Partie II : Biotechnologie moderne
I- Introduction
Il y a très longtemps que la biotechnologie fait partie de la culture de l’homme. La domestication
des espèces végétales et animales et la sélection artificielle qui l'accompagne impliquent des
manipulations génétiques, même involontaires. La préparation de la bière, du fromage et du
pain, qui repose sur la maîtrise de la fermentation à l’aide de toute une série de micro-
organismes, remonte aux débuts de l’histoire humaine. Avec l'avènement de l'ADN
recombinant, les possibilités offertes par la biotechnologie se sont considérablement
développées et ont stimulé l'imagination des scientifiques et du public. Les applications de la
biotechnologie sont particulièrement nombreuses dans les secteurs de la santé humaine et de
l'agriculture. Les considérations éthiques et la crainte de risques potentiels ont cependant pris
une importance croissante dans les débats scientifiques et publics, et ont parfois conduit à
suspendre certains essais, sur décision de la communauté scientifique elle-même ou des
pouvoirs publics.
Selon la définition de la Commission du Codex « la biotechnologie moderne s’entend :
i) De l’application des techniques in vitro aux acides nucléiques, y compris la
recombinaison de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et l’introduction directe d’acides
nucléiques dans des cellules ou organites ;
ii) ii) De la fusion cellulaire d’organismes n’appartenant pas à la même famille
taxonomique, qui surmontent les barrières naturelles de la physiologie de la
reproduction ou de la recombinaison.
L’application de la biotechnologie moderne à la production alimentaire comporte des
possibilités et des enjeux stimulants pour la santé humaine et le développement. Le génie
génétique, qui est l’une des biotechnologies modernes les plus connues, permet, en modifiant
leur patrimoine génétique, de conférer à des plantes, à des animaux et à des microorganismes
des caractères qui ne pourraient pas être obtenus à l’aide des techniques classiques de
reproduction et de sélection.
A côté de la modification génétique, il existe des techniques telles que le clonage, les cultures
de tissus ou l’amélioration génétique basée sur l’utilisation de marqueurs que l’on a souvent
tendance à considérer également comme des biotechnologies modernes.
II- Biotechnologie et production végétale
Introduction sur la transgénèse végétale
Les espèces évoluent continuellement et l’homme a mis à profit cette variabilité pour adapter
les végétaux cultivés à ses besoins. Il sera toujours nécessaire d’améliorer les plantes pour
répondre à l’évolution des contraintes biotiques (maladies, prédateurs…) ou abiotiques
(salinité, sécheresse…) et assurer des rendements minimum. De nouveaux objectifs de qualité
et de durabilité s’y ajoutent.
Comment les biotechnologies modernes ont déjà et peuvent contribuer à l’amélioration
des végétaux ?
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Entre les méthodes classiques de sélection variétale et l’amélioration par les biotechnologies
modernes qui dérive de progrès récents de la biologie moléculaire, deux différences
fondamentales apparaissent.
La sélection classique est un processus de longue haleine, il faut compter cinq à 15 ans, selon
les espèces, pour créer une nouvelle variété ayant que les caractères désirables et la mettre sur
le marché. De plus, les échanges génétiques qu’autorise la méiose dans ces conditions portent
sur des chromosomes entiers ou de larges fragments chromosomiques, ce qui conduit au
transfert simultané de caractères défavorables car la transmission des autres caractères
indésirables se fait de manière aléatoire et en mélange.
La création d’un nouvel être vivant via les méthodes traditionnelles d’amélioration des plantes
ne semble pouvoir provenir que du croisement d’individus d’une même espèce ou d’espèces
apparentées. Sa sélection est assurée par sa viabilité intrinsèque, la viabilité de sa reproduction
et son adaptation au monde environnant. Il ne semble pas envisageable de faire franchir aux
gènes la barrière des espèces (sauf par l’intermédiaire des bactéries et des virus).
En revanche, les biotechnologies modernes, notamment la transgénèse, transgresse les barrières
sexuelles liées à la notion d’espèces. Toutes les manipulations transgéniques sont
envisageables, il n’y a aucune limite à l’imagination des chercheurs, ainsi, certaines espèces
peuvent échanger spontanément l’information génétique avec l’espèce végétale à améliorer.
Les choses ont changé depuis la découverte de l’universalité de la molécule d’ADN et de son
fonctionnement a permis aux scientifiques d’envisager qu’un gène de n’importe quelle espèce
puisse être ajouté et fonctionner chez n’importe quelle autre espèce et créer un « OGM ».
Qu’est-ce qu’un OGM ?
