UNIVERSITÉ D’ANTANANARIVO - FACULTÉ DES SCIENCES

MASTER 1

UE GENETIQUE MOLECULAIRE
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Chapitre II: « Polymerase Chain Reaction » ou PCR

Iony RAZANAJATOVO, Ph.D

(Institut Pasteur de Madagascar)

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 1- Principe de la PCR

a – Définition

✓ PCR = Amplification génique = synthèse de grandes quantités d’ADN, par la

multiplication sélective d’un fragment d’ADN donné → choix de la cible.

✓ La PCR utilise les propriétés suivantes:

• Dénaturation de l'ADN à haute température pour donner deux simples brins
• Hybridation rapide et spécifique d'amorces oligonucléotidiques au brin d'ADN
qui leur est complémentaire
• Propriété des ADN polymérases de synthétiser de l'ADN double brin en
utilisant un simple brin comme matrice.
• Taq ADN polymérase thermostable (→ supporte températures élevées)
 1- Principe de la PCR

b – Principe général

✓ Choix des Amorces : ~20 bases complémentaires du gène recherché à chaque

extrémité en 5’ de la séquence à amplifier

sens antisens

✓ Nucléotides (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)

✓ Polymérase thermorésistante (Taq ADN polymérase)
✓ Cycles de T°(copies X2 / cycle) :
1. Dénaturation (séparation des brins d ’ADN) 95°C
2. Hybridation des amorces : « annealing » (40-70°C selon Tm)
3. Extension (synthèse d ’ADN complémentaire par la Taq ADN polymérase
depuis l’amorce) 72°C
 1- Principe de la PCR

95°C

Amorce 1
Amorce 2 40-70°C

72°C

4
1- Principe de la PCR

n cycles > 2n ➔ 30 cycles > 230 = ~109 copies

5
 2- PCR classique

a – Principe

6
 2- PCR classique

b – Mise en évidence des "amplicons" (ADN amplifié)

✓ Electrophorèse
✓ Digestion par une enzyme de restriction spécifique et électrophorése
✓ Southern-blot ou dot-blot, puis hybridation
✓ Capture du produit amplifié sur support/Hybridation réverse
✓ Test immunologique
✓ Séquençage
✓ Fluorescence
 2- PCR classique
✓Gel d’agarose après PCR et electrophorèse. Le gel est photographié sous
lumière UV. Les signaux positifs apparaissent sous l’aspect de bandes claires nettes
Le résultat n'est interprétable que s'il existe des témoins positifs (la réaction a
fonctionné) et un témoin négatif (il n'existe pas de contamination).
 2- PCR classique

✓ Southern-blot ou dot-blot, puis hybridation

 2- PCR classique

✓ Capture du produit amplifié sur support/Hybridation réverse

Aspect d’une microplaque

d’hybridation moléculaire
post-PCR : les puits colorés
correspondent aux signaux
positifs.
 2- PCR classique

c – Avantages de la PCR

✓ Prix des thermocycleurs actuellement abordables

✓ Rapidité (réponse en 24-48h)
✓ Sensibilité (nécessite peu d’ADN)
✓ Pour le diagnostic, ne nécessite pas de culture

d – Inconvénients/ limites

✓ Personnel qualifié

✓Faux négatif :
– paramètres d’amplification inappropriés (température,
concentration en amorces, en dNTP, concentration en Mg 2+, en ADN
polymerase...)
– quantité d’ADN cible inadéquate
– présence d’un inhibiteur de la Taq polymérase
 2- PCR classique

✓ PCR très sensible → diagnostic: germes morts détectés

✓ Faux positif :
– dus à la contamination des échantillons
– constituent le problème majeur de cette technique qui impose
des mesures expérimentales draconiennes car manipulations répétées
→ Risques de contaminations par amplicons
➔ Organisation : plusieurs pièces, marche en avant

