herbicides, inhibiteurs de la photosynthèse (Montuelle et
al. 2010).
(ii) la persistance et le comportement de la molécule testée sont très importants dans
l’impact potentiellement induit par le polluant et semble difficile à prédire. Suivant s’il est
présent dans la colonne d’eau ou dans la matrice du biofilm, la toxicité de l’herbicide peut
être différente. De nombreux mécanismes gouvernent le comportement de l’alachlore en mi-
lieu aquatique (Chester et al. 1989), la photodégradation, l’hydrolyse, l’adsorption sur du
matériel biologique ou non, la biodégradation, etc... Malgré de nombreuses précautions, par
l’utilisation de verre pour limiter les phénomes d’adsorption sur les dispositifs expérimen-
taux, l’utilisation de traitements expérimentaux utilisés pour tester les voies abiotiques de
disparition des molécules, il est toujours délicat de prédire le comportement d’une molécule
et surtout de l’anticiper et de le contrôler. C’est une difficulté que nous avons souvent ren-
contrée durant ces trois expériences d’écotoxicologie. D’après la littérature, le problème est
récurent, dans une grande partie des cas les explications données par les auteurs pour expli-
quer la disparition du polluant au sein de leurs microcosmes sont multiples sans toujours être
vérifiées (Spawn et al. 1997 ; Debenest et al. 2009). L’idéal serait de réaliser la combinaison
suivante (Tlili et al. 2008) : doser la molécule en phase aqueuse et au sein du biofilm et doser
les principaux produits ou métabolites de biodégradation. Durant ces travaux de recherche,
le dosage des principaux produits de biodégradation de l’alachlore ont été réalisés sur cer-
tains échantillons, à ce jour d’autres échantillons sont en cours d’analyse, afin de vérifier ou
exclure les mécanismes de biodégradation (Articles 1, 4, et 5). En contact avec le biofilm,
la molécule peut soit être adsorbée dans la matrice (Lawrence et al. 2001) ou soit être biodé-
gradée (Pesce et al. 2009 ; Vercraene-Eairmal et al. 2010). Dans les deux cas, la molécule perd
sa biodisponibilité et devient potentiellement moins toxique pour les organismes aquatiques.
Suivant son degré de maturation, le biofilm n’aura pas la même influence sur la molécule
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 277

suivant son épaisseur et suivant s’il est contrôlé principalement par des facteurs allogènes ou
autogènes. Une des composantes du biofilm responsable de l’adsorption des polluants, pesti-
cides ou métaux est la matrice d’exopolymères. Cette composante, par son rôle fonctionnel
et structurel clef au sein des biofilms (Battin et al. 2003a) comme rappelé dans la partie I
Synthèse bibliographique, mérite toute notre attention d’un point de vue écologique. Les
EPS contiennent également de nombreuses enzymes et permettent une certaine cohésion de
l’architecture du biofilm. Toute perturbation peut engendrer des changements de leur compo-
sition et de leur proportion comme observé pour l’article 5. Ecologiquement, ces changements
peuvent modifier certaines fonctions à l’échelle du biofilm (rétention des pesticides, de la ma-
tière organique, etc. . . ) et se répercuter à l’échelle d’un écosystème. L’étude des EPS semble
un descripteur plus sensible que l’évaluation de la structure des communautés bactériennes
par typage moléculaire (Article 5). L’absence d’étude de la composition ou de la structure
des EPS est une des lacunes que nous pouvons reprocher à ce travail de thèse. Il pourrait être
envisagé de doser par exemple les EPS (Battin et Sengschmitt 1999), ainsi que de mesurer
systématiquement l’épaisseur du biofilm comme réalisé lors de l’étude en mini-bioréacteurs
(Battin et al. 2003b). La mesure de l’épaisseur peut être un bon indicateur de la réponse
d’un biofilm à une exposition à un herbicide, comme observé dans le cadre de l’expérience
en mini-bioréacteurs où les biofilms exposés à 10 µg.L−1 d’alachlore présentaient des niveaux
d’épaisseurs plus faibles. Morin et al. (2010) soulignaient que les biofilms originaires de sites
considérés comme « clean » apparaissaient être plus adhérés au support de colonisation. Les
auteurs proposaient d’utiliser comme indicateur les types d’adhésion au substrat en réponse
à une exposition au pesticide. Guasch et al. (2003) observaient une influence de la physio-
nomie des communautés sur leur tolérance vis-à-vis d’une contamination par l’atrazine. Les
algues faiblement attachées étaient plus sensibles à l’atrazine que les biofilms plus compacts,
à même niveau de biomasse. Ces observations rejoignent les résultats de Stevenson et al.
(1996) qui concluait que des biofilms fermement attachés présentent des sensibilités moindres
aux perturbations.
(iii) Présence supposée des mécanismes de biodégradation durant les deux expériences
en microcosmes (bécher + aquarium, Articles 4 et 6), par la détection en fin d’exposition
de OA et ESA, non présents en début d’exposition. Montuelle et al. (2011) précisaient qu’une
augmentation de la tolérance était accompagnée par une forte capacité de biodégradation du
polluant, et que cela pouvait être apparenté à un type de réponse adaptative (Torang et al.
2003). Ce qui est cohérent avec les résultats de ces trois expériences, très peu d’effets sont
détectés suite à la présence de l’alachlore (Articles 4, 5 et 6).
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 278

(iv) Globalement, à travers les 3 expériences écotoxicologiques de ce chapitre, une même

tendance au sujet de la toxicité de l’alachlore apparaît. L’alachlore affecte assez le biofilm,
soit en inhibant sa croissance si la contamination se déroule dés les premiers stades de pro-
duction du biofilm (Article 5), soit par une perte de biomasse dans les stades plus avancés
de production du biofilm (Articles 4 et 6). Dans tous les cas, écologiquement la consé-
quence directe d’une baisse des niveaux de biomasse sera ressentie par les brouteurs. De
plus, l’analyse par microscopie confocale révèle que cette perte de biomasse est susceptible
d’engendrer des changements de proportions des bactéries/cyanobactéries et algues, pouvant
générer des changements d’appétence du biofilm vis-à-vis des brouteurs. Les impacts observés
sur la croissance du biofilm sont tout à fait consistant avec le mode d’action des herbicides de
la famille des chloroacétanilides. Les chloroacétanilides sont connus pour inhiber la synthèse
de l’élongation des acides gras chez les algues et les bactéries (Böger et al. 2000). Les acides
gras rentrent dans la formation des membranes cellulaires. A première vue, l’alachlore semble
n’avoir que très peu d’effets sur les communautés microbiennes des biofilms, dans le cadre
des descripteurs qui ont été mesurés, comparé à des herbicides de modes d’action différents.
Debenest et al. (2009), en comparant la toxicité d’un herbicide de la famille des chloroa-
cétanilides, le métolachlore, avec un herbicide inhibiteur de la photosynthèse, l’isoproturon,
enregistraient une toxicité plus importante de la part de l’isoproturon (urée substituée). La
biomasse est habituellement considérée comme un descripteur peu pertinent, qualifiée de
descripteurs « grossiers » pour la mise en évidence de la toxicité potentielle d’un herbicide,
particulièrement les inhibiteurs de la photosynthèse (Montuelle et al. 2010). Ces descrip-
teurs sont également très sensibles à la quantité de lumière (Villeneuve et al. 2010) et aux
conditions hydrodynamiques (Battin et al. 2003b). Roubeix et al. (2011a) qui n’observaient
pas d’impact du métolachlore, expliquaient que durant la contamination, les espèces tolé-
rantes remplacent progressivement les espèces sensibles, ce qui expliquerait que les effets sur
la biomasse ne puissent être visibles tant que les espèces sensibles sont susceptibles d’être
remplacées, et qu’il fallait attendre la limite de tolérance des espèces les plus tolérantes et
les plus compétitrices de la communauté. Cette explication se base sur la notion d’espèce
redondante. Une disparition d’espèce n’entrainera pas forcément la disparition de la fonction
à laquelle l’espèce contribue, si cette fonction est présente chez d’autres espèces tolérantes
à la perturbation. Ainsi le choix des descripteurs fonctionnels est également important lors
des expériences écotoxicologiques, la stratégie est de mesurer une variété de fonctions pour
couvrir le maximum d’effet. Durant la phase d’acclimatation, l’absence de changement de la
quantité de biomasse (MSSC et chlorophylle a) peut être attribuée à un état de développe-
ment des biofilms que l’on peut qualifier de « mature ». Durant ce stade de maturation, les
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 279

