"Beta-lactames bicycliques pontés (N1-C3) : synthèse

et évaluations théorique, chimique et biochimique"

Urbach, Allan

ABSTRACT

Notre projet s'inscrit dans le cadre de la lutte contre la résistance bactérienne et considère une approche
radicalement opposée à tout ce qui a été fait jusqu'à présent dans le but de créer de nouveaux
antibiotiques. En nous basant sur l'hypothèse qu'il existe d'autres façons pour obtenir un composé réactif
que d'inclure le noyau beta-lactame dans une structure bicyclique très tendue (ou de l'activer par des effets
électrocapteurs), nous avons imaginé une famille de molécules où l'adaptabilité conformationnelle pourrait
être à l'origine de l'activité antibiotique. Il s'agit de beta-lactames bicycliques pontés obtenus au départ de
l'acétoxy-azétidin-2-one commerciale, où les positions N1 et C3 sont connectées par des cycles de tailles
variables (à partir de n et m = 1), incluant éventuellement des fonctions "activantes" de type carbonyle
et/ou une double liaison C=C. La stratégie choisie fait intervenir la métathèse des oléfines (RCM) pour
la formation du cycle pontant. Nos dérivés ont fait l'objet d'évaluations théoriques grâce à des modèles
d'hydrolyses chimique et enzymatique, et expérimentales grâce à des suivis RMN-1H de l'hydrolyse en
milieu basique et à des tests in vitro sur enzymes bactériennes et mammaliennes.

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Urbach, Allan. Beta-lactames bicycliques pontés (N1-C3) : synthèse et évaluations théorique, chimique et
biochimique. Prom. : Marchand-Brynaert, Jacqueline http://hdl.handle.net/2078.1/5338

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 Table des matières

Chapitre 1 - Protéases à sérine bactériennes et β–lactames ..................1

1. Les protéases à sérine....................................................................................................... 1

2. Les transpeptidases de la paroi bactérienne .................................................................. 3

3. La résistance bactérienne ................................................................................................ 5

3.1. Les β-lactamases ......................................................................................................... 6
3.2. Les PBPs résistantes.................................................................................................. 12

4. Les antibiotiques à noyau β-lactame ............................................................................ 13

4.1. Les pénames .............................................................................................................. 14
4.2. Les céphèmes ............................................................................................................ 17
4.3. Les pénèmes .............................................................................................................. 22
4.4. Les carbapénèmes ..................................................................................................... 23
4.5. Les monobactames .................................................................................................... 26

5. Réactivité des β -lactames............................................................................................... 30

5.1. Modèle de réactivité, une approche intuitive ............................................................ 30
5.2. Déficiences du modèle de réactivité.......................................................................... 31
5.2.1. Réactivité du cycle à 4 chaînons et des β–lactames bicycliques............................ 31
5.2.2. Distorsion de la géométrie et résonance................................................................. 32
5.3. Structure 3-D et activité antibiotique ........................................................................ 36

6. Conclusion....................................................................................................................... 41

Chapitre 2 – Objectifs et Stratégie ........................................... 43

1. Objectifs .......................................................................................................................... 43

2. Stratégie de synthèse ...................................................................................................... 47

3. Evaluation de la réactivité théorique, chimique et biochimique des composés

synthétisés ........................................................................................................................... 47

Chapitre 3 - Accès aux précurseurs de β-lactames bicycliques pontés..... 49

1. Synthèse à partir d’azétidin-2-one................................................................................ 49

1.1. Première voie de synthèse des précurseurs ............................................................... 49
1.1.1. N-alkylation du β-lactame...................................................................................... 50
1.1.2. C3-alkylation du β-lactame .................................................................................... 54
1.2. Seconde voie de synthèse des précurseurs ................................................................ 54
 1.2.1. Protection de la fonction lactame ........................................................................... 55
1.2.2. C3-alkylation du β-lactame N-silylé ...................................................................... 56
1.2.3. Déprotection de la fonction lactame....................................................................... 60
1.2.4. N-acylation de la fonction lactame......................................................................... 61

2. Création de synthon de départ : Synthèse à partir de l’acétoxy azétidinone ........... 65

2.1. Substitution en C4 du groupement acétate par allylation indanique ......................... 68
2.1.1. Introduction ............................................................................................................ 68
2.1.2. L’allylation de dérivés carbonylés ......................................................................... 69
2.1.3. L’allylation des aldimines ...................................................................................... 70
2.1.4. Application de l’allylation indanique à la synthèse de composés .......................... 71
β-lactamiques ................................................................................................................... 71
2.2. Substitution du groupement acétate par un hydrogène ............................................. 76
2.2.1. Introduction ............................................................................................................ 76
2.2.2. La réduction aux hydrures...................................................................................... 76
2.2.3. La réduction radicalaire.......................................................................................... 77
2.2.4. Aspect mécanistique............................................................................................... 81

3. Synthèses à partir de l’acétoxy-azétidinone et de ses dérivés..................................... 85

3.1. Synthèse de composés bis-acylés .............................................................................. 86
3.2. Synthèse de composés bis-alkylés............................................................................. 93
3.3. Synthèse de composés mixtes ................................................................................... 99
3.3.1. Les dérivés mixtes carbonylés................................................................................ 99
3.3.2. Les dérivés mixtes silylés..................................................................................... 100
3.4. Synthèse de composés possédant une fonction acide carboxylique masquée......... 102

Chapitre 4. Accès aux β–lactames bicycliques (N1-C3) pontés ............. 113

1. La métathèse des oléfines............................................................................................. 113

1.1. La métathèse des oléfines et ses applications.......................................................... 116
1.2. Les catalyseurs ........................................................................................................ 117
1.2.1. Les catalyseurs au Molybdène et au Tungstène ................................................... 117
1.2.2. Les catalyseurs au Ruthénium.............................................................................. 119
1.3. La métathèse des hétérocycles azotés ..................................................................... 122
1.4. Les hétérocycles bicycliques pontés........................................................................ 125
1.5. Les composés macrocycliques ................................................................................ 126
1.6. Les β-lactames bicycliques ..................................................................................... 128

2. Application de la RCM à la synthèse de β–lactames bicycliques pontés (N1-C3).. 135

2.1. Cyclisation des précurseurs N-acylés...................................................................... 138
2.1.1. Les dérivés bis-acylés........................................................................................... 138
2.1.2. Evaluation théorique de la formation des β–lactames bicycliques 066-068 ........ 139
2.1.3. Les dérivés O-silylés ............................................................................................ 142
2.2. Cyclisation des précurseurs N-alkylés .................................................................... 143
2.2.1. Synthèse des β–lactames bicycliques pontés (N1-C3) à 13 chaînons.................. 143
2.2.2. Synthèse de β–lactames bicycliques pontés (N1-C3) à 12 chaînons ................... 146
2.2.3. Evaluation théorique de la formation des bicycles à 12 et 13 chaînons............... 148

3. Hydrogénation des β–lactames bicycliques pontés (N1-C3)..................................... 153

Chapitre 5 – Evaluations Théorique et Biochimique .......................... 163

1. Evaluation théorique de la réactivité.......................................................................... 163

1.1. Mécanisme de l’hydrolyse des β-lactames.............................................................. 163
1.2. Effets de solvant sur l’hydrolyse ............................................................................. 164
1.3. Choix de la méthode et du niveau de calcul............................................................ 166
1.4. Résultats .................................................................................................................. 169
1.4.1. Réactivité vis-à-vis d’un nucléophile anionique (-OH) ....................................... 169
1.4.2. Réactivité vis-à-vis d’un nucléophile neutre (H2O-H2O)..................................... 183
1.4.3. Utilisation d’un modèle de cavité enzymatique ................................................... 191

2. Evaluation in vitro de l’activité biochimique............................................................. 201

3. Evaluation de l’activité biochimique vis-à-vis de l’élastase pancréatique de porc 206

Chapitre 6 – Conclusions et perspectives ..................................... 219

1. Conclusions ................................................................................................................... 219

2. Perspectives................................................................................................................... 222

Chapitre 7- Partie expérimentale ............................................. 229

Bibliographie..................................................................... 397
Chapitre 1
 Chapitre 1

Chapitre 1 - Protéases à sérine bactériennes et β–lactames

1. Les protéases à sérine

Les protéases à sérine sont des enzymes ubiquitaires (eucaryotes, procaryotes, archae-
bactéries, virus) dont la fonction est de cliver les protéines en peptides (schéma 1) (Hedstrom,
L. 2002).

O O
Protéase
R2 + RNH2
R1 N R1 OH
H H2 O

schéma 1 : Fonction des protéases à sérine.

On les nomme ainsi parce qu’on distingue dans le site actif de ces enzymes une sérine,
essentielle à la catalyse, qui va jouer le rôle d’agent nucléophile. Cette classe de protéases se
caractérise par la présence d'une triade catalytique composée de résidus conservés, par
exemple Asp-His-Ser dans le cas des enzymes appartenant à la superfamille des
chymotrypsines.

D'un point de vue mécanistique, un transfert de charge assisté par l'Histidine 57

permet d’exalter la nucléophilie de la sérine 195. L'intermédiaire tétraédrique formé est
stabilisé par les NH des liaisons amides des résidus Ser 195 et Gly 193. Ces derniers forment
la cavité à oxyanion. Ensuite la réaction évolue vers la formation d'un complexe covalent de
type acyl-enzyme, finalement hydrolysé pour régénérer l'enzyme libre (schéma 2).

