Objec fs

1-Me re en évidence les qualités d’un bon milieu de culture au détriment d’exigences

nutri onnelles et physico-chimiques des microorganismes.

2-Connaitre les différents types de milieux de culture u lisés en microbiologie.

3-S’ini er avec les techniques de prépara on des milieux de culture, leur stockage et

u lisa on.

I- Introduc on : les microbiologistes ont u lisé les milieux de culture pour isoler, purifier,
repiquer, cul ver, conserver, étudier et iden fier les germes (microorganismes). Ces milieux
cons tués à par r de composes biologiques et/ou chimiques reproduisant un
environnement favorable à la croissance de certaines espèces microbiennes.

II- Défini on : les milieux de culture sont des prépara ons gélosées (solides), semi-solides ou
liquides u lisées pour faire croitre et étudier les microorganismes. Ils offrent sous forme
assimilable toutes les substances indispensables à leur nutri on. A ce jour, plusieurs
centaines de milieux de culture ont été décrits.

Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes (eau, source de
carbone, source d’énergie, source d’azote et sels minéraux) est un milieu minimum.

III- Les différents types de milieux de cultures:

III-1- Selon leur consistance:

Elle peut être:

1- Liquide (bouillon): ne contenant pas d’agar agar (= agar = gélose).

2- Semi-solide : contenant entre 0,5 et 0,75 % (c’est-à-dire entre 50 et 75 g/L) d’agar agar.

3- Solide : contenant entre 1,5 et 2 % (c’est-à-dire entre 150 et 200 g/L) d’agar agar.

NB : dans un milieu liquide, les microorganismes se développent pour former un trouble, des
dépôts, des agglomérats ou des voiles sur la surface. La croissance peut être mesurée par la
turbidimétrie.

III-2- Selon leur composi on:

1- Un milieu complexe est composé de substances nutri ves naturelles (animales ou

végétales) : la composi on chimique de leurs ingrédients est indéterminée ou mal définie.
2- Un milieu synthé que (défini) est formé de substances nutri ves chimiquement connus.

Substances nutri ves synthé ques Substances nutri ves complexes (naturelles)
(définis)

glucose, saccharose, glycérol, amidon, mélasses de canne à sucre, peptones, extrait de

nitrate, sels minéraux, viande, extrait de levure, extrait de foie,

Ces milieux sont u lisés en physiologie Ex. le bouillon nutri f et la gélose nutri ve, la
bactérienne. gélose de Chapman, la gélose VF (viande-foie), le
milieu Sabouraud (milieu gélosé glucosé), etc.

* Peptone obtenue = hydrolysats (produits de dégrada on, généralement des acides aminés)
de protéines végétales ou animales (viande, caséine, soja, géla ne, etc.) = c’est une source
de carbone, d’énergie et d’azote.

III-3- Selon leur u lisa on:

1- Milieux usuels (de base) : la gélose nutri ve pour les bactéries, le milieu Sabouraud pour
les champignons = champignons filamenteux (moisissures) + levures.

2- Milieux d’isolement :

- Milieux d’enrichissement: la gélose en présence de la cellulose, pour cibler les bactéries

celluloly ques (bactéries appar ennent à des espèces différentes et genres différents).

- Milieux sélec fs: la gélose de Chapman (75 g/L de NaCl) pour isoler principalement
les Staphylococcus, les Micrococcus, les Enterococcus et les Bacillus.

- Milieux différen els: la gélose au sang pour isoler les Streptococcus.

3- Milieux d’iden fica on : mannitol-mobilité, VF, etc.

4- Milieux de conserva on : ce sont des milieux pauvres qui main ennent les
microorganismes dans un état de vie ralen e.

IV- La composi on de quelques milieux de culture:

Le bouillon nutri f (BN) La gélose de Chapman

(milieu de base, complexe, liquide) (milieu gélosé complexe et sélec f)

Extrait de viande : 5 g, Bacto-peptone : Peptone : 10 g, extrait de viande : 1 g, NaCl : 75 g,

10 g, NaCl : 5 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 7 mannitol : 10 g, rouge de phénol : 0,025 g, agar
à 7,5). agar : 15 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à 7,5).

+ 20 g/L d’agar agar pour la gélose

nutri ve (GN).

La gélose VF La gélose ISP2 (Interna onal Streptomyces Project)

(milieu gélosé, complexe pour (milieu gélosé de base*, complexe)
déterminer le type respiratoire)
Extrait de levure : 4 g, extrait de malt : 4 g, glucose :
Viande-foie : 30 g, glucose : 2 g, agar 4 g, agar agar : 18 à 20 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à
agar : 6 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à 7,5).
7,5).
* Principalement pour les bactéries.

