‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

‫وزارة التعليم العالي و البحث العلمي‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

‫جيجل‬- ‫جامعة محمد الصديق بن يحي‬

Université Mohammed Seddik Benyahia - de Jijel

Faculté des Sciences de la Nature ‫كلية علوم الطبيعة و الحياة‬

et de la Vie
‫ الميكروبيولوجيا التطبيقية‬:‫قسم‬
Département : Microbiologie
Appliquée et Sciences ‫و علوم التغذية‬
Alimentaires
Mémoire de fin d’études
En vue de l’obtention du diplôme :Master Académique en Biologie

Option : Microbiologie Appliquée

Thème
Viabilité et performances probiotiques de
Lactobacillus plantarum S 10 dans un système
simulé au tube digestif

Membres de Jury Présenté par :

Présidente : Dr. ROULA Sagia Moussaoui Melle : Manel Ferkhi

Examinatrice : Dr. OULED Heddar Houria Melle : Hadjer Cheurfi

Encadreur : Prof. IDOUI Tayeb.

Année Universitaire 2017 - 2018.

Numéro d’ordre (bibliothèque) : …………………….

 Remerciements

En préambule à ce mémoire nous remerciant ALLAH qui nous aide et

nous donne la patience et le courage durant cette période

Nous remercions très chaleureusement Monsieur le Professeur IDOUI

Tayeb ; Merci pour votre encadrement, votre disponibilité et votre
encadrement efficace. Merci pour votre compréhension, votre grande
gentillesse et pour la confiance que vous avez témoigné tout au long de
la période de réalisation de notre mémoire. Malgré vos importantes
obligations, vous avaient toujours été présent pour recadrer notre
travail dans la bonne direction et ceci été fondamental dans la bonne
réalisation de ce travail .Soyez assurer de notre profonde gratitude.

Nous remercions très chaleureusement Monsieur Khennouf Tarek pour

ses aides pour ses conseils.

Nous tenons particulièrement à remercier les membres du jury Dr

Ouled Heddar Houria et Dr Roula Sagia Moussaoui d’avoir accepté de
juger ce travail.

Mes sincères remerciements s’adressent plus spécialement à tous les

enseignants de département de MASA.

Merci
Sommaire
Sommaire

Introduction
..........................................................................................................................................................1

Partie I : Synthèse Bibliographique

I.1. Historique et définition des probiotiques …………………………………………………....3

[Link]ères de sélection des probiotiques……………………………………................................3

[Link] microorganismes probiotiques ……………………………………………………4

I.4. Mode d’action des probiotiques…………………………………………………....................5

I.5. L’espèce Lactobacillus plantarum comme probiotiques……………………………………..6

I.5.1. Généralités sur l’espèce ………………………………………………………...….6

I.5.2. Le potential probiotique de L. plantarum …………………………………………...7

I.5.2.1. Survie de [Link] dans le tube digestif………….................................7

I.6. L’encapsulation des bactéries probiotique ………………………………............................. 7

I.6.1. Techniques d’encapsulation des probiotiques………………………………………….8

[Link] d’extrusion ……………………………………………………..10

[Link] et antioxydants naturels…………………………………………………………..11

II.1.1. Les polyphénols des fraises et concombre comme

Antioxydants………………………………………………………………………………….....11

II. 2.Mécanisme d’action des polyphénols…...............................................................................12

[Link] physiologiques des polyphénols……………………………………………….…….12

[Link] composés phénoliques et bactéries ……………………………………………….12

II.5. Probiotiques et activité antioxydante ……………………………………………………...13

II.6. Les aliments transmetteurs et protecteurs de probiotiques ………………………………..15

Partie II : Etude expérimentale

II.1. Matériel……………………………………………………………………………………17

II.1.1. Matériel biologique…………………………………………………………………… ..17

II.1.2. Les milieux de culture…………………………………………………..……………….17

II.1.3. Produits chimiques et réactifs …………………………………………………………..17

Sommaire

II.2. Méthodes …………………………………………………………………………………..18

II.2.1. Revivification de la souche…………………………………….…………………...18

II.2.2. Encapsulation de L. plantarum S10 dans un gel d’alginate

de sodium…………………………………………………………………………......................18

II.2.3. Préparation des extraits et dosages …………………………………………...........19

II.2.3.1. Extraction par macération dans le méthanol aqueux

à partir de la pulpe du concombre……………………………………….………………………19

II.2.3.2. Extraction des composés phénoliques à partir des pulpes

de fraises………………………………………………………………………….......................20

[Link]………………………………….…..................................................20

II.2.4. Détermination de l'activité antioxydante de L. plantarum

S10 in vitro …………………………………………………………………………………….21

II.2.5. Comportement des billes dans une solution de KH2PO4 …………………………22

II.2.6. Activité antioxydante des différents extraits……………………………………........23

II.2.7. Fabrication des jus de concombre et de fraises et fermentation……….......................23

II.2.7.1. Préparation des jus ………………………………………….....................23

[Link] des jus et évaluation de quelques paramètres ………...........23

II.2.8. Mesure des activités antioxydantes de la bactérie après 24heures de
fermentation………………………………………………………………………………….....24

II.2.9. La digestion bucco-gastro-intestinale in vitro …………………………….…………...24

[Link]éparation des solutions mères des liquides simulés de la

digestion…………………………………………………………………………………………25
[Link] expérimental de la digestion bucco -gastro-intestinale

in vitro……………………………………………………………………………………………………….25

a. la culture libre et encapsulée …………………………………....................26

b. Test de digestion in-vitro des extraits……………………………………....28

c. Test de digestion in-vitro de la combinaison bactérie

libre/extraits…..............................................................................................28

II.2.10. Test d’adhésion in- vitro aux cellules épithéliales……………………………...............28

Sommaire

Partie III : Résultats et discussion

[Link] de L. plantarum S10 dans un gel d’alginate de sodium à 1% ………….30

[Link] des flavonoïdes ………………………………………………………………...30

[Link] des polyphénols ……………………………………………………….…….….31

III.4.Détermination in vitro de l'activité antioxydante de L. plantarum S10 ………………...32

III.4.1.Résistance au peroxyde d’hydrogène ……………………………….........32

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles …………………………..33

III.4.3. Piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) .......34

[Link] des billes dans une solution de KH2PO4 ………………………………..34

[Link]é antioxydante des différents extraits……………………………………………..35

[Link] de quelques paramètres de fermentation………………………………............36

[Link] du pH et d’acidité………………………………………………..........36

[Link] du nombre de cellules …………………………………………..........38

[Link]és antioxydantes de la bactérie après 24heures de fermentation…………..............40

III.8.1.Résistance au peroxyde d'hydrogène………………………………………............40

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles …………………………………...41

[Link]égeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)……………42

[Link] digestion bucco-gastro-intestinale in vitro …………………………………………....43

[Link] et viabilité de la culture libre et encapsulé après les phases

de la digestion ………………………………………………………………………………….43

[Link] et viabilité de la culture libre et encapsulé à T= 0h dans les jus ………… .45

III.9.2.1. Survie dans le jus de fraise……………………………………………..45

[Link] dans le jus de concombre………………………………………..46

[Link] et viabilité de la culture après 24 h de fermentation ……………………….47

[Link] de la culture libre et encapsulé après 24heures de

fermentation dans le jus de fraise ………………………………………………………….…..47

[Link] de la culture libre et encapsulée après 24 h de fermentation

Sommaire

du jus de concombre …………………………………………………………………………..48

[Link] de l’activité antioxydante de la bactérie après digestion

bucco-gastro -intestinale………………………………………………………………………..49

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles…………………………........49

[Link]égeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)……...50

[Link] in-vitro des extraits……………………………………………………….51

[Link] in-vitro en combinant bactéries/extraits ………………………………...52

[Link] des polyphénols et flavonoïdes après les phases de digestion……………….54

[Link] d’adhésion in- vitro aux cellules épithéliales du poulet………………………………55

Conclusion.....................................................................................................................................58
Annexe ……………………………………………………………………………………………
 Liste des figures

Figure page

Figure 1 : Mécanismes d’action des probiotiques et leurs fréquences……………............6

Figure 2 : Techniques d’extrusion et d’émulsification …………………………………..10
Figure 3 : Modulation de l’activité antioxydante par les probiotiques…………………...14
Figure 4 : Teneurs en flavonoïdes dans les jus et leurs extraits…………………..............31
Figure 5 : Teneurs en polyphénols totaux………………………………………………...32
Figure 6 : Effet du peroxyde d'hydrogène sur la viabilité de [Link] S10….............33
Figure 7 : Comportement des billes d’alginate de sodium dans des solutions
de KH2PO4………………………………………………………………………………….35
Figure 8 : Pourcentage d’inhibition du radical DPPH◦……………………………………36
Figure 9 : Evolution du pH et d’acidité au cours de la fermentation
de jus de fraise par culture libre et encapsulée…………………………………………...37
Figure 10 : Evolution du pH et d’acidité au cours de la fermentation
de jus de concombre par culture libre et encapsulée………………………………..........38
Figure 11 : Evolution du nombre des cellules au cours de la fermentation
de jus de concombre……………………………………………………………………….39
Figure 12 : Evolution du nombre des cellules au cours de la fermentation
de jus de fraise………………………………………………………………........................40
Figure 13 : Effet du peroxyde d'hydrogène sur la viabilité………………………………...41
de [Link] S10 après 24h de fermentation.
Figure 14 : Pourcentage de piégeage de radical hydroxyle après 24h de
fermentation des jus par [Link]……………………………………………………….41
Figure 15 : Pourcentage de piégeage de radicaux libres DPPH après 24h de
Fermentation des jus par [Link] S10…………………………………………………..42
Figure 16 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de
[Link] S10 libres et encapsulées (UFC/ml)……………………………………...........43
Figure 17 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de
[Link] S10 libres et encapsulées (cellules/ml)………………………………………...44
Figure 18 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10
libre et encapsulé ensemencé dans le jus de fraise (cellules/ml)……………………………..45
 Liste des figures

Figure 19 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10

libre et encapsulé ensemencé dans le jus de fraise (UFC/ml)…………………………………46
Figure 20 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10
libre et encapsulé ensemencé dans le jus de concombre (Cellules/ml)……………………….47
Figure 21 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10
libre et encapsulé ensemencé dans le jus de concombre (UFC/ml)……………………………47
Figure 22 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10
libre et encapsulé après 24heures de fermentation du jus de fraise………………………….....48
Figure 23 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10
libre et encapsulé après 24heures de fermentation du jus de concombre……………………….49
Figure 24 : Pourcentage de piégeage de radical hydroxyle après digestion in vitro……………50
Figure 25 : Pourcentage de piégeage de radicaux libres DPPH après digestion in vitro……….50
Figure 26 : Effet de la digestion in vitro sur la bioaccessibilité des polyphénols………………51
Figure 27 : Effet de la digestion in vitro sur la bioaccessibilité des flavonoïdes……………….52
Figure 28 : Effet de l’extrait sur la viabilité et la survie des cellules libres de
[Link] S10 au cours de la digestion in vitro (cellules /ml)……………………………….53
Figure 29 : Effet de l’extrait sur la viabilité et la survie des cellules libres de
[Link] S10 au cours de la digestion in vitro (UFC/ml)…………………………………...53
Figure 30 : Effet de la digestion in vitro sur la teneur en flavonoïdes…………………………...54
Figure 31 : Effet de la digestion in vitro sur la teneur en polyphénols…………………………..55
Figure 32 : Nombre de cellules adhérées aux cellules épithéliales………………………………56
 Liste des Tableaux

Tableau page

Tableau 1 : Critères de sélection des souches probiotiques……………………….4

Tableau 2 : Les espèces de bactéries probiotiques………………………………..5

Tableau 3 : Biomatériaux et biopolymères utilisés dans l’encapsulation………...9

 Liste des Photos

Photo page

Photo 1 : Photographie des billes d’alginate de sodium à 1%...................................30

Photo 2 : Photographie des cellules épithéliales témoins…………………………...56

Photo 3 : Photomicrographie d’adhésion de [Link] S10 (culture témoin)……57

Photo 4 : Photomicrographie d’adhésion de [Link] S10 aux cellules

épithéliales après 2 h d’incubation dans la phase intestinal………………………..57
 Liste des abréviations

BL : Bactéries lactiques
L : Lactobacillus
GIT : transit gastro-intestinale
ERO : espèces réactives d’oxygènes
GSH : Glutathione
SOD : superoxyde dismutase
CAT : Catalase
IL : Interleukine
NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide
NADHP : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
Unités de mesures :
pH : potentiel d’hydrogène
◦D : degré dornic
rpm: Rotation par minute.
U : unité

M, mM : Molaire, millimolaire

N : normalité

Autres abréviations :

UFC : Unité Formant Colonie

MRS: Man Rogosa et Sharpe

PBS : tampon phosphate saline

LS : liquide salivaire

LG : liquide gastrique

LI : liquide intestinale
Introduction
Introduction

Le tractus gastro-intestinal est colonisé par de nombreux microorganismes qui vont constituer
le microbiote digestif. Cet écosystème complexe et diversifié, propre à chaque individu,
contribue au bon fonctionnement intestinal grâce aux multiples activités qu’il exerce.
L’équilibre du microbiote est fragile et sa rupture intervient dans la physiopathologie de
diverses affections intestinales, d’où l’idée de moduler de façon positive un microbiote
déséquilibré par l’administration de probiotiques (Bourlioux, 2014).

Le terme « probiotique » signifie « pour la vie » et il est défini comme des microorganismes
vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantités suffisantes, peuvent exercer de nombreux
bénéfices pour la santé de l’hôte. L'intérêt et le champ des recherches dans ce domaine ont
considérablement progressé ces dernières années (Sanchez et al . , 2017).

La survie dans l’environnement gastro-intestinal est une condition essentielle pour nommer
les bactéries lactiques probiotiques (Ghadimi et al ., 2008 ; Lopez et al., 2008). L’étude de la
survie des probiotiques dans le tractus gastro-intestinal est importante pour une meilleure
connaissance du devenir de ces bactéries ingérées avec l'aliment et une meilleure
compréhension de l’action des probiotiques chez l’Homme et l’animal. Il est probable que
pour exercer un effet probiotique significatif, les bactéries doivent arriver vivantes et en
nombre suffisant dans l’intestin (Drouault et Corthier, 2001).

Le règne végétal représente une source importante d’une grande variété de molécules
bioactives en particulier les polyphénols qui sont doués de multiples vertus thérapeutiques.
Ils jouent un rôle très important, principalement dans la lutte contre les cancers et les
maladies cardiovasculaires (Scalbert et al., 2005). De nombreuses publications ont montré
que la prise d’antioxydants tels que les polyphénols peut diminuer l’impact du stress oxydant
sur le corps humain (Scalbert et al., 2005). D’autres études proposent l’utilisation de
bactéries probiotiques pour diminuer le stress oxydant (Afify et al., 2012; Li et al., 2012 ;
Asemi et al., 2013).

Notre travail s’articule autour de l’étude de la survie de [Link] S10 (culture libre
et encapsulée) aux conditions de la digestion ainsi que l’évaluation de son activité
antioxydante de plus, on s’intéresse à tester l’activité antioxydante des extraits phénoliques de

1
Introduction

la fraise et du concombre et leur effets sur la viabilité et la survie de la bactérie lors de la

digestion buco-gastro-intestinale.
La première partie de ce manuscrit est consacrée à une synthèse bibliographique dans
laquelle, nous traitons toute donnée utiles sur les probiotiques, leur survie, leur activité
antioxydante, avec en second lieu un aperçu sur les jus comme matrice alimentaire véhiculant
les probiotiques.
La seconde partie du document traite les principes généraux des méthodes utilisés à savoir :
Les différents tests de survie.

Et enfin, la troisième partie du manuscrit présentera les résultats et discussion des principales
parties de cette étude.

2
 Etude
Bibliographique
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

I.1. Historique et définition des probiotiques

L’appellation « probiotique » est d’usage relativement récent, mais l’idée d’ingérer des micro-
organismes exogènes afin de moduler favorablement le microbiote endogène, qui constitue la base
du concept des probiotiques, n’est pas nouvelle. Le biologiste Russe, titulaire du prix Nobel de
physiologie ou médecine Ilya Ilyrich Mechnikov (ou Élie Metchnikoff) a proposé en 1907, que
l’ingestion de bactéries lactiques peut réduire les désordres intestinaux et améliorer l’hygiène
digestive, et donc augmenter l’espérance de vie et pour lui, la consommation de Lactobacillus
influençait positivement la microflore intestinale, diminuait la « putréfaction » et les activités
toxiques microbiennes. (Hill et al., 2014).

Le terme probiotique provient de deux mots Grecs, pro et bios, qui signifient littéralement « en
faveur de la vie ». Ce terme a été introduit en 1953 par Werner Kollath pour décrire les
compléments alimentaires organiques et inorganiques appliqués à rétablir la santé de patients
souffrant de malnutrition et différencier ces « probiotiques » des antibiotiques. Depuis cette époque,
le terme a connu une évolution de définition. Ainsi, Fuller en 1989, a défini les probiotiques
comme, complément alimentaire microbien vivant qui apporte un avantage à l’hôte en améliorant
son équilibre intestinal (Behnsen et al ., 2013).
Cette définition a été largement utilisée par l’ensemble du monde scientifique, cependant depuis
2001, la F.A.O (Food and Agriculture Organisation) et l’O.M.S (Organisation Mondiale de la
Santé) officialisent la définition du terme « probiotique » : des micro-organismes vivants qui,
lorsqu’ils sont administrés en quantités adéquates, produisent un bénéfice pour la santé de l’hôte »
(FAO/WHO, 2001 ; Hill et al., 2014).

[Link]ères de sélection des probiotiques

Pour être considéré comme probiotique, un micro-organisme doit posséder différentes

caractéristiques. Il doit être une souche non pathogène, non toxique et non allergisante (Hill et al.,
2014). Pour être à usage humain, les probiotiques doivent présenter une innocuité totale pour l’hôte
et bénéficier du statut GRAS (Generally Recognized As Safe), défini par la F.D.A (Federal Drug
Administration) aux États-Unis et/ou du statut de présomption d’innocuité reconnue ou QPS
(Qualified Presumption of Safety) défini par l’E.F.S.A (European Food Standard Agency) en
Europe (Klaenhammer et Kulen, 1999; Dunne et al., 2001).