biofilms ont atteint des niveaux de biomasses maximales et sont gouvernés principalement
par des facteurs autogènes.
Ce chapitre montre bien l’importance d’intégrer la dynamique de croissance des biofilms.
A notre connaissance, peu d’études ont évalué la réponse des communautés microbiennes des
biofilms à une exposition en intégrant sa croissance, la plupart se limitant à l’échelle d’un
cycle de croissance. Guasch et al. (1997) ont évalué les effets des variations saisonnières sur
la sensibilité d’un biofilm à l’atrazine, ce qui recouvrait un pas de temps plus important.
Les processus internes au biofilm se sont avérés dans certains cas prendre plus d’importance
que d’autres facteurs, comme vis-à-vis des ressources (Romani et Sabater 2000 ; Sekar et al.
2002), ou vis-à-vis du broutage (Schmid Araya et Schmid 2000).
Les changements dus à la présence d’un herbicide peuvent être masqués par des change-
ments dus à l’évolution temporelle naturelle du biofilm. C’est ce que nous observons pour
les communautés bactériennes et les communautés de diatomées. La structuration des com-
munautés est principalement gouvernée par l’évolution temporelle du biofilm, et les effets de
l’alachlore sur les communautés sont soit absents, soit masqués.
Ce travail intègre la notion de bio-indication, soit à l’échelle des communautés de
diatomées, soit à l’échelle plus globale de l’agrégat. Afin de déterminer la qualité des
eaux de surface, les diatomées sont utilisées en routine, au même titre que les macrophytes,
les invertébrés ou les poissons (Geizinger et al. 2009). Plusieurs indices ont été développés et
mandatés sous la directive cadre Européenne (WFD, European commission 2000), BDI (Coste
et al. 2009) ou IPS (Coste, 1982). Ces indices sont basés sur la sensibilité des espèces, leurs
abondances et leurs compositions et plus adaptés pour évaluer la qualité trophique des cours
d’eau. Ces indices présentent quelques inconvénients, l’identification des espèces est longue
et parfois difficile, certaines espèces présentent des morphotypes très proches, et le nombre
de facteurs gouvernant la structure des communautés microbiennes génère un discernement
difficile entre les deux types de pollution, trophique et par les pesticides.
De nombreuses études ont pu montrer leur sensibilité vis-à-vis des pesticides sans pour
encore prétendre à leur efficacité dans la détection des effets des pesticides (Dorigo et al.
2005). Certaines espèces de diatomées sont enregistrées comme sensibles aux pesticides, A.
minutissimum, Eolimna minima, ou Navicula lanceolata (Morin et al. 2009). Inversement
certaines espèces de diatomées qualifiées de tolérantes, ont déjà été répertoriées sous des
concentrations en herbicides supérieures à 5 µg.L−1 (Pérès et al. 1996 ; Morin et al. 2009).
De nombreuses hypothèses ont été proposées ces dernière années, sur la relation pollution
par les pesticides et diatomées (Rimet et Bouchez 2010), telles que l’effet protecteur contre
les polluants de la matrice d’exopolymères pour des diatomées vivant dans un mucus comme
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 280

les taxa Encyonema et Frustulia, l’augmentation des taxa de petites tailles en réponse à une
contamination (Morin 2006), l’augmentation de l’abondance des taxa pionniers (Rimet et
Bouchez, 2011), ou encore les taxa qui sont adaptés à exploiter plus facilement des ressources
dissoutes sont des espèces plus sensibles aux pesticides. De nombreuses études ont montré
qu’une contamination par les métaux engendrait une réduction de la taille des cellules (Mo-
rin 2006). L’écotoxicologie basée sur la composition en diatomées à l’échelle de l’espèce ne
permet pas d’obtenir une tendance très nette. Les espèces tolérantes enregistrées par Guasch
et al. (1998) ne sont pas forcément les mêmes que celles enregistrées par Dorigo et al. (2004).
Les différences peuvent être expliquées par la composition en espèces présentes au début de
l’expérience, les variations saisonnières, le niveau de colonisation, ou encore l’aspect analy-
tique (présence de morphotypes identiques). Certaines espèces sont dites cryptiques, ce qui
les rend difficile à différencier (Rimet et Bouchez 2011). Guasch et al. (1998) concluaient qu’il
semble encore difficile de définir la tolérance d’une communauté basée sur la composition des
espèces de diatomées.
Dans ce contexte, de récentes études se sont focalisées sur la taille des cellules, ou alors la
forme de vie des diatomées (Berthon et al. 2011), il a été montré également que les diatomées
motiles diminuaient au bénéfice des diatomées pédonculées lorsque les espèces sont déplacées
d’un site pollué à un site non pollué (Rimet et al. 2009). Quand aux espèces pionnières, elles
sont considérées comme de bons indicateurs d’une contamination, observé par exemple pour
le Zinc (Morin et al. 2007) et le Cuivre (Sabater et al. 2002).
Dans ce contexte, de nombreuses études ont investi des métriques autres que la sensibilité
et l’abondance pour évaluer la relation avec la qualité de l’eau. Les traits biologiques des di-
atomées incluant la forme de vie (« life-forms »), la taille des cellules, les guildes écologiques
(« ecological guilds ») pourraient être des profils écologiques robustes (Berton et al. 2011 ;
Rimet et Bouchez 2011). Associée à ces traits biologiques, l’identification serait ainsi limitée.
Par traits biologiques, nous pouvons considérer les formes de vie (coloniales, formant des
tubes, pionnière, mobile et stalked ) puis la classe des tailles, et enfin les guildes écologiques
(Rimet et Bouchez 2011). Les guildes écologiques sont définis comme un groupe d’espèces
qui vivent dans un même environnement, tout en étant adaptées différemment à un facteur
biotique (Berton et al. 2011). Passy (2007) a décrit 3 guildes possibles, « low profile » (re-
groupement d’espèce de petites tailles), « high profile », qui regroupe les espèces plus larges
ou qui tendent vers une forme de colonie (filamenteuse. . . ) et enfin « motile guild », regrou-
pant les espèces à mouvements rapides (Navicula, Nitzchia). Etant donné l’absence d’effet
observé sur la communauté des diatomées, si nous nous basons sur la composition, et l’espoir
donné aux paramètres de la « forme de vie » des diatomées comme futur descripteur de la
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 281

bio-indication, il est intéressant d’explorer dans le cadre de nos études en microcosmes si les «
formes de vie » des diatomées dominantes dans nos échantillons peuvent être une explication
à leur tolérance. Prenons le cas de la première étude de ce chapitre (Article 4), la diatomée
dominante des communautés de biofilms qui semble tolérante (site S) est A. minutissimum
(une abondance moyenne de 84 %), qualifiée par Rimet et Bouchez (2011) d’espèce coloni-
satrice, et appartenant au guilde « light profile ». Lors de leurs expériences, l’abondance des
taxa de ce guilde augmente dans les microcosmes contaminés. Dans le cadre de notre étude,
pour les diatomées dominantes du site S, dont les biofilms sont les plus sensibles, A. minutis-
simum, Navicula lanceolata et Surirella brebissonii, N. lanceolata et S. brebissonii sont des
taxa appartenant au guilde « motile » (Tableau 4, article 4). D’après Rimet et Bouchez
(2011), l’abondance de ces taxa augmentaient également dans leurs microcosmes contaminés.
Maintenant prenons le cas des troisièmes études (Article 6), pour l’ensemble des échan-
tillons, les deux espèces de diatomées dominantes sont Nitzschia amphibia et Nitzschia palea,
appartenant au guilde « motile » comme pour les taxa précédemment cités. Guasch et al.
(1998) qualifiaient Navicula menisculus, Navicula lanceolata et N. palea de taxa tolérants à
l’atrazine. Il est intéressant de noter que A. minutissimum est une colonisatrice, et que cette
catégorie regroupe des espèces capables de résister à de sévères « insultes chimiques » pour
reprendre l’expression de Rimet et Bouchez (2011). A. minutissimum voyait son abondance
diminuer en contact avec le métolachlore (Roubeix et al. 2011a) pour de fortes concentra-
tions (30 µg.L−1 ). Enfin pour la deuxième étude (Article 5), les deux espèces dominantes
sont, comme précédemment, A. minutissimum et Diatoma tenuis. D. tenuis appartenant au
guilde de la catégorie « high profile » (considéré comme sensible aux pesticides), coloniale et
pédonculée (Figure 5, article 5). Les taxa pédonculés sont connus pour être les meilleurs
dans l’exploitation des nutriments dissous. Peut être qu’avec l’utilisation d’eau de rivière très
pauvre en nutriment dans le cadre de cette étude, cette espèce était avantagée.
Il semble en effet intéressant de considérer la « forme de vie » des diatomées comme
paramètres d’évaluation de la toxicité d’un polluant et surtout intègre la communauté dans
son ensemble et non espèce par espèce. Des études complémentaires sont à réaliser afin
de consolider ces premiers résultats sur un herbicide de la famille des chloroacétanilides.
Plusieurs études conduites en micro, mésocosmes et in situ utilisant également la composition
taxonomie classique (Pérès et al. 1996 ; Guasch et al. 1998 ; Dorigo et al. 2004 ; Morin et al.
2009) ont trouvé des résultats comparables : les taxa sélectionnés par les pesticides tendent
à être des taxa appartenant au guilde « motile ».
La suite des recherches consisterait à réaliser 3 approches : (i) répéter ces expériences
en mésocosmes ou microsomes pour valider les résultats obtenus dans le cadre de ce travail
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 282

