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Génie génétique appliqué

à l’amélioration des espèces
fourragères

B. Verdaguer, M.H. Bonnecuelle,

C. Balardelle, M. Romestant, P. Lacaze

Les principaux efforts de la recherche dans le domaine des bio-

technologies ont été initialement réalisés sur les espèces de gran-
des cultures. Mais des méthodes de transformation génétique ont
été développées pour la plupart des espèces fourragères, comme
le montre cette importante synthèse bibliographique.

RÉSUMÉ

Des variétés de luzernes tolérantes au glyphosate vont être commerciali-

sées en 2005 sur le marché américain. De nombreux programmes ciblés
sur la qualité nutritionnelle des fourrages ont aussi été développés : des
plantes de luzerne et de fétuque élevée hypolignifiées, d’une digestibilité
accrue de 5 à 10%, ont été obtenues ; d’autres approches s’intéressent à
la synthèse de tannins condensés, de fructanes et de protéines riches en
acides aminés soufrés. Des études concernent la tolérance aux maladies,
aux stress environnementaux et la modification du cycle de développe-
ment. Les fourrages transgéniques peuvent aussi être utilisés pour la pro-
duction à faible coût de molécules à intérêt industriel ou pharmaceutique.
Des exemples liés à la synthèse de vaccins et à la production de phytase
dans la luzerne seront présentés.

MOTS CLÉS
Digestibilité, espèce fourragère, génomique, luzerne, résistance à la sécheresse, résistance au
froid, résistance aux maladies, sélection variétale, sénescence, stress salin, tanin, valeur alimentaire.
KEY-WORDS
Cold resistance, cultivar breeding, digestibility, feeding value, forage species, genomics, lucerne,
resistance to diseases, resistance to drought, salt stress, senescence, tannin.
AUTEURS
Biogemma, 5 rue St Germain-L’auxerrois, F-75001 Paris ; [email protected]

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lus de 20 ans après l’obtention de la première plante génétique-

P ment modifiée, le génie génétique végétal reste une technologie

émergente dans l’amélioration des plantes. Aujourd’hui, la
quasi-totalité des cultures transgéniques dans le monde concerne
deux gènes bactériens de tolérance à un herbicide et de résistance
aux insectes. En Europe, l’acceptation sociétale de ces plantes trans-
formées est une controverse ininterrompue depuis les premières
demandes d’implantation dans les années 90. Ce constat montre la
nécessité de développer de nouvelles plantes transgéniques dont les
bénéfices pour l’agriculture et l’environnement seront clairement éta-
blis. Les progrès constants réalisés dans la connaissance des voies
métaboliques chez les végétaux apportent de nouvelles cibles pour la
transgenèse. De plus, la dernière décennie a vu l’essor de la géno-
mique avec le développement de grands programmes internationaux
de décryptage du génome de plantes modèles, Arabidopsis et riz,
mais aussi Medicago truncatula. Les génomes du ray-grass, du trèfle
blanc et de la fétuque sont aussi étudiés par plusieurs organismes
nationaux (AGresearch en Nouvelle-Zélande, AgVictoria en Australie
et Fondation Noble aux USA). L’ensemble de ces travaux va accroître
notre connaissance des génomes et offrira de nombreux gènes can-
didats pour les approches transgéniques. Ces nouvelles ressources
seront utilisées pour créer des plantes transgéniques de “deuxiè-
me génération” pour lesquelles des caractères de qualité ou de
meilleure adaptabilité à l’environnement seront améliorés. Des
plantes fourragères génétiquement modifiées possédant une meilleu-
re valeur nutritive rentrent dans cette catégorie

A ce jour, la transformation génétique de la plupart des

espèces de prairie est maîtrisée. Les premières luzernes transgé-
niques ont été obtenues par Agrobacterium tumefaciens en 1988
(CHABAUD et al., 1988). Les premières graminées transgéniques de
ray-grass et de fétuque élevée, longtemps récalcitrantes à la culture
in vitro, ont été obtenues en 1995 par micro-bombardements
(SPANGENBERG et al., 1995a et b). Une méthode utilisant Agrobacterium
a été récemment développée pour ces espèces (BETTANY et al., 2003).
Les contraintes spécifiques des espèces fourragères résident
d’une part dans l’absence de matériel hautement régénérable et
adapté à la culture in vitro et d’autre part dans un schéma de sélec-
tion basé sur la création de variétés synthétiques. La création d’une
variété transgénique implique dans un premier temps l’obtention
d’une plante transformée exprimant le gène d’intérêt et dans un
deuxième temps le transfert de celui-ci par croisements à l’ensemble
des composants génétiques constituant la variété. De nombreux tra-
vaux concernent l’obtention de plantes fourragères génétiquement
modifiées. Cet article fait un état des lieux des différents programmes
aboutis ou en cours sur ces espèces. On pourra noter la prédominance
de la luzerne qui reste la plante la plus ciblée par ces programmes.
Ces efforts de recherche sont conduits essentiellement aux USA et
dans l’hémisphère sud (Australie et Nouvelle-Zélande), traduisant un
très fort différentiel de recherche avec l’Europe. La société Biogemma
est une des seules en Europe à s’intéresser à ce type d’approche à
travers un programme concernant la modulation de la lignification
chez la fétuque élevée.

