Université Pierre et Marie Curie

ED 515 : Complexité du vivant

Institut de Myologie, UMRS 974 « Thérapie des maladies du muscle strié »
Equipe 6 : « Transfert de gènes dans le Système Nerveux Central et Biothérapie des maladies du motoneurone »

Modélisation et analyses physiopathologiques

de la Sclérose Latérale Amyotrophique liée à
l’ubiquiline 2 à l’aide de vecteurs AAV10

Par Corinne BOS

Thèse de doctorat : Neurosciences

Dirigée par Martine BARKATS

Présentée et soutenue publiquement le 23 octobre 2017

Devant un jury composé de :

Mr FRIGUET Bertrand Professeur des Universités Président

Mr RAOUL Cédric Directeur de Recherche Rapporteur
Mme BLASCO-RESPAUD Hélène Maitre de Conférence-Praticien Hospitalier Rapporteur
Mme BOHL Delphine Chargé de Recherche Examinateur
Mme PERRIN Florence Professeur des Universités Examinateur
Mme BUTLER-BROWNE Gillian Directeur de Recherche Remplaçant du directeur de thèse
Mme BIFERI Maria-Grazia Chargé de Recherche Co-encadrant
 REMERCIEMENTS

Je remercie, tout d’abord, les membres du jury qui ont accepté d’évaluer mon travail : Cédric
RAOUL et Hélène BLASCO-RESPAUD en tant que rapporteur, Bertrand FRIGUET en tant que
président du jury ainsi que Delphine BOHL et Florence PERRIN en tant qu’examinateur.

Je tiens à exprimer ma gratitude à Martine BARKATS pour m’avoir accueillie au sein de son
équipe du Centre de Recherche en Myologie, ainsi que pour son enseignement, le partage de ces
connaissances et de son expérience.

Je remercie Gillian BUTLER-BROWNE pour avoir accepté de remplacer Martine durant son
congé maladie et pour sa disponibilité.

Je tiens à remercier profondément Maria-Grazia BIFERI pour m’avoir guidée durant ces trois
années de thèse, pour son enseignement, sa patience, sa disponibilité, ses conseils scientifiques, sa
formation d’un point de vue technique et pour m’avoir fait confiance. Je la remercie aussi pour
m’avoir toujours soutenue et encouragée dans mon travail.

Un grand merci à Mathilde pour son aide à chaque fois que j’en avais besoin et pour sa
disponibilité.

Je tiens également à remercier Stéphanie, Yannick, Thibault, Aurore, Jordan, Nathalie, Benoit,
Marianne, Laetitia pour m’avoir aidée dans la réalisation de certaines manipulations, d’avoir pris
du temps pour répondre à mes questions, pour tous les conseils que vous m’avez donnés, vos
encouragements et votre soutien.

Je remercie encore une fois Maria-Grazia, Gillian, Mathilde, Stéphanie et Aurore pour leurs
conseils et surtout pour le temps qu’elles ont consacré à la relecture du manuscrit.

De manière générale, je remercie toutes ces personnes qui forment une super équipe où il y
a toujours eu de l’ambiance, de la bonne humeur et de bonnes rigolades.

Merci à toutes les autres personnes que je n’ai pas sitées mais que j’ai eu le plaisir de
rencontré.

Enfin, je remercie ma famille et mes amis qui m’ont toujours soutenue durant toutes ces
années d’études, sans lesquels je ne serai pas arrivée jusque là aujourd’hui.
 SOMMAIRE
RESUME 1
ABSTRACT 2

TABLE DES FIGURES 3

TABLE DES TABLEAUX 5

ABREVIATIONS 6

INTRODUCTION 10

1 La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) ........................................................................................ 11

