Etude expérimentale : Analyse qualitative
I. Identification des composés étudiés
Les parabènes sont des conservateurs qu’on retrouve dans de nombreux produits
cosmétiques et alimentaires ainsi que dans certains médicaments. Ils permettent de lutter
contre les champignons et les bactéries et prolongent ainsi la date limite d’utilisation de
nombreux produits cosmétiques (80 % d’entre eux), aliments, boissons et médicaments. Les
parabènes les plus fréquemment rencontrés sont :
II. Etude de quelques facteurs influençant la séparation et
la rétention
Les conditions opératoires de l’analyse des parabènes par HPLC/UV fournit dans
la salle de TP :
La méthode d’ H.P.L.C utilisée est celle de partage en phase inverse. Elle se base sur les
différences de solubilité des composés dans deux phases liquides non-miscibles : la phase
stationnaire de type C18 (greffée sur des billes de silice) apolaire ; la phase mobile polaire
constituée de : Eau/acétonitrile.
Les conditions chromatographiques :
L’échantillon : doit être dilué au 1/10 dans le diluant
Colonne : C-18 de 25 cm de longueur
Volume d’injection : 20 µl
Débit : 1 ml/min
Détecteur : 254 nm
Les temps de rétention des analytes dans les solutions standards et la solution
standard mère
composé Tr (min) dans les solutions Tr (min) dans la solution
standards standard mère (mélange)
P1 4.114 4.085
P2 5.163 5.14
P3 7.016 7.013
T0 =
Selon les temps de rétentions, l’ordre d’élution des 3 composés dans le mélange est comme
suite :
1) Parahydroxybenzoate de méthyle
2) Parahydroxybenzoate d’éthyle
3) Parahydroxybenzoate de propyle
Calcule des paramètres : k, α et Rs
composé Tr (min) α Rs N
P1 4.085 20653
P2 5.14 1.479 4.329 22922
P3 7.013 1.575 25902
Tr 2−T 0
α (1 , 2 )= Siα >1 On peut dire qu’il y a une séparation
Tr 1−t 0
Tr 2−Tr 1
Rs=2 Si Rs¿ 1.5 la séparation est parfaite
w 1+W 2
2
Tr
N=16 2
W
1. Effet de débit de la phase mobile
paramètre composé Tr (min) α Rs N Nmoy
Débit P1 8.186 1.489 8.713 21833 22960
0.5ml/min P2 10.309 24086
Débit 1 ml/min P1 4.085 1.479 8.457 20653 21788
P2 5.14 22922
Débit P1 2.718 1.476 7.539 16437 17530
1.5ml/min P2 3.415 18622
Débit 2 ml/min P1 2.077 1.483 6.993 13654 14623
P2 2.619 15591
Interprétation :
Une augmentation du débit de 0.5 ml/min à 2 ml/min, diminue le temps de rétention.
Ce qui permet l’accélération de l’analyse mais cela peut affecter la qualité de la
séparation si le débit est trop élevé (chevauchement des pic).
Le facteur de sélectivité reste relativement constante (α = 1.48) pour tous les débits.
Donc le débit de la phase mobile n’a pas d’influence sur la sélectivité.
La résolution Rs diminue de 8.713 à 6.993 avec l’augmentation du débit de 0.5 à 2
ml/min. On peut dire qu’un débit plus élevé réduit le temps d’interaction entre les
analytes et la phase stationnaire, entrainant ainsi une diminution de la qualité de
séparation (une résolution plus faible peut rendre difficile la distinction entre deux pics
proches).
Le nombre de plateaux théoriques N diminue avec l’augmentation de débit (de 22960
à 14623). La diminution de N reflète une perte d’efficacité de la colonne, qui est due à
une dispersion accrue à des débits élevés (affecte les largeurs des pics).
Un débit élevé provoque une dispersion longitudinale accrue et réduit le temps de
contact entre les analytes et la phase stationnaire
B. L’effet de la composition de la phase mobile
paramètre composé Tr (min) α Rs N Nmoy
50%ACN P1 4.085 1.479 8.457 20653 21788
50%H2O P2 5.14 22922
80%ACN P1 2.706 1.207 2.245 21985 21295
20%H2O P2 2.878 20604
Interprétation :
Une augmentation de la proportion d’acétonitrile (ACN), qui est un solvant
organique moins polaire, réduit les temps de rétention des deux composés. Cela
s’explique par la diminution de polarité globale de phase mobile, ce qui diminue
les interactions des composés polaires avec la phase stationnaire.
Une proportion élevée d’ACN réduit la sélectivité entre les composés, ce qui
indique les différences d’interaction entre les deux analytes et la phase
stationnaire sont moins marquées dans des conditions moins polaires (80%ACN
20%H2O).
La résolution est nettement meilleure avec une phase mobile à 50%ACN
20%H2O. par contre la séparation à 80%ACN est plus rapide mais moins efficace
ce qui pourrait entrainer un chevauchement des pics.