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

1. Tolérance aux herbicides

La tolérance aux herbicides est historiquement un des premiers
caractères transgéniques transférés aux plantes. C’est typiquement
ce que l’on appelle maintenant un caractère transgénique de première
génération pour lequel l’expression du gène étranger est directement
responsable de la plus-value agronomique. L’herbicide ayant suscité
le plus de travaux est le glyphosate, matière active de l’herbicide non
sélectif Roundup®. Le glyphosate est un inhibiteur de la 5-enol pyru-
vyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), une enzyme clé de la
synthèse des acides aminés aromatiques essentiels pour le dévelop-
pement de la plante. C’est une cible herbicide particulièrement inté-
ressante car cette voie métabolique est absente chez les mammifères.
Dès le début des années 1990 a on pu montrer que la sur-expression
d’un gène de EPSPS dans une plante transgénique permettait un bon
niveau de tolérance à l’herbicide. En 1994, la société Monsanto mettait
au point les premières plantes de soja transgénique tolérant au
glyphosate après intégration du gène de l’EPSPS de la souche CP4
d’Agrobacterium. Cette enzyme a la particularité de présenter une
forte activité catabolique avec une faible inhibition par le glyphosate.
En 1996, les premiers sojas transgéniques étaient commercialisés
sous l’appellation “Roundup Ready®”. Cette technologie est devenue
depuis l’image de marque de la société Monsanto et a été transférée
à la plupart des plantes économiquement importantes : coton, maïs,
soja, colza... La dernière espèce en date devrait être la luzerne qui
attend courant 2005 les autorisations permettant sa commercialisa-
tion. Les premières luzernes transgéniques contenant le gène CP4
EPSPS ont été obtenues en 1997 par la société Monsanto. Différents
matériels élites contenant le transgène ont été obtenus et ont été uti-
lisés par la société Forage Genetic International pour créer plusieurs
variétés transgéniques (VAN DEYNZE et al., 2004). A ce jour, 63 auto-
risations d’essais au champ couvrant plusieurs états des USA sont
effectives pour la luzerne Roundup Ready®.

Les avantages des plantes transgéniques tolérantes à un herbici-

de total sont maintenant bien connus. Ils permettent une meilleure
gestion de l’ensemble des mauvaises herbes et en particulier des
espèces pérennes parfois difficiles à contrôler en prairies. L’application
de l’herbicide n’est plus strictement dépendante d’un stade végétatif
précis, autorisant ainsi plus de flexibilité dans les traitements. Par
ailleurs, un herbicide comme le glyphosate est globalement moins
rémanent et moins toxique que la plupart des autres herbicides sélec-
tifs utilisés. Ce type de culture transgénique devrait contribuer à bais-
ser substantiellement la quantité totale d’intrants chimiques.

Les questions liées aux cultures tolérantes aux herbicides sont

aussi bien identifiées : apparition de résistances, modification dura-
ble des populations de mauvaises herbes, pollution génétique et
acceptation sociétale. Dans le cas spécifique des plantes de prairies,
la problématique majeure concerne les flux de pollen transgénique.
Ce problème pourrait être cependant plus limité chez les espèces ento-
mophiles comme la luzerne. Des travaux récents utilisant des abeilles
pollinisatrices déterminent les distances minimales permettant
d’observer des taux de pollution croisée inférieurs à 1% (FITZPATRICK et

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al., 2003). Ce problème sera particulièrement sensible dans le cadre de

productions de graines qui devront être réalisées avec des contraintes
d’isolement bien définies. Dans le cadre de fourrages, une récolte pré-
coce, avant ou au début de la floraison, permettra de limiter les flux de
pollen.

2. Valeur alimentaire du fourrage

et de l’ensilage

■ Amélioration de la digestibilité
et voie de synthèse de la lignine
Les éleveurs veulent être plus autonomes pour l’alimentation de
leur bétail tout en maintenant un bon niveau de production. Deux
objectifs qui ne sont pas contradictoires à la condition qu’ils puissent
disposer de fourrages plus énergétiques et mieux consommés. La diges-
tibilité est la composante essentielle de la valeur alimentaire d’un four-
rage. Celle-ci est définie comme l’aptitude d’un aliment à être dégradé
dans le rumen par la flore microbienne pour libérer les hydrates de car-
bone et les protéines assimilables par l’animal. La teneur en lignine
des parois végétales, les différences dans sa composition, ainsi que
la nature des liaisons la liant aux hémicelluloses, constituent les
facteurs majeurs limitant la digestibilité des fourrages. Les lignines
sont des hétéropolymères complexes formés de trois unités structura-
les ou monolignols, l’alcool p-coumarylique, l’alcool coniférilique et
l’alcool sinapilique qui produisent respectivement les unités phénylpro-
panoïdes H (p-hydroxyphényl), G (guaiacyl) et S (syringyl) une fois incor-
porés dans le polymère. La voie de synthèse de la lignine, qui a pour
point de départ la phénylalanine, est relativement bien caractérisée
(BOERJAN et al., 2003), et les gènes des enzymes clés intervenant dans la
formation des monolignols ont été clonés chez la plupart des espèces
importantes. La digestibilité est déterminée par la teneur totale en
lignine mais aussi par la part respective des unités G, S et H dans
le polymère. Chez les légumineuses fourragères, les lignines sont cons-
tituées essentiellement de monomères S et G alors que l’on trouve une
proportion significative de résidus H chez les espèces monocotylédones.
De plus, les lignines sont un composé “vivant” qui va évoluer selon les
conditions de l’environnement et selon le stade de développement. On
observe que le rapport S/G augmente généralement avec la maturité de
la plante tandis que la digestibilité diminue. De nombreux programmes
de génie génétique ont été entrepris dans le but de diminuer les teneurs
en lignines ou de modifier le rapport S/G avec pour objectif final d’aug-
menter la digestibilité des fourrages. Les travaux les plus aboutis chez
les espèces de prairies concernent la fétuque élevée et la luzerne. Pour
ces deux espèces, des programmes sont en cours pour produire des
plantes hypolignifiées en altérant l’expression d’enzymes clés de la
voie de la biosynthèse de la lignine.