Les protéases à sérine accomplissent cette action très efficacement puisque la vitesse
d'hydrolyse est de l'ordre de 1010 fois supérieure à celle de la réaction non catalysée.

1
 Chapitre 1

CAVITE A OXYANION

Ser 195 Gly193

HN NH HN NH HN NH
O O O

R NHR'
R NHR' R'NH2
O R
O
Ser 195 O H O H
H
N HN N

NH O NH O NH O
O O O

His 57 Asp 102

INTERMEDIAIRE TETRAEDRIQUE ACYL-ENZYME

HN NH NH NH

HO R O
O
O H
R OH

HN N

NH O NH O
O O

INTERMEDIAIRE TETRAEDRIQUE

schéma 2 : Mécanisme général des protéases à sérine.

Chez l’homme, les enzymes de type chymotrypsine sont impliquées dans de nombreux
processus physiologiques tels que la digestion (trypsine), la reproduction (acroséine), la
réponse immunitaire (élastase neutrophile) ou encore l’activation séquentielle menant à la
coagulation du sang, la fixation du complément et la fibrinolyse (thrombine, plasmine).
De façon tout aussi essentielle, les protéases à sérine sont présentes dans les bactéries où elles
participent soit à la biosynthèse de la paroi, soit à la défense de l’organisme.
L'omniprésence de ces protéines leur donne une importance considérable et justifie qu'elles
soient devenues des cibles thérapeutiques.

2
 Chapitre 1

2. Les transpeptidases de la paroi bactérienne

Les transpeptidases (D-alanyl-D-alanine-peptidases) sont des protéines situées dans la

membrane interne des bactéries. Ce sont des enzymes dont les fonctions sont la biosynthèse et
la réparation de la paroi bactérienne. Celle-ci confère à la bactérie la résistance mécanique
nécessaire à sa survie car l'organisme ne possède pas la capacité de réguler les variations de
pression osmotique du milieu extérieur (Mascaretti, O. A., 2003 ; Fisher, J. F. 2005).
Elle est formée par la réticulation de chaînes linéaires polysaccharidiques reliées entre elles
par des "ponts peptidiques". Une unité de peptidoglycane correspond à un hétérodimère de N-
acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique. Ce dernier est modifié par un pentapeptide
dont la composition peut varier selon les espèces. Seuls les deux résidus terminaux D-ala-D-
ala sont conservés.
Les D, D-peptidases catalysent l’aminolyse, grâce à une sérine du site actif, du motif N-acyl-
D-alanyl-D-alanine et effectuent ainsi le lien avec une autre unité peptidoglycane (schéma 3).

D-Ala
O C
HO Ser O Ser
O C
NH
NH2
TPase TPase

schéma 3 : Réticulation du peptidoglycane catalysée par les transpeptidases

(Walsh, C. 2000).

Les antibiotiques de type β–lactame, du fait d’analogies structurales avec le substrat,

inhibent de façon efficace l’activité de ces enzymes qu’on regroupe sous le terme général de
PBPs (Penicillin Binding Proteins) (figure 1).

3
 Chapitre 1

O
O
H H H3 C
S CH3 R C H
C C
C
R N α HN α
H C N
CH3 C NH
C CH3
O
O C
H COOH
H
COOH

la flèche indique la liaison peptidique clivée

figure 1 : Comparaison inhibiteur/substrat.

L’introduction des antibiotiques de type β-lactame dans notre pharmacopée représente l’une
des avancées les plus importantes faites dans le domaine de la santé, depuis plus d’un demi-
siècle. Grâce à leur grande efficacité, leur faible coût et leur sélectivité (peu d’effets
secondaires), ces molécules constituent aujourd’hui encore des armes puissantes pour lutter
contre la menace bactérienne.
Leur sélectivité provient du fait qu’aucun équivalent, fonctionnel ou structural, des enzymes-
cibles n’existe dans les cellules humaines. Ainsi, ils vont réagir de manière spécifique pour
former un complexe acyl-enzyme, covalent et stable dont l’hydrolyse lente est responsable de
l’inactivation de la protéine (schéma 4).

R R
S S

O
N HN
O O
COO Ser COO
HO Ser

TPase TPase

schéma 4 : mode d'action des β-lactames.

4
 Chapitre 1

Le taux de réticulation de la paroi s’en trouve diminué, la fragilisant et rendant la bactérie

plus sensible aux variations de pression osmotique, et dès lors à la lyse cellulaire.

3. La résistance bactérienne

En 1940, quelques temps avant les premières utilisations médicales de la pénicilline,

E. P. Abraham et E. Chain identifiaient une enzyme bactérienne capable d’hydrolyser le
noyau β–lactame des antibiotiques et notaient la possibilité pour celle-ci, de diminuer
l’efficacité des futurs traitements à base de pénicilline. Cependant, il fut jugé improbable que
le développement d’une résistance puisse atteindre les proportions auxquelles nous sommes
actuellement confrontés. La fréquence d’apparition de mutants résistants était alors estimée à
10-9 (ou moins) /génération et les connaissances de l’époque ne permettaient pas de suspecter
que les gènes impliqués pouvaient être incorporés dans des éléments de réplication autonomes
et transférables tels que les plasmides. On sait aujourd’hui que les bactéries sont capables
d’échanger et de collecter l’information (matériel génétique), avec une extraordinaire facilité,
même entre espèces différentes (Knowles, J. R. 1985 ; Walsh, C. 2000 ; Davies, J. 1994 ;
Neu, H. C. 1992).
Pour contrer l'action des antibiotiques, les bactéries ont ainsi mis en place des systèmes de
défense. Comme pour la plupart des agents antimicrobiens, les β–lactames sont rendus
inactifs par le biais de trois mécanismes primaires de résistance, dont les deux premiers font
intervenir des protéases à sérine :

1) Le premier mécanisme est la production d’enzymes qui dégradent ou modifient

l’antibiotique avant qu’il n’atteigne sa cible. A ce titre, les β-lactamases ont pour substrat les
molécules à noyau β–lactame et sont largement disséminées à travers les bactéries Gram (+)
et Gram (-).
2) Le second mécanisme est l’altération de la cible. C’est le cas de transpeptidases modifiées
(PBP2a, PBP2x, PBP5fm) qui représentent aujourd’hui une des causes majeures de résistance
des organismes pathogènes devenus problématiques (Staphylococcus aureus, Streptococcus
pneumoniae, Enteroccocus faecium).
3) Le dernier mécanisme consiste à empêcher l’antibiotique d’accéder à sa cible au moyen
d’une diminution de la perméabilité membranaire ou de pompe d’efflux. Cette dernière option

5
 Chapitre 1

est responsable via les pompes MexA,B-OprM, de la résistance de Pseudomonas aeruginosa.

3.1. Les β-lactamases

On distingue sur base de similarité de séquences, 4 classes de β-lactamases : A, B, C

et D. Trois d'entre elles contiennent des protéases à sérine (A, C et D) alors que la classe B
concerne des métalloprotéases zinc-dépendantes (Matagne, A. 1998). Les différences entre A,
C et D se situent dans la nature des résidus basiques intervenant dans les étapes d’acylation et
de déacylation.
Les métalloprotéases sont quant à elles totalement distinctes des enzymes à sérine dans leurs
séquences, leurs formes et leurs mécanismes catalytiques.
Les β-lactamases de classes A, C et D et le domaine transpeptidase des PBPs (Penicillin
Binding Proteins) appartiennent à la superfamille des enzymes à sérine qui reconnaissent la
pénicilline (ASPRE). On retrouve dans la structure primaire de ces protéines, trois motifs
[SXXK, S(Y)XN(V) et KT(S)G], une topologie semblable et un même mécanisme
d'hydrolyse des β-lactames. Ces trois caractéristiques supportent l'hypothèse que ces enzymes
dérivent d'un ancêtre commun (figure 2) (Chesnel, L. 2002).

figure 2 : Structure tertiaire de la D,D-peptidase S. R61 (A), la β-lactamase de classe C de E.

cloacae (B) et la β-lactamase de classe A, TEM (C) (Matagne, A. 1998).

6
 Chapitre 1

Une fois exprimées, ces enzymes sont secrétées dans le périplasme (Gram-), liées à la
membrane, ou excrétées dans le milieu extérieur (Gram+). Elles catalysent l'ouverture du
cycle β-lactame transformant ainsi l'inhibiteur en composé inactif (schéma 5).

R R
β-lactamase
O
NH
N H2 O
O OH

schéma 5 : action des β-lactamases.

Si l'on sait depuis les années 70 que les protéases à sérine comme l'α-chymotrypsine,
l'élastase, ou encore la papaïne, enzyme à cysteine, forment un intermédiaire acyl(-thio)-
enzyme au cours de leur cycle catalytique, ce n'est qu'au début des années 80 que l'hypothèse
a pu être vérifiée pour les β-lactamases.
En 1980, Fisher et Knowles ont démontré que l'hydrolyse d'un substrat lent comme la
céfoxitine par la β-lactamase RTEM-2 passe par la formation d'un complexe intermédiaire lié
de façon covalente à l'enzyme et qui a les caractéristiques spectroscopiques d'un lien ester
(Fisher, J. 1980).
Dés lors, comme pour les protéases à sérine, le mécanisme de la β-lactamase a pu être décrit
par un modèle à trois étapes où [ES] représente un complexe enzyme-substrat non covalent et
[ES*], l'intermédiaire acyl-enzyme (schéma 6).

k1 k2 k3
E+S ES ES* E+P
k-1

schéma 6 : équation enzymatique de l’hydrolyse des β–lactames catalysée

par les β–lactamases de classe A, C et D.

