REPUBLIQUE ALGERIENNEDEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENTSUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE SAAD DAHLEB-BLIDA-1

FACULTE DE MEDECINE

DEPARTEMENT DE PHARMACIE

QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT

TYPE : HPLC

Thèse d’exercice présentée en vue de l’obtention du diplôme de Docteur en Pharmacie

Session : Juin 2021
Présentée par :
-SAIDANI OUSSAMA

-BENZEKHROUFA SAID

-HAMZA MOHAMMED FATEH

Promotrice du mémoire :
-Dr.BELAIDI.F : Maitre assistante en chimie analytique.

Devant le Jury :
-Dr.AZZOUZ.L: Maître assistante en chimie analytique -USDB-1- ..présidente de Jury
. -Dr. BOUZEKRI.F: Maître assistant en chimie therapeutique-USDB-1- ...Examinateur
 REPUBLIQUE ALGERIENNEDEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENTSUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE SAAD DAHLEB-BLIDA-1

FACULTE DE MEDECINE
DEPARTEMENT DE PHARMACIE

QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT

TYPE : HPLC

Thèse d’exercice présentée en vue de l’obtention du diplôme de Docteur en Pharmacie

Session : Juin 2021
Présentée par :
-SAIDANI OUSSAMA

-BENZEKHROUFA SAID

-HAMZA MOHAMMED FATEH

Promotrice du mémoire :
-Dr.BELAIDI.F : Maitre assistante en chimie analytique.
Devant le Jury :
-Dr.AZZOUZ.L: Maître assistante en chimie analytique -USDB-1- ...présidente de Jury
. -Dr. BOUZEKRI.F: Maître assistant en chimie therapeutique-USDB-1- ...Examinateur
 ‫بسم هللا الرحمن الرحيم‬

------------------------------------------------------------------------------------------------------
Nous vivons pour dessiner un sourire. Et essuyez une larme.
Et soulager la douleur. Et parce que demain nous attend.
Et le passé a disparu, et nous avons daté le nouvel horizon de l‟aube.

N‟abandonnez pas si vous êtes coincé dans un grand trou.

Tu vas t‟en sortir, et tu es plus cohésif et plus fort

-------------------------------------------------------------------------------------------------------
Résumé
L‟obtention des données analytiques fiables garantissant la protection des patients, nécessite
l‟utilisation des appareils qualifiés et de haute précision, et c‟est ce qui nous incite à savoir
comment qualifier les appareils, notamment l‟équipement type HPLC (chromatographie
liquide haute performance). ?

L‟objectif de notre travail est de maitriser tous les paramètres d‟HPLC (principes,
mécanismes séparatifs. Appareillage et conception) et savoir exactement comment qualifier
une chaine HPLC suivant quatre étapes nécessaires nommées (Qualification de conception,
Qualification d‟installation, Qualification opérationnelle, Qualification de Performance) et
selon un protocole délivré par les références internationales (pharmacopée, ICH, ASTM et
GMP.), contenant un ensemble de tests spécifiques pour chaque étape en exploitant le logiciel
system informatisé OQ/PV.

L‟optimisation des paramètres de performance tels que la précision de débit et de température

et de longueur d‟onde, holmium, stabilité du bruit et de la température, précision
d‟injection/carryover gradient, la linéarité (du débit, d‟injecteur et de détecteur) ont été
effectué, un exemple pratique sera détaillé dans cet humble travail.

Abstract
Obtaining reliable analytical data guaranteeing the protection of patients, requires the use
of qualified and high precision equipment, and this is what prompts us to know how to
qualify the equipment, especially the equipment type HPLC (high performance liquid
chromatography).
The objective of our work is to understand all the parameters of HPLC (principles,
separative mechanisms, equipment and design) and to know exactly how to qualify an HPLC
chain according to four necessary steps named (Design Qualification, Installation
Qualification, Operational Qualification, Performance Qualification) and according to a
protocol issued by international references (ICH pharmacopoeia, ASTM and GMP),
containing a set of specific tests for each step by using the computerized software system
OQ/PV
The optimization of performance parameters such as flow rate and temperature accuracy
and wavelength, holmium, noise and temperature stability, injection accuracy/caryover
gradient, linearity (of flow rate, injector and detector) has been performed, a practical
example will be detailed in this humble work.
 ‫ملخص‬

‫نضًاٌ حًاٌح انًشضى ٌتطهة انحصىل ػهى تٍاَاخ تحهٍهٍح يىثىقح و رنك تاستخذاو أجهزج‬
‫يؤههح وراخ دقح ػانٍح ‪ ،‬وهزا يا ٌههًُا نًؼشفح كٍفٍح تأهٍم األجهزج ‪ ،‬وال سًٍا انًؼذاخ يٍ‬
‫َىع ‪( HPLC‬انكشوياتىغشافٍا انسائهح ػانٍح األداء) ؟‬
‫إٌ انهذف يٍ هزا انؼًم هى يؼشفح كم يا هى يتؼهق تانكشوياتىغشافٍا انسائهح ػانٍح انذقح (‬
‫انًثادئ ‪ .‬انٍاخ انفصم ‪.‬انًؼذاخ و انتصًٍى )و يؼشفح كٍفٍح تأهٍهها تصفح خاصح يٍ خالل‬
‫أستغ خطىاخ ضشوسٌح تحًم اسى( تأهٍم انتصًٍى ‪.‬تأهٍم انتشكٍة‪ .‬تأهٍم انتشغٍم و تأهٍم‬
‫األداء ) و وفقا نثشوتىكىل صادس ػى انًشاجغ انذونٍح ‪ٌ ASTM.HDHC.GMP‬حتىي‬
‫ػهى يجًىػح اختثاساخ يحذدج نكم انخطىاخ تاستخذاو تشيجٍاخ انُظاو انحاسىب‬
‫‪OQ/PV‬‬
‫تحقٍق االستفادج انًثهى يٍ إػذاداخ األداء يثم انتذفق ‪ .‬دقح دسجح انحشاسج ‪.‬طىل انًىجح ‪.‬‬
‫و اختثاس انهىنًٍىو‪ .‬استقشاسسح خظ األفق‪.‬دقح انحقٍ‪/‬اختثاس انكاسي اوفش ‪.‬انتذفق و انحقٍ و‬
‫انكشف) و سىف ٌتى تفصٍم يثال ػهًً فً هزا انؼًم انًتىاضغ‬
Tout d’abord nous tenons à remercier ALLAH, de nous avoir donné la santé, la volonté et la
patience pour mener à terme notre formation et pouvoir réaliser ce travail de recherche

À Dr Bouzekri et Dr. Azouz

Merci de nous avoir fait l’honneur de présider ce jury. Veuillez trouver ici l’expression de
notre plus profond respect et de notre sincère reconnaissance.

À Dr.Belaidi Farah notre promotrice

Nous tenons à exprimer nos profonds remerciements à notre encadreur qui nous a guidés de
ses précieux conseils et suggestion, des éclaircissements qu’elle nous a apportés, ainsi que
pour ses remarques constructives et la confiance qu’elle nous témoigné tout au long de ce
travail.

À Monsieur FOUAD Besseriani et l’équipe de laboratoire REZGULAB

Un grand merci aussi pour les explications qui nous a fourni et la formation à laquelle on a
assisté ou il nous a donné le maximum d’information.
À l’équipe de ANPP Mme (Soraya, Dr. BENSDIRA) et Mr. Chadouli et Mounir

Merci de nous ’avoir fait l’honneur d’accepter de juger ce travail. Trouvez ici l’expression de
nôtres sentiments les plus sincères.

À nos parents

Un immense merci pour votre soutien tout au long de nos études et au cours de la
réalisation de ce travail. Merci pour votre confiance à vous qui avez toujours cru en nous.

Merci d’avoir été l’épaule protectrice et réconfortante sur laquelle nous pouvons toujours
nous reposer. Merci pour vos conseils, votre implication, votre suivi, votre patience,
l’ensemble de nos échanges…

Nous vous remercions du fond du cœur pour tout ce que vous nous ‘avez apporté.

À l’ensemble de la famille Saidani Hamza et Benzekhroufa

Merci pour vos encouragements et votre soutien depuis tant d’années.

Merci pour avoir toujours suivi nos études et notre thèse.

À nos amis

Merci pour tout ce que vous m’avez apporté depuis de longues années, de près et de loin.

Ce travail n’aurait pas été le même sans vous.

Que de bons moments passés ensemble et encore beaucoup à venir… Merci d’avoir
Supporté nôtres refus de sortie ! Et d’avoir su rester présents. Votre amitié et votre soutien

A nos chers collègues

Merci pour votre support quotidien et votre écoute. Merci pour vos partages de
connaissances. C’est un plaisir de travailler avec vous.

Une pensée particulière à la cellule qualification et ses prestataires. Merci pour vos partages
et nos échanges.

Et enfin merci à vous tous, familles, amis et collègues, qui êtes présents en ce jour c’est particulier
pour nous. Que cette thèse vous témoigne notre affection et vous exprime notre reconnaissance.
Dédicace-
Je dédie ce modeste travail à :

A MES CHERS PARENTS : pour tous leurs sacrifices, leurs amour, leur
tendresse et leur soutien tout au long de mes études

A MES chères sœur : pour leur encouragements permanents et leurs soutien moral

A MES CHERS FRERES : pour leur appui et leur encouragement

A TOUTE MA FAMILLE : pour leurs soutien tout au long de mon parcours

universitaire

A MA GRANDE MERE : La personne qui n’a jamais cessé de me soutenir et de

m’épauler

Aux personnes qui m’ont toujours aidé et encouragé, qui étaient toujours à mes côtés et
qui m’ont accompagnaient durant mon chemin d’études supérieures, mes amiables amis
et collègue d’étude

SAIDANI OUSSAMA
Dédicace

Je dédié ce modeste travail, à

A ma chère mère
A celle qui m'a donné la vie, symbole de tendresse, qui s'est sacrifiée pour mon bonheur et
ma réussite, à ma très chère mère kihali.H
A mon cher père
A mon père Mahdi, école de mon enfance, qui a été mon ombre durant toutes les années
d’études, et qui a veillé tout au long de ma vie à m’encourager, à me donner de l’aide et à me
protéger.
Que dieu les gardes et les protèges
A ma chère femme
A ma femme Bouziane.Ch, pour la patience et le soutien dont elle a fait preuve pendant
toute la durée de cette thèse et mes études.
A mes sœurs et mes frères
A mes chères frères Ahmed, Abou-elfadl et Mohamed à mes précieuses sœurs Djamila
et Amina et Amaria
Les mots ne peuvent résumer ma reconnaissance et mon amour à votre égard.
A ma grand-mère et grand père
Que dieu les gardes et les protèges
A Mes nièces et neveux
Abedelmalek ,Razane,Haroun, Jaber,Riadh,Moussa, Zaide,Youssef,Abed
elRahim,Abed elBer,Raihana
A mes cousins et cousines et A mes deux tantes toute ma famille pour leur soutien tout
au long de mon parcours universitaire,
A tous mes amies
A tous mes amis avec lesquels j’ai partagé mes moments de joie et de bonheur.
Merci pour votre présence, vos sourires et votre soutien. A tous Mes enseignants tout
au long de mes études et à mes amies de promotion A vous tous, je dédie ce modeste travail
BENZEKHROUFA SAID
Dédicace
A ma très chère Maman Hamza Amina, la lumière de mes jours, celle qui m’a donné la vie, la femme
qui formule tout le temps des prières à mon égard, merci pour sacrifices pour me voir toujours en haut,
de m’avoir poussée et motivée dans toutes les étapes de ma vie vois à travers ce travail mon amour
sincère et ma gratitude. Que Dieu te garde toujours pour nous.

A la mémoire de mon Papa Hamza Abderrahmane disparu trop tôt, avant même de partager cette joie
avec moi. Mon soutien moral et source de joie et de bonheur, celui qui s’est toujours sacrifié pour me
voir réussir, que je ne cesse d’admirer de m’avoir guidée et conseillée dans ma vie, que dieu te garde en
son vaste paradis.

A mon futur épouse Mansour. M, La personne qui n’a jamais cessé de me soutenir et de m’épauler,
‘’ ma fierté ‘’qui partage avec moi les plus petits détails de ma vie

Je prie dieu de te protège pour moi

A mes chères sœurs, mes sources de joie et de bonheur ; Ahlem, Zahira (Samra), Rachda et bien-
sûr ma petite ange MalakSirine.

A mon frère, mon soutien inestimable Mohamed AmirEddine (Mirou)

A mon frère-ami Mohamed Salim et l’ensemble de sa famille Chabi , et mon ami Islam Kobbi

A tous mes amies

A l’ensemble de mes deux familles Hamza pour leurs soutiens et l’encouragement

Aussi l’ensemble des familles : Chikh, Mouaici, Chambi et Mansour

A mes cousins et cousines et A mes deux tantes A toute ma famille pour leur soutien
tout au long de mon parcours universitaire,

Et bien-sûr tous mes enseignants depuis la période de primaire jusqu’à ce jour.

Et à toute personne qui a contribué à la réalisation de ce mémoire, de près ou de loin

HAMZAMOHAMMED FATEH
Table of Contents
1 -Chapitre1 : Chromatographie en phase liquide haute performance HPLC ................................... 5
1.1 Historique : .............................................................................................................................. 5
1.2 Définition ................................................................................................................................. 6
1.3 Principe : .................................................................................................................................. 7
1.4 Mécanismes séparatifs de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) : ............ 8
1.4.1 Chromatographie de partage : ........................................................................................ 8
1.4.2 Chromatographie d'exclusion : ..................................................................................... 11
1.4.3 Chromatographie d'adsorption :................................................................................... 11
1.4.4 Chromatographie échangeuses d'ions : ........................................................................ 13
1.4.5 Chromatographie chirale :............................................................................................. 14
1.5 Appareillage :......................................................................................................................... 16
1.5.1 Conception : .................................................................................................................. 16
1.5.2 Système de pompage du solvant : ................................................................................ 17
1.5.3 Le système D’injection :................................................................................................. 24
1.5.4 La Colonne : ................................................................................................................... 29
1.5.5 Phase Stationnaire :....................................................................................................... 32
1.5.6 Phases mobiles : ............................................................................................................ 36
1.5.7 Le détecteur :................................................................................................................. 39
1.5.8 Système informatisée (logiciel et chromatogramme) : ................................................. 43
1.6 Pic chromatographique : ....................................................................................................... 43
1.6.1 . Grandeurs de rétention : ............................................................................................. 44
1.6.2 Données chromatographiques : .................................................................................... 47
1.6.3 Paramètres de séparation : ........................................................................................... 49
1.7 La perte de charge dans une colonne : ................................................................................. 52
1.8 Le comportement d'un pic chromatographique : ................................................................. 53
1.8.1 Facteur de symétrie AS :................................................................................................ 54
1.8.2 Facteur d'asymétrie (ou facteur de trainé tf) : .............................................................. 55
1.9 Test de conformité de système (TCS) : .................................................................................. 56
 1.9.1 Définition du test de conformité du système (TCS) : .................................................... 56
1.9.2 Période d'application du test : ...................................................................................... 58
1.9.3 Les paramètres à vérifier pour l'évaluation d'un système chromatographique : ......... 58
1.10 Domaines d'application de la Chromatographie liquide haute performance (HPLC) : ......... 60
1.11 Avantages et limites : ............................................................................................................ 63
2 Chapitre Ⅱ: La qualification......................................................................................................... 66
2.1 Concept et définitions ............................................................................................................ 66
2.1.1 Qualification : ................................................................................................................ 66
2.1.2 Nécessité de la qualification .......................................................................................... 69
2.2 Réglementations applicables à la qualification des équipements de laboratoires et systèmes
informatisés associés. ........................................................................................................................ 71
2.2.1 Textes réglementaires. ................................................................................................... 71
2.2.2 Guides :.......................................................................................................................... 73
2.3 Divers guides et réglementations dans un même but ............................................................ 76
2.4 La mise au point sur la terminologie ..................................................................................... 77
2.5 Classification des équipements selon l‟USP <1058> ............................................................ 78
2.6 Organisation et Planification des activités de Qualification .................................................. 79
2.6.1 Stratégie globale de qualification des équipements, définie au Plan de
Qualification/Validation du site .................................................................................................... 79
2.6.2 Etablissement des rôles et responsabilités des différents acteurs d‟un projet de
qualification ................................................................................................................................... 80
2.6.3 Notion de cycle de Qualification ................................................................................... 82
2.7 Etapes de Qualification des équipements .............................................................................. 83
2.7.1 Consolidation de l‟analyse et définition des tests à réaliser .......................................... 83
2.7.2 Tests de vérification d‟installation et de configuration (QI) ......................................... 83
2.7.3 Tests de vérification fonctionnelle (QO) ....................................................................... 83
2.7.4 Tests de vérification de performance (QP) .................................................................... 85
2.7.5 La Qualification de Conception (QC) ........................................................................... 85
2.7.6 Factory Acceptance Testing (FAT) / Site Acceptance Testing (SAT) .......................... 85
2.7.7 La Qualification d‟Installation (QI) ............................................................................... 86
2.7.8 La Qualification Opérationnelle (QO)........................................................................... 86
2.7.9 La Qualification de Performance (QP) .......................................................................... 87
2.7.10 La Requalification ......................................................................................................... 88
 2.8 Documentation des activités de qualification (QI, QO, QP et Requalification) .................... 88
2.8.1 Protocole de Qualification ............................................................................................. 88
2.8.2 Fiche de Test ................................................................................................................. 89
2.8.3 Ecart de qualification ..................................................................................................... 89
2.8.4 Rapport de Qualification ............................................................................................... 90
2.8.5 Documents annexes ...................................................................................................... 90
2.8.6 La vie du système après qualification initiale................................................................ 92
2.9 Enjeux de la stratégie de qualification................................................................................... 93
3 Chapitre Ⅲ: Qualification d‟un équipement type HPLC .............................................................. 96
3.1 Qualification de Conception (QC) : ...................................................................................... 96
3.2 Qualification d‟installation QI :............................................................................................. 98
3.3 Qualification opérationnelle : ................................................................................................ 99
3.4 La qualification de performance ......................................................................................... 100
4 Chapitre Ⅳ: Partie critique ......................................................................................................... 103
4.1 Introduction ....................................................................................................................... 103
4.2 PRESSION ANORMALE :....................................................................................................... 103
4.3 FUITES ............................................................................................................................... 107
4.4 PROBLEMES AFFECTANT LE CHROMATOGRAMME ............................................ 109
4.5 PROBLEMES liés à l‟injecteur .............................................................................................. 117
4.6 PROBLEMES DECELES PAR L'ODORAT, LA VUE OU L'OUIE ............................. 118
5 Chapitre Ⅴ:La partie expérimentale........................................................................................... 122
5.1 Objectif : .............................................................................................................................. 122
5.2 Matériels .............................................................................................................................. 123
5.3 Logiciel ................................................................................................................................. 124
5.4 Documentation.................................................................................................................... 124
5.5 Méthodes ............................................................................................................................ 125
5.6 Procédure ............................................................................................................................ 125
5.6.1 Préparation du matériel .............................................................................................. 125
5.6.2 Préparer la pompe de régénération ............................................................................ 126
5.6.3 Préparer l'instrument .................................................................................................. 126
5.6.4 Préparation de l'échantillonneur automatique : ........................................................... 127
5.6.5 Terminer la préparation ............................................................................................... 127
 5.7 Tests de qualification de performance/QO ......................................................................... 128
5.7.1 Test de précision du débit ........................................................................................... 128
5.7.2 Précision de la température du compartiment à colonnes ........................................ 130
5.7.3 Précision de la longueur d'onde - VWD....................................................................... 132
5.7.4 Holmium ...................................................................................................................... 134
5.7.5 Stabilité du bruit / de la température ........................................................................... 135
5.7.6 Précision d'injection / caryover ................................................................................... 137
5.7.7 Linéarité de la réponse ................................................................................................ 139
5.7.8 Gradient ....................................................................................................................... 140
5.7.9 Gradient- Canaux C / D ................................................................................................ 146
6 chapitre Ⅵ: Interprétation des résultats .................................................................................... 152
6.1 Précision du débit ................................................................................................................ 152
6.2 Précision de température.................................................................................................... 154
6.3 Précision de la longueur d'onde .......................................................................................... 155
6.4 Holmium .............................................................................................................................. 157
6.5 Stabilité du bruit / de la température ................................................................................. 158
6.6 Test de Précision d'injection/carryover............................................................................... 159
6.7 Teste de Linéarité de la réponse .......................................................................................... 161
6.8 Gradient de Composition .................................................................................................... 162
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Classification des solvants selon leur polarité et leur pouvoir d‟élution dans la
chromatographie de partage en phase inverse et en phase normale [10] [11]. ____________________ 10
Figure 2 : Principe de la chromatographie d‟exclusion [13]. _________________________________ 11
Figure 3: Adsorption et désorption dans la chromatographie d‟adsorption [8]. ___________________ 12
Figure 4: Interactions entre soluté-solide adsorbant- éluant dans la chromatographie
d‟adsorption [14]. __________________________________________________________________ 12
Figure 5: Principe de la chromatographie échangeuse d'ions [16]. _____________________________ 13
Figure 6: Principe de la chromatographie échangeuse d'ions [16]. _____________________________ 16
Figure 7: La vanne de mélange et le dégazeur en ligne en fonctionnement. [22] __________________ 17
Figure 8: Vanne de mélange d‟un HPLC [22] ____________________________________________ 18
Figure 9: schéma représentatif d‟un dégazeur HPLC [15] ___________________________________ 19
Figure 10: une pompe HPLC _________________________________________________________ 20
Figure 11: D‟UNE POMPE ALTERNATIVE [21] ________________________________________ 22
Figure 12: montage à piston double. [19] ________________________________________________ 23
Figure 13:montage à deux tetes de pompe.[19] ___________________________________________ 23
Figure 14: vanne d‟injection d‟un HPLC[19] _____________________________________________ 25
Figure 15 une boucle d‟echantillonnage pour HPLC [21] __________________________________ 26
Figure 16: Vanne à boucle d'échantillonnage _____________________________________________ 27
Figure 17 : Vanne d‟injection pour HPLC et boucles assorties de différents volumes[19] __________ 27
Figure 18: une boucle d‟injection d‟un HPLC ____________________________________________ 28
Figure 19: COLONNE HPLC[19] _____________________________________________________ 30
Figure 20: Aspects extérieurs éclaté et assemblé d‟une colonne et pré-colonnepour HPLC
[18] _____________________________________________________________________________ 31
Figure 21:: Pouvoir d‟élution de certains solvants. _________________________________________ 38
Figure 22: cellule d‟un detecteuruv-visible (19) ___________________________________________ 40
Figure 23: Principaux paramètres d'un chromatogramme [32] ________________________________ 43
Figure 24: Chromatogramme illustrant le tR, t'R, tM [32] ___________________________________ 44
Figure 25: : Chromatogramme et largeurs du pic chromatographique [10]. ______________________ 47
Figure 26: Illustration du modèle de plateaux théoriques [32]. _______________________________ 49
Figure 27: Chromatogramme et résolution [38]. ___________________________________________ 50
Figure 28: Exemples de séparation chromatographique de deux composés ______________________ 50
Figure 29: : Paramètres pour calculer la sélectivité ________________________________________ 52
Figure 30: : pics chromatographiques [45] _______________________________________________ 54
Figure 31: : Exemple d'une asymétrie de pic chromatographique. _____________________________ 55
Figure32 Figure 32: : Illustration de l‟aspect qualitatif et quantitatif de l‟HPLC [03]. _____________ 61
Figure 34: Cycle de Qualification/Validation d'un système __________________________________ 82
Figure 35: Equipements et solvants ___________________________________________________ 123
Figure 36 : chromatogramme de débit de pompe _________________________________________ 153
Figure 37: chromatogramme de la longueur d‟onde _______________________________________ 154
Figure 38: chromatoramme de temperature _____________________________________________ 155
Figure 39: chromatogramme de précision de la longueur d'onde _____________________________ 156
Figure 40 : chromatogramme de test d‟holmium _________________________________________ 157
Figure 41: chromatogramme de test de Stabilité du bruit / de la température ___________________ 158
Figure 42: qualification des équipement ___________________________________________________
Figure 43: chromatogramme Test de Précision d'injection/carryover 02 _______________________ 160
Figure 44: chromatogramme Test de Précision d'injection/carryover 03 _______________________ 161
Figure 45 : charomatogramme deTeste de Linéarité de la réponse ____________________________ 162
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1:: Composition des phases mobiles et stationnaires dans la chromatographie de
partage en phase inverse et en phase normale [8]. _________________________________ 10
Tableau 2: Les paramètres du test de conformité du système. ________________________ 58
Tableau 3: Limites de paramètres de TCS selon les renseignements de l'USP et FDA [54] [07]
[55] ˃ ____________________________________________________________________ 59
Tableau 4: Avantages et limites de la HPLC _____________________________________ 64
Tableau 5:Les trois catégories des équipements selon l‟USP (1058) ___________________ 78
Tableau 6: les principaux requis en matière de rôles et de responsabilités conformément aux
GMP, à l‟USP <1058> et à l‟Annexe M3 du GAMP 5 (56) : _________________________ 80
Tableau 7: Profondeur des tests réalisés en fonction du niveau GxP ___________________ 84
Tableau8: Les enjeux de la stratégie de qualification _______________________________ 94
Tableau 9: Les éléments de la qualification de conception et ses exemples ______________ 96
Tableau 10/ Les paramètres des test et critères d‟acceptation de la QO _________________ 99
Tableau 11: Normes OQ / PV requises pour tout Détecteur UV série1100/1200 : _______ 127
Tableau 12: Conditions préalables spécifiques aux tests ___________________________ 128
Tableau 13: Les équipements de test___________________________________________ 129
Tableau 14: Limites d'acceptation définies du test de précision de débit _______________ 130
Tableau 15: Conditions de Précision de la température du compartiment à colonnes _____ 130
Tableau 16: Équipement du test de Précision de la température du compartiment à colonnes
________________________________________________________________________ 131
Tableau 17: Limites d'acceptation définies Précision de la température du compartiment à
colonnes _________________________________________________________________ 131
Tableau 18 : Conditions Précision de la longueur d'onde - VWD ____________________ 132
Tableau 19: Équipement du test de Précision de la longueur d'onde - VWD ____________ 132
Tableau 20: Maximum et minimum définis pour la solution de caféine _______________ 133
Tableau 21: Limites d'acceptation définies de Précision de la longueur d'onde - VWD ___ 133
Tableau 22: Conditions d‟ Holmium ___________________________________________ 134
Tableau 23: Longueurs d'onde des maximums définis d‟Holmium ___________________ 135
Tableau 24 :Conditions du test de Stabilité du bruit / de la température _______________ 135
Tableau 25: Limites d'acceptation définies du Stabilité du bruit / de la température ______ 136
Tableau 26: Conditions du test de Précision d'injection / caryover ___________________ 137
Tableau 27 : Équipement de test de Précision d'injection / caryover __________________ 137
Tableau 28 : Conditions du test de linéarité de la réponse __________________________ 139
Tableau 29: Équipement du test de linéarité de la réponse __________________________ 139
Tableau 30: Conditions du test de gradient ______________________________________ 140
Tableau 31: Équipement de test de gradient _____________________________________ 143
Tableau 32: Conditions du est de gradient- Canaux C / D __________________________ 146
Tableau 33: Équipement du test de gradient- Canaux C / D _________________________ 148
Tableau 34: Limites d'acceptation définies du test de gradient- Canaux C / D __________ 150
Tableau 35: Les résultats des tests de débit______________________________________ 152
Tableau 36: Résultats du test de Précision d'injection/carryover _____________________ 161
Tableau 37: Resultats du test de gradient de concentration _________________________ 162
LISTE DES ABREVIATION
AAPS: American Association of Pharmaceutical Chemists

AMM : autorisation de mise sur marché

ANSM : Agence Nationale de Sécurité du Médicament

AS ; Facteur de symétrie

ASTM: American Society for Testing and Materials

BPF : bonnes pratiques de fabrication

CCM : Chromatographie sur couche mince

CE : l‟électrophorèse capillaire

CPG : chromatographie phase gazeuse

DAD : Détecteur Autonome Déclencheur /détecteur à barrette de diodes

DI : diamètre interne

FAT/SAT:Factory Acceptance Test / Site Acceptance Test

FDA : Food and Drug Administration

FIP : International Pharmaceutical Federation

GAMP: Good AutomatedManufacturing Practices

GMP: Good Manufacturing Pratices

GxP: Good x Practices

HEPT = Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique

HILIC : Chromatographie d'interaction hydrophile

HPLC : chromatographie liquide haute performance

1
ICH: International Conference on Harmonization

ISO: International Organization of Standardization

ISPE: International Society for Pharmaceutical Engineering

KC = coefficient de distribution à l‟équilibre (ou constante de distribution),

L : Longueur de la colonne

LC : chromatographie liquide

LSC : chromatographie liquide solide

MWD : détecteur de longueurs d'ondes multiples

N : nombre apparent de plateaux théoriques de la colonne

ODS : groupement diméthyloctadécylsilane

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PASG: Pharmaceutical Analytical Science Group

PC : Chromatographie sur papier

PDA : Détecteur à barrette de diodes

PDV : Plan Directeur de Validation

PEEK : polyétherétherkétone

PSC : la phase stationnaire chirale

QC : qualification de conception

QI : qualification d‟installation

QO : qualification opérationnelle

QP : qualification de performance

2
RSD : Relatif standard déviation = Répétabilité Sr

SFC : Chromatographie fluide supercritique

SI: Systeme international

SST : System Suitability Test (test de compétence du système)

TCC : Le compartiment à colonnes thermostaté Agilent est un compartiment à colonnes pour

CPL à régulation thermostatique. Il existe sous la forme d‟un module indépendant ou intégré
à un système Agilent. Il est utilisé pour le chauffage et le refroidissement afin d‟optimiser la
reproductibilité des temps de rétention

TCS : Test de conformité de système .

USP : l'United States Pharmacopiea

UV : ultra-violet

VM = volume de la phase mobile

VR : volume de rétention

VS = volume de la phase stationnaire,

VWD : variable waevelenght detector/ Détecteur à longueur d'onde variable

ZAC : Zones à Atmosphère Contrôlées

4Q = c‟est-à-dire les quatre étapes de la qualification (qc+qi+qo+qp)

21 CFR part 11 de FDA : code of federal régulation title 21 (code électronique des
règlementation fédéral)

3
Liste des indices
tR : temps de rétention

Dm : Coefficient de distribution massique

tM :temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection
et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant non
retenu(« hold-up time »)

tt= temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection
et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant ayant accès
à tous les pores de la phase stationnaire

wh= largeur du pic à mi-hauteur

Rs : résolution

« r » : La rétention relative

rG : La rétention relative non ajustée

α : La sélectivité

tf : Facteur d'asymétrie (ou facteur de trainé )

n : Nombre des valeurs individuelles

K' : Facteur de capacité

yi : Valeurs individuelles (surfaces ou hauteurs de pic ou rapport de surface pour méthode

d'étalon).