• La fétuque élevée
C’est une graminée très largement utilisée dans les prairies pour
sa productivité et son caractère rustique. Sa digestibilité très moyenne
limite cependant sa valeur alimentaire. La société Biogemma conduit

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

actuellement des travaux sur des fétuques élevées à activité cinna-

moyl-coenzymeA- réductase (CCR) réduite. Ces plantes ont été obte-
nues après transformation avec une construction génétique permettant
la sur-expression d’un ARN antisens de CCR de fétuque. Les différents
transformants primaires (issus de la régénération in vitro de cellules
transformées) présentent des taux d’activité CCR variables : les plantes
les plus inhibées possèdent en moyenne une activité 50% inférieure à
celle des témoins non transformés. Un premier criblage des transfor-
mants primaires a été réalisé en mesurant la digestibilité de la matière
sèche in vitro de plantes en serre. Les résultats montrent que les diges-
tibilités les plus fortes sont obtenues pour les transformants les plus
inhibés. Un gain maximal de 5% de digestibilité a été mesuré par
rapport à un groupe de plantes témoins. Depuis 2002, Biogemma
conduit en France un essai de recherche en plein champ pour évaluer
et comparer des fétuques transgéniques issues de différents événe-
ments de transformation génétique. Ces plantes ont intégré dans leur
génome la même construction génétique mais diffèrent par la localisa-
tion et le nombre d’insertions du transgène. L’essai est constitué de
descendants F1 transgéniques et non transgéniques issus de croise-
ments entre transformant primaire et composants d’une variété com-
merciale. Des mesures de digestibilité seront effectuées sur trois
saisons et sur la totalité des coupes réalisées. La digestibilité est éva-
luée par des analyses NIRS ou enzymatique “pepsine cellulase” de la
matière sèche récoltée. Sachant le rôle majeur du métabolisme des phé-
nylpropanoïdes dans le développement de la plante, l’essai au champ
est aussi essentiel pour évaluer le comportement agronomique ou pour
détecter un phénotype anormal dans les conditions de culture.

D’autres travaux sur des fétuques hypolignifiées sont conduits

par la fondation Noble aux USA. Des stratégies ARN antisens et de
co-suppression ont été appliquées pour obtenir des plantes dont
l’expression du gène codant l’alcool cinnamylique déshydrogénase
(CAD) a été diminuée (CHEN et al., 2003). Sur l’ensemble des trans-
formants primaires obtenus, deux plantes se sont révélées particu-
lièrement intéressantes. Des inhibitions enzymatiques de l’ordre de
30 à 50% associées à une diminution de la teneur en lignine de 15%
ont été mesurées. L’analyse fine de la lignine des plantes transgé-
niques montre une composition altérée avec une diminution signifi-
cative du rapport S/G. Au final, ces auteurs ont pu montrer que la
digestibilité de la matière sèche de ces plantes à activité CAD
réduite avait augmenté de 7,2 et 9,5% pour les deux événements
de transformation sélectionnés. Un essai en champ réalisé en
2002 a pu montrer que les caractéristiques agronomiques des plantes
transformées étaient normales (caractéristiques de pousse, architec-
ture, date de floraison, nombre d’épis, production de graines). Un
projet analogue, ciblé sur l’acide caféique 3-o-méthyltransférase
(COMT), a aussi été entrepris par la même équipe de recherche (CHEN
et al., 2004). Des plantes de fétuque élevée ont été obtenues avec une
activité enzymatique COMT diminuée de l’ordre de 40 à 50%. Cette
altération métabolique entraîne une diminution de la teneur en lignines
de 28% ainsi qu’une modification de la composition de la lignine qui voit
son rapport S/G diminué. Ces modifications ont pour conséquence
d’augmenter la digestibilité de la matière sèche d’environ 10%.
Ces plantes sont actuellement testées en champs aux USA.

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• La luzerne
Elle constitue aussi une espèce très importante dans l’alimenta-
tion du bétail. Très riche en protéines, en minéraux et vitamines, sa
valeur alimentaire peut cependant être limitée, en particulier dans la
fraction tige, par une mauvaise digestibilité. Cette digestibilité sera
d’autant plus limitée que le stade de récolte est tardif. Plusieurs tra-
vaux ont été entrepris pour obtenir des variétés hypolignifiées. Des
plantes de luzerne ont été transformées avec une séquence antisens
de gène CAD (BAUCHER et al., 1999). La sur-expression de cette
séquence conduit à une diminution de l’activité enzymatique de 70%
tandis que la composition de la lignine est largement altérée par une
diminution importante des résidus de type S. Une amélioration de la
digestibilité de la matière sèche a été observée pour les plantes pré-
sentant les niveaux d’activité CAD les plus faibles.

