La complexité du microbiote dans les associations entre éponges et micro-organismes
Introduction
Diapo 1 : Les éponges marines contiennent des communautés microbiennes d’une grande diversité.
Les membres du phylum Poribacteria sont presque tous retrouvés dans les éponges. Malgré la
complexité du microbiote des éponges, les communautés microbiennes des différentes éponges
semblent pourtant être en partie similaires.
Les Approches génomiques unicellulaires apportent des améliorations dans la compréhension des
consortiums microbiens bénéfiques, tel que la caractérisation fonctionnelle du phylum candidat
Poribacteria. En effet, les données de certains membres sont absentes car elles sont inaccessibles
avec les techniques conventionnelles.
De nombreuses éponges marines sont remarquables pour leurs associations avec des communautés
microbiennes diverses et denses..Leurs symbiotes participent au métabolisme et au répertoire
biochimique de l'hôte, ils sont donc responsables du succès évolutif de leurs hôtes.
Les poribactéries ont été identifiées chez plus d'une douzaine d'espèces d'éponges provenant de
différents océans. Ceci démontre leur distribution étendue. En effet, la transmission verticale des
poribactéries à l'éponge de la génération suivante leurs permettent de proliférer et persister.
Certaines études récentes ont rapporté la présence d'ADN poribactérien dans l'eau de mer. Tandis
qu’auparavant on les retrouvé seulement chez les éponges marines.
Les récentes technologies de séquençage de nouvelles générations aboutissent à des améliorations
dans l'étude des micro-organismes dans les milieux naturels. Notamment l’identification d'une «
biosphère rare » microbienne, comprenant un ensemble phylogénétiquement diversifié
d'organismes qui ne sont présents qu'à très faible quantité.
Matériaux et méthodes
Diapo 2 La technique 454 permet le séquençage à partir l'amplification de l’ADN par l'amplification
en chaîne par polymérase en émulsion (EmPCR) et par le pyroséquençage. Cette technique permet
d’obtenir le séquençage de nombreuses bases dans un temps relativement court.« Les données de
pyroséquençage d'Amplicon 454 ont été précédemment générées en utilisant un ensemble de 32
espèces d'éponges.
Pour cette étude, les données des séquences de marquage des cinq éponges méditerranéennes
Aplysina aerophoba, Aplysina cavernicola, Ircinia variabilis, Petrosia ficiformis et Pseudocorticium
jarrei ont été extraits de l'ensemble des données et analysés plus en détail. (A. aerophoba: a été
récupéré en Croatie, , toutes les autres éponges: en France, à une profondeur de 15 m)
. Pour l'attribution au niveau phylum pour un seuile de simiralité de 75% , classe, ordre, famille et
genre, des seuils de similarité de séquence de 75, 80, 85, 90 et 95% ont été appliqués.
Dans les cas où la taxinomie des séquences les plus similaires étaient incohérentes, une règle de
majorité était appliquée et la séquence d'étiquette n'était attribuée que si au moins 60% de toutes
les séquences de référence partageaient la même annotation taxonomique au niveau taxinomique.
DIAPO 3 / L'amplification du génome entier (WGA) est une technologie efficace et reproductible
permettant d'obtenir plus de matériel génétique a à partir d'une faible quantité d'ADN. C’est
une amplification entière du génome effectuée à température constante soit 30°C par la polymérase
Phi29A.
La WGA montrent des résultats prometteurs mais la technique possède toujours des limites comme
les défauts de réplications. Dans l’étude, nous avons appliqué WGA à une seule cellule
poribactérienne qui a été obtenue à partir de l'éponge A. aerophoba par tri cellulaire activé par
fluorescence. Cette stratégie fournit près de 1,9 Mo d’informations sur les séquences
poribactériennes, et révèle ainsi un aperçu sans précédent du mode de vie de ce phylum bactérien
insaisissable
Diapo 4
Résultats
Les OTU A. cavernicola, I. variabilis, P. ficiformis et P. jarrei, étaient associées à 15 phylums
bactériens, à 5 phylums candidats ainsi qu’à une lignée bactérienne non classifiée auparavant
appelée SAUL (lignée non identifiée associée à l'éponge). A aerophoba a montré la plus grande
diversité de phylum avec 15 phylums bactériens différents alors que P. jarrei a révélé la plus faible
diversité avec 8 phylums bactériens. Les trois éponges restantes contenaient toutes des OTU affiliées
à 13 ou 14 phylums bactériens.
DIAPO5 Ies phylums suivant sont identifiés dans les cinq éponges étudiées , on retrouve
Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospira, Proteobacteria et Spirochaetes ainsi
que le phylum candidat Poribacteria . Chloroflexi possèdent jusqu’à 53 OTU différent et chez
les protéobactéries 45 OTU. Les acidobactéries étaient représentées par une moyenne de 11
OTU, les actinobactéries par 6 OTU et les poribactéries par 9,4 OTU. Tous les autres phylums
étaient moins diversifiés avec 7 OTU différents ou moins. Alors , Chlamydiae, et
Planctomycetes, ainsi que les phylums TM6 et TM7 candidats, ont été trouvés seulement
dans l'une des cinq espèces d'éponges.