Pièce Extraction
ADN/ARN
Pièce "Post-PCR":
Pièce Préparation Pièce PCR Electrophorèse
mélange (thermocycleur) Hybridation…
réactionnel (mix)
Pièce Addition
ADN/ARN au mix
 3- PCR en temps réel

a – Principe

✓ Captation d’un signal de fluorescence au cours de la PCR

▪ marqueur non spécifique : Intercalants de l’ADN
▪ marqueur spécifique : Sondes fluorescentes (exemple: Taqman)
 3- PCR en temps réel

▪ Marqueur non spécifique : Intercalants de l’ADN (SybrGreen, EvaGreen, Bet…)

Ex: Molécule Sybr Green I (SGI), intercalant, fluorescent une fois liée
à l’ADN double brin

SGI

SGI
 3- PCR en temps réel

▪ Marqueur non-spécifique : ex. Molécule Sybr Green I (SGI), intercalant, fluorescent

une fois liée à l’ADN double brin
 3- PCR en temps réel

▪ Marqueur spécifique : Sondes fluorescentes (exemple: Taqman)

 3- PCR en temps réel

Dénaturation

FRET

R Q
5’ Sens
5’
3’
3’
5’
Anti-sens 5’

Extension /
polymérisation

R Clivage de la sonde Fin de l’extension

Q

Q
R
 3- PCR en temps réel

R
R

R
 3- PCR en temps réel

Ordinateur + Thermocycleur +
Logiciel fluoromètre
 3- PCR en temps réel

b – Avantages

– Réduction du temps technique

– Réduction des manipulations (moins de risque de contaminations car
système fermé)
– Quantification

c – Inconvénients
– Coût
- Electricité stable (utilisation d’onduleur…)
 4- Systèmes automatisés

Exemple: Diagnostic de la tuberculose et de résistance à la

rifampicine avec Test GeneXpert

Echantillon
+
tampon de lyse

Cartouche
GeneXpert

Introduction cartouche
dans appareil

Extraction ADN +
Analyse PCR en
temps réel
 4- Systèmes automatisés

Autre exemple: Prévention de l’infection materno-fœtale

à Streptocoque B
 4- Systèmes automatisés

Exemple: Diagnostic de la tuberculose avec Test GeneXpert

Fluorescence

Nombre de cycles
 5- Applications

a – Différents types de PCR (variantes)

✓ PCR "classique"
✓ PCR multiplex
✓ PCR nichée ou "nested" PCR
✓ RT-PCR
✓ NASBA ("Nucleic Acid Sequence-Based Amplification")
✓ PCR in situ
 5- Applications

a – Différents types de PCR (variantes)

✓PCR multiplex
– Plusieurs couples d’amorces dans un même tube de PCR
– Mise au point particulière
5- Applications
 5- Applications

✓ PCR nichée ou "nested" PCR

 5- Applications

✓RT-PCR (Reverse-Transcriptase PCR)

1) Transcription réverse de l’ARNm 2) Amplification par PCR de l’ADNc

 5- Applications

✓ PCR in situ
 5- Applications
✓ PCR in situ
 5- Applications
✓ Immuno + PCR

The magnetic bead quantitative immuno-polymerase chain reaction method. Capture anti-HIV-1 p24 antibody
(2), adsorbed to the magnetic bead (1), is used to capture HIV-1 p24 antigen (Ag) (3). Streptavidin-horseradish
peroxidase (SHRP) (5) bridges between a biotinylated detector anti-HIV-1 p24 Ab (4) and biotinylated reporter
DNA (Biot-181)(7). After addition of SHRP, the ELISA may be performed by addition of substrate (6). Biot-181 is
amplified by PCR using a fluorescent probe (8) for real-time (quantitative) PCR analysis (qPCR).
(Journal of Virological Methods Volume 157, Issue 2, May 2009, Pages 122–132)
 5- Applications

b– Exemples

✓ Détection de pathogènes dans des échantillons biologiques

(diagnostic bactériologue, diagnostic viral...)
• Diagnostic qualitatif
• Diagnostic quantitatif (qPCR)
✓ Identification
✓ Diagnostic de résistance aux antibiotiques
✓ Typage génétique, empreintes génétiques
✓ Clonage de gène
✓ ...