UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
Ø Introduction :
La chromatographie d’adsorption est une technique qui permet de separer des
composes en fonction de leur affinité avec la phase mobile et la phase stationnaire.
Dans cette technique la chromatographie sur couche mine (CCM) utilise une phase
stationnaire sue une plaque d’aluminium tandis que la phase mobile monte par
capillarité.
En CCM, on peut separer des colorants visibles a l’œil un ou des composes non colores
nécessitant une révélation supplémentaire comme la lumière ou des réactifs
chimiques, pour les visualiser.
Ø Le but :
• L’extraction du chromatographe brute à partir des organes des plantes vertes et
la séparation ou de ses pigments en utilisons la CCM.
v Partie théorique :
♦ Définitions :
1. Chromatographie sur couche mince :
La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique d'analyse qualitative.
Elle a pour but de séparer les produits d'un mélange et permet d'identifier un composé,
de vérifier sa pureté ou de suivre l'avancement d'une réaction en analysant des
prélèvements successifs du milieu réactionnel afin de mettre en évidence l'apparition
de produit ou la disparition de réactifs.
2. Principe de la technique :
Considérons un mélange de composés que l'on souhaite séparer. Lors d'une
CCM, le mélange est déposé sur un solide poreux adsorbant appelé phase stationnaire
qui recouvre une plaque rigide inerte. La partie inférieure de cette plaque est mise en
contact avec un solvant appelé phase mobile qui monte par capillarité : on parle
d'élution et la phase mobile est appelée éluant. Lors de l'élution, les différents
composés du mélange migrent plus ou moins haut sur la plaque du fait de la
compétition entre trois phénomènes :
L'adsorption des composés sur la phase stationnaire
1 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
La solubilisation des composés dans l'éluant.
L'adsorption de l'éluant sur la phase stationnaire
Ces trois phénomènes sont gouvernés par des interactions faibles de type
Interactions de Van der Waals et liaisons hydrogène. Pour optimiser la séparation entre
les trois acteurs (composé, adsorbant, éluant), il faut prendre en compte :
• leur polarité (fonction de différents paramètres tels que le moment dipolaire, La
permittivité diélectrique...) ;
• leur praticité (aptitude à établir des liaisons hydrogène).
3. La cuve chromatographique :
Un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle
étanche.
4. Phase stationnaire (adsorbant) :
Elle est le plus souvent constituée La silice a un caractère de silice SiO2, déposée sur
un support rigide en verre, en aluminium ou en plastique.
Une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur
une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté l'amidon ou
un polymère organique
2 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
5. Phase mobile (éluant) :
C'est un solvant dans lequel les constituants du mélange sont plus ou moins solubles,
il migre le long de la phase fixe. Le choix du solvant peut être délicat, même pour les
expérimentateurs confirmés et il faut le plus souvent faire des essais de séparation
avant de se lancer vraiment dans L’analyse chromatographique.
Ø Remarque :
- L'éluant ne doit pas réagir avec les constituants à analyser.
- Un éluant trop polaire entraine tous les constituants de l'échantillon. Aucune
séparation n'est effectuée.
- Un éluant trop apolaire n'entraine pas assez les constituants de l'échantillon.
Les spots obtenus risquent d'être un mélange de constituants de l'échantillon.
6. Le rapport frontal :
3 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
Le rapport frontal (R,) ou facteur de rétention d'un composé est le rapport de la
distance ligne de dépôt-composé sur la distance ligne de dépôt-front de solvant. Il est
compris entre 0 et 1, et est caractéristique du composé, du matériau de la plaque et du
système d'éluant.
Le rapport frontal est donc égal à :
𝑥
𝑅! = (𝑅 < 1)
𝑦 !
7. Principe de fonctionnement :
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve,
l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité.
En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le
front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant
le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase
mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la
phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement
contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement, en chromatographie sur
couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les
composants polaires.
v Partie pratique :
♦ Modes opératoires :
• Matériel :
Pour réaliser ce type d’analyse, il nous faut :
• Cuve de chromatographie, plaque CCM (verre +silice environ 0,25𝑚𝑚 ).
4 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
• Feuille verte
• Mortier & pilon
• Sable
• Becher, phase mobile (cyclohexane, 5% ; éther de pétrole, 85% ; acétone,
10% ).
• Micropipette.