ȳ : Moyenne des valeurs individuelles.

4
Svt : souvent

Qqs : quelques

5
GLOSSAIRE
VALIDATION : l‟Etablissement de la preuve, en conformité avec les principes de bonnes
pratiques de fabrication, que la mise en œuvre ou l'utilisation de tout processus, procédure,
matériel, matière première, article de conditionnement ou produit, activité ou système permet
réellement d'atteindre les résultats escomptés

QUALIFICATION Vérification du bon fonctionnement d‟un appareil, à savoir s‟il est

capable de produire les résultats pour lesquels il est conçu tout au long de sa vie.

ADSORPTION : est un phénomène de surface par lequel des molécules de gaz ou de

liquides se fixent sur les surfaces solides des adsorbants. Les molécules ainsi adsorbées
constituant l‟adsorbat.

CHROMATOGRAPHIE : est une technique permettant de séparer plusieurs constituants

d'un mélange en les faisant migrer, sur une phase immobile, par une phase liquide ou gazeuse.

PRECISION : La précision signifie être en mesure d'obtenir la même réponse pour un

échantillon particulier à chaque fois, lorsque nous répétons une analyse sur cet échantillon.

ELUANT : Solvant frais employé en chromatographie en phase liquide pour séparer un corps
absorbé sur un support. L'éluant peut-être un mélange d'eau et d'éthanol.

SENSIBILITE : En analyse qualitative c‟est la quantité minimale d‟une substance nécessaire

pour obtenir un spectre de masse interprétable.

PHASE INVERSE : composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes
de carbones (C8 et C18) Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire
(Acétonitrile ACN), Méthanol, H2O)

PHASE MOBILE : Les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (liquide) que l'on
appelle la phase mobile

PHASE STATIONNAIRE : un support (ou matrice) fixe (un solide ou un liquide fixé) de
fine granulométrie.

6
TEMPS DE RETENTION : est le temps au bout duquel un composé est élué de la colonne
et détecté), caractérise qualitativement une substance.

DESORPTION : consiste alors à remettre, à l‟aide d‟un éluant approprier, la substance en

solution par rupture des liaisons précédentes.

DES COMPLEXES DIASTEREOISOMERES : sont des molécules qui ont le même

enchaînement d'atomes, mais qui ne sont ni superposables, ni image l'une de l'autre dans un
miroir.

ACIER INOXYDABLE : couramment appelé acier inox ou inox, est un acier avec plus de
10,5 % de chrome, dont la propriété est d'être peu sensible à la corrosion et de ne pas se
dégrader en rouille.

BARBOTAGE : le passage d'un gaz chimiquement inerte à travers un liquide.

STATOR : est la partie fixe d‟une machine rotative et la partie rotative dite rotor

Colonne baptisées narrow-bore : un type de colonne standard

REPETABILITE : Fidélité obtenu dans la condition dans laquelle, les résultats sont obtenus
par la même méthode sur des échantillons d‟essais identiques dans le même laboratoire, par le
même opérateur et avec du matériel identique.

Résolution chromatographique

INDICE DE REFRACTION : est une grandeur sans dimension caractéristique d'un milieu,
décrivant le comportement de la lumière dans celui-ci ; il dépend de la longueur d'onde de
mesure mais aussi des caractéristiques de l'environnement (notamment pression et
température)

CONSTANT DIELECTRIQUE : ou constante électrique, également nommée permittivité

du vide ou encore permittivité diélectrique du vide, est une constante physique. Elle est notée
par ε0

7
CONDUCTIVITE : ou conductibilité ; caractérise la capacité des matériaux à diffuser
la chaleur, conduire l'électricité ou laisser passer un fluide, sous l'effet
d'un gradient de température, de potentiel ou de pression.

POLAROGRAPHIE : est une forme particulière de la voltampèremètre qui utilise comme

électrode de travail une électrode à gouttes tombantes de mercure (en) et dans laquelle la
solution n'est pas agitée.

FLACON VIAL :matériel de laboratoire sous forme de flacon remplie d‟échantillon

REQUALIFICATION : Vérification à fréquence appropriée selon des

TESTESREGLEMENTAIRES : Ce sont des textes émanant directement ou indirectement

du pouvoir législatif.

CARRY-OVER : Test de dosage de traces résiduelles.

BRUIT DE FOND : En traitement du signal, on appelle bruit de fond toute composante non désirée
affectant la sortie d'un dispositif indépendamment du signal présent à son entrée.

Teste d’holmium : test utiliser pour la qualification de la longueur d’onde de détecteurd’équipement

type HPLC

ChemStation :Système informatisé qui est utilisé par l‟équipementHPLCAgilent 1100/1200

ASTM : ASTM International est un organisme de normalisation qui rédige et produit des normes
techniques concernant les matériaux, les produits, les systèmes et les services. Il a été fondé
en 1898 aux États-Unis sous la direction de Charles Benjamin Dudley. Il portait alors le nom
de American society for testing material (société américaine pour les essais des matériaux).

8
Introduction générale

9
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Introduction generale
Dans l‟industrie pharmaceutique, la mise sur le marché d‟un produit de haute qualité
nécessite une maîtrise parfaite des différentes étapes de la vie d‟un médicament.
La qualité d‟un produit regroupe ses facteurs intrinsèques, physico-chimiques et
microbiologiques, mais également extrinsèques tels que le conditionnement ou les conditions
de stockage et de distribution.
Il existe pour chaque étape, de la fabrication à la distribution, de nombreux contrôles en cours
de production ainsi que des analyses sur le produit fini permettant de vérifier que les critères
qualitatifs d‟un produit ont été respectés. L‟ensemble de ces données prouve a posteriori la
conformité du produit.
Ces nombreux essais effectués au niveau du laboratoire de contrôle qualité avec différentes
méthodes d'analyse.
Nous sommes particulièrement intéressées à la Chromatographie Liquide Haute Performance
(HPLC) qui est une méthode de séparation de plus en plus utilisée en industrie
pharmaceutique de par sa vitesse d'exécution, son grand pouvoir de résolution et son aptitude
à analyser de manière qualitative et quantitative de faibles quantités d'échantillons. Les
résultats sont faciles à lire et les tests aisément reproduits via le processus automatisé.
Aussi, afin de prouver que le système chromatographique fonctionne correctement au
moment de l'analyse, on doit être sûre que la méthode est validée et l‟équipement d‟HPLC est
qualifié.
La validation et la qualification sont des pratiques démontrant par une série de tests que les
procédés de production, de stockage ou de distribution permettront d‟assurer au produit un
haut degré de qualité.
La validation et la qualification sont devenues incontournables lors de la mise en place d‟un
nouveau procédé ou lors d‟une modification impactant fortement le procédé déjà établi. La
validation démontre la robustesse du procédé avant sa mise en place alors que la qualification,
également appelée validation d‟équipement, prouve la fiabilité d‟un équipement à délivrer un

1
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
résultat conforme. Ces deux pratiques sont étroitement liées et les équipements utilisés dans
un procédé doivent être qualifiés avant que celui-ci ne soit validé.

Dans le cadre de la réalisation de notre projet de fin d‟étude nous a proposé de faire une étude
concernant la qualification d‟un équipement type HPLC

2
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Premiere partie : Etude bibliographique

3
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

-ChapitreⅠ :
Chromatographie en phase
liquide haute performance
HPLC

4
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1 -Chapitre1 : Chromatographie en phase liquide haute performance
HPLC

1.1 Historique :
La Chromatographie comme méthode physico-chimique pour la séparation du complexe
mélanges a été découvert au tout début du XXe siècle par Le botaniste russo-italien MS
Tswet. Dans son article « Sur la nouvelle forme de phénomène d‟adsorption et son
application à l‟analyse biochimique » présenté le 21 mars 1903 à la réunion ordinaire de la
section de biologie de la Varsovie Société des sciences naturelles, Tswet a donné une
description très détaillée des phénomènes récemment découverts de séparation par adsorption
de mélanges complexes, qu'il a appelé plus tard « chromatographie » comme une
translittération du grec « Ecriture couleur ». Par hasard, la signification du mot russe « Tswet
» signifie en fait la couleur.

Bien que dans toutes ses publications, Tswet ait mentionné que l'origine du nom de sa
nouvelle méthode était basée sur l'image colorée de sa première séparation de pigments
végétaux, il a involontairement porté son propre nom au nom de la méthode qu'il a inventée.

La méthode chromatographique n'a pas été appréciée par les scientifiques de l'époque de la
découverte, ainsi qu'après presque 10 ans lorsque LS Palmer aux États-Unis et C. Dhere en
Europe a publié indépendamment la description d'un processus de séparation similaire. Vingt-
cinq ans plus tard, en 1931, Lederer a lu le livre de LS Palmer et a trouvé plus tard une
publication originale de MS Tswett, et en 1931 il (ensemble avec Kuhn et Winterstein) ont
publié un article sur la purification de xanthophylles sur CaCO3 colonne d'adsorption suivant
la procédure décrite par MS Tswet. En 1941, AJP Martin et RLM Synge à l'Université de
Cambridge, au Royaume-Uni ont découvert la chromatographie de partition pour laquelle ils
ont obtenu le Prix Noble en 1952. La même année, Martin et Synge ont publié un article qui,
avec l'article d‟AT James et AJP Martin, jeté une base solide pour la croissance rapide des
techniques chromatisent sous forme de chromatographie en phase gazeuse et partiellement en
couche mince et liquide – liquide chromatographie.

Renaissance de la chromatographie liquide dans sa modernité forme et sa croissance

5
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
extrêmement rapide en avaient fait la principale technique du XXIe siècle qui peut être
attribuée partie aux travaux pionniers du Prof. C. Horvath à l'Université de Yale.

Au milieu des années 60 Prof. Horvath, qui a précédemment travaillé sur le développement
d‟une poreuse colonne tubulaires ouvertes à couches pour la chromatographie en phase
gazeuse, avait décidé d'utiliser pour chromatographie liquide petites billes de verre avec une
couche poreuse sur leur surface pour faciliter le transfert de masse entre la phase liquide et la
surface.

Colonnes emballées avec ces billes a développé une résistance significative au flux liquide, et
le professeur Horvath a été graphiques qui bientôt suivi. La chromatographie a été découverte
par Tswet sous forme de chromatographie liquide-solide (LSC), mais son développement s'est
poursuivi pendant plus de 50 ans principale montrait de construire un instrument permettant
le développement d'un écoulement continu du liquide à travers la colonne.

C'était l‟origine de la chromatographie liquide haute performance (HPLC), et le nom de cette

méthode de séparation a été introduit par le professeur Horvath en 1970 à la vingt et unième
Conférence de Pittsburgh à Cleveland. La première séparation sur une surface chimiquement
modifiée avec un l'éluant, qui a plus tard obtenu le nom de « phase inversée », a également
été inventé par Horvath, il a démontré la première séparation en phase inversée de acides gras
sur billes de verre pelliculaire recouvertes de noir de carbone graphitées. [1]

1.2 Définition
La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une technique largement utilisée
pour l'analyse des produits pharmaceutiques, des biomolécules, des polymères et de
nombreux composés organiques et ioniques. La chromatographie liquide (LC) est une
technique de séparation physique menée entre deux phases une phase solide et une phase
liquide. Un échantillon est séparé en son constituent composants (ou analytes) en les
distribuant (par partitionnement, adsorption ou autres interactions) entre la phase mobile (un
liquide qui coule) et une phase stationnaire solide (sortants emballés à l'intérieur d'une
colonne).

Par exemple, le liquide qui s'écoule peut-être un solvant organique tel que l'hexane et la phase

6
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
stationnaire peut être les particules de silice poreuses emballées dans une colonne. HPLC est
une forme moderne de LC qui utilise des colonnes de petites particules à travers lesquelles la
phase mobile est pompée à haute pression. [2]

1.3 Principe :
La chromatographie en phase liquide sous haute performance est une méthode de séparation
qui fait sensiblement appel aux mêmes éléments de base que ceux employés pour la
chromatographie classique sur colonne, soit un ou plusieurs solvants liquides constitue(nt) la
phase mobile et une colonne remplie avec une phase stationnaire. [3]

Cependant, au lieu que le solvant passe à travers la colonne sous le seul effet de la force de
gravité prenant plus de temps pour éluer, en HPLC la durée d'élution est plus courte et est
obtenue par l'application d'une pression élevée de l'ordre de 100 bars grâce à une pompe qui
maintient constant le débit du liquide. La méthode est hautement automatisée et extrêmement
sensible. [3] [4]

Les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (liquide) que l'on appelle la phase
mobile. Elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice)
fixe (un solide ou un liquide fixé) que l'on appelle la phase stationnaire de fine granulométrie.
Cette caractéristique de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des
composants. [3]

En effet, pour un même volume de phase stationnaire, la surface d'échange augmente si les «
grains » qui la composent sont du diamètre plus petit. Les pics obtenus sont plus étroits, donc
la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés, on peut donc bien les différencier), le
seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du
bruit de fond que des pics larges et bas).[3]

La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation «

haute performance ».[3]

7
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Il y a donc une distribution ou partition des composants entre ces deux types de phases. Le
flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes
molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres [3].

Ainsi, sous certaines conditions dynamiques chaque composant du mélange atteint un

équilibre de distribution en fonction de son affinité pour les deux phases et /ou de sa taille
moléculaire. Il en résulte le déplacement des composés à différentes vitesses et c‟est le
détecteur placé à la sortie de la colonne, couplé à un enregistreur qui permet d'obtenir un tracé
appelé chromatogramme. [5]

En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence de
la phase mobile seule, par la suite ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le
temps à l'enregistrement d'un pic. [5]

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout

duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une
substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de
la ligne de base permettent de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange
injecté. [5]

1.4 Mécanismes séparatifs de la chromatographie liquide haute

performance (HPLC) :
1.4.1 Chromatographie de partage :
La séparation dépend des différences de solubilité des solutés dans la phase mobile et des
différentes interactions des solutés avec les groupements organiques greffés sur la phase
stationnaire. L'affinité de chaque constituant pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité
dans cette phase et de sa polarité. Les forces qui entrent en jeu sont donc les forces de Vander
Waals, les ponts hydrogène… etc. C‟est la technique de chromatographie liquide la plus
utilisée, elle fonctionne donc par partage de solutés entre deux phases non miscibles. Ce
mécanisme est surtout utile pour la séparation de molécules très polaires de masses molaires
inférieures à 3000g/mol (composés non-ioniques).

8
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Il existe deux types de chromatographie de partage selon la polarité des phases stationnaires
et mobiles [6] [4] :

1) Chromatographie de partage sur phase normale :

La phase normale est constituée du gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc
utiliser un éluant apolaire [4]. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires
sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent en tête.[7] [8]

L'inconvénient d'une telle phase, est la détérioration rapide au cours du temps du gel de
silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.[8]

2) Chromatographie de partage sur phase inverse :

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8
ou 18 atomes de carbones (C8 et C18) [16] Cette phase est apolaire et nécessite donc un
éluant polaire (Acétonitrile (ACN), Méthanol, H2O). Dans ce cas, ce sont les composés
polaires qui seront élués en premier.[4] [8] [9]

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours
du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante [8].

Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec une phase
greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales [8].

Ainsi, avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé apolaire.
Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des gradients
d'élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l'éluant (ex : mélange eau
/acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en croissant au cours de l'élution). On
peut en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase mobile [8].

Le tableau ci-dessous présente quelques exemples de la composition des phases mobiles et

stationnaires dans la chromatographie de partage en phase inverse et en phase normale :

9
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Tableau 1:: Composition des phases mobiles et stationnaires dans la chromatographie de
partage en phase inverse et en phase normale [8].

Phase Phase inversée Phase normale (classique)

Phase stationnaire Non polaire Polaire

ex. ex.
- silice greffée par une chaine - C3H6NH2
alkyle ou phényle - C3H6N(CH3)2
Polaire - diol

Phase mobile Polaire Non polaire

ex. Ex
- eau . - n-hexane
- méthanol - chloroforme
- acétonitrile - éther
- tétrahydrofurane

Le pouvoir d‟élution des solvants diffère selon le type de chromatographie de partage (en
phase inverse ou en phase normale), comme l‟illustre le tableau suivant :

Figure 1 : Classification des solvants selon leur polarité et leur pouvoir d‟élution dans la
chromatographie de partage en phase inverse et en phase normale [10] [11].

10
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

1.4.2 Chromatographie d'exclusion :

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel filtration ou
perméation de gel.

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille (leur volume
hydrodynamique), de leur forme et poids moléculaire. Elle est notamment utilisée pour
évaluer la distribution des volumes hydrodynamiques dans un échantillon de polymères.

On utilise pour cela des granules de gel poreux [4]. Les molécules (dont le diamètre est
supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du
volume mort (Vm ou V0). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement,
car induites dans le gel, leur migration est freinée [12]. Les solutés sont donc élués dans
l'ordre inverse de leurs masses moléculaires comme l‟illustre la figure suivante :

Figure 2 : Principe de la chromatographie d‟exclusion [13].

1.4.3 Chromatographie d'adsorption :

C'est la première chromatographie réalisée : séparation des pigments végétaux par adsorption
sur de la craie [4]. Cette chromatographie est basée sur la mise en jeu d‟un phénomène
physico-chimique : l‟adsorption qui consiste en la fixation d‟une substance à l‟état liquide sur
une surface solide [8].

Ce phénomène fait intervenir des forces complexes entre le soluté et l‟adsorbant : forces
électrostatiques, forces inductives, forces de liaisons hydrogènes, forces de transfert de

11
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
charges et autres. Mais pour que cette adsorption soit utilisable à des fins séparatives, il faut
que cette fixation soit réversible comme l‟illustre la figure 2.8 ci-dessous. La désorption
consiste alors à remettre, à l‟aide d‟un éluant approprier, la substance en solution par rupture
des liaisons précédentes. Des relations d‟équilibre règlent les interactions réciproques [8].

Figure 3: Adsorption et désorption dans la chromatographie d‟adsorption [8].

Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par adsorption) et une force
d'entrainement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration
différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation [14].

Le schéma ci-après résume les interactions entre le soluté, le solide adsorbant et l‟éluant :

Figure 4: Interactions entre soluté-solide adsorbant- éluant dans la chromatographie

d‟adsorption [14].

12
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.4.4 Chromatographie échangeuses d'ions :

Appelée chromatographie à ions ou chromatographie échangeuse d'ions, il s‟agit d‟un type de

chromatographie en phase liquide permettant d'isoler une substance chargée électriquement
(ionique) d'un mélange de molécules chargées (liquide). Pour cela, on fait passer le mélange
sur une phase stationnaire chargée, déjà associée à des ions connus. Ces ions sont remplacés
par les ions/molécules chargées du mélange à séparer. Elle est basée sur l‟affinité que les ions
en solution ont pour les ions de charge opposée de la phase stationnaire. Cette phase
stationnaire est généralement une résine sur laquelle sont liés chimiquement des groupements
ioniques. La phase mobile est une solution aqueuse tamponnée dans laquelle se trouvent les
ions possédant les charges opposées à celles de la phase stationnaire. La rétention sur la
colonne est dictée par la compétition qui existe entre le soluté et le contre-ion pour le site
ionique. C‟est une technique chromatographique couramment utilisée en chimie analytique,
notamment pour le contrôle de la qualité de l‟eau [3] [15].

Figure 5: Principe de la chromatographie échangeuse d'ions [16].

13
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

1.4.5 Chromatographie chirale :

La chromatographie chirale est une technique très importante pour l‟étude des molécules
chirales grâce à la séparation analytique des énantiomères [12].

Elle permet au niveau analytique de mesurer des excès énantiomériques, et au niveau

préparatif d‟isoler des énantiomères purs [12].

Elle consiste en la formation de liaisons non covalentes entre les énantiomères du substrat et
l'absorbant chromatographique chiral donnant des complexes diastéréoisomères ayant des
affinités de liaisons différentes [12].

Dans cette technique, le mélange racémique à séparer est introduit et va interagir avec la
phase stationnaire chirale (PSC). L‟obtention de la séparation des énantiomères passe par la
formation réversible de complexes diastéréoisomères dans la colonne de chromatographie
(par liaison de van Der Waals entre les solutés que l‟on veut séparer et le sélecteur chiral).

L‟intérêt est que les complexes diastéréoisomères ainsi formés possèdent des propriétés
physiques différentes ; ainsi l‟un des isomères sera plus accroché que l‟autre et migrera donc
plus lentement, permettant leur séparation physique [12].

A l‟heure actuelle, parmi les nombreuses méthodes de discrimination chirale, l‟HPLC

représente une technique de choix pour la purification et la quantification d‟énantiomères.

En effet, outre le fait qu‟elle allie à la fois rapidité, efficacité et sensibilité, elle permet
également la séparation de composés chiraux sur des phases stationnaires chirales ou après
addition de réactifs chiraux à la phase mobile [11] [12].

Outre les quatre principaux modes de séparation HPLC, plusieurs autres souvent rencontrés
en HPLC ou des techniques apparentées sont indiqués ci-dessous.

Chromatographie affinité 9 : Basé sur une interaction (récepteur / ligand) dans laquelle des
ligands immobilisés (enzymes, antigènes ou hormones) sur des supports solides sont utilisés
pour isoler des composants sélectionnés à partir d'un mélange. Les composants conservés
peuvent ensuite être libérés à l'état purifié.

14
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) 9 : Ceci est quelque peu similaire à la
chromatographie en phase normale utilisant une phase stationnaire polaire telle que la silice
ou des matériaux d'échange d'ions mais éluée avec un mobile polaire

QUELQUES COROLLARIES DE SENS COMMUN 11 phases de solvants organiques et

tampons aqueux. Il est le plus couramment utilisé pour séparer les analytes polaires et les
peptides hydrophiles.

Chromatographie d'interaction hydrophobe 4,9 : Analogue au RPC, sauf que des phases
mobiles de faible teneur en solvant organique et de fortes concentrations de sel sont utilisées
pour la séparation de protéines qui sont facilement dénaturées par des phases mobiles avec
des concentrations élevées de solvants organiques utilisés dans le RPC.

Électro chromatographie : Utilise l'électrophorèse capillaire 17 (CE) avec une colonne HPLC
capillaire garnie. La phase mobile est entraînée par la force électromotrice d'une source haute
tension par opposition à une pompe mécanique. Il est capable d'une très grande efficacité.

Chromatographie fluide supercritique (SFC) 18 : Utilise des colonnes à garnissage HPLC et

une phase mobile de fluides supercritiques sous pression (c'est-à-dire du dioxyde de carbone
modifié avec un solvant organique polaire). Utile pour les analytes non polaires et les
applications préparatives où les matériaux puri fi és peuvent être récupérés facilement par
évaporation du dioxyde de carbone. Les pompes HPLC et les détecteurs de type GC sont
souvent utilisés.

Autres formes de chromatographie liquide basse pression :

- Chromatographie sur couche mince (CCM) 19 utilise des plaques de verre recouvertes
d'adsorbants et l'action capillaire comme force motrice. Utile pour le dépistage d'échantillons
et l'analyse semi-quantitative.
- Chromatographie sur papier (PC), une forme de chromatographie de partition utilisant le
papier comme phase stationnaire et l'action capillaire comme force motrice.
- La chromatographie flash, technique de purification d'échantillons utilisant des colonnes
NPC en verre jetables et une phase mobile entraînée par des pompes à pression de gaz ou à
basse pression. [17]

15
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

1.5 Appareillage :

En raison de sa polyvalence et du vaste domaine de ses applications, la chromatographie

liquide haute performance (CLHP ou HPLC) est actuellement la plus utilisée de toutes les
techniques de séparation. Le champ d‟application de ce type de chromatographie recouvre
une grande partie du domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel s‟ajoute
l‟analyse : -des composés thermosensibles, des composés très polaires, ainsi que des
composés de masses molaires élevées. [18]

1.5.1 Conception :
Une installation de HPLC comporte divers modules spécialisés qui se présentent dans des
boîtiers distincts ou sont intégrés dans un même châssis pour moins d‟encombrement. [18]

Figure 6: Principe de la chromatographie échangeuse d'ions [16].

Le principe de fonctionnement d‟un HPLC consiste à éluer des composés sur une phase
stationnaire à l‟aide d‟une phase mobile en fonction de l‟affinité du composé pour les
différentes phases. Le système est donc composé :

* Le système de pompage du solvant : comprend les réservoirs à solvant, dégazeur, les

pompes à solvant, un atténuateur de pulsations et les valves permettant de choisir la
concentration des différents solvants.

16
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
* L‟injecteur : comprend une seringue qui permet d‟aspirer l‟échantillon dans une boucle
d‟injection.

* La colonne est remplie d‟une fine granulométrie, soit des grains de l‟ordre du micromètre,
et permet la rétention des composés. Servant à la séparation des composés

* le détecteur est un instrument permettant la quantification du composé élué en donnant un

signal de l‟intensité en fonction du temps d‟élution.

* le système informatisé : un micro-ordinateur muni d‟un logiciel spécialisé pour l‟intégration

et l‟acquisition des données. [20]

1.5.2 Système de pompage du solvant :

1.5.2.1 Les réservoirs à solvants :

Les appareils HPLC sont équipés d‟un ou plusieurs réservoirs de solvant en verre ou parfois
en acier inoxydable de contenance d‟environ 1 litre, ce qui permet de réaliser un nombre
important d‟analyses sans interruption. Ces réservoirs sont souvent étanches afin d‟éviter
l‟évaporation des solvants (et ainsi la modification de la composition du mélange) ou leur
contamination. [19]

On y adjoint souvent des dispositifs qui permettent d‟en éliminer les poussières et les gaz
dissous. En effet, ces derniers peuvent former des bulles au sein de la colonne, ce qui cause
un élargissement des pics ; en outre, bulles et poussières perturbent le fonctionnement du
détecteur. [21]

Figure 7: La vanne de mélange et le dégazeur en ligne en fonctionnement. [22]

17
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.5.2.2 Vanne de mélange :
C'est un dispositif, piloté par micro-ordinateur qui permet la délivrance, par unité de temps,
de solvants composant la phase mobile en proportion désirée. En pratique, la pompe aspire le
débit désiré et 4 vannes reliées aux réservoirs de solvants sont ouvertes pendant un laps de
temps correspondant à la proportion désirée de chaque solvant pur dans la phase mobile.[22]

Figure 8: Vanne de mélange d‟un HPLC [22]

1.5.2.3 Dégazeur :
Les réservoirs de solvants peuvent être équipés de dispositifs de dégazage (barbotage
d‟hélium ou mise sous vide) permettant d‟éliminer les gaz dissous et en particulier l‟oxygène.
[19]

Le dégazage peut s‟effectuer par barbotage, procédé par lequel les gaz dissous sont chassés de
la solution par l‟action de fines bulles d‟un gaz inerte, insoluble dans la phase mobile. [21]

18
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 9: schéma représentatif d‟un dégazeur HPLC [15]

Remarque : L’effet de l’oxygène sur l’analyse chromatographique :

L‟oxygène est souvent nuisible à l‟analyse chromatographique :

*il augmente le risque de dégradation des échantillons et abrège la durée de vie des colonnes
car les phases stationnaires sont facilement oxydables.

* il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le détecteur ce qui conduit à un

bruit de fond important et rend l‟analyse impossible.

*il diminue le seuil de détection lors d‟une analyse par spectroscopie d‟absorption à faible
longueur d‟onde, par fluorimétrie ou par électrochimie.

*il contribue à la corrosion des pièces en contact avec la phase mobile. La corrosion
augmentant avec la pression, les pistons et les joints des pompes sont souvent en saphir,
agate, Téflon ou en alliages spéciaux.

Il est donc préférable de dégazer les solvants soit par ultrasons soit par barbotage d‟hélium
soit par filtration avant d‟introduire les solvants dans leur réservoir. [19]

1.5.2.4 Les pompes :

La pompe d‟un chromatographe a pour rôle d‟assurer l‟écoulement de la phase mobile dans la
colonne. Ces pompes doivent être très puissantes car la viscosité des solvants et la
granulométrie très fine des phases stationnaires entraînent des différences de pression ou des
pertes de charges entre le sommet et l‟extrémité des colonnes qui peuvent parfois être
importantes (50 à 100 bars). [19]

19
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
La pompe est constituée d'un piston en saphir synthétique qui se meut au sein d'un cylindre en
acier inoxydable muni de deux clapets anti-retours.

Le mouvement de ce piston est piloté par une came en acier inox et par un ressort.

La came pousse le piston pour lui faire expulser le solvant contenu dans le cylindre à travers
le clapet de sortie.

Le ressort oblige le piston à suivre la came au cours du mouvement de retour, remplissant

ainsi le cylindre de solvant par le clapet d'entrée.

La came est usinée de telle façon que le solvant est expulsé avec un débit constant et que le
retour et le remplissage se fassent en un minimum de temps. (22)

Figure 10: une pompe HPLC

Ce système à deux corps de pompe fonctionnant en alternance a été un des premiers systèmes
permettant la délivrance d'un débit constant. (22)

Aujourd'hui grâce aux progrès de l'informatique qui permet de piloter finement la vitesse des
pistons dans les corps de pompe et par là de contrôler parfaitement le débit, la plupart des
constructeurs ont adopté la configuration suivante ; un corps de pompe suivi d'un réservoir
qui permet au mélange de solvants de s'homogénéiser (nous sommes après la vanne de
mélange) puis un second corps de pompe délivrant le débit demandé. (22)

20
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Les plus usuelles permettent d‟obtenir des pressions de 420 bars (ou 6000 PSI (1 PSI = 0,07
bar)). [19]

Les pompes doivent répondre à des exigences rigoureuses :

❶obtention de pressions jusqu‟à au moins 420 bars ;

❷absence de pulsations ;

❸débit compris entre 0,1 ml et 10 ml/min ;

❹ contrôle du débit meilleur que 0,5 % ;

❺résistance à la corrosion quel que soit le solvant.

[21]

Les pompes sont très onéreuses et interviennent pour une très grande part dans le coût élevé
des appareils. [19]

N.B !! Il faut noter que les pressions très élevées engendrées par les pompes HPLC ne
présentent aucun danger d‟explosion car les liquides ne sont pas très compressibles. La
rupture d‟une pièce mécanique n‟entraîne qu‟une fuite de solvant. [19]

La grande majorité des appareils est équipée par des pompes à pistons alternatifs. [19]

1.5.2.4.1 Types des pompes :

Les pompes alternatives : comprennent une petite chambre cylindrique qui se remplit et se
vide en fonction du mouvement de va-et-vient d‟un piston. Ce mouvement donne naissance
à un écoulement pulsé qui doit être amorti. [21]

21
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 11: D‟UNE POMPE ALTERNATIVE [21]

Leur avantage réside principalement dans :

*leur petit volume interne,

* leur pression de sortie élevée (jusqu'à 700 bars),

*leur adaptabilité à la technique de gradient d élution,

*la constance de leur débit qui est pratiquement indépendante de la pression dans la colonne
et de la viscosité du solvant.