Un probiotique doit être vivant et actif dans l’environnement digestif. Ainsi, il doit être résistant à
l’acidité gastrique et aux sels biliaires afin de pouvoir exercer ses effets bénéfiques dans le tractus
gastro-intestinal (Dunne et al., 2001). Il est difficile, voire même impossible, de sélectionner une
3
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

souche probiotique idéale remplissant la totalité des critères de sélection (Tufarelli et Laudadio ,
2016). Le tableau1, regroupe les critères de sélection des souches probiotiques.

Tableau 1 : Critères de sélection des souches probiotiques (Tripathi et Giri, 2014).

Critères de -Identification taxonomique exacte

sécurité -Non toxique, non pathogène, GRAS et/ou QPS
-Pas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques

-Adapté à une production de masse et un stockage

Viabilité des populations élevée dans le produit commercialisé (10 6 à 108
Critères UFC/g)
technologiques -Stabilité des caractéristiques désirées pendant la préparation et le stockage
-Qualités organoleptiques souhaitables (ou pas de qualités indésirables)
lorsqu’ils sont inclus dans des aliments ou des procédés de fermentation
-Génétiquement stable
-Survie et activité métabolique au niveau du site cible in vivo
-Tolérance à l’acidité, aux sels biliaires et aux enzymes digestives
Compétitivité -Capable de rivaliser avec le microbiote résident et les métabolites fermentaires
-Adhésion et colonisation potentielle
-Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé (efficacité documentée et
prouvée dans des études in vitro et in vivo contrôlées chez l’Homme)
-Action antagoniste vis-à-vis de bactéries pathogènes
Performances et -Production de substances anti-microbiennes et/ou bioactives (enzymes,
fonctionnalités peptides, bactériocines, peroxyde d’hydrogène, acides organiques ou autres
composés inhibiteurs)
-Propriétés immunostimulantes
-Anti-mutagène et anti-cancérigène

[Link] microorganismes probiotiques

Les probiotiques sont des bactéries ou des levures ingérées vivantes, présentes ou non dans le
microbiote intestinal résident. Les micro-organismes probiotiques (Tableau 2), sont principalement
des bactéries lactiques appartenant aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium, avec d’autres
espèces non pathogènes E. coli Nissle 1917, certaines souches de Bacillus subtilis et les levures du
genre Saccharomyces sont également considérés comme des probiotiques (Caselli et al., 2013). Les

4
 I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

probiotiques représentent aujourd’hui un poids économique majeur (39 milliards d’euros par an
dans le monde) en constante augmentation, cette dynamique étant soutenue par le lien existant entre
l’alimentation et les bénéfices santé (Caselli et al., 2013).

Tableau 2. Les espèces de bactéries probiotiques

(Borriello, 2002; Champagne, 2005 ; Gbassi, 2010; Kenny, 2010).

Principales espèces de bactéries lactiques Espèces de Espèces de

Lactobacilles Bifidobactéries Autres bactéries bactéries non
levures
(Bifidobacterium) lactiques lactiques
(Lactobacillus)

L. acidophilus B. adolescentis B. magnum Enterococcus E. coli (‘Nissle Saccharomyces

L. amylovirus B. angulatum B. merycicum faecalis 1917’) boulardii
[Link] B. animalis B. minimum E. faecium Propionibacterium Saccharomyces
L. brevis B. asteroides B. pseudolongum ssp Lactococcus lactis freudenreichi cerevisiae
L. casei B. boum B. psychraerophilum Leuconostoc
L. cellobius B. bifidum B. pullorum mesenteroides
L. crispatus B. breve B. ruminantium Pediococcus
L. curvatus B. catenulatum B. saeculare acidilactici
L. delbrueckii B. choerinum B. suis Sporolactobacillu
L. farciminis B. coryneforme B. thermacidophilum s
L. fermentum B. cuniculi [Link] inulinus
L. gasseri B. denticolens B. pseudocatenulatum Streptococcus
L. gallinarum B. dentium B. scardovii diacetylactis
L. helveticus B. gallicum B. subtilis Streptococcus
L. johnsonii B. gallinarium intermedius
L. paracasei B. indicum Streptococcus
L. plantarum B. infantis thermophilus
L. reuteri B. inopinatum
L. rhamnosus B. lactis
B. lacterosporus
B. longum

I.4. Mode d’action des probiotiques

Les probiotiques jouent un rôle majeur dans le maintien de l'équilibre et de la stabilité du

microbiote intestinal, principalement, en empêchant l'infection, la croissance de bactéries
potentiellement nocives et en améliorant la réponse immunitaire. D’une manière générale, les
probiotiques sont capables d’exercer leurs effets bénéfiques selon trois mécanismes principaux
comprenant (Bermudez-Brito et al., 2012).
(i) Effet barrière ;
(ii) Amélioration de la fonction barrière de la muqueuse intestinale ;
(iii) Modulation du système immunitaire.

5
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

L’effet barrière peut être lié à la modulation du microbiote de l’hôte (Figure 1), la résistance à la
colonisation des bactéries pathogènes peut être également traduite par la synthèse de molécules
antimicrobiennes telles que les bactériocines, le peroxyde d’hydrogène et l’acide lactique, la
production de métabolites tels que les acides gras à courte chaine qui induisent la diminution du pH
local de manière à créer un environnement défavorable aux pathogènes, ou les biosurfactants à
activité antimicrobienne ( Butel, 2014a).

• colonisation
Effets généraux chez • production d'acides et des acides gras à courte chaine
• régulation du transite intestinale
les probiotiques • modulation du microbiote intestinale
• exclusion compétitive des pathogénes

• synthèse des vitamines

Effets fréquents pour • Amélioration des fonctions barières
intestinales
les éspéces • Métabolisation des sels biliaires
• Antagonisme direct

Effets rares ou spécifiques • Effets neurologiques

• Production des composés bioactifs(
pour la souche bactériocines et antioxydantes)
• Immunomodulation

Figure 1 : Mécanismes d’action des probiotiques et leurs fréquences (Hill et al., 2014).

L’amélioration de la fonction barrière de la muqueuse intestinale est liée au renforcement des

jonctions serrées, à l’augmentation du renouvellement entérocytaire, à la stimulation de la synthèse
de la mucine, à la sécrétion de peptides antimicrobiens comme les β-défensines, lysozyme et à la
synthèse des vitamines (Alexandre et al., 2014). La modulation du système immunitaire est très
importante pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses, mais aussi pour le
traitement de l'inflammation (chronique) du tractus digestif (Butel, 2014b).

I.5. L’espèce Lactobacillus plantarum comme probiotique

I.5.1. Généralité sur l’espèce :

Lactobacillus plantarum (L. plantarum) est une bactérie lactique, Gram positif en forme de
bâtonnet. On la trouve communément dans diverse niches écologiques comme les produits laitiers,
les légumes, les vins, le tractus gastro-intestinale, les cavités vaginales et urovaginales et aussi dans
la cavité buccale de l’Homme, dans les eaux usées et dans les levains naturels (Siezen et al., 2010 ).

6
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

Elle peut se développer à des températures comprises entre 15 et 45 °C et à des niveaux de pH aussi
bas que 3,2. L. plantarum est un hétérofermentaire facultatif qui fermente les sucres pour produire
de l'acide lactique, de l'éthanol ou de l'acide acétique, et du dioxyde de carbone dans certaines
conditions. En fonction de la source de carbone, ces bactéries peuvent passer d'un mode
métabolique hétérofermentaire vers l’homofermentaire (Khemariya et al., 2016).

Cette bactérie est tolérante aux acides et aux sels biliaires, ce qui lui permet de survivre au passage
dans le tractus gastro-intestinal humain (Vesa et al., 2000). Une autre fonction qui doit être
soulignée est la capacité de L. plantarum à produire diverses bactériocines, qui sont des peptides
antimicrobiens avec des applications possibles comme conservateurs alimentaires (Taale et al.,
2016).
L. plantarum a un génome qui est constitué d'un chromosome circulaire de 3,3 Mb, ce chromosome
est composé de 3052 gènes codant pour des protéines et plus de 2500 protéines prédites avec
fonction biologique assignée (Wassenaar et al., 2014). La séquence nucléique des protéines de L.
plantarum sont très similaires à celles des autres bactéries Gram positives, car elles ont une faible
teneur en GC, et sont organisées de manière colinéaire (Jose et al., 2015).

I.5.2. Le potential probiotique de L. plantarum

Les souches de L. plantarum ont montré de bonnes aptitudes probiotiques in-vitro et in-vivo, elles
sont considérées comme souches probiotiques. Elles sécrètent des composés antimicrobiens, tels
que la bactériocine, qui inhibent la croissance de colonies pathogènes Gram positives et Gram
négatives (Chang et al., 2016).

L. plantarum a également une bonne adhérence à la muqueuse épithéliale de l'intestin humain, ce

qui lui permettra d'entrer en compétition avec les bactéries pathogènes Gram positives et Gram
négatives pour l’occupation des sites et pour les nutriments (Santarmaki et al., 2017). En plus de
ce qui est cité, elle a une bonne tolérance aux milieux à bas pH et aux fluctuations de températures
(Ait Seddik et al., 2017).

I.5.2.1. Survie de [Link] dans le tube digestif

Après ingestion par voie orale, les bactéries rencontrent un certain nombre de systèmes de défense
humain associés aux différentes sécrétions à travers le tube digestif. Le premier système de défense
est la présence du lysozyme et de l’ α- amylase dans la cavité buccale qui présentent une activité
antimicrobienne, au delà, les bactéries subissent l’effet de la présence d'un milieu à pH faible (entre
2,0 et 3,0) et des enzymes protéolytiques telles que la pepsine. Dans l'intestin grêle, les probiotiques

7
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

auront à s’adapter et résister à l’augmentation du pH vers 8,0 et la sécrétion de sels biliaires et des
sucs pancréatiques (de Vries et al., 2006).

Concernant la survie au niveau buccale, un nombre très faible d’études a été réalisé sur la tolérance
des souches de [Link] au lysozyme. Zago et al. (2011) ont travaillé sur 27 souches de
[Link] et ont trouvé qu’uniquement 15 souches présentaient une meilleure tolérance au
lysozyme ((≥ 68% du taux de survie). Cependant Golowczyc et al. (2010) ont trouvé un taux de
survie de L. plantarum CIDCA83114 proche de 100%.

Au niveau stomacal, plusieurs souches de [Link] ont montré une haute tolérance à l’acide
hydrochlorique en présence et en absence de la pepsine (0.03%), en contre partie, un grand nombre
de souches a montré une diminution de leurs taux de survie dans le milieu à pH2.0, en présence ou
en absence de la pepsine. Zago et al. (2011) n'ont trouvé aucune diminution significative de la
population de 27 souches testées lorsque le pH a diminué de 5,0 à 2,5 au cours des 60 minutes
d’incubation. En général, la plupart des études ont rapporté un taux de mortalité élevé de L.
plantarum en présence du pepsine, probablement en raison de l'hydrolyse du peptidoglycane
présent dans leur paroi cellulaire (Zhu et al., 2006).

Au niveau intestinal, le taux de survie de différentes souches de L. plantarum est proche de 100% à
des concentrations allant jusqu'à 0,5% de sels biliaires pendant 4 h (Melgar-Lalanne et al., 2012).
Certains souches ont survécu à des conditions de stress biliaires (1,0% de sel de bile, pH 8,0)
pendant 24 h (Wang et al., 2010 ; Jamaly et al., 2011; Zago et al., 2011). Dans d’autres études, la
présence de la pancréatine et 1% de sels biliaires, n'a pas eu d'effet significatif sur le taux de survie
de souches de L. plantarum (Michida et al., 2006; Botes et al., 2008; Jiménez- Pranteda et al.,
2011).

I.6. L’encapsulation des bactéries probiotique

La micro-encapsulation se définit comme une technique qui vise à piéger une substance bioactive
dans une matrice afin de la protéger et/ou contrôler sa libération (Eratte et al., 2018) . Cette
technique a été constamment développée, améliorée, modifiée et adaptée à une multitude de
domaines (cosmétique, pharmaceutiques, agroalimentaire, textile, peinture, électronique,
imprimerie…) (De Prisco et al ., 2016).
Elle a été introduite dans le domaine de la biotechnologie (la production des enzymes, biomasses,
etc.) pour rendre les processus de production plus efficaces lorsque la matrice autour des cellules
ce qui permet une séparation rapide et efficace des cellules productrices et les métabolites (Martín

8
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

et al., 2015). La micro encapsulation offre ainsi des solutions nouvelles aux problèmes de stabilité
de composés actifs fragiles tels que les vitamines, les polyphénols, les peptides d’intérêt
thérapeutique et les microorganismes (Mueller et al., 2018).

I.6.1. Techniques d’encapsulation des probiotiques

Diverses techniques de micro-encapsulation des cellules viables ont été employées, utilisant des
polymères naturels et synthétiques (tableau 3). Cependant, les matériaux et les conditions de
formulation utilisés devraient être doux et non toxiques. Ceci permettra d'assurer la viabilité des
probiotiques, lorsque ces derniers sont destinés pour l'administration orale (Shori, 2017).

Tableau3 : Biomatériaux et biopolymères utilisés dans l’encapsulation.

Origine Végétale Marine Animale et Références

Nature Microbienne
Polysaccharides Amidon Carraghénane Dextran (Loveleen et al., 2015)
Cellulose Alginate Chitosan (Qurat et al., 2013)
Pectine Agarose Gomme gellane (Iravani et al ., 2014)
Gomme arabique Gomme
Gomme caroube xanthane
Protéines Gluten Caséines
Protéines de (Renard et Reddy 2007)
lactosérum
Collagène
Gélatine
Albumines
Lipides Huile de palme
hydrogénée
Huile de ricin
hydrogénée (Renard et Reddy 2007)
Lécithine (soja)
Cire

Plusieurs types de biomatériaux sont utilisés pour l’encapsulation des probiotiques et chacun a des
avantages et des inconvénients. L’alginate est reconnue par sa disponibilité; non toxicité et son
faible cout mais elle présente certains inconvénients, sensible à l’environnement acide à l’inverse
du Chitosan et l’Amidon qui sont résistants aux conditions du tractus gastro-intestinal et présentent
une capacité de livraison des probiotiques dans le côlon (Shori, 2017).

Parmi les véhicules naturels utilisés pour la livraison des cellules probiotiques, les protéines du lait
ont une excellence propriété de gélification. Pour le Carraghénane, les billes obtenues à l’aide de
ce polymère sont incapables de résister au stress et sont fragiles, les biomatériaux lipidiques ont été
rarement utilisés pour l’encapsulation des probiotiques (Renard et Reddy, 2007).
9
I. Synthèse bibliographique Chapitre I. Les probiotiques

Les techniques d'encapsulation appliquées aux probiotiques peuvent être classées en 2 groupes
(figure02), en fonction du procédé utilisé pour former les billes, l’Extrusion (procédé de
gouttelettes) et l’émulsion ou système à deux phases. Les deux techniques d'extrusion et de
l'émulsion augmentent la survie des bactéries probiotiques jusqu'à 80-95% (Maleki et al., 2015).

Figure 2 : Techniques d’extrusion et d’émulsification (Maleki et al., 2015).

[Link] d’extrusion : Dans l’extrusion, la solution colloïdale (à base de biopolymére) est

mélangée à la suspension microbienne. Le mélange obtenu est introduit dans un dispositif
d’extrusion, en générale une seringue. Une pression exercée sur le piston de la seringue laisse
tomber goutte à goutte le contenu de la seringue dans une solution gélifiante, sous une faible
agitation. La taille et la forme des gouttes dépendent du diamètre de l’aiguille, et de la distance
séparant l’aiguille de la solution gélifiante (Martín et al., 2015).

L’extrusion est une méthode simple de réalisation aisée, permettant la rétention d’un nombre élevé
des cellules microbiennes, des procédés automatisés exploitant ce principe sont disponibles de nos
jours (Eratte et al., 2018).

10
I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

Chapitre II. Les probiotiques et les matrices alimentaires

[Link] et antioxydants naturels

L’oxydation représente un processus indispensable dans le métabolisme des cellules aérobies de

l’organisme. Elle met en jeu la molécule d’oxygène dont la production par des voies métaboliques
non contrôlées engendre la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) tels que les radicaux
libres superoxide O2•-, hydroxyl HO•, alkoxyl RO• et peroxyl RO2•.Ces radicaux sont impliqués
dans le stress oxydant qui est caractérisé par un déséquilibre entre la production des ERO et
l’élimination de ces espèces (Serigne et al ., 2015).

Les dommages oxydants sont causées par l’attaque des radicaux libres sur diverses biomolécules,
en particulier les protéines, les lipides et l’ADN, ayant finalement comme conséquence la
dégradation et la mort de cellules (Ghedadba et al ., 2015). Les antioxydants peuvent être définis
comme toute substance capable de ralentir ou d’inhiber l’oxydation d’un substrat oxydable (Chiha
et al ., 2016).

Les antioxydants alimentaires ont des rôles importants dans le corps humain en neutralisant les
processus d'oxydation et en prévenant les maladies chroniques liées au stress oxydatif (Cömert et
Gökmen, 2018). Ils se trouvent dans un grand nombre d'aliments : poivrons, goyave, oseille, citron,
orange, kiwi, chou, papaye, fraise, huile de tournesol, de soja, de maïs, beurre, margarine, œuf, foie,
beurre, œuf, poissons, viandes, fruits de mer, viandes, pain complet, fruits et légumes, vin, thé..etc.
L’effet préventif de ces aliments résulte de la présence d’un éventail de molécules, dont les
polyphénols, les caroténoïdes, certaines vitamines et oligo- éléments (Karlund et al., 2015).

