LES CELLULES

Belguendouz H
Les cultures cellulaires

•Définition :

Passage d’un organisme à des cellules isolées dans un milieu et

des conditions de croissance artificiels
 Quelques points de repère dans le développement de la culture tissulaire et cellulaire

• Début 20ème
- Des cellules embryonnaires de poulet peuvent être maintenues en vie dan une solution saline hors du corps de
l’animal
- Culture de moelle épinière d’amphibien dans un caillot de lymphe: preuve que les axones sont produits sous
forme d’extension de cellules nerveuses isolées

• 1940 - 1960
- Développement des milieux de culture
- Première lignée cellulaire humaine: lignée HeLa

• 1970 – 2000 : Premières applications

- Mise au point des hybridomes et des anticorps monoclonaux
- Production de cellules transfectées à l’échelle industrielle et de biomolécules (protéines recombinantes)

• 2000 +:
- Culture de cellules souches embryonnaires
- Développement de l’ingénierie cellulaire et tissulaire, de la thérapie cellulaire
 Notion de stérilité
Culture ne contenant que les cellules que l’on souhaite y trouver
et aucun autre organisme (autre cellule eucaryote, bactéries, champignons, levure, virus)
Pourquoi?
•Induit du stress par déprivation (le contaminant prolifère plus vite et consomme
les nutriments du milieu)
•Stress par des signaux de danger qui modifient les réactions d’une cellule

Les contaminants les plus courants

•Les bactéries de notre peau, E. Coli, S. Aereus
•Levures
•Mycoplasmes
•Autres types cellulaires (quand un même expérimentateur travaille au même endroit
avec plusieurs types cellulaires)

Eviter les contaminations

• filtre 0,22 mm (ne laisse pas passer les virus)
• autoclavage
Les types de cultures
 Elles peuvent être classées en fonction:

 Leur origine :
 De l’organisme : culture primaire (organes; tissus ou cellules)
 D’une culture cellulaire : culture secondaire ou lignée cellulaire
 Types de cultures (en fonction de l’organisation cellulaire)
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Culture de
Culture d’organe Culture d’explants
cellules isolées

Tissue dans une interface Tissue dans une interface Tissue désorganisés :
« liquide-gaz » « liquide-solide » Les cellules forment des
Structure histologique Les cellules migrent pour monocouches à l’interface « liquide-
maintenue former des excroissances solide »
 Les zones dans les cultures d’organes
7

Cellules en mitose (division)

Cellules non mitotiques

Nécrose (mort cellulaire)

 Cultures organo-typiques
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Les différentes cellules sont mises en co-

cultures avec ou sans matrice extracellulaire
=> structure organo-typique recréée
 Culture primaire d’explants
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Transfert des pièces dans le flacon

Incubation toute la nuit avec un film fin du
milieu de culture

Compléter le milieu de culture au volume

final après 24 h

Après une semaine, les cellules peuvent

être vue à l’extérieur de l’explant
10
Explant Primaire

Mouse cellules de carcinome squameux

de peau de souris avec une excroissance
épithéliale
Les cellules

 Elles peuvent être classées en fonction:

 De leur interactions avec le support

 Libres (flottantes) : cellules hématopoïétiques
 Adhérentes (en nappe) : toute autre cellule
12
Cellules leucémiques humaines (libres)
13
Neurones (adhérentes)

Cellules du bulbe
olfactif d’un rat de 5
jours =>
4 jours in vitro
 Cellules musculaires squelettiques (adhérentes)
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Les cellules (3)

 Elles peuvent être classées en fonction:

 De leur capacité à proliférer

 À vie limitée : cellules normales différenciées
 À vie illimitée: cellules souches, transformées ou cancéreuses
Évolution des cultures cellulaires
17

Mort cellulaire
Les cellules normales
À nombre de repiquage limité

 Obtention
À partir de prélèvement tissulaire: avec ou sans dissociation
 Dissociation des liaisons fortes entre cellules
 Mécaniques : broyage, vortexage…
 Enzymatique essentiellement

 Mise en culture : culture primaire

 Repiquage ou passage : culture secondaire
cultures primaires
Les cultures primaires

La notion de culture primaire est simple: il s'agit d'aller chercher une cellule dans un organisme
pluricellulaire et de la faire pousser in vitro. En pratique, c'est un peu plus compliqué.