7
 Chapitre 1

Ce qui différencie les β-lactamases des D, D-peptidases face aux antibiotiques, c'est la valeur
de la constante de vitesse d'hydrolyse de [ES*] (k3). En effet, pour les D, D-peptidases, celle-
ci dépasse difficilement 0,001 s-1 (Matagne, A. 1998). L'hydrolyse lente provoque
l'accumulation de l'intermédiaire (t1/2 >10 minutes) et est ainsi responsable de l'inhibition
(Frère, J. M. 1992).
En revanche, des travaux réalisés par Frère, Matagne et Waley ont montré que le k3 des β-
lactamases de B. Licheniformis et Streptomyces albus G était supérieur à 104 s-1 ce qui
explique la redoutable efficacité de ce mécanisme de résistance (Matagne, A. 1998).
Les informations structurales fournies par des études cristallographiques ont mis en évidence
qu'au moins quatre résidus du site actif des β-lactamases de classe A intervenaient dans la
catalyse: Ser70, Lys73, Lys234 et Glu166 associé à une molécule d'eau (W1) (Herzberg, O.
1987).
Des expériences de mutagénèse dirigée menées sur cette enzyme impliquent de façon
formelle le couple Glu166/W1 dans l'étape de déacylation, W1 jouant le rôle de relais dans le
transfert de charge aboutissant à l'hydrolyse (Strydnaka, N. C. J. 1992 ; Adachi, H. 1991 ;
Escobar, W. A. 1991 ; Guillaume, G. 1997).
Si cette hypothèse est communément admise, pour l'étape d'acylation, deux écoles s'opposent
encore.
L'identité du résidu activant la sérine 70 est sujet à controverse: Glu166 ou Lys73 (schéma 7)?

R R

N N
O O
O
O
H
H
O NH2
H H

O
O

Glu 166 Lys 73

schéma 7 : Les deux voies possibles de l'acylation.

8
 Chapitre 1

Selon Strydnaka et ses collaborateurs, l'hydrolyse du noyau β-lactame fait intervenir un résidu
différent pour chaque étape (Strydnaka, N.C.J. 1992). C'est la Lys 73, qui comme l'Hist 57
dans les protéases à sérine type chymotrypsine, joue le rôle d'activateur. Pour cela, le
groupement basique de la chaîne latérale doit être sous forme NH2. Or, le pKa de l'acide
aminé ne devrait pas le permettre.
D'après certains auteurs, une diminution du pKa de la lysine (5-6 unités de pH) pourrait
résulter d'un important réseau de liaisons hydrogène formé avec les résidus Ser70, Asn132 et
le carbonyle de la Ser130. Pourrait également entrer en jeu, une zone fortement
électropositive créée par le dipôle de l'hélice-α2, le groupe alkylammonium de la Lys234, et
probablement d'autres résidus basiques localisés près du site actif (Herzberg, O. 1987 ;
Strydnaka, N. C. J. 1992). Cependant de nombreux éléments viennent s'opposer à cette
hypothèse.
En effet, Gibson et ses collaborateurs ont montré que l'accumulation de l'acyl-enzyme pour
des mutants Glu166Xaa pouvait provenir d'une diminution simultanée des paramètres
cinétiques liés aux deux étapes, acylation et déacylation (Gibson, R. M. 1990).
Guillaume et son équipe ont également montré que si la mutation Glu166Asn transformait la
β-lactamase TEM-1 en PBP (k3 pour la benzylpénicilline diminué de 109), le k2/Ks était aussi
modifié d'un facteur 103 (Guillaume, G. 1997).
L'étude de Matagne et collaborateurs en 1993, vient encore affaiblir cette hypothèse. Ils ont
pu observer des constantes d'acylation très faibles avec des antibiotiques portant un
groupement méthoxy sur la face α (céfoxitine, moxalactame...). Ceci est attribué au
déplacement de la molécule d'eau W1 par la fonction méthoxy. Si la lysine intervenait dans la
formation de l'acyl-enzyme, le réseau de liaisons hydrogène entre celle-ci et la ser 70 n'étant
pas perturbé, la catalyse devrait se faire avec la même efficacité (Matagne, A. 1993).
Damblon et collaborateurs ont réalisé la titration par RMN de la Lys73 et ont pu infirmer la
diminution de pKa nécessaire à l'activation de la Ser70 (Damblon, C. 1996).
Enfin une étude cristallographique a permis d'établir que le Glu166 était sous forme acide
carboxylique à pH 8, lorsque la sérine est liée de façon covalente à un inhibiteur (Minasov, G.
2002).
Ainsi, les nombreuses études rapportées semblent privilégier l'hypothèse selon laquelle le
Glu166 interviendrait dans les deux étapes, et appuyer la voie mécanistique proposée par
Lamotte-Brasseur et collaborateurs en 1991 (Lamotte-Brasseur, J. 1991).
Les β-lactamases de classe C, initialement nommées céphalosporinases du fait de leur

9
 Chapitre 1

préférence pour ce type de substrats, sont présentes à quelques exceptions près, dans la
plupart des bactéries Gram (-). Globalement, la structure tertiaire des enzymes de cette classe
ressemble à celle de la classe A. Les résidus du site actif diffèrent néanmoins. Ainsi, à la
Ser70, la Lys73, la Lys315 et la Ser130 des protéases de classe A correspondent la Ser64, la
Lys67, la Lys315 et la Tyr150. Les premières structures cristallographiques suggéraient un
mécanisme symétrique dans lequel le rôle de la base activant la Ser64 nucléophile était tenu
par la Tyr150. Celle-ci assistait ensuite l’ouverture du β-lactame, et donc l’effondrement de
l’intermédiaire tétraédrique, en transférant le proton à l’azote du cycle à quatre chaînons. Ce
même résidu intervenait ensuite dans l’étape de déacylation en activant une molécule d’eau
conservée. Cependant, ce mécanisme est aujourd’hui remis en cause car certaines données de
la littérature viennent contredire une implication aussi directe de la Tyr150 (la Tyr serait sous
forme neutre dans l’enzyme native et ne pourrait assumer son rôle de base) (Fisher, J. F.
2005).
Les aspects structuraux et mécanistiques des β-lactamases de classe D, n’ont fait l’objet
d’études que depuis peu. Ceci est lié en partie à leur apparition récente dans certaines souches
pathogènes d’intérêt, mais aussi dans une plus grande mesure, à la difficulté de les manipuler
dans des tests in vitro. La quantité de CO2 présente lors des expériences menées sur ces
enzymes, a été identifiée comme étant un paramètre critique à l’origine des problèmes de
reproductibilité. Il a été prouvé depuis que le CO2 jouait un rôle d’activateur dans l’hydrolyse
des antibiotiques à noyaux β-lactame par les protéases de cette classe. Le mécanisme
impliquerait dans les deux étapes, activation de la sérine (acylation) et de la molécule d’eau
(déacylation), une Lysine N-carboxylée formée par réaction (réversible) du CO2 présent et du
ε-NH2 de l’acide aminé (lien carbamate) (Fisher, J. F. 2005).

L'évolution des PBPs en β-lactamases a été imposée par la sélection naturelle.

Cependant depuis la découverte de la benzylpénicilline par Fleming en 1928, l'usage intensif
d'antibiotiques a amplifié de façon dramatique le développement de ce mécanisme de
résistance.
Au-delà de la transmission des gènes grâce à des éléments mobiles qui ont permis l’expansion
du phénotype résistant, les mutations ponctuelles ont généré, en réponse à la pression exercée
par de nouvelles molécules, des enzymes aux spectres d’action plus étendus. Ainsi sont
apparues au début des années 80, peu de temps après les premières utilisations d’antibiotiques
à large spectre, de nouvelles β-lactamases : AmpC (céphalosporinase), ESBL (Extended

10
 Chapitre 1

Spectrum β-lactamase), carbapénémases (Wilke, M. S. 2005 ; Poole, K. 2004).

Les ESBLs dérivent principalement des classes A et D et sont généralement inhibées par les
inhibiteurs de β-lactamases classiques. Elles sont présentes dans les bactéries Gram (-) et en
particulier chez les membres des Enterobacteriaceae (E. coli et K. pneumoniae). Elles sont
résistantes aux pénicillines, aux céphalosporines de première et seconde génération aussi bien
qu’à celles de troisième, les oxyimino-céphalosporines (céfotaxime, ceftazidine, ceftriaxone).
Les monobactames (aztréoname) font également partie des molécules inactives. Au contraire,
elles sont sensibles aux céphamycines (céfoxitine, céfotétan), aux céphalosporines de
quatrième génération (céfépime, cefpirome) et aux carbapénèmes (imipénème, méropénème,
panipénème). La présence d’AmpC (en plus d’ESBL) ou la perte de porines dans ces
organismes peut aboutir selon les cas à une augmentation de la résistance vis-à-vis des
céphamycines, des céphalosporines de quatrième génération et/ou des carbapénèmes.