1.1 Présentation générale de la maladie........................................................................................... 11
1.1.1 Historique et description de la SLA ...................................................................................... 11
1.1.2 Fréquence et répartition de la maladie ................................................................................ 13
1.1.3 Manifestations cliniques de la SLA ....................................................................................... 13
1.1.4 Diagnostic et pronostic ......................................................................................................... 14
1.2 Les différentes formes de SLA ..................................................................................................... 16
1.2.1 Les formes sporadiques et familiales de la SLA ................................................................... 16
1.2.2 La SLA avec Démence Fronto-Temporale (DFT) ................................................................... 18
1.3 Génétique de la SLA et mécanismes pathologiques ................................................................... 20
1.3.1 La SLA liée à SOD1 (ALS 1) .................................................................................................... 21
1.3.2 La SLA liée à TARDBP (ALS 10) .............................................................................................. 25
1.3.3 La SLA liée à FUS (ALS 6) ....................................................................................................... 29
1.3.4 La SLA liée à l’OPTN (ALS 12) ................................................................................................ 31
1.3.5 La SLA liée à l’UBQLN2 (ALS 15)............................................................................................ 32
1.3.6 La SLA liée à C9ORF72 (FTDALS 1) ........................................................................................ 32
1.3.7 La SLA liée à SQSTM1 (FTDALS 3) ......................................................................................... 37
1.3.8 La SLA liée à l’UBQLN4 .......................................................................................................... 38
2 La SLA liée à l’UBQLN2 ........................................................................................................................ 39
2.1 L’ubiquiline 2 ............................................................................................................................... 39
2.1.1 Le gène UBLQLN2 et la protéine ubiquiline 2....................................................................... 39
2.1.2 Localisation cellulaire ........................................................................................................... 39
2.1.3 Expression tissulaire ............................................................................................................. 40
2.1.4 Structure ............................................................................................................................... 40
2.2 Les fonctions de l’ubiquiline 2 ..................................................................................................... 43
2.2.1 Rôle de l’ubiquiline 2 dans le Système Ubiquitine-Protéasome (SUP)................................. 43
2.2.2 Rôle de l’ubiquiline 2 dans l’autophagie .............................................................................. 44
2.3 La SLA liée aux mutations dans le gène UBQLN2 ........................................................................ 47
2.3.1 Les mutations de l’UBQLN2 dans la SLA ............................................................................... 47
 2.3.2 Les caractéristiques physiopathologiques de la SLA liée à l’UBQLN2 .................................. 48
2.3.3 Les modèles animaux de la SLA liée aux mutations de l’UBQLN2........................................ 52
3 Traitements et thérapie génique pour la SLA.................................................................................... 60
3.1 Stratégies pharmacologiques pour la SLA ................................................................................... 60
3.1.1 Stratégies ciblant l’excitotoxicité ......................................................................................... 60
3.1.2 Stratégies thérapeutiques ciblant le stress oxydatif ............................................................ 61
3.1.3 Stratégies thérapeutiques ciblant la neuroinflammation .................................................... 62
3.1.4 Stratégies thérapeutiques ciblant la dégradation des protéines ......................................... 62
3.1.5 Stratégies thérapeutiques visant les dysfonctionnements mitochondriaux ....................... 63
3.1.6 Stratégies thérapeutiques visant l’apoptose dans la SLA..................................................... 64
3.1.7 Stratégies thérapeutiques via les facteurs neurotrophiques ............................................... 64
3.2 Stratégies thérapeutiques non pharmacologiques ..................................................................... 65
3.2.1 Thérapie par cellules souches .............................................................................................. 65
3.2.2 Thérapie génique .................................................................................................................. 66
4 Les Adeno-Associated Virus (AAV) pour le transfert de gènes .......................................................... 67
4.1 Biologie de l’AAV ......................................................................................................................... 67
4.2 Les sérotypes ............................................................................................................................... 69
4.3 Le cycle viral réplicatif ................................................................................................................. 69
4.4 Les AAV recombinants ................................................................................................................. 71
4.5 Développement de vecteurs AAVr double brin .......................................................................... 72
5 Modèles animaux pour les maladies neurodégénératives via les AAV .............................................. 73
5.1 Avantages des vecteurs AAVr pour la modélisation animale...................................................... 73
5.2 Modèles animaux pour les maladies neurodégénératives via les AAVr ..................................... 73
5.2.1 Modèle murin pour la SLA-DFT liée à C9ORF72 ................................................................... 73
5.2.2 Modèle de rat surexprimant p62 ......................................................................................... 74
5.2.3 Modèles murins pour la SLA-DFT liée à l’UBQLN2 ............................................................... 75
5.2.4 Modèle porcin pour l’amyotrophie spinale (SMA) ............................................................... 76
OBJECTIFS 78
MATERIELS ET METHODES 82
1 Plasmides et clonage .......................................................................................................................... 83
2 Culture cellulaire, transfection et analyses ........................................................................................ 84
2.1 Lignées cellulaires........................................................................................................................ 84
2.2 Transfection ................................................................................................................................. 84
2.3 Immunofluorescence sur cellules ................................................................................................ 84
3 Production de vecteurs AAVr ............................................................................................................. 85
4 Expérimentations animales ................................................................................................................ 85
4.1 Lignée murine .............................................................................................................................. 85
 4.2 Injections d’AAVr ......................................................................................................................... 85
4.3 Injection du bleu de méthylène (BM).......................................................................................... 86
5 Histologie ............................................................................................................................................ 86
5.1 Immunofluorescence sur tissus ................................................................................................... 86
5.2 Coloration des fibres oxydatives ................................................................................................. 87
5.3 Analyses histopathologiques au microscope .............................................................................. 87
5.4 Stéréologie................................................................................................................................... 88
6 Analyses protéiques ........................................................................................................................... 88
6.1 Western blot ................................................................................................................................ 88
6.2 Co-immunoprécipitation ............................................................................................................. 89
6.3 Spectrométrie de masse .............................................................................................................. 89
7 Analyses phénotypiques et comportementales ................................................................................. 90
7.1 Survie et poids ............................................................................................................................. 90
7.2 Masse musculaire ........................................................................................................................ 90
7.3 Analyse des propriétés contractiles du muscle ........................................................................... 90
7.4 Test d’agrippement ..................................................................................................................... 91
7.5 Analyse de la marche (footprint test) ......................................................................................... 91
7.6 Test d’anxiété clair/obscur .......................................................................................................... 92
7.7 Phénotypes de “clasping” et “spinning” (test de suspension par la queue) ............................... 92
8 Tissus humains.................................................................................................................................... 93
9 Analyses statistiques .......................................................................................................................... 93
RESULTATS 94
1 Génération d’un modèle murin de la SLA-UBQLN2 par surexpression de l’ubiquiline 2 humaine
mutée .................................................................................................................................................... 95
1.1 L’expression de l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée in vitro conduit à la formation
d’agrégats .......................................................................................................................................... 95
1.2 La transfection des plasmides AAV-Ub2 ou AAV-Ub2Mut dans les cellules ............................... 97
NSC-34 conduit à l’expression de l’ubiquiline 2 humaine ................................................................. 97
1.3 Production et injection des vecteurs AAV10 dans les ventricules cérébraux de souris nouveau-
nées sauvages pour la génération du modèle animal ....................................................................... 99
1.4 L’injection de l’AAV10-GFP par voie ICV permet l’expression de la GFP dans le SNC et le muscle
squelettique des souris sauvages .................................................................................................... 100
2 Caractérisation physiopathologique du modèle murin de la SLA-UBQLN2 ..................................... 102
2.1 L’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit l’expression de l’ubiquiline 2
dans le cerveau et la moelle épinière des souris sauvages ............................................................. 103
2.2 L’injection d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV réduit la durée de vie et le poids des souris sauvages
......................................................................................................................................................... 104
2.3 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit la formation d’agrégats dans
le cerveau et la moelle épinière des souris sauvages ..................................................................... 106
 2.4 Les agrégats formés, suite à l’injection ICV d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut dans le cerveau
et la moelle épinière des souris sauvages, sont positifs pour les protéines p62 et ubiquitine ...... 109
2.5 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une réduction du volume
cérébral et une astrogliose dans le cerveau des souris sauvages ................................................... 114
2.6 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit la perte des MNs et une
astrogliose dans la moelle épinière des souris sauvages ................................................................ 116
2.7 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une perte de la masse et une
atrophie musculaires des souris sauvages ...................................................................................... 118
2.8 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une réduction de la force
musculaire des souris sauvages ...................................................................................................... 120
2.9 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des troubles moteurs chez les
souris sauvages................................................................................................................................ 122
2.10 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des signes d’anxiété chez les
souris sauvages................................................................................................................................ 123
2.11 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des troubles neurologiques
chez les souris sauvages .................................................................................................................. 124
3 Etude in vivo des interactions de l’ubiquiline 2 mutée avec d’autres protéines par spectrométrie de
masse ................................................................................................................................................... 126
3.1 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée in vivo induit une augmentation de son interaction avec
des sous-unités du protéasome ...................................................................................................... 126
3.2 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée induit une perte de son interaction avec l’α-spectrine in
vivo .................................................................................................................................................. 130
3.3 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée induit une accumulation de l’α-spectrine dans des
lignées cellulaires ............................................................................................................................ 131
3.4 Les niveaux protéiques de l’α-spectrine sont modifiés dans les extraits de cerveaux de patients
atteints de SLA sporadique.............................................................................................................. 132
4 Test d’un traitement au bleu de méthylène sur le modèle murin de la SLA-UBQLN2 ..................... 134
4.1 Le traitement au BM réduit les agrégats d’ubiquiline 2 dans la moelle épinière des souris
injectées avec l’AAV10-Ub2, mais les augmente chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut 134
Etude de l’effet d’un nouveau traitement pour la SLA liée aux mutations de SOD1 sur les jonctions
neuromusculaires des souris SOD1G93A 136