Un OGM (Organisme Génétiquement Modifié) est un organisme vivant dont on a modifié de
façon non naturelle par le biais du génie génétique, ses caractéristiques génétiques initiales, par
addition, suppression, remplacement d’un ou plusieurs gène(s) dit(s) « étranger(s) », ou d’un
quelconque morceau de matériel génétique, nommé ADN. Ces derniers sont dotés de propriétés
particulières dans un organisme afin que celui-là exprime ces propriétés. Les plantes ainsi
transformées sont appelées « plantes transgéniques ».
Qu’est-ce que la transgénèse végétale ? La transgénèse est un outil du génie génétique, qui
complète les méthodes traditionnelles d’amélioration des plantes quand ces dernières se
heurtent à des impossibilités. Il s’agit en fait du transfert par transformation génétique d’une
version « construite » d’un gène. C’est un moyen de créer un caractère qui n’existe pas dans
l’espèce considérée ni dans ses apparentées, comme par exemple, la résistance aux larves d’un
coléoptère. Ce gène peut être construit à partir d’une séquence présente dans la même espèce
ou dans une espèce très différente (micro-organisme, animal).
Les différentes stratégies de la transgénèse
Introduire un nouveau caractère
Le transfert de gènes s’accompagne généralement de l’apparition d’un nouveau caractère. Une
copie du gène d’intérêt est introduite dans la plante. Son expression, par l’intermédiaire d’un
ARN messager, entraîne la production d’une protéine, responsable du nouveau caractère.
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Les exemples dans ce domaine sont nombreux : introduction d’un gène de résistance à des
insectes, à des pathogènes, gène de tolérance à des herbicides, à la sécheresse ou la salinité des
sols, ou encore modification de la composition des graines, production de molécules d’intérêt
industriel ou pharmaceutique (médicaments).
Inactiver un caractère
Le transfert de gènes ou d’un ARN induit l’inhibition d’une fonction déjà existante. La stratégie
anti-sens fut la première utilisée. Elle consiste à bloquer la traduction d’un gène cible. Une
copie « inversée » de ce gène est introduite, d’où le nom de la technique. Les ARNm produits
par la copie originelle du gène et par celle introduite sont complémentaires. Ils s’hybrident donc
et forment une molécule d’ARN double brin. Cette molécule aberrante ne peut être traduite et
elle est dégradée.
Les protéines à l’origine de la fonction ne sont donc pas produites et le caractère ne s’exprime
pas. Cette technique a permis d’obtenir des espèces végétales à teneur en lignine réduite, des
melons à maturation retardée, ou des pommes de terre riches en amylopectine.
Technique de construction des plantes transgéniques : Cas du tabac
1-Identifier et isoler un gène d’intérêt
La première étape est l'identification d'un caractère que l'on veut introduire dans la plante,
comme par exemple, des caractères de qualité nutritionnelle, la résistance à certains insectes, à
certaines maladies, à des herbicides, etc.
Le gène d'intérêt peut provenir de tout organisme vivant, plante, animal ou bactérie puisque le
code génétique est universel. Il doit ensuite être isolé de l'organisme donneur.
Dans notre exemple, le gène d’intérêt que l’on souhaite transférer, code une toxine
insecticide (Bt) qui confère une résistance aux insectes. Ce gène a été isolé chez Bacillus
thuringiensis, bactérie dont certaines souches empêchent la prolifération de larves de
lépidoptères.
2-Réaliser une construction chimérique
La transgénèse constitué du gène « d’intérêt » et du gène « marqueur » sont intégrés dans un
vecteur de transformation (ADN plasmidique). Ce gène marqueur confère dans la plupart des
cas une résistance à un antibiotique et permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le gène
d'intérêt.
Dans le cas du tabac, la construction chimérique est composée de gènes artificiels (ou
composites) suivants :
- Le gène d’intérêt Bt qui leur confère une résistance aux principaux insectes nuisibles (la
pyrale) ;
- Le gène marqueur composé d’une séquence codant un gène bactérien (séquence codante de
la néomycine phosphotransférase II ou nptII) qui leur confère la résistance à un antibiotique, la
kanamycine, généralement toxique pour les cellules végétales ;
- un promoteur et un terminateur.
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Les deux dernières parties sont nécessaires pour pouvoir faire fonctionner le gène associé dans
un environnement nouveau, la cellule végétale.
La construction est ensuite multipliée (clonée) dans Escherichia coli afin de disposer d'une
quantité suffisante d'ADN pour son introduction dans les cellules végétales que l'on veut
transformer.
3-Transférer la construction génétique dans le génome d’une cellule végétale
Le vecteur de transformation génétique peut être intégré dans la cellule végétale soit par les
méthodes de transfert direct dont : l’électrolocation, la biolistique, micro injection ou par la
transformation biologique qui requiert l’intervention des bactéries telluriques du genre
Agrobacterium (méthodes indirectes).
