Licence 3, Spécialité : Microbiologie

Unité d’enseignement fondamentale 2 (UEF 3.1.2) :

Microbiologie moléculaire

Matière :

Biologie Moléculaire
&
Génie Génétique
Année universitaire : 2018-2019

Dr Souheyla BENSALMA 1
 PLAN

Introduction générale : de la cellule à la molécule

Partie 1 : La biologie moléculaire

Partie 2 : Le Génie Génétique

Partie 3 : Les techniques de base de la biologie moléculaire

Partie 4 : Introduction à la bio-informatique.

Partie 3
Partie 3 : Techniques de base
de la biologie moléculaire

Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

Chapitre 2 : Manipulation des protéines

Chapitre 3 : interaction entre Acide nucléique et

protéine

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Partie 3 Partie 3 : Techniques de base
de la biologie moléculaire
Chapitre 3 : Interaction entre Acide nucléique et protéine
I.Techniques d’analyse et de mise en évidence des interactions
acides nucléiques / protéines
 I.1. Retards sur gel
 I.2. Foot- printing

II.Techniques permettant de déterminer la (les) protéine(s) qui se

fixe(nt) sur un acide nucléique cible (ADN ou ARN)

 II.1. Simple hybride

III.Techniques permettant de déterminer la cible (ADN ou ARN)

d’une protéine

 III.1. Immunoprécipitation de chromatine

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Partie 3 Chapitre 3 :
Interaction entre Acide nucléique et
protéine
L’expression d’un gène dépend de la fixation sur la région promotrice
des protéines dites de régulation (tels que les facteurs de
transcription….). Les techniques de transformation et d’étude
fonctionnelle de promoteurs permettent de délimiter des régions
nucléotidiques du promoteur susceptibles d’intervenir dans la
régulation de l’expression du gène.

I. Techniques d’analyse et de mise en évidence des

interactions acides nucléiques / protéines

 I.1. Retards sur gel

 I.2. Foot- printing

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Partie 3 Chapitre 3 : Interaction entre Acide nucléique et
protéine
I. Techniques d’analyse et de mise en évidence des interactions acides nucléiques /
protéines
I.1. Retards sur gel

« Basée sur que la fixation d’une protéine à un fragment d’ADN réduit sa mobilité électrophorétique »

- La technique de gel-retard (appelée aussi EMSA pour Electrophoretic Mobility Shift Assay) permet de
mettre en évidence des protéines ou des complexes protéiques qui se fixent sur des régions promotrices
(séquences nucléotidiques).

- Le principe consiste à :

1. Récupérer un extrait nucléaire (contient toutes les protéines régulatrices) des noyaux de différents tissus
(généralement un tissu connu pour exprimer ce gène et un autre connu pour ne pas exprimer ce gène)
2. Hybrider ces protéines avec le fragment d’ADN radioactif (P 32) portant la séquence promotrice dont on
veut connaitre les protéines qui s’y fixent.
3. Ensuite, déposer sur gel non dénaturant (gel d’agarose par exemple) le mélange d’hybridation pour
séparer les fragments d’ADN par électrophorèse. Si le fragment s’est hybridé avec une protéine
nucléaire, sa migration sera ralentie par rapport au fragment libre non hybridé à des protéines. Le gel est
autoradiographié et la mobilité électrophorétique des fragments d’ADN complexés ou non est révélée.
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Partie 3 Chapitre 3 : Interaction entre Acide nucléique et
protéine
I. Techniques d’analyse et de mise en évidence des interactions
acides nucléiques / protéines
I.1. Retards sur gel (suite)
- Le gel retard peut être réalisé à partir d’un extrait protéique plus complexe (un extrait nucléaire par
exemple) mais aussi à partir de protéines purifiées.

- On peut vérifier la spécificité de l'interaction ADN-protéine par l'incubation préalable du complexe avec
un anticorps qui se fixe spécifiquement à la protéine. Le complexe ternaire ADN-protéine-anticorps a
une migration encore plus retardée, qu'on qualifie de supershift.

- Cette technique ne permet pas de purifier ou de caractériser les protéines interagissant avec le
promoteur. Elle permet que la mise en évidence des complexes nucléoprotéiques formés entre les
protéines et un fragment d’ADN.

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Partie 3 Chapitre 3 : Interaction entre Acide nucléique et
protéine
I. Techniques d’analyse et de mise en évidence des
interactions acides nucléiques / protéines
I.1. Retards sur gel (suite)