DISCUSSION ET PERSPECTIVES 138

1) Transfert de gène à l’aide de vecteurs AAV pour la génération de modèles animaux ................... 140
2) Caractéristiques des modèles de souris surexprimant la forme sauvage ou mutée de l’ubiquiline 2
humaine............................................................................................................................................... 142
3) Intérêt du modèle surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée par rapport aux modèles existants
............................................................................................................................................................. 145
4) Absence de « pathologie TDP-43 » dans le modèle surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée . 146
5) Investigation du mécanisme pathologique de l’ubiquiline 2: gain de fonction et perte de fonction
............................................................................................................................................................. 147
6) Administration du BM chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée
comme paradigme pour le test de thérapies ...................................................................................... 149
7) Conclusions et perspectives ............................................................................................................ 151

BIBLIOGRAPHIE 153

ANNEXE 177
 RESUME

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable

caractérisée par la perte progressive des motoneurones (MNs) au niveau du cortex moteur primaire,
du tronc cérébral et de la moelle épinière. Environ 10% des cas de SLA sont de forme familiale (SLAf) à
transmission autosomique dominante, et à ce jour, plusieurs gènes ont été associés à la SLAf.
Récemment, des mutations dans le gène UBQLN2, codant pour l’ubiquiline 2, ont été identifiées dans
des formes héréditaires de SLA et de SLA avec Démence Fronto-Temporale (SLA-DFT). Ces mutations
induisent la formation d’agrégats protéiques dans la moelle épinière de patients atteints de SLA, ainsi
que dans le cerveau de patients atteints de SLA-DFT. De façon intéressante, ces agrégats positifs à
l’ubiquiline 2, ont également été retrouvés dans d’autres formes familiales ainsi que dans des formes
sporadiques de SLA et de SLA-DFT. En raison de l’implication de l’ubiquiline 2 dans les voies assurant
la dégradation et le recyclage des protéines ubiquitinylées, essentielles pour la protéostasie et la survie
cellulaire, son rôle semble être déterminant dans la pathogénèse des différents types de SLA.

Pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la maladie et envisager des solutions

thérapeutiques, nous avons créé un modèle murin de SLA et de SLA-DFT liées à l’UBQLN2 par le
transfert de gène via un vecteur viral associé à l’adénovirus (AAV). Plus précisément, nous avons
généré deux lignées de souris exprimant soit l’ubiquiline 2 humaine sauvage, soit la forme humaine
contenant la mutation P497H, par l’injection intracérébroventriculaire (ICV) d’un vecteur AAV10. Les
souris modèles ont récapitulé l’ensemble des caractéristiques associées à la maladie ; à savoir la
présence d’inclusions d’ubiquiline 2 dans la moelle épinière et dans le cerveau, une
neuroinflammation, la dégénérescence des MNs, une atrophie et une faiblesse musculaire, des
troubles cognitifs ainsi qu’une mort prématurée des souris exprimant la mutation.

De plus, par analyse de spectrométrie de masse, nous avons mis en évidence la perte
d’interaction de l’ubiquiline 2 mutée avec une protéine indispensable pour le maintien du
cytosquelette des neurones, l’α-spectrine.

Comme étape finale de validation de notre modèle, nous avons étudié l’effet du Bleu de
Méthylène (BM), reconnu pour éliminer les agrégats protéiques toxiques. Le BM s’est révélé efficace
pour réduire le nombre d’agrégats induits par la surexpression de la forme sauvage de l’ubiquiline 2.
Paradoxalement, le BM a augmenté la quantité d’inclusions engendrées par la surexpression de
l’ubiquiline 2 mutée.

Cette étude a donc permis d’obtenir un paradigme solide pour l’étude de l’implication de
l’ubiquiline 2 dans la SLA ; et en perspective, pour comprendre les mécanismes d’agrégation protéique
associés aux maladies neurodégénératives. Ce travail représente ainsi une première étape pour
l’élaboration de stratégies thérapeutiques efficaces pour les formes familiales et sporadiques de la
pathologie.

Mots clés : SLA, ubiquiline 2, modèle murin, AAV10, ICV.

1
 ABSTRACT

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is an incurable neurodegenerative disease characterized by

progressive loss of motor neurons (MNs) in the primary motor cortex, brain stem and spinal cord.
Approximately 10% of ALS cases are familial forms (fALS) with autosomal transmission, and to date
different genes have been associated with fALS. Recently, mutations in the UBQLN2 gene, encoding
ubiquilin 2, have been identified in hereditary forms of ALS and ALS with FrontoTemporal Dementia
(ALS-FTD). These mutations induce the formation of protein aggregates in the spinal cord of patients
with ALS and in the brain of patients with ALS-FTD. Interestingly, these ubiquilin 2-positive aggregates
have also been found in other familial forms as well as in sporadic forms of ALS and ALS-FTD. The role
of ubiquilin 2 seems to be crucial in the pathogenesis of the different types of ALS, due to its
involvement in proteostasis.

To understand the physiopathology of the disease and to envision therapeutic strategies, we

have generated an ubiquilin 2-linked ALS and ALS-FTD mouse model using Adeno Associated Virus
(AAV) vectors. Specifically, we have generated two mouse lines expressing either the wild-type human
ubiquilin 2 or the mutant form carrying the P497H mutation, by intracerebroventricular (ICV) injection
of an AAV10. Injected mice recapitulated disease associated phenotypes; namely the presence of
ubiquilin 2 inclusions in brain and spinal cord, neuroinflammation, MNs degeneration, skeletal muscle
atrophy and weakness, cognitive impairment. Premature death was also observed in mice
overexpressing the mutant ubiquilin 2.

Furthermore, mass spectrometry analysis revealed a loss of interaction between the mutant
protein and one protein necessary for cytoskeleton maintenance of neurons, the α-spectrin.

As last validation step of our model, we studied the effect of Methylene Blue (MB), known to
eliminate toxic protein aggregates. MB reduced the number of aggregates induced by the
overexpression of the wild-type ubiquilin 2. Surprisingly, MB treatment increased the number of
inclusions in mice expressing the mutant ubiquilin 2.

In conclusion, this study presents a solid paradigm to study the involvement of ubiquilin 2 in ALS,
and in perspective to understand protein aggregation mechanisms underlying neurodegenerative
diseases. This work is a first step for the development of effective therapeutic strategies for familial
and sporadic forms of ALS.

Key words : ALS, ubiquilin 2, murine model, AAV10, ICV.

