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LL34 : Diversifier ses pigments : la

stratégie gagnante des cyanobactéries
Dans la grande arborescence de la Vie, les microorganismes
sont souvent oubliés alors qu’ils ont joué un grand rôle dans
l’évolution de la Planète, et continuent à nous étonner. Leur
biodiversité est énorme, et ils sont responsables des cycles
d’éléments minéraux et organiques essentiels.

Cet atelier pratique, basé sur l’expérimentation, permet aux

élèves de réaliser une extraction de pigments de
cyanobactéries de A à Z.

Ce dossier pédagogique présente les cyanobactéries et leurs

pigments, l’utilité des pigments ‘antenne’ pour bien exploiter
toute l’énergie solaire, le principe de la chromatographie (ici sur
fine couche de silice) et le protocole expérimental.

Notre laboratoire, au Centre d’Ingénierie des Protéines, a

construit une collection de cultures de cyanobactéries (surtout
de l’Antarctique et l’Arctique), qui peut être utilisée par les
professeurs de l’enseignement secondaire qui désireraient, soit
refaire cet atelier, soit montrer au microscope la diversité des
microorganismes, ou tout autre usage pédagogique.

Contact : Annick Wilmotte (awilmotte@[Link]) ou Marine

Renard (mrenard@[Link]) 04/366 33 87
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1. Qui sont les cyanobactéries ?

Les cyanobactéries sont des bactéries qui réalisent la photosynthèse qui libère de l’oxygène
(comme les plantes, et pour cause, les ancêtres des chloroplastes appartiennent au lignage
des cyanobactéries !). Ce sont probablement les ‘architectes’ de notre atmosphère. En effet,
il y a environ 3 milliards d’années, elles ont produit de l’oxygène pendant des centaines de
millions d’années, de sorte que l’atmosphère primitive de la Terre riche en gaz carbonique,
méthane, etc s’est enrichie en oxygène jusqu’à atteindre les concentrations actuelles. Ceci
était indispensable pour permettre aux autres organismes (dont nous-mêmes , les humains)
d’évoluer.
Actuellement, on observe dans cyanobactéries dans pratiquement tous les milieux où il y a
de la lumière, de l’eau, du gaz carbonique et des minéraux. Elles se retrouvent ainsi dans
des milieux qu’on dit ‘extrêmes’ comme les souches thermales d’eau chaude (jusque
70°C), les milieux hypersalins, et les environnements polaires.

2. Comment exploitent-elles la lumière ?

Une des clefs de leur succès, est leur équipement en pigments capables de capter le plus
possible de photons dans un spectre étendu de longueur d’onde. Elles sont donc équipées
non seulement de chlorophylle et de caroténoïdes, comme les algues et les plantes, mais
aussi de pigments spéciaux appelés ‘phycobiliprotéines’ et qui captent la lumière dans les
longueurs d’onde où la chlorophylle n’est pas efficace

Fig. 1
([Link] )

Dans la Figure 1, la ligne continue montre les zones du spectre de la lumière où la

chlorophylle est capable de capter l’énergie des photons. La ligne en pointillé donne le
rendement de la photosynthèse. Comme on peut le voir, il y a une zone allant de 480 à 650
nm, où la chlorophylle n’absorbe pas et où le rendement de la photosynthèse avec ce
pigment est très bas. C’est là qu’interviennent les phycobiliprotéines, qui incluent deux
pigments majeurs : la phycoérythrine (absorption entre 490 et 570 nm) et la phycocyanine
(absorption entre 610 et 655 nm).
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Voici un spectre de phycoérythrine :

Fig. 2. spectre d’absorption de phycoérythrine

(([Link]

Voici un spectre de phycocyanine :

Fig. 3 ; spectre d’absorption de phycocyanine

([Link]

3. Comment les pigments coopèrent pour une photosynthèse plus

efficace ?
La chlorophylle a est le pigment primordial qui participe à la photosynthèse. Les autres
pigments sont des pigments ‘accessoires’ ou ‘antennes’ qui capturent la lumière aux autres
longueurs d’onde que la chlorophylle a et qui sont capables de lui transférer cette énergie
lumineuse:

énergie de la lumière
pigments ‘antennes’ chlorophylle a

Tous les végétaux qui font la photosynthèse possèdent de la chlorophylle a. Certains

possèdent aussi de la chlorophylle b (ex. les épinards).