Le milieu Sabouraud Le bouillon Citrate Simmons

(milieu gélosé de base*, complexe) (milieu synthé que solide)

Glucose : 20 g, peptone : 10 g, agar Citrate de sodium : 1 g, MgSO4 : 0,2 g, (NH4)2HPO4 :

agar : 20 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 6 à 1 g, KH2PO4 : 1 g, NaCl : 5 g, Bleu de bromothymol:
6,5). 0,08 g, agar agar : 15 g, Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à
7,5).
* Principalement pour les champignons.

Matériel et produits chimiques u lisés

- Matériel léger:

- Les becs Bünsen.

- L’anse à ensemencer.

- Les boîtes de Pétri: de 90 cm ou 60 mm de diamètre.

- Les tubes à essai (à vis).

- coton cardé.

- Les pipe es Pasteur.

- La verrerie:

- Eprouve e graduées de 500 mL, flacons de 500 mL et de 1000 mL, pipe es graduées,
entonnoirs, béchers (1L), Erlenmeyers de 500 et de 1000 mL.

- Le matériel lourd

- L’autoclave.

- Les microscopes.

- L’étuve (l’incubateur).

- la balance de précision.

- Le pH-mètre.

- L’agitateur magné que.

- Barreaux magné que.

* La gélose nutri ve (GN):

- Extrait de viande : 5 g,

- Bacto-peptone : 10 g,

- NaCl: 5 g,

- Agar agar : 20 g,

- Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à 7,5).

* La gélose ISP2 (Interna onal Streptomyces Project):

- Extrait de levure : 4 g,

- Extrait de malt : 4 g,

- Glucose : 4 g,

- Agar agar : 20 g,

- Eau dis llée : 1 L (pH : 7 à 7,5).

- NaOH ou KOH (1N et 2N),

IV- Protocole expérimentale (Prépara on d’un milieu de culture):

S’effectue par simple dissolu on des ingrédients du milieu de culture dans un solvant (l’eau),
et les différentes étapes de préparer un milieu de culture sont:

- la pesée, la dissolu on des ingrédients (les ingrédients sont dissous dans un volume bien
déterminé d’eau dis llée), puis la solu on portée ensuite à un volume final (q.s.p. = quan té
suffisante pour Vf), la mesure et l’ajustement du pH (par l’ajout de quelques gou es de NaOH
ou KOH pour basifier le milieu ou HCl pour acidifier le milieu), La prépara on d’un milieu de
culture doit être sous agita on faible pour l’homogénéisa on du milieu. Finalement, l’ajout
de l’agar agar (s’il s’agit d’un milieu solide) dans les récipients, et la stérilisa on est effectuée
à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes.

Remarques:

- Avant d’ajouter l’agar agar (pour les milieux solides) selon le volume final de chaque
récipient, il faut d’abord ajuster le pH et distribuer le milieu dans les flacons, les tubes, les
Erlenmeyers, etc.

- Si certains ingrédients du milieu peuvent être altérés par la chaleur, ils sont stérilisés
séparément et ajoutés après autoclavage (dans des condi ons stériles = d’asepsie). C’est le
cas des sucres (sources de carbone) avec les protéines (source d’azote) qui peuvent réagir à
la température de l’autoclavage (réac on de Maillard) ce qui provoque un brunissement du
milieu de culture, donc on stérilise les sucres séparément (surtout les grandes quan tés).
- Pour l’autoclavage, les tubes et les flacons sont fermés, mais le vis ou le bouchon ne soit
pas trop serré. Et on visse les tubes et les flacons après autoclavage et refroidissement
complet du milieu. Selon le besoin, les tubes sont mis à refroidir en posi on ver cale (gélose
en culot) ou en posi on inclinée (gélose en pente).

- Les boites de Pétri sont coulées immédiatement sous une ho e à flux laminaire ou a cote
d’un bec Bünsen.

- Une ho e à flux laminaire est une ho e conçue pour éviter les contamina ons. L'air passe
à travers un filtre, puis est diffusé en un flux laminaire vers l'u lisateur.

Ces ho es sont généralement équipées d'une lampe UV à effet germicide pour stériliser le
plan de travail et son contenu lorsqu'il n'est pas u lisé. Il est important d'éteindre ce e
lampe lorsqu'on travaille sous la ho e car elle brûlera rapidement toute surface exposée de
peau.

- Apres l’autoclavage, il faut verser le milieu de culture à l’état fondu en surfusion (45 à
50 °C).

- Toujours, on retourne les boîtes de Pétri pour empêcher l’eau de condensa on accumulée
sous le couvercle de retomber sur la surface du milieu de culture. Leur stockage (dans un
réfrigérateur) ou leur incuba on (dans une étuve) se fait également dans ce e posi on.