2
 TABLE DES FIGURES
Figure 1: Localisation des motoneurones centraux et périphériques dans le système nerveux central
(SNC). ..................................................................................................................................................... 12
Figure 2: Chevauchements clinique, génétique et pathologique de la SLA (ALS) et de la DFT (FTD). .. 19
Figure 3: Graphique représentant les principaux gènes associés à la SLA, identifiés depuis 1993. ..... 21
Figure 4: Hypothèses sur le rôle toxique de la protéine SOD1 mutée. ................................................. 23
Figure 5: Représentation schématique des gènes et des mécanismes conduisant à la protéinopathie
TDP-43 et l’implication de celle-ci dans la pathogénèse de la SLA. ...................................................... 26
Figure 6: Représentation schématique des fonctions physiologiques de FUS. .................................... 30
Figure 7: Représentation schématique des structures secondaires et tertiaires perturbant la
transcription du gène C9ORF72 ............................................................................................................ 34
Figure 8: Représentation schématique de la protéine p62. ................................................................. 37
Figure 9: Représentation schématique du gène UBQLN2 et de la protéine ubiquiline 2 humaine. ..... 41
Figure 10: Représentations schématiques de la structure et du mécanisme de liaison des hélices de
polyproline de type II (PPII) et des domaines SH3. ............................................................................... 42
Figure 11: Représentation schématique de la prise en charge et de la dégradation des protéines mal
repliées par le Système Ubiquitine-Protéasome (SUP). ........................................................................ 43
Figure 12: Le système protéolytique. .................................................................................................... 46
Figure 13: Représentation schématique de l’implication de l’ubiquiline 2 dans la voie macro-
autophagique et la voie de Dégradation des protéines Associées au Réticulum Endoplasmique
(DARE).................................................................................................................................................... 47
Figure 14: Schéma représentatif des mutations de l’ubiquiline 2 identifiées chez des patients atteints
............................................................................................................................................................... 48
Figure 15: Photos représentatives de l’atteinte de la moelle épinière dans la SLA liée à l’UBQLN2.... 49
Figure 16: Photos représentatives de la formation d’inclusions “skein-like” localisées dans les
neurones de moelle épinière chez un patient atteint de SLA liée à l’ubiquiline 2P506T. ........................ 50
Figure 17: Photos représentatives des inclusions positives pour l’ubiquiline 2 observées dans
P506T
l’hippocampe d’un patient atteint de SLA liée à l’ubiquiline 2 . ...................................................... 51
Figure 18: Représentation schématisée du contrôle de l’expression du gène codant pour l’ubiquiline
2 mutée. ................................................................................................................................................ 54
Figure 19: Les agents neuroprotecteurs et leur cible dans la pathogénèse de la SLA. ......................... 65
Figure 20: L’organisation du génome de l'AAV . ................................................................................... 68
Figure 21: Étapes majeures du trafic intracellulaire des particules d’AAV . ......................................... 70
Figure 22: Le cycle réplicatif de l'AAV. .................................................................................................. 71
Figure 23: Test d’agrippement. ............................................................................................................. 91
Figure 24: Principe de mesure de la longueur et du chevauchement des pas ..................................... 91
Figure 25: Cage utilisée pour le test d’anxiété clair/obscur.................................................................. 92
Figure 26: Expression et localisation de l’ubiquiline 2 dans les cellules NSC-34 et Neuro2a ............... 96
Figure 27: Expression de l’ubiquiline 2 humaine 48h après la transfection des cellules NSC-34 ......... 97
Figure 28: Représentation schématisée des plasmides AAV-GFP, AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut. ............ 98
Figure 29: Expression de l’ubiquiline 2 humaine suite à la transfection des cellules NSC-34 .............. 98
Figure 30: Représentation schématisée de l’injection en ICV des AAV10 ............................................ 99
Figure 31: Expression de la GFP dans le cerveau, la moelle épinière et le muscle squelettique........ 101
Figure 32: Représentation schématisée du protocole mis en place pour la caractérisation du modèle
animal. ................................................................................................................................................. 102
Figure 33: Expression de l’ubiquiline 2 humaine dans la moelle épinière et le cerveau .................... 103
Figure 34: Réduction de la survie et du poids chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine
mutée. ................................................................................................................................................. 105

3
Figure 35: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans le cortex moteur et l’hippocampe 107
Figure 36: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans le cervelet ...................................... 108
Figure 37: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans moelle épinière ............................. 109
Figure 38: Présence d’agrégats positifs pour p62 dans le cerveau ..................................................... 110
Figure 39: Présence d’agrégats positifs pour p62 et l’ubiquitine dans la moelle épinière ................. 111
Figure 40: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquitine dans le cerveau ........................................ 113
Figure 41: Réduction du volume cérébral des souris exprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou
mutée. ................................................................................................................................................. 115
Figure 42: Astrogliose observée dans le cerveau des souris surexprimant ........................................ 116
Figure 43: Perte des MNs dans la moelle épinière des souris exprimant ........................................... 117
Figure 44: Astrogliose observée dans la moelle épinière des souris surexprimant ............................ 118
Figure 45: Observation d’une atrophie musculaire chez les souris surexprimant .............................. 119
Figure 46: Augmentation du nombre de fibres musculaires oxydatives dans le Tibialis anterior des
souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée. ........................................................ 120
Figure 47: Observation d’une faiblesse musculaire chez les souris surexprimant ............................. 121
Figure 48: Observation de troubles moteurs chez les souris surexprimant ....................................... 122
Figure 49: Observation de signes d’anxiété chez les souris surexprimant ......................................... 124
Figure 50: Observation d’un phénotype « clasping » chez les souris surexprimant ........................... 125
Figure 51: Observation d’un phénotype « spinning » chez les souris surexprimant .......................... 125
Figure 52: Vérification de l’efficacité d’immunoprécipitation par western blot. ............................... 126
Figure 53: Migration sur gel des protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 de moelle
épinière................................................................................................................................................ 127
Figure 54: Liste de protéines identifiées suite à l’analyse par spectrométrie de masse. ................... 128
Figure 55: Schéma du protéasome montrant les protéines interagissant uniquement ..................... 129
Figure 56: Western blot montrant l’accumulation anormale d’ubiquitine dans le cerveau .............. 130
Figure 57: Perte d’interaction de l’ubiquiline 2 avec l’α-spectrine chez les souris............................. 131
Figure 58: Accumulation des formes complète et clivées de l’α-spectrine dans les cellules NSC-34. 132
Figure 59: Accumulation des formes complète et clivée de l’α-spectrine dans le cortex .................. 133
Figure 60: Révélation au rouge Ponceau des protéines du cortex d’individus contrôles ou atteints de
SLAs ..................................................................................................................................................... 133
Figure 61: Analyse du nombre d’agrégats d’ubiquiline 2 suite au traitement au BM. ....................... 135

4
 TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1: Critères d’Airlie House pour le diagnostic de la SLA .......................................................... 15
Tableau 2: Principaux gènes associés à la SLA ..................................................................................... 17
Tableau 3: Modèles de SLA liée à l’UBQLN2 avec leurs caractéristiques physiopathologiques. .......... 59
Tableau 4: Séquence des amorces. ....................................................................................................... 83
Tableau 5: Titre des vecteurs AAVr. ...................................................................................................... 85
Tableau 6: Caractéristiques des individus contrôles (témoin) et des patients atteints de SLA
sporadiques. .......................................................................................................................................... 93