Afin d‟éviter l‟écoulement pulsé qui est propre au mouvement de va-et-vient du piston
(remplissage-expulsion), les constructeurs ont mis au point des pompes à deux pistons qui
fonctionnent soit en mode série soit en mode parallèle.

a/ En mode série, le piston amont (piston A) refoule une quantité de solvant deux fois plus
importante que le piston aval, soit parce que son diamètre est plus important, soit parce que sa
course est plus grande. Les deux pistons sont déphasés : lorsque l‟un aspire, l‟autre refoule.
Dans ce système, pendant que le piston A aspire une quantité d éluant, le piston B refoule la
phase mobile dans la colonne. Ensuite, lorsque le piston A refoule l éluant, une partie de ce
dernier vient remplir le cylindre du piston B qui règle ainsi le débit nominal et l‟autre partie
est refoulée dans la colonne. Ces montages nécessitent des vannes en amont et en aval de
chaque piston. [19]

22
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 12: montage à piston double. [19]

b/ en mode parallèle système de pompage est constitué de deux têtes de pompe fonctionnant
en opposition permettant d‟obtenir un débit de phase liquide sans pulsations.[19]

Figure 13:montage à deux tetes de pompe.[19]

Modes de gradient :

Deux modes de gradients peuvent être déduits :

A. / Gradient d’éluant :

L élution graduée lors de la séparation de mélanges complexes permet, en modifiant la

composition de l‟éluant, d‟optimiser les facteurs de capacité et de réduire les temps d‟analyse.
[19]

Les gradients peuvent être réalisés de deux manières différentes :

23
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
01.les solvants sont dosés et mélangés en amont de la pompe en programmant le temps
d‟ouverture de vannes proportionnelles (système basse pression). Ce système nécessite d
intercaler un système de dégazage en ligne des solvants (souvent effectué par dépression).

02. Les solvants sont dosés et mélangés en aval des pompes (système haute pression).
Dans ce dispositif, il est nécessaire d‟avoir autant de pompes que de solvants. Le gradient
est obtenu simplement en modifiant, à débit total constant, le rapport des débits des
pompes. [19]

La programmation de solvant est destinée à améliorer l‟efficacité de la séparation, tout

comme la programmation de température en CG. Les appareils modernes de CLHP sont
souvent équipés de vannes proportionnâtes qui permettent d‟injecter les liquides de deux ou
plusieurs réservoirs à des vitesses qui varient de manière continue. [21]

B/ Mode isocratique ;

Une élution isocratique est une élution au cours de laquelle la composition de la phase
mobile n'est pas modifiée au cours du temps.

1.5.3 Le système D’injection :

La solution à examiner est introduite dans la phase mobile qui circule en tête de colonne, ou à
proximité de celle-ci, à l‟aide d‟un système d‟injection conçu pour fonctionner à pression
élevée. [22]

L‟injection d‟un volume précis d‟échantillon doit se faire en un temps bref afin de perturber
le moins possible le régime de circulation de la phase mobile.[18]

On doit injecter rapidement un volume précis sans arrêter l‟écoulement du solvant à un

endroit où règne une pression élevée.[22]

La difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume d‟échantillon là où la pression

atteint plusieurs dizaines de bars. [19]

1.5.3.1 Vannes De Remplissage :

Ce type de vannes peut être utilisé soit manuellement soit commandé par un passeur
automatique d‟échantillons. [19]

24
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Le remplissage partiel des boucles manuellement, peut entraîner une moindre fidélité du
volume injecté. [4]

Figure 14: vanne d‟injection d‟un HPLC [19]

1.5.3.2 Vanne D’injection :

C‟est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes,
nous utiliserons une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la
taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la
boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour
l'analyse quantitative. [24]

☛ On injecte souvent l‟échantillon à l‟aide d‟une seringue à travers un septum en élastomère

; toutefois, cette procédure n‟est pas très reproductible et reste limitée aux pressions ≤100
bars. [21]

☛ En injection à écoulement bloqué, on arrête momentanément le flux de solvant,

on ouvre un ajustage au-dessus de la colonne et on y injecte l‟échantillon à l‟aide d‟une

seringue.la méthode d‟introduction emploie des boucles d‟échantillonnage.
[21]

☛ Ces dispositifs font partie intégrante de l‟appareillage de HPLC moderne qui possède des

boucles interchangeables permettant de choisir des volumes d‟échantillon compris entre 5 et

25
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
500 µL. Avec ce système, la reproductibilité des volumes injectés est de quelques dixièmes
de %. [21]

Figure 15 une boucle d‟echantillonnage pour HPLC [21]

La vanne d‟injection fonctionne en deux temps :

➤En position « Chargement », seule la communication entre pompe et colonne est assurée

et l‟échantillon est introduit dans la boucle à l‟aide d‟une seringue. La reproductibilité des
volumes n‟est atteinte que si la boucle a été totalement remplie par l‟échantillon. Le volume
prélevé est donc toujours largement supérieur à celui de la boucle. [18]

➤En position « Injection », l‟échantillon est inséré dans le flux de phase mobile par rotation

de 60◦ d‟un levier qui permet d‟inverser le sens de circulation dans la boucle. [18]

Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage
d'une capacité fixe (10, 20, 50 µL..). Cette boucle permet d'introduire l'échantillon sans
modifier la pression dans la colonne. [25]

26
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 16: Vanne à boucle d'échantillonnage

N.B !!! L‟injecteur et la colonne doivent être adaptés. [19]

1.5.3.3 Boucle D’injection :

Le fait de travailler en phase liquide (difficilement compressible) et à haute pression, ne
permet pas d'introduire l'échantillon en jouant sur la compressibilité du milieu comme avec
un septum dans le cas de la CPG. Ce problème technique a été résolu en allongeant la
longueur de circuit à l'aide d'une boucle d'injection.[22]

La vanne est placée juste avant la colonne. Cette pièce de précision qui doit résister à des
pressions pouvant dépasser 300 bars est raccordée à une boucle d‟injection de volume précis.
Ces boucles sont disponibles avec différents volumes et sont soit externes, soit intégrées dans
le corps de la vanne. [18]

Figure 17 : Vanne d‟injection pour HPLC et boucles assorties de différents volumes [19]

27
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Cette boucle est constituée d'un corps métallique cylindrique statique percé de 6 trous
disposés en hexagone régulier et d'une partie mobile portant à sa surface 3 arcs de cercle
creusés représentant chacun 1/6 de périmètre du même cercle.

Ces canaux en arcs de cercles permettent de relier deux à deux les 6 trous du stator.[22]

Figure 18: une boucle d‟injection d‟un HPLC

Les trous sont reliés :

-à la pompe

-à la boucle d'injection (entrée)

-à la connexion de remplissage

-à la sortie (poubelle)

-à la boucle d'injection (sortie)

-à la colonne

Selon la position de la partie mobile on observe 2 cas différents

Boucle 1er cas

La pompe est reliée à la colonne

La connexion de remplissage est reliée à l'entrée de la boucle

La sortie de la boucle est reliée à la poubelle

28
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Ceci est la position de chargement de la boucle.

2ème cas

La pompe est reliée à l'entrée de la boucle

La connexion de remplissage est reliée à la poubelle

La sortie de la boucle est reliée à la colonne.[22]

Ce système évite les brusques variations de pression dans l‟appareil et est d‟une grande
reproductibilité car il y a peu d‟irrégularité dans les injections étant donné que la quantité
introduite est obligatoirement celle du volume de la boucle. Les volumes injectés sont fixés
par la capacité de la boucle qui a des volumes variables allant du microlitre au millilitre. [19]

Dans ce cas la pompe est reliée à la boucle puis à la colonne. C'est la position d'injection.

Entre ces deux positions, on voit que la longueur de canalisation entre la pompe et la colonne
s'est agrandie de la longueur de la boucle et d'un arc de cercle.

L'injection se fait en deux temps : le chargement et l'injection proprement dite. Le chargement

de la boucle n'est optimal et reproductible que s'il a été effectué avec un volume d'au moins 5
fois celui de la boucle (Pour une boucle de 20 µL, le chargement doit être fait avec un volume
de 100µL minimum de solution).

1.5.4 La Colonne :
Les colonnes d HPLC sont généralement courtes et droites en acier inoxydable 316 capable
de résister aux fortes pressions. [19]

La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en acier inoxydable, dont la longueur
et le diamètre sont différents selon les modèles. [18]

Les colonnes dites « standard » ont un diamètre interne (I.D.) de 4,6 ou 5 mm et une
longueur entre 100 et 250 mm Des colonnes de plus faibles diamètres, baptisées narrow-bore
(I.D. 2-4 mm), micro bore (I.D. 1-2mm) et capillaires remplies (I.D. 0,1-1 mm) sont apparues

29
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
suite à l‟évolution des phases stationnaires mais surtout pour simplifier le couplage avec la
spectrométrie de masse. [18]

La plupart des colonnes ont une longueur de 10 à 25 cm et un diamètre de 4 à 5 mm [19]

Ce type decolonne offre souvent de 40000 à 60000 plateaux/m. [21]

Ces colonnes sont remplies de phase stationnaire, maintenue entre deux disques poreux
situés aux extrémités et dont la taille des particules varie de 5 à 10 µm. Ce type de colonne
offre souvent de à plateaux par mètre. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques
ml/min. [19]

Figure 19: COLONNE HPLC [19]

1.5.4.1 Pré-Colonne (Colonne De Garde) :

La colonne est souvent précédée d‟un filtre de porosité inférieure à 0,5 mm et d‟une pré-
colonne, dite « colonne de garde », courte (0,4 à 1 cm) et remplie de la même phase
stationnaire. Ces derniers, doivent être changés régulièrement (périodiquement) car ils
retiennent les impuretés et préviennent le colmatage de la colonne. Ils permettent ainsi
d‟allonger sa durée de vie et de préserver ses performances. [18]

30
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 20: Aspects extérieurs éclaté et assemblé d‟une colonne et pré-colonne pour HPLC
[18]

☛ Il existe des micro-colonnes à haute performance qui ont un diamètre intérieur de 1 à 4,6

mm et une longueur de 3 à 7,5 cm. Ces colonnes, remplies de particules de 2 à 5 µm, offrent
jusqu‟à 100000 plateaux/théorique et présentent les avantages de rapidité et d‟une
consommation minimale de solvant. [21]

Ces colonnes ont l‟avantage :

* de la rapidité de l‟analyse,

*de consommer moins de solvant (les solvants de haute pureté pour l HPLC sont très
coûteux),

*de conduire à une meilleure résolution de l‟analyse (par suite d‟une moindre diffusion),

* de permettre de faire du couplage HPLC/MS. [19]

1.5.4.2 Four A Colonne :

Au cours des mesures, la température ne doit pas varier plus de ± 1 °C. [26]

Une modification de la température de colonne en HPLC modifie en général le temps de

rétention et compromet la reproductibilité des résultats. En effet, la constante de rétention est
diminuée de 0,5% /°C lorsque le méthanol est utilisé comme solvant et d‟environ 0,2% /°C
avec l‟acétonitrile. Pour pallier à cet inconvénient des fours sont utilisés pour fixer la
température de la colonne et permettent à la fois d‟améliorer l‟efficacité de celle-ci, d‟assurer

31
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
la répétabilité des analyses ou encore d‟utiliser la température comme paramètre de
séparation (Flanagan,2007).[18]

Lorsque le four à colonne n‟est pas disponible, la colonne ne devra pas être placée dans des
endroits où elle sera sujette à de grandes variations de températures par exemple directement
exposée au soleil ou à proximité d‟une fenêtre ou d‟un climatiseur. [18]

1.5.5 Phase Stationnaire :

De nombreux types de phases stationnaires sont utilisés en HPLC, notamment :

- De la silice, de l‟alumine ou du graphite poreux, utilisé en chromatographie en polarité de

phase normale, où la séparation repose sur une adsorption différentielle et/ou une distribution
de masse [27] ;

- Des résines ou polymères à groupement acides ou basiques utilisés en chromatographie à

échange d‟ions, où la séparation repose sur la compétition entre les ions à séparer et ceux de
la phase mobile [27] ;

- De la silice ou des polymères poreux utilisés en chromatographie d‟exclusion où la

séparation repose sur les différences de volumes entre molécules, ce qui correspond à une
exclusion stérique [27] ;

- Divers supports chimiquement modifiés préparés à partir de polymères de silice utilisés en

HPLC en polarité de phase inversée, où la séparation repose :

Principalement sur le partage des molécules entre la phase mobile et la phase stationnaire
[27].

- Des phases stationnaires chimiquement modifiées spéciales, tels que des dérivés de la
cellulose ou de l‟amylose, des protéines ou des peptides, des cyclodextrines… etc. Pour la
séparation des énantiomères (chromatographie chirale) [27].

La surface du support (par exemple les groupes silanols de la silice) est mise en
présence de différents réactifs de la famille des silanes, avec lesquels elle réagit en formant

32
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
par liaison covalente, des dérivés silylés qui occupent un nombre variable de sites actifs de la
surface du support [28].

La recherche d‟une bonne résolution chromatographique et par conséquence d‟une efficacité

élevée, a conduit à la création de phases stationnaires de nature et de structure très variées
parmi lesquelles, le gel de silice garde une place prépondérante .Lors de la préparation de ce
gel par des procédés de polymérisation d‟un tétra alcoxysilane au sein d‟un liquide et sous
l‟effet d‟une hydrolyse catalysée, un certain nombre de groupements silanols (Si–OH)
résistent à la phase finale de déshydratation thermique et confèrent des propriétés catalytiques
acides à ce matériau très polaire. [18]

1.5.5.1 Procédé De Préparation Du Gel De Silice :

Pour diminuer la polarité du gel de silice, jugée excessive, on le rend essentiellement
hydrophobe en mettant à profit la réactivité des fonctions silanols libres pour fixer des
molécules organiques par des liaisons covalentes. Ces phases greffées, dont la faible polarité
peut être ajustée avec précision, sont à l‟origine de la chromatographie de partage à polarité
de phase inversée, utilisée dans quasiment toutes les séparations. [18]

Une fraction des groupements silanols demeure cependant intacte et peut être la cause
d‟interactions polaires gênantes ou au contraire souhaitée afin d‟élargir l‟analyse à des
composés peu à assez polaires. Les modifications de la surface du gel de silice conduisent à
deux types de phases :

1/ Phases monomériques :(10–15 μm d‟épaisseur) Obtenues en faisant réagir un

monochlorosilane en présence d‟une base sur les fonctions silanols de surface. On prépare
ainsi les phases classiques RP–8 ou C8 (groupement diméthyloctylsilane) et RP–18 ou C18
(groupement diméthyloctadécylsilane, ou ODS). [18]

2/ Phases polymériques : (≥ 25 μm d‟épaisseur) On utilise un di- ou trichlorosilane en

présence de vapeur d‟eau qui provoque une polymérisation en solution du réactif avant dépôt
et greffage sur la silice. On obtient ainsi une couche polymérique réticulée. L‟architecture
finale du revêtement est difficile à se représenter. [18]

33
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Les gels de silice précédents, comportant des greffons alkyles à 8 ou 18 atomes de carbone,
sont polyvalents et par conséquent très utilisés (65 % des applications), mais pour améliorer
la séparation de certaines classes de composés, il est fait appel à des phases stationnaires
spécifiques à polarités variées. Sur une âme de silice, sont fixés des ligands porteurs de
fonctions (groupements amino-propyle, cyanopropyle, benzyle) ou des greffons dipolaires
(zwitterions) pour conférer une polarité intermédiaire à la phase stationnaire. La séparation
des mélanges comportant à la fois des constituants polaires et non polaires, qui exigent des
phases mobiles riches en eau, s‟en trouve améliorée (Rouessac,2004). [18]

La nature de la phase greffée est un paramètre déterminant pour les propriétés de

séparation du système chromatographique [28].

Les phases greffées les plus couramment utilisées sont :

-Octyl = Si-(CH2)7-CH3 ………………………… ... C8

-Octadécyl = Si-(CH2)17-CH3 …………………………. C18

-Phényl = Si-(CH2) n-C6H5 ………………………… C6H5

-Cyanopropyl = Si-(CH2)3-CN …………………………. CN

-Aminopropyl = Si-(CH2)3-NH2 ………………………. NH2

Les colonnes en phase inversée à base de silice sont considérées comme stables pour les
phases mobiles de pH apparent compris entre 2 et 8 [28].

La silice utilisée pour les colonnes en phase inversée est une silice amorphe et poreuse,
elle est utilisée sous forme de granules ou de microparticules régulières poreuses préparées
par le procédé sol-gel. La réactivité de la silice est essentiellement gouvernée par la nature
des groupements présents à sa surface parmi lesquels : les groupements silanols (Si-OH) et
les groupements siloxanes [28].

34
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
 Les groupements silanols (Si-OH) :

Elles conditionnent la réactivité de la silice. Ils participent aux processus de rétention par
l'adsorption, site d'échange d'ion et par une influence de la solvatation sélective de la région

Interface : trois types de groupements silanols (silanols libres ou isolés, silanol vicinaux ou
ponts et silanolsgéminaux) [29] [28].

Les groupements silanols ont un caractère amphotère résumé par les deux équations ci-
dessous [28] :

Si -OH2 + Si-OH + H+ pKa = -2

Si-OHSi-O- + H+ pKa = 7

 Les groupements siloxanes

Ils sont générés par dihydroxylation à haute température (environ 1000C°) et cela se fait
par une condensation de deux groupements silanols voisins avec élimination d'eau.

Du fait de leur caractère hydrophobe et leur faible réactivité, ces groupements sont très
peu impliqués dans la chimie de surface en solution aqueuse [28].

En chromatographie analytique la taille des particules constituant les phases stationnaires

les plus souvent utilisées est comprise entre 3-10µm. Elles sont en acier inoxydable, et sont
de longueur et de diamètre intérieur variables [27].

La température de la phase mobile et de la colonne doit être maintenue constante pendant

toute la durée de l‟analyse. La plupart des séparations sont effectuées à température ambiante,
mais il est possible de chauffer les colonnes pour obtenir une efficacité supérieure [27].

Il est toutefois recommandé de ne pas dépasser 60°C, sous peine de dégradation de la

phase stationnaire ou d‟altération de la composition de la phase mobile [27].

35
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.5.6 Phases mobiles :
Les différentes parties de l‟appareillage en contact avec la phase mobile sont généralement
construites en acier inoxydable [type 316] qui présente l‟avantage de la tenue à la pression et
d‟une bonne résistance à la corrosion chimique. [19]

En raison des pressions élevées qui doivent être appliquées pour assurer des débits
raisonnables et de l‟utilisation de supports dont le diamètre particulaire est de l‟ordre de 2 à
10 µm, l‟appareillage requis pour cette méthode d‟analyse est ainsi nécessairement plus
sophistiqué et plus coûteux que celui utilisé pour d‟autres méthodes chromatographiques. [29]

Les canalisations de très faible diamètre interne (0,1 mm) qui assurent la circulation de la
phase mobile sont soit en acier inoxydable soit en polymère de type PEEK
(polyétherétherkétone) qui est un polymère plus économique que l‟acier, souple, coloré et qui
résiste aux solvants usuels à pH souvent corrosif, même pouvant résister aux solvants sous
des pressions élevées jusqu‟à 350 bars.[19]

Pour la chromatographie en phase normale, les solvants utilisés sont de faible polarité. Un
contrôle strict de la présence d‟eau dans la phase mobile est nécessaire pour obtenir des
résultats reproductibles [27].

La plupart des applications actuelles font appel à la chromatographie à polarité de phase

inversée où les phases stationnaires peu polaires imposent l‟utilisation de phases mobiles
polaires pour l‟élution. [18]

Pour l‟HPLC en phase inversée, on utilise des phases mobiles aqueuses avec ou sans
modifiants organiques. Les composants de la phase mobile sont généralement filtrés pour
éliminer les particules de taille supérieure à 0,45 µm. Les phases mobiles à plusieurs
composants sont préparées par mesure de volumes requis (à moins que les proportions ne
soient spécifiées en masse) pour chaque composant, puis par mélange des différents
composants [27]

Une autre méthode possible consiste à délivrer les solvants au moyen de pompes
individuelles commandées par des vannes à débit proportionnant [27].

36
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Les solvants sont normalement dégazés avant le pompage, par passage d‟un courant
d‟hélium, sonication ou traitement en ligne par des modules membranes/vide, pour éviter la
formation de bulles de gaz dans la cellule de détection [27].

Les solvants utilisés pour préparer la phase mobile sont normalement exempts d‟agents
stabilisants, et transparents à la longueur d‟onde de détection si on utilise un détecteur UV
haute pureté, non corrosive et de faible viscosité [07][27].

Les solvants et autres composants utilisés doivent être de qualité appropriée.

La sélectivité du solvant est basée sur le triangle de Snyder, qui guide le choix du solvant
ou des solvants à choisir ainsi que la phase stationnaire pour optimiser la séparation de
l‟analyte. Chaque apex du triangle représente une caractéristique d‟un solvant, soit accepteur
de proton, donneur de proton ou ayant un dipôle. Les solvants sont classés dans le triangle, de
façon à les catégoriser selon les interactions possibles du solvant avec l‟analyte [30].

Les gels de silice greffés sont dotés d‟une mauvaise mouillabilité, l‟eau ne doit pas être
utilisée seul au risque de provoquer un dégrafage des chaines. La phase mobile est par
conséquent, une phase polaire hydro-organique contenant de l‟eau et un modifieur organique
moins polaire qui ne doit pas, ou très peu, absorber dans l‟intervalle de longueurs d‟ondes
choisit pour l‟analyse. (Kintz,1998). [18]

Le méthanol et l‟acétonitrile sont les modifieurs les plus utilisés, d‟une part pour leur force
d‟élution supérieure à celle de l‟eau en phase inverse mais surtout parce qu‟ils forment avec
l‟eau un mélange de viscosité moyenne, ce qui évite l‟augmentation de la pression entête de
colonne. (Rouessac,2004). [18]

37
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 21:: Pouvoir d‟élution de certains solvants.

Le pH de la phase mobile est un facteur important qui conditionne la séparation des

composés et oriente la rétention en fonction de leur pKa. En phase inverse, les performances
de rétention sont abaissées pour les molécules ionisées, c‟est pourquoi un pH pour lequel la
molécule se trouve sous forme non-ionisée est souvent choisit. [18]

L‟ajustement du pH, s‟il y a lieu doit être exclusivement effectué sur le composant aqueux de
la phase mobile et non sur le mélange [31] [27]

Si des solutions tampons sont utilisées, il convient de rincer soigneusement le système

avec un mélange d‟eau et du modifiant organique de la phase mobile (5% V/V) une fois la
chromatographie terminée, afin d‟éviter la cristallisation des sels [30] [27]

La polarité de la phase conditionne aussi l‟ordre et le temps d‟élution. Avec un éluant

polaire, un composé polaire migre plus vite qu‟un composé apolaire. Dans ces conditions, les
composés polaires sont assez difficiles à séparer entre eux tandis que les composés apolaires
fortement retenus tardent à migrer. [18]

Dans le cas ou plusieurs composés de polarités différentes doivent être analyses

simultanément, il faut réaliser un gradient d‟élution en modifiant la polarité du solvant
encours d‟analyse pour obtenir la meilleure séparation possible dans un temps d‟analyse

38
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
raisonnable. En phase inverse, on diminue progressivement la concentration en eau (polaire)
au profit du modifiant choisi (moins polaire). [18]

Les phases mobiles peuvent contenir des additifs, comme par exemple un contre-ion dans
le cas d‟une chromatographie à appariement d‟ions, ou un sélecteur chiral dans le cas d‟une
chromatographie avec phase stationnaire achirale [30] [27]

1.5.7 Le détecteur :
En HPLC, il n‟existe pas de détecteurs universels aussi sensibles que ceux utilisés en CG.
Dès lors, le dispositif utilisé dépend de la nature de l‟échantillon.

Un Détecteur Consiste à mesurer l'absorbance absolue d'un soluté.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un intégrateur permet d'obtenir un tracé

appelé chromatogramme. Il dirige sur l‟intégrateur un signal constant appelé ligne de base en
présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé, il conduit dans le temps
à l'enregistrement d'un pic.

1.5.7.1 Principes de détection et classification des détecteurs :

Les détecteurs sont classés aussi sur leurs bases de fonctionnement, en deux :

• Le premier est basé sur les propriétés générales (solvant + soluté); ex: indice de réfraction,
conductivité, constante diélectrique,...

• Le second est basé sur les propriétés des solutés ; ex : UV, polarographie, radioactivité. [16]

1.5.7.1.1 Détecteurs par absorption dans l’ultra-violet et le visible :

Ces détecteurs sont les plus couramment utilisés en HPLC car ils sont peu sensibles aux
fluctuations de débit et de température et un grand nombre de solvants ont une bonne
transparence dans l‟UV.

Consiste à mesurer l'énergie de fluorescence d'un soluté excité par une radiation ultraviolette.

Les photomètres utilisent souvent les raies à 254 et 280 nm du mercure parce que de
nombreux groupements fonctionnels organiques absorbent dans cette région . Les

39
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
détecteurs les plus utilisés sont basés sur l‟absorption du rayonnement
UV-Visible. [21]

Figure 22: cellule d‟un détecteur UV-visible (19)

On mesure en permanence l‟absorbance de la phase mobile en sortie de la colonne à une ou

plusieurs longueurs d‟onde. Le signal donné par ces détecteurs est proportionnel à la
concentration du soluté dans l‟effluent de la colonne chromatographique. En effet,
l‟absorbance A est liée à la concentration.

La limite de détection dépend : du coefficient d‟absorption du soluté, de sa concentration dans

l‟effluent lors de la traversée dans la cellule de mesure c‟est-à dire de la dilution apportée par
la colonne, du bruit de fond du détecteur.

L‟absorbance A est liée à la concentration par la relation de Beer Lambert : A = ε λ l C

Avec : ε λ : coefficient d‟absorption molaire, l : trajet optique C : concentration du soluté

dans l‟effluent. (2)

1.5.7.1.2 Détecteurs spectrofluorimetrique :

Ce mode de détection a une grande sélectivité et une grande sensibilité. Il exploite les
propriétés qu‟ont certaines molécules en solution d‟absorber des radiations dans l‟ultraviolet
(passage à un état excité) et de réémettre une fraction de la lumière absorbée donc à une

40
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
longueur d‟onde supérieure, l‟autre fraction étant convertie en énergie interne (conversion
interne). (19)

1.5.7.1.3 Détecteurs par conductimétrie :

Ce détecteur est limité à la détection des espèces ionisées et est surtout utilisé en
chromatographie ionique. Son principe repose sur la mesure, en sortie de colonne, de la
conductance de la phase mobile riche en composé ionique. La difficulté dans cette analyse est
de reconnaître dans le signal global la part de conduction due aux ions ou substances ioniques
faiblement chargées appartenant à l‟échantillon de celle de l‟électrolyte contenu dans la phase
mobile. (19)

1.5.7.1.4 Détecteurs par spectrométrie de masse :

Le couplage HPLC/MS est en plein essor et devient un outil puissant d‟identification et de
détection.

Cependant deux caractéristiques de HPLC rendent le couplage difficile :

1) les méthodes d‟ionisation de la spectrophotométrie de masse nécessitent que l‟échantillon

soit vaporisé sous un vide poussé d‟où une décomposition possible du produit pendant ce
processus. En fait l‟ionisation chimique du soluté par les molécules de solvant protège celui-
ci de toute dégradation. Des composés de masse moléculaire aussi élevée que 1500 ont déjà
été détectés.

2) la quantité de phase mobile utilisée est beaucoup plus grande que celle pouvant être
raisonnablement introduite dans la chambre du spectromètre. (19)

1.5.7.1.5 Détecteurs par réfractométrie différentielle :

Le principe repose sur les lois de Fresnel de transmission de la lumière dans les milieux
transparents dont l‟indice de réfraction est n. Schématiquement, un faisceau lumineux (mono
ou polychromatique) passe à travers une cellule comportant deux compartiments dont l‟un est
rempli avec l‟éluant seul et l‟autre avec la phase mobile en sortie de colonne. La différence de
l‟indice entre les deux liquides, qui apparaît lorsqu‟un composé est mélangé à l éluant se
traduit par un déplacement angulaire du rayon réfracté.

41
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
La limite de détection de la réfractométrie n‟est pas très bonne. Elle dépend à la foi de la
nature du soluté et de celle de la phase éluant. (19)

1.5.7.1.6 Spectroscopie infra-rouge :

Permet de caractériser la masse des produits à l'état de traces et permet d'obtenir des
informations poussées sur la structure. (19)

1.5.7.1.7 Détecteur a barrette de diode :

Les spectrophotomètres à barrette de diodes permettant l‟enregistrement tridimensionnel
absorbance-temps-longueur d ondes. De ce fait, on dispose à tout moment du spectre UV-
Visible de la phase mobile éluée, ce qui est une aide à l‟identification de solutés inconnus par
comparaison des spectres UV des solutés avec ceux des composés purs stockés en
bibliothèque. Ce type de détecteur permet de sélectionner la longueur d onde optimale de
détection pour chaque soluté. (19)

1.5.7.2 Facteurs influençant la forme du spectre UV :

A/ Le pH de la phase mobile

Le spectre des composes acides ou basiques peut être complètement diffèrent à l‟état
protonique ou non si le groupement acide ou basique est une partie du chromophore. Dans ce
cas, une modification même faible du pH peut changer la forme du spectre si le pKa de la
molécule est proche du pH du tampon. [18]

B/ La polarité de la phase mobile

Le spectre UV peut aussi varier selon la polarité du solvant et sa capacité à former ou non
des liaisons hydrogènes. En général une déviation vers les longueurs d‟ondes plus grande et
un élargissement des bandes d‟absorption est observé avec l‟augmentation de la polarité du
solvant. [18]

En mode inverse, l‟eau étant le solvant le plus polaire dans la phase mobile il domine dans les
interactions solvant-soluté. Ainsi le type et la concentration du modifieur organique
n‟influence pas beaucoup la forme des spectres même en mode gradient d‟élution. [18]

42
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.5.8 Système informatisée (logiciel et chromatogramme) :
Les détecteurs sont munis de logiciels appropriés qui permettent d‟acquérir simultanément le
chromatogramme, le spectre UV spécifique à chaque molécule éluée et parfois le spectro-
chromatogramme en trois dimension (temps, absorbance, longueur d‟onde λ). [18]

Le chromatogramme change d‟aspect selon la longueur d‟onde de détection qui peut être
modifiée au cours de l‟analyse. On choisit en générale la λ max du composé analysé ou celle
qui permet d‟avoir le moins d‟interférences due à la matrice ou à la phase mobile. [18]

La détection est basée sur la loi de Beer-Lambert (A = ε. c) : l‟absorbance A de la phase

mobile est mesurée en continue en sortie de colonne, à une longueur d‟onde pour laquelle elle
n‟absorbe pas. Le détecteur donne ainsi pour chaque composé élué une réponse
proportionnelle à sa concentration instantanée. L‟intensité de l‟absorption dépend aussi du
coefficient d‟absorption molaire ε, ce qui rend impossible, par la simple observation d‟un
chromatogramme, de se faire une idée de la concentration des espèces repérées, même de
manière très approximative (Rouessac,2004). [18]

1.6 Pic chromatographique :

Le résultat observable d‟une analyse HPLC se présente sous la forme d‟un «
chromatogramme »

Figure 23: Principaux paramètres d'un chromatogramme [32]

Le chromatogramme est une représentation, graphique ou autre, de la réponse d‟un détecteur,

de la concentration d‟un effluent ou d‟une autre grandeur utilisée comme mesure de la
concentration d‟un effluent en fonction du temps, du volume ou de la distance. Idéalement,

43
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Un chromatogramme se présente comme une séquence de pics gaussiens au-dessus d‟une
ligne de base [27].

