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NORME ISO
INTERNATIONALE 16212

Deuxième édition
2017-06

Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement des levures et des
moisissures
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould

Numéro de référence
ISO 16212:2017(F)

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Sommaire Page

Avant-propos............................................................................................................................................................................................................................... iv
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 1
4 Principes........................................................................................................................................................................................................................ 2
4.1 Généralités................................................................................................................................................................................................... 2
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Petri............................................................................................................... 2
4.3 Filtration sur membrane................................................................................................................................................................. 2
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture....................................................................................................... 3
5.1 Généralités................................................................................................................................................................................................... 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants........................................................................................................................................... 3
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone sel)........................................................................ 4
5.4 Milieux de culture.................................................................................................................................................................................. 4
6 Matériel et verrerie............................................................................................................................................................................................ 5
7 Souches de micro-organismes................................................................................................................................................................. 6
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire......................................... 6
9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6
9.1 Recommandations générales...................................................................................................................................................... 6
9.2 Préparation de la suspension initiale................................................................................................................................... 6
9.2.1 Généralités............................................................................................................................................................................. 6
9.2.2 Produits miscibles dans l’eau................................................................................................................................ 7
9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau..................................................................................................................... 7
9.3 Méthodes de dénombrement...................................................................................................................................................... 7
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement.................................................................................. 7
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Petri........................................................ 7
10 Dénombrement des colonies (méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de
Petri et par filtration sur membrane)............................................................................................................................................. 8
11 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 8
11.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri............................................. 8
11.2 Interprétation........................................................................................................................................................................................... 9
12 Neutralisation des propriétés fongicides du produit...................................................................................................11
12.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 11
12.2 Préparation de l’inoculum........................................................................................................................................................... 11
12.3 Applicabilité des méthodes de dénombrement........................................................................................................ 11
12.3.1 Principes............................................................................................................................................................................... 11
12.3.2 Essai d’applicabilité de la méthode par ensemencement en profondeur..................... 12
12.3.3 Applicabilité de la méthode par étalement en surface................................................................. 12
12.3.4 Applicabilité de la méthode par filtration sur membrane......................................................... 12
13 Rapport d’essai.....................................................................................................................................................................................................12
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants....................................................................................................................14
Annexe B (informative) Autres diluants.........................................................................................................................................................16
Annexe C (informative) Autres milieux de culture...............................................................................................................................17
Annexe D (informative) Neutralisants de l’activité fongicide des
conservateurset des liquides de rinçage...................................................................................................................................19
Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 21

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www​
.iso​.org/​directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www​.iso​.org/​brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www​.iso​.org/​iso/​f r/​avant​-propos​.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16212:2008), qui a fait l’objet d’une
révision mineure. Les modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— dans le domaine d’application, «voir l’ISO 29621» a été ajouté et la référence a été ajoutée à la
Bibliographie;
— dans le domaine d’application, «validée» a été remplacé par «indiquée comme adéquate»;
— en 4.1, «validée» a été remplacé par «démontrée»;
— en 4.3, «selon une méthode validée» a été remplacé par «tel que décrit dans l’Article 12» et «opératoire
validé» a été remplacé par «opératoire décrit»;
— en 5.1, «spécifications» a été remplacé par «instructions»;
— en [Link].2, «de peptone» a été remplacé par «d’hydrolysat pepsique de tissus animaux»;
— dans l’Article 7, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
— en [Link], «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable»;
— en [Link], «validée» a été remplacé par «démontrée comme étant applicable»;
— en 11.2.1, «validées selon» a été remplacé par «démontrées comme étant applicables pour»;
— en 12.3, «validation» a été remplacé par «applicabilité»;

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— en 12.3.2, les occurrences de «validation» ont été remplacées par «essai d’applicabilité» et «validés»
a été remplacé par «satisfaisants»;
— en 12.3.3, la première occurrence de «validation» a été remplacée par «applicabilité» et la deuxième
occurrence a été remplacée par «essai d’applicabilité»; «validés» a été remplacé par «satisfaisants»;
— en 12.3.4, la première occurrence de «validation» a été remplacée par «applicabilité» et la deuxième
occurrence a été remplacée par «essai d’applicabilité»; «validés» a été remplacé par «satisfaisants»;
— dans l’Article 13 f), «validation» a été remplacé par «applicabilité»;
— en A.1, B.1, C.1, «validé» a été remplacé par «démontré comme étant applicable».

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Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des

levures et des moisissures

1 Domaine d’application
Le présent document donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures et des
moisissures présentes dans les cosmétiques par dénombrement des colonies en milieu gélosé sélectif
après une incubation aérobie.
Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d’effectuer une
analyse de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques
qui relèvent du présent document. Les produits considérés comme présentant un faible risque
microbiologique (voir l’ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau ou des valeurs de
pH extrêmes, les produits hydro-alcooliques, etc.
En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d’application, la
présente méthode pourrait ne pas être applicable en tout point à certains produits (par exemple
à certains produits non miscibles à l’eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par
d’autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été
démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate.
Les levures dénombrées peuvent être identifiées à l’aide d’essais d’identification appropriés, par
exemple ceux décrits dans les normes indiquées dans la Bibliographie. Les moisissures dénombrées
peuvent être identifiées en utilisant d’autres méthodes appropriées, si nécessaire.