Les caroténoïdes sont une autre famille de pigments ‘antennes’, qui absorbent vers 450 nm
(Fig. 4). On les trouve aussi dans tous les végétaux photosynthétiques et certaines
bactéries. En plus de servir de pigment ‘antenne’, ils servent aussi de protecteurs car ils
permettent d’absorber l’excès d’énergie lumineuse
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Fig. 4. Spectre d’absorption du béta-carotène et de la fucoxanthine

([Link]/pedagogie/svt/infoprat/EvCapExp/04EvI)

Voici donc le résultat final montrant que les cyanobactéries qui ont de la phycocyanine
(toujours) et de la phycoérythrine (parfois, selon les souches), peuvent exploiter l’énergie
présente tout le long du spectre de la lumière visible (Fig. 5) :

Fig. 5. Spectres d’absorption des différents pigments de cyanobactéries

4. Qu’est ce qui distingue ces pigments au point de vue chimique ?

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Voici les structures (a) de la chlorophylle, (b) de 2 phycobiliprotéines : phycocyanine et

phycoérythrine, (c) de 3 caroténoïdes : beta-carotène, lutéine et fucoxanthine.

Fig. 5. Structure de quelques pigments photosynthétiques ([Link]

[Link]/DSVT/AGREG_SVT/Ressources/sujetDavid/[Link])

Il est intéressant de noter que toutes ces molécules contiennent des liaisons doubles
conjuguées qui sont essentielles pour l’absorption et le transport de l’énergie lumineuse.
Pour pouvoir les séparer, on utilise le fait que les phycobiliprotéines sont solubles dans les
solvants aqueux, ce qui n’est pas le cas des chlorophylles et caroténoïdes. Pour cet atelier,
on les extrait dans un tampon phosphate dont le rôle est de simplement stabiliser les
pigments. Par contre, les pigments solubles dans les solvants organiques sont séparés par
chromatographie sur silice, grâce au fait qu’ils ont des polarités différentes dans ces
solvants (éther de pétrole, acétone, etc).
Les organismes utilisés seront des plantes utilisées comme points de comparaison
(Tradescantia (« misère ») et carottes) et des cultures de cyanobactéries provenant de
l’Antarctique et l’Arctique. Ces cultures ont été rassemblées dans une collection de
cyanobactéries polaires, en cours d’élaboration, pour un projet de recherche des BCCM
(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)
([Link]

5. Principe de la chromatographie
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([Link]
s1sm/documents_TP/c_epinards.htm)

Un solide adsorbant est fixé sur un support rigide (plaque de chromatographie). Ici, c’est
une fine couche de silice. La solution à analyser (l’extrait de cyanobactéries ou de plantes)
est déposée goutte à goutte en un point à l'une des extrémités de la plaque. Le solvant (ici
l’acétone) s'évapore et seuls restent sur la plaque les produits à analyser. La plaque est
alors mise en contact avec un autre solvant (appelé éluant) choisi en fonction des produits à
analyser et qui par capillarité s'élève dans l'adsorbant. Au passage, les produits à analyser
sont entraînés par l'éluant: les produits très polaires, fortement "accrochés" à l'adsorbant
ont peu tendance à passer dans l'éluant et sont peu entraînés; ils restent donc près du point
initial où ils ont été déposés. Les produits moins polaires, moins adsorbés, sont plus
facilement entraînés et migrent sur la plaque. Ils s'élèvent (ou s'éluent) d'autant plus qu'ils
sont moins adsorbés et s'ils ne le sont pas ils migrent en même temps que le solvant. On les
trouve alors à l'endroit où s'est arrêté l'éluant sur la plaque (front de solvant).