Difficultés de la culture primaire

•Obtention des cellules
•Leur maintien en culture
•Les cellules primaires ne sont généralement pas immortelles
=> phénomène de sénescence
Obtention de cellules primaires
Deux sources de cellules sont possibles :
-des cellules isolées dans les liquides biologiques comme le sang (lymphocytes sur gradient
de Ficoll avec centrifugation).
-des cellules isolées à partir de tissus ou d'organes. Un tissu est formé d'un ensemble de
cellules et éventuellement d'une matrice extracellulaire. Les tissus appartiennent en général à
un organe constitué d'un tissu principal et de nombreux tissus accessoires : tissus conjonctifs
d'emballages, tissus des vaisseaux sanguins, neurones...).
Dans un tissu, il existe plusieurs types de cellules
• Parfois il y a intérêt à conserver les différents types de cellules qui conservent certaines
interactions.
• Parfois il y a nécessité de séparer un type cellulaire. Cela est réalisé:
- par méthode de clonage
- par méthodes de séparation physique
Les cultures primaires flottantes

Les cellules hématopoïétiques, telles que certaines cellules du sang ou de la moelle osseuse,
sont des cellules à développement rapide et faciles à prélever sur un animal ou un humain.

•La moelle osseuse est particulièrement riche en précurseurs, qui vont reconstituer une
moelle osseuse in vitro, et générer quelques générations de cellules avant de péricliter.

•Les cellules du sang sont également faciles à prélever: une prise de sang sur anticoagulant
(type héparine/EDTA) permettra d'en récupérer des quantités plus ou moins importante
selon le volume de sang et la cellule d'intérêt
Les cultures primaires adhérentes

Les cellules d'intérêt peuvent aussi faire partie d'un organe, qu'il va falloir dissocier.
Les méthode diffèrent selon les organes et les cellules à en extraire, mais
généralement, il faut détruire l'architecture de l'organe, mécaniquement ou
enzymatiquement, puis séparer les cellules d'intérêt des cellules gênantes.
fibroblasts myoblasts
 Conditions de cultures primaires

Les cellules primaires sont très sensibles à leur environnement. Mis à part les cellules à
développement rapide, de moelle osseuse ou d'intestin par exemple, qui sont capables
de se développer en formant spontanément une matrice, les autres cellules, comme les
lymphocytes par exemple, sont incapables de se développer en culture dans du milieu
de culture standard. Dans ces conditions, il faut trouver :
•un facteur de croissance spécifique, qui dépend du type de cellule à privilégier.
•une cellule nourricière adaptée qui permettra d'habiller le plastique d'une couche
de cellules sur lesquelles les cellules d'intérêt pourront pousser et échanger des
nutriments
 Les contaminations en culture primaire

La contamination est un problème naturel dans une culture primaire, car l'organisme dont provient
les cellules n'était pas stérile. Il faut donc décontaminer les prélèvements, ce qui induit un stress
supplémentaire pour les cellules, et ajouter des antibiotiques.
Le contaminant cellulaire principal dans une culture primaire issue d'un animal sont les fibroblastes,
qui sont les cellules cicatricielles. Elles prolifèrent facilement en s'étendent en tapis de cellule en
fuseau, et forment elles-même une couche nourricière parfois bénéfique ; mais parfois aussi elles
envahissent la culture et affament les cellules d'intérêt. Il est difficile de s'en débarrasser
Les cellules à vie illimitée
(transformées ou éventuellement embryonnaires)