2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés
pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et
virucide (bactériophages inclus)

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse [Link] ww​.iso​.org/​obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse [Link] ww​.electropedia​.org/​
3.1
levure
champignon unicellulaire qui se multiplie principalement de manière végétative en bourgeonnant,
capable de se développer dans les conditions d’essais spécifiées dans le présent document

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3.2
moisissure
mycélium formant des micromycètes, y compris les spores et les conidies, capable de se développer
dans les conditions d’essai spécifiées dans le présent document
3.3
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.4
échantillon
portion du produit (3.3) (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l’essai pour préparer la suspension initiale
3.5
suspension initiale
suspension (ou solution) de l’échantillon (3.4) dans un volume défini d’un bouillon d’enrichissement
approprié
3.6
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale (3.5)

4 Principes

4.1 Généralités
La présente méthode implique le dénombrement des colonies dans un milieu gélosé sélectif. L’inhibition
possible du développement fongique par l’échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection
des micro-organismes viables[5]. Dans tous les cas et quelle que soit la méthodologie, la neutralisation
des propriétés fongicides du produit doit être vérifiée et démontrée[6] [8] [9].

4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Petri

Le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri comprend les étapes suivantes.
— Préparation des boîtes de géloses pour ensemencement en profondeur ou pour étalement en surface,
au moyen d’un milieu de culture défini, et ensemencement des boîtes de gélose avec une quantité
définie de la suspension initiale ou d’une dilution du produit.
— Incubation aérobie des géloses de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
— Dénombrement du nombre d’unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures
et de moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d’incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.

4.3 Filtration sur membrane

La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes.
— Transfert d’une quantité adaptée d’échantillon préparé tel que décrit dans l’Article 12 dans l’appareil
de filtration humidifié à l’aide d’un faible volume de diluant approprié stérile, filtration immédiate
et lavage selon le mode opératoire décrit (voir 12.3.4). Transfert de la membrane de filtration à la
surface du milieu gélosé spécifié, comme indiqué dans l’ISO 21148;
— Incubation aérobie des membranes de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
— Dénombrement du nombre d’unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures
et de moisissures par millilitre ou par gramme de produit.

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NOTE Une condition d’incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.

5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture

5.1 Généralités
Les instructions générales sont indiquées dans l’ISO 21148. Lorsque de l’eau est mentionnée dans ce
document, utiliser de l’eau distillée ou purifiée tel qu’indiqué dans l’ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement
des levures et des moisissures. D’autres diluants, agents neutralisants et milieux de culture peuvent
être utilisés s’il a été démontré qu’ils sont applicables pour cet emploi.

5.2 Diluants neutralisants et diluants

5.2.1 Généralités

Le diluant est utilisé pour disperser l’échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l’échantillon
à soumettre à essai a des propriétés fongicides. L’efficacité de la neutralisation doit être démontrée
avant la détermination de la concentration en micro-organismes (voir Article 12). Des informations
relatives à des agents neutralisants appropriés sont fournies dans l’Annexe D.

5.2.2 Diluant neutralisant

[Link] Milieu aux hydrolysats de caséine-lécithine de soja-polysorbate 20 (bouillon SCDLP 20)

[Link].1 Composition

Hydrolysat pancréatique de caséine 20,0 g

Lécithine de soja 5,0 g

Polysorbate 20 40 ml

Eau 960 ml

[Link].2 Préparation

Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d’eau en mélangeant pendant le chauffage au bain-marie à

49 °C ± 2 °C. Ajouter l’ hydrolysat pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant
environ 30 min pour obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le
mesurage étant effectué à température ambiante.

[Link] Autres diluants neutralisants

D’autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe A et Annexe D).

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5.2.3 Diluant

[Link] Liquide A

[Link].1 Composition

Hydrolysat pepsique de tissus animaux 1,0 g

Eau 1 000 ml

[Link].2 Préparation

Dissoudre 1 g d’hydrolysat pepsique de tissus animaux dans l’eau pour obtenir 1 l. Chauffer en agitant
fréquemment. Répartir dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
Après la stérilisation, le pH doit être de 7,1 ±  0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.

[Link] Autres diluants

D’autres diluants peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe B).

5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone sel)

5.3.1 Composition

Tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,00 g

Chlorure de sodium 8,50 g

Eau 1 000 ml

5.3.2 Préparation

Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être
de 7,0 ±  0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.

5.4 Milieux de culture

5.4.1 Généralités

Les milieux de culture peuvent être préparés comme indiqué ci-dessous ou à partir de milieux de
culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant. Des milieux prêts à l’emploi peuvent
être utilisés si leur composition et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des
formulations indiquées ci-après.