avec un meilleur contrôle des concentrations en alachlore et une diversité plus importante du
nombre de descripteurs, (ii) travailler à plus large échelle avec des données concernant la liste
des diatomées, données chimiques, etc..., afin de tester in situ les hypothèses sur l’utilisation
des biofilms phototrophes dans la bio-indication mise en place en laboratoire et (iii) travailler
à l’échelle d’un bassin versant pilote afin de valider ce type de bio-indicateurs. Pourquoi lors
de nos 3 expérimentations, le seuil de tolérance comme défini par Clement et Newman (2002)
des communautés bactériennes n’a-t-il pas été atteint ? La réponse est à rechercher parmi (i) le
mode d’action de l’alachlore qui le rend faiblement toxique, (ii) sa biodégradation potentielle
par une enzyme, la GST présente chez les Procaryotes et les Eucaryotes, (iii) les interactions
antagonistes ou synergiques des effets de l’alachlore avec les effets d’autres facteurs biotiques
(immigration, Article 5 ; évolution temporelle, Articles 4 et 6) ou avec les effets d’une
autre perturbation (transfert des biofilms vers les microcosmes), et (iv) la disparition de
l’alachlore au cours du temps pour les expériences en batch (Articles 4 et 6), ce qui illustre
une contamination de type « épisode de crue ». Finalement de nombreuses questions restent
encore ouvertes malgré le choix de travailler en microcosmes pour simplifier le système. Dans
ce contexte, pour s’affranchir des changements liés à la dynamique temporelle de l’agrégat et
augmenter le niveau de réalisme de cette approche écotoxicologique, la stratégie consisterait
peut-être à cultiver les biofilms in situ le long d’un gradient de pollution et d’y appliquer des
descripteurs fonctionnels ou structurels (production primaire, typage moléculaire etc. . . ).
III.5. Conclusion et perspectives du chapitre 3 283

Conclusion générale et

perspectives
 Conclusion générale et perspectives

Les communautés microbiennes des biofilms phototrophes : modèle

d’étude pour appréhender les relations entre diversité / structure et
fonctionnement des écosystèmes

Un des challenges majeur de l’écologie contemporaine est de décrire les liens entre la
biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes, afin d’évaluer les impacts qu’un change-
ment d’origine anthropique (variation de température, urbanisation, utilisation des sols. . . )
de la biodiversité ou de la structure des communautés peut engendrer sur le fonctionnement
global des écosystèmes dont certaines fonctions sont qualifiées de « services écologiques »
(par exemple l’auto-épuration) (Figure 59). Dans ce contexte, quel modèle d’étude est
capable d’intégrer les dimensions de biodiversité et de fonctionnalités, à l’échelle
des communautés et des écosystèmes, tout en étant capable de distinguer les
impacts anthropiques subis et les « services écologiques » rendus ?

Figure 59 – Schéma simplifié des interactions complexes entre biodiversité et fonctionnement d’un
écosystème (extrait de Boulêtreau et al. 2010c)
 285

Comme suggéré par Battin et al. (2003a), le biofilm peut s’apparenter à un paysage
microbien " to emphasize their spatially explicit dimension, and to lay the foundation for
a unifying theoretical basis that supports and guides the relationships between biodiversity,
ecosystem function and the effects of scales (composition, structure or function)”. En milieu
aquatique, les communautés microbiennes benthiques des biofilms phototrophes semblent être
de bons outils dans la compréhension de cette relation par :
– leur caractère ubiquiste,
– leur variété de biodiversité et de fonctions,
– leur capacité à intégrer rapidement tous changements environnementaux.
Notre étude a démarré d’un exemple de « service écologique », la biodégradation poten-
tielle d’un herbicide, l’alachlore, réalisée en milieu aquatique par différentes communautés
microbiennes (Article 1). Il s’est avéré que les trois communautés, provenant d’habitats
différents (biofilms phototrophes de ruisseau et de fleuve et flocs de boues activées de station
d’épuration), favorisent la disparition de l’herbicide en phase aqueuse. Cette disparition a
comme conséquence directe une perte de la biodisponibilité de la molécule, limitant ainsi les
risques de toxicité potentiels sur les organismes aquatiques, d’où ce qualificatif de « service
écologique ». L’apparition des métabolites au sein des microcosmes nous a permis de vérifier
l’hypothèse de la biodégradation, qui semble d’intensité similaire entre les communautés. La
communauté qui présente la biomasse la plus élevée est responsable d’un taux de disparition
plus important, pouvant traduire des phénomènes d’adsorption qui se rajoutent à la biodé-
gradation effective. Ces résultats nous amènent à poser une question fondamentale : comment
trois structures microbiennes provenant d’habitats différents peuvent porter une fonction si-
milaire de biodégradation de l’alachlore ? Plusieurs tentatives de réponse sont possibles : (i)
cette fonction est liée à certains micro-organismes ubiquistes des environnements aquatiques,
comme c’est le cas pour les organismes nitrifiants ou dénitrifiants, (ii) les herbicides de la
famille des chloroacétanilides sont connus pour être dégradés lors de réactions de conjugaison
catalysées par une enzyme non spécifique, la Glutathione S-transférase présente chez la plu-
part des micro-organismes, (iii) cette fonction est associée à la maturation des communautés
microbiennes, en quelque sorte programmée, elle suit un déterminisme autogène, comme le
cas du potentiel de dénitrification qui apparaît dans un biofilm épais et mature (Lyautey
2005), ou encore (iv) la présence de cette fonction dépend de la composition de la commu-
nauté qui peut être associée à une certaine capacité de résistance vis-à-vis des effets de la
molécule. En d’autres termes, la fonction de biodégradation est-elle contrôlée par des facteurs
allogènes ou par des facteurs autogènes ?
 286