Le nombre de plateaux théorique N est relativement constant entre les deux
compositions, avec une légère baisse à 80%ACN. Bien que la diminution soit
faible, un solvant plus riche en ACN (apolaire) peut introduire une légère
dispersion qui affecte l’efficacité de la séparation.
Les pics sont mieux définis avec 50%ACN 50%H2O comme l’indiquent le
chromatogramme et les valeurs de Rs et N, par contre à 80%ACN, les pics
deviennent moins bien résolus. Donc avec une polarité plus équilibré (50%ACN
50%H2O) les composés interagissent mieux avec la phase stationnaire, ce qui
améliore la séparation et avec une polarité faible (80%ACN 20%H2O) l’élution est
accéléré mais la qualité des pics se détruit.
50%ACN 50%H20 offre une meilleure séparation, une résolution élevée et des
pics bien définis, mais au prix d’un temps d’analyse légèrement plus long.
80%ACN 20%H2O réduit considérablement les temps d’analyse, mais
compromet la résolution et la sélectivité.
C. L’effet de la longueur de colonne C18 :
paramètre composé Tr (min) α Rs N Nmoy
Colonne C18 de P1 3.936 1.473 8.011 19412 20457
25 cm P2 4.927 21502
Colonne C18 de P1 1.481 1.278 1.266 990 1562
12.5 cm P2 1.693 2134
Interprétation :
La colonne la plus longue (25 cm) offre une meilleure résolution que la colonne la
plus courte (12,5 cm), car une colonne plus longue permet une meilleure séparation
des composés en offrant plus de temps pour l'interaction entre la phase mobile et la
phase stationnaire. Toutefois, cela peut aussi augmenter le temps d'analyse.
La résolution dans la colonne le plus longue (25 cm) est plus élevée en raison de la
plus grande interaction entre les analytes et la phase stationnaire. Cependant, le temps
d'analyse sera plus long. Par contre la résolution est légèrement réduite dans la courte
colonne (12.5 cm), mais l'analyse est plus rapide.
La sélectivité dans la longue Colonne (25 cm) est très élevée, ce qui donne des pics
mieux séparés. Par contre la sélectivité dans la courte colonne provoque moins de
séparation des composés (chevauchement des pics).
Pour la colonne 25 cm, les pics tendent à être plus nets et symétriques en raison de la
meilleure séparation, mais peuvent être légèrement plus larges en raison du temps
d’analyse plus long. Les effets de diffusion sont réduits. Inversement à colonne 12,5
cm, Les pics sont plus larges et moins symétriques en raison de la séparation moins
efficace et du temps d'interaction réduit entre les analytes et la phase stationnaire.
Une colonne de 25 cm offre une meilleure résolution et des pics plus nets et
symétriques, mais au prix d'un temps d'analyse plus long. Cependant, une colonne de
12,5 cm réduit le temps d'analyse mais présente une résolution plus faible et des pics
plus larges et moins symétriques.
2. Effet de la longueur d’onde
L'effet de la longueur d'onde sur la forme des pics et la séparation dans une chromatographie
liquide à haute performance (HPLC) est principalement lié à la détection des analytes via un
détecteur UV-Vis, qui utilise différentes longueurs d'onde pour détecter les composés en
fonction de leurs propriétés d'absorption. La sélection de la longueur d'onde influencera donc
la sensibilité, la sélectivité, et la forme des pics dans les chromatogrammes.
Longueur d’onde Les analytes
230 nm Faible absorption
Pics visible
254 nm Forte absorption
Pics intenses
275 nm Modérée
Pics détectables mais moins intenses
À 254 nm, les pics sont plus intenses, ce qui facilite la détection de faibles concentrations des
parabènes.
À 230 nm ou 275 nm, les pics deviennent moins intenses, ce qui peut compliquer la détection
des analytes si leur concentration est faible.
Pour analyser ces parabènes, une longueur d’onde autour de 254 nm est souvent
préférée pour maximiser la sensibilité et obtenir des pics bien définis.
3. Optimisation
Pour obtenir une séparation chromatographique optimale avec des critères de "séparation
parfaite", plusieurs facteurs doivent être optimisés simultanément, incluant la longueur de
colonne, la composition de la phase mobile, le débit de la phase mobile…
Stratégie d'optimisation pour une séparation parfaite :
On choisi une colonne C18 de 25 cm pour de meilleures résolutions et une meilleure
séparation.
On fait réduire le débit à environ 0,5 à 1,0 mL/min pour obtenir une bonne séparation
tout en évitant un temps d'analyse trop long.
On utilise une longueur d'onde UV égal à 254 nm qui correspond aux maximal
d'absorption des analytes.
On utilise un gradient de phase mobile, avec un mélange de 80% d’acétonitrile et 20%
d’eau, ajustable selon la polarité des analytes.
Avec cette stratégie, on peut réaliser une séparation chromatographique optimale, tout en
ajustant les paramètres pour satisfaire les exigences spécifiques de l’analyse (temps d’analyse,
séparation des pics, etc.).