II.1.1. Les polyphénols des fraises et concombre comme antioxydants

Les polyphénols sont définis comme un groupe complexe et très varié de substances naturelles
d’origine végétale, qui résultent des métabolites secondaires des plantes, ces composés sont
reconnus par leur forte bioactivité, qui se traduit au niveau de l’organisme par une large gamme de
propriétés biologiques (Adriouch et al ., 2017).
Les fraises ont une teneur particulièrement élevée en polyphénols comparativement aux autres
fruits, elles sont classées au premier rang pour la capacité antioxydante. En général, les fraises sont
riches en flavonoïdes tels que les anthocyanines qui ont démontré le plus haut pouvoir antioxydant
et en flavonols (quercetine et myricetine), et en acides phénoliques (Basu et al., 2014).Des études
ont démontré la présence de composés phénoliques ayant une légère activité antioxydante dans le

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I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

concombre (Chu et al., 2002). La teneur en composés antioxydants dans le concombre est
cependant plus faible que celui d’autres légumes et fruits fréquemment consommés comme les
fraises et le persil (Stratil et al., 2006).

II. 2.Mécanisme d’action des polyphénols

Ces métabolites possèdent des propriétés sur l'organisme humain, principalement comme
antioxydants, antiallergiques, anti-inflammatoires, anticancéreux, antihypertenseurs et
antimicrobiens (Daglia, 2012). Ils exercent leur activité antioxydante selon plusieurs mécanismes.
Les composés phénoliques ont des propriétés antioxydantes en raison de leur capacité à piéger les
radicaux libres et les espèces réactives de l'oxygène, le processus est radicalaire (Sökmen et al .,
2012). Ils interfèrent avec l'oxydation des lipides et d'autres molécules par la donation rapide d'un
atome d'hydrogène aux radicaux libres selon un mécanisme proposé dès 1976 par Sherwin :
l’antioxydant cède formellement un radical hydrogène, qui peut être un transfert d’électrons suivi,
plus ou moins rapidement, par un transfert de proton, pour donner un radical intermédiaire. Il est
stabilisé par ses structures mésomères conjuguées (Stratil et al. , 2006).
[Link] physiologiques des polyphénols

Selon des études in vitro combinées avec celles in vivo, il a été éclairé que la métabolisation des
composés phénoliques débute dans l'intestin grêle suivi par l'absorption des parties biodisponibles et
leurs modifications dans le foie ou autres organes (Manach et al., 2005). Une fois ingérés, ils sont
métabolisés et transformés en métabolites méthylés, glucuronés et sulfatés (Heleno et al., 2015).

Les composés phénoliques montrent une relation réciproque avec la microflore colique, ils sont
capables d'améliorer la santé du côlon et moduler la diversité microbiotique, les polyphénols sont
métabolisés aux niveau du côlon soit par déconjugaison, déshydroxylation, et convertion à des
acides phénoliques simples qui peuvent également entrer dans le système circulatoire (Velderrain-
Rodriguez et al., 2014 ; Ozdal et al., 2016).

Le concept des trois P pour la santé intestinale, qui comprend les probiotiques, les prébiotiques et
les composés phénoliques, a été récemment créé, et il favorise les composés phénoliques au même
niveau biologique des prébiotiques (Marchesi et al., 2015 ; Espín et al., 2017).

12
I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

[Link] composés phénoliques et bactéries

Il est crucial de comprendre l’effet inhibiteur ou effet stimulant des composés phénoliques sur les
bactéries bénéfiques ou pathogènes , et leur rapport dans l'intestin. Il y a plusieurs études faites sur
l’effet des composés phénoliques sur le microbiote intestinal (Duda- Chodak, 2012; Kawabata et
al., 2013; Etxeberria et al., 2015). Duda-Chodak (2012) a analysé les effets des flavonoïdes sur
six espèces bactériennes pathogènes et bénéfiques communément trouvées dans la microflore
intestinale et il a trouvé que la quercétine, la rutine, naringénine, et l'hespérétine ont des effets
inhibiteurs sur toutes les espèces bactériennes (micro-organismes pathogènes et probiotiques). Par
ailleurs Etxeberria et al. (2015) ont montré que tous les composés phénoliques testés à l'exception
de la rutine, étaient efficaces sur les souches pathogènes du microbiote intestinal, alors que les
souches probiotiques de lactobacilles étaient relativement épargnées.

Dans une autre étude, il a été conclu que l'incubation des catéchines avec un microbiote sélectionné
a entraînné une augmentation significative de la croissance du groupe Clostridium coccoides-
Eubacterium rectale, Bifidobacterium spp., et Escherichia coli, alors qu'un effet inhibiteur
significatif sur la croissance du groupe Clostridium histolyticum a été noté (Kawabata et al., 2013).
Il est évident que la diminution de la croissance des souches pathogènes est liée aux effets
antimicrobiens des composés phénoliques, la croissance des souches probiotiques pourrait être liée
à la capacité à métaboliser ces composés phénoliques pour stimuler leur croissance (Etxeberria et
al., 2015).

II.5. Probiotiques et activité antioxydante

Des études ont démontré que différentes souches de bactéries probiotiques exercent une capacité
antioxydante de différentes manières. La figure 3 montre les mécanismes de résistance de diverses
souches probiotiques à des agents oxydants (espèces réactives d’oxygène).

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I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

Figure 3 : Modulation de l’activité antioxydante par les probiotiques (Wang et al., 2017).

(1) Chélation des ions métalliques. (2) Production des antioxydases des probiotiques. (3) Production des
métabolites antioxydants. (4) Régulation de l’activité des antioxydases au niveau de côlon. (5) Stimulation de la
production des substances antioxydantes par le côlon. (6) Régulation des voies de signalisation. (7) Inhibition des
enzymes produisants des ERO. (8) Régulation de la composition du microbiote.

Parmi les mécanismes de résistance des probiotiques aux agents oxydants les plus fréquents sont :

a. Les probiotiques peuvent produire divers métabolites ayant une activité antioxydante, tels
que le glutathion (GSH), le butyrate et le folate (Vijendra et al., 2015). Le folate est une
vitamine qui est impliquée dans de nombreuses voies métaboliques (L'efficacité de la
réplication, de la réparation et de la méthylation de l'ADN est affectée par la disponibilité de
folate). Ahire et al. (2013), ont signalé que l'extrait intracellulaire de folate de L. helveticus
CD6, a donné des potentiels antioxydants comparables à ceux de la cellule intacte. Le
butyrate est un acide gras à chaîne courte (AGCC) produit par le microbiote dans le côlon et
l'intestin grêle distal (Vijendra et al., 2015). Les niveaux de métabolites antioxydants de

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I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

l'hôte peuvent également être régulés par un traitement probiotique, le niveau de GSH et la
biosynthèse du GSH ont également été améliorés chez des rats traités avec des probiotiques,
ce qui a permis de réduire le stress oxydatif d’une pancréatite aiguë (Wang et al., 2017).

b. Comme les animaux, les probiotiques ont aussi leurs propres systèmes enzymatiques
antioxydants. Un des meilleurs connus de ces enzymes est la SOD. Une étude explorant
l'impact de l'ingénierie des souches BL23 de L. casei produisant de la SOD sur des souris
atteintes de la maladie de Crohn a démontré que les souris recevant des souches d'ingénierie
ont eu une récupération plus rapide de la perte de poids initiale, a augmenté les activités
enzymatiques dans l'intestin, et une moindre ampleur de l'inflammation intestinale que les
souris témoins(Le Blanc et al., 2011).

La catalase (CAT) participe à la défense antioxydante cellulaire en décomposant le peroxyde

d'hydrogène, empêchant ainsi la génération de radicaux hydroxyles (Spyropoulos et al
.,2011). Les bactéries lactiques sont généralement CAT négatives, cependant, une étude a
prouvé qu'une CAT produite par Lactococcuss lactis pourrait prévenir le cancer du côlon
induit par la 1,2-diméthylhydrazine chez la souris (De Le Blanc et al., 2008).

II.6. Les aliments transmetteurs et protecteurs de probiotiques

Les aliments sont des transporteurs pour la livraison des probiotiques au corps humain, de plus, ils
aident à protéger les probiotiques au cours du passage dans le tractus gastro-intestinal. La
croissance et la survie des probiotiques dans le transit gastro-intestinal sont affectées par les
propriétés physico-chimiques des transporteurs alimentaires. Cependant, une large gamme
d'aliments, y compris les produits laitiers fermentés et non fermentés, crèmes glacées, fruits et
légumes, jus de fruits et de légumes, beurre, les produits à base de céréales, aliments à base de
viande (saucisses fermentées) ; les produits de boulangerie ; ont été enrichies en probiotiques et
évalués en tant qu’excellentes matrices porteuses de micro-organismes (Perricone et al., 2015).

Le développement de nouveaux aliments probiotiques devrait tenir compte non seulement des
caractéristiques intrinsèques des souches bactériennes, mais aussi de la capacité de la matrice
alimentaire à protéger les cellules bactériennes à travers le tractus gastro-intestinal (Drouaul et al .,
2006).

15
I. Synthèse bibliographique Chapitre [Link] probiotiques et les matrices alimentaires

II.6.1. Les fruits et légumes comme véhicule de probiotique

Bien que, les produits laitiers sont reconnus comme le meilleur véhicule pour la livraison de
probiotiques viables à l'intestin humain, le nombre croissant de personnes souffrant
d'une intolérance au lactose, la dyslipidémie et le végétarisme renforce l'importance du
développement des produits probiotiques non laitiers (Garcia et al., 2016). Les produits
alimentaires crus ont récemment fait l'objet d'études approfondies en tant que substrats potentiels
pour la production d'aliments probiotiques non laitiers (Martins et al., 2013).

Les produits d'origine végétale, tels que les fruits, peuvent être considérés comme des substrats
idéaux pour les probiotiques car ils contiennent des nutriments tels que les vitamines, les minéraux,
les glucides, les fibres et les composés antioxydants (Bakr Shori, 2015), ces aliments ne
contiennent aucune substance allergène, présente dans les produits laitiers pouvant limiter leur
consommation (Martins et al., 2015) .

Les produits probiotiques à base de fruits sont fabriqués à partir d'ananas, de canneberge, de fraise,
de citron vert, de mangue, de raisin, de pomme de cajou, d'olive et d'orange (Panghal et al., 2018).
La demande croissante de nouveaux aliments probiotiques a stimulé le développement dans le
monde entier aussi des produits non laitiers, principalement l'exploration de jus de fruits comme un
moyen pour les probiotiques (Santo et al ., 2011). Le chou végétal, la racine de carotte, la tomate,
la betterave, l'oignon, le gingembre, les arachides, sont utilisés comme véhicules de probiotiques.
Les bactéries comme L. acidophilus, L. plantarum, L. casei et B. longum peuvent être utilisées
pour comme probiotiques dans les aliments à base de légumes (Panghal et al., 2018).

Cependant, il existe certaines limites qui pourraient empêcher la production de probiotique non
laitiers au niveau industriel, comme les caractères sensoriels, l'acceptation globale et, plus important
encore, la survie des probiotiques pendant le stockage (Perricone et al., 2015).

16
 Etude
Expérimentale
Matériel et Méthodes

Notre travail a été réalisé au niveau du laboratoire de Microbiologie de la Faculté des Sciences de la
Nature et de la Vie de l’Université de Jijel, durant la période Mai- Juin 2018. Ce travail avait pour
objectifs de réaliser les points suivants :
Etudier la survie in vitro de Lactobacillus plantarum S10 (culture libre et encapsulée) dans des
conditions similaires à celles bucco- gastro-intestinales, et évaluation de son activité antioxydante
avant et après son passage à travers les trois étages digestifs. D’autre part, évaluer l’activité
antioxydante des extraits phénoliques du concombre et de fraises, et tester leurs effets sur la
viabilité, l’activité antioxydante et l’adhésion de la souche dans les mêmes conditions bucco-gastro-
intestinales.

II.1. Matériel

II.1.1. Matériel biologique

Au cours de cette étude, nous avons utilisé ce qui suit :

✓ Une bactérie lactique, Lactobacillus plantarum codée S10 a été utilisée, cette dernière a été
isolée du rumen de chèvre de race locale ;
✓ Un légume, le concombre et un fruit, la fraise ont été achetés du marché (1Kg). Ils ont servi
pour la préparation de jus et d’extraits ;
✓ Les cellules épithéliales de l’espèce Gallus gallus ont été préparées au niveau du laboratoire
et elles ont servi pour le test d’adhésion.

II.1.2. Les milieux de culture

Un seul milieu de culture avec les deux formes, bouillon et gélose a été utilisé. Il s’agit du milieu
MRS (Composition en Annexe)

II.1.3. Produits chimiques et réactifs

La réalisation de notre étude a demandé l’utilisation de ce qui suit :

✓ Les sels : Chlorure de calcium CaCl2 (0.5M et 0.3M) ; Chlore de potassium KCl (0.5M),
Chlore de sodium NaCl (2M), Bicarbonate d’ammonium NH4 (CO3)2 (0.5M), Carbonate de
sodium (75g/ml), FeSO4, Trichlorure d’aluminium AlCl3 (2%), MgCl2(H2O)6 (0.15M),
KH2PO4(0.5M), NaHCO3(1M).
✓ Les acides, bases et alcool : HCl (6M), NaOH (1M), Sels biliaires, Acide gallique,
Méthanol .

17
Matériel et Méthodes

✓ Les enzymes, réactifs et autres : Pepsine (2000U/ml), α-amylase (75U/ml),

Phénophtaléine, Folin-Ciocalteu (1/10), 2,2-Diphényil- picrylhydrazyl DPPH◦, Pancreatine,
H2O2(9.8M), Alginate de sodium (1%), Phenotrauline.
✓ Les Tampons: Tampon phosphate salin PBS, Tampon phosphate potassique pH=07(2M).
✓ Les colorants : Violet de Gentiane, Lugol, Fushine, Cristal violet.

II.1.4. Appareillage

Lors de la réalisation de notre étude, nous avons utilisé ce qui suit :

✓ Bec Bunzen ;
✓ Autoclave (Slli AVX éléctric), Four pasteur (Memmert), Etuve (Memmert) ;
✓ Centrifugeuse (Hettich EBA 20) ;
✓ Spectrophotomètre optique (specord plus) ;
✓ pH mètre (HANNA) ;
✓ Balance électronique (Kern EMB 600-2), Balance analytique ;
✓ Agitateur magnétique chauffant (Heidolph MR 3002), Vortex (VWR) ;
✓ Réfrigérateur (ENIEM) ;
✓ Rotavapor(BUCHI) ;
✓ Microscope à caméra, Microscope optique.

II.2. Méthodes

II.2.1. Revivification de la souche

La revivification de la souche est effectuée par ensemencement dans du bouillon et gélose MRS,
suivi d’une incubation à 37°C/24h. La pureté de Lactobacillus plantarum S10 a été vérifiée par
observation macroscopique (aspects des colonies sur gélose) et observation microscopique
(coloration de Gram).

II.2.2. Encapsulation de L. plantarum S10 dans un gel d’alginate de sodium à 1%

L’encapsulation de la bactérie a été effectuée en suivant le protocole décrit par Sifour et al.
(2012) avec quelques modifications. 2ml d’une culture de 20h de la souche [Link] S10 (dans
le bouillon MRS) a été centrifugé (15minutes, 50000g) et le culot obtenu a subit deux lavages à
l’eau physiologique stérile, puis suspendu dans 10ml d’eau physiologique (suspension à
encapsuler).

18
Matériel et Méthodes

Cette suspension a été mélangée à 90ml de la suspension aqueuse d’alginate de sodium (1% pH7)
préalablement stérilisée à l’autoclave (120°C, 20min) ce qui a permis d’obtenir un inoculum
bactérien. Ce dernier a été introduit dans une seringue de 5ml surmontée d’une aiguille de taille
(22G). La pression manuelle exercée sur le piston de la seringue, a permis de laisser tomber goutte à
goutte le contenu de la seringue dans une solution stérile de CaCl2 (0.5M, 300ml).
Après un temps de contact d’une heure, les gouttes gélifiées (les billes formées) obtenus ont été
séparées de la solution de CaCl2, cette dernière a été aspirée plusieurs foies à l’aide une
micropipette.
Les billes obtenues ont été rincées deux fois avec l’eau distillée stérile, et conservées dans l’eau
physiologique à 4°C jusqu’à leur utilisation.

II.2.3. Préparation des extraits et dosages (composés phénoliques et flavonoïdes)

Les composés phénoliques et flavonoïdes ont été extraits à partir du concombre et de la fraise par
deux méthodes différentes : Extraction par macération dans le méthanol aqueux, extraction avec le
méthanol recombiné avec un processus de centrifugation.
Pour la préparation de la matière première, les concombres et fraises ont subi un triage et un lavage
à main, puis épluchés (concombre), broyés (mixeur) et enfin tamisés pour séparer la pulpe qui
servira par la suite pour la préparation des extraits.

II.2.3.1. Extraction par macération dans le méthanol aqueux (extraction solide/liquide) à

partir de la pulpe du concombre
La macération (extraction solide-liquide) est une opération qui consiste à laisser séjourner la
matière végétale (broyat) dans le méthanol aqueux pour extraire les principes actifs (composés
phénoliques et flavonoïdes).
Cette méthode d’extraction a été effectuée selon le protocole décrit par Hamia et al. (2014) avec
quelques modifications. Le protocole de la macération de ce légume est le suivant : 10g de la pulpe
du concombre a été mis dans un bécher contenant 100 ml de méthanol aqueux (70/30 : v/v), le tout
a été chauffé jusqu'à ébullition puis refroidi sous agitation. La mixture est laissée macérer pendant
24 h, ensuite filtré sur du papier filtre Wattman N°1. Le filtrat a été récupéré dans un flacon stérile.
Pour optimiser l’extraction, la procédure a été répétée trois fois, par macération du retentât dans
100 ml de méthanol aqueux bouillant. Enfin, les macéras hydro-alcooliques de 3 jours sont placés
dans un seul récipient.

19
Matériel et Méthodes

Les macéras hydro alcoolique obtenus ont été évaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif, ou
Rotavapor (BUCHI) à température de 45°C et une vitesse de rotation de 27/ min. Après
élimination du méthanol, le ballon du rotavap a été retiré et laissé refroidir. Le contenu du ballon
(l’extrait) a été recueilli dans de l’eau chaude (100 ml) puis laissé décanter pendant 24 h à
température ambiante. Enfin, le contenu du ballon a été filtré sur papier filtre Wattman N°1 pour
éliminer les boues (graisse et résine).