Ainsi au cours de ce travail de recherche, à travers une compilation de différentes études in

situ et différentes stratégies expérimentales conduites en microcosmes, nous avons contribué
à l’amélioration des connaissances sur l’origine des fonctions qualifiées de « service écologique
».
Dans un premier temps, l’objectif était de comprendre les mécanismes par lesquels nous
avions pu aboutir à l’image transitoire des deux communautés microbiennes de biofilms tes-
tées pour la biodégradation de l’alachlore. L’expérience réalisée in situ (Article 2) nous a
confirmé l’influence de deux types de facteurs sur la structuration des biofilms, les facteurs al-
logènes et les facteurs autogènes (Lyautey 2005) qui contrôlent les successions des populations
au sein de la communauté. Les facteurs allogènes, associés à des facteurs externes au biofilm
et illustrant les différentes conditions environnementales des sites d’incubation, influencent
principalement la structure des biofilms dans les premières étapes de leur développement
alors que les facteurs autogènes, internes et propres au biofilm, deviennent prédominants
essentiellement lorsque le biofilm est « mature ». La structure de l’agrégat est à la fois gou-
vernée par l’espace et par le temps (c’est-à-dire par la maturation). Le choix d’une stratégie
de transplantation entre deux sites aux caractéristiques physico-chimiques contrastées, a pro-
voqué la modification de la trajectoire des successions écologiques sans pour autant atteindre
complètement la structure des communautés « autochtones » traduisant soit (i) une période
de pré-transplantation trop longue aboutissant à un biofilm influencé principalement par les
facteurs autogènes, soit (ii) une période post-transplantation trop courte pour atteindre le
Climax, ou soit (iii) une double influence des facteurs allogènes et autogènes.
L’atteinte d’un bon état écologique des eaux de surface, un des objectifs de la Directive
Cadre Européenne, nécessite un rétablissement (« recovery » en anglais) des écosystèmes
aquatiques perturbés par les activités anthropiques. Le « recovery » d’un écosystème peut se
définir comme la capacité pour un écosystème aquatique à retrouver l’état qu’il avait avant
l’application de la perturbation. A travers ce phénomène de « recovery » des écosystèmes, la
notion de résilience des communautés est à prendre en compte. C’est dans cette optique que de
nombreuses études ont vu le jour, basées sur un design expérimental qui utilise une approche
de transplantation pour tester la résilience in situ de communautés suite à une exposition dans
des sites pollués (e.g. Teixeira et al. 2008 ; Mouton et al. 2009 ; Dorigo et al. 2010 ; Morin et al.
2010). C’est une stratégie particulièrement intéressante car elle permet d’intégrer l’influence
de la maturation du biofilm sur sa structuration et les notions de trajectoire de successions
écologiques. Travailler in situ rend difficile la possibilité de dissocier les facteurs allogènes des
facteurs autogènes, et d’évaluer par la suite la part du déterminisme autogène sur la fonction
de biodégradation de l’alachlore. Le seul moyen de dissocier ces deux facteurs est de s’éloigner
 287

de l’environnement de la rivière et faire abstraction des facteurs externes pour se focaliser

uniquement sur la croissance et la dynamique propre du biofilm et ne s’intéresser qu’à la
notion d’agrégat. Comme souligné par des travaux antérieurs sur la dynamique de croissance
des communautés de biofilms phototrophes in situ (Boulêtreau 2007), la maturation des
communautés est gérée par deux fonctions, une fonction de croissance associée à une forte
activité phototrophe, peu sensible à la lumière et contrôlée essentiellement par des facteurs
externes, puis une fonction de perte de biomasse (minéralisation, autodétachement) engendrée
par une activité bactérienne hétérotrophe. Cette dernière phase est basée sur le recyclage
d’une partie des ressources accumulées dans le biofilm et dépendante de la température
et de la présence ou pas de perturbations. Afin que ce phénomène de maturation mène à
un autodétachement, aucune altération ne doit apparaître, ce qui est rarement le cas en
rivière où les changements des conditions hydrodynamiques notamment, sont susceptibles de
réinitialiser la croissance du biofilm. Dans une optique de supprimer toutes perturbations
potentielles lors de la croissance de biofilm, notre stratégie fut de choisir un prototype de
bioréacteur expérimenté au sein du laboratoire EcoLab pour la première fois dans le cadre
de cette thèse, le bioréacteur annulaire rotatif (Article 3).
Dans ce cadre expérimental, seul l’épaississement de l’agrégat devient le moteur des pro-
priétés structurelles et fonctionnelles, en contrôlant les successions des populations. Les bio-
films produits se sont avérés être peu diversifiés en terme de diversité algale, mais présentent
des successions écologiques amenant à des trajectoires d’évolution des structures des commu-
nautés et des biomasses finales différentes.
Malgré le caractère stochastique de l’étape de colonisation des biofilms ainsi que l’utilisa-
tion des inocula de nature et de diversité différentes, les diversités algales des biofilms sont
identiques au terme de 7 semaines de culture. Plusieurs conclusions ressortent de cette étude :
– Dans un tel type de bioréacteur, le nombre final d’espèces algales ainsi que les succes-
sions des populations sont régis par un déterminisme autogène dans un environnement
dépourvu de toute perturbation ;
– La biomasse, associée à une fonction de la communauté phototrophe, ne semble pas
être uniquement gouvernée par un déterminisme autogène mais également par la com-
position de la communauté algale. A des communautés algales différentes sont associées
des vitesses de croissance différentes aboutissant à des structures physiques différentes
(biofilm plus ou moins compact, dense...). Une communauté de biofilm riche en di-
atomées présente une structure plus compacte qu’un biofilm riche en algues vertes.
Qu’en est-il des fonctions apparentées aux communautés hétérotrophes (e.g. fonctions
de biodégradation d’un herbicide), sont-elles gouvernées par la composition et donc par
 288

des facteurs allogènes (lumière, nutriments, immigration, émigration. . . ) ou sont-elles

gouvernées par la maturation de l’agrégat ? Une réponse pourra être partiellement ap-
portée par la mesure de différentes fonctions associées aux communautés hétérotrophes,
incluant la biodégradation d’un polluant, ou encore leur capacité à utiliser différentes
sources de carbone (Biolog) ;
– L’hypothèse du rôle primordial de la biodiversité dans la productivité des communautés
(Loreau et al. 2001) n’est pas vérifiée ici, nous obtenons des niveaux de biomasses, avec
des biofilms peu diversifiés, aussi importantes que ceux enregistrés antérieurement pour
des biofilms plus riches en espèces algales.

Intégrer l’écologie des communautés aux approches de l’écotoxicolo-

gie

Les résultats et analyses qui touchent à l’écologie des communautés nous montrent l’inté-
rêt de tenir compte des successions écologiques et de leurs trajectoires dans la structuration
des biofilms phototrophes, mais également la part d’influence des facteurs allogènes et auto-
gènes dans l’évaluation du bon fonctionnement des écosystèmes. L’influence de la maturation
du biofilm sur la stabilité de sa structure modifie sa sensibilité et sa tolérance à une pertur-
bation et, par de là, sa capacité potentielle à « épurer » les eaux de surface. Ce qui revient
à intégrer à l’échelle de l’agrégat ses différents stades de maturation (biofilms jeunes ou ma-
tures, fins ou épais) et son histoire. L’intégration de ces deux traits durant l’analyse de la
réponse des communautés à une exposition à un herbicide a été réalisée à travers 3 approches
expérimentales en microcosmes.
D’une manière générale, ces travaux nous ont permis de formuler les conclusions suivantes :
– Globalement, l’alachlore, susceptible d’affecter directement ou indirectement les com-
munautés microbiennes, semble avoir un impact particulièrement marqué sur les des-
cripteurs de biomasse comme la chlorophylle a et la matière sèche sans cendre. Ces
descripteurs sont par exemple souvent considérés comme peu sensibles à des contami-
nations par des inhibiteurs de la photosynthèse (Montuelle et al. 2011). Ce qui rend
notre travail de recherche original, c’est le choix de l’herbicide testé. La plupart des
études écotoxicologiques travaillent préférentiellement sur des molécules inhibitrices de
la photosynthèse, qui présentent des effets directs uniquement sur les communautés
phototrophes, permettent une quantification et une détection plus rapide et plus facile
des effets que ce soit au niveau des communautés phototrophes (par exemple mesure
 289

de la photosynthèse) ou des communautés hétérotrophes impactées uniquement par des

