219

- Une recherche et une numération

des principaux germes microbiens
rencontrés dans nos aliments.

- Détection des germes pathogènes

dangereux.

présence / absence

220
 Les industriels agroalimentaires ont besoin:

 De méthodes rapides pour

apprécier la qualité hygiénique des denrées
produites.

 pouvoir maîtriser efficacement

leurs procédés de fabrication.

 commercialiser leurs produits sans attendre

longtemps avant l’apparition des résultats
des analyses microbiologiques

221
 L’analyse microbiologique traditionnelle
des produits finis reste indispensable car
elle permet d’éviter la commercialisation
ou la consommation des produits dangereux
ou non conformes.

222
223
 En bactériologie alimentaire il n’est pas toujours
nécessaire de rechercher, de compter et d’identifier
systématiquement tous les germes présents dans
le produit.

 La présence de germes témoins de contamination

fécale indique plutôt une probabilité de présence de
pathogènes qu'une certitude de présence.

224
 Il faut commencer par effectuer :
1) une étude quantitative de la flore microbienne.

Puis si c’est nécessaire effectué

2) Une recherche orientée de certaines bactéries

pathogènes (Salmonella, Staphylococcus aureus)

225
 La recherche des flores spécifiques passe par
l’ensemencement de l'échantillon sur 2 types de
milieux:

- Le premier, appelé milieu présomptif, va

restreindre le développement de certains micro-
organismes pour ainsi mettre en évidence la
croissance du micro-organisme recherché.

- Le second, appelé milieu confirmatif, confirme la

présence du germe.

226
 Reflète la qualité microbiologique générale d’un produit et
permet d’en suivre l’évolution.

 Donne une indication de l’état de décomposition du

produit.

 Peut constituer un indice de la qualité sanitaire.

 Exemple: milieu PCA (Plate Count Agar).

227
 Les coliformes totaux: Entérobactéries Gram-, non sporulé,
fermentent le lactose à (30 – 37°C) avec production de gaz.

 Les coliformes thermotolérants (fécaux) qui fermentent le

lactose avec production de gaz à 44 °C.
Exemple Escherichia coli.

228
 Recherchés dans les aliments car ils sont de bons
marqueurs de l'hygiène des manipulations de ces
aliments.
 Les coliformes étant des bactéries vivant dans les
intestins d'animaux ou humains, leurs présence dans
l'eau indique une pollution fécale récente.
 Ce sont donc des organismes indicateurs de la qualité
microbiologique de l'eau et des aliments.
 Milieu BLBVB (bouillon lactosé bilié au vert brillant) ,
milieu VRBL La gélose lactosée biliée au cristal violet et
au rouge neutre.(30°C et 44°C)

229
 Deux milieux sont utilisés:
- le milieu présomptif Roth (présence de trouble)
- et le milieu de confirmation Litsky (présence de
trouble + formation de pastille violette à la surface
du tube).

 Témoignent d'une contamination d'origine fécale

ancienne.

230
 Le dénombrement des spores d’anaérobies
sulfitoréductrices sur milieu Viande Foie:
Ce milieu est constitué de :
- viande foie :Source de protéine
- Glucose : Source de carbone
- Amidon soluble : Facilite la germination des spores

Production de H2S qui réagit avec le

fer pour former du sulfure de fer qui précipite,
entourant les colonies d’un halo noir.
S + Fe --> FeS

231
 Détection des formes végétatives
(Clostridium perfringens) sur milieu TSN
(Tryptone sulfite néomycin):
Le milieu TSN est une gélose sélective, elle
exploite le fait que Clostridium perfringens
est résistant au deux antibiotiques
la polymyxine et la néomycine et qu’il a le
pouvoir de réduire les sulfites (apparition de
colonies noires).
(croissance en anaérobiose)

232
 L’isolement des champignons est
réalisé par exemple sur milieu PDA
(pomme de terre Agar).

233
234
4.2.1. Dénombrement en milieu solide.

Exemple dénombrement des germes

mésophiles aérobie totaux.