II.2.3.2. Extraction des composés phénoliques à partir des pulpes de fraises

Cette méthode d’extraction a été effectuée selon le protocole décrit par Michiels et al. (2017). Les
polyphénols sont extraits par macération de 5g de la pulpe dans 15 ml de méthanol sous agitation à
l’obscurité (condition réalisée par enrobage du bécher par du papier aluminium) pendant 60 min, ce
qui empêche l’oxydation des composés phénoliques. Après centrifugation (20minutes, 5000g), le
surnageant contenant les polyphénols est récupéré. Nous procédons à une deuxième extraction
identique sur le culot pour extraire 30% de polyphénols supplémentaires (Boizot et al., 2006), donc
obtenir un dosage plus exhaustif. Les surnageants sont mélangés avec 5ml de méthanol et stockés à
4°C jusqu’à leur utilisation.

[Link] des flavonoïdes

La teneur en flavonoïdes des extraits et des jus a été déterminée en utilisant la méthode du
Chlorure d’aluminium (AlCl3) décrite par Quettier-Deleu et al. (2000) qui consiste à mélanger 1
ml d’extrait et 1 ml de la solution de chlorure d’aluminium (AlCl3 à 2% dans le méthanol). Le
mélange est laissé 10 min à l’obscurité et à température ambiante. Après incubation, l'absorbance
est mesurée à 415nm. Un témoin a été préparé en remplaçant l’extrait par le même volume du
solvant d’extraction.
La teneur en flavonoïdes de chaque extrait est calculée à partir de la courbe d’étalonnage établie
avec la quercétine, elle est exprimée en milligrammes équivalent quercétine par gramme de matière
sèche (mg E .Q/g MS).

[Link] des polyphénols

La teneur en polyphénols totaux des extraits et des jus a été effectuée en utilisant le protocole décrit
par George et al. (2005).
A un volume de 250 μl de chaque extrait est ajouté 1.25 ml du réactif de Folin-Ciocalteu (dilué à
1/10), après 2 min de repos dans l’obscurité, 1 ml de carbonate de sodium (75g/l) est ajouté, le tout
est agité puis incubé pendant15 min au bain Marie à 50 °C. Après cette période, le mélange

20
Matériel et Méthodes

réactionnel est laissé refroidir. L’absorbance de la coloration bleue développée est mesurée à 750
nm.
Un blanc a été préparé en remplaçant l’extrait par le solvant d’extraction et la teneur en composés
phénoliques de chaque extrait est calculée à partir de la courbe d’étalonnage préparée avec l’acide
gallique, elle est exprimée en milligrammes équivalent d’acide gallique par gramme de matière
sèche (mg EAG/g MS).

II.2.4. Détermination in vitro de l'activité antioxydante de L. plantarum S10

[Link]éparation de la suspension bactérienne

La souche L. plantarum S10 a été cultivée sur bouillon MRS (1% : V / V) à 37 ° C pendant 18 h.
Les cellules bactériennes ont été récoltées par centrifugation (6000 g, 10 min, 4 ◦C), lavée trois fois
et mise en suspension dans le tampon phosphate salin (PBS). Le nombre de bactéries dans le culot
cellulaire a été ajusté à une absorbance de 0.9 (environ 109 UFC / ml) (Li et al., 2012).

II.2.4.2. Préparation des surnageants cellulaires

Le bouillon MRS a été inoculé avec 1% (V / V) de la culture bactérienne puis mis à incuber à 37
°C pendant 18 heures. Le surnageant de la culture a été obtenu par centrifugation de la culture à
10 000 tours par minute pendant 5 minutes à 4 ° C (Afify et al., 2012).
La suspension bactérienne et son surnageant ont été soumis aux différents tests antioxydants à
savoir :

a. Résistance au peroxyde d’hydrogène (H2O2 Scavenging activity): La méthode décrite

par Li et al. ( 2012). a été appliquée. La culture d'une nuit de la L. plantarum S10 a été
ensemencée à 1% (v / v) dans du bouillon MRS contenant 0.4, 0.7 et 1.0 mM de peroxyde
d'hydrogène suivi d’une incubation à 37 C pendant 8 h. La croissance cellulaire a été
mesurée par spectrophotométrie (specord plus) à 600 nm. Les résultats ont été donnés en
densité optique (DO). La culture sur bouillon MRS a été utilisée comme témoin.

b. Activité de piégeage des radicaux hydroxyles : L'essai de piégeage des radicaux

hydroxyles a été réalisé par application de la méthode décrite par Zhang et al. (2011).
Brièvement, à un mélange de réaction contenant 1 ml de Phenotrauline (0.75mM), 1 ml de
FeSO4 (0,75 mM), 1ml de H2O2 (0,01% : v / v) et 1,5 ml du PBS (0,15M), 1ml de chaque
préparation (suspension bactérienne, surnageant) a été ajouté et le tout a été incubé à 37°C
pendant 30 min. Après cette période d’incubation, l'absorbance a été mesurée à 536 nm. Le
21
Matériel et Méthodes

changement d'absorbance du mélange réactionnel indique la capacité de piégeage des

radicaux hydroxyles par L. plantarum S10.

L’activité de piégeage des radicaux hydroxyles est exprimée par la formule suivante:

Scavenging activity (%) = [(As−A0)/ (A−A0)] ×100

Avec :
As : l’absorbance l'échantillon.
A0 : l'absorbance du témoin.
A : l'absorbance sans l'échantillon et le système de réaction.
c. Piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) : Ce test a été
mesuré en utilisant le mode opératoire décrit par Heo et al. (2005). Pour 500µl de chaque
préparation bactérienne, 3 ml d'une solution fraîchement préparée de 2,2-diphényl-2-picryle
hydrate de hydrazyl (DPPH) (0.05mM) a été ajouté, le mélange a été incubé en obscurité
pendant 30 min. Après cette période, l'absorbance a été mesurée à 517nm.

Une suspension contienne que du Méthanol et des cellules a servi de blanc et un contrôle a
été préparé en remplaçant les 500 µl de la préparation bactérienne par du méthanol.
Les lectures ont été faites en triple exemplaire et la valeur d'absorbance moyenne a été
calculée.
Le pourcentage d'activité de piégeage des radicaux a été calculé selon l'équation
Scavenging activity (%) = [1− (A sample−A blank)/A control] ×100

Avec :

A sample : absorbance d’échantillon

A blank: absorbance du blanc
A contrôle : absorbance du contrôle
II.2.5. Comportement des billes dans une solution de KH2PO4
Le protocole consiste à préparer deux solutions de KH2PO4 (0,2M) avec des pH simulants celui des
conditions stomacales (solution de KH2PO4 :0,2M à pH2 et à pH3) et celui intestinal (solution de
KH2PO4 : 0,2M à pH7). Par la suite, évaluer le comportement des cellules de [Link] S10
emprisonnées dans des billes d’alginate de sodium dans les deux milieux.
Pour se faire, chaque gramme de billes a été introduit dans un volume de 9 ml de la solution de
KH2PO4 aux différents pH et l’ensemble a été incubé à 37°C. Après 2h, 4h, 24h et 48h d’incubation,

22
Matériel et Méthodes

l'absorbance a été mesurée à 600nm. Les solutions de KH2PO4 aux différents pH ont servis de
blanc.

II.2.6. Activité antioxydante des différents extraits

L’activité antioxydante des extraits a été évaluée par un seul test, l’activité anti radicalaire DPPH°.
La mesure de l’activité anti radicalaire DPPH a été effectuée par application de la méthode décrite
par Brand-Williams et al. (1995).
A un volume de 50 µl de chaque extrait est ajouté 2 ml de la solution méthanolique de DPPH
préparée à 0.004%. Le mélange est incubé à l’obscurité et à température ambiante pendant 30 min
et la décoloration est mesurée à 517 nm contre un blanc, contenant le DPPH• et le solvant
d’extraction. Un contrôle est préparé avec un mélange de 50 μl de méthanol et 2 ml de DPPH°.

Et le Trolox est utilisé comme étalon d’activité antioxydante

Le pourcentage d’inhibition du DPPH° des extraits a été calculé en utilisant la formule suivante:

% d’inhibition du DPPH°= [(A contrôle –A extrait)/A contrôle] ×100

A contrôle : absorbance du control;

A extrait : absorbance de l’extrait.

II.2.7. Fabrication des jus de concombre et de fraises et fermentation

II.2.7.1. Préparation des jus
Les deux jus sont préparés de la même méthode, pour le légume aussi bien que pour le fruit 500g a
été lavé (les deux matières premières) et épluché (pour le concombre), coupés et broyés (mixeur),
addition d’un volume d’eau stérile, puis chaque produit a été congelé (une nuit), suivi d’une
décongélation et centrifugation pour but de clarifier les jus, les jus ainsi récupérés sont mis dans des
flacons stériles. L’ensemble a été stérilisé par trempage dans un bain Marie réglé à 95°C pendant
20min (Breidt et Caldwell, 2011).

[Link] des jus et évaluation de quelques paramètres

Pour chaque flacon de jus déjà stérilisé, nous procédons à son ensemencement soit par la souche
[Link] S10 libre (5%) ou par la culture encapsulée (les billes : 5%). La fermentation a été
lancée à l’étuve agitatrice pendant 24heures.
Durant la fermentation des jus, nous avons suivis trois paramètres, le pH, l’acidité et le nombre de
cellules viables, cela lors de l’ensemencement puis après 2h, 4h et 24h d’incubation à 37°C.

23
Matériel et Méthodes

Le pH a été mesuré à l’aide d’un pH mètre (HANNA), en prolongent l’électrode du pH mètre dans
20 ml des jus et la valeur affichée sur l’écran a été notée (AOAC, 2000).

La mesure d’acidité a été effectuée par la titration de 10 ml de jus en présence de 10 gouttes de

phénolphtaléine, avec du NaOH (0.1N) (Idoui, 2013).

La valeur est donnée selon l’équation suivante Acidité (°D) = V NaOH ×10

Avec VNaOH : Volume de la soude utilisé pour titrer les 10ml de jus

Le comptage des colonies lors de la fermentation des jus a été réalisé par la méthode de numération
sur milieu solide (gélose MRS), en suivant les étapes suivantes : Nous commençons par la
préparation des dilutions, en transférant 1ml de jus dans un tube à essai contenant 9ml d’eau
physiologique, ainsi s’obtient la dilution 10-1. Ce geste est répété jusqu’à aboutir à la dilution de
10-9. Une fois les dilutions prêtes, nous procédons à l’ensemencement par étalement des boites de
Pétri contenant la gélose MRS à partir de la dilution 10-9. Les boites sont mises à incuber à 37°C
pendant 24h. Le nombre d’UFC est calculé comme suit (Sharma et al.,2013) :

Nombre (UFC) = la moyenne du nombre de colonies comptées sur deux boites × l’inverse du
facteur de dilution.

II.2.8. Mesure des activités antioxydantes de la bactérie après 24heures de fermentation

Après 24 h de fermentation, l’activité antioxydante des cellules de L. plantarum S10 a été évaluée.
Les mêmes tests de l’activité déjà décrits en. II.2.4. Ont été appliqués.

II.2.9. La digestion bucco-gastro-intestinale in vitro

Pour réaliser ce test, nous avons adopté la méthode décrite par Minikus et al. (2014). L’avantage de
cette technique est la continuité de la digestion par écoulement et mélange des liquides de la bouche
vers l’intestin.

24
Matériel et Méthodes

[Link]éparation des solutions mères des liquides simulés de la digestion

Cette étape consiste à préparer des solutions simulées à celles de la digestion (solution équivalente
au liquide salivaire, liquide gastrique et solution simulant la partie inferieure du tractus; solution de
liquide intestinale). La composition des liquides est mentionnée dans le tableau 04. Les solutions
préparées ont été autoclavées à 120°C pendant 15min.

Tableau 04. Composition des solutions simulées de la digestion (Minikus et al., 2014)

Solution mère ajoutée Solution mère ajoutée Solution mère ajoutée

pour préparer pour préparer pour préparer
250ml (LS) 250ml (LG) 250ml (LI)

KCl (0.5M) 7.55mL 3.45mL 3.4mL

KH2PO4(0.5M) 1.85mL 0.45mL 0.4mL
NaHCO3(1M) 3.4mL 6.25mL 21.25mL
NaCl (2M) / 5.9mL 4.8mL
MgCl2(H2O)6(0.15M) 0.25mL 0.2mL 0.55mL
NH4(CO3)2 (0.5M) 0.03mL 0.25mL /
HCl(6M) 0.045mL 0.65mL 0.7mL

[Link] expérimental de la digestion bucco -gastro-intestinale in vitro

Les étapes du protocole sont mentionnées dans la figure 4. Le protocole a pour but de tester la
viabilité et la survie de la souche libre et encapsulée aux conditions bucco- gastro-intestinales et de
tester l’effet des jus (matrices alimentaires comme véhicules de la bactérie probiotique) sur la
viabilité et la survie de la souche libre et encapsulée aux mêmes conditions de la digestion, d’autre
part tester la bio accessibilité des composés phénoliques des extraits à ces conditions, et l’effet de
la combinaison de ces extraits avec la bactéries sur ses aptitudes à survivre dans les mêmes
conditions.

Le schéma suivant, illustre la méthode adoptée pour réaliser ce test.

25
 Matériel et Méthodes

1g (1mL) d’échantillon +5mL de liquide salivaire (LS)

+α-amylase (75U/mL) 7,5µg +CaCl2 (0.3M) 25µL

Digestion Incubation pendant 2min à 37°C, pH7

5mL phase orale

Orale

5mL de la phase orale+5mL de liquide gastrique(LG)

Pepsine (2000U/mL) 20µg+2,5µL CaCl2(0.3M)

Digestion Incubation pendant 2h à 37°C, pH3 +HCl (6M)

Gastrique 10mL phase gastrique

10mL phase gastrique+10mL de liquide intestinal (LI)

Pancréatine 37,5µg, sels biliaires 40mg+ 20µL

Digestion CaCl2 (0.3M)

Incubation pendant 2h à 37°C, pH7+NaOH (1M)

Intestinale
20mL phase intestinale

Stockage à-24°C

Figure 4. Schéma de la digestion bucco-stomaco-duodénale in vitro

26
Matériel et Méthodes

a. Pour la culture libre et encapsulée : nous avons réalisé les tests suivants :

✓ Survie et viabilité de la culture libre et encapsulée après chaque phase de digestion ;

✓ Survie et viabilité de la culture à T= 0h dans les jus (Les jus ensemencés par les billes sont
laissés 1h à température ambiante avant la réalisation de ce test);
✓ Survie et viabilité de la culture après 24 h de fermentation.

La survie a été déterminée par la comparaison du nombre de bactéries après chaque phase de la
digestion, avec le nombre initial.

La mise en évidence des résultats (le nombre de cellules viable) des trois tests est effectuée par :

✓ Le dénombrement direct sur boite de Pétri : A l’aide d’une pipette stérile, nous prélevons
1ml de chaque contenu digestif que l’on introduit dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau
physiologique stérile, nous obtenons alors la dilution 10-1, à partir de cette dernière on refait
la même opération pour aboutir à la dilution 10-9. L’ensemencement est réalisé en étalant en
double 1ml de la dilution 10-9 en surface de la gélose MRS préalablement coulée et
solidifiée. L’incubation s’est effectuée à 37°C pendant 48h. Après cette durée, on dénombre
les colonies bactériennes (Sharma et al.,2013).

Une évaluation du nombre initial de cellules de la culture libre a été effectuée. De même, le
dénombrement du nombre initial des bactéries encapsulées (dans un 1g de bille) a été effectué, en
libérant les bactéries des capsules par séquestration des ions calcium par le tampon phosphate
potassique (2M).

✓ La mesure de la DO à 600nm : Chaque échantillon de chaque étage digestif a été soumis à

une lecture de sa DO à 600nm.
✓ Le comptage des cellules par la cellule de Malassez : Pour le comptage des cellules
bactériennes viables, la technique décrite par Sadok et al (2015) a été appliquée:
- Préparation des micro-dilutions : L’échantillon prélevé (contenu buccale, stomacale
ou intestinale) a été bien homogénéisés et des micro-dilutions ont été préparées (100µl
du l’échantillon dans 900µl de l’eau physiologique stérile). La micro-dilution a été
poussée jusqu’à 10-9.
- Préparation de la cellule de Malassez : la lame a été rincée et séchée. Pour réaliser le
remplissage de la cellule, nous avons humidifié les glissières latérales puis, nous avons
déposé la lamelle sur les rebords. Enfin, l’extrémité de la micropipette a été placée
contre la lamelle et l’inoculum a été délivré par capillarité.
27
Matériel et Méthodes

- Observation microscopique et comptage des cellules: la cellule est portée au

microscope optique à l’objectif ×100, les cellules vivantes sont comptées, et le nombre
de cellules a été calculé selon la formule suivante :

Nc = Ng .100.1/Z

Avec :
• Nc : nombre de cellules ;
• Ng : nombre de cellules comptées sous microscope optique ;

• Z : la dilution utilisée.

✓ Evaluation de l’activité antioxydante : Les mêmes tests motionnés en II.2.4. ont été
appliqués pour évaluer cette activité de la bactérie après la phase orale, la phase gastrique
et la phase intestinale.

b. Test de digestion in-vitro des extraits : Ce test a été réalisé par le dosage des polyphénols et des
flavonoïdes après chaque phase de digestion. Les mêmes méthodes décrites en II.2.3.3, II.23.4 ont
été appliquées.

c. Test de digestion in-vitro de la combinaison bactérie libre/extraits (du concombre et de

fraise)

Ce test a également été réalisé, en évaluant la survie et la viabilité de la bactérie en présence de

l’extrait après chaque phase de digestion. Les méthodes pour la mise en évidence des résultats sont
les mêmes que celles utilisées avec la culture libre.

Dans le même objectif, nous avons procédé au dosage des polyphénoles et des flavonoïdes après
chaque phase de digestion avec usage des mêmes protocoles utilisés précédemment.

II.2.10. Test d’adhésion in- vitro aux cellules épithéliales

Le test est effectué en se basant sur la méthode décrite par Lin et al. (2007).