Les AmpC, céphalosporinases de classe C, quant à elles, ne sont pour l’instant sensibles
qu’aux céphalosporines de quatrième génération et aux carbapénèmes. Pourtant, des cas de
résistance concernant la première famille, ont déjà été observés cliniquement, et la perte d’une
porine peut également conduire à une augmentation de la résistance envers les carbapénèmes
dans les organismes producteurs des ces enzymes. Contrairement aux protéases de classe A et
aux ESBLs, leur activité n’est pas bloquée par des inhibiteurs de β–lactamases classiques.
Des activités carbapénémases ont déjà été observées dans les classes de β-lactamases A, B et
D. Le phénomène reste rare et les enzymes peuvent-être inactivées. Cependant, il a été isolé
chez Aeromonas veronii, une nouvelle enzyme, AVS-1, capable d’hydrolyser l’imipénème, et
insensible aux composés habituels du type acide clavulanique.

Les β–lactamases représentent le mécanisme de résistance le plus répandu dans le

monde bactérien et leur évolution illustre la grande plasticité dont ces organismes font preuve
pour survivre. Cette adaptabilité s’exprime également dans la diversité des mécanismes mis
en jeu pour contrer l’action létale des antibiotiques. Ainsi des organismes, dont beaucoup sont
impliqués dans les maladies nosocomiales, ont développé une résistance assistée par d’autres
protéases à sérine, les transpeptidases elles-mêmes.

11
 Chapitre 1

3.2. Les PBPs résistantes

Les PBPs sont divisées en deux groupes, celles de bas poids moléculaire (BPMs) et
celles de haut poids moléculaire (HPMs). Les BPMs, solubles, n’ont pour l’instant pas été
impliquées dans des phénomènes de résistance.
Au contraire, les HPMs sont au cœur d’une forme de résistance qui s’exprime par la
modification des cibles (PBPs) elles-mêmes. Les organismes concernés (S. pneumoniae, S.
aureus, E. faecium, N. gonorrhoeae…) sont parmis les plus virulents et les plus
problématiques (Wilke, M. S. 2005 ; Poole, K. 2004).
La résistance de S. pneumoniae a débuté en 1977 en Afrique du Sud mais s’est rapidement
propagée à travers le monde. Le mécanisme implique, entre autre, le développement de PBPs
mutantes possédant une affinité réduite pour les antibiotiques à noyau β–lactame.
Par exemple le phénotype PRSP, Penicillin-Resistant Streptococcus pneumoniae, regroupe les
organismes exprimant des variants d’une enzyme, PBP2x, qui ont été intensivement étudiés.
La souche sp328 héberge le mutant Thr338Ala, le plus représenté cliniquement, pour lequel la
résistance est attribuée à la perte d’une molécule d’eau du site actif, affaiblissant le réseau de
liaisons hydrogène qui stabilise l’intermédiaire acyl-enzyme. Un plus haut niveau de
résistance peut être atteint avec une mutation supplémentaire, Met339Phe. Dans ce variant, la
sérine nucléophile 337 est réorientée et les vitesses de réaction sont diminuées de 4 à 10 fois.
Dans les mutants Ser389Leu et Asn514His de cette même souche, les interactions avec
l’antibiotique sont stériquement défavorisées, réduisant de cette manière les taux d’acylation.
Des mécanismes alternatifs ont été trouvés dans d’autres souches. Ainsi, dans la souche
sp5259, la mutation Gln552Glu introduit une charge négative à l’entrée du site actif qui
comme dans PBP5fm (E. faecium) défavorise l’interaction avec les β–lactames chargés
négativement. D’autres mutations peuvent altérer la structure, comme dans PBP2a (S.
aureus), de telle sorte que le réarrangement requis pour l’acylation soit énergétiquement
défavorisé.
Il faut cependant noter que PBP2x n’est pas la seule enzyme impliquée dans le phénotype
PRSP. S. pneumoniae possède cinq HPMs, 1a, 1b et 2a de classe A (bifonctionnelles :
transpeptidase et glycosydase) et 2x, 2b de classe B (monofonctionnelles). Chacune d’entre
elles peut être mutée en variant de faible affinité et plusieurs combinaisons peuvent ainsi être
générées au sein d’une bactérie lui conférant une résistance plus ou moins importante
(Sanbongi, Y. 2004).

12
 Chapitre 1

Staphylococcus aureus constitue un autre exemple d’organisme possédant des PBPs

modifiées (PBP2a). En 1941, toutes les souches de cette espèce étaient considérées comme
sensibles à la Pénicilline G. Mais en 1944, les premières β–lactamases sont apparues.
L’industrie pharmaceutique répliqua avec l’introduction de la méticilline qui fut suivie peu de
temps après de l’émergence du phénotype MRSA (Meticillin-resistant Staphylococcus
aureus).

Depuis l’utilisation des premiers antibiotiques, les bactéries ne cessent de s’adapter au

stress imposé par l’Homme. Au travers des mutations, de l’échange et de la collecte
d’informations génétiques, elles renforcent leur défense afin de survivre.
Voilà pourquoi la recherche de molécules actives continue dans ce domaine de la santé.
Aujourd’hui des agents thérapeutiques possédant une activité anti-MRSA, anti-PRSP, anti-
entérocoques, voire les trois, voient le jour. De nouvelles céphalosporines, de nouveaux
céphèmes et carbapénèmes, stables vis-à-vis des β–lactamases et à haute affinité envers les
PBPs résistantes, sont développés. Ces composés permettent pour l’instant de garder une
longueur d’avance mais tôt ou tard leur efficacité sera remise en question.

4. Les antibiotiques à noyau β-lactame

Les antibiotiques à noyau β–lactame constituent la plus importante classe de

médicaments utilisée aujourd’hui dans le traitement des maladies infectieuses d’origine
bactériennes (65 % du marché des antibiotiques) (Elander, R. P. 2003).
Avant 1940, celles-ci représentaient la plus grande cause de mortalité. Mais depuis
l’avènement de l’antibiotique, peu de personnes les considèrent encore comme une menace au
même titre que les infections virales ou les maladies cardiovasculaires.
Or l’apparition et l’évolution du phénomène de résistance nous rapprochent d’une crise
majeure. La pression de sélection naturelle s’est inversée depuis la première utilisation de la
pénicilline, et celle-ci, exercée par les bactéries, stimule la recherche de nouveaux composés
toujours plus actifs (Niccolai, D. 1997 ; Dürckheimer, W. 1985).

13
 Chapitre 1

4.1. Les pénames

La pénicilline G (P. notatum) fut découverte par hasard, par A. Fleming en 1928
(figure 3). Néanmoins, c’est la démonstration de son efficacité antibactérienne et de sa faible
toxicité par Florey et Chain en 1940 qui marqua réellement le début d’une ère nouvelle pour
la santé publique.

H H H
R N S

O
N
O
CO2H

Figure 3 : les pénicillines (Benzylpénicilline ou Pénicilline G : R = PhCH2).

Peu de temps après, beaucoup d’autres antibiotiques non β-lactamiques comme la

streptomycine (1943), le chloramphenicol (1947) ou l’érythromycine (1952), furent
successivement découverts grâce au screening systématique effectués sur les organismes
(moisissures, bactéries…) présents dans les sols. Une seconde impulsion provint de
l’isolement d’un intermédiaire dans la voie de biosynthèse de la pénicilline, l’acide 6-amino-
pénicillanique, également présent dans la voie de synthèse chimique décrite par Sheehan en
1957 (figure 4) (Sheehan, J. C. 1957).

H H
H2N S
6 5 1
2
7 4
N 3

O
CO2H

Figure 4 : l’acide 6-amino-pénicillanique (6-APA).

14
 Chapitre 1

Cette molécule biologiquement inactive, constitue le noyau de base des pénicillines

développées ensuite par hémi-synthèse. La méthode consiste à acyler la fonction amine libre
en position 6 du noyau lactame pour donner ainsi accès à une large gamme de molécules
potentiellement plus actives que la Pénicilline G.
L’ampicilline est par exemple née de cette hémi-synthèse. Puis, des modifications chimiques
ont permis d’élargir le spectre d’action, d’améliorer l’absorption, d’obtenir un effet
bactéricide plus rapide ou encore de diminuer les effets secondaires.
Pourtant certaines de ces molécules se sont révélées inefficaces contre les organismes
produisant des β–lactamases, et sont encore aujourd’hui utilisées en association avec un
inhibiteur de ces enzymes de défense (figure 5). C’est le cas de l’Augmentin qui réunit
Amoxicilline et acide Clavulanique. D’autres compositions pharmaceutiques sont à base de
Sulbactame.

H H O O
O OH S

N N
O O
CO2H CO2H

acide clavulanique sulbactame

figure 5 : exemples d’inhibiteurs de β–lactamases.

La stabilité des pénames vis-à-vis des β–lactamases s’est vite révélée être le défi majeur et la
recherche de composés capables de résister aux assauts de ces enzymes a abouti avec plus ou
moins de succès. Ainsi l’introduction d’un groupement méthoxy en position 6 a fourni la
Temocilline, efficace contre les Enterobacteriacae produisant des β–lactamases.
Des modifications similaires ont permis d’obtenir des molécules dont les spectres d’activité
antibactérienne se sont étendus au point d’être comparables à ceux des céphalosporines de
3ème génération. C’est le cas du composé BRL 36 650 contenant un groupement formylamino
en position 6 déposé par Beecham (tableau 1).