235
236
 ∑ Cn
N=
(n1 ×v1)d1 + (n2 ×v2)d2 +…+ (nn ×vn)dn

Cn : nombre de colonies comptées sur les boites

retenues
nn : nombre de boite retenu de la n-ième dilution
vn : volume de l’inoculum de la n-ième dilution en ml
dn : valeur de la dilution de la n-ième dilution

237
Exemple : dénombrement des coliformes totaux et fécaux

238
La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) utilise
une méthode statistique pour connaître le nombre (le
plus probable) de bactéries présentes dans 1 mL de
dilution.

Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2, 3,

4 ou 5) et on compare les résultats à une table statistique
= la table de Mac Grady qui donne le NPP sur la
dilution considérée.

 Il s’agit donc d’une interprétation probabiliste

239
EXEMPLE: recherche de coliformes dans une eau polluée.
1. Réaliser une gamme de dilution

2. Etape présomptif: Ensemencer 1 ml de chaque

dilution dans trois tubes contenant un bouillon lactosé
(avec cloche de Durham).
Incubation à 30°C.

3. Etape confirmatif: 1 ml de chaque tube positif est

incubé dans un tube contenant du milieu BLBVB
(avec cloche de Durham).
-Incubation entre (30 - 37°C) pendant 48 h, pour la
recherche des coliformes totaux.
-Incubation à 44°C pour la recherche des coliformes
thermotolérants.
240
Remarques:
- La cloche de Durham permet de recueillir les gaz produits.
- Sont considérés comme positifs (tube +) les tubes présentant à la
fois :

 Un dégagement gazeux
(supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche).

 Un trouble microbien

tube + tube - 241

Composition du milieu BLBVB(bouillon lactosé bilié au
vert brillant).

 Peptone 10,0 g
 Lactose 10,0 g
 Bile 20,0 ml
 Vert brillant 13,0 mg
 pH = 7,4

Ce milieu contient deux inhibiteur des bactéries Gram+ : la bile

et le vert brillant.

242
 Lecture
Après incubation des tubes, noter dans un tableau pour chaque tube
si le résultat est positif (+) ou négatif (-).
Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats
Nombre de + + + + + + + + - + - - - - -
résultats +
Regroupement

- Il y a au moins un microorganisme dans un ml de la dilution 10-3

- Il y a moins de un microorganisme dans un ml de la dilution 10-4 .
243
 Grouper le nombre de résultats positifs par dilution

Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
résultats + 3 3 2 1 0
Regroupement

244
 Regrouper en nombre de 3 chiffres la suite de
chiffres obtenue en commençant par le chiffre obtenu
par la plus faible dilution.

Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
résultats + 3 3 2 1 0
Regroupement 332 321 210 - -

245
Choix de la dilution pour le calcul:

choisir la dilution qui possède le

regroupement le plus grand tout en
étant inférieur à 330 pour la
méthode à 3 tubes / dilution.

246
 Dilutions 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Aspect des
tubes
(BLBVB
+ cloche)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de
résultats + 3 3 2 1 0
Regroupement 332 321 210 - -

247
248
 Lire la valeur du NPP dans la table de Mac Grady et en
déduire la concentration des bactéries dans l’échantillon :
Nombre de Nombre de tubes
tubes positifs au positifs au niveau
niveau des 3 NPP des 3 taux de NPP
taux de dilution dilution retenus
retenus
000 < 0,3 230 2,9
001 0,3 300 2,3
010 0,3 301 4
020 0,6 302 6
100 0,4 310 4
101 0,7 311 7
110 0,7 322 12
111 1,1 320 9
120 1,1 321 15
121 1,5 322 21
200 0,9 323 29
201 1,4 330 20
210 1,5 331 50
211 2,0 332 110
220 2,1 333 >110
221 2,8

249
• Choisir le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à
330 (meilleure répartition dans les dilutions).
• Lire le NPP dans la table de Mac Grady pour 3 tubes par dilution.
• En déduire la concentration en micro-organismes par mL de
produit [N]