effets indirects ;
– Un effet dose important sur la biomasse quelle que soit la stratégie expérimentale utilisée
(Articles 4, 5 et 6). Pour des concentrations en alachlore proches des concentrations
détectées dans les eaux de surface, les effets sont limités ;
– Les sensibilités à l’alachlore de la part de biofilms considérés comme « matures » sont
différentes. La sensibilité a t-elle une origine et une explication liées à la composition de
la communauté, en d’autres termes à l’influence des facteurs allogènes ? Cette hypothèse
reste à vérifier. Lors de résultats préliminaires, il est apparu que la tolérance du biofilm
le moins sensible pouvait être expliquée par une augmentation de l’activité de la GST.
Cottingham et al. (1993) ont observé également une corrélation entre l’activité de la
GST et la tolérance, mais pas entre la quantité de GST et la tolérance chez le maïs.
Dans ce cas, la tolérance ne viendrait pas exclusivement de la composition en espèces
mais serait gouvernée par l’induction de l’activité de la GST. Quels sont les mécanismes
qui induisent cette augmentation de l’activité de la GST en présence de l’alachlore et
limite ainsi sa toxicité vis-à-vis des communautés ? Pourquoi si cette enzyme est présente
chez les procaryotes et les eucaryotes, certaines communautés de biofilms phototrophes
dans cette étude ou lors d’études antérieures (Spawn et al. 1997 ; Roubeix et al. 2011a)
restent-elles sensibles aux chloroacétanilides ?
– Deux notions importantes non abordées dans le cadre de ce travail de recherche, mais
à intégrer lors de prochains travaux, sont la structure physique et l’architecture du
biofilm (élasticité, compacité, cohésion. . . ) et sa composition en exopolymères (EPS).
Ces deux paramètres peuvent influencer la capacité du biofilm à adsorber la molécule
dans sa matrice, ce qui augmente ou pas les surfaces de contact. Les EPS sont le siège
d’activités enzymatiques à l’origine de nombreuses fonctions dont certaines susceptibles
d’être qualifiées de « service écologique ». Evaluer l’impact d’un polluant sur les EPS
présente donc un intérêt écologique pertinent. La structure physique et l’architecture du
biofilm sont en grande partie gouvernées par l’hydrodynamique (Battin et al. 2003b).
Par l’expérience en mini-bioréacteurs (Article 5), il a été montré que l’alachlore pou-
vait engendrer des effets sur la composition de certaines lectines, ce qui peut modifier la
cohésion du biofilm et son appétence vis-à-vis des brouteurs. Battin et al. (2003b) en-
registraient une utilisation des substrats organiques plus importante pour des biofilms
colonisés sous de fortes vitesses de courant. Les auteurs attribuaient ces observations
à la résistance diffusive plus forte durant les traitements à vitesse de courant rapide.
La couche limite externe est plus mince avec un débit rapide, mais avec une résistance
 290

interne de diffusion plus forte en raison de l’épaisseur réduite et la densité de surface.

De même Stevenson et al. (1996) stipulait que des communautés algales colonisant des
milieux à forts débits présentaient une structure étroitement adhérée aux supports de
colonisation et compacte alors que des communautés algales colonisant des milieux à
faibles débits présentaient une architecture très aérée. Vu la très bonne connaissance
des conditions hydrodynamiques des écoulements (profil de vitesse et contraintes de
cisaillement) appliquées à la surface des biofilms cultivés au sein de notre bioréacteur
RAB, il serait intéressant d’associer une dynamique de croissance du biofilm avec l’étude
de son architecture et de sa structure physique en parallèle des mesures de différentes
fonctions apparentées à la fois aux communautés hétérotrophes (exemple, fonction de
biodégradation) et phototrophes (production primaire) et de leurs tolérances à l’ala-
chlore ;
– L’hypothèse biodiversité - stabilité décrite par MacCellan (2000), qui souligne qu’une
communauté diversifiée est d’autant plus stable qu’elle présente une tolérance plus
importance face à une perturbation. Une partie de nos résultats (Article 4) ne montre
pas de tolérance particulière à l’alachlore pour des biofilms faiblement diversifiés en
termes de communauté algale. Kaufman (1982) observait que les communautés obtenues
dans un environnement hautement variable étaient plus tolérantes que celles provenant
d’un environnement stable. Cette hypothèse va dans le sens que les communautés dans
un habitat perturbé naturel sont pré-adaptées à des perturbations et ainsi sont plus
résistantes à des pressions anthropiques ;
– Une des difficultés récurrentes rencontrées durant les 3 expériences en microcosmes est
de vouloir associer un changement de la communauté à la présence de l’alachlore. Il est
très difficile d’affirmer si l’alachlore ne présente pas d’effet sur la structure des com-
munautés algales ou bactériennes ou si ses effets potentiels sont masqués par d’autres
facteurs. Pour les expériences réalisées en microcosmes (Articles 4 et 6), les consé-
quences d’un transfert des biofilms entre leur lieu de production (in situ ou le RAB)
et les microcosmes des expériences écotoxicologiques interagissent très souvent avec les
conséquences potentielles que peut avoir l’alachlore sur les communautés. En effet ce
transfert peut générer un stress, rendant les communautés beaucoup moins sensibles
à un second stress, dans notre cas l’exposition à un herbicide et cela malgré l’inté-
gration d’une phase d’acclimatation lors des deux expériences. Le design, l’approche
expérimentale et le choix des conditions opératoires sont importants.
– L’évolution temporelle est également un facteur critique lors de nos expériences en mi-
crocosmes. Les changements induits par la dynamique de croissance du biofilm masquent
 291

le plus souvent les effets de l’alachlore, et cela quel que soit le stade de maturation testé.
Ainsi l’évolution temporelle de l’agrégat a une influence prépondérante sur la structure
des communautés bactériennes et de diatomées ;
– Le dernier facteur difficilement contrôlable lors de nos expériences est le comportement
de la molécule. Pour les deux expériences en batch, l’exposition imposée aux commu-
nautés de biofilms s’apparente finalement à des expositions de quelques jours et peuvent
illustrer des types d’exposition souvent enregistrés in situ durant des épisodes de crues.
Plusieurs mécanismes sont susceptibles de participer à la disparition de l’alachlore, pho-
todégradation, volatilisation, biodégradation, adsorption sur la biomasse ou les surfaces
des microcosmes. Malgré certaines précautions, il est délicat de contrôler l’ensemble de
ces mécanismes, surtout que d’une expérience à l’autre, le comportement des molécules
de la famille des chloroacétanilides peut varier. Roubeix et al. (2011a) ne détectaient
pas de dissipation du métolachlore durant leur expérience de 20 jours en microcosmes,
inversement Debenest et al. (2009) observaient une disparition. Laabs et al. (2007) ainsi
que Bohuss et al. (2005) n’expliquaient pas plus de 1 % de la disparition de l’acéto-
lachlore ou de l’alachlore par des mécanismes d’adsorption, alors que certains de nos
résultats suggèrent des phénomènes importants d’adsorption (Articles 1 et 4). D’un
point de vue analytique, le suivi du comportement de l’alachlore dans les dispositifs
de laboratoire peut être amélioré. Par exemple, une technique couramment utilisée est
la méthode de radiorespirométrie (exemple, Lawrence et al. 2001 ; Pesce et al. 2010),
qui mesure la quantité de CO2 produit à l’issue de la biodégradation de la molécule.
Cette méthode est couplée à l’utilisation de la molécule d’alachlore radiomarquée. De
même pour évaluer l’adsorption potentielle d’une molécule, il est possible d’utiliser la
microscopie à balayage par transmission de rayons X (STXM, « Scanning Transmis-
sion X-ray Microscope ») (Dynes et al. 2006), cette technique mesure la répartition
spatiale d’une molécule dans le biofilm. Dans le cadre de ce travail, quelques échan-
tillons de biofilms exposés à l’alachlore, de quelques heures à plusieurs semaines ont
été analysés par G. Swerhone et J.R. Lawrence (Environnent Canada). Des analyses
complémentaires sont à réaliser car pour le moment, il nous est impossible de diffé-
rencier piégés dans une cellule diatomique, les lipides de l’alachlore. Il est nécessaire
de prendre certaines précautions en intégrant par exemple des traitements expérimen-
taux pour éliminer l’ensemble des hypothèses de la disparition de la molécule par voies
non biologiques (photolyse, photodégradation. . . ), réaliser systématiquement le dosage
de la molécule testée dans la biomasse des biofilms, et détecter les principaux méta-
bolites connus. Il nous semble important, en amont des expériences écotoxicologiques,
 292

de connaître parfaitement bien les paramètres biotiques (biodégradation, adsorption)

ou abiotiques (lumière, température. . . ) susceptibles d’influencer le polluant testé ainsi
que leur niveau de pertinence. La notion de successions écologiques est également à
prendre en compte dans l’évaluation du comportement de l’alachlore. Des études sur
les métaux ont déjà pu le souligner, le stade de maturation lié à l’épaississement du
biofilm gouverne les mécanismes de bioaccumulation des polluants (Duong et al. 2010).