15
 Chapitre 1

H R2 H
R1 N S

O
N
O
CO2H

R1 R2 Nom générique/code

(R)
H Ampicilline (1962)
NH2

(R)
HO
H Amoxicilline (1971)
NH2

S (R, S) OCH3 Temocilline (1982)

CO2Na

HO

HO (R) O

HN C N N C2 H5
NHCHO BRL 36 650 (1984)

O O

tableau 1 : les pénicillines.

Néanmoins, malgré les améliorations obtenues, les pénicillines se sont trouvées vite
dépassées par l’évolution de la résistance. Aujourd’hui, elles sont encore utilisées dans le
traitement préventif d’infections, le plus souvent en association avec un inhibiteur de β-
lactamase (augmentin), mais ne sont plus au coeur des programmes de recherche.

16
 Chapitre 1

4.2. Les céphèmes

La céphalosporine C (C. acremonium) isolée en 1945 par Brotzu, a vu sa structure

élucidée au début des années 60. Sa grande stabilité vis-à-vis des β–lactamases a rapidement
suscité l’intérêt, mais ses faibles propriétés pharmacologiques n’ont jamais permis son
développement en tant que médicament (figure 6). La production d’acide 7-amino-
céphalosporinique (7-ACA) qui s’ensuivit fut comme pour la pénicilline le point de départ
vers une diversité de composés plus puissants (Page, M. G. P. 2004).

H H H
N S
5
7 6 4

8 1 3
O N 2 OAc
H 2N O

COOH COOH

figure 6 : la céphalosporine C.

Ainsi la propriété la plus remarquable de la première céphalosporine obtenue par hémi-

synthèse, la cephalothine, fut son haut niveau d’activité contre des staphylocoques résistants
aux pénicillines. Par la suite, d’autres développements ont abouti à des molécules comme la
cephalexine (Keflex) ou le cefaclor, efficace par voie orale. Cependant l’activité de cette
première génération de produits contre des souches Gram (-) telles que Proteus, Klebsiella,
Shigella, Serratia, Hemophilus ou encore Pseudomonas restait insuffisante.
La seconde génération de céphalosporines, cefazoline (Ancef), cefuroxime axtel (Ceftin,
Zinacef), cefoxitine (Mefoxin) a élargi le spectre à certaines souches de bactéries Gram
(-), mais c’est la 3ème génération dont le premier représentant est la cefotaxime (Claforan)
qui a apporté l’amélioration décisive. En effet, alors que l’activité contre les bactéries Gram
(+) est comparable à celle des 1ère générations de céphalosporines, l’activité contre les

17
 Chapitre 1

souches Gram (-) est de dix à cent fois plus élevée. De plus, la cefotaxime est la première
céphalosporine à posséder une activité clinique significative contre Pseudomonas (tableau 2).

H R3 H
R1 N S

O N
R2
O
COOH

R1 R2 R3 Nom générique
(R)
H2N (CH3)3
-CH2OAc H Cephalosporine C (1945)
CO2H

-CH2OAc H Cephalothine (1962)

S

(R)
-CH3 H Cephalexine (1967)
NH2

(R)
-Cl H Cefaclor (1974)
NH2

N N N N

N N
S CH3
H Cefazoline (1970)
S

O -CH2OCONH2 H Cefuroxime (1975)

N
OCH3

-CH2OCONH2 OCH3 Cefoxitine (1972)

S

H2N
S -CH2OAc H Cefotaxime (1975)
N
OCH3

tableau 2 : Les céphalosporines.

18
 Chapitre 1

Malgré leur succès commercial, les céphalosporines de 3ème génération sont peu nombreuses à
pouvoir être administrées par voie orale (cefixime, cefdinir, ceftibuten). De plus, leur faible
caractère lipophile rend leur absorption, au niveau du tractus intestinal, difficile. Un des
facteurs contributifs est le faible pKa de la fonction acide carboxylique en position C4 du
noyau céphème. La stratégie utilisée pour remédier à ce problème est de masquer la charge
portée par l’acide, à l’aide d’un groupement lipophile qui pourra être clivé spontanément ou
enzymatiquement lors de son absorption. Ainsi des composés estérifiés ont été mis sur le
marché (cefpodoxime proxetil [Vantin]), et récemment (décembre 2004), le composé
Ceftizoxime alapivoxil a fait l’objet d’une demande d’approbation au Japon (figure 7).

O
N
Développement
H H H Asahi Kasei
N N S Découverte
HN Kyoto Pharmaceutical Ind.
O N
S
O
H 3N O
O

O O O

Ceftidoxime alapivoxil

figure 7 : Céphalosporine de 3ème génération active par voie orale.

Avec la 4ème génération, la gamme des bactéries Gram (-) sensibles aux agents antibactériens
s’est étendue du fait d’une meilleure stabilité vis-à-vis des β–lactamases mais aussi
probablement grâce à une capacité moindre à induire une résistance. Le cefepime
(Maxipime) et le cefpirome (Cefrom) sont des exemples de cette catégorie de
céphalosporines (figure 8).

19
 Chapitre 1

OMe

H H H
N S

S
N O N N
O
H2N
COO

cefepime

OMe

H H H
N S

S
N O N N
O
H2N
COO H2SO4

cefpirome

figure 8 : Céphalosporine de 4ème génération

Comme la cefuroxime (2nde génération), cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidine et ceftizoxime

(3ème génération), le cefepime est capable de pénétrer le système nerveux central et est ainsi
utile dans le traitement contre B. meningitis.

Enfin, les céphalosporines anti-MRSA développées depuis le milieu des années 90,
constituent un nouveau groupe de molécules qui exhibent un plus large spectre d’activité
contre les bactéries Gram (+) et pour la première fois, contre les staphylocoques résistants à la
méticilline. Actuellement plusieurs de ces composés sont en phase de développement clinique
(tableau 3) (Page, M. G. P. 2004 ; Bryskier, A. 2005 ; Bush, K. 2004 ; Appelbaum, P. C.
2005).

20
 Chapitre 1

Développement
Structure/code Découverte
Statut

N
OEt H
Développement :
N N
H H
N
Shionogi
N N S
Découverte :
S
N O N N Shionogi
H2N
O Statut :
O O S-3578 Phase I (novembre 2003)

OH

Cl N
H
N
H
S
Développement :
S
N RW Johnson
N O N Pharmaceutical
S
O
H2N Research Institute
R
O O S Découverte :
Microcide
NH3
R= H
Pharmaceuticals,
N COO
Inc. (MC-02479)
O
Statut :
Phase I (septembre 2003)
RWJ-442831

OH
N
Développement :
O
H
N
H
S O Basilea Pharmaceutica
N O
S N O Découverte :
N
N O N O Hoffmann-La Roche
H2N
O
(Ro-63-9141)
O
O O Statut :
Phase III
Ceftobiprole BAL-9141/5788, Ro 63-9141
(mars 2004)
F

Développement :
O
N
Cubist
H H Découverte :
N N S

S
HN Sandoz (CAB-175)
N O N N
N
NH Statut :
N
H2N
O Phase I stoppée
O O CB-181963 (février 2004)

21
 Chapitre 1

CH3

N
Développement :
OEt
N
Peninsula
N
H
N
H
S
Pharmaceuticals, Inc.
S
N Découverte :
N O N
S S
Takeda Chemical
O
R1HN Industries
O O Statut :
TAK-599, R1 = PO(OH)2 Phase I (2005)

tableau 3 : Les céphalosporines de 4ème génération

active contre les bactéries Gram (+).

4.3. Les pénèmes

H H
R S
1
6 5
2 X
7 4
N 3

O
CO2H

figure 9 : Les pénèmes.

Les pénèmes constituent la seule classe d’antibiotiques à noyau β-lactame d’origine

entièrement synthétique (figure 9). C’est Woodward qui a décrit pour la première fois la
synthèse de ces composés qui peuvent être considérés comme des hybrides entre les
pénicillines et les céphalosporines (Woodward, R. B. 1980). Malgré leur bonne activité
antibactérienne, la plupart de ces molécules se sont révélées inutilisables du fait de leur trop
grande instabilité chimique. Cette famille conserve pourtant un intérêt puisque quelques
molécules comme le sulopénème, le ritipénème ou le faropénème daloxate, pro-drogue du
faropénème sodique, actuellement en phase clinique III, ont montré des activités
remarquables contre les souches de bactéries résistantes Gram (+) (figure 10).

22
 Chapitre 1

OH O OH
S O
H H H H
S S NH2
S O
N N
O O
COO COO

sulopénème Ritipénème

OH
H H
S O

N
O 2,5 H2O
CO2Na

faropénème sodique

figure 10 : Les pénèmes.

4.4. Les carbapénèmes

La thiénamycine, produite par S. cattleya, a été découverte à la fin des années 70. Bien
que possédant une activité antibactérienne puissante, c’est l’imipénème, un dérivé plus stable
chimiquement, qui fut utilisé contre les infections sérieuses. Malgré sa stabilité à la fois
chimique et enzymatique (stable envers les β–lactamases du fait de sa chaîne hydroxyéthyle),
il est rapidement inactivé par la déhydropeptidase (DHP) présente dans les reins des
mammifères. Son utilisation requiert donc, à la manière des premières pénicillines,
l’administration conjointe d’un inhibiteur de DHP (cilastatine) qui réduit ainsi l’accumulation
rénale de l’antibiotique néphrotoxique (figure 11).