5.4.2 Milieu gélosé Sabouraud au dextrose et chloramphénicol (SDCA)

[Link] Composition

Dextrose 40,0 g

Hydrolysat pepsique de tissus animaux 5,0 g

Hydrolysat pancréatique de caséine 5,0 g

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Chloramphénicol 0 050 g

Gélose 15,0 g

Eau 1 000 ml

[Link] Préparation

Dissoudre les composants (y compris le chloramphénicol) ou le milieu complet déshydraté dans l’eau,
en mélangeant pendant le chauffage. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ±  0,2, le mesurage étant
effectué à température ambiante.
NOTE Pour les produits connus et non contaminés (par des bactéries) le milieu sera utilisé sans
chloramphénicol.

5.4.3 Autres médias

D’autres milieux peuvent être utilisés s’ils sont appropriés (voir Annexe C).

5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de la souche de référence: Milieu gélosé Sabouraud au
dextrose (SDA)

[Link] Composition

Dextrose 40,0 g

Hydrolysat pepsique de tissus animaux 5,0 g

Hydrolysat pancréatique de caséine 5,0 g

Gélose 15,0 g

Eau 1 000 ml

[Link] Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau en mélangeant tout en chauffant.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ±  0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.

6 Matériel et verrerie
Les équipements, le matériel et la verrerie de laboratoire sont décrits dans l’ISO 21148.

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7 Souches de micro-organismes
Pour soumettre à essai l’efficacité des agents neutralisants, une souche de levure de référence est
utilisée:
— Candida albicans ATCC1) 10231 ou toute autre souche équivalente (IP2) 48.72 ou NCPF3) 3179 ou
NBRC4) 1594 ou KCTC5) 17205 ou TISTR6) 5779) ou toute autre souche équivalente issue d’une
collection nationale.
La souche de levure sélectionnée considérée comme étant plus sensible à l’activité fongicide que les
moisissures peut être acceptée comme représentative des champignons (levures et moisissures) pour
l’applicabilité de la méthode. Cependant, en cas de besoins spécifiques, l’essai d’efficacité des agents
neutralisants peut être réalisé avec une souche de référence supplémentaire de moisissure, en utilisant
un protocole approprié pour la préparation d’un inoculum calibré (par exemple, voir l’EN 13624:2013,[3]
[Link]).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la
souche de référence.
La souche peut être conservée au laboratoire, conformément à l’EN 12353.

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire

Si nécessaire, conserver les produits à soumettre à essai à température ambiante.
Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits (3.3) et les échantillons (3.4) avant ou après analyse.
Il convient d’effectuer l’échantillonnage des produits cosmétiques à analyser tel que décrit dans
l’ISO 21148. Analyser les échantillons tel que décrit dans l’ISO 21148 et conformément au mode
opératoire décrit dans l’Article 9.

9 Mode opératoire

9.1 Recommandations générales

Utiliser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer
l’échantillon, la suspension initiale et les dilutions. En cas de préparation d’une suspension initiale,
le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum entre en contact avec
le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières mentionnées dans les
protocoles ou documents établis.

9.2 Préparation de la suspension initiale

9.2.1 Généralités

La suspension initiale est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml du produit d’essai
mélangé avec soin.

1) ATCC = American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types).

2) IP = Institut Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi (Collection nationale de champignons pathogènes).
4) NBRC = National Biological Resource Centre, NITE (Centre national de ressources biologiques).
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture (Collection coréenne de cultures types).
6) TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research (Institut thaïlandais de recherche scientifique
et technologique).

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Noter S la masse ou le volume exact de l’échantillon.

La suspension initiale est généralement une dilution 1:10. Des volumes plus importants de diluant
peuvent être exigés si des niveaux de contamination élevés sont attendus et/ou si des propriétés
fongicides persistent dans la dilution 1:10.

9.2.2 Produits miscibles dans l’eau

Transférer l’échantillon de produit, S, dans un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant
neutralisant (5.2.2) ou de diluant (5.2.3).
Noter d, le facteur de dilution.

9.2.3 Produits non miscibles dans l’eau

Transférer l’échantillon de produit, S, dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate
d’agent solubilisant (par exemple solution polysorbate 80). Disperser l’échantillon dans l’agent
solubilisant et ajouter un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (5.2.2) ou de
diluant (5.2.3).
Noter d, le facteur de dilution.

9.3 Méthodes de dénombrement

9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement

La suspension initiale est généralement la première dilution dénombrée. Au besoin, d’autres dilutions
en série (dilution 1:10, par exemple) peuvent être réalisées à partir de la suspension initiale en utilisant
le même diluant (en fonction du niveau de contamination attendu pour le produit).
Le dénombrement est généralement effectué en utilisant au moins deux boîtes de Petri. Il est cependant
possible d’utiliser une seule boîte de Petri dans le cas d’un essai de routine, ou si les dénombrements
sont réalisés sur des dilutions successives du même échantillon ou en fonction des résultats antérieurs.