1.6.1 . Grandeurs de rétention :

Plusieurs grandeurs nous renseignent sur la conformité du système chromatographique :

Temps de rétention tR :

En chromatographie d‟élution, les mesures de rétention peuvent être exprimées en termes de

temps de rétention tR directement défini par la position du maximum du pic dans le
chromatogramme [27].

Ce temps de rétention peut être déduit par le calcul de volume de rétention VR :

* tR = temps de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection et la

perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant au composant considéré

* v= débit de la phase mobile [27].

Figure 24: Chromatogramme illustrant le tR, t'R, tM [32]

Le temps de rétention représente le temps que met le soluté à sortir de la colonne, c‟est- à-dire
le temps écoulé entre l‟injection et le maximum du pic du composé élué, c‟est la principale
grandeur de rétention [28] [33].

Il varie en fonction du débit, de la température d'élution, de la composition de la phase mobile

et du vieillissement de la colonne [33].

44
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Le volume de rétention de chaque soluté représente le volume de phase mobile nécessaire
pour le faire migrer d‟une extrémité à l‟autre de la colonne [27].

Coefficient de distribution massique Dm

Le coefficient de distribution massique ou facteur de capacité k‟ ou facteur de rétention k est

défini comme suit :

* KC = coefficient de distribution à l‟équilibre (ou constante de distribution),

* VS = volume de la phase stationnaire,

* VM = volume de la phase mobile [27].

Le coefficient de distribution massique d‟un composant peut être déterminé à partir du

chromatogramme, à l‟aide de l‟expression :

* tR = temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant au composant
considéré,

* tM= t0 = temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant
non retenu (« hold-up time ») [27].

* tM= t0 = temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant
non retenu (« hold-up time ») [27].

45
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Le temps mort représente le temps mis par la phase mobile pour aller de l‟injecteur au
détecteur.

Le coefficient de distribution massique Dm est un paramètre expérimental important qui

traduit l‟affinité d‟un composé pour la phase stationnaire. Il rend compte de la faculté plus ou
moins grande de la colonne à retenir un composé. Ce paramètre ne dépend pas du débit de la
phase mobile, ni des dimensions de la colonne mais affecté par toutes les autres conditions
chromatographiques [34] [15]

Coefficient de partage :

En chromatographie d‟exclusion, les caractéristiques d‟élution d‟un composant dans une

colonne particulière peuvent être décrites par le coefficient de partage Ko, calculé à l‟aide de
l‟expression :

* tR= temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant au composant
considéré,

* t0 = tM = temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un
composant non retenu (« hold-up time ») [27],

* tt= temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection
et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant ayant accès
à tous les pores de la phase stationnaire [27].

46
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.6.2 Données chromatographiques :
A/ Largeur d’un pic chromatographique :

Les pics chromatographiques ont une allure gaussienne. Un pic peut être défini par sa surface
A (calculée en assimilant le pic à un triangle), par sa hauteur h ainsi que sa largeur, comme
illustré par la figure ci-dessous [27] [10].

La largeur d‟une courbe de Gauss est définie par :

* w = ω = largeur à la base du pic

* wh = δ = largeur à mi-hauteur

* ζ = écart type = ½ largeur du pic à la hauteur des points d‟inflexion, à 60,6% de la hauteur
[10].

* ζ = écart type = ½ largeur du pic à la hauteur des points d‟inflexion, à 60,6% de la hauteur
[10].

Figure 25: : Chromatogramme et largeurs du pic chromatographique [10].

B/ Performance d’une colonne et nombre apparent de plateaux théoriques :

La performance d‟une colonne (efficacité apparente) peut être calculée, à partir de données
obtenues dans des conditions isothermes, isocratique ou isodenses, selon la technique utilisée,

47
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
en termes de nombre apparent de plateaux théoriques N, à l‟aide de l‟expression suivante, où
les valeurs de tR et wh doivent être exprimées dans la même unité (de temps, volume ou
distance) [27] :

* tR = temps (ou volume) de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point
d‟injection et la perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant au composant
considéré,

* wh= largeur du pic à mi-hauteur [27].

Le nombre apparent de plateaux théoriques dépend du composant considéré, ainsi que de la

colonne et du temps de rétention [35] [27].

L‟efficacité d‟une colonne chromatographique est mesurée pour chaque composé, par le
nombre apparent de plateaux théoriques N de la colonne [36].

Cette théorie est née à la recherche d‟un modèle permettant de décrire le fonctionnement
d‟une colonne chromatographique comme celui d‟une colonne à distiller [31] [27][07][29].

Au lieu de considérer le déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci
progresse par sauts successifs et donc que chaque soluté se déplace progressivement dans la
colonne en une suite d‟étapes distinctes. A chacune de ces étapes, la concentration du soluté
dans la phase mobile est en équilibre avec la concentration du soluté dans la phase
stationnaire. On peut alors imaginer la colonne de chromatographie comme une série de
compartiments distincts dans lesquels s‟établit l‟équilibre de répartition du soluté. Ces
compartiments imaginaires sont ce qu‟on appelle les « plateaux théoriques ». A chaque
nouvel équilibre, le soluté a progressé d‟un petit disque supplémentaire dans la colonne[32].

La chromatographie est décrite comme une suite de temps d‟équilibration suivis de

glissements de la phase mobile d‟un plateau par rapport à la phase stationnaire [32].

48
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 26: Illustration du modèle de plateaux théoriques [32].

La colonne de longueur L est donc découpée en N petits disques fictifs ou « plateaux

théoriques » de même hauteur, dans chacun d‟eux s‟établit l‟équilibre de répartition du soluté
entre la phase stationnaire et la phase mobile, d‟où l‟expression :

*N = Nombre apparent de plateaux théoriques.

*L = Longueur de la colonne (cm).

*HEPT = Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (cm)[33].

1.6.3 Paramètres de séparation :

A/ Résolution Rs :

La résolution correspond à une grandeur numérique caractérisant l'aptitude du système

chromatographique (colonne, solutés, solvants) à séparer deux composés d'un mélange. Ce
paramètre nous renseigne sur la qualité de la séparation [37] [29].

La résolution Rs entre deux pics peut être calculée à l‟aide de l‟expression suivante :

49
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 27: Chromatogramme et résolution [38].

*TR1 et tR2 = temps de rétention ou distances sur la ligne de base entre le point d‟injection et
les perpendiculaires abaissées des maximums de deux pics adjacents,

*Wh1 et wh2 = largeur des pics à mi-hauteur [27].

Une résolution supérieure à 1,5 correspond à une séparation jusqu‟à la ligne de base.

Figure 28: Exemples de séparation chromatographique de deux composés

Les trois chromatogrammes ci-dessous illustrent des exemples de séparation

chromatographique de deux composés :

Les trois chromatogrammes ci-dessous illustrent des exemples de séparation

chromatographique de deux composés :

(a) Les pics se recouvrent.

(b) La distance séparant les sommets des pics est plus grande mais les largeurs à la base sont
les mêmes qu‟en (a).

50
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
(c) La distance séparant les sommets des pics est égale à celle trouvée en (a) mais les largeurs
à la base sont plus petites qu‟en (b).

Comme la montre la figure ci-dessus, la séparation idéale est réalisée en (c).

B/ Rétention relative :

La rétention relative « r » est une estimation calculée à l‟aide de l‟expression :

tR2 = temps de rétention du pic considéré,

tR1 = temps de rétention du pic de référence (généralement celui de la substance à examiner),

tM= temps de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection et la
perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant non retenu («
hold-up time »)[39].

tM= temps de rétention ou distance sur la ligne de base entre le point d‟injection et la
perpendiculaire abaissée du maximum du pic correspondant à un composant non retenu («
hold-up time »)[39].

La rétention relative non ajustée rGest calculée à l‟aide de l‟expression :

Sauf indication contraire, les valeurs de rétention relative indiquées dans les monographies
correspondent à la rétention relative non ajustée [39].

51
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
C/ Sélectivité α :

Le facteur de sélectivité α est définit par le rapport de coefficient de distribution de l'espèce la

plus retenue, au coefficient de distribution de l'espèce la plus rapidement élué, il est calculé à
partir de l'équation suivante :

On a

Donc:

Donc, elle représente le rapport entre deux temps de rétention réduit [41]:

La sélectivité α permet de préciser les positions relatives de deux pics adjacents 1 et 2 sur un
chromatogramme [34] [29].

Figure 29: : Paramètres pour calculer la sélectivité

1.7 La perte de charge dans une colonne :

La perte de charge est une caractéristique de la colonne. Elle exprime sa résistance à
l'écoulement de la phase mobile. Elle est appelée aussi pression de la colonne [34].
La perte de charge Δp dans une colonne est donnée par la loi de DARCY :

52
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

p=L u / Bo (16)

ΔP: Perte de charge en pascale (Pa).1 Pa = 1.10-5 bar.

η: Viscosité de la phase mobile en Pa.s.
L: Longueur de la colonne (m).
U: Vitesse linéaire de la phase mobile (m.s.-1).
Bo: Perméabilité spécifique (m2).[34]
La perméabilité spécifique d'une colonne remplie est:

Bo= d2p/
[34]
d p: Diamètre des particules de remplissage [34].
Φ: Facteur de résistance à l‟écoulement

La perte de charge montre que, sous certaines conditions, le débit peut être augmenté sans
changement de la pression de travail si la viscosité diminue, ce qui peut être obtenu par
élévation de la température. Une plus grande diminution du temps d‟analyse peut être obtenue
à la suite de la réduction du facteur de rétention due à l‟effet de l‟augmentation de la
température, phénomène qui est largement déterminé par l‟enthalpie d‟interaction du soluté
avec la phase stationnaire. [42]

1.8 Le comportement d'un pic chromatographique :

Les pics obtenus dans les différentes conditions d‟analyse présentent une forme gaussienne.
La vérification d‟une bonne symétrie de pic a été effectuée : cela signifie que les pics
présentent une symétrie entre 0,8 et 1,4. En effet, pour une valeur inférieure à 0,8 cela signifie
qu‟une déformation du pic est présente à l‟avant du pic (« fronting ») et pour une valeur
supérieure à 1,4
Une déformation est présente en fin de pic (« tailing »). [43]

53
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Dans les conditions idéales, un pic chromatographique doit avoir une forme gaussienne et
présente une symétrie parfaite, mais en pratique plusieurs pics n'ont pas une meilleure
symétrie, en plus un pic chromatographique peut présentes soit une trainé ou un fronting[44].

Le phénomène d'adsorption et les bandes élargies de pré-colonne, provoquent une trainé de

pic, tandis que la surcharge de la colonne ou une réaction chimique de l'analyte pendant
l'élution entrainent un fronting du pic [07].

Figure 30: : pics chromatographiques [45]

1.8.1 Facteur de symétrie AS :

Le facteur de symétrie As d'un pic est calculé à l'aide de l'équation suivante :
As = W0.05/2d [27]
W0.05 : Largeur du pic au vingtième de sa hauteur.

54
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
d: Distance entre la perpendiculaire abaissée du maximum du pic et le bord d'entré du pic au
vingtième de sa hauteur [27].
En HPLC, un pic idéal tend vers une courbe d‟aspect gaussien. Il est possible de calculer la
symétrie du pic par l‟intermédiaire du facteur AS, qui est le rapport entre la largeur du pic au
1/20 de sa hauteur et la distance entre la perpendiculaire abaissée du sommet du pic et le bord
d‟entrée au 1/20 de sa hauteur [46].
Les valeurs idéales de AS sont comprises entre 0,8 et 1,3. Le pic est alors symétrique. Si le
pic présente une trainée d‟entrée, AS sera inférieur à 1, s‟il présente une queue, AS sera
supérieur à 1,5
[47].

Figure 31: : Exemple d'une asymétrie de pic chromatographique.

Avec :(a) représente une trainé de pic,(b)représente un [48]

1.8.2 Facteur d'asymétrie (ou facteur de trainé tf) :

Selon l'United States Pharmacopiea (USP), le facteur de trainé est calculé à l'aide de
l'équation suivante: Tf= a+b/ 2a

55
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
a : Distance entre la perpendiculaire abaissée du maximum du pic et le bord d'entré du pic
(mesurée à 5% de la hauteur du pic).
b : distance entre la perpendiculaire abaissée du maximum du pic et le bord de sortie du pic
(mesurée à 5%de la hauteur du pic) [07.].

Dans le cas d‟une forte asymétrie, il est préférable d‟utiliser la relation empirique de Foley et
Dorsey. [49]

1.9 Test de conformité de système (TCS) :

Le test de conformité du système constitue l'une des parties les plus importantes dans
l'analyse chromatographique dont l'objet de ce test est de s'assurer de la performance du
système utilisé pour l'analyse et de montré que le système de mesurer est satisfaisant au
moment de l‟analyse [27]

Lors d‟optimisation d‟une méthode HPLC les différents éléments de l‟appareillage doivent
être qualifiés afin d‟atteindre la performance requise pour la réalisation des analyses
considérées.
Les essais de conformité du système font partie intégrante de la méthode. Ils visent à vérifier
les performances du système chromatographique. Les paramètres généralement utilisés pour
évaluer les performances de la colonne sont (ANONYME 11, 2011).

L‟efficacité apparente ;
Le facteur de rétention (coefficient de distribution massique) ;
La résolution ;
La rétention relative ;
Le facteur de symétrie [50]

Les critères de conformité sont ceux de 2018 de la FDA.

1.9.1 Définition du test de conformité du système (TCS) :

Un test de ce type est généralement effectué pour vérifier la séparation de deux substances
ayant un temps de migration voisin, la substance proprement dite et une substance proche

56
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
(couple critique). Il faut démontrer que la séparation de ces deux substances constitue une
garantie de l'adéquation du système chromatographique. Ce critère de conformité est essentiel
dans le cas des essais des substances apparentées. [51]
Conformément à l'USP, les tests de conformité du système (en anglais, Système Suitability
tests) font partie intégrante des méthodes chromatographiques gazeux et liquides. Ils visent à
vérifier la performance du système chromatographique, par la vérification de quelques
paramètres tels que la résolution et la reproductibilité de ce système [52] [34] [27].
La conformité du système renseigne sur l‟aptitude du system a effectuer l‟analyse suivant des
critères préétablis. Elle sera démontrée en analysant 06 fois la solution standard.
Les paramètres à évaluer sont :
Ecart type relatif du signal pour les 06 injections de la solution standard (Relatif standard
déviation : RSD), moyenne et écart type ;
Le nombre de plateaux théoriques ;
Facteur de symétrie ;
La résolution. [50]
Normes:

-Le %RSD des aires du pic de Principe actif pour les 06 injections de la solution standard

Doit être ≤ 2,0 .%

-Le % RSD des aires du pic de conservateur pour les 06 injections de la solution standard

Doit être ≤ 2,0 .%

-Le nombre de plateaux théoriques doit être supérieur ou égal à 50 % de celle trouvées durant

la validation analytique

-le facteur de symétrie doit être compris entre 0,8 et 1,5. [53 ]

57
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.9.2 Période d'application du test :
Le système doit satisfaire aux critères de conformité pendant toute la procédure
chromatographique. Il revient à l'analyste de définir, en fonction de facteurs tels que la
fréquence d'utilisation de la procédure et son expérience du système chromatographique, un
programme de contrôle approprié pour assurer le suivi de la conformité.
Selon les derniers directifs de l'USP et L‟ICH, le TCS doit être effectué avant et pendant tous
les essais réglementés [07] [27].
Cependant le plus souvent, le test de conformité du système (TCS) est fait au moment de
lancement de l'analyse.

1.9.3 Les paramètres à vérifier pour l'évaluation d'un système chromatographique :

Le test de conformité du système (TCS) est effectué en injectant jusqu'à six injections de la
même Vial du standard. Il permet d'évaluer la performance et de juger sur la capacité d'un
système chromatographique à séparer les constituants d'un composé par l'utilisation des
paramètres regroupés dans le tableau ci-dessous, dont les normes soit fixées dans la procédure
interne du laboratoire ou dans les référentiels tels que United States Pharmacopiea (USP) et la
Pharmacopée européenne (Ph.Eur)[ 07] [27].
Tableau 2: Les paramètres du test de conformité du système.

Paramètres Description
Résolution Rs Mesure du degré de séparation des pics au
niveau du chromatogramme
Répétabilité Sr (ou RSD) Mesure de la reproductibilité du système
durant l'analyse chromatographique.
Facteur de capacité K' Mesure du degré de rétention de l'analyte.
Nombre de plateaux théoriques N Mesure l'efficacité de la séparation.
Facteur de symétrie As(ou Tf) Mesure de la symétrie d'un pic.

Les limites de ces paramètres sont mentionnées sur le tableau suivant :

58
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Tableau 3: Limites de paramètres de TCS selon les renseignements de l'USP et FDA [54] [07]
[55] ˃

Paramètres Résolution% Répétabilité Facteur de Nombre de Facteur de

(Rs) (Sr ou RSD) capacité plateaux symétrie As
théoriques (ou tffacteur
de trainé)
Limites ˃2,0 ≤ 1.0 pour 5 ˃2.0 ˃2000 ≤2,0 selon
injections USP
répétées ˃2,0 0,8≤ As≥ 1,5
Selon l'EP

La répétabilité est exprimée en pourcentage par l'écart type relatif Sr (selon l'USP il est
désigné par RSD, relative standard déviation), estimé à partir des résultats d'une série d'au
moins 3 mesures consécutives réalisées par injection d'une solution témoin, il est calculé à
l'aide de l'équation suivante : [27]

Sr(%)=100/ȳ *√Σ (yi-ȳ) 2] /n-1

yi: Valeurs individuelles (surfaces ou hauteurs de pic ou rapport de surface pour méthode
d'étalon).
ȳ: Moyenne des valeurs individuelles.
n: Nombre des valeurs individuelles

Si au moins l'un des paramètres du système est non conforme à la norme fixée dans la
procédure analytique, il convient de prendre les mesures suivantes :
1) Arrêter immédiatement de la séquence à réaliser.
2) Procéder à un diagnostic convenable pour résoudre le problème.
3) Faire les ajustements requis.
4) Réaliser un autre test de la conformité du système (TCS) [07.].

59
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1.10 Domaines d'application de la Chromatographie liquide haute
performance (HPLC) :
Les domaines d‟application de l‟HPLC sont extrêmement nombreux et vastes .Elle est utilisée
comme méthode d‟analyse qualitative et quantitative aussi bien dans les services de recherche
et développement que dans le domaine du contrôle [56].Son champ d'activité couvre les
organismes d'État et les industries de la chimie, biochimie, pharmacie et parachimie
(agrochimie, cosmétiques, parfums, caoutchoucs, polymères, matériaux composites,
fermentations) et même la médecine (humaine et vétérinaire), la génétique, la toxicologie, la
pharmacognosie, l'environnement, le droit et la justice (police scientifique, douanes,
répression des fraudes) [37] [03] [56].
En raison de sa polyvalence et du vaste domaine de ses applications, la chromatographie
liquide haute performance (CLHP ou HPLC) est actuellement la plus utilisée de toutes les
techniques de séparation.
-Le champ d‟application de ce type de chromatographie recouvre une grande partie du
domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel s‟ajoute l‟analyse des composés
thermosensibles des composés très polaires ainsi que des composés de masses molaires
élevées.[50]

Citons plus particulièrement trois domaines dans lesquels l‟utilisation de l‟HPLC reste
incontestable :
- Contrôle de la pureté optique des molécules thérapeutiques.
- Analyse des résidus et des traces dans le domaine environnemental.
- Suivi des concentrations des composés cytotoxiques (chimiothérapie anticancéreuse) [03].
L‟HPLC permet l‟analyse, le dosage et l‟étude de la stabilité soit de substances
thermiquement instables, puisque l‟opération s‟effectue à température ambiante, soit de
substances peu volatiles de masse moléculaire pouvant atteindre 2 000 000, soit encore de
substances ionisées [56]. C‟est donc, une méthode « douce » avec les molécules. La grande
importance de l‟HPLC provient de sa vitesse d'exécution, de son grand pouvoir de résolution
et de son aptitude à analyser de manière qualitative et quantitative de faibles quantités
d'échantillon [08] :

60
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
L‟analyse qualitative consiste à identifier les substances à analyser par leur temps de
rétention, lequel pour des conditions données (solvant, débit, colonne, etc…) est
caractéristique du composé [Chromatographie en phase liquide, Saint Etienne Ecole des
mines.].
L‟analyse quantitative consiste à déterminer la quantité de chaque composé du mélange qui
pour des conditions données est proportionnelle à la surface du pic correspondant [03].

Temps de rétention : caractéristique du

composé

Figure32 Figure 32: : Illustration de l‟aspect qualitatif et quantitatif de l‟HPLC [03].

Les applications sont innombrables. La méthode permet de séparer des composés de masse
molaires variables (de 100 à 2000), de natures chimiques différentes et même les isomères.
La HPLC est un très bon complément de la GC pour :
- les substances peu volatiles : molécules de masse molaire > 300.

61
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
- les substances thermolabiles comme les médicaments issus des biotechnologies ou
les composés d‟origine biologique ;
-les substances ionisées.

En effet la HPLC n‟est pas limitée par la volatilité de l'échantillon ni par sa stabilité
thermique. De plus, la préparation de l'échantillon avant son injection est souvent plus simple
qu‟en phase gazeuse.
LA HPLC est complémentaire de la chromatographie sur couche mince CCM.
Elle couvre tous les domaines d'applications. Citons dans les domaines :
 De l’agroalimentaire :
- La détermination de la teneur en acide carboxyliques (acide lactique, acétique,
tartrique, succinique et citrique).
 De la pharmacie :
-la recherche d'impureté dans les matières premières ;
-Analyse quantitative et identification de principe actif dans les préparations
pharmaceutiques.
A titre d'exemple, rappelant :
Le protocole de la Pharmacopée Européenne pour l'analyse de la composition du
distéarate de glycol par perméation de gel avec une colonne de 0.6 de diamètre 7 mm
remplie avec du styrènedivinylbenzene (5 µm) et du tetrahydrofuranne comme phase
mobile. La teneur en mono, di et très acylglycérols doit être respectivement de l'ordre
de 8 à 22 %, 40 à 60 %, et 25 à 35 %.
-L‟analyse d‟un mélange de catécholamines avec et sans paires d‟ions
-L‟analyse de dextrans par perméation surgel.
-Les études de stabilité des matières premières et des spécialités pharmaceutiques.
-les études pharmacocinétique et métabolique de médicaments ;
-Les études de suivi thérapeutiques : analyse de médicaments à marge thérapeutique
étroite dans les milieux biologiques (plasma) pour ajuster leur posologie.
à titre d'exemple :
Leclonazépam, l‟amphotéricine B, l‟itroconazole, la chloroquine, la ranitidine et le
clobazam avec un détecteur spectrophotométrique UV/visible,

62
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
. La lévodopa avec un détecteur électrochimique.
 Biopharmaceutique ou biologique
Analyse de masses molaires de polypeptides, protéines, nucléotides analyse
protéomique (caractérisation des protéines) [37]

1.11 Avantages et limites :

Le tableau 1.1 met en évidence les avantages et les limites de la HPLC. HPLC est une
technique de séparation de premier ordre capable d'analyser à plusieurs composants des
échantillons réels et des mélanges complexes. Peu de techniques peuvent égaler sa
polyvalence et sa précision de <0,5% d'écart type relatif (RSD). HPLC est hautement
automatisée, utilisant des échantillonneurs automatiques et des systèmes de données
sophistiqués pour une analyse sans surveillance et la génération de rapports. Une multitude de
détecte-étendent les limites de détection aux niveaux de nanogramme, de picogramme et
même de femtogramme. En tant que technique de préparation, il permet une récupération
quantitative de nombreux composants labiles en quantités de milligramme à kilogramme.
Plus important encore, la HPLC est susceptible de 60% à 80% de tous les composés existants,
contre environ 15% pour GC. 3,4 HPLC souffre de plusieurs inconvénients bien connus ou de
limitations perçues. Premièrement, il n'y a pas de détecteur universel, comme l'équivalence du
détecteur à ionisation de flamme en GC, donc la détection est plus problématique si l'analyte
n'absorbe pas les foins UV ou ne peut pas être facilement ionisé pour la détection par
spectrométrie de masse. Deuxièmement, l'efficacité de séparation est sensiblement inférieure
à celle de la GC capillaire, ainsi, l'analyse des mélanges complexes est plus difficile. Enfin, la
HPLC a de nombreux paramètres de fonctionnement et est plus difficile pour un novice.
Comme montré dans les chapitres suivants, ces limitations ont été largement minimisées
grâce au développement des instruments et des colonnes

63
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Tableau 4: Avantages et limites de la HPLC

Avantages
• Analyse quantitative rapide et précise
• Fonctionnement automatisé
• Détection haute sensibilité
• Récupération d'échantillons quantitative
• Adapté à divers échantillons
Limitations
• Pas de détecteur universel
• Moins d'efficacité de séparation que GC capillaire
• Plus difficile pour les novices

64
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Chapitre Ⅱ: La
qualification

65
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
2 Chapitre Ⅱ: La qualification

2.1 Concept et définitions

La qualification des équipements de laboratoires est l‟un des nombreux éléments
permettant d‟être en conformité avec les réglementations dans le but ultime d‟offrir aux
patients des produits innovants, sûrs et efficaces.
La qualification des équipements de laboratoires et systèmes informatisés date de
2001 avec la naissance de l‟Annexe 15. [61]

2.1.1 Qualification :
La qualification est définie par les BPF comme étant « l‟action de prouver et de documenter
qu'un équipement ou ses systèmes auxiliaires sont installés convenablement, travaillent
correctement et conduisent réellement aux résultats attendus [61].
La qualification est constituée d‟une succession de 4 étapes :
 Avant l'achat
 Qualification de la conception (QC)
 Après l'achat
 Qualification à l'installation (QI)
 Qualification opérationnelle (QO)
 Qualification des performances (QP)

- Qualification de Conception (QC) : étape qui documente toute la phase de conception avant
la décision d‟achat d‟un nouvel équipement et qui démontre la conformité de la conception
par rapport aux bonnes pratiques. La QC commence dès l‟étape de définition des besoins
utilisateurs et s‟étend jusqu‟au suivi du fournisseur lors de la réalisation de la qualification de
l‟équipement. .[60]
Elle couvre toutes les procédures qui se déroulent avant l‟installation, elle est pratiquement
toujours réalisée chez le vendeur ou le fabriquant, le rôle de l‟utilisateur est :
• D‟identifier les besoins de laboratoire.
• Etablir en fonction des usages prévus, des spécifications opérationnelles et fonctionnelles

66
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
• Etablir le budget nécessaire à l‟acquisition et à la maintenance.
• Considérer que l‟utilisation est facile. [78]

- Qualification d’Installation (QI) : « vérification documentée que les installations, systèmes et

équipements, tels qu'ils ont été installés ou modifiés, sont conformes à la conception
approuvée et aux recommandations du fabricant » [61]
. La QI teste la partie physique de l‟équipement.
Elle couvre les procédures qui se déroulent à l‟installation de l‟appareil dans son
environnement, durant cette phase, il doit vérifier que l‟appareillage :
 Est accompagné de la documentation requise.
 Est conforme à la commande et livré sans dommage physique
 Est installé dans un environnement qui convient à son utilisation
 Le logiciel et les composants du système communiquent entre eux de façon
satisfaisante.
 A l‟installation, une étiquette est apposée sur l‟appareil comportant un numéro
d‟identification propre au laboratoire et le numéro de série de l‟appareil. [78]
Documents fournis lors de la qualification d‟installation :
Caractéristiques techniques et documentation
- des éléments de construction de l‟enceinte climatique,
- des éléments de production thermique, chauffage, production d‟humidité,
- schémas de fonctionnement.
- des systèmes de commandes et de puissance des installations, régulateurs de température et
d‟humidité, schémas électriques.
- des capteurs de température, d‟humidité, enregistreur de température et d‟humidité.
- Principe de fonctionnement des enceintes climatiques, mode opératoire et procédure de mise en
service.
- Liste des pièces détachées, procédure de maintenance des équipements[85]

- Qualification Opérationnelle (QO) : « vérification documentée que les installations, systèmes

et équipements, tels qu'ils ont été installés ou modifiés, fonctionnent comme prévu sur toute
la gamme d'exploitation. » [61]

67
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
La QO teste les caractéristiques dynamiques de l‟équipement.
Elle couvre le processus permettant d‟établir que l‟appareil ou les modules qui le constituent
fonctionnent dans leur environnement, dans un intervalle d‟utilisation représentatif, suivant
les spécifications opérationnelles et que les systèmes informatiques et de sécurité
fonctionnent correctement. [78]
Le protocole de qualification opérationnelle présente :
- les objectifs de la qualification,
- les éléments à vérifier,
- la méthode retenue,
- les exigences (limite, nominal, tolérance),
- les fréquences de requalification,
- tests de défaillance et maintenance curative avec indication des risques majeurs et mineurs.
Une mise au point est effectuée par le fournisseur, en présence du personnel client.
Cette opération permet de déterminer et de valider les paramètres et les sécurités du
process.[85]
Qualification de Performance (QP) :« vérification documentée que les installations, systèmes
et équipements, tels qu'ils ont été agencés, sont en mesure de fonctionner de manière efficace
et reproductible, sur la base de la méthode opérationnelle approuvée et de la spécification du
produit » [61]
Elle couvre le processus servant à démontrer que l‟appareil continu à fonctionner de façon
régulière et constante selon les spécifications appropriées à son usage de routine,
Il peut être effectué de façon classique ou automatique avec un logiciel intégré, la
qualification de performance est en général faite par l‟utilisateur et sous sa responsabilité, à
condition qu‟il y‟est le matériel et les intrants à cette qualification. Des organismes externes
accrédités sont souvent désignés pour assurer les QP.
Pour chaque étape, la démarche de traçabilité est la suivante : Protocole, test et rapport.
[Waters corporation, Waters AQUITY UPLC système OQ / PQ kits de solution de test :
- Pour les cellules d'écoulement de 10 mm, numéro d‟article, 700002642,
- Pour les cellules d'écoulement de 25 mm, numéro d‟article, 700002846]

68
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Pour y satisfaire, le fournisseur de l‟équipement doit lui aussi avoir été au préalable qualifié.
Dans l‟industrie pharmaceutique, sont qualifiés :
- Les équipements : de production et de laboratoire de contrôle, y compris des systèmes
informatiques de type « hardware »
- Les locaux (Zones à Atmosphère Contrôlées ou ZAC)
La notion de « Qualification » ne doit pas être confondue avec le terme de
« Validation » qui est « l‟Etablissement de la preuve, en conformité avec les principes de
bonnes pratiques de fabrication, que la mise en œuvre ou l'utilisation de tout processus,
procédure, matériel, matière première, article de conditionnement ou produit, activité ou
système permet réellement d'atteindre les résultats escomptés » [61]

Figure 42 Qualification des équipements

2.1.2 Nécessité de la qualification

La nécessité de qualifier les équipements de laboratoires découle de trois principales raisons :

69
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
a) Raison légale :
La qualification des équipements est une obligation légale. L‟Annexe 15 des GMP «
Qualification et Validation », le 21CFR Part 211 abordent la nécessité de qualifier tout
équipement de production et de laboratoire
L‟USP <1058> Analytical Instrument Qualification et les autres guides tels de le PIC/S, le
GAMP 5 établissent des aides pour qualifier/valider, en accord avec les requis réglementaires,
les équipements et systèmes informatisés associés, qui seront détaillées.

b) Economique :
Tel que mentionné dans le guide GAMP des laboratoires (ISPE (International Society for
Pharmaceutical Engineering). GAMP 5 : A Risk-Based Approach to Compliant GxP
Computerized Systems, 2nd édition, 2008.), la mauvaise application des recommandations de
validation et de qualification peut impliquer des résultats hors spécifications, des coûts
supplémentaires, des pertes de temps, un risque de non-conformité et des problèmes
d‟intégrité des données. Dans un contexte de concurrence rude des industries
pharmaceutiques, la mise en conformité et la démonstration de sa capacité à être performant
constitue un véritable enjeu stratégique [64]
Par exemple, un équipement non qualifié ne permettra pas de justifier de la fiabilité des
données obtenues. Certes la démarche de qualification/validation demande un investissement
mais ce coût est infime comparé aux conséquences d‟une non-conformité pouvant conduire à
l‟arrêt de la production ou à une amende de plusieurs centaines de milliers d‟euros [65]
C )Morale :
C‟est une question de responsabilité par rapport à la santé publique. L‟utilisateur final est un
malade, auquel le rôle des industries pharmaceutiques produisant des médicaments une fois
l‟AMM obtenue est de garantir la qualité, la sureté et l‟efficacité du produit fini. Tout lot
libéré doit être conforme au dossier d‟AMM tel que celui-ci a été déposé.
La qualification permet de sécuriser les données de manière maximale afin d‟éviter que toute
personne mal intentionnée ne puisse falsifier un résultat analytique. Ceci conduirait à des
effets potentiellement dramatiques une fois administré au patient (effets indésirables,
hospitalisation voire décès).