Diapo 6
La Similitude de la communauté bactérienne des cinq éponges
La distance de Bray-Curtis permet de définir la dissimilarité entre deux échantillons donnés, en
termes d'abondance d'espèces présentes dans chacun de ces échantillons. Au niveau de
l'embranchement, l'analyse des valeurs de similarité de Bray-Curtis a montré une importante
similitude de 75% pour les communautés bactériennes présentes chez A. aerophoba, A.
cavernicola, P. ficiformis, et I. variabilis avec les deux éponges Aplysina détiennent des communautés
bactériennes similaires. La communauté bactérienne de P. jarrei se différenciée des autres éponges
avec une valeur de BrayCurtis de seulement 60%. Avec une approche du phylotype, on retombe sur
le même résultat. Le même modèle de similarité a été obtenu avec les deux éponges Aplysina
regroupant les communautés bactériennes les plus similaires. Tandis que P. jarrei possèdent la
communauté bactérienne étant la plus différente.
Diapo 7
. le nom de contig remplace l’étiquette de locus
Environ 28 mg d'ADN génomique amplifié ont été obtenus puis révélé par spectrophotométrie. Le
pyroséquençage SAG a produit 105Mb de données de séquences brutes, ainsi que 1,88Mb
d'informations génomiques organisées dans 1597 contigs ont été assemblés.
Deux ensembles de données ont été générés. Le premier ensemble de 455 contigs abrite au moins
un cadre de lecture ouvert (ORF) par contig et inclut environ 1,6 Mo d'informations de séquence.
Un autre ensemble de 1142 contigs regroupent seulement des fragments de gènes sans codon start
et stop. Ces contigs ont été traduits dans les six cadres de lecture.
. On constate qu’il y a presque trois fois plus de contig non codant. Un certain nombre de gènes
codant pour le métabolisme de dégradation ont été trouvés.
Les gènes codant pour le cycle réducteur de l'acide tricarboxylique et la voie réductrice de l'acétyl-
CoA, aussi nommée voie de Wood-Ljungdahl, ont été identifiés sur le génome poribactérien.
Diapo 9
Enveloppe cellulaire
Les gènes possédant un rôle dans la biosynthèse du peptidoglycane, la biosynthèse des
lipopolysaccharides ont été identifié .La découverte d'un récepteur membranaire externe dépendant
de TonB (POR_0881), de la protéine TonB elle-même (POR_0882) et de la sous-unité préprotéique
translocase SecA (POR_0883) démontre la présence d'un périplasme. De plus, la voie Tat Sec
independent a été identifié, elle est déjà connue des bactéries Gram-négatives et Gram-positives.
Diapo 10Discussion
Les risques de contamination sont es préoccupations majeures dans l'amplification des génomes
uniques. Les criblages PCR de l'amplicon du puits A3 utilisant des paires d'amorces ciblant différents
gènes ARNr étaient négatifs. Il faut souligner que l'ADNr 16S poribactérien ne peut pas être amplifié
avec les amorces universelles eubactériennes 27f / 1492r à cause de mésappariements dans la
région de liaison d'amorce.
Les poribactéries sont capables de métabolisme aérobie et hétérotrophe.
Les microhabitats microaérobies ou même anaérobies sont capables d’être générés par un
métabolisme microbien actif, lorsque la demande en oxygène dépasse l'apport d'oxygène. De plus, il
a été démontré que A. aerophoba devient anaérobie pendant les périodes de non-pompage.
La voie de Wood-Ljungdahl constitue le moyen le plus fondamental d'obtenir du carbone organique
par l'assemblage de deux molécules de carbone inorganiques. En termes d'évolution, la voie de
Wood-Ljungdahl est considérée telle que la voie métabolique la plus ancienne qui aurait pu être
présente dans les bactéries habitant la terre anoxique il y a plusieurs milliards d'années.
Diapo 11
Il semble que les poribactéries possèdent un ancêtre Gram négatif. Effectivement, les gènes
impliqués dans la biosynthèse du peptidoglycane et des lipopolysaccharides ont été identifiés.
Aplysina aerophoba est une éponge modèle pour l'étude des associations éponge-microbe.
Depuis 1970, les études sur la diversité morphologique des bactéries associées à A. aerophoba ont
été enrichies par des approches et des études moléculaires sur la diversité microbienne. Dans cette
étude, un jeu de données de pyroséquençage d'amplicons 454 obtenu à partir d'A. aerophoba a été
réanalysé en même temps que les données de marqueurs de séquences de quatre autres éponges
méditerranéennes. Chez A. aerophoba , 15 phylums bactériens sont identifiés , dont 10 ont été
découverts grâce à cette éponges .
La lignée SAUL a été détecté dans plusieurs éponges auparavant mais n'a pas été trouvé chez A.
aerophoba. L'affiliation phylogénétique de la lignée SAUL n'est toujours pas bien déterminé.