9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Petri

[Link] Méthode par ensemencement en profondeur

Ajouter 1 ml de la suspension initiale et/ou de la dilution d’échantillon préparée telle qu’elle a été
démontrée comme étant applicable (voir Article 12) dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de
diamètre et verser de 15 ml à 20 ml du milieu gélosé (5.4.2) maintenu en surfusion dans un bain-marie
à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Petri plus grandes sont utilisées, augmenter
la quantité de milieu gélosé en conséquence.
Mélanger la suspension initiale et/ou la dilution d’échantillon avec le milieu en faisant soigneusement
tourner ou en inclinant suffisamment les géloses de manière à assurer la dispersion. Laisser le mélange
se solidifier dans les boîtes de Petri sur une surface horizontale à température ambiante.

[Link] Méthode par étalement en surface

Verser, dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de diamètre, de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé (5.4.2)
maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de
Petri plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de milieu gélosé en conséquence.
Laisser la gélose se refroidir et se solidifier, par exemple sous hotte microbiologique ou dans un
incubateur. Étaler un volume mesuré supérieur ou égal à 0,1 ml de la suspension initiale et/ou de la
dilution d’échantillon préparée tel que décrit dans l’Article 12 sur la surface du milieu.

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[Link] Méthode par filtration sur membrane

Utiliser une membrane dont le diamètre des pores n’excède pas ≤ 0,45 µm.
Transférer sur la membrane une quantité appropriée de la suspension initiale ou de la dilution
d’échantillon démontrée comme étant applicable (représentant de préférence au moins 1 g ou 1 ml du
produit).
Filtrer immédiatement et laver la membrane (suivre le mode opératoire d’essai d’applicabilité,
voir Article 12).
Transférer la membrane sur la surface du milieu gélosé (5.4.2).

[Link] Incubation

Sauf indication contraire, retourner les boîtes ensemencées et les placer dans l’incubateur de 3 jours
à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note en 4.2 et de 4.3). Après incubation, les boîtes
doivent, si possible, être examinées immédiatement. Autrement, elles peuvent être conservées au
réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C, au plus 24 h, sauf indication contraire.
NOTE 1 Dans certains cas, lorsque les particules du produit risquent d’être confondues avec les colonies
dénombrées, il peut être utile de dupliquer des boîtes contenant les mêmes dilutions de l’échantillon et le même
milieu gélosé, et de les stocker au réfrigérateur à des fins de comparaison avec les boîtes incubées.

NOTE 2 Une vérification intermédiaire peut être effectuée lorsque la présence simultanée de levures et de
moisissures est suspectée.

10 Dénombrement des colonies (méthodes de dénombrement sur gélose en

boîtes de Petri et par filtration sur membrane)
Après incubation, dénombrer les colonies:
— dans des boîtes de Petri contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont
dénombrées, voir 11.2.3;
— sur des membranes contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont dénombrées,
voir 11.2.3.

11 Expression des résultats

11.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose en boîtes de Petri

Calculer N, le nombre de micro-organismes présents dans l’échantillon S, au moyen de:
— m, la moyenne arithmétique des dénombrements obtenus à partir des boîtes de Petri dupliquées
[Formule (1)];
— c, le nombre de colonies dénombrées sur une seule gélose [Formule (2)];
— wm, la moyenne pondérée des dénombrements obtenus à partir de deux dilutions successives
[Formule (3)];
selon les formules suivantes:
N = m/(V · d) (1)

N = c/(V · d) (2)

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N = wm/(V · d) (3)

où

m est la moyenne arithmétique des dénombrements obtenus à partir des boîtes de Petri
dupliquées;

V est le volume d’inoculum introduit dans chaque boîte, en millilitres;

d est le facteur de dilution correspondant à la dilution réalisée pour la préparation de la suspen-

sion initiale (voir 9.2) ou pour la première dilution dénombrée;

c est le nombre de colonies dénombrées dans une seule boîte.

La moyenne pondérée des colonies dénombrées à partir de deux dilutions successives, x c , est donnée par

xc =
∑c
(n1 + 0, 1n2 )
où

est la somme des colonies dénombrées dans toutes les boîtes retenues à partir de deux
åc dilutions successives;

n1 est le nombre de boîtes dénombrées pour la suspension initiale (ou pour la première
dilution dénombrée);

n2 est le nombre de boîtes dénombré pour la dilution 1:10 de la suspension initiale (ou pour la
deuxième dilution dénombrée).
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour ce faire, si le dernier chiffre est inférieur
à 5, le chiffre précédent n’est pas modifié; si le dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre
précédent est augmenté d’une unité. Procéder par étapes jusqu’à obtenir deux chiffres significatifs.
Noter le nombre, N, obtenu.