 À nombre de passages illimité donnant une lignée continue

 Les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale: cellules
Vero, cellules rénales de singe africain (Cercopithecus aethiops)
 Aspect fibroblaste : fusiforme
 Adhérant rapidement au support de verre ou plastique grace aux ions
Ca2+ ou Mg2+
 Autres cellules
 Cellules tumorales:
 HeLa (tumeur utérine),
 KB (carcinome oral humain)
 Cellules embryonnaires:
 MRC-5 (poumon fœtus humain)
 3T3 (embryon de souris)
 Evolution des cellules en culture

28
29

Finite cell line (green)

Continuous cell lines (blue, red)
Les lignées cellulaires
 Les lignées cellulaires

Les lignées cellulaires sont des cellules "immortelles", c'est-à-dire que l'on peut maintenir en
culture indéfiniment. Ce sont des cellules qui ont été rendues immortelles car :
•elles sont cancéreuses

•elles sont contaminées par un virus qui les rend immortelles (comme un virus du groupe
Herpès ou le SV40)

•elles ont été modifiées par génie génétique pour être immortelles ; le plus simple étant de
leur injecter le gène codant pour la protéine rendant immortel (comme le gène T du virus
SV40).
 Les lignées cellulaires (suite)

Leur culture est considérée comme facile, car elles échappent à tout phénomène de sénescence, et
échappent plus ou moins à l'apoptose. Elles s'adaptent donc facilement aux conditions de culture
artificielles.
En conséquence, les lignées sont exposées au risque de dérivation de souche, qui pose des problèmes de
reproductibilité entre deux laboratoires différents.
En pratique, une lignée est isolée dans un laboratoire X. Ses caractéristiques sont publiées et la lignée est
distribuée ou vendue dans le monde entier. Chaque laboratoire va avoir ses propres conditions et
habitudes de manipulation, qui vont induire des pressions de sélection différentes. Les lignées sont très
adaptables, et vont donc suivre la pression pour s'adapter. Il en résulte que tous les laboratoires qui
pensent travailler sur la souche du laboratoire X, travaillent en fait sur des souches légèrement
différentes. Plus le temps passe, et plus les habitudes de manipulation sont éloignées des standards, et
plus les souches dérivent, ce qui conduit parfois à des querelles entre laboratoires de recherche. Pour
cette raison, les laboratoires doivent constituer des banques de lignées, conservées dans l'azote liquide,
avec le plus petit nombre de passages possible. Le cas échéant, il faut re-faire une expérience avec une
lignée "jeune" pour valider ce qu'on a pu obtenir avec une lignée passée des dizaines de fois.
 Les lignées cellulaires adhérentes

Les cellules adhérentes occupent la surface du flacon de culture, et sont donc soumises à l'inhibition
de contact, c'est-à-dire que lorsque la culture approche de la confluence (c'est-à-dire que toute la
surface ou presque est occupée par les cellules), les cellules cessent de pousser ou se différencient.
Dans les deux cas, la manière avec laquelle les cellules poussent va changer, ce qui perturbera la
culture.
Il faut donc passer les cellules avant la confluence. Il faut pour cela les détacher du support pour
pouvoir les resuspendre dans du milieu de culture neuf. Pour les détacher, il existe plusieurs
méthodes :
•L'utilisation d'un grattoir, qui va racler les cellules ;
•L'utilisation de trypsine, qui va opérer une digestion enzymatique des protéines d'adhésion ;
•L'utilisation d'un chélateur du calcium, type EDTA, qui va empêcher l'action des lectines.
De toutes ces méthodes, la chélation du calcium stresse le moins les cellules, mais ne suffit pas
toujours. De plus, cela va empêcher les cellules de coller au plastique ou au verre, mais pas de
coller entre elles. De ce point de vue là, l'utilisation de la trypsine sera d'une efficacité maximale
 Digestion enzymatique : Trypsination
34
 Trypsination (2)
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Les lignées cellulaires flottantes