Méthodes directes
Le transfert direct de gène est réalisé grâce à l’introduction dans l’ADN d’un gène dit d’intérêt
véhiculé par un plasmide.
Electrolocation
Cette méthode, efficace et l’une des plus simples à mettre en œuvre, fait appel à des impulsions
électriques. Elle consiste à soumettre un mélange de protoplastes et d'ADN à une série de chocs
électriques de courte durée et de tension élevée. Le champ électrique provoque la déstabilisation
de la membrane plasmique par polarisation des phospholipides qui la constituent et induit alors
la formation de pores au travers desquels les molécules d'ADN peuvent transiter. Si le choc
électrique n'a pas été trop violent, le phénomène est réversible et la membrane reprend ensuite
son état initial, laisant le protoplaste parfaitement viable.
La biolistique
C’est une technique qui consiste à introduire de l'ADN directement dans le noyau des cellules
végétales par projection de microbilles métalliques porteuses de cet ADN. Cette technique est
employée pour le maïs, le blé, le riz, le coton, le soja, etc
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La micro injection
Méthodes indirectes
La méthode indirecte utilise des agents pathogènes tels que les virus et les bactéries, les vecteurs
les plus utilisés sont les agrobactéries.
Dans notre exemple, nous ferons appel à A. tumefaciens, possédant dans les conditions
naturelles, la capacité unique de transférer une partie de son matériel génétique, l’ADN-T (T
pour transfert), dans le génome de la cellule végétale ;
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Le plasmide porteur d’une région d’ADN-T incluant les transgènes est introduit dans les
cellules bactériennes qui vont accomplir le transfert. Les disques foliaires du tabac (désinfectés
et coupés au préalable) sont mis en contact avec les agrobactéries en culture liquide (on parle
de co-culture) pendant un certain temps qui varie de quelques minutes à quelques heures.
Au niveau de la coupure, les cellules végétales sont blessées, ce qui stimule le système naturel
de transfert de gènes d'A. tumefaciens. Les explants sont ensuite transférés dans un milieu
nutritif (co-culture de 2 à 6 jours).
Co-culture du tabac et développement de cals
Pourquoi utilise-t-on Agrobacterium tumefaciens ?
Agrobacterium tumefaciens est capable d’injecter un ADN dans une cellule végétale où il
s’insère dans le génome chromosomique. Cet ADN, qui peut circuler ainsi d’un organisme à un
autre, est un fragment de plasmide : le plasmide Ti (tumor inducing). L’ADN qui est ainsi
transféré est nommé ADN-T (Tansferred DNA). Il a été rapidement proposé, une fois ce
mécanisme connu, de le détourner dans un but de transgénèse. Pour cela, il suffit de remplacer
l’ADN-T par un autre ADN portant un gène d’intérêt, par exemple.
4-Sélectionner les cellules végétales transformées et régénération d’une plante
entièrement transformée
Après avoir lavé les explants pour éliminer l’excès des agrobactéries, les fragments de feuilles
du tabac sont ensuite incubés en présence de kanamycine et de céfotaxime, sur un milieu nutritif
additionné de phytohormones. La céfotaxime est un antibiotique ayant comme rôle de stopper
la croissance des agrobactéries transportées avec le disque foliaire.
Seules les cellules transformées, qui ont intégré le gène nptII, résisteront à la kanamycine et
donc proliféreront sur ce milieu sélectif. Après sélection des cellules transformées, il faut
régénérer de nouvelles plantes transgéniques en culture in vitro.
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Les cellules transformées se développent d'abord en cals, larges amas de cellules
indifférenciées .Ce phénomène est observé dans un petit nombre de cellules de l’explant d’où
la nécessité de multiplier les cellules transformées. Après quelques semaines, on observe le
développement de tige.
Le milieu de culture doit posséder une balance hormonale (rapport cytokines/auxines)
favorable à la différenciation de bourgeons dans les cellules transformées. Les explants sont
alors placés dans un nouveau milieu de culture permettant le développement des racines.
Quand les racines sont suffisamment développées, les vitro plants sont repiquées en pot et
acclimatées en serre conçue spécialement pour les PGM.
Régénération in vitro du tabac transgénique
Applications agronomiques de la transgénèse
Dans le domaine agronomique, les avancées de la transgénèse commencent à être significatives
pour les végétaux. Les transformations opérées sur les plantes visent principalement à les rendre
résistants aux différents stress biotiques et abiotiques.