11.2 Interprétation

11.2.1 Il convient de tenir compte de la variabilité inhérente du dénombrement sur gélose en boîtes de
Petri. Il convient de considérer deux résultats comme différents seulement si leur différence n’excède pas
50 % ou, quand elle est exprimée en log, seulement si elle dépasse 0,3 log.

Pour que le dénombrement soit précis, seules des géloses ou des membranes ayant plus de 15 colonies
et moins de 150 colonies doivent être prises en compte. Vérifier que les dénombrements sont obtenus à
partir de dilutions démontrées comme étant applicables pour la méthode sélectionnée (voir Article 12).

11.2.2 Lorsque le nombre d’UFC est supérieur à 15 et inférieur à 150 sur les géloses ou les membranes,
exprimer le résultat comme suit:

— si S est d’au moins 1 g ou 1 ml et V est d’au moins 1 ml, le nombre de levures et de moisissures par
millilitre ou par gramme d’échantillon est égal à N/S;
— si S est inférieur à 1 g ou 1 ml et/ou V est inférieur à 1 ml, le nombre de levures et de moisissures
dans l’échantillon (noter la quantité d’échantillon soumise à essai en prenant en compte S et V) est
égal à N;
où S est la masse ou le volume de l’échantillon (voir 9.2).

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Exprimer le résultat sous la forme d’un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
de 10 appropriée (voir exemples).

11.2.3 Lorsque le nombre d’UFC est inférieur à 15 sur les géloses ou les membranes, exprimer le résultat
comme suit:

— si S est d’au moins 1 g ou 1 ml et V est d’au moins 1 ml, le nombre estimé de levures et de moisissures
par millilitre ou par gramme d’échantillon est égal à N/S;
— si S est inférieur à 1 g ou 1 ml et/ou que V est inférieur à 1 ml, le nombre estimé de levures et de
moisissures dans l’échantillon est égal à N.
où S est la masse ou le volume de l’échantillon (voir 9.2).
Exprimer le résultat sous la forme d’un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance
de 10 appropriée (voir exemples).

11.2.4 Lorsqu’aucune colonie n’est observée, le résultat est rapporté de la manière suivante:

— il y a moins de 1/d · V · S de levures et de moisissures par gramme ou millilitre de produit (S est

au moins 1 g ou 1 ml);
— il y a moins de 1/d · V de levures et de moisissures dans l’échantillon S (noter la quantité d’échantillon
soumise à essai en tenant compte de S et V) (S est inférieur à 1 g ou 1 ml).
où

d est le facteur de dilution de la suspension initiale (voir 9.2);

V est égal à 1 (pour le dénombrement avec la méthode par ensemencement en profondeur et

pour la filtration sur membrane) ou 0,1 (dans le cas de la méthode par étalement en surface)
(voir exemple).
EXEMPLE 1 Deux boîtes pour une dilution

S = 1 g; V = 1; dénombrements obtenus pour la dilution 10−1: 38 et 42

Formule (1) N = m/(V · d) = 40/(1 · 10−1) = 40/0,1 = 400 ou 4 · 102 levures et moisissures par millilitre ou par
gramme d’échantillon.

EXEMPLE 2 Une boîte pour une dilution

S = 1 g; V = 1; dénombrement obtenu pour la dilution 10−1: 60

Formule (2) N = c/(V · d) = 60/(1 · 10−1) = 60/0,1 = 600 ou 6 · 102 levures et moisissures par millilitre ou par
gramme d’échantillon.

EXEMPLE 3 Deux boîtes pour deux dilutions

S = 1 g; V = 1; dénombrements obtenus pour la dilution 10−2: 235 et 282 et pour la dilution 10−3: 31 et 39

Formule (3) N = wm/(V · d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1 · 2) · 10−2 = 587/0,022 = 26 682.

L’arrondi du résultat comme indiqué ci-dessus donne 27 000 ou 2,7 · 104 levures et moisissures par millilitre ou
par gramme d’échantillon.

EXEMPLE 4 Deux membranes de filtration pour une dilution

S = 1 g; V = 1; dénombrements obtenus pour la dilution 10−1: 18 et 22

Formule (1) N = m/(V · d) = 20/(1 · 10−1) = 20/0,1 = 200 ou 2 · 102 levures et moisissures par millilitre ou par
gramme d’échantillon.

EXEMPLE 5 Une membrane de filtration pour une dilution

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S = 1 g; V = 1; dénombrement obtenu pour la dilution 10−1: 65

Formule (2) N = c/(V · d) = 65/(1 · 10−1) = 65/0,1 = 650 ou 6,5 · 102 levures et moisissures aérobies par millilitre
ou par gramme d’échantillon.

EXEMPLE 6 Deux membranes de filtration pour deux dilutions

S = 1 g; V = 1; dénombrements obtenus pour la dilution 10−1: 121 et 105; pour la dilution 10−2: 15 et 25

Formule (3) N = wm/(V · d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1 · 2) · 10−1 = 266/0,22 = 1 209.

L’arrondi du résultat comme indiqué ci-dessus donne 1 200 ou 1,2 · 103 levures et moisissures par millilitre ou
par gramme d’échantillon.