Les cellules flottantes occupent le volume de milieu disponible. Elles ne sont pas directement
concernées par l'inhibition de contact, mais par la déprivation du milieu en nutriments. Il faut donc
surveiller leur densité, la plupart des cellules de type lymphocytaire supportant bien des densités
de 105 à 106 cellules par mL. Certains types de cellules, notamment les hybridomes, sont cultivés
de manière très dense, pour forcer la production de la protéine d'intérêt
 Bases moléculaires du cancer :
les oncogènes

Mise en évidence des oncogènes par transfection d’ADN de tumeurs humaines dans des
lignées cellulaires de souris.
Les oncogènes sont des gènes cellulaires impliqués dans la prolifération cellulaire. Lorsque
ces gènes sont mutés ou que leurs régulateurs sont mutés, la prolifération cellulaire devient
anarchique et se fait au détriment de la différenciation cellulaire.
Deux classes d’oncogènes ont ainsi été caractérisées :
Classe I: oncogène immortalisant
Classe II: oncogène transformant
 2 types de lignées cellulaires
Les lignées cellulaires immortalisées :
- nombre de génération infini
- maintien de l’inhibition de contact
- dépendance d’ancrage

Les lignées cellulaires transformées :

- nombre de génération infini
- perte de l’inhibition de contact
- indépendance d’ancrage : croissance en agar
Exemples de lignées transformées ou immortalisées

- cellules Hela provenant d'une tumeur utérine

- cellules KB provenant d'un carcinome oral humain

- cellules Jurkatt provenant d’un lymphome humain

- cellules 3T3 provenant d'un embryon de souris

- cellules Véro et Cos provenant de rein de singe

- cellules MRC-5 provenant de poumons de foetus humain

Avantages et inconvénients des lignées
cellulaires et des cultures primaires

A vous de répondre!
Transformation cellulaire
 Transformation cellulaire
42

Amas de cellules 3T3 transformées :

Ces amas se forment spontanément
en culture dense de cellules 3T3.
43
44

Finite cell line (green)

Continuous cell lines from transformed glia (blue) and metastatic
melanoma (red)
Transfection de cellules eucaryotes
- Transfection transitoire : faire exprimer de façon transitoire un gène
ou un marqueur dans une lignée cellulaire.
 Analyse de promoteurs, production de protéines,
recherche de partenaires…..
 Vecteurs d’expression eucaryotes, infection virale

- Transfection stable : obtenir une lignée cellulaire clonale exprimant le

gène ou le marqueur d’intérêt.
 Analyse d’une fonction, d’une régulation…..
 Nécessité d’un gène de sélection
Les cellules souches
 Définition

 Une cellule souche est une cellule indiférenciée. Elle a la

capacité unique de:
 s’auto-renouveler indéfiniment ou de
manière prolongée

 produire différentes cellules spécialisées

(différenciées)
 On parle de cellules souches chez les animaux en particulier, mais les méristèmes des plantes
en sont aussi constitués. De manière plus globale,
tous les organismes pluricellulaires possèdent des cellules souches.
 Qu’entend-on par auto-
renouvellement?
Divisions asymétriques

 La division d’une cellule souche est

asymétrique - les cellules filles ne sont
pas identiques, et seule une des deux
est identique à la cellule mère
Différents types de cellules souches

• totipotentes : ovule fécondé ou cellules issues des 1eres divisions de cet œuf
(morula de 2 à 8 cellules); permettent le développement d’un individu complet
à condition d’être in vivo. C’est seulement à ce stade que peut s’opérer un clonage
reproductif par scission embryonnaire

• pluripotentes : dont font partie les cellules ES. Les cellules ES ne peuvent pas
produire un organisme entier, mais peuvent se différentier en cellules issues des 3
feuillets embryonnaires y compris les cellules germinales. Elles proviennent de la
masse interne du blastocyste (au stade 40 cellules). Le clonage reproductif à partir
des cellules ES n’est pas possible.