Des approches expérimentales en microcosmes vers une stratégie

d’approche in situ

Il existe de nombreuses études écotoxicologiques, décrivant la réponse des biofilms pho-

totrophes aux herbicides. Chaque expérience présente son propre design expérimental, tels
que le dispositif expérimental, les descripteurs structurels ou fonctionnels, les conditions opé-
ratoires, le niveau biologique intégré, le polluant, les concentrations en polluant etc... Tout
ceci rend difficile, voir même impossible, la comparaison de ces études. Chacun y va de sa
conclusion en essayant d’expliquer tant bien que mal les différences ou les similarités d’une
expérience à l’autre. Les expériences en microcosmes, très utilisées ces dernières années,
ont l’avantage de présenter un bon compromis entre le réalisme, mais aussi la complexité,
des études réalisées in situ, et la simplification à l’extrême des bio-essais monospécifiques.
L’époque des « cosmes » a apporté dans l’étude des relations communautés - polluants une
première compréhension nécessaire des effets de certains polluants vis-à-vis de communautés
suivant leur mode d’action. Mais pour être pertinent d’un point de vue écologique, et ré-
pondre aux exigences de la Directive Cadre Européenne sur le bon état écologique et si nous
souhaitons comprendre à quel niveau une perturbation peut engendrer des changements dans
le fonctionnement des écosystèmes, les expériences en microcosmes sont limitées pour relier
l’écologie des communautés au fonctionnement des écosystèmes. Depuis quelques années,
la tendance est un retour aux études in situ. Travailler à des niveaux de complexité plus
importants permet :
– De mieux intégrer le biofilm dans son environnement, et de ne plus le voir seulement
comme un agrégat, mais en interaction avec des niveaux biologiques supérieurs, les
brouteurs, etc.(Lawrence et al. 2002) ;
– D’intégrer la notion de multi-perturbations, le cas des épisodes de crue, durant lesquels
l’hydrodynamique, la lumière, les particules en suspension et des concentrations en
pesticides se côtoient (Villeneuve et al. 2011b et c) ;
 293

– De faire abstraction de certaines contraintes liées aux études en microcosmes. Travailler

au niveau d’un gradient de pollution peut limiter les difficultés à distinguer entre les
effets relatifs des pressions de sélection dues à la pollution par les xénobiotiques et celles
résultant des facteurs environnementaux dits de « confusion » (Molander 1991). Il est
important de caractériser une « base-line Tolerance » (Molander 1991) ;
– Un des objectifs de l’ingénierie écologique est la réhabilitation des écosystèmes. La plu-
part des études mettant en évidence les mécanismes de résilience des communautés de
biofilms sont réalisées dans le cadre de techniques de transplantation utilisées comme
lors de notre première expérience in situ (Article 2). En effet, l’avantage de ces tech-
niques, c’est leur réalisme, elles permettent d’intégrer un ensemble de paramètres, des
niveaux biologiques différents, et les multi-perturbations que subissent constamment
les communautés.
Mais travailler in situ implique de construire une stratégie d’échantillonnage et d’acqui-
sition de données physico-chimiques importante, couplée à des analyses multivariées, afin de
comprendre l’influence des facteurs sur la structuration des biofilms (Villeneuve et al. 2011c).

Vers un modèle de bio-indication ?

Pour répondre aux enjeux de la Directive Cadre Européen qui souhaite réintégrer un bon
état écologique et surveiller l’état des milieux aquatiques, il est important de définir ce qu’est
un bon état écologique. Pour cela, la communauté scientifique s’est tournée vers l’utilisation
de bio-indicatrices de la qualité de l’eau.
Les diatomées des biofilms sont largement utilisées comme bio-indicateurs de la qualité
des eaux, qui sont souvent basées sur la composition (indice BID, Coste et al. 2009). De
nombreuses études ont pu mettre en évidence un lien entre la forme anormale des frustules
et la présence de métaux (Morin et al. 2009). De même, quelques études récentes concernent
la relation entre la forme anormale des frustules et la présence des pesticides, pour différents
modes d’action, inhibiteur de la photosynthèse (Schmitt-Jansen et Altenburger 2005), de
l’expression des gènes (maleichydrazide, Debenest et al. 2008) et de la synthèse de lipides
(métolachlore, Roubeix et al. 2011a). De récentes études se sont penchées sur les commu-
nautés bactériennes des biofilms, les suggérant pertinentes comme indicatrices de qualité des
eaux douces (Lear et al. 2010). Certains de nos résultats s’inscrivent dans cette optique d’uti-
liser a posteriori l’apparition de formes anormales des diatomées comme une indication de
la présence d’une pollution par les pesticides (Article 4). Nos 3 expériences en microcosmes
suggèrent bien la faible pertinence et sensibilité de la composition des diatomées comme in-
dicateur soit parce que (i) l’alachlore sélectionne les diatomées sensibles avant même leurs
 294

fixations sur les supports de colonisation, (ii) soit la composition est un paramètre assez
peu sensible à de faibles concentrations en alachlore et dépendante du temps d’exposition
(30 µ.g.L−1 , Article 4), comme observé pour une étude antérieure sur le métolachlore (fa-
mille des chloroacétanilides) (Roubeix et al. 2011a). Certaines espèces présentent un seuil de
tolérance élevé que d’autres. Généralement les espèces dominantes des communautés de di-
atomées au sein des biofilms utilisés pour les expériences sont reconnues pour être tolérantes
aux herbicides. Rimet et Bouchez (2011) proposaient d’utiliser le mode de vie des diatomées
(mobile, pionnière, colonisatrice. . . ) comme indicateur de pollution. Par exemple, les auteurs
qualifiaient les espèces pionnières et très mobiles comme tolérantes aux herbicides (Rimet
et Bouchez 2011). D’après nos résultats (Article 4), il est important d’intégrer également
l’analyse au niveau du morphotype. En effet, pour une même espèce de diatomées (A. minu-
tissimum), les deux morphotypes ne présentent pas le même comportement, un morphotype
présentant des formes anormales de leurs frustules à de fortes concentrations en alachlore.
Des études supplémentaires seraient à réaliser dans ce sens.
Les bio-indicateurs sont traditionnellement basés sur la mesure d’indicateurs structuraux
comme la qualité de l’eau (mesure analytique), la composition de différents organismes (in-
vertébrés, diatomées...). Ces choix de base pour les bio-indicateurs excluent les indicateurs
relatifs à de grandes fonctions contribuant au bon fonctionnement des écosystèmes (produc-
tion primaire, dégradation de la matière). L’avantage de tels indicateurs est de fournir direc-
tement une image de la qualité du fonctionnement ou du dysfonctionnement de l’écosystème
(Garabetian 2007).
La sensibilité des biofilms à une pollution et leur réponse rapide est maintenant bien
établie (Sabater et al. 2006), il reste à réaliser des recherches pour trouver des critères de bio-
indication. Ceci pourrait être une association de métriques de structure, diversité et fonction
(Eisman et Montuelle 1999 ; Lawrence et al. 2003) afin de refléter les multiples dimensions
des communautés au service des écosystèmes. Il est important de relier des métriques de
fonction liés aux communautés photo-autotrophes (production primaire) et aux communautés
hétérotrophes (biodégradation).
Des contaminations chroniques à long terme de l’ordre de 1 µ.g.L−1 induisent des change-
ments plus importants sur la structure des communautés bactériennes que des contaminations
de 14 µ.g.L−1 à court terme, suggérant une adaptation de la communauté (Tlili et al. 2008).
C’est basé sur cette notion de tolérance, que le concept PICT a vu le jour (voir la synthèse
de Tlili 2011, avantages et défauts de ce concept). Ce concept fait état que la tolérance d’une
communauté à un contaminant est reliée à son exposition antérieure à ce contaminant ou à
d’autres contaminants qui appartiennent à la même famille.
 295

Nos 3 expériences écotoxicologiques participent à l’amélioration de nos connaissances

des effets d’un herbicide, inhibiteur de l’élongation des acides gras, sur les communautés
de biofilms phototrophes à travers différents descripteurs de mesure, qu’il sera nécessaire
d’élargir, pour une meilleur identification et distinction de la toxicité de ce type d’herbicide.
Pour être capable d’évaluer les effets d’un polluant afin de surveiller, de réhabiliter ou/et
d’obtenir une image parfaite de l’état écologique d’un écosystème, plusieurs facteurs sont à
prendre en compte nécessitant une approche interdisciplinaire, au croisement de l’écologie des
communautés, du fonctionnement des écosystèmes et de la chimiodynamique des polluants.
Chaque facteur représente une partie de cette mosaïque, dont seulement une partie fut men-
tionnée dans le cadre de nos différentes stratégies expérimentales (Figure 60).