EXEMPLE 7 Deux boîtes pour une dilution

S = 1 g; V = 1; dénombrements estimés obtenus pour la dilution 10−1: 28 et 22

Formule (1) N = m/(V · d) = 25/(1 · 10−1) = 25/0,1 = 250 ou 2,5 · 102 levures et moisissures par millilitre ou par
gramme d’échantillon.

Le nombre estimé est 250 ou 2,5 · 102 levures et moisissures par millilitre ou par gramme d’échantillon.

EXEMPLE 8

S = 1 g; V = 1; dénombrements estimés obtenus pour la dilution 10−1: 0 et 0

Formule (1) N =   ≤ 1/d · V · S, ≤ (1/0,1) · 1 · 1 ≤ 10 levures et moisissures par millilitre ou par gramme de
l’échantillon.

Le nombre estimé est inférieur à 10 levures et moisissures par millilitre ou par gramme d’échantillon.

12 Neutralisation des propriétés fongicides du produit

12.1 Généralités
Les différents essais décrits ci-dessous démontrent que les micro-organismes peuvent se développer
dans les conditions de l’analyse.

12.2 Préparation de l’inoculum

Avant l’essai, ensemencer la surface du milieu gélosé Sabouraud dextrose (SDA) avec Candida albicans.
Incuber la boîte de 18 h à 24 h, à 32,5 °C ± 2,5 °C.
Utiliser une anse stérile pour prélever en surface par stries et remettre en suspension dans le diluant
(voir 5.2) pour obtenir une suspension calibrée d’environ 1 × 106 UFC/ml (en utilisant, par exemple, un
spectrophotomètre); voir l’ISO 21148.
Utiliser cette suspension étalonnée et ses dilutions dans les 2 h qui suivent.

12.3 Applicabilité des méthodes de dénombrement

12.3.1 Principes

Mélanger l’échantillon neutralisé (suspension initiale ou dilution d’échantillon en fonction de l’activité

fongicide ou de la faible solubilité du produit) avec une dilution de la souche de référence. Transférer
dans une boîte de Petri ou filtrer sur une membrane. Après incubation, vérifier la nature des colonies et
comparer le dénombrement avec un témoin (sans l’échantillon).
Si le dénombrement est inférieur à 50 % (0,3 log) du témoin, modifier le mode opératoire (diluants,
agents neutralisants ou combinaison de ceux-ci; voir Annexe D). L’échec de développement de l’inoculum

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invalide l’essai, à moins qu’il soit possible de considérer comme improbable la contamination du produit
avec ce micro-organisme.

12.3.2 Essai d’applicabilité de la méthode par ensemencement en profondeur

Mélanger 9 ml de la suspension initiale et/ou de la ou des dilutions d’échantillons dans le diluant

neutralisant (ou autre; voir 5.2) avec 1 ml de la suspension de micro-organismes contenant de
1 000 UFC/ml à 3 000 UFC/ml. Transférer 1 ml dans une boîte de Petri (duplication de préférence)
et verser de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé (5.4.2) maintenu en surfusion dans un bain-marie à une
température ne dépassant pas 48 °C. En parallèle, préparer en boîte de Petri un témoin en utilisant le
même diluant et la même suspension de micro-organismes, mais sans l’échantillon.
Après incubation de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note en 4.2 et 4.3),
dénombrer les colonies sur les géloses et comparer les dénombrements obtenus pour l’essai et pour le
témoin. Le diluant et la méthode de dénombrement sont satisfaisants pour la dilution 1:10 (lorsque 1 ml
de la suspension initiale est utilisé) si le dénombrement est au moins égal à 50 % du témoin.

12.3.3 Applicabilité de la méthode par étalement en surface

Mélanger 9 ml de la suspension initiale dans le diluant neutralisant (ou autre, voir 5.2) avec 1 ml de
la suspension de micro-organismes contenant 10 000 UFC/ml à 30 000 UFC/ml (ou moins si 0,5 ml
ou 1 ml est étalé). Étaler au moins 0,1 ml sur une gélose solidifiée (5.4.2) (duplication de préférence).
En parallèle, préparer en boîte de Petri un témoin en utilisant le même diluant et la même suspension
de micro-organismes, mais sans l’échantillon.
Après incubation de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note en 4.2 et 4.3),
dénombrer les colonies sur les géloses et comparer les dénombrements obtenus pour l’essai et pour le
témoin. Le diluant et la méthode de dénombrement sont satisfaisants pour la dilution 1:10 (lorsque 1 ml
de la suspension initiale est utilisé) si le dénombrement de l’essai d’applicabilité est au moins égal à
50 % (0,3 log) du dénombrement du témoin.