Les chlorophylles possédant des groupements polaires sont peu éluées alors que les
caroténoïdes peu polaires le sont plus. La chromatographie permet même de distinguer les
caroténoïdes entre eux.
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Protocole expérimental
(Adapté du protocole pour la chromatographie sur papier de pigments de plantes de Mme
Marchesini, Athénée d’Alleur)

Matériel biologique :
-Feuilles de Tradescantia (‘misère’), morceau de carotte
-Cultures de cyanobactéries polaires lyophilisées

Cultures de cyanobactéries (souches 2, 40, 54, 61 et 80)

Matériel :
-1 cuve à chromatographie
-une plaque de chromatographie sur couche mince de silice
-des tubes eppendorf et pistons en plastique adaptés

Plaques de silice en couche mince

Produits :
-Solvant (85% éther de pétrole, 10% acétone, 5 % isopropanol ou isobutanol)
-Tampon PBS (pour 1 litre : 8 gr NaCl, 0.2 gr KH2PO4, 1,15 gr Na2HPO4x2H2O,
0.2 gr KCl, pH 7.2)
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A. Extraction des pigments hydrosolubles de cyanobactéries :

phycoérythrine et phycocyanine
1. Ajouter environ 300 µl de tampon PBS au culot de cellule (frais ou
lyophilisé) , casser les cellules avec les pistons en plastique en pressant
fortement sur le culot pendant 1-2 minutes.
2. Centrifuger pour enlever les débris cellulaires et observer la couleur du
surnageant

Mélange de phycoérythrine et phycocyanine chez les souches S2 et S40, phycoérythrine

chez la souche S54 et phycocyanine chez la souche S61.

B. Extraction des chlorophylles et caroténoïdes de souches de

cyanobactéries
1. Ajouter quelques gouttes d’acétone (pour arriver au milieu du tube) au culot
de cellules lyophilisés et casser les cellules avec les pistons en plastique en
pressant fortement sur le culot.
2. Centrifuger (ou décanter/filtrer) pour enlever les débris cellulaires
3. Utiliser le surnageant pour la chromatographie

C. Extraction des chlorophylles et caroténoïdes de plantes

1. Couper en petits morceaux des carottes rapées ou des feuilles de plante
2. Introduire les petits morceaux de carottes ou de plante dans un microtube,
ajouter 400 µl d’acétone et broyer avec les pistons en plastique jusqu’à
l’apparition d’une couleur intense du liquide
3. Centrifuger (ou décanter/filtrer) pour enlever les débris cellulaires
4. Utiliser le surnageant pour la chromatographie

D. Chromatographie sur couche mince de silice

1. Enlever l’humidité résiduelle des plaques de silice en les mettant 2h dans
une étuve à 60-80°C
2. Enfiler des gants et découper la surface nécessaire (environ 10 cm pour 5 ou
6 échantillons)
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3. Avec un crayon, tracer délicatement une ligne à 2 cm du bord, et indiquer

où les échantillons seront déposés
4. Avec une pipette pasteur, prélever par capillarité environ 25 µl des
surnageants à analyser et les déposer à l’endroit respectif sur la plaque.
Sécher avec un sèche-cheveux (important). Le dépôt ne devra pas avoir une
taille trop importante. Recommencer les dépôts 4 à 5 fois en fonction de
l’intensité de celui-ci.

Dépôt des échantillons

5. Positionner la plaque dans la cuve (où le solvant arrive à 1 cm du bas de la

plaque) et laisser migrer le front de solvant pendant 30 min. Placer la cuve
dans un endroit pas trop éclairé.

6. Noter au crayon par un trait la hauteur atteinte par le solvant, entourer

chaque tache et noter sa couleur (les couleurs pâliront rapidement).

7. Positionner la plaque dans la cuve (où le solvant arrive à 1 cm du bas de la

plaque) et laisser migrer le front de solvant pendant 30 min. Placer la cuve
dans un endroit pas trop éclairé.

8. Noter au crayon par un trait la hauteur atteinte par le solvant, entourer

chaque tache et noter sa couleur (les couleurs pâliront rapidement).
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caroténoïdes

chlorophylle a
chlorophylle a

chlorophylle b

xanthophylles

Comparaison des patrons de pigments de 1) Tradescantia (‘misère’), 2) Epinard (dépôt

trop gros), 3) Carotte 4) Souche de cyanobactérie S40

Wilmotte, A. 2007. Les cyanobactéries, comment exploiter au mieux la lumière? In: Probio
Service. Recueil trimestriel. 26ème année. septembre 2007 (3). p 219-230. Association des
professeurs de biologie PROBIO ASBL. (Belgium)