23
 Chapitre 1

OH
H
NHR
S O NH NH3
S
N -
CO2 CO2-
O
CO2-
cilastatine
R = H, Thiénamycine

R = CH=NH2, imipénème

OH
H

S O
N
O
NMe2
CO2- NH

méropénème

figure 11 : Les carbapénèmes.

L’introduction d’un méthyle en position 1-β fournit le méropénème et permet de s’affranchir

de la cilastatine. De plus, il est possible d’injecter le composé en une seule dose avant une
intervention chirurgicale alors que l’imipénème nécessite un mode d’administration plus
graduel à cause, entre autre, de sa plus faible solubilité.
Bien que les carbapénèmes soient des composés d’origine naturelle, la production des
intermédiaires clés à grande échelle par fermentation n’est pas encore commercialement
viable et très tôt, l’intérêt s’est concentré vers des approches entièrement synthétiques
notament chez Merck Sharp & Dohme (Salzmann, T. N. 1980 ; Shih, D. H. 1984).
La découverte de nouvelles structures a pour objectif l’élargissement du spectre d’action
(Bryskier, A. 2005 ; Andreotti, D. 2000 ; Edwards, J. R. 2000). Par exemple, certains
carbapénèmes comme d’autres β-lactames sont inefficaces contre les souches MRSA

24
 Chapitre 1

(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) du fait de leur faible affinité pour la PBP2a.

L’addition d’un groupement lipophile à une extrémité de la molécule peut pallier ce manque.
Grâce à cette approche, deux molécules ont vu le jour chez Merck :
L-696256 et son analogue plus soluble L-742728. Néanmoins, des réactions immuno-toxiques
ont été observées au cours des évaluations cliniques et ces composés ont été abandonnés. Le
CS-023 (RO-4908463), en phase clinique II (dernière mise à jour, juin 2006), mis au point
initialement par Sankyo et développé par Roche, se montre pour l’instant prometteur puisque
de très bonnes activités contre des souches résistantes comme les MRSA et PRSP ont été
observées (figure 12).

R2
OH
R1
H

N O
O
CO2-

N
L-696256 : R1= H, R2= N

L-742728 : R1= Me, R2= N O

N
NH2
X

OH
H
CS-023
S O
N
O O
N N
COSH H
N NH2
CH3 N
H
NH

figure 12 : Carbapénèmes anti-MRSA développés par Merck et Roche.

25
 Chapitre 1

De son côté, Glaxo Wellcome a rapporté la synthèse de carbapénèmes particuliers, les

trinèmes dont le représentant le plus cité est le sanfetrinème (Singh, K. V. 1996). Toutefois, il
semble que le projet ait été interrompu (figure 13).
Les carbapénèmes sont aujourd’hui considérés comme la classe d’antibiotiques à noyau β–
lactame la plus puissante et la plus stable vis-à-vis de l’hydrolyse par les β-lactamases. Mais
depuis une dizaine d’années, une résistance, due à la production de métallo-β-lactamases
(classe B) ou de carbapénémases, est apparue. Ces enzymes sont capables de reconnaître la
chaîne hydroxy-éthyle qui protège habituellement ces molécules des protéases plus
traditionnelles. A l’heure actuelle, le défi consiste donc à synthétiser des composés possédant
un large spectre d’action et une stabilité accrue envers les β–lactamases.

OH

N
OMe
O
O
O
O O
O
H3C

figure 13 : Sanfetrinème cilexetil développé par Glaxo Wellcome.

4.5. Les monobactames

Au milieu des années 70, il fut décrit dans la littérature, un nouveau genre de β-
lactames, possédant potentiellement une activité antibactérienne et ayant pour caractéristique
d’être monocyclique.
C’est l’exemple des nocardicines (N. uniformis), dérivées de l’acide 3-aminonocardicinique
(3-ANA). Bien que cette famille de composés ne présente pas véritablement d’intérêt

26
 Chapitre 1

thérapeutique, la nocardicine A exhibe une activité modérée contre les souches Gram (-) et
Pseudomonas (figure 14).

H2 N
OH

N
O
H CO2H

Acide 3-aminocardicinique

H OH
N
NH2
HO2C H
N
OH
O
O
N
O
H CO2H

Nocardicine A

figure 14 : Exemple de nocardicine.

Des β-lactames monocycliques ayant une réelle activité antibiotique furent décrits pour la
première fois au début des années 80. Deux équipes, l’une de Takeda Chemical industries et
l’autre du Squibb Institute décrirent indépendamment cette nouvelle classe de produits
naturels (Sykes, R. B. 1981 ; Imada, A. 1981). Comme caractéristiques particulières, les
monobactames, possèdent un cycle β–lactame non substitué en position 4, un groupe
acylamido en position 3, et une fonction acide sulfonique sur l’azote du β–lactame. Dans la
plupart des composés trouvés, la chaîne acyle consiste en un di, tri ou oligopeptide bien que
des dérivés mono-acétylés aient été isolés. Les monobactames naturels possèdent quasiment
tous un groupement méthoxy- en position 3 probablement à l’origine de leur grande stabilité
envers les β–lactamases (tableau 4).

27
 Chapitre 1

H X
N
R

N
O SO3

R X Nom générique/code

CH3CO OCH3 SQ 26 180

NH2 O
H
N
HO2C CH3 OCH3 Sulfazécine/ SQ 26 445
O

NH2 O
H
N
HO2C CH3 OCH3 Isosulfazécine
O

HO COCH3
HN

CH3 H SQ 26 700
O

HO COCH3
HN

CH3 OCH3 SQ 26 875

O

tableau 4 : Les monobactames naturels.

Contrairement aux pénicillines, céphalosporines ou aux nocardicines, ces molécules sont en

fait des produits du métabolisme des bactéries. La sulfazecine a par exemple été isolée à partir
de diverses souches telles que Gluconobacter sp., Pseudomonas sp., Agrobacterium
radiobacter, Flexibacter sp. , et Chromobacterium violaceum.
Comme la nocardicine, les monobactames possèdent une faible activité antibiotique contre les
souches Gram (-) et Pseudomonas mais exhibent une très forte activité envers les Gram (+).

28
 Chapitre 1

Pour améliorer ses capacités d’agent antibactérien, la chaîne acylamido mais aussi le squelette
de la molécule elle-même ont fait l’objet de nombreuses modifications.
Dans ce but, l’acide 3-amino-monobactamique (3-AMA) a été synthétisé car sa production
par fermentation s’est révélée difficile (figure 15) (Cimarusti, C. M. 1982).
Les monobactames non-subtitués en position 4 du cycle ont pu être obtenus par conversion de
l’acide 7-aminodesacetoxycephalosporanique et de la pénicilline G.
En revanche, les composés substitués en C-4 n’ont pu être obtenus de cette façon et sont donc
issus de la synthèse totale.

H3N CH3

N
O SO3

figure 15 : L’acide 3-amino-monobactamique (3-AMA).

Les variations structurales au niveau de la fonction acylamido ont abouti à l’Aztréoname,

molécule possédant une forte activité contre les bactéries Gram (-) et Pseudomonas,
comparable à celle des céphalosporines de 3ème génération, mais faible contre les bactéries
Gram (+) (figure 16).
H3C
CH3
O
N CO2H
H 3N N
H
N CH3
S
O
N
O SO3

aztréoname

figure 16 : Exemple d’un monobactame d’origine synthétique.

29
 Chapitre 1

5. Réactivité des β -lactames

5.1. Modèle de réactivité, une approche intuitive

Pendant longtemps, l’activité biologique des β–lactames a été attribuée à leur

réactivité chimique. Celle-ci fût expliquée par le biais de facteurs géométriques. Ainsi, peu de
temps après l’introduction de la pénicilline dans notre pharmacopée, il fût suggéré que
l’activité antibiotique était essentiellement due à trois caractéristiques :
(1) la tension inhérente du noyau β-lactame, suffisamment rare dans la nature pour être
considérée comme l’origine de la réactivité, (2) la réduction de la résonance de l’amide, due à
la conformation particulière de la molécule qui empêche la délocalisation de la paire libre de
l’azote, et (3) la fusion d’un second cycle qui augmente les contraintes angulaires de ces
systèmes bicycliques (schéma 8) (Strominger, J. L. 1967 ; Woodward, R. B. 1949).

S
O
N
CO2

S S

N N
O O

schéma 8 : Pyramidalisation de l’azote et inhibition de la résonance.

En effet, il a été montré qu’une réaction, quelle qu’elle soit, procède 1020 fois plus vite si elle
implique un cycle à quatre chaînons et son ouverture, que le système acyclique correspondant.
De plus, il a été estimé que la délocalisation stabilise les amides d’environ 18 kcal/mol et
donc, qu’une réaction impliquant la perte de la résonance à l’état de transition procède 1013
fois plus vite si la délocalisation est inhibée. Ainsi, une réaction ayant pour résultat

30
 Chapitre 1

l’ouverture d’un β-lactame devrait se dérouler 1033 fois plus rapidement qu’avec son analogue
acyclique.
Pourtant, si les pénicillines, et céphalosporines, sont plus réactives que les amides classiques
vis à vis des nucléophiles, les différences ne sont pas flagrantes et ne reflètent pas les
contributions théoriques de ces deux facteurs (Page, M. I. 1984 et 1987).