5
 ABREVIATIONS
µm : micromètre
32G : 32 Gauges
A315T : Alanine substituée en Thréonine en position 315
A382T : Alanine substituée en Thréonine en position 382
A4V : Alanine substituée en Valine en position 4
AAV : Adéno-Associated Virus
AAVdb : Adéno-Associated Virus double brin
AAVr : Adéno-Associated Virus recombinant
AAVsb : Adéno-Associated Virus simple brin
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : ADN complémentaire
alfa-1 (ok3062) : α1-antitrypsine
ALS : Amyotrophic Lateral Sclerosis
AMC : Autophagie Médiée par les Chaperonnes
AMPA : α-alpha-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate
ANG : Angiogénine
APP : Aphasie Primaire Progressive
ARN : Acide RiboNucléique
ARNm : Acide RiboNucléique messager
ARN-sh : ARN en épingle à cheveux (short hairpin)
ARNsi : ARN interférent (small interfering)
ATP : Adénosine TriPhosphate
ATPase : Adénosine TriPhosphatase
ATXN2 : Ataxine 2
b : bases
BHE : Barrière Hémato-Encéphalique
BM : Bleu de Méthylène
BSA : Bovine Serum Albumin
C21ORF2 : Chromosome 21 Open Reading Frame 2
C9ORF72 : Chromosome 9 Open Reading Frame 72
CaMkα2 : Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase II alpha
CAP : Calcium-dependent Activator Protein
CBA : Chromosome Bactérien Artificiel
CD19+ : Cluster of Differentiation 19
CD33+ : Cluster of Differentiation 33
CD4+ : Cluster of Differentiation 4
CD8+ : Cluster of Differentiation 8
ChAT : Choline Acetyltransferase
CHCHD10 : Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix Domain Containing 10
CHMP2B : Charged Multivesicular body Protein 2B
CMA: Chaperone Mediated Autophagy
CO2 : dioxide de carbone
CTFs : phosphorylated C-Terminal Fragments
Ctip2 : Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor-interacting protein 2
CTL : contrôle
D83G : acide aspartique substitué en Glycine en position 83
D90A : acide aspartique substitué en Alanine en position 90
DAO : D-amino Acid Oxidase
DARE : Dégradation des protéines Associées au Réticulum Endoplasmique
db : double brin
DCTN1 : Dynactin subunit 1
DD : Duplex Dimer
DFT : Démence Fronto-Temporale
DFTvc : DFT à variante comportementale
DLFT : Dégénérescence Lobaire Fronto-Temporale

6
DM : Duplex Monomer
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DRP : Dynamin-Related Protein
DS : Démence Sémantique
E478G : acide glutamique substitué en Glycine en position 478
E54D : acide glutamique substitué en acide aspartique en position 54
EAAT2 : Transporteur d’acide aminé excitatoire
ECL : Enhanced ChemiLuminescence
EEA1 : Early Endosome Antigen 1
EGFP : Enhanced Green Fluorescent Protein
ENMG : ElectroNeuroMyoGramme
ERN : Expansion d’une Répétition de Nucléotides
ESS : cellules souches embryonnaires
FDA : Food and Drug Administration
FFPE : Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded
FTDALS: FrontoTemporal Dementia - Amyotrophic Lateral Sclerosis
FTLD: FrontoTemporal Lobar Dementia
FUS: Fused in Sarcoma
FVB : Friend Virus B
Fw : Forward
FXTAS : Fragile X–associated Tremor/Ataxia Syndrome
g : gramme
G127X : Glycine substituée en un autre acide aminé en position 127
G298S : Glycine substituée en Sérine en position 298
G348C : Glycine substituée en Cystéine en position 348
G37R : Glycine substituée en arginine en position 37
G4C2 : Guanine(4)-Cytosine(2)
G85R : Glycine substituée en arginine en position 85
G93A : Glycine substituée en Alanine en position 93
GDNF : Glial cell-Derived Neurotrophic Factor
GFAP : Glial Fibrillary Acidic Protein
GFP : Green Fluorescent Protein
GLT1: Glutamate Transporter 1
gv/ml : génomes viraux par millilitre
H46R : Histidine substituée en arginine en position 46
H48Q : Histidine substituée en glutamine en position 48
HCl : acide chlorhydrique
HEK293T : Human Embryonic Kidney cells
Herp : Homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein
hnRNPA1 : heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein A1
hnRNPA2B1 : heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein A2/B1
HPR : Horseradish Peroxydase
HSC : Hematopoietic Stem Cells
HSC70 : Heat Shock Cognate protein 70
hSOD1 : SOD1 humaine
Hsp70 : Heat shock protein 70
I113T : Isoleucine substituée en Thréonine en position 113
Iba-I : Ionized calcium binding adapter molecule 1
ICV : IntraCérébroVentriculaire
IGF-1: Insulin-like Growth Factor-1
IgG : Immunoglobuline G
IL-6 : Interleukine 6
Ipsc : Induced pluripotent stem cells
IRM : Imagerie par Résonance Magnétique
ITR : Inverted Terminal Repeat
IV : IntraVeineux
J0 : Jour 0
kDa : kilo Dalton
KO : Knock Out

7
L126Z : mutation stop à la Leucine en position 126
L84V : Leucine substituée en Valine en position 84
lacZ : beta-lactamase Z
LAMP-2A : Lysosomal Associated Membrane Protein type 2A
LC3 : Light Chain 3
LIR : LC3 Interacting Region
LTR : Long Terminal Repeat
M337V : Méthionine substituée en Valine en position 337
MAP 1-LC3 : Microtubule-Associated Protein 1-Light Chain 3
MATR3 : Matrine 3
miARN : micro-ARN artificiel
MN : MotoNeurone
MNC : MotoNeurones Centraux
MNP : MotoNeurones Périphériques
MOBP : Myelin-associated Oligodendrocyte Basic Protein
MOPS : 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MSC : Mesenchymal Stem Cells
N : Newton
NaCl : chlorure de sodium
NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide
NEK1 : NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 1
NeuN : Neuronal specific Nuclear
Neuro2a : Neuroblastoma
NI : Non Injectées
NIAID : National Institute of Allergy and Infectious Diseases
NK : Natural Killer
NMD : Nonsense-Mediated Decay
NMDA : N-Methyl-D-Aspartic acid
NOR-test: Novel Object Recognition test
NSC-34 : Neuroblastoma Spinal Cord cells
N-Src : Neural form of Src (Sarcoma)
NT : Non Transfecté
OPTN : Optineurine
P1 : Post Natal 1
P506T : Proline substituée en Thréonine en position 506
P520T : Proline substituée en Thréonine en position 520
p62 : nucleoporin 62
pb : paire de bases
PBS : Phosphate-Buffered Saline
PcDNA : plasmide ADN complémentaire
PCR : Polymerase Chain Reaction
PFA : ParaFormAldehyde
PFN1 : Profiline 1
PGK : PhosphoGlycérate Kinase
PGRN: Protein Granulin precursor
PPII : hélice de PolyProline de type II
PVDF : PolyVinylidene DiFluoride
PXX : P = proline, X = autre acide aminé
Q331K : Glutamine substituée en Lysine en position 331
Q398X : Glutamine substituée en un autre acide aminé en position 398
RE : Réticulum Endoplasmique
REP : Replication initiator Protein
Rev : Reverse
rhAAV10 : rhésus AAV10
RIPA : Radio Immuno Precipitation Assay
RT-PCR : Real Time Polymerase Chain Reaction
sb : simple brin
SCFD1 : Sec1 family domain-containing protein 1
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