✓ Préparation de la culture bactérienne : Les cellules bactériennes (culture d’une nuit de

la souche [Link] S10) ont été récoltées par centrifugation (7000 g, 10 min, 4°C),
lavées trois fois et mise en suspension dans le tampon phosphate salin PBS. Pour la
standardisation de notre culture et afin de s’assurer que notre inoculum qui va servir pour le

28
Matériel et Méthodes

test est à une concentration des cellules de 1×108cellules/ml, nous nous sommes servi d’une
cellule de comptage « cellule de Malassez » pour la standardisation.

✓ Préparation des cellules épithéliales : Pour la préparation des cellules épithéliales, un

segment de l'iléum d'un poulet a été bien lavé et nettoyé puis ouvert et lavé avec du tampon
phosphate salin stérile (PBS pH 7.2), ce dernier a été mis à 4°C pendant 30 min. Les cellules
ont été récupérées dans du PBS, en grattant la surface tapissant ce segment intestinal par une
lame stérile. Des dilutions décimales ont été réalisées jusqu’à 10-4, cette suspension
cellulaire a été examinée par microscope pour assurer qu'elle n'était pas contaminée et que la
concentration des cellules épithéliales est approximativement 5x104 cellules/ml.

✓ Réalisation du test : 1ml de chaque culture est mélangé avec 1ml de la dilution 10-4de la
suspension des cellules épithéliales déjà préparée. Après incubation à 37°C pendant 40
minutes, une préparation de frottis et une coloration au cristal violet 0.5% pendant 5 min a
été réalisée pour observer l'adhésion au microscope optique. Le test est considéré comme
positif si le nombre de bactéries adhérées est supérieur à 15.

Ce test sert de témoin pour la comparaison avec le test d’adhésion réalisé après passage de la
bactérie dans les liquides simulant la digestion intestinale.

Pour le test expérimental, c'est-à-dire effet de la digestion sur la capacité d’adhésion, nous avons
procédé comme suit : après passage du contenu buccal vers le contenu stomacal puis le tout vers le
contenu intestinal, nous avons ajouté un volume équivalent en cellule épithéliale de la dilution 10 -4,
le mélange est incubé à 37°C. Après 1h et 2h d’incubation, nous réalisation le même test cité en
haut pour dénombrer les cellules adhérentes.

Après 1h d’incubation et après 2h d’incubation, nous préparons des frottis que nous colorons au
cristal violet 0.5% pendant 5 min, puis nous passons à l’observation microscope pour dénombrer les
cellules bactériennes adhérentes.

29
Résultats et
Discussion
Résultats et Discussion

[Link] de L. plantarum S10 dans un gel d’alginate de sodium à 1%

La souche [Link] est encapsulée dans l’alginate de sodium dont la forme des billes est
de type sphérique ou ovale. La photo 01 illustre une masse des billes obtenues. Après
libération des cellules emprisonnées, nous avons obtenu une concentration finale estimée à
7,33×1013cellules/bille. Le poids d’une bille est en moyenne de 5,67mg.

Photo01 : Photographie des billes d’alginate de sodium à 1%.

[Link] des flavonoïdes

Le dosage des flavonoïdes a été réalisé par la méthode colorimétrique. Nous avons calculé la
teneur en flavonoïdes des différents échantillons (extraits et jus), en utilisant une courbe
d’étalonnage (y = 24,15x + 0,057 ou R² = 0,999) où la quercétine est considérée comme un
standard.

D’après les résultats des teneurs en flavonoïdes illustrés par la figure 04, nous avons constaté
la présence d’une variété des teneurs en ce paramètre, non seulement entre les types des
matières végétales (concombre, fraise), mais aussi entre leurs extraits.

30
Résultats et Discussion

Teneur en flavonoides
3000
2500
µg/100ml

2000
1500
1000
500
0
jus fraise jus concombre extrait fraise extrait concombre
Echantillons

Figure04 : Teneurs en flavonoïdes dans les jus et leurs extraits.

Les résultats présentés dans la figure, montrent que les concentrations en flavonoïdes sont très
différentes. La teneur en flavonoïdes dans le jus de fraise est de 744,53µg/100ml avec une
concentration de 2560µg/100ml pour son extrait. Arizaa et al. (2018) ont trouvé des résultats
proches aux notres avec une concentration en flavonoïdes entre 1983-2960 pour des extraits
méthanolique des fraises.

La teneur en flavonoïdes dans la fraise est supérieure à celle du concombre, ou nous avons
obtenu pour ce légume une teneur allant de 422µg/ml pour le jus et 620µg/ml pour l’extrait.
Carmona-Hernandez et al. (2018) ont montré la présence des concentrations moyennes en
flavonoïdes dans le concombre (640,03µg/ml).

Les différences entre les échantillons peuvent être liées aux conditions climatiques qui
stimulent la biosynthèse des métabolites secondaires tels que les flavonoïdes la région et la
date de récolte ainsi que la méthode d’extraction et les solvants utilisés (Fallah et al ., 2008).

[Link] des polyphénols

Le dosage des polyphénols nous donne une estimation globale de la teneur en différentes
classes des composés phénoliques contenus dans le concombre et la fraise. Le dosage de ces
composés a été réalisé par des réactions chimiques en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu.
Pour calculer les concentrations, nous avons utilisé une courbe d’étalonnage ou l’acide
gallique est considéré comme standard avec l’équation : Y= 0,012X, R2=0,99.

31
Résultats et Discussion

1400
Teneur en polyphénols

1200
mg EAG/100ml

1000

800

600

400

200

0
jus fraise jus concombre extrait fraise extrait
concombre
Echantillons

Figure05 : Teneurs en polyphénols totaux

Les résultats montrent que les composés phénoliques sont abondants dans le jus et l’extrait de
fraise. La teneur élevée en polyphénols dans les extraits est liée à la solubilité élevée des
phénols dans les solvants polaires, grâce à la richesse en groupement hydroxyle (Ghedaba et
al., 2014). D’après les résultats obtenus, la fraise a donné des teneurs plus importantes en
polyphénols totaux, qui varient de 1245mg EAG/100gMS pour l’extrait, 688mgEAG/100ml
pour le jus avec une différence de celles trouvées pour le concombre qui varient de 756 mg
EAG/gMS pour l’extrait et 460mgEAG/ml pour le jus.

Plusieurs facteurs peuvent influencer la teneur en composés phénoliques. Cheurfa et Allen

(2016) ont montré que les facteurs extrinsèques (facteur géographiques et climatiques), les
facteurs génétiques, mais également la maturation de la matière végétale et la durée de
stockage à une forte influence sur le contenu en composés phénoliques.

Nos résultats, présentés précédemment sur la fraise, se concordent et ceux obtenus par
Luthria (2006) qui a trouvé un taux de polyphénols dans l’extrait de fraise de l’ordre de
2903.20 mg EAG/100 g.

III.4.Détermination in vitro de l'activité antioxydante de L. plantarum S10

III.4.1.Résistance au peroxyde d’hydrogène

L'effet du peroxyde d'hydrogène sur l’activité antioxydante de S10 est représenté par la
figure 06. La souche L. plantarum S10 a montré une résistance modérée vis-à-vis des
32
Résultats et Discussion

différentes concentrations d’H2O2 comparativement au résultat obtenu avec le témoin. Les

résultats ont révélé que la souche est capable de tolérer une concentration de 0.4mM d’H2O2,
tandis qu'à 0.7mM, 1.0 mM d’H2O2, la croissance a été réduite avec des densités optiques,
inférieures à 0,65 après incubation pendant 8 h.

2
Absornance à 600 nm

1,5

0,5

0
0 0,4mM 0,7mM 1mM
Concentration en peroxyde d'hydrogène

Figure 6: Effet du peroxyde d'hydrogène sur la viabilité de [Link] S10.

Nos résultats rejoignent ceux de Wang et al .(2009) qui ont trouvé que la souche L.
fermentum peut survivre avec plus de 90% des nombres initiaux des cellules viables après 4 h
d’incubation en présence de peroxyde d'hydrogène à différentes concentrations d’H2O2. Le
mécanisme de la résistance au peroxyde d'hydrogène par différentes souches de
Lactobacillus n’est pas connu ou pas bien établi (Li et al., 2012).

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles

Les résultats de l’activité de piégeage des radicaux hydroxyles par L. plantarum S10 sont
regroupés dans l’annexe. Le résultat a révélé que la souche avait une forte capacité de
piégeage des radicaux hydroxyles, avec un taux d'inhibition de 78. 56 % (1 ml de cellules à
une absorbance de 0.9). Le surnagent de la culture a représenté aussi une capacité modérée
de piégeage des radicaux hydroxyles avec un taux d’inhibition de 44.31%.

Les radicaux hydroxyles sont principalement responsables de la lésion oxydative des

biomolécules, et ceux-ci proviennent principalement de la réaction de Fenton en présence de
2+ 2+
métaux de transition tels que le fer (Fe ) et le cuivre (Cu ). La chélation de ces ions par

33
Résultats et Discussion

certains antioxydants peut inhiber la production de radicaux hydroxyles (Kao et Chen, 2006
). Certaines souches de bactéries lactiques, telle que Bifidobacterium longum15708 (Lin et
Yen, 1999), et [Link] KCTC 3260 (Lee et al ., 2005), ont été signalées comme possédant une
activité antioxydante par l’élimination des ions de ces métaux, autrement dit, pourraient
participer à des réactions de type Fenton génératrices d’hydroxyle radicalaire.

III.4.3. Piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Le résultat a révélé que le surnagent de la culture de [Link] S10 avait une capacité de
piégeage des radicaux hydroxyles, avec un taux d'inhibition de 53.05 %, et la suspension des
cellules a montré une capacité de piégeage des radicaux plus élevée, estimée à 63.22%.

Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par Arasu et al.(2014), ces auteurs ont testé la
capacité d’une souche de [Link] à piéger des radicaux libres et ont trouvé que le taux
d’inhibition du radical libre est égale à 59,88%. Le mécanisme de l'activité peut être due à
l'existence d'enzymes, telles que la NADH-oxydase, la SOD, le peroxyde de NADH et les
catalases non hémiques (Zhang et al., 2010).

[Link] des billes dans une solution de KH2PO4

Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 7. Il apparait qu’entre 2h et 4h d’incubation
des billes dans les solutions KH2PO4 aux pH simulées à ceux de l’estomac et de l’intestin,
l’alginate de sodium a joué un rôle de protection contre ces pH hostiles et pour lesquels, les
DO restent dans des valeurs de limite très proches du point de départ, c'est-à-dire aucune
libération de cellules de [Link] dans le milieu .

Au-delà de 4h d’incubation (temps nécessaire pour la digestion d’un repas), nous constatons
qu’il y à une fragilisation des billes avec probablement une désintégration et libération de
cellules dans les milieux. Au-delà de cette période, il y a une séparation des courbes déjà
tracées en fonction de l’absorbance à 600 nm dont l’absorbance et plus importante avec le
milieu à pH2, puis avec pH3. Avec les milieux simulés à la digestion stomacale, l’effet sur les
capsules est trop prononcé au niveau du milieu pH2 (estomac à jeun) ou, l’absorbance a
connu une augmentation assez importance après 8h et 24h d’incubation, ce qui laisse supposer
qu’il y à une forte libération accompagnée probablement d’une forte dégradation de l’alginate
de sodium. En revanche, nous assistons à une bonne résistance des billes au milieu simulé à

34
Résultats et Discussion

celui de la digestion intestinale ou l’absorbance (DO) a connu une faible augmentation, donc
une faible libération de cellules dans ce milieu.

2,5
absorbance à 600nm

1,5 pH=2
pH=3
1 pH=7

0,5

0
2h 4h 8h 24 h 48h
Temps

Figure7 : Comportement des billes d’alginate de sodium dans des solutions de KH2PO4

On peut déduire de ces résultats, que si la durée de la digestion stomaco-duodénale ne dépasse

pas 4 à 6h, l’alginate de sodium servira de matrice pour délivrer les bactéries probiotiques, à
leur site d’action, l’intestinal .

[Link]é antioxydante des différents extraits

L’activité antioxydante des différents extraits (concombre et fraise) vis-vis du radical DPPH à
été évaluée spéctrophotométriquement en suivant la réduction de ce radical qui s’accompagne
par son passage de la couleur violette à la couleur jaune (Nur et al., 2013).

Les résultats du piégeage du radical libre DPPH sont exprimés en pourcentage d’inhibition du
radical libre (figure8).

35
Résultats et Discussion

100
%d'inhibition du DPPH

80

60

40

20

0
jus de fraise jus de extrait de fraise extrait de trolox
concombre concombre
Echantillons

Figure 8: Pourcentage d’inhibition du radical DPPH◦

D’après les résultats obtenus, nous avons trouvé que l’extrait des fruits de la fraise est le plus
actif avec une activité anti radicalaire importante comparativement à celle de l’antioxydant
utilisé comme standard le Trolox et comparativement à celui du concombre. Ces résultats
peuvent être justifiés par l’étude de Ferrão et al. (2017) qui ont trouvé que les extraits des
fraises ont une forte capacité d’inhibition du DPPH.

D’après les résultats obtenus, la variation du pouvoir antioxydant des extraits pourrait
s’expliquer par la richesse différentielle en polyphénols, selon Turkmen et al. (2007), les
polyphénols semblent être des donateurs efficaces d’hydrogène au radical DPPH, en raison
de leur chimie structurale idéale.

D’après les résultats des dosages des polyphénoles et des flavonoïdes totaux, on peut déduire
que la fraise a un effet anti radicalaire, qui est fort probablement lié à la présence des ces
composés.

[Link] de quelques paramètres de fermentation

[Link] du pH et d’acidité

Avant de lancer la fermentation, le jus brut de concombre a un pH de 5.6, ce résultat est

proche de celui obtenu par Tyagi et al. (2016) (un pH égale à 6 pour le jus du même légume).
Cependant, le jus frais de fraise avait un pH de 4, cette valeur est proche de celle trouvée par
Garzón et Wrolstad (2006) (pH égale à 3,98 pour un jus du même fruit).

36
Résultats et Discussion

Nous trouvons que les valeurs de pH ont diminué au cours de la fermentation du jus de fraise
aussi bien que celui du concombre ensemencés par la culture libre et encapsulée de la souche
[Link] S10. Les figures 9 et 10 résument l’évolution du pH et d’acidité des jus au cours
de la fermentation.

Nous remarquons que la valeur du pH reste inchangée au moment d’ensemencement des jus
par la culture encapsulée, mais l’ensemencement par la culture libre a montré une diminution
de la valeur de pH à 5.4 pour le jus de concombre et à 3.8 pour le jus de la fraise. Après
24heures de fermentation, nous remarquons un abaissement progressif de la valeur de pH des
deux jus ensemencés par la culture libre pour atteindre une valeur de 2.5 pour le jus de
concombre et 1.8 pour le jus de fraise, par contre les valeurs de pH des jus ensemencés par la
même culture encapsulée ont montré une faible diminution pour atteindre après le même
temps d’incubation, 4.1 pour le jus de concombre et 2.9 pour le jus de fraise.

Cette diminution du pH est due au métabolisme de fermentation des matières organiques

présentes dans les jus dont le principal produit de fermentation est l’acide lactique.

La faible diminution de pH des jus ensemencés par la culture encapsulée peut être justifiée par
la faible concentration des cellules dans les jus car les billes ne libèrent pas toutes les
bactéries encapsulées en ces conditions.

140 5
4,5
120
evolution de pHet d'acidité

4
100 3,5

80 3
Acidité culture libre
2,5
60 2 Acidité culture
encapsulé
40 1,5
pHculture libre
1
20 pHculture encapsulé
0,5
0 0
à T0h après 2h après 4h après 6h après 24h

Figure 9 : Evolution du pH et d’acidité au cours de la fermentation de jus de fraise par

culture libre et encapsulée.
37
Résultats et Discussion

120 6

100 5
Evolution du pHet d'acidité
80 4

Acidité culture
60 3 libre
Acidité culture
40 2 encapsulé
pHculture libre
20 1
pHculture
0 0 encapsulé
à T0h après 2h après 4h après 6h après 24h

Temps

Figure 10 : Evolution du pH et d’acidité au cours de la fermentation de jus de concombre

par culture libre et encapsulée.

Les études menées par Sharma et al. (2013), Nosrati et al. (2014) et Reddy et al. (2015)
ont montré que les valeurs de pH diminuent au cours de la fermentation des jus de légumes et
des fruits.

En ce qui concerne l’acidité des échantillons après 24heures d’incubation et d’après les
résultats des figures 9 et 10, nous trouvons que l’acidité des jus augmente au cours de la
fermentation pour atteindre les valeurs de 10g/l pour le jus de concombre fermenté par la
culture libre, 4.7g/l pour le jus de concombre fermenté par celle encapsulée, 12g /l pour le jus
de fraise fermenté par la culture libre et 6.5g/l pour le jus fermenté par la culture encapsulée

Les résultats trouvés après 24h de fermentation par la culture libre sont supérieurs à ceux
trouvés par Lavinia et al. (2012) qui ont obtenu, après le même temps d’incubation une
acidité produite par L. acidophilus dans un jus de concombre de 9.36g/l. En revanche, il est
clair, que l’acidité produite dans les mêmes jus en présence de notre culture encapsulée est
trop faible, par manque de libération de cellules dans les mêmes matrices alimentaires.

La différence dans les résultats est due au statut fermentaire des souches, notre souche à un
statut fermentaire incomparable à celui de souches utilisées dans d’autres études.

38
Résultats et Discussion

[Link] du nombre de cellules

Au cours de la fermentation du jus de fraise et celui du concombre par la culture libre et

encapsulée, le nombre de cellules viables a été suivi et calculé en utilisant le dénombrement
direct sur boite de Pétri (UFC/ml). D’après les résultats des figures 11et 12, il apparait que le
nombre de cellules viables de [Link] augmente durant la fermentation pour atteindre en
fin de fermentation 130×109UFC/ml et 58 ×109UFC/ml pour le jus de fraise et le jus de
concombre fermentés par la culture libre respectivement. Pour les mêmes jus fermentés par
la culture encapsulée, le nombre était de 40×109UFC/ml pour le jus de concombre et 42.3
×109UFC/ml pour le jus de fraise.

L’analyse des courbes montre un phénomène de diauxi, pour lequel, entre 4 et 6h de

fermentation pour les deux jus ensemencés par la culture libre, il y a eu une phase
stationnaire, mais au-delà il y a eu une reprise de la croissance.