NPP

[N ] =
valeur de la dilution correspond au premier chiffre

Dans le cas de l’exemple, on choisit 321 (car < 330) pour la

dilution 1/10 250
Dans la table de Mac Grady, le NNP correspondant à 321 est 15.
[N] = 15X10= 150 micro-organismes / mL.
 Dilutions en série ou successives 1/10, 1/100, 1/1000…
 Chaque essai doit être doublée ou triplée : ensemencement de 2 ou 3
tubes pour chaque dilution.
 La méthode du Nombre le Plus Probable ou NPP, dérivée des
études de MacGrady, consiste à
interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs
résultats.
• Il s’agit d’une interprétation probabiliste.
• Après incubation, on note pour chaque essai si le résultat est positif
ou négatif.

251
 La confirmation ou la mise en évidence des coliformes
thermo-tolérants (E. coli) s’effectue à partir des tubes positifs
issus des résultats de la recherche des coliformes fécaux, par
la méthode de Mackenzie.
 Milieu BLBVB (44°C), + réactif de Kovacs pour la recherche
de la production d’indole.

252
Test de Mackenzie : méthode classique

Tubes positifs
Ensemencement à partir des tubes +

tube contenant 10 ml de (BLBVB) observation de trouble plus

production de gaz

Tube d’eau quelques gouttes de

Incubation 48h à
44°C
Peptonée réactif de Kovacs
Couleur rouge indique présence d’[Link]

* Le test de Mackenzie confirme la

présence d’[Link].
253
Principe du test de Mackenzie
Tryptophane + eau

Tryptophanase

Indole + pyruvate + ammoniaque

Indole + kovacs donne un anneau rouge

254
255
 Contamination surtout dans les viandes.
 Le nombre de germes pouvant provoquer une
maladie infectieuse est parfois très faible (de l’ordre
de 1 à 50 par 100 g de produit) et dépend de
l’espèce et du consommateur.
 La recherche de ces germes s’effectue par des tests
présence ou absence et la norme est de 0 germe / g

256
 La mise en évidence des Salmonella par la
méthode “traditionnelle” nécessite plusieurs
phases:
- un pré-enrichissement (revivification)
- un enrichissement sélectif ( obligatoire )
- un isolement sélectif
- une identification biochimique
- Sérotypage

257
 Ensemencement dans un milieu liquide non sélectif afin de
favoriser la récupération et la croissance des salmonelles
soumises à un stress ou endommagées par des facteurs
comme:
- l'exposition à la chaleur,
- la congélation,
- la déshydratation,
- les agents de conservation,
- une forte pression osmotique
- d'importantes fluctuations de
température

258
 Milieu eau peptonée tamponnée
 extrait de viande 10 g
 peptone 20 g
 NaCl 6 g
 KH2PO4 1,5 g
 Na2HPO4 9 g
 eau D 1000 ml pH = 6,9.

L’incubation est réalisée pendant 16 h au moins et 24 h au

plus à 37°C.

259
 Ensemencement dans un milieu d'enrichissement sélectif afin
de favoriser le développement des salmonelles tout en
retardant ou inhibant la croissance des micro-organismes
compétiteurs.

260
 Milieu de MULLER KAUFFMANN au tétrathionate
- extrait de viande 0,9 g
- peptone 4,5 g
- extrait de levure 1,8 g
- NaCl 4,5 g
- CaCO3 25 g
- Na2S2O3(thiosulfate) 40,7 g
- bile de bœuf sèche 4,75 g
- eau 1000 ml, pH = 7,6.
 Au moment de l’emploi ajouter 19 ml de solution iodo
iodurée et 9,5 ml de vert brillant à 0,1 %.
 L’addition de 40 mg de novobiocine inhibe les Proteus .
 L’incubation est réalisée sur chaque tube
respectivement à 42°C et 37°C pendant 24 h à 48 h.
261
 Dans ce milieu le thiosulfate (Na2S2O3) se transforme en
tétrathionate en présence d’iode.

 Le tétrathionate inhibe la croissance des coliformes et des

autres bactéries intestinales.

 Les Salmonella (mais aussi les Proteus) réduisent le

tétrathionate et ne sont pas inhibés.