• multipotentes : présentes dans l’embryon ou dans l’organisme adulte. Elles

conservent leur capacité à s’autorenouveler. Elles sont déjà engagées dans une
certaine direction; leurs potentialités sont plus restreintes que les cellules ES. Par ex
Les cellules hématopoïétiques
Cellules souches et différenciation cellulaire
 Catégories des cellules souches

Il existe 2 catégories de cellules souches selon leur origine:

- cellules souches pluripotentes : cellules embryonnaires,
pouvant se différencier en tous les types cellulaires présents dans
l ’embryon et l ’adulte

- cellules souches somatiques: chez l’adulte, cellules

multipotentes ou unipotentes spécifiques d’organe, formant un
nombre limité de types cellulaires

Attention à ne pas confondre avec les cellules précurseurs ou

progénitures
Trois sources possibles de cellules souches totipotentes
Trois types de cellules souches pluripotentes isolées chez les mammifères:
- cellules de carcinome embryonnaire (EC)
- cellules germinales embryonnaires (EG)
- cellules souches embryonnaires (ES)

EC ES EG

origine PGC ICM PGC

caryotype aneuploïde euploïde euploïde

chimère soma soma/germ soma/germ

PA + + +
Télomérase + + +
OCT4 + + +
 Cellules souches embryonnaires

Cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste pré-

implantatoire.

Isolée chez la souris, les primates et l’homme (Thomson, 1998)

Définition:
- dérivées de l’embryon préimplantatoire
- prolifération prolongée dans un état indifférencié
- après culture prolongée, différenciation in vitro possible en cellules
méso-, ecto- ou endodermiques
Euploïdes et haut niveau d’expression de télomérase
 Trois critères de totipotence

Transfert des ES dans un blastocyste murin: formation d’une souris

chimère où les ES participent à tous les tissus y compris la lignée
germinale

Transfert des ES dans des souris immunodéficientes : formation de

tératomes constitués des 3 couches germinales e

ES retirées de la couche cellulaire nourricière: différenciation et

formation d’une structure 3D appelée corps embryoïde contenant des
tissus d’origine méso-, ecto- ou endo-dermique.
En fonction des conditions de culture, obtention de cultures
enrichies en progéniteurs spécifiques de différents types
cellulaires.
Intérêt d’obtenir des cultures pures: développement de méthodes
de sélection cellulaire
Différenciation in vitro obtenue pour différents types cellulaires:

-myocytes/cardiomyocytes
-adipocytes, chondrocytes
-cellules endothéliales
-neurones, glie
-cellules ß des ilots pancréatiques
 Pureté des cultures - Isolement de cellules

L’obtention de lignées pures reste un problème majeur:

-identifier des marqueurs de surface : tri cellulaire au FACS

-induire l’expression de marqueurs (de surface ou non) permettant

un tri cellulaire

-induire l’expression de gènes de résistance : contre-sélection des

populations non désirées
L’intérêt

 Étudier la différentiation au cours du développement embryonnaire et identifier

des facteurs impliqués dans ce processus.

 Ressource unique pour des analyses fonctionnelles du développement précoce de

l’embryon.

 Modèle pour créer des maladies humaines in vitro.

 Tester des produits tératogènes.

 Source renouvelable de cellules pour des thérapies par transplantations.

. . . etc.
 Comparaison des cellules ES
humaines et murines
Établissement des
souris homme
lignées

A partir d’embryon
congelé - +

Stade Idem
blastocyste
de développement (6eme j. après l’insémination)
(3.5 dpc)

Séparation ICM/ séparation mécanique après uniquement

trophectoderme quelque jours de culture par immunochirurgie
ou par immunochirurgie

à partir de « paquets »de cellules

Passage des cellules à partir des cellules isolées
isolés mécaniquement ou par
en culture par trypsination
légère digestion enzymatique
 Comparaison des cellules ES
humaines et murines
Caractéristiques
des lignées souris homme

Des colonies de cellules Des colonies « plates »,

morphologie étroitement compactées cellules moins serrées avec des
bordures plus distinctes.
Normal, diploïde, maintenu
caryotype Idem, mais la majorité est
au cours des passage
La majorité XY, Les XX, XO XX et stable.

expression de Élevée dans toutes Elevée uniquement dans les ES.

la télomérase les cellules.