5.2. Déficiences du modèle de réactivité

5.2.1. Réactivité du cycle à 4 chaînons et des β–lactames bicycliques

Une façon simple d’évaluer la réactivité de composés consiste à étudier leur sensibilité
envers l’hydrolyse basique. Les comportements de divers β-lactames bicycliques,
monocycliques, et amides acycliques vis-à-vis de l’hydrolyse alcaline ont donc été analysés. Il
en ressort plusieurs informations qui soulignent les déficiences du modèle de réactivité
communément admis (Proctor, P. 1982).

La tension intrinsèque du cycle β-lactame ne constitue pas un gage de réactivité. Page et ses
collaborateurs ont ainsi montré qu’il existe des cas où l’amide acyclique correspondante est
aussi réactive (figure 17).

H3C CH3

N N
CH3
O O CH3

6,1×10-6 M-1.s-1 2,3×10-6 M-1.s-1

figure 17 : Constantes de vitesse d’hydrolyse (kOH en M-1.s-1) d’un β-lactame

et de son équivalent acyclique (Page, M. I. 2000).

31
 Chapitre 1

Ils ont également mis en évidence la relation qui existe entre le logarithme de la constante de
vitesse d’hydrolyse (kOH en M-1.s-1) et la basicité de l’amine formée. En effet, il semble que,
contrairement aux amides acycliques, les vitesses d’hydrolyse des β-lactames soient fortement
dépendantes du pKa des acides conjugués des amines résultantes. Cette influence diminue
néanmoins, de façon importante, pour les amines dont le pKa est supérieur à 6. La
conséquence directe de cette observation est que la différence de réactivité entre un amide et
le β-lactame correspondant sera d’autant plus grande que le pKa de l’amine est faible, c'est-à-
dire inférieur à 6. Un tel composé cyclique pourra être alors de 30 à 500 fois plus réactif vis-
à-vis de l’hydrolyse que son équivalent linéaire.

Enfin, ils ont montré que la fusion d’un second cycle au β-lactame augmente la réactivité d’un
facteur 100. Bien que ce gain soit substantiel, les auteurs soulignent que la réactivité équivaut
à peine à celle attendue, lors de l’ouverture d’un cycle à quatre chaînons ou d’un système
dans lequel la résonance de l’amide est inhibée.

5.2.2. Distorsion de la géométrie et résonance

Au début des années 80, sur base de l’hypothèse associant la pyramidalité de l’azote
du β–lactame et la réactivité via l’inhibition de la résonance, des composés bicycliques ont été
synthétisés. Selon Sweet et Dahl, la distorsion de la coplanarité peut être exprimée par la
hauteur h d’une pyramide dont l’atome d’azote constitue le sommet et ses trois substituants, la
base (figure 18) (Sweet et Dahl, 1970).

7
S
5
O
3
4
N

figure 18 : Définition de la pyramidalité de l’azote dans le noyau péname.

32
 Chapitre 1

La première caractéristique de ces molécules a été de posséder une structure très tendue, et la
seconde, un atome d’azote très éloigné du plan défini par les atomes 3, 5 et 7. Une analyse de
la réactivité chimique et du caractère pyramidal de ces molécules révèle, une fois encore, les
lacunes du modèle utilisé pour rationaliser l’activité biologique des antibiotiques à noyaux β–
lactames (figure 19) (Pfaendler, H. R. 1981).

N N N
O O O
CO2Na CO2Na CO2Na

I actif II actif III inactif

h = 0,42 h = 0,50 h = 0,54

figure 19 : Paradoxe entre le degré de pyramidalisation de l’azote,

la réactivité chimique et l’activité biologique.

En effet, la réactivité vis-à-vis de l’hydrolyse basique du composé inactif III a été jugée
comparable à celle des deux autres. De plus, l’étude cristallographique des esters des trois β–
lactames a montré que la déviation de l’azote par rapport au plan de référence, explicitée par
la hauteur h (Å), était plus prononcée dans III que dans I et II, et que cette pyramidalité pour
les trois molécules était de toute façon supérieure à celle des pénicillines (PenG, h = 0,40) et
céphalosporines (céphaloridine, h = 0,24).

L’inhibition de la résonance de l’amide due à la déformation du cycle dans les β–lactames

bicycliques n’a jamais été prouvée. En effet, celle-ci devrait faire ressembler l’amide à la
forme canonique A représentée dans le schéma 9 au détriment de la forme chargée B (Page,
M. I. 1987).

33
 Chapitre 1

N N

O O
A B

schéma 9 : Résonance de l’amide, formes canoniques.

Une conséquence de l’accroissement de la densité de charge négative sur l’azote est

l’augmentation de la basicité. Il est connu que la torsion des liaisons dans les systèmes amides
peut avoir cet effet. Par exemple la 6,6-diméthyl-1-azabicyclo-[2.2.2]-octan-2-one
(quinuclidin-2-one), dont la paire libre est présumée orthogonale au système π du carbonyle
affiche un pKa de 5,3 alors qu’en générale, les amides sont très faiblement basiques, le pKa
de leur acide conjugué étant proche de 0 (figure 20).

figure 20 : 6,6-diméthyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-one.

S’il n’était plus possible d’écrire de forme mésomère de la pénicilline du fait de la position de
l’azote par rapport au plan du cycle, celle-ci devrait aussi faire preuve d’une basicité accrue.
Or, il semble que ce soit l’inverse car en présence d’acide chlorhydrique 12 M, la protonation
de l’azote n’est pas détectée ; le pKa doit être inférieur à -5 pour l’observer.
Une autre indication d’un caractère basique augmenté, pourrait être une constante d’équilibre
de coordination d’un métal entre l’acide carboxylique et l’azote du β–lactame plus

34
 Chapitre 1

importante. Néanmoins, avec le Ni (II), le Zn (II), le Co (II) et le Cu (II), elle est comparable
(100-200 M-1) à celle attendue entre un amide classique et un groupe carboxyle (figure 21).

RCOHN S

N
O Mn+

O
O

figure 21 : Coordination d’un métal entre le groupe carboxyle et l’azote d’une pénicilline.

La dépendance angulaire des interactions orbitalaires a fait l’objet de nombreuses études. Il a

été montré que des interactions stabilisantes peuvent se produire même lorsque les orbitales p
sont perpendiculaires. L’énergie de rotation autour de la liaison C-N dans les amides,
d’environ 20 kcal/mol, indique toutefois une dépendance significative de la résonance vis-à-
vis des angles de torsion. L’exemple de la quinuclidin-2-one illustre l’influence de la variation
des angles dièdres dans ces systèmes.
Pourtant, le maintien de la résonance dans certaines molécules pontées, lorsque l’azote
adjacent au système p ou π est pyramidal, a été démontré. En effet, la géométrie des bicyclo-
[3.3.1]-nonanes permet une stabilisation partielle des carbocations dans les réactions de
solvolyse (figure 22).

Y
Y

X N Cl

A B C

figure 22 : Maintien de la résonance dans des structures déformées.

35
 Chapitre 1

Ainsi, le composé A (Y = -NCH3) affiche une réactivité supérieure à l’analogue carboné (Y =

-CH2) d’un facteur 107. La molécule B (Y = -NCH3), dont la géométrie impose l’orthogonalité
entre le doublet libre de l’azote et l’orbitale p vacante, est 356 fois plus réactive que
l’équivalent carboné (Y = -CH2). La réactivité du système bicyclo-[2.2.1]-heptane C semble,
quant à elle, diminuée d’un facteur 20. Néanmoins, la résonance résiduelle contribue une fois
encore à la stabilisation du carbocation, car un azote en α de celui-ci devrait conduire par effet
inductif à une baisse de la réactivité d’un facteur 105 (Page, M. I. 1987 et références citées).

Ces observations suggèrent qu’une faible distorsion de la géométrie de l’amide

n’implique pas nécessairement la diminution ou la perte de la résonance. Les vieux dogmes se
sont trouvés un peu plus fragilisés par l’apparition des monobactames (β–lactames
monocycliques). Ces molécules, qui peuvent être aussi réactives que les pénicillines et
céphalosporines, contredisaient par leur structure deux hypothèses : d’une part, qu’il est
nécessaire pour avoir une liaison amide réactive que le β–lactame fasse partie d’un système
bicyclique contraint, et d’autre part, que l’azote doit être pyramidal, puisque ces composés
sont parfaitement plans.
Par contre, dans ces molécules, la liaison C-N est activée par effet électrocapteur du
groupement sulfonate qui diminue le pKa de l’amine correspondante et en fait un meilleur
groupe partant (Cimarusti, C. M. 1983).

5.3. Structure 3-D et activité antibiotique

La compréhension des relations structure-activité est une condition essentielle pour

l’élaboration rationnelle de nouvelles molécules. Dans cette perspective, des analogues
structuraux de composés biologiquement actifs ont été synthétisés.
Il a ainsi été observé que les dérivés ∆2- des céphalosporines, qui ne diffèrent que par la
position de la double liaison, sont totalement dépourvus d’activité biologique. Pourtant, les
différences structurales existant entre les céphalosporines et les pénicillines sont bien plus
grandes (figure 23).

36
 Chapitre 1

H H
R N R N
S S
CH3

O O
N N
CH3
R'
O O
COOH
COOH

pénicillines ∆3-céphalosporines

H
R N
S

O
N
R'
O
COOH

∆2-céphalosporines

figure 23 : Structures actives ou inactives des antibiotiques.