 L’addition de bile de bœuf stimule la croissance de Salmonella

et inhibe les germes d’origine non intestinale.

 Le vert brillant inhibe les bactéries Gram+.

262
 La culture d'enrichissement est ensemencée en stries sur
milieux sélectives différentielles pour l'isolement des
salmonelles.
 Identification des colonies caractéristiques de Salmonella:
forme, aspect, couleur….

263
 Milieu SS: Salmonella- Shigella
 Le milieu contient 3 inhibiteurs :
- sels biliaires,
- vert brillant
- et forte concentration en citrate de sodium.
Inhibe la croissance de toutes bactéries Gram+, et rendent
difficile la croissance des bactéries Gram- autres
que Salmonella et Shigella.

 Le milieu contient du lactose dont la fermentation est révélée

par le virage de l’indicateur coloré, le rouge neutre, à sa teinte
acide.
 Si la bactérie ensemencée produit H2S, en présence du fer III,
un précipité noir se forme au centre de la colonie.

264
 Composition du milieu SS
 Extrait de viande de bœuf 5 g/l
 Bio-polytone 5 g/l
 Sels biliares 8.5 g/l
 Lactose 10 g/l
 Citrate de sodium 8.5 g/l
 Thiosulfate de sodium 8.5 g/l
 Citrate ferrique 4 g/l
Milieu SS + Salmonella
 Vert brillant 0.330 mg
 Rouge neutre 0.025 g/l
 Agar 13.5 g/l
 pH = 7,0
 Incubation 48 h à 37°C
- Lescolonies suspectes de Salmonella, présenteront un centre noir
avec un halo transparent .
- Ces colonies seront l’objet des tests d’identification biochimique.
265
 La reconnaissance des colonies sur milieu
sélectif ne permet pas d’identifier Salmonella
mais donne une bonne présomption.
 Généralement, la présomption de présence
de Salmonella suffit pour satisfaire aux
buts de l’analyse.
 Cette présomption est acquise dès la fin
de l’isolement sur SS (lac -, H2S +)

266
 Ce bouillon (milieu liquide) permet l'enrichissement en
Salmonella par ralentissement de la croissance des autres
bactéries.

267
 La recherche du biotype se fait par la
méthode classique :
- Kligler-Hajna, urée-indole, LDC, ß-
galactosidase, citrate…..
- ou par un mini-système de type galerie
API.

268
 est un ensemble de petits tubes contenant des milieux
déshydratés.

 réalisation rapide et facile de tests

biochimiques miniaturisés.

269
 API® 20 E pour les Entérobactéries
 API® Staph pour les Staphylocoques
 API® Listeria pour les Listeria
 API® Candida pour les levures
 API® 20 A pour les anaérobies ;
 API® Strep pour les Streptococcus;

270
 1- Présentation de la galerie
Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests
biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des
ENTEROBACTERIACEAE.

cupule

microtube contenant le milieu déshydraté

La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés

271
 2- Préparation de l’inoculum

1 seule colonie

Prélèvement
d’une souche
isolement
pure

5 mL d’ED stérile

Suspension d’opacité 0,5 sur l’échelle de

Mac Farland
Souche pure

272
 3- Ensemencement de la galerie API 20 E

Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une

pipette Pasteur stérile, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté
pour éviter la formation de bulles

Pour certains caractères:

Remplir le tube de suspension et

Remplir de suspension le tube
recouvrir d’huile de paraffine
et la cupule
ADH, LDC, ODC, H2S, URE 273
CIT, VP, GEL
 4- Lecture de la galerie API 20 E
Les 10 premiers tests
Tests
négatifs

Tests
positifs

274
 Les 10 derniers tests
Tests négatifs

Tests positifs

NR +
275
 5- Exemple d’ identification d’’une souche
Résultats de la galerie:

- + + + +

5 2 1 5 7 7 3 5 5
Résultats reportés sur la fiche d’identification

Code n°: 5 215 773 (55)

Se référer au catalogue pour identifier la souche à

l’aide du code
276
 sérovar = sérotype désigne une
propriété antigénique permettant d'identifier une cellule
bactérienne par des méthodes sérologiques sur la base des
caractéristiques de leur antigène ou protéines.