Pour les jus fermentés par la culture encapsulée, l’analyse de la courbe montre un manque de
croissance entre 2h à 4h mais au-delà, il y a une reprise de croissance et la duplication de la
souche.

140
unité formant colonie ×109/ ml

120

100

80
libre
60
encapsulée
40

20

0
t 0h t 2h t 4h t6h t 24h
Temps

Figure11 : Evolution du nombre des cellules au cours de la fermentation du jus de

concombre.

39
Résultats et Discussion

90
80
70
60
Titre de l'axe

50
libre
40
encapsulée
30
20
10
0
t 0h t 2h t 4h
Temps t6h t 24h

Figure 12: Evolution du nombre des cellules au cours de la fermentation du jus de

fraise

Nos résultats sont proches de ceux trouvés par Lavinia et al.(2012) et de Reddy et al.(2015)
qui ont montré l’augmentation du nombre de bactéries lactiques durant la fermentation des
légumes et fruits. Dans l’étude menée par Lavinia et al. (2012), la croissance de la souche
[Link] dans le jus de concombre a augmenté pour atteindre 18.6×1014UFC/ml après
8heures de fermentation.

[Link]és antioxydantes de la bactérie après 24heures de fermentation

Ce test avait comme objectifs, la vérification de la perte ou non des activités antioxydante de
la souche véhiculée par deux matrices alimentaires fermentées, le jus de concombre et le jus
de fraise .

III.8.1.Résistance au peroxyde d'hydrogène

L'effet du peroxyde d'hydrogène sur la viabilité de la souche S10 après 24h de fermentation
dans les jus de fraise et de concombre est représenté sur la figure13.

On trouve qu’il y a une amélioration de la résistance de la souche L. plantarum S10 après

24heures de fermentation vis-à-vis de différentes concentrations d’H2O2 par rapport au
témoin, on remarque que l’échantillon de jus de fraise présente une meilleure valeur de la
résistance comparativement à celle de concombre.

40
Résultats et Discussion

Absorbance à600nm
2,5
2
1,5
1
0,5
0
culture témoin
0
0,4mM
0,7mM cuture dans le jus de la
1mM fraise
Peroxyde d'hydrogéne culture dans le jus de
concombre

Figure 13: Effet du peroxyde d'hydrogène sur la viabilité de [Link] S10 après 24h de
fermentation.

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles

Les résultats des pourcentages de piégeage des radicaux hydroxyles après 24 heures de
fermentation des jus par [Link] S10 sont groupés sur la figure 14. Les résultats ont
révélé que la capacité de piégeage de ces radicaux a augmenté, montrant ainsi, un taux
d'inhibition de 95.52% pour l’échantillon de jus de fraise et 80.01% pour l’échantillon de jus
de concombre.
% de piégeage de radicaux

100

80
hydroxyle

60

40

20

0
culture culture dans jus de culture dans jus de
témoin fraise concombre
Echantillons

Figure 14: Pourcentage de piégeage de radical hydroxyle après 24h de fermentation des jus
par L. plantarum S10

41
Résultats et Discussion

[Link]égeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Les résultats des pourcentages de piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-
picrylhydrazyl après 24 heures de fermentation des jus par L. plantarum S10 sont illustrés
par la figure 15.
La lecture des résultats obtenus, montre que la culture du jus de fraise donne la meilleure
activité d'inhibition avec un pourcentage de piégeage des radicaux libres de 75.06%. De
même, la même culture ayant servi à la fermentation du jus de concombre a donné une
capacité de piégeage des radicaux de 66.23%. En revanche, la culture témoin a donné le
plus faible pourcentage d’activité anti radicalaire.
% de piéagae de radicaux libre DPPH

76
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
culture témoin culture dans jus de culture dans jus de
fraise concombre
Echantillons

Figure 15: Pourcentage de piégeage de radicaux libres DPPH après 24h de fermentation des
jus par [Link] S10

L’augmentation des activités antioxydants de la bactérie peut être due aux augmentations du
nombre des cellules au cours de la fermentation (24heures) avec une contribution probable
des composés contenus dans les jus. L’étude menée par Lin et al. (2012) a montré que les
valeurs des différents tests d’activité antioxydante y compris la résistance aux peroxyde
d’hydrogène, l’inhibition de radical hydroxyle et libre ont augmenté avec l’augmentation
de la concentration en cellules de Lactobacillus au cours de la fermentation.

42
Résultats et Discussion

[Link] digestion bucco-gastro-intestinale in vitro

[Link] et viabilité de la culture libre et encapsulée après les phases de la

digestion

L'effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules libres et encapsulées est
représenté sur les figures 16 et 17.

500

400
×10 9 UFC /ml

300

200

100

0
sans après après après
culture libre
traitement digestion digestion digestion
orale gastrique intestinale
culture
encapsulé
Echantillons

Figure16 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de [Link] S10
libres et encapsulées (UFC/ml)

500

400
×1013 cellule/ml

300

200

100

0
sans après après après culture libre
traitement digestion digestion digestion
orale gastrique intestinale culture
Echantillons encapsulé

Figure17 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de

[Link] S10 libres et encapsulées (cellules/ml).

43
Résultats et Discussion

Les résultats des figures 16 et17 montrent que la souche [Link] S10 est résistante aux
conditions similaires de la digestion orale (la présence de α-amylase (75U/ml et pH de 7)
après 2min d’incubation avec un pourcentage de survie égale à 61.9%. Après la digestion
stomacale, nous constatons une réduction de la survie qui est reflétée par une diminution de
la population cellulaire, de même, il se trouve qu’après digestion intestinale, le nombre a
baissé mais la survie reste toujours.

Par ailleurs, la souche encapsulée dans l’alginate de sodium à 1% a passé par les mêmes
conditions de la digestion bucco-gastro-intestinale dont les résultats de dénombrement
montrent une protection de la souche contre ces conditions et le pourcentage de la survie est
égale à 35% contre 15% obtenu avec les cellules de la culture libre.

Les résultats obtenus avec la culture libre et encapsulée, rejoignent ceux de Cai et al. (2014)
qui ont trouvé que l’encapsulation de la souche L. acidophilus CGMCC1.2686 dans une
matrice d’alginate de sodium a augmenté la survie de cette dernière aux conditions de la
digestion par un pourcentage de 22%.

D’après les résultats, il est très remarquable qu’au niveau de digestion gastrique, la matrice
utilisée pour le processus de l’encapsulation a permis la libération du plus grand nombre de
cellules (environ 80% des cellules sont libérés des billes).

[Link] et viabilité de la culture libre et encapsulée à T= 0h dans les jus

III.9.2.1. Survie dans le jus de fraise

L'effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de la culture libre et

encapsulée à T= 0h est représenté sur les figures 18 et 19.

Les résultats montrent que les méthodes appliquées ont donné des résultats différents mais
sans contradiction. Il apparait, qu’avec la numération cellulaire, le nombre de cellules obtenu
après les trois phases de digestion est presque stable comparativement au témoin
(16×1013cellule/ml). Pour la culture encapsulée, le nombre de cellules libéré au cours des
trois phases de digestion a chuté en phase orale (10×1013cellule/ml).et il a connu une
augmentation graduelle au cours du reste des phases de digestion (29,66×1013cellule/ml)
après la phase gastrique et de (45,9×1013cellule/ml) après la phase intestinale.

Par ailleurs, la numération en UFC par ml, montre une bonne concordance des résultats avec
une bonne survie des cellules libres au cours des trois phases de digestion, de même, il y a

44
Résultats et Discussion

une reproduction des résultats avec les cellules encapsulées ou, il y à une faible viabilité
(63×109 UFC/ml ) en phase buccale, puis on assiste à une augmentation de la libération des
cellules sous l’effet des conditions qui règnent au niveau stomacale(190,5×10 9 UFC/ml) et
intestinale(410,5×109 UFC/ml) et qui s’est traduit par une augmentation du nombre d’UFC

80
70
60
×1013cellules/ml

50
40
30
20
10
0
sans traitement après digestion après digestion après digestion
orale gastrique intestinale
Echantillons culture libre
cultureencapsulé

Figure 18 : Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre et

encapsulée ensemencée dans le jus de fraise (cellules/ml)

500
450
400
350
×10 9UFC/ml

300
250
200
150
100
50
0
sans après après après culture libre
traitement digestion digestion digestion
orale gastrique intestinale cultureencapsulé
Echantillons

Figure19: Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre

et encapsulée ensemencée dans le jus de fraise (UFC/ml).

45
Résultats et Discussion

[Link] dans le jus de concombre

L'effet de la digestion sur la viabilité et la survie des cellules de la culture libre et

encapsulée à T= 0h est représenté sur les figures 20et 21.

Les résultats des figures 20, 21 montrent qu’il y a un taux de survie de [Link] S10
libre et encapsulée dans le jus de concombre presque comparable à celui trouvée avec le
témoin (90%) et ce au cours des trois phases de digestion.

Il est remarquable, que pour les cellules encapsulées, la digestion intestinale a permis la
libération d’un bon nombre de cellules emprisonnées dans la matrice (460 ×10 9 UFC/ml) et
de (60×1013céllule /ml), ce qui laisse supposer que cette composition permet la détérioration
de la matrice d’encapsulation, ce qui libère les cellules de [Link] S10 avec un taux de
survie important que se soit exprimé par rapport aux UFC/ml ou en Cellules/ml

80
70
60
×1013cellule/ml

50
40
30
20
10
0
sans traitement après digestion après digestion après digestion
orale gastrique intestinale
Echantillons culture libre
cultureencapsulé

Figure20: Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre et

encapsulé ensemencé dans le jus de concombre (Cellules/ml).

46
Résultats et Discussion

500

400
×10 9UFC/ml

300

200

100

0
sans traitement après digestion après digestion après digestion
culture libre
orale gastrique intestinale
Echantillons cultureencapsulé

Figure21: Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre et

encapsulé ensemencé dans le jus de concombre (UFC/ml)

[Link] et viabilité de la culture après 24 h de fermentation

[Link] de la culture libre et encapsulée après 24heures de fermentation dans le

jus de fraise

D’après les résultats de la figure 22, après 24heures de fermentation du jus de fraise par la
souche [Link] S10 libre, on remarque que le taux de survie a diminué au cours des
phases de digestion (50%), cela peut s’expliquer par l’effet inhibiteur des composés entrant
dans la formulation de ce type de liquides simulant les conditions de digestion. Ajouter à
cela, l’effet de l’acide lactique produit par la souche lors de la fermentation et qui peut causer
des dommages pariétaux.
En revanche, il apparait que pour la souche encapsulée, le taux de survie a connu une
augmentation en fonction de chaque étage digestif, pour laquelle, nous constatons une
libération de cellules plus importante au niveau intestinale (43%).

47
Résultats et Discussion

70

60

50
×10 13 cellule/ml

40

30

20

10

0
sans après digestion après digestion après digestion
traitement orale gastrique intestinale
culture libre
Echantillon
cultureencapsulé

Figure22: Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre et

encapsulée après 24heures de fermentation du jus de fraise

[Link] de la culture libre et encapsulée après 24 h de fermentation du jus de

concombre

Après 24 heures de fermentation de jus de concombre par la souche [Link] S10 libre
(figure 23), nous remarquons que le taux de survie a diminué environ (40%) à cause
probablement de la production de métabolites fermentaires comme l’acide lactique,
cependant, pour la souche encapsulée, l’effet protecteur de l’alginate de sodium apparait
très clairement pour lequel, la libération de cellules dans les différents contenus de digestion
a connu une augmentation graduelle pour atteindre un maximum au niveau intestinal, lieu
d’exercer les fonctions probiotiques demandées d’une souche.

48
Résultats et Discussion

80
70
60
×1013cellules/ml

50
40
30
20
10
0
sans traitement après digestion après digestion après digestion culture libre
orale gastrique intestinale
cultureencapsulé
Echantillons

Figure23: Effet de la digestion sur la viabilité et la survie de [Link] S10 libre et

encapsulée après 24heures de fermentation du jus de concombre.

Enfin, d’après les résultats de la survie de la bactérie après T=0h dans les jus et celles de 24h
de la fermentation des jus on trouve une augmentation similaire de la survie et de la
viabilité cellulaire après T= 0h et 24h de fermentation par rapport à celle trouvée avec les
cultures témoins (libre et encapsulée). Avec des pourcentages de survie plus élevés pour la
bactérie dans les jus après 24 heurs de fermentation.

[Link] de l’activité antioxydante de la bactérie après digestion bucco-gastro-

intestinale

[Link]é de piégeage des radicaux hydroxyles

L’effet de la digestion in vitro sur le pourcentage de piégeage d'hydroxyle est illustré par la
figure 24. Les résultats ont révélé que la capacité de piégeage des radicaux hydroxyles a
diminué au cours du passage de cette dernière dans les conditions similaires de la digestion
in vitro, avec une diminution de 50% du taux d’inhibition. Cela dit, il est fort probable que
la perte en cellules est la cause de cette perte en activité.

49
Résultats et Discussion

%d'inhibition de radical 80
hydroxyle
60

40

20

0
culture témoin digestion orale digestion digestion
gastrique intestinal
Echantillons

Figure 24: Pourcentage de piégeage de radical hydroxyle après digestion in vitro.

[Link]égeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Les résultats du pourcentage de piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl
du L. plantarum S10 après digestion in vitro sont illustrés par la figure 25.

D’après les résultats de cette figure, après les trois phases de la digestion bucco-gastro-
intestinal, le pourcentage de piégeage a connu une diminution pour aboutir à un pourcentage
de 19%, ces résultats montrent clairement qu’il y a une forte perte en capacité d’inhibition de
radical libre DPPH.
%d'inhibition de radical libre

70
60
50
DPPH

40
30
20
10
0
culture témoin digestion orale digestion gastrique digestion intestinal
Echantillons

Figure 25: Pourcentage de piégeage de radicaux libres DPPH après digestion in vitro.

Nos résultats de l’évaluation de l’activité antioxydante de la bactérie après digestion bucco-

gastro-intestinale, sont similaires à ceux de Li et al. (2012) qui ont trouvé également une

50
Résultats et Discussion

diminution d’environ 80% de l’activité antioxydante d’une souche [Link] après les
différents traitements (pH bas, traitement par la pepsine et autres enzymes).

Certains auteurs ont montré que l'activité antioxydante de quelques souches de bactéries
lactiques peut être attribuée à la production de composés de surface cellulaire, par exemple,
des polysaccharides extracellulaires produits par Lactococcus lactis subsp. lactis 12 ( Pan et
Mei, 2010 ) et Bifidobacterium animalis RH ( Xu et al., 2011 ) et la présence de l'acide
lipotéichoïque sur la surface des bifidobactéries ( Yi et al., 2009 ).

Notre étude laisse supposer que les protéines de surface cellulaire ou des polysaccharides de
L. plantarum S10 sont impliqués dans l'activité antioxydante de cette souche, car la présence
des enzymes tels que la pepsine et la pancreatine provoque la suppression de ces composés
de surface cellulaire qui a entraîné par la suite une diminution significative de la capacité de
l’activité de la souche.

[Link] in-vitro des extraits

Ce test a été réalisé par le dosage des polyphénols et des flavonoïdes après chaque phase de
digestion, l'effet de la digestion sur la bioaccessibilité des composés actifs (polyphénols,
flavonoïdes) est représenté sur les figures 26et 27.

1400
polyphénoles totaux mg

1200
EAG/100ml

1000

800

600

400

200

0
extrait fraise
sans trait orale gastrique intestinal
Traitements extrait
concombre

Figure 26 : Effet de la digestion in vitro sur la bioaccessibilité des polyphénols.

51
Résultats et Discussion

3000

2500
flavonoide (µg/100ml)

2000

1500

1000

500

0
sans traitement orale gastrique intestinal
Traitements extrait fraise
extrait concombre

Figure 27: Effet de la digestion in vitro sur la bioaccessibilité des flavonoïdes.

Selon les résultats des figure 26 et 27, la teneur en flavonoïdes et en polyphénols est en
diminution continue, il est a constater que les extraits bruts renferment des teneurs en
polyphénols et flavonoïdes élevés, après la digestion bucco-gastro-intestinale in vitro la teneur
en ces molécules bioactives a connu une diminution, c’est-à-dire la digestion a affecté la
bioaccessibilité des ces composés.

Ces résultats peuvent être justifiés par Ariza et al. (2018), qui ont rapporté que la digestion in
vitro a un effet direct sur les micronutriments (polyphénols, flavonoïdes) dont elle contribue à
la perte de ces composés par un phénomène d’oxydation.

[Link] in-vitro en combinant bactéries libres/extraits (du concombre et de

fraise)

Les résultats de la survie et la viabilité de la bactérie en présence de l’extrait (fraise,

concombre) après chaque phase de digestion sont groupés sur les figures 28 et 29.

D’après les résultats de la survie de la bactérie libre combiné avec les extraits dans des
conditions similaires de la digestion, nous remarquons qu’au niveau buccal, aucune
différence n’a été observée comparativement aux résultats témoins, cependant au niveau
gastrique, il y a une diminution du nombre de cellules qui était de 25× 1013 cellules /ml en
présence de l’extrait de fraise et 22,33× 1013cellules/ml en présence de l’extrait de concombre.
Par ailleurs, la digestion intestinale, il y a une bonne survie de [Link] en présence de
l’extrait de la fraise (180× 109 UFC/ml) comparativement à celle obtenue en présence de
l’extrait du concombre (120 × 109UFC/ml).

52
Résultats et Discussion

Le maintient de la survie à un nombre appréciable peut être justifié par la capacité de notre
bactérie à métaboliser les substances bioactives présentes dans les extraits.

25

20
×1013cellules/ml

15

10

0
sans traitement après digestion après digestion après digestion extrait fraise
orale gastrique intestinale
extraitconcombre
Traitements

Figure28 : Effet de l’extrait sur la viabilité et la survie des cellules libres de [Link]
S10 au cours de la digestion in vitro (cellules /ml).

400
350

300
×10 9 UFC/ml

250

200
150

100

50

0
sans traitement après digestion après digestion après digestion extrait fraise
orale gastrique intestinale
extraitconcombre
Traitements

Figure 29: Effet de l’extrait sur la viabilité et la survie des cellules libres de [Link]
S10 au cours de la digestion in vitro (UFC/ml).