8
SEM : Standard Error of the Mean
Sh : Short hairpin
SH3 : Src Homology 3
SLA : Sclérose Latérale Amyotrophique
SLAf : SLA familiale
SLAs : SLA sporadique
SMA : Spinal Muscular Atrophy
SNC : Système Nerveux Central
SOD1 : SuperOxyde Dismutase 1
SPTAN1 : Spectrin alpha chain
SQSTM1: Séquestrome 1
Sti1 : Stress induced protein 1
SUP : Système Ubiquitine-Protéasome
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TA : Tibialis anterior
TAF15 : TATA-box binding protein associated Factor 15
TARDBP : TAR DNA-binding protein 43
TDP-43 : TAR DNA-binding protein 43
tTA : tétracycline
TRE : Tetracycline-Response Element
TFIID : Transcription Factor II D
Tg : Trangénique
TRS : Terminal Resolution Site
TUBA4A : Tubuline Alpha 4a
Ub2Mut : Ubiquiline 2 Mutée
UBA : Ubiquitin-Associated domain
UBL : Ubiquitin-Like domain
Ubq : Ubiquitine
UBQLN 2: Ubiquiline 2
Ubxd8 : Ubiquitin regulatory X domain-containing protein 8
UNC13A: Unc-13 homolog A
UPR : Unfolded Protein Response
UTR : UnTranslated Region
VAPB : Vesicule Associated membrane Protein B
VCP : Valosin Containing Protein
vg : viral genome
VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine
WPRE : Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional regulatory element

9
INTRODUCTION

10
1 La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
Les amyotrophies progressives et incurables se caractérisent par la dégénérescence des
neurones moteurs, appelés motoneurones (MNs, assurant le contrôle de la motricité), au niveau
du cortex moteur, du bulbe rachidien et/ou de la moelle épinière (Strong, 2003; Monani, 2005).
La SLA est la maladie du MN la plus fréquente chez l’adulte, suivie de la maladie de Kennedy (X-
linked Spinal and Bulbar Muscular Atrophy ou SBMA) et de la Sclérose Latérale Primitive (SLP)
(MacLean et al. 1996; Singer et al. 2007). Les maladies du MN sont relativement rares et forment
un groupe cliniquement hétérogène (origine familiale ou sporadique, pouvant toucher aussi bien
l’enfant que l’adulte). Dans tous les cas, la dégénérescence des MNs conduit à une faiblesse et
une atrophie musculaire, voire même à des difficultés de langage et de déglutition dans certains
cas, ainsi qu’à une détresse respiratoire (Gordon et al., 2013).

1.1 Présentation générale de la maladie

1.1.1 Historique et description de la SLA
La Sclérose Latérale Amyotrophique a été décrite pour la première fois, en 1850, par le
docteur François Amilcar Aran. A cette époque, elle est appelée « Atrophie Musculaire
Progressive » en raison des caractéristiques phénotypiques observées : perte de poids, faiblesse
musculaire, dyspnée (difficultés respiratoires), rigidité des membres ainsi que des fasciculations
(contractions musculaires involontaires : tressautements) (François Amilcar Aran, 1850). En 1853,
les médecins Guillaume Duchenne et Jean Cruveilhier décrivent d’un point de vue clinique la forme
bulbaire de la maladie. Au cours d’une autopsie, Jean Cruveilhier démontre une atteinte de la
moelle épinière avec l’atrophie des racines antérieures qui précède l’atrophie musculaire
(Cruveilhier, 1853-4). Par la suite, Jean-Martin Charcot met en évidence l’atteinte du bulbe chez
une jeune femme atteinte d’une faiblesse progressive, de contractures et d’anormalités
sensorielles. En effet, il a pu observer des changements sclérotiques gris brunâtres dans les aires
latérales de la moelle épinière cervicale mais pas dans les cornes antérieures. En revanche, il a
remarqué des lésions dans les cornes antérieures accompagnées d’une dégénérescence des
cellules nerveuses motrices chez un enfant paralysé. Il en déduit que la sclérose latérale est
associée à la spasticité et aux contractures, alors que les pathologies des cornes ventrales sont
liées à la faiblesse musculaire atrophique. Ainsi, la maladie s’appelle désormais la « Sclérose
Latérale Amyotrophique » (SLA), ou encore la maladie de Charcot, qu’il décrit avec précision dans
le recueil de ses « Leçons sur les maladies du système nerveux faites à la Sâlpétrière » en 1874
(Bromberg, 2015).

11
 La SLA est une maladie neurodégénérative rare incurable qui touche le système moteur. Le
nom de la maladie fait référence aux différents compartiments tissulaires qui sont sévèrement
touchés. Tout d’abord, la "sclérose" désigne le tissu cicatriciel et fibreux laissé par la
dégénérescence des MNs. Ensuite, le terme "latérale" fait référence aux MNs altérés qui sont
situés de chaque côté de la moelle épinière, et enfin "amyotrophique" signifie l’atrophie des fibres
musculaires avec la perte de masse musculaire (Musarò et al., 2010). La SLA est principalement
caractérisée par la perte progressive des MNs localisés au niveau du cortex cérébral et du bulbe
(MNs centraux), ainsi que dans la corne antérieure de la moelle épinière MNs périphériques)
(figure 1). Le rôle de ces MNs est de transmettre les signaux électriques provenant du cerveau et
de la moelle épinière vers les muscles qui contrôlent les mouvements volontaires (Pradat et al.,
2006).

Figure 1 : Localisation des motoneurones centraux et périphériques dans le système nerveux central (SNC).
La SLA touche les neurones moteurs centraux localisés dans le cortex cérébral et la medulla (en rouge), ainsi que
les neurones moteurs périphériques situés dans les cornes antérieures de la moelle épinière (en vert). Schéma
modifié à partir de : http://yassermetwally.wordpress.com/dementia-alzheimer-type-and-others/motor-
neuron-disease/

12
1.1.2 Fréquence et répartition de la maladie
La SLA fait partie des maladies orphelines dont l’incidence annuelle est relativement
homogène dans le monde (environ 1,9 cas sur 100 000 personnes) (Arthur et al., 2016), à
l’exception de quelques populations ethniques moins affectées comme les Indiens d’Amériques,
ou certaines régions plus touchées comme l’Île de Guam, la péninsule japonaise Kii et la Nouvelle
Guinée occidentale. Les taux d’incidence augmentent avec l’âge pour atteindre un pic entre 70 et
80 ans, avec davantage d’hommes touchés que de femmes (Gordon et al., 2013). La prévalence
annuelle, d’environ 5 cas sur 100 000 personnes, reflète la rapidité à laquelle les patients décèdent
après que la maladie soit diagnostiquée (Taylor et al., 2016).