Des plantes résistantes aux herbicides
Les gènes de tolérance à l’herbicide introduits dans une plante empêchent la matière active
d’agir sur celle-ci, transformant l’herbicide total en herbicide sélectif pour cette plante. Ainsi
l’herbicide détruit toutes les mauvaises herbes en laissant la plante cultivée poursuivre son
développement. Ces principes actifs sont connus pour être moins rémanents. De nombreuses
plantes transgéniques ont été développées pour obtenir une tolérance à ces herbicides. Il s’agit
de variétés de betterave, colza, coton, maïs, pomme de terre et de soja. Différentes stratégies de
transgénèse ont été mises au point pour rendre les plantes utiles résistantes aux herbicides.
L’une des possibilités vise à faire synthétiser par la plante un produit qui détruit l'herbicide.
Des plantes protégées contre les ravageurs
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Les insectes, les virus, les champignons et les bactéries sont responsables de pertes importantes
en production végétale (37% de la production agricole). Or, il existe une alternative pour rendre
les plantes résistantes à ses différents parasites et ainsi éviter l’utilisation abusive des pesticides
et apportent donc un gain significatif en matière de coût et de pollution.
a. Des plantes résistantes aux insectes
Les insectes nuisibles causent des dommages importants aux plantes et peuvent détruire des
cultures entières et des stocks de graines, ce qui a souvent des conséquences économiques et
alimentaires importantes.
Maïs Bt
La pyrale (Ostrinia nubilanis) est un papillon qui pond ses œufs par plaque sur la face inférieure
des feuilles de maïs. L’insecte creuse des galeries dans les tiges, les pédoncules d’épis et les
épis, entravant ainsi le courant de la sève et lésant tous les organes végétatifs. L’allongement
du maïs est inhibé. L’ensemble de ces dégâts peut occasionner des pertes de rendement allant
jusqu’à 30% en cas de forte infestation
La bactérie Bacillus thuringiensis constitue un véritable réservoir de gènes de résistance aux
insectes. En effet, les différentes souches de cette bactérie du sol recèlent plusieurs protéines
insecticides ayant différents modes d’action, et affectant uniquement certains insectes.
La résistance à la pyrale est conférée par le gène Cry A, appelé communément Bt. Ce gène
permet la production dans les cellules de maïs d’une protéine qui fonctionne comme une toxine
létale dans le tube digestif de la pyrale car celui-ci contient des récepteurs spécifiques à sa
surface.
Chez les autres animaux et chez l’homme qui ne possèdent pas ces récepteurs, cette protéine
est simplement digérée sans aucun effet toxique.
b. Des plantes résistantes aux virus
Parmi les nombreuses attaques que doivent subir les plantes, les virus sont les plus nocifs car
il n'existe aucun traitement curatif.
. Chez la pomme de terre, le manioc, le riz, les infections virales peuvent occasionner jusqu'à
80 % de perte sur une même récolte. De plus, on considère que les pertes de rendement
occasionnées par les virus s’élèvent à plus de 10% chaque année pour les plantes de grandes
cultures.
Pomme de terre résistante au mildiou Concernant les champignons, beaucoup de variétés de
pomme de terre sont sensibles au mildiou (maladie cryptogamique). Les croisements par
sélection conventionnelle n’ont pas permis de créer de variétés tolérantes à cette maladie qui
cause de nombreux dégâts sur le rendement et la qualité. Une pomme de terre de table
génétiquement modifiée résistante au mildiou existe. Elle contient deux gènes de résistance
issus d’espèces sauvages d’Amérique du Sud, zone d’origine de la pomme de terre.
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Dans le secteur agroalimentaire
a. Améliorer les qualités nutritionnelles
En alimentation animale, les recherches vont dans le sens d’un développement de plantes
permettant un meilleur bilan nutritionnel et évitant l’apport de compléments nutritifs. Ainsi, il
est possible d’obtenir des plantes de maïs, colza, soja à teneurs élevées en acides aminés,
notamment en méthionine et lysine, et des maïs enrichis en huile.
Concernant l’alimentation humaine, des travaux sont menés pour diminuer les propriétés
allergènes du riz et du soja. Pour obtenir ce résultat, on cherche à introduire dans la plante un
transgène qui inhibe la synthèse de la protéine allergisante.
D’autres travaux ont permis de modifier la teneur en amidon de la pomme de terre et de disposer
ainsi de variétés mieux adaptées à la fabrication de fécule, de purée ou de chips.
Des plantes plus riches en éléments essentiels (vitamines et acides aminés) Par ailleurs, la
modification volontaire du génotype des plantes par la transgénèse peut permettre d'apporter
aux consommateurs des aliments plus riches en éléments essentiels.
• Le riz doré : riz enrichi en bêta-carotène, précurseur de la vitamine A. l’objectif recherché
est de réduire les carences en cette vitamine. Le riz doré est donc capable de fournir un
supplément de vitamine A aux 400 millions d'êtres humains qui en manquent et sont menacés
de perdre la vue.