Croissance clonale + _
Clonage
 transfert de noyau d’une cellule somatique

Il est possible de produire des cellules souches

embryonnaires à partir d’une cellule somatique
adulte par transfert de noyau; le noyau d’une
cellule adulte est ainsi fusionné avec un ovule
dont on a retiré le noyau.
Transfert de noyau d’une cellule somatique

Les clonages thérapeutiques et reproductifs

commencent tous deux par un transfert de
noyau d’une cellule somatique, mais le
clonage reproductif permet au blastocyste de
se transformer en un fœtus.

• Le clonage thérapeutique a pour but de récolter des cellules souches

embryonnaires en vue de mener des recherches sur d’éventuels
traitements
 l’embryon sert à fabriquer des cellules souches embryonnaires.

• Le clonage reproductif a pour but de créer un nouvel organisme,

identique à la cellule adulte donneuse
 le blastocyste est implanté dans l’utérus.
 Les premières expériences de transplantation
nucléaires

Tadpole (frog larva) Frog egg cell

Nucleus

UV
Intestinal cell
Nucleus

Transplantation Nucleus
of nucleus destroyed
1962
Tadpole
Eight-cell
embryo

Le clonage de têtards a montré que les noyaux de cellules

animales différenciées gardaient tout leur potentiel
Gurdon,
génétique. 1962
 La première expérience de transplantation
nucléaire chez un mammifère

Le 1er mammifère cloné

s’appelle Dolly et a été
produit en 1997
 Avantages de la culture cellulaire
69

Caractéristique Avantages
Environnement physico-chimique Control du pH, température, osmolarité
Conditions physiologiques Control des concentrations des hormones et des nutriments
microenvironnement Régulation des interactions avec la matrice et entre les
cellules
Homogénéité de la lignée cellulaire Milieux sélectifs, clonage
Caractérisation Cytologie, immuno-marquage
Conservation Azote liquide
Validation et accréditation Origine, histoire, pureté
Réplication et variabilité dosage
Économie des réactifs Volumes réduits, accès direct, faible cout
Contrôle de la température et du temps Doses, concentration et temps définis,
mécanisation Micro-titration, robotique
Réduction de l’utilisation des animaux Pharmaceutique, cosmétique, cytotoxicité et screening
 Limites de la culture cellulaire
70

Domaine inconvenants
Expertise nécessaire Manipulation
Contamination chimique
Contamination microbienne
Contamination croisée
Control de l’environnement Place de travail
Incubation, control du pH
Maitrise et élimination des Biorisques
quantité et prix Équipement important
Consommables : milieux, sérum, plastics
Instabilité génétique et phénotypique Hétérogénéité, variabilité
Dédifférenciation, adaptation, sélection
Identification des types cellulaires Expression des marqueurs, histologie, cytologie,
géométrie et microenvironnement
 Applications de la culture cellulaire (1): dans le domaine de la recherche
fondamentale

71
 Applications de la culture cellulaire (2): dans le domaine biomédical et industriel

72

1. Domaine du diagnostic
- Cytogénétique
- Production d’anticorps monoclonaux

2. Domaine des biotechnologies et de la pharmacie

- Elaboration de vaccins
- Production de médicaments
Criblage
Effets toxiques
Protéines recombinantes
-Ingénierie cellulaire et tissulaire: cyto-compatibilité des biomatériaux,
immunothérapie cellulaire, cellules épidermiques, cellules souches embryonnaires