La fondation Noble a aussi développé des programmes ciblés sur

les activités COMT et CCoAOMT (caffeoyl CoenzymeA 3-o-méthyl-
transférase). Des stratégies ARN antisens et de co-suppression ont été
appliquées aux séquences codantes des gènes COMT et CCoAOMT de
la luzerne (GUO et al., 2001a). Dans ce projet, l’expression des gènes
est contrôlée par le promoteur PAL2 du gène codant la phénylalanine-
ammonia-lyase du pois, qui est actif préférentiellement dans les zones
de lignification et en particulier dans les tissus vasculaires. Dans les
deux cas, des transformants primaires de luzerne ont pu être obtenus
avec des taux de lignine diminués de 30%. Les plantes à activité
COMT réduite avaient une diminution plus importante des unités S
tandis que les plantes transgéniques CCoAOMT avaient une réduction
du nombre d’unités G traduisant les implications différentes de ces
enzymes dans la voie de biosynthèse des monolignols. Les plantes les
plus intéressantes ont été croisées avec une variété commerciale et les
descendances transgéniques et non transgéniques ont été évaluées au
champ sur trois lieux différents. Ces essais ont pu montrer que les
plantes transgéniques présentaient une meilleure digestibilité par
rapport aux plantes témoins. En particulier, on peut noter une aug-
mentation de l’ordre de 5% de la digestibilité dans le rumen de
veaux fistulés (GUO et al., 2001b). WL Research et Forage Genetic
International, deux des plus importants acteurs du marché de la
luzerne aux USA, testent déjà depuis trois ans des plantes de luzerne
à activité COMT réduite, montrant ainsi qu’une valorisation com-
merciale de ces produits est envisageable dans un proche avenir.

Ces travaux montrent donc qu’il est possible par la voie du

génie génétique d’obtenir des plantes fortement hypolignifiées avec
une digestibilité significativement améliorée. S’il est vérifié qu’un
gain de 10% de la digestibilité de la matière sèche peut être obtenu,
cela constituerait une rupture dans la courbe de progrès génétique
de ces dernières années. Il est aussi remarquable de constater que,
dans les cas cités, des modifications importantes de la teneur ou/et
de la composition en lignine n’affectent pas significativement le
phénotype et le comportement de la plante, témoignant ainsi de
la grande plasticité de la lignine.

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

■ Tannins condensés
Un autre axe de recherche sur la valeur nutritionnelle des four-
rages concerne les tannins condensés (CTs) ou protoanthocyanidi-
nes. Ce sont des polymères de flavan-3-ol, ou catéchines, produits
du métabolisme des flavonoïdes. Leur voie de synthèse est largement
commune avec celle des anthocyanes. Ces polymères présentent un
grand intérêt dans l’amélioration de la valeur alimentaire des légumi-
neuses comme la luzerne et le trèfle blanc. En effet il est démontré
que, présents en faible quantité dans la ration, les CTs se fixent sur
les protéines et en ralentissent la dégradation dans le rumen. Ainsi,
ils diminuent les phénomènes de météorisation et augmentent la
quantité des protéines passant dans l’intestin. Les CTs peuvent aussi
diminuer la protéolyse lors de l’ensilage. L’apport de CTs améliore
donc la nutrition azotée en favorisant l’absorption des acides
aminés essentiels. Les effets bénéfiques des CTs disparaissent
cependant à concentration élevée où ils diminuent fortement l’appé-
tence et influent négativement sur la valeur nutritionnelle. Les CTs
sont cependant absents dans les tissus végétatifs des légumineuses
cultivées. Le génie génétique, par sa capacité à modifier les voies
métaboliques, offre des perspectives prometteuses pour autoriser
une production de protoanthocyanidines dans les feuilles de légumi-
neuses. On a ainsi pu montrer pour la première fois chez la luzerne
que la synthèse de CTs dans les parties aériennes de la plante était
possible suite à la sur-expression d’un facteur de transcription impli-
qué dans la régulation de la voie de biosynthèse des anthocyanes
(RAY et al., 2003). L’approche transgenèse est cependant limitée par
la méconnaissance des étapes enzymatiques spécifiques conduisant
à la synthèse des protoanthocyanines. Récemment, l’étude de
mutants d’Arabidopsis a permis d’isoler le gène Ban codant une
anthocyanidine réductase, enzyme clé qui catalyse la conversion
des précurseurs leucoanthocyanidines en flavan-3-ol, unité de base
des polymères de CTs. Des travaux récents chez le tabac montrent
que la manipulation des niveaux d’activité de cette enzyme pourrait
permettre la synthèse de protoanthocyanidines dans les feuilles de
plantes transgéniques (XIE et al., 2003 ; DIXON et al., 2005). Ces
résultats encourageants sont une première étape vers l’obtention
d’une luzerne n’entraînant pas de phénomène de météorisation.

■ Protéines riches en résidus soufrés,

cystéine et méthionine
Les carences en acides aminés soufrés (méthionine et cystéine)
dans l’alimentation des ruminants peuvent être extrêmement limitan-
tes pour la productivité animale. Ceci est particulièrement vrai pour
la production de laine mais aussi dans une moindre mesure pour le
lait et la viande. Ces carences sont fréquentes dans la mesure où les
protéines de la ration sont rapidement dégradées par les micro-orga-
nismes du rumen et converties en protéines microbiennes pauvres en
résidus soufrés. Des programmes de transformation génétique ont
donc été entrepris pour répondre à ce problème. La stratégie choisie
est de sur-exprimer dans les fourrages une protéine de réserve de
graine naturellement riche en acides aminés soufrés et résistante

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à la dégradation dans le rumen. Un gène codant une albumine du

tournesol a ainsi été introduit dans le trèfle (CHRISTIANSEN et al., 2000)
et la fétuque élevée (WANG et al., 2001), ainsi qu’un gène de zeïne de
maïs dans la luzerne (BELLUCI et al., 2003) et dans le trèfle (SHARMA et
al., 1998). Une séquence signal de rétention dans le réticulum endo-
plasmique est associée au transgène pour permettre à la protéine de
s’accumuler en grande quantité dans ce compartiment cellulaire.
Malgré cela, les taux de production de ces protéines de réserve dans
les feuilles des plantes transformées sont en deçà des seuils nécessai-
res pour réellement avoir un impact nutritionnel (environ 4% des pro-
téines solubles totales). De nouveaux systèmes d’expression plus
efficaces (nouveaux promoteurs, intégration et expression du transgè-
ne dans les chloroplastes par exemple) doivent donc être envisagés
pour valider ce type de stratégie.