• Procédure :
1. Extraction des pigments :
- Prendre quelques feuilles vertes d'une plante quelconque, les rincer à l'eau
distillée puis les couper à l'aide d'un ciseau.
- Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis rajouter une spatule de sable,
une pincée de chlorure de calcium (pour faciliter le broyage) et quelques
millilitres d'acétone (environ 5ml).
- Laisser décanter et récupérer le liquide dans un tube en verre, et verser le
liquide dans un tube de centrifugeuse.
- Centrifuger et récupérer le surnageant.
2. Séparation des pigments par CCM :
Préparation de la phase mobile :
La phase mobile est un mélange de solvant (système solvant) : (cyclohexane, 5% ; éther
de pétrole, 85% ; acétone, 10%) ; ou éther de pétrole/ éther d'éthylique (40/60).
Préparation de la cuve de chromatographie :
Mettre un volume du solvant à l'intérieur de la cuve de chromatographie de telle sorte
que la hauteur du solvant ne dépasse pas 1 Cm.
Fermer la cuve hermétiquement avec son couvercle, et laisser l'atmosphère à
l'intérieur de la cuve se saturer en vapeur de solvant.
5 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
Préparation de la phase stationnaire :
(Chaque binôme d'étudiants doit disposer d'une plaque de 20 Cm X 10 Cm)
Tracer au crayon et sans appuyer un trait horizontal à environ 2 Cm du bord de la
plaque (la ligne de dépôt).
Indiquer légèrement au crayon l'emplacement des dépôts tout en évitant de toucher la
plaque avec les doigts.
Dépôt de l'échantillon :
A l'aide d'une pipette pasteur (ou micropipette) appropriée pour chaque binôme,
prélever quelques microlitres de l'extrait vert, les mettent sur le point repère situer sur
la ligne de dépôt tout en réduisant au maximum possible la surface des spots. Laisser
sécher à l'air libre avant d'effectuer un nouveau dépôt. Le fait de faire plusieurs dépôts
superposés permet de concentrer la tâche et donc augmenter l'intensité des couleurs
lors de la révélation.
Développement de la CCM :
Tremper la plaque doucement et verticalement dans la cuve de telle façon que la ligne
de dépôt soit en parallèle avec le front (initial) de migration du solvant.
Une fois le front de migration du solvant arrive à 2 Cm du bord supérieur de la plaque,
retirer la plaque de la cuve avec une pince.
Repérer rapidement le front de migration du solvant puis laisser la plaque se sécher à
l'air libre.
v Résultantes et interprétation :
Apres l’expérience on observe que chaque échantillon a déplacé d’une certaine vitesse
est certaine distance on calcule les rapports frontaux on trouve :
6 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
𝑑𝑥
𝑅𝑓 =
𝐷
𝐷 = 7,9𝑐𝑚 𝑑" = 1,8𝑐𝑚 𝑑# = 2,5𝑐𝑚 𝑑$ = 3,3𝑐𝑚
%! ",(
• 𝑅𝑓" = &
= ),* = 0,227
%" #,+
• 𝑅𝑓# = &
= ),* = 0,316
%" $,$
• 𝑅𝑓$ = &
= ),* = 0,434
𝑅𝑓" < 𝑅𝑓# < 𝑅𝑓$
D'après les valeurs de 𝑅𝑓 on remarque que l’échantillon n’est pas pur.
Donc il est constitué de plusieurs constituants.
Le mélange joue le rôle du tampon.
v Conclusion :
La technique de chromatographie sur couche mince (CCM) est efficace pour séparer et
identifier les pigments végétaux présents dans la chlorophylle. Lors de l’expérience,
plusieurs pigments comme la chlorophylle a, la chlorophylle b, les caroténoïdes et les
7 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
UNIVERSITE DE CONSTANTINE 3 SALAH BOUBNIDER
3EME ANNEE : 2024-2025
xanthophylles ont été séparés, chaque pigment apparaissant avec une couleur et une
distance spécifique sur la plaque selon sa polarité. Les valeurs de Rf calculées pour
chaque pigment ont permis de les identifier clairement.
On générale cette technique met en évidence la diversité des pigments végétaux, ce qui
aide à comprendre leur rôle dans la photosynthèse et l’optimisation de l’absorption de
la lumière par les plantes.
8 MODULE : TECHNIQUE D’ANALYSE