Ce travail de thèse s’inscrit dans une optique de désigner et proposer des

bio-indicateurs pour la détection rapide de pollution, la résilience d’un écosys-
tème, et les conséquences sur les « services écologiques », dans un souci d’obtenir
une image parfaite de l’état écologique des écosystèmes. Beaucoup de questions
restent encore ouvertes, mais de nombreux travaux, dont ce travail de thèse, dé-
signent les biofilms phototrophes comme :

• de très bons candidats comme modèle d’étude pour une meilleure connais-
sance des relations biodiversité - fonction des écosystèmes, pour l’analyse
des effets des perturbations anthropiques et leur contribution fonctionnelle
aux services écologiques rendus ;
• de bons outils prometteurs en tant que bio-indicateurs de la qualité des eaux
lorsqu’ils sont associés à une approche multimétrique. Mais la validation de
ce type d’outil reste encore à vérifier, à travers de multiples expériences
in situ, afin de mieux comprendre comment se hiérarchisent les facteurs
environnementaux les uns par rapport aux autres dans l’objectif de diffé-
rencier au mieux les impacts des pesticides des impacts des autres facteurs,
et pour d’autres types de perturbations, changements climatiques, pollution
par les métaux, les pesticides ou les nouvelles molécules émergentes (résidus
médicamenteux). Il est indispensable d’intégrer la dynamique naturelle du
biofilm, sa variabilité et sa sensibilité à l’ensemble des différents facteurs bio-
tiques et abiotiques qui conditionnent sa structure et qualifiés de « facteurs
de confusion » lors de l’évaluation de la présence d’une pollution (Dorigo et
 296

Pression anthropique

POLLUANT
Propriétés physico-chimique Site d’étude Stade de maturation
Persistance / devenir Facteurs allogènes
Articles 2 et 3

Histoire du biofilm Facteurs allogènes/ autogènes

Biodisponibilité
milieu aquatique
BIOFILM
biodiversité – composition - structure

Sensibilité du biofilm
Toxicité de l’herbicide Communauté

Articles 4, 5 et 6
Effets observés « Services écologiques » Article 1
Biodégradation d’un herbicide

Bio-indication Ecosystème
Figure 60 – Les concepts et leurs relations abordées dans le cadre de ce travail de recherche

al. 2009).

Dans un objectif de pertinence écologique et comme montré au cours de ce

travail de thèse, il est important d’intégrer à la notion de biofilm, la dimension
temporelle en le considérant comme une entité dynamique afin de tenir compte
du concept de succession écologique (Prach et Walker 2011).
Annexe
 298

Hydrosolubilité (mg
Famille chimique Substance active Log Koc
L-1)
Tebuconazole 32 3,7
Flusilazole 900 NR
Triazoles
Cyproconazole 140 2,91
Epoxyconazole NR 3,44
Trifuraline 1 4,83
Toluidines
Pendimethaline 0,3 5,18
Linuron 81 3
Isoproturon 55 2,25
Urée Substituées
Chlorotoluron 70 2,2
Monolinuron 735 2,25
Tetbuthylazine 8,5 3,2
Chloro S Triazines Atrazine desethyl 6 2,75
Simazine 6 2
Hexazinone 298 1,19
S triazines
Aclonifen 2,5 4,37

Tableau 16 – Liste des molécules de pesticides recherchés et leurs principales caractéristiques

physico-chimiques. Koc désigne le coefficient de partage carbone organique / eau. Il donne indication
sur l’aptitude de la molécule à s’adsorber sur la matière organique. NR = Donnée Non répertoriée
 299

Protocole de dosage de l’alachlore et de ses deux métabolites de l’alachlore (H.

Preud’hommes)

1.1. Material

An Acquity UPLC system (Waters Corp., Milford, MA) including a binary solvent pump, a
cooled autosampler, an Acquity UPLC BEH C18 column, 50 mm x 2.1 mm (1.7 µm particles,
Waters) with a matching Vanguard precolumn was used.

The detectors were: a diode-array UV detector (Acquity) used at 265 nm, a XevoTQ
(quadrupole-T-wave-quadrupole in scan wave mode) MS with an orthogonal Z-spray-
electrospray interface (Waters, Milford, MAs). A hybrid mass spectrometer ESI - QTOF
(QSTAR XL, Sciex, ON, Canada) was used in the method development.

1.2. Procedures

1.2.1. Chromatographic separation

The parameters studied included: mobile phase composition (H2O/CH3CN containing 0.1%
of HCOOH or CH3COOH), LC-gradients and column (Acquity UPLC BEH C18 column: 2.1mm
x 50mm, particle size 1.7 µm). Because of the target analytes and the detection in ESIneg /
ESIpos mode, it was decided not to work with an ion-pairing agent, such as trifluoroacetic acid
(TFA) or heptafluorobutyric acid (HFBA).

Mobile phase was a mixture of water (A) and acetonitrile (B), both containing 0.1% HCOOH.
The elution gradient (non-linear hyperbole) was: 0 min (5% B), 0.2 min (10% B), 1.8 min (28%
B), 2.5 min (80% B), 3.2 min (80% B), and 4 min (5% B) for 1 min. The gradient steps after 2.5
min served to clean and re-equilibrate the column to guarantee the repeatability of the analysis.
Total analysis time was 5 min, column equilibration included. The injected volume was 25 µL (or
50µL if a sample was diluted). The flow rate was 0.65 ml/min, the column temperature was 45°C
and the autosampler temperature was 5°C.

1.2.2.. Mass spectrometric conditions

MS/MS data acquisition was performed with the electrospray source operating in negative
mode (ESIneg) under the MRM conditions listed in Supplementary Data file. The optimized values
for the Xevo TQ MS instrument were: capillary voltage 2.50 kV in negative mode and 3,5kV in
 300

positive mode; source temperature 150°C; desolvatation temperature 400°C; extractor voltage
3V; RF lens 0.4 V. Nitrogen was used as both the nebulizing gas and the desolvatation gas. Cone
gas and desolvatation gas flows were set at 20 L/h flow and 1000 L/h respectively. Argon was
used as collision gas with a pressure of 2 x 10-3 mbar in the T-wave cell. Dwell times of 0.040
s/scan for Alachlor and 0.080 s/scan for ESA and OA, were selected. The Masslynx software
(Waters Corp., Milford, MA) was used to process data. Quantification was based on peak area.
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Table des matières

Remerciements i

Résumé / Abstract iv

Introduction xx
Contexte scientifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx
Les objectifs et l’organisation générale de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiii

I Synthèse bibliographique 1
I Modèle biologique d’étude : les biofilms phototrophes de milieux lotiques 2
I.1 Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
I.2 Le développement d’une entité structurelle et fonctionnelle dynamique . . . . . 6
I.2.1 Les facteurs influant le développement des biofilms phototrophes . . . . 6
I.2.1.1 La lumière . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
I.2.1.2 Les teneurs en nutriments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
I.2.1.3 Les conditions hydrodynamiques . . . . . . . . . . . . . . . . 11
I.2.1.4 La température . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
I.2.1.5 Les substrats de colonisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
I.2.1.6 Les facteurs biotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
I.2.2 Le concept de succession écologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
I.2.2.1 Dynamique temporelle de la biomasse . . . . . . . . . . . . . 15
I.2.2.2 Dynamique temporelle du compartiment algal . . . . . . . . . 18
I.2.2.3 Dynamique temporelle du compartiment bactérien . . . . . . 18
I.3 Les biofilms phototrophes : compartiment fonctionnel clef des milieux lotiques 19
I.4 Les biofilms phototrophes : un outil pour la Directive Cadre Européenne ? . . 20
I.5 Les dispositifs d’investigation des biofilms phototrophes . . . . . . . . . . . . . 22

II La problématique des pesticides dans l’environnement 24

II.1 La contamination des milieux aquatiques par les pesticides : origines du problème 24
II.2 Impact des pesticides sur les organismes aquatiques en milieu lotique . . . . . 27
II.2.1 Différentes approches utilisées en écotoxicologie . . . . . . . . . . . . . 27
II.2.2 Cibles biologiques potentielles des pesticides . . . . . . . . . . . . . . . 30
II.3 Interactions biofilms phototrophes-pesticides en milieux lotique . . . . . . . . . 31
II.3.1 L’importance des biofilms phototrophes en écotoxicologie . . . . . . . . 31
II.3.2 L’impact des pesticides sur les biofilms autotrophes . . . . . . . . . . . 34
II.3.2.1 Comment évaluer la réponse du biofilm phototrophe ? . . . . . 34
Table des matières 336