■ Sucres solubles
Les fructanes sont des polyfructoses qui constituent la princi-
pale forme de sucre de stockage chez de nombreuses espèces et chez
les graminées fourragères en particulier. La teneur en carbohydrates
solubles détermine en partie la densité énergétique de la ration et
constitue donc une composante essentielle de la valeur nutritive d’un
fourrage. Chez le ray-grass, on a pu constater que la diminution de
la valeur nutritive durant l’été, due à la lignification, était en partie
compensée par une accumulation de fructanes. Il est par ailleurs
suggéré que les fructanes jouent un rôle dans la tolérance au froid et
à la sécheresse. Pour toutes ces raisons, les fructanes constituent
une cible intéressante pour l’amélioration des fourrages.

L’approche choisie vise à augmenter la teneur en fructanes

en sur-exprimant une enzyme impliquée dans leur synthèse. Le gène
candidat peut être d’origine végétale, comme dans le cas du ray-grass
sur-exprimant la fructosyltransférase du blé (HISANO et al., 2004), ou
d’origine microbienne. Les bactéries synthétisent en effet un analo-
gue du fructane, ou levane, et des gènes codant la levanesucrase de
Bacillus subtilis et la fructosyltransférase de Streptococcus salivarius
ont été transférés respectivement chez le ray-grass (YE et al., 2001)
et le trèfle blanc (JENKINS et al., 2002). Les travaux réalisés à ce jour
ne permettent pas de conclure quant aux améliorations nutritionnel-
les de ces plantes transgéniques mais une tolérance accrue au froid
a pu être constatée chez le ray-grass (HISANO et al., 2004). Plusieurs
indications semblent suggérer cependant qu’une trop forte accumu-
lation de fructanes pourrait avoir un effet négatif sur la croissance et
le développement des plantes (CAIRNS, 2003).

3. Stress biotique et abiotique

■ Résistance aux maladies

Les progrès de la recherche durant cette dernière décennie per-
mettent une meilleure compréhension des mécanismes de défense des
plantes vis-à-vis des pathogènes. L’identification de nombreux gènes
de défense, l’exploration des voies de transduction, l’identification de

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

mécanismes de défense contre les virus offrent de nombreux candi-

dats pour une approche de transformation génétique des espèces
cultivées. Cependant, les exemples de valorisation au champ de ce
type d’approche sont encore assez rares. Les relations entre plantes et
micro-organismes sont par nature évolutives et l’efficacité d’une straté-
gie transgénique de tolérance efficace et stable reste un vrai challenge.
Par ailleurs, et chez les espèces fourragères en particulier, la plupart
des problèmes liés aux pathogènes sont contrôlés convenablement
par la sélection classique.
Le seul vrai succès commercial du génie génétique dans ce type
de thématique provient de l’utilisation des gènes Cry issus de
Bacillus thuringensis sur maïs et coton. L’expression des gènes Cry
permet d’apporter une réponse très efficace et spécifique contre cer-
tains lépidoptères ravageurs. Ce type de gène a aussi été utilisé
chez la luzerne et le trèfle blanc pour lutter contre les noctuelles et
les Hepialidae (STRIZHOV et al., 1996 ; SPANGENBERG et al., 2001). Une
autre approche dans la lutte contre les insectes consiste à faire pro-
duire aux plantes génétiquement modifiées des inhibiteurs de
protéinase. L’ingestion de ces enzymes inhibe la capacité digestive
des insectes. On a pu montrer ainsi que la sur-expression d’une anti-
protéinase de Manduca sexta (sphynx du tabac) pouvait diminuer les
attaques de thrips sur la luzerne (THOMAS et al., 1994).
Une infestation par un champignon pathogène induit sou-
vent chez la plante l’expression de ß 1-3 glucanases et de chitinases.
Ces enzymes attaquent directement la paroi des champignons et per-
mettent la libération de signaux moléculaires activateurs des réac-
tions de défense de la plante. Une protection contre le pourrissement
des racines de la luzerne, causée par le champignon pathogène
Phytophthora megasperma f. sp. Medicaginis, a ainsi pu être mesu-
rée sur des plantes de luzerne transgénique sur-exprimant une ß 1-
3 glucanase (MASOUD et al., 1996). Une approche intéressante est
proposée par TESFAYE et coll. (2004) qui ont associé le gène d’endochi-
tinase ech42 à un peptide signal d’une phosphatase du lupin permet-
tant l’exsudation de l’enzyme dans la rhizosphère de luzernes
transgéniques. L’expression d’une chitinase du riz dans le ray-grass
améliore aussi au laboratoire la résistance à la rouille couronnée,
Puccinia coronata (TAKAHASHI et al., 2004).
Des stratégies de résistances dérivées du pathogène (patho-
gen derived resistance) pour lutter contre les virus ont aussi été
appliquées sur les espèces fourragères. Dans ces stratégies, l’expression
d’une séquence d’origine virale, protéines de capside ou réplicases,
induit une protection contre les viroses. On peut ainsi citer les tra-
vaux sur la résistance à la mosaïque du ray-grass (XU et al., 2001)
et sur la résistance du trèfle blanc au virus de la mosaïque de la
luzerne, ou AMV (SPANGENBERG et al., 2001). Pour ce dernier cas, des
plantes transgéniques contenant la capside du virus ont été croisées
avec du matériel élite pour permettre la création de la première variété
tolérante à l’AMV (EMMERLING et al., 2003).
Le seul exemple de plante fourragère testée actuellement au
champ aux USA pour une résistance aux maladies concerne une
luzerne transformée avec un gène d’arachide codant la resvératrol