 Le genre Salmonella comprend plus de 2000 sérotypes.

 Ils se différencient par leurs antigènes somatiques 0, de

surface Vi et flagellaires H.
 On peut déterminer si c’est S. paratyphi
S. typhi
S. typhi murium……..

C’est-à-dire déterminer genre et espèce

277
L’immunofluorescence

278
 L’anticorps est couplé à une substance fluorescente:
- Fluorescéine l’Iso-Thio-Cyanate (FITC) (verte)
- Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate
(TRITC) (rouge)
 Pour détecter la présence de l’antigène
correspondant dans le prélèvement.

 Lorsque les anticorps réagissent avec les antigènes

qui leur sont spécifiques, le complexe antigène-
anticorps fluorescent est visualisé à l’aide d’un
microscope à fluorescence.

 La technique peut être directe ou indirecte

279
 L’anticorps spécifique de l’antigène recherché qui est
marqué, puis déposé sur la préparation de l’échantillon à
examiner.

 Une émission de fluorescence après lavage signe la présence

de l’antigène.

280
Immunofluorescence directe

281
 L’anticorps spécifique de l’antigène recherché joue le rôle
d’anticorps dans le premier temps, et le rôle d’antigène
dans le deuxième temps.

 Le fluorochrome est porté par l’anti-anticorps.

282
Immunofluorescence indirecte

283
284
 5. Les Tests physico-chimiques

 Détecter la présence des bactéries dans l’aliment en mesurant

les changements générés par la croissance ou le métabolisme
bactérien.

 Ces tests nécessitent une culture bactérienne pure.

285
 L’impédance

 et la bioluminescence

286
 Définition: l’impédance est une résistance au flux
d’un courant alternatif

 au cours de la croissance , les bactéries

transforment certaines molécules électriquement
neutres ( ex: glucose) du milieu en molécules
chargées ionisées (acides organiques):

 conductivité et une de l’impédance

 bonne indication de l’activité bactérienne

 Bonne sensibilité :107 UFC/ml mais fonction des

espèces bactériennes 287
 Le Bactometer de bioMérieux Vitek.
Appareil disponible actuellement présente une bonne performances
(détection instantanée de 10 7 cellules/ml) et une bonne adaptation aux besoins
du contrôle des produits alimentaires :

- possibilité d’utiliser des échantillons de taille variable ;

- possibilité de traiter de nombreux échantillons simultanément;
- large gamme de température ;
- facilité d’utilisation ;
- possibilité de travail en milieu trouble.

288
 L’échantillon à analyser est introduit dans une
cellule contenant un milieu de culture approprié
dans lequel plongent deux électrodes ;

 Le passage périodique d’un courant alternatif

permet de mesurer l’impédance et d’enregistrer
ses variations, par rapport à une cellule témoin
remplie de milieu stérile ;

 La diminution d’impédance dans la cellule de

mesure y révèle la présence et la croissance des
micro-organismes

 Le temps nécessaire pour obtenir un signal

perceptible est en relation avec le nombre de
micro-organismes présents.

289
 L’ATP (adénosine triphosphate) un composé présent
dans toutes les cellules vivantes, et en particulier
dans toutes les cellules bactériennes.

 Le dosage de l’ATP est donc un indicateur de la

présence d’organismes vivants dans l’aliment.

 L’ATP-métrie est une technique basée sur le

principe de la bioluminescence, qui permet de
mesurer la quantité d'ATP présente dans un
échantillon.

290
 La bioluminescence est la production et l'émission
de lumière par un organisme vivant résultant d'une réaction
chimique au cours de laquelle l'énergie chimique est
convertie en énergie lumineuse.

 La luciférine a été découverte chez plus de 300 espèces

capables de bioluminescence.