II.3.2.2 Une variété de réponses possibles . . . . . . . . . . . . . . . . 37

III Etude de cas : l’alachlore 43

III.1 Présentation de la molécule d’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
III.2 Mode d’action de l’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
III.3 Chimiodynamique de l’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
III.4 Contamination des eaux de surface par l’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . 53
III.5 Impact de l’alachlore au sein des milieux aquatiques . . . . . . . . . . . . . . . 53
III.6 L’alachlore et les biofilms phototrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
III.7 Les arguments du choix de l’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

II Matériel et Méthodes 57
I Sites d’étude et stratégies d’échantillonnage 58
I.1 Choix des sites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
I.2 Présentation des sites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
I.3 Caractéristiques physico-chimiques des stations . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
I.4 Dispositifs de collecte des biofilms phototrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

II Stratégies d’approche expérimentale 66

II.1 Approche expérimentale in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
II.1.1 Objectif de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
II.1.2 Déroulement de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
II.2 Approches expérimentales en microcosmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
II.2.1 Capacité de biodégradation d’un herbicide par des suspensions de bio-
films phototrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
II.2.1.1 Objectif de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
II.2.1.2 Déroulement de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
II.2.2 Réponse des communautés microbiennes de biofilms phototrophes à
une exposition à un herbicide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
II.2.2.1 Objectif de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
II.2.2.2 Déroulement de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
II.2.3 Bioréacteurs annulaires rotatifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
II.2.3.1 Prototype de bioréacteur annulaire rotatif (RAB) à écoule-
ment de type Taylor-Couette . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
II.2.3.1.1 Présentation et description générale . . . . . . . . . 75
II.2.3.1.2 Choix des conditions expérimentales . . . . . . . . 76
II.2.3.1.2.1 Support de colonisation . . . . . . . . . . . . . . . 76
II.2.3.1.2.2 Source lumineuse interne . . . . . . . . . . . . . . 78
II.2.3.1.2.3 Conditions hydrodynamiques . . . . . . . . . . . . 81
II.2.3.1.2.3.1 Distribution des temps de séjours . . . . . . . . 85
II.2.3.1.2.3.2 Simulations numériques de l’écoulement . . . . 85
II.2.3.1.2.4 Inoculum et eau d’alimentation . . . . . . . . . . . 86
II.2.3.1.2.5 Entretien du bioréacteur : nettoyage complet et
partiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Table des matières 337

II.2.3.1.3 Validation de la capacité du bioréacteur à produire

du biofilm phototrophe . . . . . . . . . . . . . . . . 88
II.2.3.1.3.1 Phase d’inoculation . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
II.2.3.1.3.2 Echantillonnage des coupons . . . . . . . . . . . . 90
II.2.3.1.3.3 Analyses physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . 91
II.2.3.1.4 Bioréacteur prototype RAB, une nourrice à bio-
films phototrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
II.2.3.1.4.1 Objectif de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . 92
II.2.3.1.4.2 Déroulement de l’expérience . . . . . . . . . . . . 92
II.2.3.1.4.3 Mini-bioréacteurs annulaires rotatifs de laboratoire 95
II.2.3.1.4.3.1 Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
II.2.3.1.4.3.2 Objectif de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . 95
II.2.3.1.4.3.3 Déroulement de l’expérience . . . . . . . . . . . 97

III Volet analytique 98

III.1 Analyses physico-chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
III.2 Analyse des pesticides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
III.2.1 Analyses de l’alachlore et de deux de ses métabolites de biodégradation 101
III.2.2 Dosage des pesticides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
III.3 Analyses biologiques des biofilms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
III.3.1 Préparation des échantillons de biofilms . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
III.3.2 Descripteurs structurels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
III.3.2.1 Descripteurs de biomasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
III.3.2.1.1 Matière sèche et matière sèche sans cendre . . . . . 103
III.3.2.1.2 Chlorophylle a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
III.3.2.1.3 Index autotrophique et ratio MSSC / MS . . . . . . 105
III.3.3 Analyse de la composition algale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
III.3.4 Microscopie confocale à balayage laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
III.3.5 Structure des communautés bactériennes (DGGE et T-RFLP) . . . . . 106
III.3.5.1 Préparation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
III.3.5.2 Extraction de l’ADN génomique total (ADNg) . . . . . . . . . 110
III.3.5.3 Amplification par PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
III.3.5.3.1 La T-RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
III.3.5.3.2 La DGGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
III.3.5.4 Exploitation et interprétation des profils . . . . . . . . . . . . 112
III.3.6 Descripteurs fonctionnels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
III.3.6.1 Etat physiologique du biofilm . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
III.3.6.2 Productions bactériennes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
III.3.6.3 Mesure de l’activité enzymatique de la GST . . . . . . . . . . 116

IV Analyses statistiques des données 117

IV.1 Les analyses univariées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
IV.2 Le calcul du temps de demi-vie de l’alachlore durant les expériences en micro-
cosmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
IV.3 Les analyses multivariées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Table des matières 338

III Etudes expérimentales 120

I Biodégradation d’un herbicide par des communautés bactériennes de bio-
films phototrophes : approche expérimentale en microcosme 121
I.1 Contexte de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
I.2 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
I.3 Principaux résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
I.4 Résultats complémentaires à l’article 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
I.5 Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
I.6 Article 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

II Comment appréhender les facteurs qui contrôlent les successions écolo-

giques des communautés microbiennes : cas des biofilms phototrophes 150
II.1 Importance des facteurs allo- et autogènes sur les communautés bactériennes
durant le développement de biofilms phototrophes . . . . . . . . . . . . . . . 151
II.1.1 Contexte de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
II.1.2 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
II.1.3 Principaux résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
II.1.4 Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
II.1.5 Article 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
II.2 Déterminisme autogène sur la structuration/dynamique des communautés mi-
crobiennes en bioréacteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
II.2.1 Contexte de l’étude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
II.2.2 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
II.2.3 Principaux résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
II.2.4 Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
II.2.5 Article 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
II.3 Conclusions du chapitre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189

III Importance relative des facteurs allogènes et autogènes dans la réponse

de biofilms phototrophes à un herbicide – différentes approches expéri-
mentales en microcosmes 193
III.1 Contexte scientifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
III.2 Influence de l’histoire sur la réponse structurelle et fonctionnelle de biofilms
phototrophes post-exposés à l’alachlore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
III.2.1 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
III.2.2 Principaux résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
III.2.3 Résultats complémentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
III.2.4 Conclusion et perpectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
III.2.5 Article 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
III.3 Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide durant ses premiers stades de
développement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
III.3.1 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
III.3.2 Principaux résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
III.3.3 Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
III.3.4 Article 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
Table des matières 339

III.4 Réponse du biofilm phototrophe à un herbicide selon son degré de maturation 252
III.4.1 Approche expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
III.4.2 Principaux résultats et discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
III.4.3 Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
III.4.4 Article 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
III.5 Conclusion et perspectives du chapitre 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275

Conclusion générale et perpectives 284

Les communautés microbiennes des biofilms phototrophes : modèle d’étude pour
appréhender les relations entre diversité / structure et fonctionnement des
écosystèmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284
Intégrer l’écologie des communautés aux approches de l’écotoxicologie . . . . . . . . 288
Des approches expérimentales en microcosmes vers une stratégie d’approche in situ 292
Vers un modèle de bio-indication ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

Annexe 297

Bibliographie 301
AUTHOR: 

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ABSTRACT

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KEY WORDS

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AUTEUR : 

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RESUME en français

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DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Ecologie Fonctionnelle

INTITULE ET ADRESSE DE L'U.F.R. OU DU LABORATOIRE :
Laboratoire d’écologie fonctionnelle et Environnement (EcoLab) – UMR 5245 (UPS-CNRS-
INPT) Université Paul Sabatier, bât. 4R3 b2 – 118 route de Narbonne
31062 Toulouse cedex 9 - FRANCE