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B. Verdaguer et al.

synthase, RS (HIPSKIND et PAIVA, 2000). Il s’agit d’une enzyme absente

chez la luzerne dont l’expression va permettre la synthèse d’une nou-
velle molécule antimicrobienne végétale, le resvératrol. Cette molécule
considérée comme une phytoalexine est un stilbène, normalement
absent de la luzerne et connu pour son action antimicrobienne à
large spectre. L’expression du gène RS permet donc la synthèse
d’une nouvelle molécule complexe, pouvant renforcer les défenses de
la plante. Des inoculations expérimentales de feuilles de luzerne par
Phoma medicaginis , champignon pathogène responsable de la maladie
des tiges noires, ont montré une diminution significative de la taille
des lésions et du nombre de structures reproductives du champignon
dans les plantes transformées en comparaison aux plantes témoins.
Dans la même thématique, l’équipe de R. DIXON (HE et DIXON, 2000)
s’est appliquée à augmenter les niveaux de phytoalexines naturelles
de la luzerne par la sur-expression du gène de la isoflavone
7-o-méthyl transférase (IOMT). Cette enzyme est impliquée dans
la synthèse d’isoflavones à caractère antimicrobien : la médicarpine
et la formononétine. Une diminution des symptômes est observée
chez les plantes transgéniques suite à l’inoculation par Phoma
medicaginis.

■ Les stress abiotiques

Les stress liés à l’environnement tels que sécheresse, froid et
gel, excès d’eau, ainsi que les pollutions sont responsables de bais-
ses de production, de mauvaise implantation et d’altération de la per-
sistance des cultures fourragères. La tolérance au stress est donc
une thématique de recherche importante. La plupart des stress liés
à l’environnement, en particulier le froid et la sécheresse, produisent
dans la plante un choc oxydatif qui va se traduire par la production
de radicaux libres et de formes activées de l’oxygène. Ces molécules
actives dégradent les lipides membranaires et sont responsables de
dégâts irréversibles dans la plante. La tolérance au stress oxydatif
peut être considérée comme une stratégie globale pour lutter
contre les stress abiotiques. La plante possède des systèmes de
détoxification des molécules actives de l’oxygène, en particulier enzy-
matiques (superoxyde dismutase, catalase, peroxydase), mais ceux-
ci deviennent insuffisants en cas de stress important. Une stratégie
d’amélioration consiste donc à élever cette capacité naturelle de la
plante. Cette approche a été appliquée sur la luzerne par D.
MCKERSIE et coll. (1996 ; 1999 ; 2000) de l’université de Guelph
(Canada). L’objectif était de pouvoir améliorer la production de la
luzerne dans l’Ontario où sa persistance est limitée par la rigueur de
l’hiver. Pour cela, un gène codant une superoxyde dismutase a été
isolé chez le tabac et chez Arabidopsis et introduit dans le génome de
la luzerne. Des plantes transgéniques sur-exprimant l’une ou l’autre
enzyme ont été obtenues et testées à la fois en chambres de culture
et dans des expérimentations pluriannuelles au champ. L’ensemble
des données obtenues montre que les plantes de luzerne transgé-
nique ont une tolérance au froid, au gel et à la dessiccation supérieu-
re aux témoins non transformés. Ceci se traduit par une persistance
améliorée et une meilleure production de biomasse au champ,
exprimant une meilleure adaptation à l’environnement.

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

D’autres travaux moins avancés concernent la tolérance à

l’aluminium et au stress salin. L’acidité des sols limite la produc-
tion de nombreuses espèces de fourrages et en particulier la culture
de la luzerne. Un problème récurrent des sols acides concerne la
toxicité de l’aluminium. A pH acide, l’aluminium du sol devient solu-
ble et est absorbé par la plante dont il inhibe la croissance et l’ab-
sorption racinaire. On a pu remarquer que beaucoup de plantes
tolérantes exsudaient dans leur rhizosphère nombre d’acides orga-
niques (citrate, malate, oxalate) qui en se fixant sur l’aluminium lui
font perdre sa phytotoxicité. Cette propriété a été utilisée pour amé-
liorer le comportement de la luzerne en sol acide. Des plantes ont été
modifiées pour sur-exprimer une malate déshydrogénase permettant
une augmentation d’un facteur 7 de la quantité d’acides organiques
excrétés par les racines (TESFAYE et al., 2001). Cette modification a pu
être associée avec une tolérance accrue à l’aluminium et à une
meilleure croissance racinaire en sol acide.

La salinité des sols est aussi un problème croissant dans certai-

nes régions du monde où l’irrigation est importante. La présence de sels
est directement responsable de baisses de rendement et peut rendre à
terme les sols impropres à la culture. Des plantes de luzerne transgé-
nique tolérante aux sels ont pu être obtenues par la sur-expression du
facteur de transcription Alfin1 qui a une fonction probable dans la régu-
lation de l’expression de gènes dans les racines et lors de stress salin.
Les plantes produites se caractérisent en particulier par une meilleure
croissance racinaire en condition stressée mais aussi en condition nor-
male de culture (WINICOV et BASTOLA, 1999 ; 2000).