La différence d’activité fut initialement attribuée à une conformation inadéquate du

groupement acide carboxylique. Cependant les études cristallographiques révélèrent que les
composés actifs ne présentaient pas de similitudes structurales évidentes, et que au contraire,
la ∆2-céphalosporine ressemblait davantage à la Pen G qu’à son analogue ∆3-. On conclut de
ces observations que les contraintes conformationnelles nécessaires à la reconnaissance de
l’antibiotique par l’enzyme n’étaient pas si restrictives.
L’inactivité des ∆2-céphalosporines, fut donc expliquée par une réactivité chimique plus
faible. Ces molécules sont en effet caractérisées par un azote quasi-plan (phénoxyméthyl ∆2-
céphalosporine : h = 0,06 Å) et par l’absence de résonance de l’énamine (schéma 10).

37
 Chapitre 1

H H
R N R N
S S

O O
N N
R' R'
O O
COOH COOH

schéma 10 : Résonance de l’énamine dans les ∆3-céphalosporines

(effet absent dans les ∆2-céphalosporines).

Cette hypothèse est néanmoins contredite par la comparaison des constantes de vitesse
d’hydrolyse en milieu basique puisqu’il a été observé que les ∆3-céphalosporines sont
seulement deux à trois fois plus réactives (figure 24) (Proctor et Page, observations non
publiées).

H H
N N
S S
Ph Ph

O O
N N
CH3 CH3
O O
COOH COOH

2,90 × 10-2 M-1s-1 1,10 × 10-2 M-1s-1

figure 24 : Différences de réactivité entre ∆2- et ∆3-céphalosporines

envers l’hydrolyse alcaline.

Les divers exemples et paradoxes mentionnés précédemment traduisent bien l’impossibilité

de restreindre l’activité antibiotique d’un β-lactame à sa seule réactivité chimique. Le faire,
c’est oublier qu’avant de réagir, le composé doit atteindre sa cible, c'est-à-dire dans la plupart

38
 Chapitre 1

des cas, traverser des membranes. C’est également mettre de côté les contraintes
conformationnelles du récepteur biologique (PBPs) et les interactions à l’intérieur de celui-ci.

La comparaison des structures 3-D des pénicillines et ∆2- et ∆3-céphalosporines n’a pas
permis de révéler de prime abord, les caractéristiques géométriques permettant de rationaliser
l’activité ou l’inactivité antibactérienne de ces molécules. La clé qui permet d’interpréter ces
différences est la flexibilité conformationnelle du noyau péname. En effet celui-ci, grâce à des
mouvements pseudo-rotatoires du cycle thiazolidine, est capable de modifier non seulement
sa forme, mais aussi l’orientation de ses substituants (schéma 11) (Cohen, N. C. 1983).

CO2H

O CO2H O
N N

S S

I II

schéma 11 : Pseudo-rotation du noyau péname.

Ainsi, dans la conformation I, le groupement acide carboxylique est en position pseudo-axiale

(plus stable), et en position pseudo-équatoriale dans la conformation II (moins stable). Les
deux formes ont été observées expérimentalement dans des études cristallographiques sur les
pénicillines. De petites variations d’énergies (~ 0,7 kcal/mol) accompagnent le passage de
l’une à l’autre, permettant à la fonction acide de fluctuer facilement entre ces deux positions.
Des structures plus rigides comme les pénèmes et les carbapénèmes, dépourvues d’effets
pseudo-rotatoires, doivent elles, répondre strictement aux critères géométriques de l’enzyme
pour pouvoir interagir.
Une étude comparative des structures 3-D de molécules actives et inactives a permis à Cohen
de mettre en évidence l’importance de la distance entre le carbone de l’acide carboxylique et
l’oxygène de la fonction lactame, et ainsi, de rationaliser les différences d’activité observées
(tableau 5).

39
 Chapitre 1

Conformation
composé activité Distance (Å)
du COOH
S

N
O + 3,198
COOH

∆3-céphalosporines

N
pseudo-
O
C
O
- 2 équatoriale + 3,568

∆2-thiénamycines
S

N
O + 3,899
COOH

pénicillines
S

N
O - 4,111
COOH

∆2-céphalosporines

N
O pseudo-axiale - 4,276
CO2-

∆1-thiénamycines
S

N
O - 4,263
COOH

pénicillines

tableau 5 : Relation entre la conformation du –COOH

et l’activité antibiotique des β–lactames.

Il a été postulé à la vue de ces résultats, que la géométrie des composés inactifs est différente
de celles des molécules actives. La première se rapproche structuralement de la conformation

40
 Chapitre 1

I (pseudo-axiale) du noyau péname, qui constituerait de cette manière une forme inactive des
pénicillines, et est caractérisée par une distance de plus de 4,1 Å entre l’oxygène de la
fonction lactame et le carbone de la fonction acide. Dans les β–lactames affichant une activité
biologique, et ressemblant à la conformation II du noyau péname, cette distance est plus
courte et comprise entre 3,0 et 3,9 Å (c : distance de Cohen). Cette approche a permis
d’expliquer de façon rationnelle, l’inactivité des analogues structuraux tels que les ∆2-
céphalosporines ou les ∆1-thiénamycines.
Si ce facteur est encore utilisé aujourd’hui dans l’industrie pour l’élaboration de nouvelles
substances, il faut cependant souligner le faible nombre de molécules utilisées pour l’étude de
relation structure-activité (9). Une étude plus complète (114 β–lactames issus de la CSD) a
ainsi mis en évidence les limites de ce paramètre, à savoir qu’il existe des composés actifs
pour lesquels c > 3,9 Å (acide clavulanique), et en a défini un autre résultant de l’analyse
conjointe de h et de c et donnant, selon les auteurs, de meilleures corrélations entre la
structure et l’activité biologique (Nangia, A. 1996).
Le pouvoir antibiotique d’une molécule est fortement dépendant de sa structure 3-D. Le
composé doit, s’il veut interagir efficacement avec sa cible, posséder la conformation
adéquate ou la possibilité de modifier sa forme et l’orientation de ses substituants.

6. Conclusion

Depuis les années 40 et l’utilisation des premiers agents antibactériens les

microorganismes ont développé et/ou acquis, au travers d’échanges et de mutations, la
capacité de survivre. Cette résistance, objet de toutes les inquiétudes, évolue continuellement.
La diversité des mécanismes impliqués et la possibilité de les cumuler, confèrent aux
bactéries l’arsenal nécessaire pour lutter contre une grande variété d’antibiotiques.
En particulier, la production de protéases à sérine (β–lactamases) capables d’hydrolyser
rapidement les composés β–lactames pour les rendre inactifs ou la modification des cibles de
ces molécules (PBPs résistantes), constituent aujourd’hui, les formes de résistance les plus
répandues et les plus problématiques.
Dès les premiers signes, l’homme a recherché de nouvelles structures susceptibles d’enrayer
la progression de ce phénomène. L’hémisynthèse, le screening des sols et des organismes ont
permis de mettre à jour rapidement les grandes familles d’antibiotiques connues actuellement.

41
 Chapitre 1

La mise au point de nouveaux composés a nécessité de comprendre les raisons de l’activité

biologique de ces molécules. Cette dernière fut attribuée de manière intuitive à la réactivité
chimique des β–lactames. L’activation du cycle à quatre chaînons, peu commun dans la
nature, était alors expliquée par la tension angulaire, la fusion d’un second cycle ou
l’inhibition de la résonance de l’amide par pyramidalisation de l’azote. Mais ces hypothèses
furent toutes contredites expérimentalement. Il est clair que l’aspect chimique joue un rôle
important dans l’activité des antibiotiques, néanmoins, celle-ci ne peut se réduire à de tels
critères.
L’évolution des connaissances permet, à l’heure actuelle, de mieux appréhender les relations
structure-activité (antibiotiques, enzymes) et les interactions (enzyme-substrat, récepteur-
agoniste) dans des systèmes complexes. Dans le domaine des β–lactames comme dans
d’autres, l’activité biologique requiert des considérations géométriques strictes. Seule une
molécule présentant la bonne conformation pourra interagir avec sa cible de façon efficace,
via le maximum d’interactions stabilisantes. Dans le cas qui nous intéresse, certains composés
possèdent une propriété qui leur confère une adaptabilité conformationnelle. En effet, le
noyau thiazolidine des pénicillines est capable d’osciller entre deux conformations, actives et
inactives, dans lesquelles l’orientation des substituants est modifiée. Cette caractéristique
fournit une explication rationnelle à l’inactivité de certains analogues structuraux, qui
pourtant présentent une réactivité chimique non négligeable, mais qui sont figés dans des
conformations inadéquates.
Aujourd’hui malgré l’état de nos connaissances et l’urgence de la situation, de moins en
moins de nouveaux médicaments antibiotiques sont mis sur le marché. La plupart des
molécules sont des dérivés d’antibiotiques déjà connus, possédant pour un temps, un plus
large spectre d’action, une plus grande efficacité et/ou des propriétés pharmacologiques
améliorées…
Une meilleure hygiène et l’utilisation à bon escient des antibiotiques peuvent permettre de
ralentir l’évolution du phénomène de résistance, mais le compte à rebours est enclenché et le
besoin d’innovation est réel.

42