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Chapitre 3 : Interaction entre Acide nucléique et protéine
I. Techniques d’analyse et de mise en évidence des interactions acides
nucléiques / protéines
I.2. Foot-printing (empreinte à la DNAse I) « Basée sur que la fixation d’une protéine à l’ADN protège ce
dernier contre une dégradation à la DNAse I ». Elle permet de définir avec précision les bases du promoteur qui
interagissent physiquement avec un facteur protéique nucléaire.
1. Le fragment d’ADN contenant la séquence du promoteur est marqué radioactivement à une de ses extrémités (en
faisant une PCR dans laquelle nous utilisons des amorces radioactifs)
2. Ensuite ce fragment est hybridé avec des extraits protéiques nucléaires ou tout simplement avec des protéines
purifiées
3. Puis le mélange est soumis à un traitement modéré à la DNAse I qui est une endonucléase capable de couper les
liaisons phospho-diesters à l’intérieur des chaînes d’ADN sur un seul des 2 brins. Il en résulte une collection de
fragments de tailles différentes, chacun marqué à l’une de ses extrémités. La présence d’un complexe protéique sur
une portion d’ADN empêche l’action de la DNAse I
4. Ces produits de digestion sont séparés par électrophorèse sur un gel d’acrylamide à grand pouvoir séparateur, puis
détectés par autoradiographie sur une membrane de nictrocellulose (comme pour le southern blot)
5. En comparant les bandes obtenues pour un fragment d’ADN coupé, en présence ou en absence de facteurs
protéiques, on met en évidence une région sans bande correspondant au site de fixation du facteur protéique, qui
par sa liaison à l’ADN a protégé celui-ci des coupures de la DNAse I.
6. Enfin, en réalisant un séquençage du fragment étudié et en faisant migrer les produits de réaction en parallèle avec
ceux obtenus lors de l’expérience de foot-printing, il sera alors possible de déterminer la séquence du site de fixation
du facteur protéique. 9
Partie 3 Chapitre 3 :
Interaction entre Acide nucléique et protéine
I. Techniques d’analyse des interactions acides nucléiques /
protéines
I.2. Foot- printing
(empreinte à la
DNAse I)

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Partie 3 Chapitre 3 :
Interaction entre Acide nucléique et protéine
II. Techniques permettant de déterminer la (les) protéine(s) qui se fixe(nt) sur
un acide nucléique cible (ADN ou ARN)

II.1. Simple hybride

- L’interaction entre une séquence nucléique (ADN) et un facteur de transcription (protéine X) peut être
étudiée in vivo chez la levure grâce à la technique du simple hybride.
- La séquence nucléique (ADN à tester, élément cis -régulateur) est placée en amont d’un gène rapporteur.
Le domaine de fixation d’un facteur de transcription (BD, binding domain of FT) est fusionné à un domaine
activateur (AD, activating domain) de la transcription d’une protéine connu de levure : le domaine
activateur du facteur Gal4 est très fréquemment utilisé.

- Tout ce système (vecteur) est placé dans la levure par transfection. Si le FT reconnait la séquence d’ADN,
la protéine hybride formée par le FT et le domaine AD entraine l’expression du gène rapporteur, ce qui peut
être détecté.

- Par exemple si le gène rapporteur est celui de l’opéron LacZ, celui qui code pour la β-galactosidase. Si on
fait pousser les levures ayant reçu ce vecteur sur un milieu en présence de X-gal, les colonies
obtenues seront bleues si la protéine X interagit avec la séquence d’ADN étudiée . 11
Partie 3 Chapitre 3 :
Interaction entre Acide nucléique et protéine
II. Techniques permettant de déterminer la (les) protéine(s) qui
se fixe(nt) sur un acide nucléique cible (ADN ou ARN)

II.1. Simple hybride

Target
protein
-BD

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 Chapitre 3 :
Partie 3 Interaction entre Acide nucléique et protéine
III. Techniques permettant de déterminer la cible (ADN ou ARN) d’une
protéine
III.1. Immunoprécipitation de chromatine (Chromatin immunoprecipitation, ChIP)
- Le « ChIP » consiste à identifier et purifier des complexes ADN-protéines, formés in vivo et liés de façon
covalente.
- Le principe de cette technique est basé sur la fixation des protéines à l’ADN par le formaldéhyde, suivie
d’une immuno-précipitation par un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt.
1. La première étape consiste à traiter les cellules par un agent chimique (le formaldéhyde) afin de fixer de
façon covalente les protéines liées à l’ADN et les protéines faisant partie d’un même complexe,
2. Ensuite, l’ADN est extrait des cellules et segmenté par sonication pour obtenir des fragments de 200 à
500pb.
3. Un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine d’intérêt est ajouté au mélange de lyse et les
complexes ADN-protéines sont immuno-précipités à l’aide de billes (magnétiques, d’agarose ou de
sépharose)
4. Pour identifier les séquences d’ADN liées à la protéine d’intérêt, plusieurs techniques peuvent être utilisées
telles que la qPCR avec des amorces spécifique, le séquençage à haut débit (chip suivie d’un séquençage
est appelé : ChIP-Seq).
- L’avantage majeur du ChIP est qu’il s’effectue in vivo, c’est-à-dire que l’information tirée de cette expérience
provient directement d’une analyse faite sur les cellules vivantes.
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 Chapitre 3 :
Partie 3 Interaction entre Acide nucléique et protéine
III. Techniques permettant de déterminer la cible (ADN ou ARN) d’une
protéine
III.1. Immuno-précipitation de chromatine (Chromatin immuno-precipitation, ChIP)

A) Les protéines sont pontées de façon

covalente à l’ADN (fixées grâce au
formaldéhyde), et ces complexes sont
fragmentés par sonication.

B) Une immuno-précipitation avec un anticorps

spécifique dirigé contre la protéine d’intérêt
(pâle) et des lavages permettent d’isoler les
fragments d’ADN qui lui sont liés.

C) Les liens entre l’ADN et les protéines isolées

sont rompus, et l’ADN est ensuite purifié.

D) L’ADN immuno-précipité peut être détecté

par des amplifications par PCR. 14
 PLAN

Introduction générale : de la cellule à la molécule

Partie 1 : La biologie moléculaire

Partie 2 : Le Génie Génétique

Partie 3 : Les techniques de base de la biologie moléculaire

Partie 4 : Introduction à la bio-informatique.