291
luciole

292
Omphalotus nidiformis. 293
Planctons bioluminescent
294
 Le dosage de l’ATP par la réaction bioluminescente du système
ATP-luciférine-luciférase est très employé en microbiologie
alimentaire

 Les luciférines sont des molécules dont

l’oxydation, sous le contrôle d'une enzyme,
la luciférase, aboutit à la formation
d'oxyluciférine et à l'émission de photons.

 Luciférine + luciférase + O2 +ATP lumière visible

 L'ATP intervient dans l'étape d'activation du

complexe luciférine-luciférase, dont l'oxydation
est à l'origine d'une émission lumineuse visible.
295
ATP

296
 l'intensité lumineuse I max varie proportionnellement à la
quantité d'ATP présente dans le milieu.

 Le dosage de l'ATP repose donc sur la mesure de l'intensité

de l'émission lumineuse qui se produit dans un milieu mis
en présence de luciférine et de luciférase.

297
 La luminométrie (technique de mesure de la lumière émise
par une réaction) possède plusieurs avantages:
- une sensibilité extraordinaire ;
- des instruments de mesure et des réactifs très peu chers ;
- un protocole expérimental très simple ;
- un bruit de fond très réduit ou nul.

298
 Le luminomètres: instrument qui mesure l’intensité lumineuse

Ex: Le procédé est

utilisable pour
évaluer la
contamination
globale de l’eau

299
5. Identification des germes et des
toxines dans les aliments par des
techniques de Biologies
moléculaires.

300
 La Polymerase Chain Reaction (PCR) est une technique qui a été mise au
point en 1983 par Kary MULLIS (Saiki et coll., 1985) (récompensé en
1993 par le prix Nobel de Chimie) et qui consiste à amplifier de manière
exponentielle et sélective une courte séquence d’ADN par l’action d’une
enzymze l’ADN polymérase.

301
 Les applications commerciales de la PCR sont en effet immenses :
- séquençage des génomes,
-détection des maladies génétiques,
- étude de l'ADN fossile,
- police scientifique,
- détection des O.G.M,
- détection des germes pathogènes dans les aliments, - - détection des
toxines dans les aliments.....
- Détection du virus COVID19 chez les patients…..

302
- De l’ADN (matrice 10-2 pg ),
- Des nucléotides dNTP (déoxyribonucléotide triphosphate) (dATP, dCTP,
dGTP et dTTP).
- Les amorces (primer) « sens » et « antisens » qui sont des
oligonucléotides de synthèse, généralement de 20 à 25 nucléotides,
complémentaires à l’ADN cible à amplifier et qui délimiteront l’amplicon.
- L’ADN polymérase, enzyme thermostable.
- Le tampon spécifique à cette enzyme contenant notamment des ions
magnésium.
- Mg2+ nécessaires à l’activité de l’enzyme.

303
La réaction se déroule en trois étapes :
- La dénaturation : étape au cours de laquelle les brins d’ADN (matrice) sont dénaturés, par
chauffage à 94°C généralement pendant environ 1 minute.

- L’hybridation : étape au cours de laquelle les deux amorces se collent aux brins simples
d’ADN. La température à laquelle se déroule cette étape dépend de la taille et de la
composition des amorces et doit être optimisée pour tout couple d’amorces afin d’avoir une
efficacité et une spécificité maximales (plus la température est élevée, plus les amorces se
lieront spécifiquement au brin d’ADN cible jusqu’à une température limite où elles ne
s’hybrideront plus).

- L’élongation (l’extension) : étape au cours de laquelle l’ADN polymérase synthétise le brin

d’ADN complémentaire à partir de l’amorce. Elle ajoute les nucléotides complémentaires au
brin d’ADN à partir de l’extrémité 3’ de l’amorce. La température à laquelle se fait cette
étape est en général proche de 70-72°C. La durée est proportionnelle à la taille du fragment à
amplifier et dépend de la polymérase utilisée.