12.3.4 Applicabilité de la méthode par filtration sur membrane

Mélanger une quantité appropriée d’une suspension calibrée de micro-organismes correspondant

à environ 100 UFC au volume de la suspension initiale ou de la dilution d’échantillon de l’essai
(voir [Link]).
Filtrer immédiatement la totalité du volume et laver la membrane en utilisant les volumes d’eau (5.1),
de diluant (5.2.3) ou de diluant neutralisant (5.2.2) définis. Transférer la membrane sur la surface d’un
milieu gélosé approprié (5.4.2).
En parallèle, préparer un témoin dans les mêmes conditions que ci-dessus, mais sans le produit. Filtrer
et laver le témoin dans les mêmes conditions.
Après incubation de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note en 4.2 et 4.3),
dénombrer les colonies sur les membranes et comparer les dénombrements obtenus pour l’essai et pour
le témoin. La méthode de filtration sur membrane et le diluant sont satisfaisants si le dénombrement de
l’essai d’applicabilité est au moins égal à 50 % (0,3 log) du dénombrement témoin.

13 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:
a) toutes les informations nécessaires à l’identification complète du produit;
b) la méthode utilisée;
c) les résultats obtenus;

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d) tous les détails opératoires pour la préparation de la suspension initiale;

e) la description de la méthode, avec les neutralisants et les milieux utilisés;
f) l’applicabilité de la méthode, même si l’essai a été réalisé séparément;
g) tout point non spécifié dans le présent document ou proposé comme une option ainsi que des
précisions concernant les incidents ayant pu influer sur les résultats.

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Annexe A
(informative)

Autres diluants neutralisants

A.1 Généralités
N’importe quel diluant neutralisant peut être utilisé pour préparer la suspension initiale dans la mesure
où il a été vérifié et démontré comme étant applicable. Les diluants neutralisants suivants sont des
exemples de formulations appropriées. Des informations générales sur la neutralisation sont fournies
dans l’Annexe D.

A.2 Bouillon liquide Eugon LT100

A.2.1 Généralités
Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans
l’échantillon (lécithine et polysorbate 80); et un agent de dispersion (octoxynol 9).

A.2.2 Composition

Hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g

Hydrolysat papaïque de soja 5,0 g

L-cystine 0,7 g

Chlorure de sodium 4,0 g

Sulfite de sodium 0,2 g

Glucose 5,5 g

Lécithine d’œuf 1,0 g

Polysorbate 80 5,0 g

Octoxynol 9 1,0 g

Eau 1 000 ml

A.2.3 Préparation
Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf
jusqu’à dilution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant. Répartir
le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
stérilisation, le pH doit être de 7,0 ±  0,2, le mesurage étant effectué à la température ambiante.

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A.3 Diluant lécithine polysorbate (LP)

A.3.1 Composition

Polypeptone 1,0 g

Lécithine d’œuf 0,7 g

Polysorbate 80 20,0 g

Eau 980 ml

A.3.2 Préparation
Mélanger et dissoudre les ingrédients tout en chauffant. Laisser refroidir jusqu’à 25 °C avant de répartir
la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la
stérilisation, le pH doit être de 7,2 ±  0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.

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Annexe B
(informative)

Autres diluants

B.1 Généralités
N’importe quel diluant peut être utilisé pour préparer la suspension initiale dans la mesure où il a été
vérifié et démontré comme étant applicable. Les diluants suivants sont des exemples de formulations
appropriées.

B.2 Solution peptonée tamponée (pH 7)

B.2.1 Composition

Hydrolysat de viande 1,0 g

Chlorure de sodium 4,3 g

Phosphate de monopotassium 3,6 g

Phosphate disodique dihydraté 7,2 g

Eau 1 000 ml

B.2.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients dans l’eau bouillante. Mélanger et laisser refroidir jusqu’à 25 °C avant de
répartir la solution dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
Après la stérilisation, le pH doit être de 7,1 ±  0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.

B.3 Tampon phosphate (pH 7,2)

B.3.1 Composition

Phosphate monopotassique 34 g

Eau 500 ml

B.3.2 Préparation
Dissoudre les ingrédients dans l’eau dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Ajuster la valeur de pH à 7,2 ± 0,1
avec environ 175 ml d’hydroxyde de sodium (4,3 g/100 ml). L’eau est ensuite ajoutée pour obtenir un
volume final de 1 000 ml. La concentration finale de la solution est de 0,05 mol/l. Il s’agit de la solution
mère. La stocker au réfrigérateur.
Avant utilisation, diluer la solution mère avec de l’eau selon un rapport de 1:800 et la stériliser à
l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

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Annexe C
(informative)

Autres milieux de culture

C.1 Généralités
N’importe quel milieu de culture peut être utilisé dans la mesure où il a été vérifié et démontré comme
étant applicable. Les milieux suivants sont des exemples de formulations appropriées.