1.1.3 Manifestations cliniques de la SLA

Les symptômes apparaissent généralement entre 50 et 60 ans (Gordon et al., 2013). En
fonction de la région touchée, la SLA peut se présenter principalement sous deux formes :

- la forme « spinale » qui concerne les deux tiers des cas, est due à la dégénérescence des MNs
situés dans la moelle épinière. Elle se manifeste dans les membres, avec le plus souvent des
premiers symptômes dans un seul membre. Très vite, le patient aura une perte de sa dextérité,
une faiblesse lorsqu’il lève les bras, des difficultés à marcher liées à une faiblesse des muscles
releveurs du pied pouvant ainsi entrainer sa chute. L’apparition progressive des déficits moteurs
s’accompagnent également de crampes et de fasciculations touchant les muscles atrophiés ou
sains en apparence.

- la forme « bulbaire » est associée à la dégénérescence des MNs du tronc cérébral. Elle est plus
fréquente chez les femmes âgées. La maladie débute le plus souvent par de la dysarthrie (troubles
de l’élocution causée par des lésions des MNs dans le cerveau) suivie d’une dysphagie (difficulté
à avaler) pouvant progresser en sialorrhée (sécrétion excessive de salive), de malnutrition et
d’anarthrie (difficulté ou impossibilité d’articuler les sons du langage). La faiblesse axiale peut
causer un chute de la tête et une cyphose (courbure dorsale excessive) qui sont associées à la
douleur et à un mauvais équilibre (Gordon et al., 2013).

Les patients peuvent ressentir des douleurs plus ou moins fortes qui sont souvent
associées aux contractions musculaires, aux crampes musculaires, à la mobilité articulaire réduite,
à la pression cutanée causée par l'immobilité et pouvant entrainer la formation d’escarres
(Hanisch et al., 2015).

Auparavant, la SLA était diagnostiquée comme une pathologie exclusivement

neuromusculaire sans atteinte cognitive, mais elle est maintenant considérée comme une maladie
avec un large spectre comprenant également des cas qui associent d’importants déficits
13
neuromusculaires et cognitifs (Montuschi et al., 2015, Ringholz et al., 2005). Jusqu’à 50% des cas
de SLA présentent des troubles cognitifs et environ 15% montrent des signes de Démence Fronto-
Temporale (DFT) qui se manifestent par des changements du comportement et de la personnalité,
avec des difficultés au niveau des fonctions exécutives, du langage et du jugement (Montuschi et
al., 2015, Ringholz et al., 2005). Ces cas de SLA-DFT ont une survie plus courte, peut-être en raison
de l’indécision du patient à suivre les soins. A n'importe quel stade de la maladie, des signes de
dépression et d’anxiété peuvent également apparaître (Gordon et al., 2013).

Les symptômes apparaissent de façon progressive et ils sont variables d’un patient à
l’autre ou chez différents membres issus d’une même famille portant la même mutation du gène
(Gordon et al., 2013). Les patients décèdent généralement 3 à 5 ans après l’apparition des
symptômes par une insuffisance respiratoire (Rowland et al., 2001).

1.1.4 Diagnostic et pronostic

Diagnostic :
Le diagnostic positif de la maladie repose sur la mise en évidence de signes cliniques, mais
il est parfois difficile à établir en raison de la discrétion des premiers symptômes (crampes,
faiblesse de la main, modification de la voix). De plus, le médecin doit effectuer un diagnostic
différentiel dans le but d’écarter les maladies qui présentent certains symptômes identiques à la
SLA.

Pour cela, un électroneuromyogramme (ENMG) est systématiquement réalisé afin de vérifier

si les muscles et les neurones moteurs périphériques sont atteints. Cet examen se fait en deux
temps :
- le muscle est stimulé par un courant électrique de manière directe (électrodes en contact
du muscle) ou indirecte (électrodes en contact des MNs). En cas de SLA, l’ENMG révèle que le
muscle se contracte normalement mais que les MNs innervant le muscle ne transmettent plus ou
mal l’influx nerveux, signifiant une dénervation. Les résultats de l’ENMG montrent alors
généralement des vitesses de conduction motrice et sensitive normales, par contre, l’amplitude
du potentiel d’action musculaire décroît suivant le degré de perte motoneuronale.
- l’activité électrique des muscles au repos et lors d’une contraction volontaire est
enregistrée à l’aide d’une électrode-aiguille insérée dans le muscle. Au repos, l’atteinte des MNs
se traduit par des signes de dénervation active (fibrillations et ondes lentes positives) associés à
des fasciculations. Lors d’une contraction volontaire, l’ENMG révèle une réduction du nombre de
potentiels d’unité motrice (Couratier et al., 2014).

14
 L’ENMG peut être aussi réalisé par stimulation transcrânienne pour vérifier si les neurones
moteurs centraux sont touchés (Couratier et al., 2014).

Des analyses d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) sont également réalisées pour
compléter le diagnostic différentiel. L’IRM cérébrale permet notamment de vérifier l’hypothèse
de tumeur localisée au niveau du tronc cérébral. L’IRM médullaire, quant à elle, permet de
diagnostiquer une myélopathie cervicale, une ischémie médullaire et une syringomyéline
(Couratier et al., 2014).

La suspission d’un lymphome est écartée par des analyses biologiques (hémogramme,
mesure de la vitesse de sédimentation ou dosage de la protéine C-réactive, électrophorèse des
protéines sériques) (Couratier et al., 2014).

L’examen du liquide cérébro-spinal, prélevé par ponction lombaire, permet d’orienter le

diagnostic différentiel vers une autre affection que la SLA, comme un lymphome ou une maladie
infectieuse (maladie de Lyme, syphilis, VIH) (Couratier et al., 2014).

Le niveau de certitude du diagnostic de la SLA est défini suivant les critères d’El Escorial ou
les critères d’Airlie House, ces derniers étant une révision des critères d’El Escorial (tableau 1)
(Couratier et al., 2014).

Tableau 1: Critères d’Airlie House pour le diagnostic de la SLA (Couratier et al., 2014).

Niveau de certitude Caractéristiques

SLA cliniquement certaine Signes d’atteinte des MNC et MNP : région bulbaire et 2 régions
spinales ou 3 régions spinales
Signes d’atteinte des MNC et MNP dans au moins 2 régions avec des
SLA cliniquement probable signes d’atteintes du MNC rostral par rapport aux signes
périphériques

SLA cliniquement probable Signes d’atteinte des MNC et MNP dans 1 région et signes d’atteinte
du MNP par ENMG dans au moins 2 régions*
étayée par des examens ou
paracliniques Signes d’atteinte des MNC dans 1 région et signes d’atteinte du MNP
par ENMG dans au moins 2 régions*

Signes d’atteinte des MNP et MNC dans 1 région*

ou
Signes d’atteinte des MNC dans au moins 2 régions*
SLA cliniquement possible ou
Signes d’atteinte des MNP rostraux par rapport aux signes d’atteinte
des MNC avec absence de preuve électrophysiologique d’atteinte
des MNP dans d’autres régions*
MNC : motoneurones centraux ; MNP : motoneurones périphériques. * après exclusion des autres causes par neuro-imagerie,
électrophysiologie et investigations biologiques.