53
Résultats et Discussion

[Link] des polyphénols et flavonoïdes après les phases de digestion

Les résultats des dosages après les phases de la digestion sont illustrés dans les figures 30
et 31.

Il apparait que la teneur en composés phénoliques et flavonoïdes a diminué d’une manière

plus élevée comparativement à celle obtenue avec la digestion des extraits, cela confirme qu’il
y a une dégradation des ces composés par la bactérie [Link] S10.

L’analyse des résultats de la digestion montre une perte en flavonoïdes avec les deux
combinaisons « extrait de fraise- [Link] » et « extrait de concombre -[Link] »,
pour aboutir au niveau intestinal à une concentration de 530µg/100ml avec la première
combinaison et 60,66µg/100ml avec la deuxième combinaison.

Par ailleurs, le même constat a été noté à l’égard de l’effet de la digestion sur l’évolution de la
teneur en poly phénols, pour les deux combinaisons. Après la digestion intestinale, la
concentration en ces composés était de 266 mg EAG/100ml avec la combinaison « extrait de
fraise- [Link] » et de 35 mg EAG/100ml avec la combinaison « extrait de concombre-
[Link] »
teneur en flavoniodes µg/100ml

3000

2500

2000

1500

1000

500

0
sans traitement orale gastrique intestinal
extrait fraise
Echantillons
extrait concombre

Figure30 : Effet de la digestion in vitro sur la teneur en flavonoïdes (µg/100ml).

Nos résultats, rejoignent ceux de Pacheco-Ordaz et al. (2017) qui ont montré que les
composés phénoliques représentent des prébiotiques pour les bactéries probiotiques et que

54
Résultats et Discussion

l’incubation des composés phénoliques avec les souches [Link] GG et L. acidophilus

a permis de maintenir leurs survie et viabilité.

1400

1200
Teneur en polyphénols

1000
mg EAG/100ml

800

600

400

200

0
sans traitement orale gastrique intestinal extrait fraise
Echantillons
extrait
concombre

Figure 31 : Effet de la digestion in vitro sur la teneur en polyphénols (mg EAG/100ml).

[Link] d’adhésion in- vitro aux cellules épithéliales du poulet

Les difficultés liées à l’étude de l’adhésion des bactéries in vivo ont conduit à développer des
modèle d’adhésion in vitro (Kos et al., 2005). Avant la réalisation du test, nous avons
confirmé que nos cellules épithéliales sont indemnes de contaminants par une coloration,
suivie d’une observation microscopique dont la photographie 2 illustre que le tissu est
dépourvu de contaminants.

55
Résultats et Discussion

Photo02 : Photographie des cellules épithéliales témoins (grossissement × 40)

Pour le test témoin, nous avons obtenu un nombre de cellules adhérentes de 120. Par ailleurs,
pour les résultats du test expérimental, nous avons eu après 1h de digestion intestinale, un
nombre de cellules adhérentes de 70, après 2h de digestion intestinale, nous avons compté 50
cellules de [Link] adhérentes.

En analysant les résultats obtenus (figure 32), nous pouvons conclure que la digestion bucco-
gastro-intestinale affecte la capacité de [Link] à adhérer aux cellules épithéliales.

120

100
Nombre des cellules

80

60

40

20

0
MRS témoin après 1h dans la phase après 2h dans la phase
intestinal intestinal

Figure 32: Nombre de cellules adhérées aux cellules épithéliales (culture ré-isolée du liquide
intestinal de la digestion).

56
Résultats et Discussion

La photo 03 représente l’observation microscopique des cellules adhérées aux cellules

épithéliales.

Cellules
adhérentes

Photo 03 : Photomicrographie d’adhésion de [Link] S10 (culture témoin) aux cellules

épithéliales (grossissement × 100).

Le nombre des cellules adhérées aux cellules épithéliales après phase intestinale sont illustrés
par la photo 04.

Cellules
adhérentes

Photo 04 : Photomicrographie d’adhésion de [Link] S10 aux cellules épithéliales après

2 h d’incubation dans la phase intestinale (grossissement × 100).

57
Conclusion
Conclusion

D’après les résultats obtenus L. plantarum S10 est résistante aux conditions de digestion
bucco-gastro-intestinale. Cette dernière peut survivre aux conditions hostiles pour arriver au
niveau intestinal à un niveau de population important. Cette souche répond à un critère de
sélection de souche probiotique, la survie.

La micro encapsulation par l’alginate de sodium a contribué fortement à l’amélioration du

taux de survie de [Link], en la protégeant contre les activités enzymatiques, les bas pH,
les sels biliaires et la pancréatine.

Les résultats ont montré que la matrice jus de concombre améliore la survie de la souche
[Link] S10 au cours de la fermentation et lors du passage à travers les trois cavités
simulées, par contre la survie est moins appréciée avec le jus de fraise.

Notre souche a une bonne activité antioxydante. Elle montre une bonne résistance au
peroxyde d’hydrogène, peut piéger les radicaux hydroxyles ainsi que ceux libres 2,2-
diphényl-1-picrylhydrazyl. Cette activité a été démontrée dans les jus de fraise et de
concombre, après digestion en conditions simulant les tractus digestif et en présence des
extraits des deux matrices alimentaires.

La combinaison bactéries libres - extraits de fraise ou de concombre et leur passage dans le

liquide simulant la digestion montre une bonne survie de [Link] avec une évolution du
statut des poly phénols et des flavonoïdes d’un segment intestinal à l’autre.

Les résultats du test d’adhésion ont montré que la digestion bucco-gastro-intestinale affecte la
capacité de [Link] à adhérer aux cellules épithéliales.

Les résultats de notre recherche permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives pour compléter
ce travail, ainsi nous proposons :
-Une évaluation in vivo de la survie et de la viabilité de cette souche dans le tube digestif.

- Une évaluation in vivo de leur profil antioxydant.

58
Références
 A

Adriouch S , Kesse-GuyoE , Hercberg S ,Touvier M , Fezeu L K ,2017. Association entre

les apports en polyphénols et le risque de maladies cardiovasculaires : résultats d’une étude
prospective sur 84 000 adultes français ,Nutrition Clinique et Métabolisme ,31(3), 238-240.

Afify A M, Ramy M , Shaimaa R I M, Sultan M, Hussein M,[Link] activity

and biological evaluations of probiotic bacteria strains. International Journal of Academic
Research Part A, 4(6), 131-139.
Ahire J.J, Mokashe N U, Patil H J, Chaudhari B L,2013. Antioxidative potential of folate
producing probiotic Lactobacillus helveticus CD6. J Food Sci Technol , 50, 26–34.
Ait Seddik H, Bendali F, Gancel1 F, Fliss I , Spano G , Drider1 J,[Link]
plantarum and Its Probiotic and Food Potentialities. Probiotics & Antimicro Prot, 9,111–122.
Alexandre Y, Le Blay G , Boisramé-Gastrin S, Le Gall F, Héry-Arnaud G , Gouriou S,
... et Le Berre R,2014. Probiotics: A new way to fight bacterial pulmonary infections? .
Médecine et Maladies Infectieuses, 44(1), 9-17.

AOAC , 2000 .official Methods of Analysis .17thED .Maryland .U .S .A .360 .

Asemi Z, Zare Z, Shakeri H ,Sima-sadat S, Esmaillzadeh H ,[Link] of Multispecies

Probiotic Supplements on Metabolic Profiles, hs-CRP, and Oxidative Stress in Patients with
Type 2 Diabetes . Ann Nutrition and Metabolisme ,63,1–9.
Ariza T A ,Patricia R ,Lucía C, Carmen S, Elsa M , Carmen Go , Beatriz C , Maurizio
B, Jesús S,2018. Bioaccessibility and potential bioavailability of phenolic compounds from
achenes as a new target for strawberry breeding programs, Food Chemistry, 248 155–165

B
Basu A, Nguyen A, Betts N M, Lyons TJ,2014. Strawberry as a functional food: an
evidence-based review. Crit Rev Food Sci Nutr ,54(6), 790−806.
Behnsen J , Deriu E , Sassone-Corsi M, Raffatellu M, 2013. Probiotics: properties,
examples and specific applications.

Borriello P , Hammes W , W. Holzapfel, Marteau P , Schrezenmeir J , Vaara M , and.

Valtonen V, 2002. “Safety of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria.,” Clinical
infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America,36,
775–780,
Bermudez-Brito M, Plaza-Diaz J ,Munoz-Quezada S, Gomez-Llorente C ,Gil
A,[Link] mechanisms of action. Annals of Nutrition and Metabolism, 61( 2), 160–
174.
Boizot N, Charpentier J P ,2006. Méthode rapide d’évaluation du contenu en composés
phénoliques des organes d’un arbre forestier. Le Cahier des Techniques de 11INRA, Numéro
spécial 2006: Méthodes et outils pour 1’observation et l’évaluation des milieux forestiers,
prairiaux et aquatiques, 79-82.
Botes M, van Reenen CA , Dicks L M T,2008. Evaluation of Enterococcus mundtii ST4SA
and Lactobacillus plantarum 423 as probiotics by using a gastro-intestinal model with infant
milk formulations as substrate. International Journal of Food Microbiology ,128, 362-370.
Bourlioux P ,2014. Actualité du microbiote intestinalCurrent view on gut microbiota.
Annales Pharmaceutiques Françaises, 72(1), 2014, 15-21.

Brand-Williams W, Cuvelier M E, Berset C, 1995. Use of a free radical method to evaluate

antioxidant activity. LWT-Food science and Technology ,28(1):25-30.
Breidt F , Caldwell J M ,2011. Survival of Escherichia coli O157 :7 in cuncumber
Fermentation Brines .Journal of food science ,76,198-203.
Buchmeier N , Bossie S , Chen C Y , Fang F C , Guiney D G, Libby S J,1997 . a
transcriptional regulator of Salmonella typhimurium, is required for resistance to oxidative
stress and is expressed in the intracellular environment of macrophages. Infection and
Immunity, 65, 3725–3730.

Butel M. J ,2014a. Les probiotiques et leur place en médecine humaine. Journal des Anti-
infectieux, 16(2), 33-43.
Butel M. J ,2014b. Probiotic .gut microbiota and health.

Cammarota G , Ianiro G , Bibbo S , Gasbarrini A ,2014 .Gut microbiota modulation:

probiotics antibiotics or fecal microbiota transplantation. Intern Emerg Med 9:365–373.
Canani H. J, Flint S, Salminen , 2014. Expert consensus document : The International
Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and
appropriate use of the term probiotic. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 11(8),
506–514.
Carlos J, Hernandez C, Ceballos-López L M , González-Correa C H, [Link]
and Flavonoids in Colombian Fruit and Vegetables - Applications and Benefits: A Review.”
.Journal of Food and Nutrition Research, 6(3), 176-181.

Caselli M F, Cassol G C , Holton J, Zuliani G , Gasbarrini A,2013. Actual concept of

"probiotics" : Is it more functional to science or business .World journal of gastroenterology :
WJG, 19 (10), 1527.
Chang MH, Hong SF, Chen JH, Lin MF, Chen CS, Wang SC, 2016. Antibacterial activity
Lactobacillus plantarum isolatedfrom fermented vegetables and investigation of the
plantaricin genes. Afr J Microbiol Res ,10,796–803.
Chen C Y O , Robles-Sanchez M , Gonzalez-Aguilar G A, 2014. Phenolic compounds:
Their journey after intake. Food & Function, 5(2), 189–197.
Cheurfa M, Allem R, 2016. Évaluation de l’activité anti-oxydante de différents extraits des
feuilles d’Aloysia triphylla. Phytothérapie , 14(3),181-187.
Chiha F, Benkara Y, Sellami A , Karouche S, [Link] Oxydant : influence d’une
complémentation nurtitionnelle en antioxydant et adaptational exercice physique. Science
humains 45(B), 52-63

Chu Y F, Sun J, 2002. Antioxidant and antiproliferative activities of common vegetables. J

Agric Food Chem ,50 (6),6910-6.
Collins J,2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin : correlation
with in vivo findings. The American journal of clinical nutrition, 73( 2), 386s–392s.

Daglia M ,2012 .Polyphénols en tant qu'agents antimicrobiens. Opinion actuelle en

biotechnologie , 23( 2) 174-181

De LeBlanc A M ,LeBlanc J G, Perdigon G, Miyoshi A, Langella P, Azevedo V, Sesma

F,2008. Oral administration of a catalase-producing Lactococcus lactis can prevent a
chemically induced colon cancer in mice. J. Med. Microbiol,57, 100–105.
De Prisco A, Mauriello G, [Link] of foods: A focus on microencapsulation
tool. Trends in Food Science & Technology , 48 ,27-39.
De Vries M C , Vaughan E E , Kleerebezem M, de Vos W M, 2006. Lactobacillus
plantarum survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract.
International Dairy Journal, 16, 1018-1028.

Drouault S , Corthier G ,2001 . Health effects of lactic acid bacteria ingested in fermented
milk. Vet Res. 32(2): 101-17.
Duda-Chodak ,2012 . The inhibitory effect of polyphenols on human gut microbiota.
Dunne C L, Murphy L., Thornton G, Morrissey D., Halloran S. , Feeney M., Flynn S ,
G. Fitzgerald, C. Daly B, Shanahan F, Collins S, (2001). In vitro selection criteria for
probiotic bacteria of human origin : correlation with in vivo findings. The American journal of
clinical nutrition, 73, , 386–392.

Erattea D, Dowlinga K , Barrowb CJ, Adhikaric B, [Link] advances in the

microencapsulation of omega-3 oil and probiotic bacteria through complex coacervation: A
review .Trends in Food Science & Technology,17,121-131

Falah S, Suzuki T, Katayama T, 2008. Chemical constituents from Swietenia macrophylla

bark and their antioxidant [Link] J Biol Sci .
FAO/WHO, [Link] on Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health
and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid
Bacteria.

Garcia E F , Luciano WA , Xavier D E, Whyara C , Da Costa A , Oliveira DS ,

Franco OL, Marcos A , Júnior DM, Brígida T L ,Lucena R, Picão C, Serela MM, de
Souza LE ,2016 .Identification of Lactic Acid Bacteria in Fruit Pulp Processing Byproducts
and Potential Probiotic Properties of Selected Lactobacillus Strains .Frontier in
Microbiologie ,30,150-155.
Georgé S, Brat P, Alter P, Amiot MJ,2005. Rapid determination of polyphenols and
vitamin C in plant-derived [Link] of agricultural and food chemistry, 53(5),1370-
1373.
Ghadimi D, Folster H , De vrese M ,Winkler P ,Heller KJ ,Schrezenmeie J,2008.. Effects
of probiotic bacteria and their genomic DNA on TH1/TH2-cytokine production by peripheral
blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy and allergic subjects. Immunobiology. 213 :
677–692.
Ghedadba N, Bousselsela H, Hambaba L, Benbia S, Mouloud Y, 2014. Evaluation de
l’activité antioxydante et antimicrobienne des feuilles et des sommités fleuries de Marrubium
vulgare L. Phytothérapie , 12(1),15-24.
Ghedadba N, Hambaba L, Ayachi A, Aberkane M, Bousselsela H, Oueld-Mokhtar S,
2015. Polyphénols totaux, activités antioxydante et antimicrobienne des extraits des feuilles
de Marrubium deserti de Noé. Phytothérapie .13(2) ,118-129.
Golowczyc M A , Silva J , Teixeira P , De Antoni G L , Abraham A G , 2011. Cellular
injuries of spray-dried Lactobacillus spp. isolated from kefir and their impact on probiotic
properties. International Journal of Food Microbiology, 144, 556-560.
Cömert, E. D., & Gökmen, V. (2017). Antioxidants bound to an insoluble food matrix:
Their analysis, regeneration behavior, and physiological importance. Reviews in Food Science
and Food Safety, 16(3), 382–399

H
Hamia C , Guergab A , Rennane N , Birache M , Haddad M , Saidi M , Yousfi M,2014.
Influence des solvants sur le contenu en composés phénoliques et l'activité antioxydante des
extraits du rhanterium adpressium. Annales des sciences et technologie, 6 ( 1),22-27.
Heleno S A, Martins A , Queiroz M J R P , Ferreira I C. F R,2015. Bioactivity of
acids: Metabolites versus parent compounds: A review. Food Chemistry,
Heo S J , Park J E, Lee K W , Jeon YJ, 2005. Antioxidant activities of enzymatic extracts
from brown seaweeds. Bioresource Technology, 96(4) ,1529-1632.
 I

Idoui T ,2013 .Changes of microbial Population and Some Composition in Carrot Juice
During Fermentation With Selected Autochthonous Lactobacillus fermentum SK5 isolated
from vagina of a healthy woman . Clinicl microbiology ,333,1-8

Iravani S , Korbekandi H, Mirmohammadi SV ,[Link] and potential

applications of probiotic encapsulation in fermented milk products .J Food Sci Technol, 6,3-6.

Jamaly N, Benjouad A, Bouksaim M, 2011. Probiotic potentital of Lactobacillus strains

isolated from known popular traditional Moroccan dairy products. British microbiology
research Journal,1(4) 79-94.
Jiménez-Pranteda, M L , Poncelet D , Náder-Macías M E , Arcos A , Aguilera M.,
Monteoliva-Sánchez M , Ramos-Cormenzana A,2011. Stability of Lactobacilli
encapsulated in various microbial polymers. Journal of Bioscience and Bioengineering.
Jose NM, Bunt CR, Hussain M A , 2015. Comparison of microbiological and probiotic
characteristics of lactobacilli isolates from dairy food products and animal rumen contents.
[Link] of Physiology and Pharmacology, 63, 497–503.

Kao T , Chen B ,2006 . Functional components in soybean cake and their effects on
antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 7544–7555.

Kawabata K, Sugiyama Y., Sakano T., Ohigashi, H. (2013). Flavonols enhanced

production of anti-inflammatory substance(s) by Bifidobacterium adolescentis:
Prebiotic actions of galangin, quercetin, and fisetin. BioFactors, 39, 422–429.