70
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
2.2 Réglementations applicables à la qualification des équipements de laboratoires et
systèmes informatisés associés.
Tout appareil et équipement utilisés dans un laboratoire de contrôle de qualité de produits
pharmaceutiques doit être vérifié et qualifié pour l‟utilisation à laquelle il est destiné avant sa
mise en service, puis au cours de sa vie, le maintien de cette capacité doit être prouvé par des
tests appropriés, de manière à garantir l‟exactitude et la validité du résultat.
Pour ce faire, des séries de normes ont été établies et mises en œuvre pour répondre aux
besoins et attentes des parties intéressées. Voici quelques extraits des normes applicables lors
de la qualification des équipements de laboratoire :
La norme ISO 9001 : 2008 - système de management de la qualité / Section 7.6 : Maîtrise des
dispositifs de laboratoire « Les équipements de mesure doivent être étalonnés ou vérifiés à
intervalles spécifiés par rapport à des étalons internationaux, réglés, identifiés, protégés
contre des réglages susceptibles d'invalider les résultats de mesure, protégés contre tout
dommage… »
La norme ISO 17025 : 2005 - laboratoires d‟étalonnages et d‟essais / Un extrait sur les
équipements de laboratoire « Personnel autorisé, identification, numéro de série, fabricant,
vérification de conformité, instructions du fabricant, plan de maintenance, dates et copies des
rapports, étalonnage, ajustages, critères d‟acceptation, certificats d'étalonnage » [81]
« Le matériel de mesure, de pesée, d'enregistrement, de contrôle doit être étalonné et vérifié à
intervalles définis et par des méthodes appropriées. Les comptes rendus de ces contrôles
doivent être conservés ».[79] [80]

2.2.1 Textes réglementaires.

Les textes réglementaires sont ceux issus des BPF/GMP Européennes et cGMP
américaines.

2.2.1.1 Textes orientés équipement

La qualification des équipements de laboratoires a vu le jour dans les années 1990 où de
nombreux articles ont été publiés. Le modèle de qualification par 4Q, c‟est-à-dire
les quatre étapes de la qualification, a été publié en 1995 au Royaume-Uni par le
Pharmaceutical Analytical Science Group (PASG)[64].

71
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
La qualification des équipements permet de satisfaire à l‟objectif quotidien d‟un laboratoire
de contrôle qualité qui est l‟obtention de données analytiques fiables.
Le chapitre spécifique au contrôle de la qualité des BPF (chapitre 6) ne stipule pas clairement
la démarche à adopter pour qualifier les équipements mais se borde à dire que les
équipements doivent être qualifiés et entretenus [61]
Il en est de même pour les cGMP au point 211.160b(4) (section I) : « L‟étalonnage à
intervalle réguliers des instruments, appareils… selon un programme établi qui contient des
indications spécifiques, plannings, limites de précision et d‟exactitude et des dispositions
concernant les actions correctives dans le cas où les limites d‟exactitude et/ou de précision ne
sont pas respectées. Les instruments, appareils, indicateurs et dispositifs d‟enregistrement qui
ne répondent pas aux spécifications établies ne doivent pas être utilisés » [67]
En complément de ce paragraphe, les paragraphes 211.63 et 211.65 (a/b) (section D) des
cGMP concernent la conception, la construction, la taille et la localisation des équipements
qui doit être adaptée à l‟usage prévu (facilité de nettoyage, maintenance) et ne doit pas altérer
la sécurité, l‟identité, l‟efficacité, la qualité ou la pureté du produit pharmaceutique.
Les textes présentés ci-dessous définissent plus spécifiquement les objectifs à atteindre pour
qualifier conformément aux exigences réglementaires.

1.2.1.1.1L‟Annexe 15 des GMP : Qualification et Validation

La Ligne Directrice 15 « Qualification et de la Validation » a été révisée depuis la version de
2001. La nouvelle version est entrée en vigueur depuis le 1er Octobre 2015. Cette révision est
en faveur d‟un rapprochement de l‟Europe vers les exigences de la FDA en matière de
validation des procédés par l‟intégration des ICH Q8 (« Développement Pharmaceutique »),
Q9, Q10 et Q11 (« Développement et fabrication de substances actives »).
L‟ensemble de l‟Annexe 15 a été profondément révisée et sa structure modifiée. Des
changements notables affectent les activités de qualification des équipements.
En effet, les Spécifications Besoins Utilisateurs (document qui établit les besoins spécifiques
de l‟utilisateur à la fois par rapport à l‟utilisation souhaitée de l‟appareil et sa conformité aux
GMP) deviennent obligatoires pour tout nouvel équipement. La notion de FAT/SAT (Factory
Acceptance Test/Site Acceptance Test) est également intégrée. Il s‟agit des tests effectués par
le fournisseur à la fois sur son site de fabrication et sur le site de production du client.

72
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Ces changements ont été incorporés dans le but d‟une harmonisation avec les autres textes
réglementaires et guides ICH, PIC/S et le GAMP 5. La nouvelle version fait également
référence au processus déviation (une déviation est un écart par rapport à une instruction
approuvée ou à un standard établi).
Pour la première fois, cette annexe recouvre les systèmes informatisés en précisant qu‟ils
doivent être validés en accord avec les exigences de l‟Annexe 11.
Le tableau ci-dessous (tableau I) présente un comparatif entre l‟ancienne et la nouvelle
version de l‟Annexe, applicable à la qualification.

Tableau I: Comparatif qualification Annexe 15 ancienne et nouvelle version

Annexe 15 Ancienne Version Annexe 15 Nouvelle Version
Qualification Description QC, QI, QO, QP en Intégration des spécifications
tant que phases indépendantes les besoins utilisateurs
unes des autres (pas de possibilité Intégration FAT/SAT
de combinaison ou de passage à Combinaison QI/QO
étape ultérieure sans une Possibilité d‟approbation
libération officielle par conditionnelle pour passer à l‟étape
approbation de l‟assurance suivante de qualification en cas de
qualité) déviation si pas d‟impact critique
Requalification Terme employé : revalidation Terme employé : requalification
Vérification des paramètres et Vérification à fréquence appropriée
limites pour variables critiques selon des critères d‟évaluation
Pas de notion de fréquence de prédéfinis
Revalidation

2.2.2 Guides :

2.2.2.1 Pour les systèmes informatisés des équipements

Les systèmes utilisant des enregistrements et des signatures électroniques doivent être en
conformité avec les exigences du 21 CFR Part 11 de la FDA et du guide Scope and
Application associé lorsqu‟un industriel vend ses produits aux Etats-Unis. Si la vente

73
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
s‟effectue en Europe, c‟est l‟annexe 11 des GMP et le document du PIC/S PI011-3 qui seront
pris en compte. Mais au-delà des Etats-Unis et de l‟Europe, de nombreuses agences
réglementaires internationales font maintenant partie du PIC/S, faisant ainsi du PI 011-3 la
référence internationale pour la gestion des systèmes informatisés et automatisés. Le GAMP
5, guide reconnu par les industriels et les instances réglementaires, n‟est pas en reste puisqu‟il
intègre toutes les exigences du PIC/S [60]

2.2.2.2 L’USP <1058> (United States Pharmacopoeia)

Le chapitre général <1058> de la Pharmacopée US, intitulé Analytical Instrument
Qualification datant de 2008, explique la manière d‟obtenir des données de qualité.
Contrairement aux validations de méthodes et aux SST, la qualification des équipements
analytiques n‟a pas de guidance spécifique. Le texte souligne également le fait que diverses
opinions existent à ce sujet, ce qui implique une diversité d‟options et de démarches pratiques
au sein des industries pharmaceutiques. Le chapitre ne prétend qu‟apporter une approche
scientifique à l‟activité de qualification, considérant que cette activité est l‟un des éléments
majeurs permettant de générer des données cohérentes et reproductibles.

2.2.2.3 Le GAMP 5
GAMP 5 découle un ensemble de guides pratiques (Good Practice Guides) pour les
infrastructures, les enregistrements électroniques et signatures, l‟archivage des données etc.
Il fournit une vue d‟ensemble du cycle de validation des systèmes informatisés de
laboratoires, depuis le concept jusqu‟au retrait du SI. Comparé aux textes réglementaires, ce
guide apporte des compléments indispensables quant à comment procéder pour valider les
systèmes. Il insiste notamment sur l‟importance de l‟étude de la documentation fournisseur et
sur les connaissances nécessaires quant à l‟utilisation souhaitée en interne afin d‟éviter les
tests inutiles sans valeur ajoutée.
L‟approche requière une meilleure connaissance de l‟utilisation du système et du procédé en
vue d‟améliorer l‟efficacité et la productivité en se focalisant sur les activités les plus
critiques.
Le laboratoire de contrôle doit maîtriser les risques reliés à l‟intégrité des données en
fonction de leur importance. Les efforts prouvant que le système correspond à l‟utilisation

74
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
souhaitée doit être basée sur les aspects critiques que sont l‟intégrité de données, la sécurité
du patient et la qualité du produit. Ces aspects critiques doivent être identifiés, spécifiés et
vérifiés. Il est préférable d‟intégrer la vérification à la fois du hardware et du software. Des
instructions pour l‟utilisation des données électroniques critiques, en accord avec les
réglementations telles que le 21 CFR part 11, sont également fournies (ISPE (International
Society for Pharmaceutical Engineering). GAMP 5: A Risk-Based Approach to GxP
Compliant Laboratory Computerized Systems (Second Edition), October 2012.).
Le guide contient également 13 annexes dont la catégorisation détaillée des logiciels, les
requis de validation selon la catégorisation, l‟intégrité des données, le management de la
sécurité des SI de laboratoires, la définition des enregistrements et données brutes.
Le GAMP 5 établit les rôles et responsabilités des propriétaires et administrateurs d‟un SI. Le
propriétaire du système est la personne responsable des ressources financières et humaines
nécessaires à la vie du système. Il s‟agit habituellement du responsable du laboratoire. Il est
responsable du système durant toute sa durée de vie, s‟assure du respect des procédures
associés au système et constitue le contact privilégié auprès des autorités réglementaires ou
tierce-parties.
L‟administrateur du système est responsable du bon fonctionnement de l‟application et de
l‟infrastructure du système au cours de son cycle de vie. Cette personne dispose d‟une
expertise du système pour des activités demandant une compétence spécifique (tel que la
sauvegarde et la sécurité des données) tout en respectant les procédures générales
informatiques. Cette personne ne constitue en aucun cas un utilisateur en routine du système,
mais elle s‟assure du maintien du système dont elle est en charge [72]

2.2.2.4 L’ICH
Le terme qualification est utilisé pour les équipements, installations, utilités et locaux.
La validation du procédé de fabrication ne peut être réalisée que sur des équipements
qualifiés. La qualification est essentielle pour une mesure précise et juste : si le matériel n'est
pas qualifié, assurant que les résultats indiqués sont dignes de confiance, tout autre travail
basé sur l'utilisation de ce matériel sera suspect. La qualification est « l‟action de fournir et
documenter que l‟équipement ou les matériels annexes sont correctement installés,
fonctionnent correctement et fournissent en réalité les résultats attendus. La qualification est

75
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
partie intégrante de la validation mais les étapes de qualification seules ne constituent pas la
validation de procédé. » [74]

2.3 Divers guides et réglementations dans un même but

La stratégie de qualification des équipements de laboratoire repose sur plusieurs textes
(réglementaires et guides). Tous ne couvrent pas les mêmes requis. Une étude attentive de la
littérature s‟avère nécessaire afin de construire sa propre stratégie tout en respectant la
législation.
Le tableau II ci-dessous présente les diverses approches des étapes de qualification selon les
GMP Européennes, l‟USP <1058> et le GAMP 5 :
Approche GMP (Annexe 15) Approche USP <1058> Approche GAMP 5
QC Etape qui démontre que la Vérification documentée des Revue du design.
conception proposée par le activités qui ont permis de Evaluation des
fournisseur a été comparée définir les spécifications livrables pour
par rapport aux spécifications, fonctionnelles et s‟assurer qu‟ils
aux opérationnelles de l‟équipement satisfont aux
GMP et au cahier des charges et les critères de sélection ayant besoins spécifiés
définissant le projet permis de choisir le fournisseur
Basée sur l‟utilisation souhaitée
de l‟équipement
QI Etape démontrant que la Documentation des activités Vérification, tests
construction et l‟installation permettant d‟établir qu‟un ou autre
sont conformes à ce qui avait équipement est livré tel que vérification
été prévu dans le cahier des dessiné et spécifié, qu‟il est démontrant :
charges et la QC. La QI convenablement installé dans Une installation
prouve via vérifications l‟environnement sélectionné, et correcte du
techniques et documentaires que cet environnement lui est software et de
que l‟équipement construit, adapté description détaillée des l‟hardware
réceptionné et installé dans activités et documentation La configuration
l‟industrie est conforme au caractéristiques correcte du
cahier des charges pré établit. software et de

76
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
l‟hardware
QO Phase prouvant au travers Vérification documentée que le Vérification que le
d‟un certain nombre de tests système fonctionne selon les système
que l‟équipement tel qu‟il est spécifications opérationnelles fonctionne selon les
installé, fonctionne écrites et préétablies dans spécifications
conformément aux l‟environnement défini déterminées dans
spécifications du fabricant Description détaillée des la plage de mesure
paramètres fixes à tester, tests souhaitée
fonctionnels et sécurité des
Données
QP Etape démontrant qu‟un Vérification documentée que le Vérification
procédé s‟exécute système fonctionne démontrant
correctement et qu‟il produit conformément aux l'aptitude à l'usage
de manière répétitive un spécifications souhaitées par prévu et
résultat conforme à ses l‟utilisateur et que l‟équipement permettant
spécifications dans des est approprié pour l‟usage l'acceptation du
conditions réelles, c‟est à dire souhaité système selon les
normales et limites («worst exigences
case»). Il donne lieu spécifiques
à la libération officielle des
installations, systèmes et
équipements

2.4 La mise au point sur la terminologie

Les terminologies utilisées dans ces divers textes sont différentes. Alors que l‟Annexe
15 établit clairement une différence entre la qualification et la validation, le GAMP 5 et
l‟USP<1058> utilisent le terme de vérification. Ce terme inclus à la fois la qualification et la
validation en tant que preuve que le système est adapté à l‟usage prévu selon la définition de
l‟ASTM (American Society for Testing and Materials) Standard E2500. La vérification est
l‟approche systématique de vérifier que la fabrication des systèmes, qu‟ils soient seuls ou

77
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
combinés, sont adaptés à l‟usage prévu, sont installés et fonctionnent correctement. Il s‟agit
d‟un terme générique englobant tous types d‟approches pour garantir une utilisation adaptée
dans la qualification, la mise en service, la validation du système ou autres appellations.[75]
En Mars 2003, un groupe de travail, sponsorisé par l‟ISPE, l‟AAPS (American Association of
Pharmaceutical Chemists) et le FIP (International Pharmaceutical Federation), statua sur
l‟approche scientifique de la qualification des instruments analytiques. L‟ensemble des parties
(regroupant utilisateurs, spécialistes de l‟assurance qualité, fournisseurs, consultants et
affaires réglementaires) s‟accordèrent pour statuer qu‟un procédé se valide et qu‟un
équipement se qualifie.[76]
C‟est pourquoi le terme choisit dans le cadre de ce travail sera celui de qualification lorsqu‟il
s‟agit des activités de QI, QO, QP. Cet ensemble intégrera la validation en lui-même du
système (équipement plus système informatisé).
Un autre point, pouvant prêter à confusion par la traduction des termes anglais utilisés, est
que l‟Annexe 15 présente bien le terme équipement tandis que l‟USP <1058> utilise le terme
instrument. Un instrument est un type d‟équipement s‟il est utilisé pour la fabrication,
l‟emballage ou au laboratoire.[77]
. Ces deux termes sont considérés comme équivalents dans le cadre de ce travail puisque les
équipements de laboratoires sont concernés.
Bien que les définitions des phases de qualification présentent certaines différences,
l‟essentiel est de s‟appuyer sur la catégorisation des équipements qui permettra de savoir la
stratégie de qualification/validation à adopter.

2.5 Classification des équipements selon l’USP <1058>

L‟USP <1058> classe les équipements en trois catégories :
Tableau 5:Les trois catégories des équipements selon l‟USP (1058)

Catégorie Description
Équipement USP
<1058>
Groupe A Equipement standard ne donnant pas de résultat tels que des agitateurs
magnétiques, les vortex ou encore les centrifugeuses. La conformité des

78
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
équipements du groupe A aux besoins utilisateurs peut être vérifiée et
documentée par observation visuelle du bon fonctionnement.
Groupe B Equipements standard, instruments donnant des valeurs mesurées et
équipements contrôlant des paramètres physiques (pression,
température…)
nécessitant un étalonnage. Cette catégorie comprend par exemple les
balances, les pH-mètres, les titrateurs, les viscosimètres ou encore les
réfrigérateurs, fours, pompes, diluteurs. La conformité des équipements
de catégorie B est déterminée selon les procédures normalisées
d‟exploitation de l‟instrument et documentées pendant la QI et la QO.
Groupe C Equipements comprenant un système informatisé, tel que
spectrophotomètres infrarouges, UV/visible, chromatographies en phase
gazeuse, lecteurs de microplaques…La conformité des instruments du
groupe C aux besoins des utilisateurs est déterminée par les tests
fonctionnels spécifiques et les tests de performance. Un processus de
qualification complet, tel que décrit dans l‟USP <1058> devrait
s‟appliquer à ce type d‟instruments.
L‟USP précise que pour un équipement donné, sa catégorie doit être évaluée par l‟utilisateur
en fonction des exigences requises (57) .

2.6 Organisation et Planification des activités de Qualification

Pour chaque entreprise, l‟organisation des activités de qualification découle de procédures
générales internes. Il est primordial d‟établir en amont les rôles et responsabilités
des acteurs (utilisateur, vérificateur, AQ…) ainsi que la stratégie applicable.

2.6.1 Stratégie globale de qualification des équipements, définie au Plan de

Qualification/Validation du site
Selon les GMP, les activités relatives à la qualification/validation doivent être planifiées via
un Plan Directeur de Validation (PDV), ou documents équivalents, décrivant les principales
activités afin d‟assurer le niveau de qualité approprié tout au long du cycle de
qualification/validation. Ces activités sont réalisées par des personnes formées suivant des

79
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
procédures approuvées par l‟Assurance Qualité. Véritable document support, le PDV décrit
la politique et la stratégie à déployer pour la réalisation et le suivi des activités de
qualification de ses équipements. Ce document peut regrouper l‟ensemble des systèmes,
équipements, procédés, matériels et locaux du site. Habituellement, un plan est dédié par
famille : qualification, validation de procédé et nettoyage. Le PDV appliqué aux équipements
intègre :
- La politique de Qualification du site
- La structure organisationnelle des activités de qualification
- Les responsabilités des diverses parties
- Le relevé des équipements et SI associés à qualifier et existants (en utilisation ou en cours
de retrait)
- Les modèles requis pour chaque document de qualification (QI, QO, QP)
- Les méthodologies employées (certains équipements simples ne requièrent pas de QP)
- La notion de maîtrise des changements : selon la gestion des Change Control en interne.
Le programme de qualification global peut ensuite être retranscrit sous forme de planning afin
de prioriser les projets de qualification (33) (55).

2.6.2 Etablissement des rôles et responsabilités des différents acteurs d’un projet de
qualification
Les rôles et responsabilités des divers acteurs peuvent légèrement différer selon les industries.
Le tableau ci-dessous (tableau VIII) résume les principaux requis en matière de rôles et de
responsabilités conformément aux GMP, à l‟USP <1058> et à l‟Annexe M3 du GAMP 5 (56)
Tableau 6: les principaux requis en matière de rôles et de responsabilités conformément aux
GMP, à l‟USP <1058> et à l‟Annexe M3 du GAMP 5 (56) :

Acteur Rôles/Responsabilités
Technicien de laboratoire - Rédaction des documents reliés à la qualification/requalification
(pour l‟équipement dont de l‟équipement
il est responsable) - Suivi documentaire de l‟équipement

80
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
- Exécutant des tests de qualification/requalification
- Vérificateur des tests effectués par une entreprise extérieure
(sous-traitance)
- Maintenance préventive et curative de l‟équipement
Responsable de - Exprime les besoins quant à l‟acquisition d‟un nouvel
laboratoire équipement
- Vérificateur de l‟ensemble des documents de
qualification/requalification, manuel d‟utilisation,
d‟administration de son laboratoire/unité
- Nomme le responsable équipement et son suppléant en
cas d‟indisponibilité de celui-ci
Responsable/coordinateur - Rédaction du Plan de Qualification global
qualification - Gestion des activités de qualification
- Vérificateur de l‟ensemble des documents de
qualification/requalification, manuel d‟utilisation
- Rédaction des Plan de Qualification système, Analyse de
Criticité, Analyse de Risques, matrice de traçabilité
- Planification des activités de qualification et de
requalification
- Interlocuteur privilégié des fournisseurs
Administrateur des - Vérificateur de l‟ensemble des documents de
systèmes qualification/requalification
informatisés - Rédaction des manuels d‟instructions d‟administration,
sauvegarde et restauration du système
- Rédaction et exécution des tests liés au système Informatisé
Assurance Qualité - Approbation des documents de qualification (protocoles et
rapports)
- S‟assure du respect de la réglementation
- Evalue les demandes de changements via Change
Control

81
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
- Gestion des écarts/déviations du site
Les utilisateurs peuvent être aidés d‟autres personnes qualifiées tels que des consultants et des
spécialistes. Cependant, c‟est aux utilisateurs que revient la responsabilité finale de la
qualification du système.
La responsabilité des fabricants est explicitée à la fois dans l‟Annexe 15, l‟USP<1058> et le
GAMP 5. Ils sont à la fois responsables de la QC, de la validation du process et de la
fabrication en elle-même de l‟équipement qu‟ils doivent tester avant expédition
(impliquant la notion de Factory Acceptance Test). La version draft de l‟USP <1058>
renforce également leur responsabilité en indiquant qu‟ils doivent fournir aux utilisateurs les
formations et un support technique (maintenance, réparation). Un accord établissant les
rôles et responsabilités de chaque tierce partie doit exister entre l‟utilisateur et le fournisseur.

2.6.3 Notion de cycle de Qualification

La validation d‟un système informatisé ou d‟un procédé est modélisée selon un cycleen V

Figure 33: Cycle de Qualification/Validation d'un système

Ce cycle en V regroupe les différentes étapes du cycle de vie d‟un système, depuis
l‟établissement des besoins utilisateurs jusqu‟à sa mise en exploitation et son maintien. Le
retrait intervient à la fin de l‟exploitation du système (notion uniquement présente dans le
GAMP 5). Selon le GAMP, « l‟approche du cycle de vie implique de définir et de mener à
bien des activités de façon systématique à partir de la conception, de comprendre les

82
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
exigences à travers le développement, la libération et l‟exploitation opérationnelle jusqu‟au
retrait du système » (7).
La plupart des systèmes informatisés de laboratoires sont des standards ou des produits
configurables dont le hardware et la partie logicielle sont étroitement liées et qualifiées en
tant qu‟unité. La validation du SI s‟effectue en même temps que la qualification de
l‟équipement analytique. Par exemple, il serait inapproprié de tester séparément la partie
logicielle de la partie matérielle d‟un spectrophotomètre proche infrarouge

2.7 Etapes de Qualification des équipements

Selon la figure 6, le cycle en V illustre la validation par différentes phases depuis le
développement initial des spécifications des besoins des utilisateurs (SBU), en passant par la
planification des activités, l‟analyses de risques et tests de qualification initiale permettant
l‟utilisation en routine du système jusqu‟à la fin de son utilisation. Chaque étape de
qualification satisfaisant aux critères élaborés au protocole fait l‟objet d‟une libération
officielle par l‟Assurance Qualité pour réaliser l‟étape suivante.
L‟Annexe 15 des GMP autorise la combinaison d‟étapes de qualification (tel que QI avec
QO). Une autorisation de passage à l‟étape ultérieure de qualification via une approbation
conditionnelle de l‟assurance Qualité est envisageable (3).

2.7.1 Consolidation de l’analyse et définition des tests à réaliser

L‟Analyse de Risques est ensuite revue, analysée et consolidée en réunion avec les divers
acteurs du projet, avec identification du type de test à réaliser.

2.7.2 Tests de vérification d’installation et de configuration (QI)

Les tests de QI doivent couvrir l‟ensemble des composants en rapport avec le système
informatisé et démontrer que les risques identifiés sont sous contrôle.
Ce sont des tests de vérification documentaire, de vérification physique / logique /
paramétrage par rapport à des spécifications dites techniques. Ce type de spécification décrit
les contraintes et les environnements dans lesquels doivent évoluer les systèmes.

2.7.3 Tests de vérification fonctionnelle (QO)

Les tests de QO doivent couvrir l‟ensemble des fonctions identifiées comme critiques.
Le tableau XII ci-dessous montre la profondeur des tests à réaliser selon le niveau de risque

83
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Associé :
Tableau 7: Profondeur des tests réalisés en fonction du niveau GxP

Niveau GxP/ Priorité Notation De risque Notation Profondeur de test

de risque
Pas d‟impact GxP Faible Pas de test obligatoire
(Business)
Moyen Test fonctionnel (potentiellement réalisé par le
fournisseur)
Elevé Vérification de procédures
Impact mineur Faible Pas de test ou test fonctionnel ou vérification de
procédure
Impact majeur Moyen Test nominal
Impact critique Elevé Test fonctionnel nominal et des tests défaillants/
dans des conditions de stress / tests limites à
réaliser selon applicabilité.
Test nominal
Test de défaillance
Tests aux limites

Le tableau XII met en évidence quatre types de tests de qualification :

 Tests fonctionnels : Test de fonctionnement élémentaire que le composant est
opérationnel dans une configuration standard. Ce test est en général réalisé par le
fournisseur.
 Test nominal : Le test nominal vérifie que le composant est opérationnel dans des
plages de fonctionnement représentatives prévues dans les spécifications de
l‟entreprise avec un paramétrage ou un réglage représentatif des conditions réelles
d‟exploitation prévues. Ce type de test démontre que le système fait bien ce qu‟il est
censé faire.
 Test de défaillance : Le test de défaillance vérifie la réponse du système dans des
conditions anormales de fonctionnement. Ce type de test démontre que le système

84
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
ne fait pas ce qu‟il n‟est pas censé faire.
 Test aux limites : Le composant est opérationnel et détecte, ou rejette, les données ou
les situations erronées ou les états d‟anomalie. Le test aux limites vérifie le
fonctionnement dans les limites extrêmes du fonctionnement standard, c‟est-à-dire
dans les situations les plus défavorables de fonctionnement.

2.7.4 Tests de vérification de performance (QP)

En QP, les vérifications effectuées doivent couvrir l‟ensemble des processus en rapport avec
le système. Des vérifications documentaires (procédures, formation…) sont principalement
réalisées. D‟autres tests sur le système sont réalisés et visent à démontrer la performance du
système dans son environnement de routine et dans le temps.