C.2 Gélose pour le dénombrement

C.2.1 Milieu gélosé dextrosé à la pomme de terre avec antibiotiques

C.2.1.1 Composition

Extrait de pomme de terre 4,0 g

Glucose 20,0 g

Gélose 15,0 g

Chloramphénicol 0,05 g

Eau 1 000 ml

C.2.1.2 Préparation

Mélanger tous les composants et répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave
à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 5,6 ±  0,2, le mesurage
étant effectué à température ambiante.
Il est également permis de remplacer le chloramphénicol par 0,10 g de benzylpénicilline potassique
et 0,10 g de tétracycline par litre de milieu, ajoutées sous forme de solutions stériles, juste avant
l’utilisation.

C.2.2 Milieu gélosé glucose-hydrolysat (GP) avec antibiotiques

C.2.2.1 Composition

Glucose 20,0 g

Extrait de levure 2,0 g

Sulfate de magnésium 0,5 g

Hydrolysat 5,0 g

Phosphate de potassium monobasique 1,0 g

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Gélose 15,0 g

Chloramphénicol 0,05 g

Eau 1 000 ml

C.2.2.2 Préparation

Mélanger tous les composants et répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave
à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 5,7 ±  0,1, le mesurage
étant effectué à température ambiante.
Il est également permis de remplacer le chloramphénicol par 0,10 g de benzylpénicilline potassique
et 0,10 g de tétracycline par litre de milieu, ajoutées sous forme de solutions stériles, juste avant
l’utilisation.

C.3 Milieu gélosé à l’extrait de malt

C.3.1 Composition

Extrait de malt 30,0 g

Hydrolysat de soja, hydrolysat papaïque de soja 3,0 g

Gélose 15,0 g

Chloramphénicol 0,05 g

Eau 1 000 ml

C.3.2 Préparation
Dissoudre les composants (y compris le chloramphénicol) ou le milieu complet déshydraté dans
l’eau en chauffant. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 115 °C
pendant 10 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à
température ambiante.

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Annexe D
(informative)

Neutralisants de l’activité fongicide des

conservateurset des liquides de rinçage

Tableau D.1

Composés chimiques pouvant Exemples de neutralisants appropriés

Conservateur neutraliser l’activité fongicide des et de liquides de rinçage
conservateurs (pour les méthodes de filtration sur membrane)
Composés phénoliques: Lécithine Polysorbate 80, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
parabens,
Polysorbate 80 Condensat d’oxyde d’éthylène et d’alcools gras,
phénoxyéthanol,
7 g/l + lécithine, 20 g/l + polysorbate 80, 4 g/l.
phényléthanol, Condensat d’oxyde d’éthylène
anilides d’alcools gras Bouillon neutralisant D/E.
Tensioactifs non ioniques Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone,
1 g/l + NaCl, 9 g/l; polysorbate 80, 5 g/l.
Composés d’ammonium Lécithine, saponine, polysorbate 80, Polysorbate 80, 30 g/l + dodécylsulfate de
quaternaire dodécylsulfate de sodium sodium, 4 g/l + lécithine, 3 g/l.
Tensioactifs cationiques Condensat d’oxyde d’éthylène Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l +
d’alcools gras lécithine, 3 g/l.
Bouillon neutralisant D/E.
Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone,
1 g/l + NaCl, 9 g/l; polysorbate 80, 5 g/l.
Aldéhydes Glycine, histidine Lécithine, 3 g/l + polysorbate 80, 30 g/l +
L-histidine, 1 g/l.
Agents générateurs de
formaldéhyde Polysorbate 80, 30 g/l + saponine,
30 g/l + Lhistidine, 1 g/l + L-cystéine, 1 g/l.
Bouillon neutralisant D/E.
Liquide de rinçage: polysorbate 80, 3 g/l +
L-histidine, 0,5 g/l.
Oxydants Thiosulfate de sodium Thiosulfate de sodium, 5 g/l.
Liquide de rinçage: thiosulfate de sodium, 3 g/l.
NOTE En fonction du pH du produit cosmétique, le pH du neutralisant peut être ajusté à une valeur appropriée.

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Tableau D.1 (suite)

Composés chimiques pouvant Exemples de neutralisants appropriés

Conservateur neutraliser l’activité fongicide des et de liquides de rinçage
conservateurs (pour les méthodes de filtration sur membrane)
Isothiazolinones, Lécithine, saponine, amines, sulfates, Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l +
imidazoles mercaptans, bisulfite de sodium, lécithine, 3 g/l.
thioglycolate de sodium
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polysorbate 80, 5 g/l.
Biguanides Lécithine, saponine, polysorbate 80 Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l +
lécithine, 3 g/l.
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polysorbate 80, 5 g/l.
Sels métalliques (Cu, Bisulfate de sodium, L-cystéine Thioglycolate de sodium, 0,5 g/l ou 5 g/l.
Zn, Hg)
Composés sulfurés, L-cystéine, 0,8 g/l ou 1,5 g/l.
Composés acide thioglycolique
Bouillon neutralisant D/E.
organomercuriels
Liquide de rinçage: thioglycolate de sodium,
0,5 g/l.
NOTE En fonction du pH du produit cosmétique, le pH du neutralisant peut être ajusté à une valeur appropriée.

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Bibliographie

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