4. Développement de la plante

■ Sénescence
Le génie génétique peut être utilisé pour moduler des processus
physiologiques du développement de la plante. Les travaux les plus
intéressants concernant cette thématique sont ceux de la société
Cal/West Seeds aux USA qui s’intéresse aux processus de sénescen-
ce foliaire chez la luzerne. Une sénescence foliaire chronique et non
létale peut être déclenchée par toute une série de stress de l’environ-
nement (froid, sécheresse, pathogène, carence...) entraînant une bais-
se importante de la biomasse récoltée. Dans la série des événements
menant à la sénescence, les facteurs de croissance jouent un rôle
important : activateur de sénescence pour l’éthylène, l’acide abscis-
sique et méthyl jasmonate ou répresseur pour les cytokinines. La
stratégie de Cal/West consiste à utiliser cette propriété des cytokini-
nes pour bloquer la sénescence foliaire chez la luzerne. Une enzyme
clé de la voie de biosynthèse des cytokinines, l’isopentényl trans-
férase, est ainsi exprimée chez les plantes sous le contrôle du promo-
teur SAG12 dont l’expression est spécifique de la sénescence. Ceci
permet de retarder les phénomènes de la mort cellulaire se produisant
lors de la sénescence tout en évitant une surproduction de cytokini-
nes non contrôlée qui aurait des effets adverses sur le développement
de la plante. Les plantes de luzerne transgénique obtenues se carac-
térisent par la persistance d’un feuillage vert en condition de

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B. Verdaguer et al.

stress et par des qualités agronomiques globalement supérieures

aux plantes non transformées (SANDMAN et al., 2003). Plusieurs essais
au champ concernant ce matériel sont en cours aux USA. Une stra-
tégie identique a aussi été appliquée à des ray-grass (LI et al., 2004).

■ Floraison
La floraison est aussi un processus du développement ciblé par
des approches de génie génétique. La société DLF Trifolium et le
laboratoire national danois RISOE s’intéressent aux gènes impliqués
dans la transition des méristèmes végétatifs en méristèmes floraux.
Un gène du ray-grass homologue du gène terminal flower1 (TLF1)
d’Arabidopsis a ainsi été isolé. Sa fonction est de bloquer les méris-
tèmes apicaux à un stade végétatif ; il réprime donc la floraison. Le
gène Lp TFL1 a été sur-exprimé chez la fétuque rouge utilisée ici
comme modèle (JENSEN et al., 2004). Après vernalisation, un retard
de floraison est observé chez les plantes transformées, en corréla-
tion avec le niveau d’expression du transgène. Les plantes présentant
les niveaux d’expression les plus élevés ne fleurissent pas. Ces résul-
tats expérimentaux démontrent donc que les mécanismes contrô-
lant l’induction florale peuvent être modulés par transgenèse. Ce
type de stratégie peut avoir un double avantage : l’allongement de la
phase végétative de la plante permet d’augmenter la productivité en
fourrage et une modification de la phase de floraison peut constituer
un moyen pour contrôler les flux de pollen transgénique.
Le gène barnase codant une ribonucléase est souvent utilisé
associé à un promoteur pollen-spécifique pour induire par transge-
nèse une stérilité mâle génique. Cette stratégie a aussi été dévelop-
pée sur la luzerne (ROSELLINI et al., 2001) avec pour objectif principal
une utilisation dans la production d’hybrides. Cette approche peut
être aussi appliquée pour limiter les flux de pollen transgénique et
des systèmes fonctionnels ont déjà été mis en place dans des espè-
ces de gazons (LUO et al., 2003).

5. Production de nouveaux composés

Dans des plantes transformées, le génie génétique peut permet-
tre la synthèse de molécules à intérêt industriel ou pharmaceu-
tique. Cette perspective séduit les industriels pour produire en
grande quantité et à bas coût des protéines à haute valeur ajoutée.
La plante la plus utilisée dans ce type d’approche est le maïs et plu-
sieurs produits commerciaux existent déjà. Les fourrages sont aussi
utilisés et plusieurs exemples montrent que la luzerne est un modè-
le particulièrement adapté à ces applications. La transformation et la
régénération de luzernes transgéniques sont complètement maîtri-
sées et c’est une plante pérenne qui produit beaucoup de biomasse.
D’autre part, la luzerne peut être multipliée par bouturage, permet-
tant ainsi d’obtenir rapidement la population clonale d’un événement
d’intégration sélectionné. La luzerne est ainsi utilisée pour produire
des anticorps thérapeutiques ou de diagnostic destinés à la médeci-
ne humaine (KHOUDI et al., 1999). Mais ce type d’approche a aussi un
intérêt dans l’agriculture pour produire des molécules préservant la
santé des animaux ou la qualité de l’environnement.

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Génie génétique et amélioration des espèces fourragères

La luzerne étant une composante importante de l’alimentation

du bétail, elle peut être utilisée comme une source de vaccins
comestibles destinés aux animaux. L’approche de la transgenèse
associée aux techniques de biologie moléculaire permet en effet de
faire synthétiser à la plante un antigène recombinant qui, une fois
ingéré par l’animal, pourra produire une réaction immunitaire. Le
fourrage peut donc devenir une source de vaccin peu coûteuse et
facilement administrable. Cette approche reste à ce jour encore expé-
rimentale mais la validité du concept est déjà acquise. Le gène codant
la protéine de capside VP1 du virus de la fièvre aphteuse (FMDV :
Foot and mouth disease virus) a ainsi été introduit dans le génome de
la luzerne (WIGDOROVITZ et al., 1999). La protéine VP1 sans pouvoir
pathogène mais contenant des épitopes très immunogènes va s’accu-
muler dans les plantes transgéniques. Des feuilles de luzerne ont été
utilisées pour nourrir des souris sur lesquelles la réaction immuni-
taire produite ainsi que la protection contre une infection au FMDV
ont été étudiées. Toutes les souris nourries de luzerne génétiquement
modifiée ont développé une réponse immunitaire spécifique contre le
virus et 70% des animaux se sont montrés protégés contre une infec-
tion virale. La difficulté de cette approche réside cependant dans la
difficulté de quantifier la dose d’antigène administré oralement à
l’animal. Par ailleurs, le niveau d’antigène produit dans la plante
reste encore trop faible pour envisager une vaccination effective du
bétail. La même approche a aussi été appliquée pour produire un
vaccin contre le rotavirus bovin dans la luzerne et contre Manheima
haemolytica, agent pathogène responsable de la pasteurellose, dans
le trèfle blanc (WIGDOVOVITZ et al., 2004 ; LEE et al., 2001). Dans tous
les cas, une réponse immunitaire a été détectée chez les animaux
traités, démontrant que le fourrage transgénique peut être une source
de vaccins.