2.7.5 La Qualification de Conception (QC)

La Qualification de Conception (QC) documente toute la phase de conception avant la
décision d‟achat d‟un nouvel équipement. Cette phase démontre la conformité de la
conception par rapport aux besoins des utilisateurs et aux bonnes pratiques. La QC commence
dès l‟étape de définition des besoins utilisateurs et s‟étend jusqu‟au suivi du fournisseur lors
de la réalisation de la qualification de l‟équipement.

2.7.6 Factory Acceptance Testing (FAT) / Site Acceptance Testing (SAT)

La notion de FAT et de SAT est nouvelle dans les GMP Européennes (3). Les Tests
d‟Acceptation Fournisseur ou Factory Acceptance Testing (FAT) sont des tests exécutés chez
le fournisseur. Il s‟agit d‟une vérification de la conformité de l‟équipement vis-à-vis de la
SBU/spécifications fonctionnelles générales, avant d‟accepter l‟envoi sur site du système
(33).
La FAT s‟applique plus particulièrement aux technologies nouvelles et complexes (elle n‟est
donc pas directement applicable à la catégorie 3 du GAMP 5). Certains tests de QI/QO
pourraient être effectués à la FAT sans nécessité d‟être déroulés sur site de livraison si une
justification de la non altération de la fonctionnalité par le transport et l‟installation est
apportée.
Les Tests d‟Acceptation sur Site ou Site Acceptance Testing (SAT) font suite à la réception
de l‟équipement sur le site de fabrication et complètent ainsi la FAT. Les mêmes vérifications

85
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
sont effectuées que durant la FAT, mais après réception sur site. La FAT et la SAT doivent
être déroulées avec l‟équipe projet et le fournisseur

2.7.7 La Qualification d’Installation (QI)

La qualification d‟installation fournit la preuve documentée que les composants matériels et
logiciels sont installés selon les spécifications écrites et approuvées au préalable. Elle est
destinée à vérifier que le système est correctement installé. Différents types de tests sont
envisagés :
- Vérification de l‟environnement (température, humidité relative, vibrations etc.)
- Vérification de l‟installation physique (branchements, câbles, imprimante, PC etc.)
- Vérification de l‟installation du logiciel (version installée, paramétrage des droits de
Windows, écran de veille etc.) et du paramétrage de l‟application (profils utilisateurs,
activation de l‟audit trail etc.)
- Vérification de la présence de la documentation fournisseur (manuels d‟utilisation,
documents de qualification, Curriculum Vitae de l‟installateur etc.)

2.7.8 La Qualification Opérationnelle (QO)

La qualification opérationnelle fournit la preuve documentée que le système fonctionne selon
les spécifications écrites et approuvées. La QO teste le fonctionnement du système.
La vérification fonctionnelle du système se traduit par :
- La vérification du bon fonctionnement des profils utilisateurs et de la sécurité des accès
- Des tests de vérification du pilotage de l‟équipement par le système et de l‟acquisition des
données
- Des tests de vérification des calculs : précision, exactitude…
- Des tests de vérification de la sécurité des données informatisées (non supprimables, non
modifiables etc.)
- Des tests de répétabilité d‟injection ou de prélèvement…
En accord avec l‟Analyse de Risques, la QO n‟est pas une vérification du fonctionnement de
toutes les fonctions, mais une vérification des fonctions critiques utilisées (par exemple : tests
de répétabilité d‟injection sur substance la plus visqueuse, définie comme la plus critique).

86
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Ces deux phases QI et de QO peuvent être regroupées dans un seul et même document selon
la nouvelle version de l‟Annexe 15 des GMP. Les deux phases sont ainsi formalisées dans un
protocole / rapport identifié Qualification d‟Installation et Opérationnelle, la partie protocole
étant signée avant la réalisation des tests. Suite à la réalisation des tests de QI et de QO, une
partie rapport doit être renseignée. La signature de la partie rapport permet de statuer sur la
poursuite de la qualification en QP (voir autorisation de passage en QP même si QI/QO non
finalisé si pas d‟impact).

2.7.9 La Qualification de Performance (QP)

La Qualification de Performance (QP) vérifie le processus d‟utilisation et de performance du
système avec le personnel. La QP fournit la preuve documentée que le système est capable de
réaliser les analyses pour lequel il été configuré, selon les spécifications écrites et approuvées
au préalable, dans son environnement de routine.
La QP peut contenir plusieurs phases, par exemple :
- Une première phase couvrant la vérification d‟aptitude du système où la
documentation de son utilisation (manuel utilisateur équipement et administration) est
vérifiée ainsi que le fonctionnement répétable et sous contrôle du système
- Attestation de formation des utilisateurs selon leurs niveaux (utilisateur,
administrateur)
- Attestation de formation du formateur
- Vérification que des manuels d‟utilisation du système et d‟administration sont
disponibles
- Vérifier que ces manuels sont exacts…
L‟approbation du rapport de la première phase permet le déroulement de la seconde phase qui
correspondra à la vérification de la performance analytique du système dans son
environnement d‟utilisation de routine et dans le temps. La QP d‟un système doit être
effectuée avant la validation des méthodes analytiques.
Le rapport de QP conclut quant à l‟acceptation finale de l‟utilisation du système, son
approbation atteste du statut qualifié (opérationnel et maîtrisé). Lorsque le système peut être
libéré pour être mis en routine, une étiquette de conformité est apposée sur l‟équipement et
signifie qu‟il peut être utilisé jusqu‟à la date définie de la requalification.

87
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
2.7.10 La Requalification
La requalification d‟un équipement consiste à prouver que le système fonctionne toujours
selon les spécifications établies, c‟est-à-dire qu‟il donne toujours des résultats analytiques
fiables. La fréquence de requalification doit être évaluée et appropriée (ni trop souvent, ni pas
assez) selon l‟analyse de risques. La requalification est essentielle puisqu‟elle garantit
l‟intégrité des données sur toute la période d‟utilisation de l‟équipement.

2.8 Documentation des activités de qualification (QI, QO, QP et Requalification)

2.8.1 Protocole de Qualification

Le protocole est un document écrit précisant les modalités de mise en œuvre des activités de
qualification, les étapes critiques et critères d‟acceptation de conformité aux tests effectués.
Quel que soit le type de protocole choisi (la rédaction n‟étant pas normalisée), son
approbation par l‟Assurance Qualité est obligatoire avant la réalisation des essais.
Un protocole de qualification doit, à minima, contenir les éléments suivants :
- Description générale de l‟équipement/système à qualifier
- Objet de la qualification, périmètre (service, produit concerné), pré requis au déroulement
(exemple pour la QP : approbation du rapport de QO)
- Description des responsabilités de chaque service acteur de la qualification (technicien de
laboratoire de contrôle, responsable laboratoire, assurance qualité, pôle
qualification/validation)
- Les instructions à suivre pour la réalisation des tests, description des paramètres mesurés
- Description de la méthode d‟analyse des résultats
- Critères d‟acceptation
- Description de la gestion des éventuels écarts, déviations liées au protocole selon les
procédures internes et dans le respect des GMP
Si ce protocole est fourni par un tiers (exemple : fournisseur), le personnel approprié doit
juger de sa conformité vis-à-vis des procédures internes. Un protocole fournisseur peut être
complété par des protocoles internes additionnels.
Tout changement significatif par rapport au protocole approuvé durant l‟exécution des tests
(exemple : critères d‟acceptation), doit être documenté comme un écart et justifié de manière

88
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
scientifique. Les résultats ne satisfaisant pas aux critères d‟acceptation sont enregistrés en tant
qu‟écarts et investigués en accord avec les procédures internes (33), pouvant aboutir à des
déviations selon la criticité.

2.8.2 Fiche de Test

La Fiche de Test permet de renseigner les tests à réaliser, l‟environnement et les résultats. Les
fiches de test vierges se trouvent habituellement en annexe du protocole.
Celles complétées lors de l‟exécution des tests sont en annexe du rapport.
Les éléments ci-dessous doivent être trouvés dans les fiches de tests (liste non exhaustive) :
- Liste des participants aux tests : rôles, date et visas
- Liste et identification du matériel utilisé
- Pré requis si applicable (exemple : accès utilisateur au système informatisé)
- Conformité de chaque cas de test vis-à-vis des critères d‟acceptation (un test est considéré
comme conforme lorsque le résultat obtenu correspond aux spécifications)
- Conformité de la fiche de test (si l‟un des critères d‟acceptation n‟est pas conforme,
l‟ensemble de la fiche de test est considérée comme non conforme)
- Fiche d‟écart ou d‟incident lors d‟anomalies de qualification
Lors de leur exécution, ces fiches doivent être complétées dans le respect des bonnes
pratiques documentaires (écrire avec un stylo indélébile, barrer d‟un simple trait toute erreur,
dater et viser).
Chaque test est déroulé par le testeur attitré (technicien pour exécution des analyses,
administrateur pour tâches informatiques d‟administration du système). Un vérificateur
l‟accompagne dans sa démarche et s‟assure de la réalisation correcte du test. Les fiches de
tests sont revues par l‟Assurance Qualité en même temps que le rapport de qualification

2.8.3 Ecart de qualification

Tout écart de qualification par rapport aux critères d‟acceptation devra être traité. Le cas
échéant, une fiche d‟incident sera complétée. Celle-ci contiendra à la fois une description de
l‟anomalie constatée, son impact (réglementaire ou business), sa cause probable et l‟action
corrective mise en place. Une non-conformité majeure peut aboutir à une déviation.

89
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Dans le cas d‟une non-conformité nécessitant la réexécution de la fiche de test (ou
uniquement du test ayant engendré l‟anomalie), une nouvelle fiche de test sera déroulée et
jointe au rapport.

2.8.4 Rapport de Qualification

L‟exécution de l‟ensemble des tests relatifs à la phase de qualification (QI, QO, QP)
effectuée, un rapport de qualification est alors rédigé. L‟ensemble de la qualification doit être
étudiée, les conclusions reportées et les résultats obtenus résumés par rapport aux critères
d‟acceptation : « Toute modification ultérieure des critères d'acceptation doit être
scientifiquement justifiée et une recommandation finale faite quant à l'issue de la validation »
(1).
Le rapport combine les essais ayant été déroulés et leur conformité pour apporter une décision
finale au passage ou non à l‟étape ultérieure. Le rapport est indépendant du protocole mais est
relié à celui-ci par un numéro.
Les informations figurant dans le rapport de qualification sont les suivantes :
- Historique des qualifications antérieures, si applicable
- Période d‟exécution des tests
- Résultats de la conformité de chaque fiche de test et synthèse globale
- Liste des écarts relevés (et déviations le cas échéant)
- Conclusion générale
Avant utilisation du système en routine, un rapport final de qualification peut être rédigé. Il
couvre la totalité des résultats et résume les anomalies rencontrées. Le statut final du système
est alors défini (qualifié, non qualifié, qualifié sous réserve) (3) (33).

2.8.5 Documents annexes

2.8.5.1 Rédaction d’un manuel opérationnel

Le manuel opérationnel standardisé est un document qualité décrivant les modalités
d‟utilisation et de maintenance pour chaque équipement. Ces manuels peuvent être regroupés
par famille d‟équipements. Les flux de processus et responsabilités liées l‟utilisation du
système sont décrits. Ce document doit être précis, directif et sans ambiguïté, puisqu‟il est
utilisé par les techniciens en routine.

90
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Dans ce manuel, le flux nécessaire depuis la mise en route de l‟équipement jusqu‟à
l‟obtention des données brutes, leur exploitation, le nettoyage et l‟arrêt est scrupuleusement
détaillé.
Les contrôles à effectuer avant analyse (SST, calibration), les programmes à utiliser, la
manière de codifier la séance d‟analyse et les échantillons, la manière de générer les rapports
et impressions sont ainsi procédurées. Tout utilisateur doit se conformer à ce qui est écrit dans
ce manuel. Le document est situé à côté de l‟équipement et doit toujours être disponible.
Le manuel décrit également les actions à mener en cas de panne sur l‟un des composants du
système ou selon les messages d‟erreurs pouvant être générés.

2.8.5.2 Rédaction d’un manuel d’administration

Le manuel d‟administration système est spécifique à la gestion de chaque SI de laboratoire. Il
est rédigé par l‟administrateur des systèmes informatisés.
Ce manuel comporte à la fois :
- La configuration minimale du système et des sécurités générales :
- PC client : connexion au poste, horloge du système, langage, antivirus…
- Applicatif : chemin complet des exécutables de lancement, verrouillage des accès,
déconnexion automatique…
- La gestion des utilisateurs (profils et privilèges, création, modification, désactivation,
déblocage de compte)
- La gestion des méthodes, des données et signatures (si gestion électronique ou papier), la
gestion des rapports d‟analyse
- La sauvegarde, l‟archivage et la restauration du système
- La conservation et la sécurisation des données
- La gestion l'audit trail
- La surveillance du système (vérification espace disque, des sauvegardes, des messages
d‟erreurs…) et des accès
Ce document permet de définir les différents niveaux d‟accès selon les requis réglementaires.
L‟administrateur système ne doit pas pouvoir lancer d‟analyse. Certains opérateurs ont le
droit de créer et de modifier des méthodes (sous couvert qualité), alors que d‟autres ne feront
que les analyses de routine.

91
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
2.8.5.3 Le Cahier de Route
Selon les BPF, (§4.31) : « Les équipements principaux ou critiques en fabrication comme en
contrôle de la qualité et les locaux de production doivent être accompagnés d‟un cahier de
route mentionnant, par ordre chronologique, et selon les cas, l‟utilisation qui en est faite, les
opérations d‟étalonnage, d‟entretien, de nettoyage ou de réparation avec les dates et le nom
des personnes ayant effectué ces opérations » (1).
Le Cahier de Route doit se trouver à côté de l‟équipement. Il doit exister depuis l‟installation
de l‟équipement au laboratoire, avant le démarrage des étapes de qualification.
Toutes les informations décrites aux GMP doivent y figurer, de même que les étapes de vie
du système (qualification, requalification) et les évènements (messages d‟erreurs…) pouvant
survenir tout au long de la vie du système

2.8.6 La vie du système après qualification initiale

2.8.6.1 Requalification
La qualification initiale d‟un équipement ne permettant pas de garantir le maintien de ce
statut, garantir la maîtrise de son équipement pendant toute sa période d‟exploitation est
nécessaire. Par conséquent, l‟objectif de la requalification est de reconduire le statut qualifié
de l‟équipement par l‟établissement de la preuve documentée que les paramètres critiques du
système ont été maitrisés et que l‟intégrité des données est toujours assurée.
La requalification est une vérification périodique du fonctionnement répétable du système
dans le temps. Les tests effectués en requalification ne doivent pas couvrir l‟ensemble des
tests de QI, QO et QP. Seuls les tests couvrant les points les plus critiques doivent être
effectués. La fréquence est en générale annuelle mais peut différer. L‟analyse de risque
détermine la périodicité de requalification.
La requalification s‟effectue via un protocole, rédigé par le responsable équipement ou tout
utilisateur formé qui connaît le sujet, sous la supervision du pôle qualification/validation de
l‟entreprise et du (des) responsable(s) de laboratoires CQ. La démarche de protocole, avec
fiches de tests vierges devant être approuvées par l‟AQ avant déroulement, est identique à
celle décrite au §2.5.1. Il est préférable de programmer les opérations de requalification un
mois avant échéance. Une étiquette de validité est apposée sur l‟instrument après chaque

92
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
requalification conforme. Cette étiquette comporte la période de validité du système jusqu‟à
la prochaine vérification périodique. En cas de dépassement de la durée de validité ou de non-
conformité lors du déroulement des tests, une étiquette de non-validité de l‟instrument se
substitue à celle de validité. L‟équipement est alors inutilisable jusqu‟à nouvel ordre. Toute
analyse qui serait effectuée durant cette période sera invalide.
La requalification est dite partielle lorsqu‟elle concerne les équipements et systèmes qualifiés
ayant subi des modifications techniques (changement d‟un composant). Elle est basée sur
l‟analyse de risques qui définit les tests devant être déroulés lors de la modification ou de la
réparation de chaque composant. En reprenant l‟Analyse de Risques de l‟osmomètre à point
de congélation, un exemple de tests à effectuer selon changement de certains composants est
disponible à l‟Annexe 2. Les protocoles/fiches de tests sont des documents vivants, liés à
l‟Analyse de Risques. Si un test n‟est plus pertinent, il faut le supprimer ou le remplacer par
un test plus adapté.

2.8.6.2 Revue périodique

La revue périodique est une revue de l‟ensemble du système, à savoir l‟équipement, le
logiciel et les utilisateurs. Le suivi correct du processus de gestion des modifications doit être
vérifié à intervalles réguliers. La périodicité est évaluée selon la criticité du système, sa
fréquence d‟utilisation, le volume de données générées, le nombre d‟utilisateurs potentiels…
L‟absence de modifications « sauvages » sans autorisation et sans traçabilité (par exemple,
modification d‟un paramètre critique d‟une méthode analytique au sein du logiciel) doit être
prouvée lors de cette revue. La vérification du relevé des divers incidents est également
effectuée, de même que la gestion des résultats hors spécifications ayant eu lieu durant la
période en cours et leur gestion. Les acteurs de cette revue sont le responsable équipement et
l‟administrateur du système informatisé. Cette revue sera approuvée par l‟Assurance Qualité.
La totalité des attendues de cette revue figurent à l‟Annexe O8 du GAMP 5 (7).

2.9 Enjeux de la stratégie de qualification

L‟objectif de ce travail, en regard des éléments réglementaires développés ci-dessus est
d‟adapter la démarche de qualification en fonction des catégories d‟équipements/systèmes et
en fonction de leur usage. La réglementation rend obligatoire la qualification des équipements

93
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
et SI associés de laboratoires. Cependant, la véritable démarche relève de stratégies plus
particulièrement déployées en mettant en commun l‟USP <1058> et le guide GAMP 5.
Rappelons que l‟USP <1058> va être prochainement révisée pour intégrer le GAMP 5. Quoi
qu‟il en soit, la stratégie reste toujours basée sur l‟évaluation des risques selon l‟ICH Q9.

Tableau8: Les enjeux de la stratégie de qualification

Objectifs Méthodes
Efficacité et productivité - Elimination des activités redondantes
tout au long du cycle de - Elimination des activités sans valeur ajoutée ou de
vie du système « Sur-qualité »
- Catégorisation des équipements/SI
- Evaluation des fournisseurs
- Optimisation du système documentaire
Garantir la fiabilité et - Comprendre l‟utilisation du système et du processus
l‟intégrité des données analytique associé
tout au long du cycle de - Comprendre à quoi servent les données générées
vie du système - Mettre en place une structure adaptée
- Mettre en place des moyens de contrôle
- Mettre en place des vérifications du fonctionnement du
système

94
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Chapitre Ⅲ: Qualification d’un

équipement type HPLC

95
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
3 Chapitre Ⅲ : Qualification d’un équipement type HPLC
Les tests de qualifications ont été développés spécifiquement pour garantir que l'instrument
fonctionne comme prévu sur des plages de fonctionnement représentatives, tout au long de la
durée de vie prise en charge par le fabricant de l'instrument

La qualification est constituée d‟une succession d‟étapes :

3.1 Qualification de Conception (QC) :

Avant l‟achat d‟un nouveau instrument décrit les exigences de l‟utilisateur et définir les
spécifications fonctionnelles et opérationnelles de l‟instrument. QC doit garantir que
l‟instrument acheté possède les fonctions et les performances nécessaires qui permettant une
application prévue approprie.

Tableau 9: Les éléments de la qualification de conception et ses exemples

Les éléments de conception Les exemples

Utilisation prévue Analyse des médicaments et des impuretés

Spécification des exigences de -Plus de 100 échantillons

l‟utilisateurs pour l‟analyse HPLC -analyse automatisée pendant la nuit

- limite de quantification 0.1%

-confirmation automatisée de l‟identité et de la pureté

des pics avec détection par DAD

-quantification automatisée des composes et

impression du rapport

Spécification fonctionnelle : -gradient binaire ou supérieur

Pompe -uv/vis 190/900nm

Détecteur - 100 échantillons, volume (0.5ul _5ml)

Echantillonneur automatique , contrôle de 15 à 60 C

Compartiment de colonne - Contrôle de système, acquisition des données

96
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Ordinateur pour les signaux et les spectres, intégration des
pics et quantification

- Evaluation spectral pour la pureté du pic et la

confirmation des composes

- Enregistrement électronique de tous les

chromatogrammes génère par le système

Spécification opérationnelle - Détecteur : bruit inférieur à 5*10-5

- Echantillonneur : précision de volumes injecte

inferieur à0.5%RSD, échantillon carryover
inferieur à0.5%

- Pompe : précision du temps de rétention

Instruction de l‟utilisateur - Manuel d‟utilisation sur papier

- Tutoriel sur l‟ordinateur

Qualification Le fournisseur doit fournir des procédures et des

services pour QI et QO

Maintenance Le fournisseur doit fournir la procédure de

maintenance et le calendrier recommander

L‟instrument doit inclure un retour d‟information sur

la maintenance pour un échange rapide de la pièce de
maintenance les plus importantes

La procédure de maintenances doit être fournie sur un

CD ROM multimédia

Formation Le fournisseur doit fournir une familiarisation et une

information

97
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

3.2 Qualification d’installation QI :

La qualification d‟installation établis que l‟instrument reçu comme la conception est spécifié

Il est établi que l‟instrument est correctement installé dans l‟environnement sélectionner et
que l‟environnement doit être approprier pour le fonctionnement de l‟instrument

Les échantillons de test vérifient une installation correcte de tous les modules, des
connections électriques et fluides

Avant l‟installation :

1- Obtenir les recommandations des fabricants pour les exigences des sites
d‟installation

2- Vérifier que les recommandations du fabricant (électricité, humidité, température)

sont respectées pour ce site

3- Laisser suffisamment d‟espace sur les étagères pour l‟équipement, les manuels
d‟utilisation …)

Pendant l‟installation

1- Comparer les équipements tels que reçu, avec la commande d‟achat

(accessoires, pièces de rechanges et logiciel)

2- Vérifier la documentation pour l‟exhaustivité (manuel d‟utilisation, instruction

de maintenance, procédure d‟exploitation, standard pour les tests, certificat de
validation et de sécurité

3- Vérifier les équipements pour tout dommage

4- Installer le matériel (ordinateur, équipements, raccord et tube pour les

connections fluides, colonne, câble d‟alimentation, et table de contrôle
d‟instrument)

5- Activer l‟instrument et s‟assurer que tous les modules mettent en évidence et

effectuaient un auto test électronique

98
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
6- Identifier une fiche de description de tout matériels, inclure des dessins si
nécessaire

7- Exécuter l‟échantillon de test et comparer les chromatogrammes avec celles de

références

8- Préparer un rapport d‟installation.

3.3 Qualification opérationnelle :

C’est le processus de démontrer qu’un instrument fonctionnera selon sa spécification opérationnelle
dans l’environnement sélectionner .il vérifie que le system HPLC compile avec la fonction clé et les
exigences opérationnelles indiquées dans la QC.

Dans la spécification opérationnelle, le fournisseur doit définir exactement les conditions qui
doivent être observer avec des conditions variables (par exemple : la température ambiante
déférente)

Avant d‟effectuer tout autre test d‟exécutions d‟abord l‟essai de fuite s‟il est échoué, la
plupart du test restant s‟échappera

Tableau 10/ Les paramètres des test et critères d‟acceptation de la QO

Paramètres Procédure Limite d‟utilisateur

Test de fuite Test de débit en +/- 5%

volume/temps ou
poids/temps

Dérive de ligne de base ASTM (American society for >2*10-3 AU

testing materiel) method
E19.09.20min

Bruit de ligne de base ASTM (American society for >5*10-5AU

testing materiel) method
E19.09.20min*1

Précision de volume 6*injection de caféine 0.3%RSD

d‟injection standard RSD surface de pic

99
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Précision de débit 6*injection de caféine 0.5% RSD (waters
standard RSD temps de 0.999(Agilent)
rétention

Linéarité de détecteur Injection 5 standard <1.5 AU, 5%RSD

Précision de longueur d onde Filter d „oxide d „holmium +/-1nm (waters)

+/-2nm (Agilent)

Précision de température Comparaison avec un +/-1C (waters)

appareil de mesure externe +/-2 (Agilent)

Echantillonneur et carryover Injection d‟un grand nombre >0.5% (waters )

d „injection de concentration >0.4% (Agilent )
déférents

Précision de la composition +/-1% (waters)

de la phase mobile (gradient) 0.999 % (Agilent)

3.4 La qualification de performance

C'est le processus de démonstration qu'un instrument fonctionne de manière cohérente selon
une spécification appropriée pour son utilisation de routine. Important ici est le mot
constamment. La fréquence de test est beaucoup plus élevée que pour OQ. Une autre
différence est que la PQ doit toujours être effectuée dans des conditions similaires à l'analyse
d'échantillon de routine. Pour un chromatogramme, cela signifie utiliser la même colonne, les
mêmes conditions d'analyse et les composés d'essai identiques ou similaires.
La QP doit être effectuée quotidiennement ou chaque fois que l'instrument est utilisé. *
La fréquence de test ne dépend uniquement de la stabilité de l'équipement mais de tout le
système qui peut contribuer à l'analyse du résultat
Pour un chromatographe en phase liquide, cela peut être la colonne de chromatographie ou
une lampe de détection
* Les critères de test et la fréquence doivent être déterminés lors de l'élaboration et de la
validation de la méthode analytique.

100
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
En pratique, PQ signifie test de stabilité du système, où les caractéristiques de performance
clés du système sont mesurées et comparées à une limite prédéfinie documentée.
Par exemple, un étalon bien caractérisé peut être injecté 5 ou 6 fois et l'écart type des
quantités est ensuite comparé à la valeur prédéfinie.
Les tests PQ sont spécifiques à l'application.
Si les limites de détection et de quantification sont critiques, le profil d'intensité des lampes
ou la ligne de base doit testés
* Ils doivent utiliser la même colonne et les mêmes produits chimiques pour l'échantillon
réel.
Le test doit inclure :
 Précision des quantités
 Précision des temps de rétention
 Résolution entre deux pics
 Largeur de pic à mi-hauteur
 Queue de pic
 Bruit de base
 Précision de la longueur d'onde du détecteur de longueur d'onde uv/vis, de
préférence en utilisant des filtres holmium - oxyde intégrés

101
QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Chapitre Ⅳ: Partie critique

102
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

4 Chapitre IV : Partie critique

4.1 Introduction

Localisation et correction du problème

Pour le dépannage de système HPLC, la meilleure approche est une approche

systématique qui mène à l‟identification du problème. Pour aider à identifier la source des
problèmes rencontres, on a cinq catégories principales :
 Anomalies liées à la pression
 Fuites
 Problèmes affectant le chromatogramme
 Problèmes liés à l‟injecteur
 Autres problèmes décèlent par l‟odorat, la vue ou l‟ouïe
Après la correction du problème, il est conseillé de consigner l‟incident dans le registre du
système, afin d‟aider à la résolution de tout problèmes ultérieurs.

PREVENTION :
En HPLC, il est possible d‟éviter un grand nombre de problèmes par une maintenance
préventive de routine. Par exemple, le remplacement des joints de la pompe a
inter- valles réguliers permet d'éviter les dysfonctionnements a ce niveau et
donc d'éviter les problèmes associes. Le paragraphe VII détaille les problèmes
les plus courants pour chaque module d'un système HPLC, ainsi que les
procédures de maintenance qui permettent d'en réduire la fréquence. II convient
de modifier ces suggestions pour les adapter a votre module de HPLC
particulier, puis de les inclure dans la routine de votre laboratoire.

4.2 PRESSION ANORMALE :

Une modification de Ia pression de fonctionnement est un signe indiquant un
éventuel problème. Choisissez ci-dessous Ia catégorie qui correspond le mieux
aux symptômes observes, puis suivez les conseils pour résoudre le problème.

103
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

. A- Aucune indication de pression, aucun débit :

Causes possibles Solutions

1.Pas de courant / hors-tension 1. Mettre sous tension
2. Fusible fondu 2. Remplacer le fusible

3. Réglage ou défaillance du 3. a. Vérifier que les réglages sont

contrôleur adéquats
b. Réparer ou remplacer le contrôleur
4. Piston casse 4. Remplacer le piston
5.Air piégé dans la pompe 5. Dégazer les solvants ; purger I „air
de la pompe, amorcer la pompe

6.Phase mobile insuffisante 6. a. remplir le réservoir

b. remplacer la frite d‟admission s‟il
est bloqué
7. Clapet(s) anti-retour défectueux 7. Remplacer le ou les clapets anti-
retour
8. Fuite importante 8. Serrer ou remplacer les raccords

B. aucune indication de pression, le débit et normal

Causes possibles Solutions
1. Compteur défectueux 1. Remplacer le compteur
2. Transducteur de pression défectueux 2. remplacer le transducteur

104
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

C. aucune élevée et uniforme

Causes possibles Solutions
1. Débit trop élevé 1. Ajuster le réglage
2. Fritté de la colonne bloqué 2. A/ rincer la colonne (si possible)
B/ remplacer le fritté*
C/ remplacer la colonne
3. Phase mobile incompatible 3. A/ utiliser une phase mobile adéquate
B/ laver la colonne
4. Colonne inadéquate 4. Utiliser une colonne adéquate
5. Blocage au niveau de l‟injecteur 5. A éliminer le blocage ou remplacer
l‟injecteur
6. Température de la colonne trop basse 6. Elever la température
7. Dysfonctionnement du contrôleur 7. Réparer ou remplacer le contrôleur
8. Colonne de garde bloqué 8. enlever/remplacer la colonne de garde
9. Filtre en ligne bloqué 9. Enlever/remplacer le filtre en ligne
Vérifier d‟abord la garantie du fabricant de la colonne .le retrait des raccords d‟extrémité peut
annuler la garantie. .