Karlund A, Hanhineva K, Lehtonen M, Karjalainen R, Sandell M,2015. Nontargeted

metabolite profiles and sensory properties of strawberry cultivars grown both organically and
conventionally. J Agric Food Chem. 63(3): 1010-19

Kenny H, Smidt E, Mengheri, Miller B, [Link] – do they have a role in the pig
key factor in the therapeutic effects of polyphenols. Biochemical Pharmacology, 3,198–212.
Khemariya P, Singh S, Jaiswal N, Chaurasia SNS ,2016. Isolation and identification of
Lactobacillus plantarum from vegetable samples. Food Biotechnol, 30,94–62.
Klaenhammer T R, et Kullen M J, 1999. Selection and design of probiotics. International
journal of food microbiology, 50( 1), 45–57.
Kos B, Suskovic J, Vukovic S, Simpraga M , Frece J Matosic S,[Link] and
aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92 .Journal of applied
microbiology,94,981-987.

Lavinia B C , ManeaI ,Bratu M G , Avram D , Nicolescu C L ,2012 .Evaluation of the

cabbage and cuncumber juices as substrate for lactobacillus acidophilus LA-5 .Romanian
biotechnological Letters ,17 ,7418-7429.

Le Blanc J G, Del Carmen S, Miyoshi A. Azevedo V ,Sesma F, Langella P, Bermudez-

Humaran L, Watterlot L, Perdigon G,2011. Use of superoxide dismutase and catalase
producing lactic acid bacteria in TNBS induced Crohn’s disease in mice. J. Biotechnol, 151,
287–293.
Lee J , Hwang K , Chung M , Cho D , Park C,2005. Resistance of Lactobacillus casei
KCTC 3260 to reactive oxygen species (ROS): Role for a metal ion chelating effect. Journal
of Food Science, 70, 388–391.

Li S , Zhao Y , Zhang L, Zhang X, Huang L, Li D, Niu C, Yang Z , Wang

Q ,[Link] activity of Lactobacillus plantarum strains isolated from traditional
Chinese fermented foods .Food Chemistry ,135 1914–1919.
Lin T Y , Chien M F C,2007. Exopolysaccharides production as affected by lactic acid
bacteria .Food Science And Technology-New York-Macel Dekker , 139,175-198.

Lin M , Yen C,1999 . Antioxidative ability of lactic acid bacteria. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 47, 1460–1466.

Lopez M , LI N , KATARIA J , RUSSELL M. , NEU J,2008. Live and ultraviolet-

inactivated Lactobacillus rhamnosus GG decrease flagellin-induced interleukin-8 production
in Caco-2 cells. Journal of Nutrition,138 , 2264–2268.
Loveleen K S ,Arora M ,2015. Probiotics, Prebiotics and Microencapsulation - A Review,
Critical .Science and Nutrition Luthria D L,2006. Significance of sample preparation in
developing analytical methodologies for accurate estimation of bioactive compounds in
functional foods. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86(14), 2266–2272.

Maleki D, Azizi A, Vaghef E, Balkani S, Homayouni A,[Link] of Increasing

Probiotic Survival in Food and Gastrointestinal Conditions. Prensa Med Argent, 10,14-20

Manach , Williamson Morand C, Scalbert A, Rémésy C,2005 . Bioavailability and

bioefficacy of polyphenols in human ;Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin
Nutr.;81(1).

Martínez-Ferria E, González-Barreirob C, Cancho-Grandeb B, Battinoc M, Simal-

Gándarab J,2018. Bioaccessibility and potential bioavailability of phenolic compounds from
achenes as a new target for strawberry breeding [Link] Chemistry ,248, 155–165.
Martins E M , Ramos A M , Vanzela E S L, Stringheta P C, Pinto C L D, Martins J
M, 2013. Products of vegetable originI a new alternative for the consumption of probiotic
bacteria. Food Research International, 51(2), 764-770.

Martins E M F, Ramos A M , Martins M L, Rodrigues M Z, 2015. Research and

development of probiotic products from vegetable basesI a new alternative for consuming
functional food. In V. R. Rai J. A. Bai. Benefiial microbes in fermented and functional foods
.Boca RatonI CRC Press,207-233.
Marcos A , Junior DM, Brígida T L ,Lucena R, Picão C, Serela MM, de Souza LE ,
2016 .Identification of Lactic Acid Bacteria in Fruit Pulp Processing Byproducts and Potential
Probiotic Properties of Selected Lactobacillus Strains .Frontier in Microbiologie ,30,16-18
Melgar-Lalanne G, Rivera-Espinoza Y, Hernández-Sánchez H ,2012. Lactobacillus
plantarum: An overview with emphasis in biochemical and healthy properties.
Michida H , Tamalampudi S , Pandiella S S, Webb C , Fukuda H, Kondo A, 2006. Effect
of cereal extracts and cereal fiber on viability of Lactobacillus plantarum under
gastrointestinal tract conditions. Biochemical Engineering Journal, 28,73-78.
Michiels J A, Kevers C, Pincemail J, Defraigne J O, Dommes J,2017. Extraction
conditions can greatly influence antioxidant capacity assays in plant food matrices. Food
Chem, 130,986–993.
Minikus M, Alminger A, Alvito P, Ballance S, Bohn T, Bourlieu C, Carriere T, Boutrou
R, Corredig M, Dupont D, 2014. A standartized static in vitro digestion method suitable for
food-an international consensus. Food Funct, 5, 1113-1124.
Muellera D, Junga K, Wintera M, Rogollb D, Melcherb R, Kulozikc U, Schwarzd K,
Richlinga E,[Link] of anthocyanins from bilberries – Effects on bioavailability
and intestinal accessibility in humans. Food Chemistry ,248 ,217–224

O
Ozdal T, Sela D A , Xiao J , Boyacioglu D , Chen F , Capanoglu E,2016. The reciprocal
interactions between polyphenols and gut microbiota and effects on bioaccessibility.
Nutrients, 8(2).

Panghal A , Janghu S , Virkar K ,Gat Y, Kumar V ,Chhikara N, February

2018. Potential non-dairy probiotic products A healthy approach . Food Bioscience, 21, 80-
89.
Perricone M, Bevilacqua A, Altieri C, Sinigaglia M , Corbo, M.R,2015. Challenges
for the production of probiotic fruit juices ,Beverages, 1 (2), 95-103 .

Qhairul N , Izzreen M, Fadzelly M A, 2013. Phytochemicals and antioxidant properties of

different parts of Camellia sinensis leaves from Sabah Tea Plantation in Malaysia.
.International Food Research Journal , 20(1).

Quettier-Deleu C, Gressier B, Vasseur J, Dine T, Brunet C, Luyckx M, Cazin M, Cazin

J C, Bailleul F, Trotin F, 2000. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat
(Fagopyrum esculentum Moench) hulls and flour. Journal of ethnopharmacology ,72(1),35-
42.
Qurat A R , Masud T, 2013. Recent Trends and Applications of Encapsulating Materials for
Probiotic Stability. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 53(3), 231-244 .

Sadok S , HASSEN A , BOUSAID B ,2016. Evaluation de la qualité des huitres creuses

crassostrea gigas au cours du stockage réfrigéré:suivi de viabilité [Link]. [Link]
de Salammbo , 42,87-90 .

Sánchez B ,Delgado S , Blanco‐Míguez A , Lourenço A , Gueimonde M ,Margolles

A,2016 .Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and
disease .[Link] .Food Res , 61( 1),160-240
Santarmaki V, Kourkoutas Y, Zoumpopoulou G, Mavrogonatou E, Kiourtzidis
M, Chorianopoulos N, Tassou C, Tsakalidou E, Simopoulos C, Ypsilanti P, 2017.
Survival, Intestinal Mucosa Adhesion, and Immunomodulatory Potential of Lactobacillus
plantarum Strains. Current Microbiology, 74(9), 1061–1067

Santo D E, Perego P , Convertib A , Oliveira N M ,[Link] of food matrices on

probiotic viability A review focusing on the fruity bases. Trends in Food Science &
Technology ,22 ,377-385

Scalbert A , Manach C, Morand C, Rémésy C , Jiménez L ,2005. Polyphénols

alimentaires et la prévention des maladies. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,
45(4), 287-306.
Shori A B , [Link] potential applications of probiotics on dairy and non-dairy foods
focusing on viability during storage, Biocatalysis and AgriculturaBiotechnology ,4(4) ,423-
431.
Shori B A , [Link] Improved Probiotics Survival During Gastric Transit.
HAYATI Journal of Biosciences, 24 ,1-5.
Siezen R.J, HylckamaV, Vlieg J E, 2011. Genomic diversity and versatility of Lactobacillus
plantaruma natural metabolic engineer. Microbial Cell Factories , 10, 1-13.

Sifour M, Ouled-Haddar H, Idoui T, January 2012. Microencapsulation d’un

Lactobacillus plantarum probiotique isolé du jabot de poulet: Etude de la stabilité dans les
conditions du tube digestif.
Sirigne S O , Fall A D, Gueyel R, Diopl A, Diatta K, Diopl N, Ndiayel B , Diopl M.Y ,
2015. Etude de l’activité antioxydante des extraits des feuilles de Vitex doniana
(Verbenacea) International. Journal of Biological. Chemical. Science, 9(3), 1263-1269.

Sökmen B B , Aydın S, Kınalıoğlu K,2012 . Antioxidant and antibacterial properties of a

lichen species Diploschistes scruposus (Schreb.).Journal of Biology, 71(1), 43-51.

Spyropoulos B G, Misiakos E P, Fotiadis C, Stoidis C,[Link] properties of

probiotics and their protective effects in the pathogenesis of radiation-induced enteritis and
colitis. Dig. Dis. Sci, 56, 285–294.
Stratil P, Klejdus B, Kuban V, 2006 .Determination of total content of phenolic compounds
and their antioxidant activity in vegetables evaluation of spectrophotometric methods. J Agric
Food Chem, 54(3):607-16.

T
Taale E, Savadogo A, Sina H, Zongo C ,Karou S D, Baba-Moussa L and Traore A S
,[Link] For fermented Food in Burkina Faso By Molecular Methods. International
Journal of Applied Pharmaceutical Technology,244,129-137.
Turkmen N, Velioglu YS, Sari F, Polat G. 2007. Effect of extraction conditions on
measured total polyphenol contents and antioxidant and antibacterial activities of black tea.
Molecules 12(3):484-496.
Tripathi M K , Giri S K,2014 .Probiotic Functional Foods survival of probiotic during
processing and storage. Journal of functional foods,9,225-241

Tufarelli V, Laudadio V, 2016 .An overview on the functional food concept :prospective
applied resesrches in probiotic,probiotic and synbiotics. Journal of Experimental Biology and
Agricultural Sciences, 4 , 273-278

Valtonen V, March [Link] of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria.

Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases, Society of
America, 36, 775–780.
Velderrain-Rodriguez G R , Palafox-Carlos H , Wall-Medrano A , Ayala-Zavala J F
,Vijendra M ,Shah C ,Mokashe N , Chavan R, Yadav H ,Prajapati J ,[Link] as
Potential Antioxydants :A Systèmatic Review .J. Agricultural .food Chemestry ,63(14),21-30

Wang A N , Yi X W , Yu H F , Dong B, Qiao S Y,2009 . Free radical scavenging activity

of Lactobacillus fermentum in vitro and its antioxidative effect on growing-finishing pigs.
Journal of Applied Microbiology, 107, 1140–1148.

Wang Y , Li C , Liu P , Ahmed Z , Xiao P , Bai, X , 2010. Physical characterization of

exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum KF5 isolated from Tibet Kefir.
Journal of Applied Microbiology,82, 895-903.
Wang Y, Wu Y, Wang Y, Xu H, Mei X, Yu D, Wang Y , Li W, 2017 . Antioxidant
Properties of Probiotic Bacteria .Nutrients, 9, 521-525.
Wassenaar T M , Lukjancenko O ,Chichester W,[Link] genomics of
Lactobacillus and other LAB. In: Holzapfel WH, Wood JB (eds) Lactic acid bacteria:
biodiversity and taxonomy. Current Microbiology.

Z
Zago M, Fornasari M E , Carminati D, Burns P, Suàrez V, Vinderola G, Reinheimer J ,
Giraffa G, [Link] and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains
isolated from cheeses. Food Microbiology. 28 (5), 1033-1040.

Zhu H , Hart C A , Sales D , Roberts N B , 2006. Bacterial killing in gastric juice – effect
of pH and pepsin on Escherichia coli and Helicobacter pylori. Journal of Medical
Microbiology. 55, 1265-1270
.
Annexes
Annexes

1. Composition des milieux et des tampons

❖ Bouillon Man-Rogosa-Sharpe

Ingrédients unité
Peptone 10g
Extrait de levure 4g
Extrait de viande 8g
Glucose 20g
Phosphate dipotassique 2g
Acétate de sodium 5g
Citrate d’ammonium 2g
Sulfate de magnésium 0.2g
Sulfate de manganèse 0.05g
Tween 80 1mL
Eau distillée 1000mL

❖ Gélose MRS pH=6,2

Ingrédients unité
Peptone 10g
Extrait de levure 5g
Extrait de viande 10g
Glucose 20g
Phosphate dipotassique 2g
Acétate de sodium 5g
Citrate d’ammonium 2g
Sulfate de magnésium 0.2g
Sulfate de manganèse 0.05g
Tween 80 1,08mL
Agar agar 15g
Eau distillée 1000mL

❖ Tampon Phosphate Salin PBS

Ingrédients unité
K2HPO4 1.21g
KH2PO4 0.34g
NaCl 8g
Eau distillée 1000mL
Annexes
❖ Tampon phosphate potassique (2M) pH=7

Ingrédients unité
K2HPO4 69.5
KH2PO4 13.5
Eau distillée 1000mL
Annexes

Photos des résultats de la survie des cultures témoins : ×109UFC/ml

Culture libre :

Culture libre sans traitement Après phase orale

Culture encapsulé

Culture encapsulée sans traitement Après phase orale

Annexes

❖ Les courbes d’étalonnages

2,5

2
DO à 510nm

1,5

1
y = 24,15x + 0,057
0,5 R² = 0,999

0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
Concentration de Quercetine ( µg/ml)

Figure 2 : Courbe d’étalonnage des flavonoïdes.

1,4

1,2

1
DO à 725nm

0,8

0,6 y = 0,012x
R² = 0,999
0,4

0,2

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentration d'acide gallique

Figure 2 : Courbe d’étalonnage des polyphénols mg/ml (acide gallique).

Réalisé par : Melle Manel FERKHI Encadreur : Pr. Tayeb IDOUI.
Melle Hadjer CHEURFI Date de soutenance : 04/07/2018
Thème : Viabilité et performances probiotiques de Lactobacillus plantarum S10 dans un système
simulé au tube digestif

Résumé
Le but de notre travail est l’évaluation de la survie de [Link] S10 (culture libre et
encapsulée) aux conditions simulées à la digestion, déterminer son activité antioxydante et celles
des extraits de la fraise et du concombre et l’effet de la combinaison sur la viabilité et la survie
lors de la digestion bucco-gastro-intestinale.

Les résultats ont montré que la souche est résistante in vitro aux conditions simulées à la
digestion, que la micro encapsulation améliore le taux de survie aux mêmes conditions. Les
matrices jus de fraise et jus de concombre améliorent la survie de la souche lors de la digestion in
vitro, de même, ces matrices ont permis d’avoir une bonne activité antioxydante. La combinaison
bactérie-extrait a montré une augmentation du taux de survie avec une perte en composés
phénoliques et flavonoidiques et une diminution du pouvoir d’adhésion au cours du passage dans
les différents contenus de digestion.

Mots clés : [Link] S10, survie, digestion, extraits, activité antioxydante, jus.
Abstract
The aim of our work is to evaluate the survival of [Link] S10 (free culture and
encapsulated) under simulated digestion conditions, to determine its antioxidant activity and
those of strawberry and cucumber extracts and the effect of combination on viability and survival
during in vitro digestion.

The result showed that the strain is resistant in vitro to digestion simulated conditions, that micro
encapsulation improves the survival rate under the same conditions. Strawberry juice and
cucumber juice matrix improved the survival of the strain during in vitro digestion, and these
matrixes permit to have good antioxidant activity. The bacterium-extract combination showed an
increase in the survival rate with a loss of phenolic and flavonoid compounds, and a decrease in
adhesion potential during the passage in different digestion contents.

Key words: [Link] S10, survival, digestion, extract, antioxidant activity, juice.

‫ملخص‬
‫ عهً قيذ انحياة (حزة و مغهفت) في شزوط محاكيت‬01 ‫انغزض مه دراطخىا هى حقييم مذي بقاء انبكخيزيا الكخىباطيهىص ص‬
‫ وكذا ححذيذ انىشاط انمضاد نألكظذة ن مظخخهصاث انفزاونت وانخيار وحأثيز‬,‫ ححذيذ وشاطها انمضاد نألكظذة‬، ‫نهدهاس انهضمي‬
. ‫اندمع بيىهما عهً فعانيت ومذي قذرة هذي انظالنت عهً انبقاء عهً قيذ انحياة أثىاء مزاحم انهضم‬

‫ وأن انخغهيف اندشئي يحظه معذل انبقاء عهً قيذ‬،‫أظهزث انىخائح أن هذي انظالنت مقاومت نهظزوف انمحاكيت نهدهاس انهضمي‬
‫ و أن كم مه عصيز انفزاونت و انخيار يحظىان مه قذرة بقاء انظالنت حيت أثىاء عمهيت انهضم خارج‬.‫انحياة ححج وفض انظزوف‬
‫و أظهزث وخائح اندمع سيادة في معذل انبقاء مع حىاقص‬.‫ و آن هذي انمصفىفاث حخمخع أيضا بىشاط مضاد نألكظذة خيذ‬،‫انخهيت‬
‫ و اثبثج انىخائح أيضا اوخفاض في قذرة االنخصاق انذاحي نظالنت انالكج باطيهىص‬, ‫في حزكيش انمزكباث انفيىىنيت وانفالفىوىيذاث‬
.‫أثىاء انمزور خالل محخىياث انهضم انمخخهفت‬

‫عصيز‬,‫ وشاط مضاد نألكظذة‬,‫مظخخهص‬,‫ انهضم‬,‫ انبقاء عهً قيذ انحياة‬,01 ‫ انالكج باطيهىص ص‬: ‫الكلمات المفتاح‬