Les plantes transgéniques peuvent être utilisées comme “bio-

réacteur” pour permettre la synthèse d’enzymes, normalement pro-
duites industriellement en fermenteur. Un exemple intéressant pour
l’agriculture concerne la production de phytase dans des luzernes
transgéniques. La pollution de l’eau par des rejets de phosphate
issus des élevages d’animaux non ruminants (porcs et volailles
essentiellement) est un des challenges que doivent résoudre les mon-
des scientifique et agricole. Les animaux monogastriques sont inca-
pables de solubiliser l’acide phytique, source majeure de phosphates
dans les céréales et le soja, constituants importants de leur alimen-
tation. Une large proportion de ce phosphate d’origine végétale n’est
donc pas utilisée et est excrétée dans les fèces. L’ajout de phosphate
inorganique dans la ration pour répondre aux besoins des animaux
augmente encore le phénomène. L’addition de phytase dans la
ration, enzyme d’origine microbienne qui hydrolyse les acides phy-
tiques, fait diminuer de moitié les rejets de phosphate. Le coût de cet
apport limite cependant l’intérêt de ce procédé. Des programmes de
recherche ont donc été développés pour produire cette enzyme dans
des plantes transgéniques. Des chercheurs de l’USDA s’attachent
depuis plusieurs années à produire des luzernes transgéniques sur-
exprimant un gène de phytase d’Aspergillus ficuum. Ces chercheurs
ont ainsi pu montrer que ces luzernes transformées produisaient
une enzyme stable et active dans les feuilles de luzerne (ULLAH et al.,

Fourrages (2005) 183, 347-364 359

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B. Verdaguer et al.

2002). La phytase peut être récupérée simplement dans un jus de

feuilles et utilisée telle quelle dans la ration. Cette approche consti-
tue donc une alternative économiquement viable pour la production
de phytase. Le développement de variétés de maïs et de soja à faible
teneur en acide phytique pourrait cependant mettre un frein à ce
type d’approche transgénique. En effet, l’utilisation de ces variétés
dans la ration augmente de manière importante l’assimilation du
phosphate d’origine végétale et fait diminuer de 30 à 40% les rejets
animaux (CROMWELL et al., 2000).

Conclusion
L’ensemble des travaux présentés montre que le génie géné-
tique est maîtrisé chez les variétés fourragères. Ces approches peu-
vent être une source d’amélioration importante pour des
caractères difficilement accessibles aux méthodes classiques de
sélection. L’ensemble des programmes présentés vise à une amélio-
ration de la valeur alimentaire des fourrages et de la persistance des
prairies. Ces avancées peuvent constituer un atout dans les systè-
mes de production en donnant une place plus importante aux prai-
ries et en favorisant l’autonomie alimentaire des exploitations.

Des plantes transgéniques exprimant différents caractères

(résistance au glyphosate, hypolignification, tolérance aux pathogè-
nes, sénescence retardée) ont été testées au champ et les premières
commercialisations de variétés de luzerne sont envisagées. Les pro-
grès agronomiques de ces plantes sont réels et le génie géné-
tique peut avoir un impact considérable sur la création variétale.
Néanmoins, la valorisation dans l’agriculture de ces plantes transfor-
mées sera dépendante de la réponse apportée aux problèmes de flux
de gènes entre cultures et avec les espèces sauvages. L’impact pos-
sible d’un transgène doit être évalué au cas par cas selon le caractè-
re transféré. Un transgène d’origine végétale n’apportant pas
d’avantage sélectif particulier ne représente pas un risque supérieur
à un gène non transgénique. Pour les caractères apportant un avan-
tage sélectif ou pour des gènes exprimant des herbicides ou des
médicaments, des mesures d’isolement, des pratiques culturales ou
l’utilisation de stérilité pourront être envisagés.
Intervention présentée aux Journées de l’A.F.P.F.,
“Génétique et prairies”,
les 15 et 16 mars 2005.

360 Fourrages (2005) 183, 347-364

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B. Verdaguer et al.

SUMMARY

Genetic engineering applied to the improvement of forage

species
Most efforts in biotechnological research were at first applied to
the major field crops. For most species, methods of genetical transfor-
mation have also been developed, as is shown in the large literature.
Thus a number of lucerne cultivars tolerant to glyphosate will appear
on the American market in 2005. There have been also numerous pro-
grammes aiming at nutritional quality : plants of lucerne and of tall fes-
cue with low lignin contents and a digestibility increased by 5 to 10%
have been obtained ; other studies concern genes involved in the syn-
thesis of condensated tannins (protoantocyanidines), of fructanes and
of proteins rich in sulphur (cysteine, methionine). The problems linked
to tolerance to diseases, to environmental stresses, and to the modifi-
cation of the plants’ developmental cycle (senescence, flowering) are
also being attacked. Transgenic plants, particularly forages, can also
be utilized for the production at low cost of molecules of industrial or
pharmaceutical interest. Examples are given, which are linked to the
synthesis of vaccines and to the production of phytase in Lucerne
plants.

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