D. Pression basse et uniforme

Cause possible Solution

1. Débit réglé trop bas 1. Ajuster le débit
2. Fuite dans le système 2. Localiser et corriger la fuite
3. Colonne inadéquate 3.Utiliser une colonne adéquate

105
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
4.Température de la colonne trop élevée 4. Abaisser la température

5.Dysfonctionnement du 5.Réparer ou remplacer le contrôleur

contrôleur

E. Augmentation de Ia pression :

CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Voir paragraphe C Voir paragraphe C

F. Chute de Ia pression jusqu'à zero

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Voir paragraphes A et B Voir paragraphes A et B
G.Chute de Ia pression mais pas jusqu'a zero

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Voir paragraphe D Voir paragraphe D
H.Fluctuations de Ia pression

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Présence d'air dans la pompe a. Dégazer le solvant
b. Purger l'air de la pompe
Clapet(s) anti-retour défectueux
Remplacer le ou les clapets antiretours
Remplacer le joint de la pompe
Défaillance du joint de la pompe
Degazage insuffisant
a. Dégazer le solvant
b. Modifier les méthodes de dégazage
(utiliser le dégazeur en ligne Degassex TM)
Fuite dans le système Localiser et corriger Ia fuite
Utilisation d'un gradient d'élution Les fluctuations de la pression sont
normales en raison des variations de la

106
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
viscosité

4.3 FUITES
II est généralement possible d'arrêter les fuites en serrant ou en remplaçant
un raccord. Cependant, garder à L'esprit que les raccords métalliques de
compression trop serres peuvent fuir et que les dispositifs de serrage en
plastique peuvent s'user. Si une fuite de raccord persiste après un léger
resserrage du raccord, démontez-le et vérifier qu'il n'est pas endommagé (par
exemple, férules déformée ou présence de particules sur Ia surface
d'étanchéité). II convient d'éliminer les raccords endommages

A. Fuites au niveau des raccords

CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Raccord desserre Resserrer le raccord
Raccord endommage Resserrer le raccord
. Raccord excessivement serre* a. Desserrer et resserrer le raccord
b. Remplacer le raccord
Raccord sale
a. Démonter et nettoyer le raccord
b. Remplacer le raccord
Pièces inadaptées Utiliser des pièces de mème marque
B. Fuites au niveau de Ia pompe

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Clapets anti-retours desserres a. Resserrer le clapet anti-retour
(ne pas serrer excessivement)
b. Remplacer le clapet anti-retour
Raccords desserres Resserrer les raccords (ne pas
serrer excessivement)
Défaillance du joint du mélangeur a. Remplacer le joint du mélangeur.
b. Remplacer le mélangeur
Défaillance du joint du pompe Réparer ou remplacer le joint de Ia
pompe
Défaillance du transducteur de pression Réparer ou remplacer le transducteur
de pression.
Défaillance de l'amortisseur Remplacer I „amortisseur
d'impulsions d'impulsions

107
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Défaillance de la vanne doseuse a. Vérifier les diaphragmes, remplacer
si présence de fuites
b. Contrôler le bon état du

Vanne de purge . a. Serrer la vanne de purge

b. Remplacer Ia vanne de purge
*Utiliser des raccords d'extrémités avec dispositifs de serrage pour éviter des problèmes d‟étanchéité et la
nécessite de clés

C. Fuites au niveau de l'injecteur

CAUSE POSSIBLE Solution

Défaillance du joint du rotor Remonter ou remplacer l‟injecteur
Boucle d'échantillonnage bloquée Remplacer la boucle d‟échantillonnage
Joint de ('orifice d'injection desserre ajuster le joint
Diamètre inadéquate de l‟aiguille de Utiliser une seringue inadéquate
seringue
Siphonnement de Ia ligne Garder la ligne d‟évacuation au-
d'évacuation dessus de L‟évacuation de surface
Blocage de Ia ligne d'évacuation Remplacer la ligne d‟évacuation

D. Fuites au niveau de la colonne

CAUSE POSSIBLE Solution

. Raccord d'extrémité desserre resserrer le raccord d‟extrémité
démontrer, rincer le serre-joint et
Présence de remplissage de la remonter
colonne au niveau de Ia férule
Epaisseur incorrecte du fritte utiliser un fritte adéquat (voir
diagramme ci-dessous)

E. Fuites au niveau du détecteur

CAUSE POSSIBLE
Solution
Défaillance du joint de la cellule a. Eviter une contre pression
excessive
b. remplacer le joint statique
Fenêtre(s) de Ia cellule craquelée Remplacer la ou les fenêtre

108
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Fuites au niveau des raccords

.serrer ou remplacer les raccords

Ligne d'évacuation bloquée remplacer les conduit d‟évacuation

remonter ou remplacer la cuve de
Cuve de circulation bloquée circulation

4.4 PROBLEMES AFFECTANT LE CHROMATOGRAMME

Un grand nombre des problèmes rencontres avec le système d'HPLC se
manifestent sous forme de modifications du chromatogramme. Certains
d'entre eux peuvent
être résolus par des changements de matériel ; cependant d'autres exigent
des
modifications de Ia méthode d'essai. La sélection des types de colonne et
de phase mobile adéquats est un élément déterminant pour une c, bonne
chromatographie »

A. Etalement des pics

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Fritté bloqué a. Inverser la colonne de rinçage (si
possible)
b. Remplacer le fritté d'admission*
Vide à l‟intérieure de la colonne Combler le vide ou changer la colonne
Pic interferent a, Utiliser une colonne plus longue
b. Changer do phase mobile et/ou de
colonne/sélectivité
pH de Ia phase mobile incorrect Ajuster le pH. Dans le cas des
composes basiques, un pH plus faible
fournit généralement des faibles fournit
généralement des pics plus symétriques

109
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
. L'Echantillon réagit avec des sites a. Ajouter un réactif a paire d'ions
actifs ou un modificateur basique
volatil
b. Changer de colonne

B. Pics frontaux

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Température trop basse . Augmenter la température de la
colonne
Solvant d'échantillon incorrect . Utiliser Ia phase mobile comme
solvant d'injection
Surcharge d'échantillon (saturation de . Diminuer la concentration de
la colonne) échantillon
. Choix de colonne incorrect . Voir A.1. et A.2.

C. Pics divises

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Impuretés sur Ia colonne de garde ou Retirer la colonne de garde et tenter
sur l'admission de Ia colonne une analyse. Remplacer Ia colonne de
analytique garde
Pics divisés Conseil: Si la colonne analytique est
bouchée, l'inverser et Ia rincer. Si le
problèmes persiste, il se peut que la
colonne soit bloquée par des impuretés
fortement retenues. Utiliser une
procédure de restauration adéquate. Si
Ie problème persiste, it se peut que
l'admission soit bouchée. Changer le
fritté ou remplacer la colonne
Changer de solvant. Lorsque cela est
Solvant de échantillon incompatible possible, injecter les echantillons dans
avec la phase mobile la phase mobile

110
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Effets ne concernant pas Ia colonne a.Refaire les canalisations du système
(longueur des tubes etc.)
(tubes plus courts et plus étroits)
b. Utiliser une cellule de détecteur de
plus petit volume

D. D.Malformation des pics les plus hauts

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Surcharge d'échantillon (saturation de Diminuer la taille de échantillon
la colonne)
E. Malformation des pics précoces

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Solvant d'injection incorrect a.Diminuer le volume d'injection
b. Utiliser un solvant d'injection plus
faible

F. Etalement grandissant au fur et a mesure que k' augmente

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

a ajouter de la triméthylamine( échantillons
Effets de rétention secondaire mode basiques)
phase inverse b.ajouter de l‟acétate (échantillons acides )
c.ajouter du sel ou un tampon (echantions
ionique )
d.essayer une colonne differnte
. Effets de rétention secondaire mode a ajouter de la triméthylamine ( composé
phase normale basique)
b. ajouter de l‟acide acétique (composés
acide )

Effets de rétention secondaire, mode c.Ajouter de I „eau (composes

phase normale polyfonctionnel]
d. Essayer une méthode d'HPLC
différente
. Effets de rétention secondaire, paire Ajouter de la triméthylamine
d'ions (échantillons basiques)

111
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
G. Etalement des pics acides ou basiques

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Tamponnage inadéquat a.Utiliser une concentration de tampon
de 50 a 100 mM
b.Utiliser un tampon de pKa égal au pH
de la phase mobile

H. Pics supplémentaires

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Présence d'autres composants dans Normal

échantillon
a.Augmenter le temps de passage ou
Pic d'élution tardive d'injection
la pente du gradient
préalable b. Augmenter le débit
Absence de pics ou pics fantômes a.Vérifier la pureté de la phase mobile
b.Utiliser la phase mobile comme
solvant d'injection
c.Diminuer le volume d'injection

I. Dérives des temps de rétention

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Contrôle médiocre de Ia température . Utiliser un thermostat pour régler Ia
température de Ia colonne
Changement de Ia phase mobile Eviter les changements (évaporation,
réaction, etc.)

Equilibrage médiocre de Ia colonne Laisser davantage de temps pour

équilibrage de la colonne entre les
différents passages

112
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
J. Changements brusques des temps de rétention

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Changement de débit Réinitialiser le débit
Présence de bulles d'air dans la Purger l'air de la pompe
pompe
Phase mobile inadéquate a. Remplacer par une phase mobile
adéquatb .Installer un mélange de phase
mobile adéquat sur le contrôleur

K. Dérive de Ia ligne de base

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

. Fluctuations de la température de la Vérifier la température de la colonne et
colonne celle de Ia phase mobile; utiliser un
Changeur de chaleur avant le détecteur
Phase mobile non homogène . Utiliser des solvants de qualité HPLC
des sels de forte pureté et des additifs.
Dégazer Ia phase mobile avant
utilisation, faire barboter a l'hélium
pendant l'utilisation.
Accumulation d'impuretés ou d'air Rincer la cellule avec du méthanol ou
dans la
cellule du détecteur un autre solvant fort. Au besoin nettoyer
la cellule avec du HNO3 1N (ne jamais
utiliser d'HCI)
Ligne de sortie bouchée âpres le . Déboucher ou remplacer Ia ligne
détecteur Se reporter au manuel du détecteur
pour remplacer Ia fenêtre
Problème de mélange de la phase Corriger la composition/le débit Pour
mobile ou changement de débit éviter ce problème, surveiller
régulièrement Ia composition et le débit
Equilibrage lent de la colonne, en Rincer avec un solvant de force
particulier lors du changement de intermédiaire, faire passer 10 a 20
phase mobile volumes de colonne de Ia nouvelle
phase mobile avant l'analyse
Phase mobile contaminée, détériorée Vérifier la fabrication de Ia phase
ou préparée à partir de produits de
qualité douteuse mobile. Utiliser des substances
chimiques et des solvants de grade
HPLC.

113
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Les matériaux fortement retenus Utiliser une colonne de garde Au besoin,
dans l‟échantillon (k' élève) peuvent rincer la colonne avec un solvant fort entre les
Bluer sous forme de pics tits larges et injections ou périodiquement pendant
ressembler l'analyse
Phase mobile recyclée mais détecteur Réinitialiser la ligne de base Utiliser une
non réglé
nouvelle phase mobile lorsque la plage
dynamique du détecteur est dépassée

Le détecteur (UV) n'est pas réglé sur Modifier la longueur d‟onde vers une
l'absorbance maximale mais sur une pente de absorbance UV maximale
la courbe

L.Bruit de la ligne de base (irrégulier)

Causes possibles Solutions
1 . Fuite 1 . Voir paragraphe III. Vérifier
['absence de dessarage des raccords.
Vérifier l'absence de fuites,
d'accumulation de sels ou de bruits
anormaux dans la pompe. Au besoin,
changer les joints Contrôler l'absence
de fuites dans la cellule du détecteur
2 . Phase mobile contaminée, 2 . Verifier la fabrication de Ia phase
détériorée ou préparée a partir de mobile
matériaux de
3 . Solvants de la phase mobile non 3 . Ne choisir et n'utiliser que des
miscibles solvants miscibles
4 . Electronique du 4 . Isoler le détecteur et l'enregistreur
détecteur/enregistreur du point de vue électronique. Se
reporter au manuel d'instruction pour
corriger le problème .
5 . Air piégé dans le système 5 . Rincer le système avec un solvant
fort
6 . Air piégé dans le système 6 . Purger le détecteur. Installer un
dispositif de contre-pression âpres le
détecteur .
7 . . cellule du détecteur contaminée 7 . . Nettoyer la cellule on rinçant
(même une légère quantité d‟impuretés avec du HNO3. 1N (ne jamais utiliser
peut provoquer du bruit d'HCI)

114
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

8 . Lampe du détecteur faiblissant 8 . Remplacer Ia lampe

9 . Fuite de silice ou de remplissage de la 9 . Remplacer Ia colonne
colonne
10 . Mélangeur de phase mobile 10 . Réparer ou remplacer le
inadéquat ou ne fonctionnant pas mélangeur ; ou mélanger hors ligne si
correctement la phase mobile est isocratique
M . Pics larges :
Causes possibles Solutions
Changement de Ia composition de Ia Préparer une nouvelle phase mobile
phase mobile
Débit de la phase mobile trop faible Ajuster le débit
Fuites (en particulier entre Ia colonne Voir paragraphe III.
et le détecteur) Vérifier l'absence de desserrage
désaccords. V6rifier ('absence de fuites,
d'accumulation de sels ou de besoin
dans Ia pompe. Au besoin, changer les joints
ajuster les réglages
Réglages du détecteur incorrects Ajuster les réglages
a. Injecter un volume plus faible
Effets ne concernant pas Ia colonne : (par exemple 10 pl au lieu de 100
a. Saturation de la colonne pl) ou dilutions au 1/10 et 1/100 de
b. Temps de réponse du détecteur l‟échantillon
trop long ou volume de Ia cellule b. Raccourcir le temps de réponse
trop del/6 ou utiliser une cellule de plus
c. Tube trop long entre la colonne faible volume.
et le détecteur ou DI trop élève c. Utiliser un tube de DI 0,18 a 0,25
d. Temps de réponse de mm le plus court possible
l'enregistreur trop long d. Diminuer le temps de réponse

Concentration du tampon trop faible Augmenter Ia concentration

Colonne de garde contaminée/usée Remplacer Ia colonne de garde
Colonne contaminée/usée Remplacer Ia colonne par une nouvelle
colonne de même type.
Nombre de plateaux réduit
Si la nouvelle colonne produit des pics
symétriques, rincer I „ancienne colonne
avec un solvant fort.
Vide au niveau de ('admission de la Ouvrir l'extrémité de ('admission et
colonne combler le vide ou remplacer Ia colonne

115
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Le pic représente deux composes ou Changer l e type de la

plus, de résolution médiocre colonne pour améliorer
la séparation
Température de Ia colonne trop basse Augmenter Ia température Ne jamais
dépasser 75°C a moins qu'une
température
Constante de temps du détecteur trop Utiliser une constante de temps plus
élevée faible

N. Perte de résolution

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

.Phase mobile contaminée/usée Préparer une nouvelle phase mobile
Colonne de garde ou analytique bouché . Retirer la colonne de garde et tenter
une analyse. Remplacer Ia colonne de
garde au besoin. Si la colonne
analytique est bouchée, I „inverser et
rincer. Si le problème persiste, it se peut
que la colonne soit encrassée par des
impuretés fortement retenues. Utiliser
une procédure de rétablissement
adéquates le problème persiste, il se peut
que l'admission soit bouchée. Changer le
fritté ou remplacer Ia colonne.

O. Tous les pics sont trop petits

CAUSE POSSIBLE SOLUTION

Trop forte atténuation du détecteur. Réduire atténuation
Constante de temps du détecteur trop Utiliser une constante de temps plus
élevé faible
Volume d'injection trop faible Utiliser une boucle d'échantillonnage plus
grande
Branchement incorrect de l'enregistreur Utiliser un branchement adéquat

116
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

P . Tous les pics sont trop grands

Cause possible solution

Atténuation du détecteur trop faible . Augmenter l'atténuation
Volume d'injection trop élevée Utiliser une boucle d'échantillonnage de
plus faible volume
Branchement incorrect de l'enregistreur Utiliser un branchement adequat

4.5 PROBLEMES liés à l’injecteur

Ces problèmes sont généralement décèles lors de l‟utilisation de la vanne d‟injection.
les fuite au niveau des vannes d‟injection sont traitées au paragraphe 3 (fuite )

A . Injecteur manuel, difficile a tourné :

Cause possible solution

. Joint du rotor endommage Remonter ou remplacer Ia vanne
Rotor trop serre Régler Ia tension du rotor

B . Injecteur manuel, difficile a chargé :

Cause possible solution

Mauvais alignement de Ia vanne Régler I‟ alignement
Boucle bloquée Remplacer Ia boucle
Seringue sale Nettoyer ou remplacer Ia seringue
Conduits bloques Eliminer le blocage ou remplacer les
lignes
C . Auto-injecteur, ne tourne pas

Cause possible solution

Absence de pression d'air Fournir Ia pression
. Rotor trop serre Régler Ia tension du rotor
Mauvais alignement de Ia vanne Régler l'alignement de Ia vanne

117
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
D. Auto-injecteur, autres problèmes
Cause possible solution
Blocage Eliminer le blocage ou remplacer Ia
portion bloquée
Contrôleur défectueux
. Réparer ou remplacer le contrôleur

4.6 PROBLEMES DECELES PAR L'ODORAT, LA VUE OU L'OUIE

II est nécessaire de faire appel à tous vos sens pour identifier les problèmes en
HPLC. II convient de prendre l'habitude de consacrer quelques minutes taus les
jours pour mettre vos sens (hormis le gout) au contact de I'HPLC de manière a en «
ressentir » le fonctionnement normal. Cela vous aidera a localiser
rapidement les problèmes. Par exemple, il est possible de sentir une fuite avant
de la voir. La plupart des problèmes sont identifiés par la vue, et sont traites au
paragraphe précédent.

A. Odeur de solvant
Cause possible solution
Fuite
Voir paragraphe III
Voir paragraphe III a. Vérifier l'absence de débordement du
récipient a déchets
b.Localiser le déversement et le nettoyer

B. Odeur de « chaud

Cause possible solution

a. Verifier que la ventilation est adéquate,
Module en surchauffe
régler au besoin
b. b. Verifier le réglage de Ia température,
ajuster
c. c. Eteindre le module.
C. Relèves de compteur anormaux

Cause possible solution

Pression anormale Voir paragraphe II

118
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Problème lie au four de Ia colonne a. Vérifier les réglages, ajuster

b. Verifier le réglage de Ia limite, ajuster

D .alarmes

Cause possible solution

Fuite/déversement de solvant localisation et corriger la fuite/le
deversement

E. grincements et couinements
Cause possible solution
Lubrification médicore Lubrifier comme il convient

PROBLEMES CLES ET MAINTENANCE PREVENTIVE

Le diagramme ci-dessous énumère les problèmes les plus courants rencontrés avec
chaque module d'HPLC. La colonne de droite contient les pratiques de maintenance
préventive qui peuvent réduire le taux de défaillance .les nombres entre parenthèses

représentent les intervalles les recommandes entre deux actions de maintenance.

Les manuels de l'operateur et d'entretien de votre HPLC peuvent contenir des
recommandations supplémentaires pour la maintenance préventive de votre module
d‟HPLC.

A.
Réservoir
Probleme solution
Fritte d'admission bloque a. Remplacer le fritte (3 a 6 mois)
b. Filtrer la phase mobile, filtre de 0.5

119
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
pm

Bulles de gaz Dégazer la phase mobile

B . Pompe

Problème solution
Bulles d'air Dégazer la phase mobile
Défaillance du joint de Ia pompe Remplacer le joint de la pompe (03mois)
Défaillance du clapet anti-retour . Filtrer la phase mobile, utiliser le fritte
de la ligne d‟admission.
Conserver une pièce de rechange

C . Injecteur
Problèmes solution
Usure du joint du rotor a. Ne jamais serrer excessivement
b. Filtrer les échantillons

D . Colonne
Problèmes solution
Fritte bloque a. Filtrer la phase mobile
b. Filtrer les échantillons
c. Utiliser un filtre et/ou une colonne de
garde en ligne
Vide au niveau de la tête de Ia colonne a. Eviter une phase mobile de pH > 8
(pour la majorité des colonnes a base de
silice)
b. Utiliser une colonne de garde
c. Utiliser une pre-colonne (colonne de
saturation)

E . Détecteur
Problèmes solution
défaillance de Ia lampe ; réponse du a. Remplacer (6 mois) ou conserver une
détecteur diminuée ; bruit du détecteur lampe de rechange
accru
Bulles dans Ia cellule a. Garder Ia cellule propre
b. Utiliser un restricteur après la
cellule

120
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
c. Dégazer Ia phase mobile

F . Généralités

Problèmes solution
Dommages corrosifs/abrasifs Rincer le tampon de d'HPLC et nettoyer
lorsqu'elle n'est pas utilisée.

Deuxieme partie : Experimentation

121
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5 Chapitre V :La partie expérimentale

5.1 Objectif :
Dans le cadre de qualifier un équipement de type HPLC nous avons assisté à la
qualification de la chaine HPLC au niveau de laboratoire RezguiLab situé à CAFE
CHARGUI d‟Alger dont l‟objectif étant d‟établir une instruction opérationnelle
d‟utilisation de l‟équipement en se basant sur une série de qualifications (QO, QP)
réalisées par le fournisseur de l‟équipement d‟HPLC Agilent Séries 1100/1200.
. Cette instruction d‟utilisation servira comme protocole à suivre en routine par les opérateurs
(les bio-analystes).:
Noter : Une ChemStation portable n'est requise Équipements et solvants
Tapis de fermeture

Demi-plateau 40 x 2 ml
que si le système n'est pas connecté à une
Débitmètre numérique
Thermomètre digital
Flacons, bouchons et septa

Plaques de puits et

Kit d'étalons de caffeine

Kit d'étalons de glycérine
L'eau
Acétone
Capillaire de restriction

ChemStation pendant le fonctionnement

normal ou si la version de ChemStation
utilisée ne prend pas en charge les tests
nécessaires. De plus, les plaques à puits et
les tapis de fermeture ne sont nécessaires
que lorsqu'un échantillonneur à plaques à
puits (thermostaté) fait partie du système.
MODULE TEST
Toute pompe Precision / précision du
X X X
débit
Tous les UV Précision WL X X X X X
Tous les UV Holmium X X

122
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
TCC Précision de la
X
température
FLD Précision EM / EX WL X X
Tous les UV, RID Bruit / stabilité de la
X X
température
FLD Signal / bruit X X
Tous UV, MSD Inj. précision / report X X X X X
DÉBARRASSER Inj. précision / report X X X X X
FLD Inj. précision / report X X X X X
Tous UV, MSD Linéarité de la réponse X X X X X
DÉBARRASSER Linéarité de la réponse X X X X X
Bin / quat. et UV Composition dégradée X X X
Collecteur de fractions Collection de fractions X X X X X X
ALS / WPS Temp contenu du flacon /
X X X X
thermostaté puits. acc.

Equipements et solvants

5.2 Matériels

 Matériels constituant HPLC

- Ce protocole s'applique à la Agilent 1100/1200 Instrument HPLC de série qui
comprend les modules suivants.

- Pompe principale:

- Dégazeur

- Pompe quaternaries

- Échantillonneur:

123
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
- Échantillonneur automatique

- Compartiment à colonne thermostaté

- Détecteur:

- Détecteur à barrette de diodes

 Matériels utilisés dans la préparation des échantillons :

 Thermomètre digitale
 Micropipettes de haute précision.
 Filtre à base de cellulose.
 Conductimètre

 Verrerie
 Flacons volumétriques
 Béchers
 Fioles jaugées

5.3 Logiciel
L'instrument complet est testé dans sa configuration d'origine (test complet du
système) avec des performances automatisées et une évaluation des tests réalisés à
l'aide du logiciel ChemStation.
Si une ChemStation portable est fournie par Agilent Technologies,
1) utilise uniquement une ChemStation portable avec une ChemStation OQ / PV
valide effectuée sur cet appareil avant d'exécuter 1100/1200OQ / PV ;
2) joindre une copie du certificat Portable ChemStation OQ / PV à ce protocole ;
3) exécutez ChemStation Communications comme premier1100/1200 Test OQ / PV

5.4 Documentation
1. Rapport de correction des écarts

2. Rapport OQ / PV

124
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
3. Certificat OQ / PV de la ChemStation portable

4. Certificat d'étalonnage du débitmètre

5. Certificats de kit de normes OQ / PV

6. Certificat d'étalonnage du thermomètre numérique

7. Certificat de formation du représentant de service qualifié

5.5 Méthodes
- Préqualification
Avant d‟entamer la qualification de la chaine HPLC, il faut :
Avoir un certificat de qualification de la personne spécialiste responsable de cette action.
qualification, délivré par la société Agilent ;
Procéder à l‟installation de l‟équipement en vérifiant les connexions électriques ;
Procédure du rinçage et dégazage de l‟équipement de la chaine HPLC :
C‟est le nettoyage de système dont le but est d‟éliminer toute sorte d‟impuretés (traces de
selle de tampon…) et chasser les bulles d‟aires.
. Le nettoyage se fait avec de l‟eau ultra pure à 40° c et filtrer à 0.45 micromètre et à 1
microsiemens de conductivité.
On met les voix de la phase mobile dans l‟eau et on lance une purge à 5 ml et on ouvre la
vaine de purge à ¼ (90°) pour assurer la purge passe uniquement par la pompe et le dégazeur.
N.B il faut débrancher le détecteur avant commencer le rinçage

5.6 Procédure
5.6.1 Préparation du matériel
1. Installer le capillaire de restriction (colonne de qualification) à la place de la colonne
HPLC.

2. Installer le thermostat numérique avec les capteurs en contact étroit avec les échangeurs
de chaleur gauche et droit.

Utilisez la procédure du manuel de référence pour Compartiment à colonne thermostatée

(TCC) série1100/1200.

125
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
3. Effectuez l'une des actions suivantes.

a. Si un détecteur UV est installé, installe le débitmètre numérique avec l'entrée

connectée au capillaire de sortie du détecteur UV.

b. Si un RID est le seul détecteur, connecter la sortie du TCC à l'entrée du débitmètre (la
sortie du détecteur ne convient pas).

4. Dirigez les déchets du débitmètre dans un récipient approprié.

5. Pour les instruments équipés de pompes binaires ou quaternaires, procédez comme suit.

a. Installer le solvant A (eau de qualité HPLC) et B (0,5% d'acétone* dans de l'eau de

qualité HPLC) et purger les deux canaux individuellement à 5ml / minute pendant au
moins 10 minutes.

b. Si les canaux C et D de la pompe quaternaire doivent être qualifiés, purger également

le solvant A (eau de qualité HPLC) par le canal C et le solvant B (0,5% d'acétone *
dans l'eau de qualité HPLC) par le canal D à 5 ml / minute pendant un minimum de 10
minutes.

6. Pour les instruments équipés d'une pompe isocratique, installer le solvant A (eau de
qualité HPLC) et purgez à 5 ml / minute pendant au moins 10 minutes.

N.B* L'acétone à 0,5% n'est nécessaire que si le système comprend un détecteur UV et que le
test de composition du gradient est programmé.

5.6.2 Préparer la pompe de régénération

1. Si l'instrument comprend une pompe de régénération isocratique ou quaternaire, installe le
solvant A et purge le canal A à 5 ml / minute pendant au moins 10 minutes.

2. Si l'instrument comprend une pompe de régénération binaire, installe le solvant A et le

solvant B (tous deux de l'eau de qualité HPLC) et purgez les deux canaux
individuellement à 5 ml / minute pendant au moins 10 minutes.

5.6.3 Préparer l'instrument

1. Régler la température du thermostat de colonne sur 40C.

126
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
2. Si un échantillonneur automatique thermostaté est installé, réglez la température de son
thermostat sur 40C.

3. Une fois la purge terminée, chargez la méthode OQ FLOW.M

5.6.4 Préparation de l'échantillonneur automatique :

1. Bouchon lâche tous les flacons requis contenant les standards OQ / PV et les blancs et
charge les flacons dans le plateau d'échantillons comme indiqué dans le tableau ci-
dessous.

2. Si l'échantillonneur automatique est thermostaté, suivez ces étapes supplémentaires.

a. Distribue 1 ml d'eau de qualité HPLC dans chacun des quatre flacons de volume
nominal de 2 ml et sceller chaque flacon avec un capuchon et un septum.

b. Utilisez un cure-dent pour percer le centre de chaque septum, puis insérez environ 1
cm de tube en plastique de 1,6 mm de diamètre intérieur à travers le septum.

c. Placez les flacons aux positions 23, 28, 45 et 75 dans le plateau d'échantillons.

5.6.5 Terminer la préparation

Remettez en place les capots avant de tous les modules.

Tableau 11: Normes OQ / PV requises pour tout Détecteur UV série1100/1200 :

Kit de normes de P / N 50014486 lot: 465651AX20

caféine
N. Standard Position du
plateau
1 0,5 g / ml  5% de caféine dans l'eau 1
2 1.0 g / ml  3% de caféine dans l'eau 2
3 5,0 g / ml  2% de caféine dans l'eau 3
4 25,0 g / ml  2% de caféine dans l'eau 4
5 50,0 g / ml  2% de caféine dans l'eau 5

127
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
6 Vierge (phase mobile A) 6

5.7 Tests de qualification de performance/QO

5.7.1 Test de précision du débit

Cette procédure utilise un débitmètre numérique traçable pour déterminer l'exactitude et la

précision du débit pour l‟Instrument HPLC de série1100/1200.

L'utilisation d'HyperTerminal pour capturer les lectures de flux est facultative, pas
obligatoire.

Lorsque HyperTerminal est utilisé, les conditions préalables doivent être remplies. Sinon,
enregistrez simplement les mesures directement dans la boîte de dialogue ChemStation.

Conditions préalables spécifiques aux tests

 Configurez le débitmètre en mode terminal.

 Configurez HyperTerminal pour capturer automatiquement les lectures de débit.

Les instructions sont fournies dans le document Procédure de configuration de la mesure du

débit.

Tableau 12: Conditions préalables spécifiques aux tests

Méthode OQFLOW.M
Debit 2.000 ml / minute
Temps d'arrêt 10,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Tableau des temps Temps Debit
3.20 2. 000
3.21 1. 000
Temperature 40,0C

128
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Séquence OQFLOW.S
Ligne 1 1 blanc d'injection sans injection

Tableau 13: Les équipements de test

Description de l'équipement Débitmètre numérique

spécification Précision ± 1%, précision 0,5% RSD
Période de recalibrage 12 mois
Lors de l'utilisation du type de débitmètre le plus ancien (PSL68001), le temps de
collecte des mesures avec HyperTerminal peut être trop court. Modifiez la méthode
pour passer de 2 à 1 ml / minute à 3,7 minutes et arrêter l'analyse à 11 minutes.
A.09.03 fournit cette méthode / séquence personnalisée (oqflowa.m / s).

Procédure

Ce test est partiellement automatisé par le logiciel ChemStation.

Capturer des lectures avec HyperTerminal

1. Lorsque le débitmètre est allumé et que la tubulure est correctement connectée, le

débitmètre numérique affiche les lectures à des intervalles de temps cohérents.

Les intervalles varient en fonction du type de débitmètre utilisé et le temps écoulé est
affiché sous forme de caractère changeant.

2. Chaque fois que l'électrovanne s'ouvre (et clique), une lecture de débit est ajoutée au
fichier texte spécifié dans la configuration HyperTerminal.