Parmi les quatre phylums nouvellement trouvés, le Deinococcus-Thermus et le phylum candidat TM7
aussi retrouvé dans d'autres éponges mais, toujours à faible diversité.
Deux nouveaux phylums candidat ont été détectés, OS-K et OP10. Ceci prouve l’important potentiel
de la pyroséquençage des amplicons afin de détecter des membres moins abondants des
communautés bactériennes. En effet, ils peuvent passer inaperçu avec les méthodes moléculaires
conventionnelles= ( oral les méthodes moléculaires conventionnelles ne les détectent pas toujours
). Cette méthode pyroséquençage des amplicons permet d’améliorer les connaissances sur la
diversité bactérienne.
Diapo 12
Dans cette étude, 13 phylums bactériens différents ont été détectés chez A. cavernicola, y compris
deux phylums candidats (Poribacteria, OP10), ainsi que la lignée SAUL non classifiée. .
Effectivement, 8 phylums ont été retrouvés dans les quatre éponges, sauf Firmicutes, tous ces
phylums sont connus pour contenir des groupes spécifiques à l'éponge.Les quatre éponges A.
aerophoba, A. cavernicola, I. variabilis et P. ficiformis présentent un chevauchement de plus de 75%
entre leurs communautés microbiennes au niveau de l’embranchement.
Dans les éponges marines, les phylums les plus diversifiées sont : Proteobacteria et Chloroflexi.Ceci
est conforme avec les données obtenues à partir de banques de clones de gènes de l'ARNr 16S. Les
communautés de base, variables et spécifiques à l'espèce sont phylogénétiquement diverses et ne
sont pas dominées par un seul embranchement.
Diapo 13En émettant l’hypothèse que 97% de similarité de séquence est un seuil approximatif pour
les espèces bactériennes. Les résultats suggèrent que les éponges partagent peu de leurs espèces
bactériennes. Chaque espèce d'éponge contient un grand ensemble d'espèces bactériennes uniques.
Cependant, ceci entre en contradiction avec la compréhension actuelle du microbiote dans les
éponges que l'on suppose très similaire.
Dans une étude précédente, un modèle de transmission symbiotique a été envisagé. Il détient une
combinaison de transmission verticale et horizontale afin de permettre la conservation des
consortiums microbiens complexes dans les éponges.Le mécanisme alternatif de transmission
horizontale est l'absorption direct de symbiotes à partir de l'eau de mer. Cependant, il est assez
compliqué à démontrer.
Diapo 14
Enfin, une récente étude sur le pyroséquençage d'amplicons 454 a détecté des micro-organismes
spécifiques à l'éponge dans l'eau de mer, mais à très faible quantité. Les auteurs supposent que des
micro-organismes spécifiques à l'éponge seraient présents dans l'eau de mer dans la biosphère d'eau
de mer.. Les éponges seraient capables de récolter ces lignées microbiennes à partir de l'eau de mer
en plus de la transmission verticale des symbiotes la théorie est que la combinaison de transmission
horizontale et environnementale permet le maintien des associations éponges-micro-organismes. La
réalisation études complémentaires sont essentielles afin de valider cette théorie.
Les séquences du gène de l'ARNr 16S récupérées dans cette étude ne correspondent pas toujours à
d'autres séquences géniques dérivées de d'éponge mais à des séquences de l'ARNr 16S de
l’environnement ils seraient donc définis comme des contaminants de l'eau de mer.
Conclusions
Diapo 15
Plusieurs facteurs de symbiose tels que les adhésines et les protéines contenant des domaines
eucaryotes ont été identifiés, pouvant être impliqués dans des interactions micro-organisme-éponge
les symbiotes des éponges sont commensales et bénéfiques pour leurs hôtes.
Tels que l es Poribactéries qui sont des bactéries mixotrophes, elles sont capables de respiration
aérobie et anaérobie., ils s sont capables réaliser la dénitrification permet une respiration alternative
lorsque l’oxygène est limité.Dans le génome poribactérien les gènes codant pour la voie de Wood-
Ljungdahl ont été identifiés. Cette voie constitue le moyen le plus fondamental d'obtenir du
carbone organique avec l'assemblage de deux molécules de carbones inorganiques
Pour cette étude, l'ensemble de données de cinq éponges méditerranéennes a été choisi, ainsi que
l'éponge modèle Aplysina aerophoba.
Le séquençage profond des éponges a révélé une diversité encore inconnue révèlant de nouveau. Le
microbiome de l’éponge regroupe très peu de bactéries de base trouvées également chez les cinq
éponges et possède une forte abondance de bactéries spécifiques de l’hôte
Cependant, ces bactéries spécifiques à l'espèce hôte sont probablement encore étroitement liées
entre elle , ceci explique la similitude observée entre les communautés bactériennes dans les
éponges. Ces nouveaux résultats nous permettent de mieux évaluer et comprendre l'un des systèmes
symbiotiques les plus variées .Certains détails comme la transmission horizontale environnementale
sont encore controversés et nécessite de nouvelles recherches.