La PCR consiste à répéter plusieurs fois ces trois étapes au cours de chaque cycle thermique (en
générale 30 cycles).
304
305
306
 Pour réaliser une réaction de PCR, il faut établir
le mélange réactionnel suivant :

1. l'ADN matrice,
2. les amorces oligonucléotidiques à partir desquelles la
polymérisation de l'ADN s'enclenche,
3. les désoxyribonucléotides qui sont incorporés dans l'ADN
(dATP, dCTP, dGTP et dTTP),
4. la TAQpolymérase,
5. une solution tampon appropriée au bon fonctionnement de la
TAQpolymérase.
307
 Le fragment d'ADN qui est amplifié
est celui qui est physiquement
délimité par les deux amorces

Comment choisir les amorces ?

Le choix des amorces, qui est évidemment crucial, est
entre les mains de l'expérimentateur.
Pour définir et faire synthétiser les amorces, il faut en
général :
- Connaître la séquence du fragment que l'on veut
amplifier.
- Il faut déterminer les enchaînements nucléotidiques à
partir desquels la polymérase pourra synthétiser de
novo les brins d'ADN.
308
Les amorces doivent donc être :

- complémentaires des brins d'ADN

existants ;
- "orientées" dans le "bon" sens de
façon à permettre la synthèse d'ADN de
5' en 3’.
- Les amorces utilisées pour la PCR ont
des longueurs habituellement
comprises entre 17 et 25 pb.
- Les amorces sont obtenues par
synthèse chimique et à la demande,
c'est-à-dire selon la séquence que 309

définit l'expérimentateur.
Température de fusion moléculaire d'un fragment d'ADN

– Tm d’un fragment d’ADN.

Le Tm (melting temperature ou température de fusion moléculaire)
d’un fragment d’ADN est la température à laquelle 50 % des
molécules sont sous forme simple brin.
310
Comment calculer la température d'hybridation des amorces ?

- Si la température d'hybridation est trop élevée, les amorces ne

s'hybrideront pas avec la matrice et la synthèse d'ADN ne pourra
pas s'enclencher.

- Si la température d'hybridation est trop basse, les amorces

risquent de s'hybrider non seulement à la position choisie mais
aussi de manière non spécifique avec d'autres régions d'ADN de
séquence proche de celle qui a été sélectionnée.
- On risque alors une amplification de fragments d'ADN autres que
celui qui intéresse l'expérimentateur.

La détermination de la température d'hybridation des amorces avec

la matrice est donc cruciale.

311
Une formule, simplifiée à outrance, du calcul de la température
optimale d'hybridation d'une amorce est, en degrés Celsius :
Température d’hybridation : Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) +/- 5°C

Cette formule pas très exacte

où G, C, A et T sont respectivement les nombres de bases G, C, A et
T composant l'amorce.

Différents logiciels tels Amplify,

[Link] sont disponibles sur Internet
pour le calcul des Tm et la recherche
d'homologies de séquences inter-
amorces.
312
- Pour le choix de la température
d'hybridation il est souvent recommandé de
se placer à une température inférieure de 4
- 5°C au Tm du couple d'amorce (si ce Tm
est différent pour les 2 amorces, prendre le
Tm le plus bas comme point de référence).

313
 En théorie, après n cycles, on augmente le nombre
d'ADN interressant de 2n.

 En pratique, le nombre de brins est limité à cause de

la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la
viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN
polymérase.

 A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de

même taille correspondant à la distance en base qui
sépare les amorces.

314
 La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable
appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes
contenant le mélange réactionnel.
 Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et
pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR
est extrêmement rapide, elle ne dure que quelques heures (2 à 3 heures
pour une PCR de 30 cycles).

315
316
  Les produits de PCR sont visualisés par électrophorèse
sur gel d’agarose et marquage de l’ADN par le
bromure d’éthidium (BET) par exemple.

Un gel d'agarose Le gel est exposé

Cuve à à des
électrophorèse avant éclairage
sous ultraviolets rayonnements
ultraviolets

BET (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre Photo du gel. Puits 1. Échelle
de marqueur de taille moléculaire,
les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule Puits 2. vide, Puits 3. Un produit
d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV de PCR d'une taille légèrement
supérieure à 500 pb, Puits 4.
courts (environ 30 nm)) Fragment d’ADN d'environ 4,5 kb.

317