3. Au temps de fonctionnement de 3,2 minutes, le débit passe à 1. 000 ml / minute.

4. Lorsque l'analyse s'arrête, fermez HyperTerminal.

5. Ouvrez le fichier texte, imprimez-le et ajoutez-le au protocole.

Entrer les mesures dans la ChemStation

129
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
1. Entrez les 10 valeurs du fichier texte qui apparaît avant le commutateur de débit dans le
tableau de gauche de la boîte de dialogue ChemStation.

2. Entrez la première lecture de débit après le changement de débit dans le champ approprié.

3. Entrez les 10 lectures du fichier texte qui apparaît avant la lecture finale de 1 ml / minute
dans le tableau de droite de la boîte de dialogue ChemStation.

Noter : Certains débitmètres indiquent 4 chiffres dans le fichier texte. Arrondissez ces
nombres à trois chiffres pour qu'ils correspondent à la boîte de dialogue : 4e chiffre
0-4, vers le bas ; 4e chiffre 5-9, vers le haut.

4. Cliquez sur Terminer le test.

Calculs

1. La précision du débit est calculée pour chaque débit comme la différence absolue en%
entre la moyenne des 10 lectures de débit et le débit réglé.

2. La précision du débit est calculée comme le% RSD des 10 lectures de débit pour chaque
débit.

3. La précision du débit et les valeurs de précision sont comparées aux limites d'acceptation
définies.

4. Une fois les tests d'exactitude / précision du débit terminés, retirez le débitmètre
numérique du capillaire d'entrée.

Tableau 14: Limites d'acceptation définies du test de précision de débit

Précision 5 %
RSD 0,50 %

5.7.2 Précision de la température du compartiment à colonnes

Cette procédure utilise un thermomètre numérique traçable pour déterminer la précision de la
température de l‟Instrument HPLC de série1100/1200

Tableau 15: Conditions de Précision de la température du compartiment à colonnes

130
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC
Temps d'arrêt 5,00 minutes
Température 40,0C

Ligne 1 1 injection sans injection de blanc

Tableau 16: Équipement du test de Précision de la température du compartiment à colonnes

Description de l'équipement Thermomètre digital

Specification Résolution d'affichage 0,1 ° C
Fournisseur d'équipement Voir la section Liste des équipements.
Période de recalibrage 12 mois

Procédure

Ce test est partiellement automatisé par le logiciel ChemStation.

1. Le thermomètre numérique affiche une lecture des températures des échangeurs de

chaleur gauche et droite à un point de consigne de 40,0C.

2. Entrez les 2 lectures dans la boîte de dialogue ChemStation pendant le test.

3. Le test se termine après 5 minutes.

4. La précision de la température est calculée pour chaque échangeur de chaleur comme la

différence absolue entre les lectures de température et le point de consigne.

5. La valeur de précision de la température est comparée aux limites d'acceptation

définies.

Tableau 17: Limites d'acceptation définies Précision de la température du compartiment à

colonnes

Précision à gauche 2,0 °C

Exactitude juste 2,0 °C

131
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5.7.3 Précision de la longueur d'onde - VWD

Cette procédure utilise une solution de caféine traçable pour déterminer la précision
de la longueur d'onde UV pour l‟Instrument HPLC de série 1100/1200

Tableau 18 : Conditions Précision de la longueur d'onde - VWD

Débit 1. 000 ml / minute

Temps d'arrêt 1,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Longueur d'onde 273 nm
Volume d'injecteur 20,0 l
Température 40,0C

Ligne 1 1 flacon d'injection 4 standard 4

Tableau 19: Équipement du test de Précision de la longueur d'onde - VWD

Description de l'équipement Kit d'étalons de caféine - Standard 4

Specification 25 µg / ml ± 2%
Fournisseur d'équipement Technologies Agilent

132
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Le spectre UV du pic dû au 20,0L'injection de l'étalon de caféine éluée à 1.000

ml / minute à partir du solvant A (eau de qualité HPLC) est mesurée.

2. Les longueurs d'onde des maximas d'absorbance trouvés dans le spectre de

l'échantillon sont comparées aux maxima et minimum définis pour la solution de
caféine ci-dessous.

3. La précision de longueur d'onde est calculée comme la différence absolue entre les
longueurs d'onde des maxima et minimum trouvés dans le spectre et les longueurs
d'onde des maxima et minimum définis.

4. Les valeurs de précision de longueur d'onde sont comparées aux limites

d'acceptation définies.

Tableau 20: Maximum et minimum définis pour la solution de caféine

1er maximum 205,0 nm

Le minimum 245,0 nm
2ème maximum 273,0 nm

Tableau 21: Limites d'acceptation définies de Précision de la longueur d'onde - VWD

Précision 1er maximum 2,0 nm

Précision minimum 2,0 nm
Précision 2ème maximum 2,0 nm

133
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5.7.4 Holmium
Cette procédure utilise un filtre interne en oxyde d'holmium traçable. C'est la
deuxième des deux procédures utilisées pour déterminer la précision de la longueur
d'onde UV / visible pour l‟Instrument HPLC de série1100/1200.

Tableau 22: Conditions d‟Holmium

debit 1 .000 ml / minute

Temps d'arrêt Automatique
Solvant A Eau de qualité HPLC

Filtre à l'oxyde d'holmium Détails dans le manuel de référence du détecteur ou

dans le certificat de conformité.

Équipement de test d‟Holmium

Aucun équipement de test spécifique n'est requis.

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Le spectre UV du filtre à oxyde d'holmium est mesuré avec un débit de 1.000 ml /

minute de solvant A (eau de qualité HPLC) à travers la cuve à circulation du
détecteur.

2. Les longueurs d'onde des maximas d'absorbance trouvés dans le spectre sont
comparées aux maximas définis pour le filtre à oxyde d'holmium (ci-dessous).

3. La précision de longueur d'onde est calculée comme la différence absolue entre

les longueurs d'onde des maxima trouvés dans le spectre et les longueurs d'onde
des maxima définis.

4. Les valeurs de précision de longueur d'onde sont comparées aux limites

d'acceptation définies.

134
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Tableau 23: Longueurs d'onde des maximums définis d‟Holmium

Détecteur de longueur Détecteur à barrette de

d'onde variable diodes / détecteur à
longueurs d'onde multiples
360,8 nm 361,0 nm
418,5 nm 453,7 nm
536,4 nm 536,7 nm

Limites d'acceptation définies d‟Holmium

Précision 2 Nm

5.7.5 Stabilité du bruit / de la température

Cette procédure basée sur la norme ASTM E 685-93 détermine le bruit, le dérapage,
la dérive et la stabilité en température de l‟Instrument HPLC de série1100/1200.

Tableau 24 : Conditions du test de Stabilité du bruit / de la température

Débit 1. 000 ml / minute

Temps d'arrêt 20,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Longueur d'onde 254 nm
Température 40,0C

Ligne 1 1 injection sans injection de blanc

135
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Equipment de test

Aucun équipement de test spécifique n'est requis.

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Le signal d'absorbance est acquis sur une période de 20 minutes à une longueur
d'onde de 254 nm avec un débit de 1.000 ml / minute de solvant A (eau de qualité
HPLC).

2. Si un TCC est installé, la température de ses côtés gauche et droit est surveillée
pendant cette période de 20 minutes à l'aide de capteurs internes.

3. Le bruit, la déambulation et la dérive sont calculés selon la méthode décrite dans

la norme ASTM E 685-93.

4. La stabilité de la température est calculée comme la différence absolue entre la

température la plus élevée et la plus basse surveillée des deux côtés du TCC.

5. Les valeurs de bruit, de dérapage, de dérive et de stabilité en température sont

comparées aux limites d'acceptation définies.

Tableau 25: Limites d'acceptation définies du Stabilité du bruit / de la température

Bruit 0,040 mAU Stabilité à gauche 0,50 °C*

TCC
VWD Errer 0,200 mAU Stabilité droite 0,50 °C*
Dérive 0,500 mAU / heure * S'applique uniquement si l'instrument
DAD comprend un Compartiment colonne
Bruit 0,050 mAU
/ thermostaté série1100/1200
MW Errer 0,200 mAU
D Dérive 5.000 mAU / heure

136
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5.7.6 Précision d'injection / caryover

Cette procédure utilise une solution de caféine traçable pour déterminer la précision
de l'injection et le report pour le 1100/1200 Instrument HPLC de série.

Tableau 26: Conditions du test de Précision d'injection / caryover

Débit 1 .000 ml / minute

Temps d'arrêt 1,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Longueur d'onde 273 nm
Volume d'injecteur 20,0 L
Température 40,0C

Ligne 1 Flacon de 3 injections 6 blancs

Ligne 2 Flacon de 6 injections 4 standard 4
Ligne 3 1 flacon d'injection 6 blancs

Tableau 27 : Équipement de test de Précision d'injection / caryover

Description de Kit d'étalons de caféine - Standard 4

Specification
l'équipement 25 µg / ml ± 2%
Fournisseur d'équipement Technologies Agilent

137
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Les surfaces et les hauteurs des pics sont mesurées pour trois 20,0l injections de
phase mobile suivies de six 20,0 l injections de caféine standard et un quatrième
20,0 l injection de phase mobile éluée à 1.000 ml / minute à partir du solvant A
(eau de qualité HPLC).

2. Si un injecteur manuel est installé, utilisez une technique d'injection correcte.

3. La précision d'injection est calculée pour la surface et la hauteur comme le% RSD
des réponses de pic standard de caféine (surface et hauteur).

4. Le rapport d'injection est calculé à la fois pour la surface et la hauteur comme la

réponse maximale (surface et hauteur) dans la quatrième injection à blanc, la
réponse maximale de la troisième injection à blanc étant soustraite en tant que
pourcentage de la réponse du sixième pic standard de caféine.

5. La précision d'injection et les valeurs de rapport sont comparées aux limites

d'acceptation définies.

Noter : Une valeur de rapport calculée de 0,00% ou moins indique seulement

qu'aucun rapport n'a été détecté par la méthode d'essai utilisée.

Limites d'acceptation définies

Zone de pic de précision 1000 % RSD

Hauteur de pointe de précision 2 000 % RSD
Zone de report 0,200 %
Porter sur la hauteur 0,400 %

138
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5.7.7 Linéarité de la réponse

Cette procédure utilise une solution de caféine traçable pour déterminer la linéarité de
la réponse pour l‟instrument HPLC de série1100/1200.
Tableau 28 : Conditions du test de linéarité de la réponse

Débit 1 .000 ml / minute

Temps d'arrêt 1,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Longueur d'onde 273 nm
Volume d'injecteur 20,0 l
Température 40,0C

Ligne 1 1 flacon d'injection 1 standard 1

Ligne 2 1 flacon d'injection 2 standard 2
Ligne 3 1 flacon d'injection 3 standard 3
Ligne 4 1 flacon d'injection 4 standard 4
Ligne 5 1 flacon d'injection 5 standard 5

Tableau 29: Équipement du test de linéarité de la réponse

Description de l'équipement Kit de normes de caféine

0,5 ± 5%, 1,0 ± 3%, 5,0 ± 2%, 25 ± 2% et 50 ±
Specification
2% µg / ml
Fournisseur d'équipement Technologies Agilent

139
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Les surfaces et les hauteurs des pics sont mesurées pour 20,0 l injections de 5
standards de caféine de concentration croissante éluées à 1.000 ml / minute à
partir du solvant A (eau de qualité HPLC).

2. Si un injecteur manuel est installé, utilisez une technique d'injection correcte.

3. La linéarité de la réponse est calculée comme la corrélation de la courbe

d'étalonnage pour la surface du pic. Les concentrations standard nominales sont
utilisées dans les calculs.

4. La corrélation est comparée aux limites d'acceptation définies.

Limites d'acceptation définies

Corrélation (limite basse) 0,9990

5.7.8 Gradient
Cette procédure utilise un traceur d'acétone pour determiner l'exactitude, la précision,
la linéarité et l'ondulation de la composition du gradient pour l‟Instrument HPLC de
série1100/1200.

Tableau 30: Conditions du test de gradient

Débit 2.000 ml / minute

Temps d'arrêt 10,00 minutes
Solvant A Eau de qualité HPLC
Solvant B 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC *
Tableau des temps Temps Solvant. B
0,01 100,0
8,00 100,0
8.01 0,0

140
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

265 nm
Longueur d'onde

Température 40,0C

* Si l'instrument comprend également un Détecteur sélectif de masse

ensérie1100/1200, le solvant B sera 0,1% d'acideacétique + 0,5% d'acétone dans de
l'eau de qualité HPLC.

141
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Débit 2.000 ml / minute

Temps d'arrêt 55,00 minutes + 10 minutes de pré-purge
Solvant A Eau de qualité HPLC
Solvant B 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC
Tableau des temps Temps Solvant. B
1,00 0,0
1,01 100,0
6,00 100,0
6.01 90,0
9h00 90,0
9.01 89,0
12h00 89,0
12.01 51,0
16.00 51,0
16.01 50,0
19.00 50,0
19.01 6,0
23,00 6,0
23.01 5,0
26,00 5,0
26.01 0,0
29,00 0,0
29.01 5,0
32,00 5,0
32.01 6,0
35,00 6,0
35.01 50,0
39,00 50,0
39,01 51,0

142
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

42,00 51,0
42,01 50,0
45,00 50,0
45,01 6,0
49,00 6,0
49,01 5,0
52,00 5,0
52.01 0,0
Longueur d'onde 265 nm
Température 40,0C

Ligne 1 1 blanc d'injection sans injection (flush)

Ligne 2 1 injection sans injection de blanc

Tableau 31: Équipement de test de gradient

Description du solvant Acétone

143
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Procedure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Avant le gradient de test, une pré-purge de 10 minutes du canal B (OQFLUSH.M) est

effectuée.

2. La hauteur moyenne et le bruit de crête à crête de chaque étape du signal d'absorbance à

265 nm généré par un gradient défini de 2.000 ml / minute de solvant A (eau de qualité
HPLC) et de solvant B (0,5% d'acétone en qualité HPLC l'eau*) est mesuré.

3. La hauteur et le bruit sont remis à l'échelle des valeurs d'absorbance aux valeurs de
composition (% B).

4. La précision de la composition est calculée pour chaque pas comme la différence absolue
entre la hauteur de pas mesurée remise à l'échelle et la valeur de composition de gradient
correspondante.

Pour la pompe quaternaire, la différence est typiquement beaucoup plus grande pour les
compositions% B plus élevées que pour les niveaux 6% et 5% B. Cela est dû au réglage
automatique du canal primaire de la pompe sur A.

5. La précision de composition est calculée comme le% SD des hauteurs de pas mesurées
rééchelonnées pour les 3 répétitions des valeurs de composition de gradient 50,0% B,
6,0% B et 5,0% B.

6. La linéarité de la composition est calculée comme la corrélation de la régression linéaire

des hauteurs de pas mesurées remises à l'échelle par rapport à la première répétition des
valeurs de composition du gradient 100,0% B, 90,0% B, 89,0% B, 51,0% B, 50,0% B,
6,0% B, 5,0% B et 0,0% B.

7. L'ondulation de la composition est calculée comme le bruit de crête à crête redimensionné

des étapes correspondant à chaque valeur de composition de gradient.

8. Le volume de retard de l'instrument est calculé comme le temps de retard multiplié par le
débit.

9. Les valeurs d'exactitude, de précision, de linéarité et d'ondulation de la composition sont

comparées aux limites d'acceptation définies.

144
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

* Si l'instrument comprend également un Détecteur sélectif de masse ensérie1100/1200, le

solvant B est 0,1% d'acideacétique plus 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC.
Limites d'acceptation définies

Ondulation 0,500 %
Pompe binaire de précision 0,700 %
Pompe quaternaire de précision 1.500 %
Précision 0,500 % DAKOTA DU SUD
Corrélation 0,999 Limite basse

145
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

5.7.9 Gradient- Canaux C / D

Cette procédure utilise un traceur d'acétone pour déterminer l'exactitude, la précision, la
linéarité et l'ondulation de la composition du gradient des canaux de pompe quaternaires C et
D pour l‟Instrument HPLC de série1100/1200.

Tableau 32: Conditions du est de gradient- Canaux C / D

Débit 2.000 ml / minute

Temps d'arrêt 10,00 minutes
Solvant C Eau de qualité HPLC
Solvant D 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC *
Tableau des temps Temps Solvant C Solvant D
0,01 0,0 100,0
8,00 0,0 100,0
8.01 100,0 0,0
Longueur d'onde 265 nm
Température 40,0C

* Si l'instrument comprend également un détecteur sélectif de masse

ensérie1100/1200, le solvant D sera 0,1% d'acideacétique + 0,5% d'acétonedans de
l'eau de qualité HPLC.

146
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Débit 2.000 ml / minute

Temps d'arrêt 55,00 minutes + 10 minutes de pré-purge
Solvant C Eau de qualité HPLC
Solvant D 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC
Tableau des temps Temps Solvant C Solvant D
1,00 100,0 0,0
1,01 0,0 100,0
6,00 0,0 100,0
6.01 10,0 90,0
9h00 10,0 90,0
9.01 11,0 89,0
12h00 11,0 89,0
12.01 49,0 51,0
16.00 49,0 51,0
16.01 50,0 50,0
19.00 50,0 50,0
19.01 94,0 6,0
23,00 94,0 6,0
23.01 95,0 5,0
26,00 95,0 5,0
26.01 100,0 0,0
29,00 100,0 0,0
29.01 95,0 5,0
32,00 95,0 5,0
32.01 94,0 6,0
35,00 94,0 6,0
35.01 50,0 50,0
39,00 50,0 50,0
39,01 49,0 51,0
42,00 49,0 51,0

147
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

42,01 50,0 50,0

45,00 50,0 50,0
45,01 94,0 6,0
49,00 94,0 6,0
49,01 95,0 5,0
52,00 95,0 5,0
52.01 100,0 0,0
Longueur d'onde 265 nm
Température 40,0C

Ligne 1 1 blanc d'injection sans injection (flush)

Ligne 2 1 injection sans injection de blanc

Tableau 33: Équipement du test de gradient- Canaux C / D

Description du solvant Acétone

148
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Procédure

Ce test est exécuté automatiquement par le logiciel ChemStation.

1. Avant le gradient de test, une pré-purge de 10 minutes du canal D (OQFLUSCD.M) est

effectuée.

2. La hauteur moyenne et le bruit de crête à crête de chaque étape du signal d'absorbance à

265 nm généré par un gradient défini de 2.000 ml / minute de solvant C (eau de qualité
HPLC) et de solvant D (0,5% d'acétone en qualité HPLC l'eau*) est mesuré.

3. La hauteur et le bruit sont rééchelonnés des valeurs d'absorbance aux valeurs de

composition (% D).

4. La précision de la composition est calculée pour chaque pas comme la différence absolue
entre la hauteur de pas mesurée remise à l'échelle et la valeur de composition de gradient
correspondante.

Pour la pompe quaternaire, la différence est typiquement beaucoup plus grande pour les
compositions% D plus élevées que pour les niveaux 6% et 5% D. Cela est dû au réglage
automatique du canal primaire de la pompe sur A.

5. La précision de composition est calculée comme le% SD des hauteurs de pas mesurées
rééchelonnées pour les 3 répétitions des valeurs de composition de gradient 50,0% D,
6,0% D et 5,0% D.

6. La linéarité de la composition est calculée comme la corrélation de la régression linéaire

des hauteurs de pas mesurées remises à l'échelle par rapport à la première répétition des
valeurs de composition du gradient 100,0% D, 90,0% D, 89,0% D, 51,0% D, 50,0% D,
6,0% D, 5,0% D et 0,0% D.

7. L'ondulation de la composition est calculée comme le bruit de crête à crête redimensionné

des étapes correspondant à chaque valeur de composition de gradient.

8. Le volume de retard de l'instrument est calculé comme le temps de retard multiplié par le
débit.

9. Les valeurs d'exactitude, de précision, de linéarité et d'ondulation de la composition sont

comparées aux limites d'acceptation définies.

149
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

* Si l'instrument comprend également un Détecteur sélectif de masse ensérie1100/1200, le

solvant D sera 0,1% d'acideacétique plus 0,5% d'acétone dans de l'eau de qualité HPLC.

Tableau 34: Limites d'acceptation définies du test de gradient- Canaux C / D

Ondulation 0,500 %
Pompe quaternaire de précision 1.500 %
Précision 0,500 %
Correlation 0,999 Limite basse

150
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Chapitre Ⅵ: Interprétation des

résultats

151
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

6 Chapitre VI : Interprétation des résultats

6.1 Précision du débit

Les résultats des tests de débit sont introduits dans le tableau :

Tableau 35: Les résultats des tests de débit

lecture Le débit réglé Débit réel (ml / min)

(ml / min)
1 2.000 1.990
2 2.000 1.990
3 2.000 1.990
4 2.000 1.990
5 2.000 1.990
6 2.000 1.990
7 2.000 1.990
8 2.000 1.980
9 2.000 1.980
10 2.000 1.980

Moyenne = 1,987 ml / RSD = 0,24%

lecture Le débit réglé Débit réel (ml / min)

(ml / min)
11 1.000 0.990
12 1.000 0.990
13 1.000 0.990
14 1.000 0.990
15 1.000 0.990
16 1.000 0.990
17 1.000 0.990
18 1.000 0.990
19 1.000 0.990
20 1.000 0.990

Moyenne = 0.990 ml / min RSD = 0,00%

152
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 34 : chromatogramme de débit de pompe

Limite Résultat Statut

Precision% 5 % 1% Acceptée

RSD % 0,50 % 0.2431% Acceptée

- La valeur de débit de la pompe calculé est dans l’intervalle de la norme arrêtée

153
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 35: chromatogramme de la longueur d‟onde

6.2 Précision de température

La température du compartiment à La température du compartiment à

colonne droite colonne gauche
40.30°c 40.40°c

154
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 36: chromatogramme de température

Limite Résultat Statut

Précision du côté droit 2°c -0.40°c Acceptée

Precision du côté gauche 2°c -0.30°c Acceptée

Les températures de la chambre et la température du compartiment à colonne droite et gauche

de la colonne répondent aux normes de température fixées au préalable.

6.3 Précision de la longueur d'onde

1er maximum 205,0 nm

Le minimum 244,0 nm
2ème maximum 271,0 nm

155
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 37: chromatogramme de précision de la longueur d'onde

Limite Résultat Statut

Precision 1er maximum 2.0nm 0.0 Acceptée

Précision minimum 2.0nm 1.0 Acceptée

Précision 2ème 2.0 Acceptéé

2.0nm
maximum

La langueur d’onde réponde aux normes fixées au préalable

156
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

6.4 Holmium

Requis (nm) Mesuré (nm) Différence (nm

360.8 360.8 0.0
418.5 418.5 0.0
536.4 536.5 0.1

La plus grande différence absolue =0,1

Figure 38 : chromatogramme de test d‟holmium

Limite Résultat Statut

Precision de holmium 2.0nm 0.1 Acceptée

Le test d’holmium répond aux normes fixées au préalable.

157
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

6.5 Stabilité du bruit / de la température

Test Limite Résultât Statut
bruit 0.04 1.72e-2 acceptée
Erreur 0.2 5.029e-2 acceptée
derive 0.5 1.753e-1 Acceptée
Temps de stabilite gauche 0.5 0.1 Acceptée

Temps de stabilite droite 0.5 0.06 Acceptée

Figure 39: chromatogramme de test de Stabilité du bruit / de la température

Le test de Stabilité du bruit / de la température répond aux normes.

158
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

6.6 Test de Précision d'injection/carryover

1/ Ligne 1: 3 injections de flacon 6 blanc

Échantillon d'informations : BLANK 1 - PHASE MOBILE

Ligne 1 Inj1 Inj2 Inj3

Temps de rétention 0.104 s 0.106 s 0.103 s

Ligne 2: 6 injections de flacon 4 standard 4

Échantillon d'informations : STD4 - 25,0ug / ml de caféine dans l'eau

Ligne 2 Inj1 Inj2 Inj3 Inj4 Inj5 Inj6

Temps de 0.116 0.115 0.116 0.115 0.116 0.116
rétention

159
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 40: chromatogramme Test de Précision d'injection/carryover 02

Ligne 3: 1 injection de flacon 6 blanc

Échantillon d'informations : BLANC 2 - PHASE MOBILE

Ligne 3 Inj1
Temps de rétention 0.104

160
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 41: chromatogramme Test de Précision d'injection/carryover 03

Tableau 36: Résultats du test de Précision d'injection/carryover

Le test Les résultats Les limites statut

Precision de surface 0.0537 1.000 % RSD acceptée

précision Hauteur de 0.3843 Acceptée

2.000 % RSD
pointe

surface de carryover -0.0009 0,200 % Acceptée

Hauteur de carryover -0.0593 0,400 % acceptée

Les Tests de Précision d'injection/carryover répondent à la norme

6.7 Teste de Linéarité de la réponse

Le test resultat Limite statut

Corrélation (limite basse) 0.999 0,9990 acceptée

Teste de Linéarité de la réponse répond aux normes

161
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 42 : chromatogramme de Teste de Linéarité de la réponse

6.8 Gradient de Composition

Tableau 37: Résultats du test de gradient de concentration

Les tests Résultats Limites statut

Ondulation 0.086 0,500% Acceptée

Pompe quaternaire de precision 0.752 1.500% Acceptée

Précision 0.033 0.500% Acceptée

Corrélation 0.999968 0,999 % Acceptée

Le test de Gradient de Composition répond aux normes

162
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Figure 46 : de précision de gradient

Au cours de cette étude consacrée à la qualification d‟une chaine HPLC au niveau du

Laboratoire REZGUI LAB situé à CAFE CHARGUI d‟Alger, les résultats de cette dernière
nous ont permis de tirer les conclusions suivantes :
- la chaine HPLC a été bien installée selon des conditions enviromentales convenables,
- Le logiciel ChemStation® qui pilote l‟ensemble du système est bien connecté aux différents
modules de la chaine.
- La vérification du fonctionnement de la chaine par le logiciel ChemStation® a donné des
résultats satisfaisants (corrects et bien précis).
Compte tenu des résultats des tests de la précision de débit et de température et de longueur
d‟onde, holmium, stabilité du bruit et de la température, précision d‟injection/caryover,
gradient, la linéarité (du débit, d‟injecteur et de détecteur)….etc. obtenus lors de la
qualification de la chaine HPLC ce dernier est déclaré conforme et qualifié en QI QO QP
pendant une année (périodicité de requalification).

163
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

conclusion
La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une technique largement utilisée pour
l'analyse des produits pharmaceutiques, des biomolécules, des polymères et de nombreux composés
organiques et ioniques, pour détecter, identifier et quantifier les différents constituants d‟un mélange
complexe.

Aujourd‟hui, la technologie HPLC créant de nouvelles opportunités de rentabilité et apportant un

nouveau sens au mot « qualité » dans les laboratoires analytiques.
Dans l‟industrie pharmaceutique, la qualification des équipements de laboratoires et systèmes
informatisés associés est le pré-requis indispensable à l‟obtention de données analytiques fiables
garantissant la protection des patients. La stratégie à mettre en place consiste à adapter la démarche de
qualification en fonction des catégories d‟équipements/systèmes
Qualification est constitué de quatre étapes :

 Qualification de conception : avant l‟achat des équipements

 Qualification d‟installation
1. Avant installation
2. Pendant l‟installation
 Qualification opérationnelle
 Qualification de performance

Nous avons pu déceler plusieurs anomalies et de ce fait proposer des solutions pour les différents
problèmes encore triés ;

Et pour dire que les appareils sont qualifiés ils doivent subir périodiquement des tests de
qualification dans un certain laps de temps (1ans).

Les résultats de qualification doivent être acceptés par les référence internationales

164
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

Les references :
[1]- 2007 HPLC For Pharmaceutical Scientists. YURI KAZAKEVICH – ROSARIO LOBRUTTO.

[2]- 2019 John Wiley & Sons, Inc. HPLC AND UHPLC FOR PARACTICING SCIENTISTS.

[3]- Chromatographie en phase liquide, Saint Etienne Ecole des mines.

[4]- SKOOG. WEST. HOLLER, Traduction et révision par BUESS-HERMAN Claude,

DAUCHOT-WEYMERRS Josette et DUMONT Freddy, Chimie Analytique (SKOOG.

WEST.HOLLER), 1997.

[5]- ChromatoguideAppendix F. 1, F.20.

[6]- MENDHAM et al 2008, Analyse Chimique Quantitative de VOGEL, traduction et révision

scientifique de la 6eédition anglaise par Jon Toulle et MoniaqueMottet.

[7]- DONG W.MICHAEL, 2006. Modern HPLC for Practicing Scientists, New Jersey: John

Wiley and sons.

[8]- DUBEREUIL.P, Introduction à la chromatographie.

[9]-AHUJA Satinder, 1989. Selectivity and delectability Optimization in HPLC, by John

Wiley.

[10]-Théorie de la chromatographie, cour de chromatographie (Master 2 chimie), Orsay.

[11]-Umber. J, Chromatographie Liquide Haute performance, Nancy-Metz.

[12]-Vanthuyne 2010, La chromatographie sur support chiraux, Montpelier.

[13]-VERGE, 2012. Chromatographie Liquide Haute performance, Paris.

[14]-Méthodes physiques de séparation et d'analyse / Méthodes de dosage des biomolécules,

Paris: Université Pierre et Marie Curie.

[15]-KAZAKEVICH Yuri, ROSARIO Lobrutto, 2007. HPLC for Pharmaceuticals Scientists,

New Jersey John and Sons.

[16]-Leblanc B.Purificaion des protéines, Université Sherbrooke.

[17]- Livre: MODERN HPLC FOR PRACTICING SCIENTISTS A JOHN WILEY & SONS, INC.,
PUBLICATION

165
 QUALIFICATION D’UN EQUIPEMENT TYPE : HPLC

[18]-Analyticaltoxicologyhttps://docplayer.fr/33421281-Principe-chromatographie-liquide-haute-
performance-hplc-sommaire.html

[19]- La chromatographie liquide haute performance (hplc) , V.JACOB , IHT de chimie de grenoble
22/08/2010 https://docplayer.fr/8331861-La-chromatographie-performance-hplc-salle-de-tp-de-genie-
analytique-presentation-theorique-de-la-hplc-type-de-document-dt.html#show_full_text

[20]- Analyse des modifications de la cytosine après oxydation de l‟ADN par digestion enzymatique et
HPLC-MS/MS , Par François Samson-Thibault Département de médecine nucléaire et
radiobiologie,Sherbrooke, Québec, Canada Janvier 2012 . https://docplayer.fr/11876761-Universite-de-
sherbrooke-analyse-des-modifications-de-la-cytosine-apres-oxydation-de-l-adn-par-digestion-
enzymatique-et-hplc-ms-ms.html

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