Plan :
Séance 1 : bonne pratiques en biologiste moléculaire
objectif : acquérir les bonnes pratiques en biologiste moléculaire
Cad :
- utilisation pipette automatique avec di érents volumes pour maîtriser de faibles doses.
- Préparation d’un gel à 1 pour cents
- Savoir visualiser et e ectuer une electrophorèse
Séance 2 : Extraction d’ADN
Objectif : Puri cation de l’ADN : Besoin d’une lyse cellulaire et PCR
- extraction de l’ADN à partir d’un tissu de moule
- Dans un tube Précellys ( voir def ) ( = Ce sont des tubes à broyage sans ADN appartenant
à un kit pour permettre l’extraction d’ADN )
- Ajout PBS ( def ) ( L’utilisation de PBS ( Tampon phosphate salin ) sert surtout à rincer les
cellules lorsqu'il faut enlever toute trace de milieu avant de les traiter mais aussi de conserver
les conditions physiologique en terme de concentration ioniques et pH )
- Broyage but ? ( Cette solution tampon est ensuite utilisée pour procéder au broyage cellulaire.
Le broyage cellulaire désigne le fait de briser la membrane plasmique contenant les éléments à
extraire. Une fois que la membrane plasmique est brisée et fractionnée, di érentes
manipulations (comme la ltration ou la centrifugation ) peuvent être e ectuées pour séparer le
contenu des cellules des débris de membrane plasmique. )
- Tampon et protéinase K (Elimination e cace des protéines des solutions d’acide nucléique
pour PCRs )
- incubation chaleur ? ( di T° )
- Éthanol (pk?)
- Lysat ( lyse cellulaire )
Passage à la puri cation :
- centrifugation : pour obtenir seulement échantillon d’ADN
- Première sans tampon et deux autres avec tampon ( B5 et BW ) ( = 3 )
- Quatrième sans tampon
- Dernière ajout Tampon BE ( = 5 )
Fin préparation ADN
Passage à la PCR
- eau
- PCR master mix ( def )
- Amorces Me15 et Me16 ( def )
- notre ADN puri er précédemment
-> centrifugation et programme Myt54 du thermocycleur ( def )
Séance 3 : electrophorèse et biométrie
Objectif : Étude de la biométrie pour identi er l’animal en reprenant nos analyses moléculaires
( c° et qualité de l’ADN : rapport, PCR : quantité d’ADN pb )
Mesure C° et qualité :
C° : 51,1 ND et 38,5 AL
Qualité : 1,75 ND et 1,74 AL
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Electrophorèse à partir de PCR (= explication )
-> analyse morphologique coquille
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- une analyse morphologique illustré
- Résultats extraction et analyse ( C° et qualité = rapport )
- Résultat electrophorèse annotée et légendé
- Analyse et
Même après une puri cation, les ADN ou les ARN peuvent encore contenir des
contaminants. Certains contaminants impactent signi cativement les applications de
biologie moléculaire et sont responsables d’analyses erronées, de résultats incohérents
ou non reproductibles … Il est alors important de contrôler systématiquement la pureté
des acides nucléiques en amont de toute application pour identi er les contaminants. La
spectrophotométrie est la seule méthode qui permette de véri er la pureté d’un acide
nucléique grâce aux deux ratios A260 nm/A280 nm et A260 nm/A230 nm
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Il y a quatre étapes principales pour extraire les acides nucléiques
1. La lyse des cellules
2. La dénaturation des protéines et des complexes nucléoprotéiques
3. L’inactivation des nucléases
4. La puri cation des acides nucléiques (ADN ou ARN)
Les cellules peuvent être lysées par des méthodes chimiques (à l’aide de détergents
comme le CTAB, SDS, etc.) enzymatiques (ex. protéinase K, lysozyme, zymolase, etc.),
ou mécaniques (billes de broyage et broyeurs). Ces di érentes techniques de lyse ont été
décrites dans ce TechOzyme
Après la lyse, les protéines et les complexes nucléoprotéiques sont dénaturés par des
détergents ioniques (ex. SDS), des agents réducteurs (ex. béta-mercaptoéthanol …) ou
des agents chaotropes (ex. chlorure de guanidine). La protéinase K peut être également
utilisée pour la digestion des protéines.
Les nucléases sont ensuite inactivées par les agents chaotropiques (urée, chlorure de
guanidine, thiocyanate de guanidine …) et les chélateurs comme l’EDTA souvent inclus
dans les tampons de lyse.
A l’issue des trois premières étapes, les acides nucléiques (ADN et ARN) sont dans un
mélange (ou un lysat de cellules) incluant des débris cellulaires, tels que les protéines, les
lipides, les polysaccharides, etc. Ces impuretés inhibent généralement les réactions
enzymatiques (qPCR, RT-qPCR, séquençage, méthylation, etc). Il est donc essentiel
d’éliminer ces impuretés pour obtenir les ADN ou les ARN dans une préparation pure.
b. Elimination des contaminants issus des tampons ou des réactions enzymatiques
Après la puri cation, les impuretés comme le phénol (méthode d’extraction phénol/
chloroforme), les sels, les détergents peuvent être encore présents. La méthode de
puri cation en phase solide est généralement utilisée pour nettoyer les acides nucléiques.
Les colonnes de puri cation par centrifugation sont les plus utilisées pour ce type de
nettoyage, car pratiques et rapides. Mais, les colonnes de puri cation conventionnelles
sont connues pour générer des contaminations de transfert (carry-over contaminations).
Ces contaminations proviennent des gouttes de tampon retenues à la surface de la
colonne malgré les centrifugations. Pour minimiser ces contaminations de transfert, des
centrifugations supplémentaires sont recommandées et il est nécessaire d’éluer les
acides nucléiques dans un grand volume de tampon. Mais, pour des applications
sensibles comme la qPCR et le séquençage, toutes les traces d’impureté persistantes
sont néfastes.
Présentation de la PCR
La PCR ou Polymerase Chain Reaction (= réaction en chaîne de la polymérase) est une
technique qui a révolutionnée la biologie moléculaire. La première publication publique
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sur la PCR remonte à 1986 et a valu le prix Nobel de Chimie à son auteur Kary Mullis en
1993.
Objectif de la PCR : ampli er in vitro, de manière exponentielle (= en très grande quantité,
jusque x 106), un fragment d’ADN choisi, même si la quantité initiale est très faible (1
copie ).
Principe de la PCR : basée sur la capacité de l’ADN polymérase à pouvoir synthétiser un
brin complémentaire d'ADN à partir d’un brin matrice, et ce uniquement à partir d’une
amorce. La PCR utilise ces propriétés de l’ADN polymérase, de manière répétitive.
Séquence de l’amorce Am1 : 5'- TGCGGCTGAAGAAGAGATC - 3' amorce sens
Séquence de l’amorce Am2 : 5'- AGGCTTGGGACAGACAAGG - 3' amorce anti-sens
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