15
Pronostic :
La médiane de survie est en moyenne de 19 mois à partir du diagnostic et de 30 mois à partir
de l’apparition des symptômes, mais elle est très variable suivant les cas, allant de quelques mois
à plusieurs dizaines d’années (Gordon et al., 2013). Généralement, un meilleur pronostic de survie
est associé à une SLA avec un début spinal plutôt que bulbaire, un diagnostic réalisé à un âge
précoce, une progression lente des symptômes, une atteinte respiratoire moins grave, une
meilleure fonction motrice, un poids stable ainsi qu’une durée plus longue entre l’apparition des
symptômes et le diagnostic (Gordon et al., 2013 ; Couratier et al., 2014). En fonction des mutations
génétiques responsables des formes familiales de SLA, la durée de survie est variable. Par
exemples, les mutations des gènes C9ORF72 et FUS (présentés dans les paragraphes « 1.3.6 La SLA
liée à C9ORF72 » et « 1.3.3 La SLA liée à FUS ») sont associés à une durée de survie plus courte.
Les différentes mutations identifiées dans le gène SOD1 (présenté dans le paragraphe « 1.3.1 La
SLA liée à SOD1 ») ne vont pas avoir le même impact sur la durée de survie, comme c’est le cas
pour la mutation A4V qui est une forme très rapide de la maladie comparée aux mutations D90A
(Couratier et al., 2014).

1.2 Les différentes formes de SLA

1.2.1 Les formes sporadiques et familiales de la SLA
La majorité des formes de SLA sont des formes sporadiques (SLAs) et leurs causes sont
encore inconnues ; environ 10% des cas de SLA sont des formes familiales (SLAf). Pour ces deux
formes, les mécanismes impliqués dans la dégénérescence des MNs sont encore mal connus du
fait de leur complexité et des causes multifactorielles. La SLAf est liée à des facteurs génétiques
qui sont, dans la majorité des cas, à caractère dominant avec une forte pénétrance. Jusqu’à
présent, plus de 100 gènes lui sont associés (les gènes associés à la SLA les plus étudiés sont
présentés dans le tableau 2, les autres mutations sont référencées dans la base de données
« ALSoD database ») et la cause génétique est connue dans plus de 70% des cas (Al-Chalabi et al.,
2013). Certaines SLAs peuvent également présenter des variations génétiques touchant des gènes
responsables de SLAf. Néanmoins, la cause de la maladie est inconnue pour la majorité des
patients atteints de SLAs (Taylor et al., 2016). D’autres gènes mutés, encore non identifiés, ainsi
que des facteurs de risques environnementaux (activité physique intense, le tabac, certains
métaux lourds, etc.) pourraient expliquer ces cas (Al-Chalabi et al., 2013).

16
 Tableau 2 : Principaux gènes associés à la SLA (d’après : Alsultan et al., 2016 ; Taylor et al., 2016; Al Chalabi et
al., 2013 ; Boylan, 2015 ; Edens et al., 2017).
Classification Locus Gène Protéine
ALS 1 21q22 SOD1 Superoxide dismutase 1
ALS 2 2q33.2 ALS2 Alsin
ALS 3 18q21 Inconnu Inconnu
ALS 4 9q34 SETX Senataxin
ALS 5 15q14 SPG11 Spatacsin
ALS 6 16p11.2 FUS Fused in sarcoma
ALS 7 20p13 Inconnu Inconnu
ALS 8 20q13.3 VAPB Vesicle-associated membrane protein-associated protein B
ALS 9 14q11.2 ANG Angiogenin
ALS 10 1p36.2 TARDBP TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43)
ALS 11 6q21 FIG4 Polyphosphoinositide phosphatase
ALS 12 10p13 OPTN Optineurin
ALS 13 12q24.1 ATXN2 Ataxin-2
ALS 14 9p13.3 VCP Valosin-containing protein
ALS 15 Xp11.21 UBQLN2 Ubiquilin 2
ALS 16 9p13.3 SIGMAR1 Sigma non-opioid intracellular receptor 1
ALS 17 3p11.2 CHMP2B Chromatin modifying protein 2B
ALS 18 17p13.3 PFN1 Profilin 1
ALS 19 2q34 ERBB4 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4
ALS 20 12q13.13 HNRNPA1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1
ALS 21 5q31.2 MATR3 Matrin 3
ALS 22 2q36.1 TUBA4A Tubulin alpha-4A
FTDALS1 9p21.2 C9ORF72 Chromosome 9 open reading frame 72
FTDALS2 22q11.23 CHCHD10 Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 10
FTDALS3 5q35.3 SQSTM1 Sequestosome 1 (p62)
FTDALS4 12q14.1 TBK1 Serine/threonine-protein kinase TBK1
ALS 12q24 DAO D-amino-acid oxidase
ALS 2p13 DCTN1 Dynactin subunit 1
ALS 8p21.1 ELP3 Elongator complex protein 3
ALS 7p15.2 HNRNPA2B1 Heterogenous nuclear ribonucleoprotein A2/B1
ALS 22q12.1-q13.1 NEFH Neurofilament heavy polypeptide
ALS 12q12 PRPH Peripherin
ALS 2p22.3 SPAST Spastin
ALS 17q12 TAF15 TATA-binding protein-associated factor 2N
ALS 1q22 UBQLN4 Ubiquilin 4
ALS 19p13.12 UNC13A Unc-13 homolog A
Abréviations: ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis; FTDALS, FrontoTemporal Dementia – ALS.

17
1.2.2 La SLA avec Démence Fronto-Temporale (DFT)
La Démence Fronto-Temporale (DFT) est une maladie neurodégénérative qui touche les
neurones situés dans les régions frontale et temporale du cortex cérébral. Dans la population de
moins de 65 ans, la DFT est la deuxième forme de démence la plus commune (10 à 20% de toutes
les démences) après celle observée dans la maladie d’Alzheimer (Ratnavalli et al., 2002). Environ
40% de DFT sont des formes familiales (Snowden et al., 2002). La maladie se manifeste par des
changements du comportement et de la personnalité avec des troubles cognitifs et du langage. La
DFT regroupe trois syndromes qui se chevauchent souvent (mais généralement une
caractéristique spécifique prédomine) :
- La DFT à variante comportementale (DFTvc), la plus commune, se caractérise par des
troubles cognitifs et comportementaux associés à des changements dans la conduite personnelle
et sociale ;
- La Démence Sémantique (DS) se caractérise principalement par un discours fluide avec
une mauvaise compréhension du sens des mots et/ou de l’identité d’un objet ;
- L'Aphasie Primaire Progressive (APP) se caractérise par un discours progressif spontané
non fluide avec agrammatisme (structures syntaxiques simplifiées et peu diversifiées), des
paraphasies (transformation d’un mot ou substitution d’un mot pour un autre) et des difficultés
ou incapacités à nommer (Neary et al., 1998).

Selon une estimation, 15% des patients diagnostiqués pour la DFT présentent des
symptômes de SLA et, à l’inverse, 15% des patients diagnostiqués pour la SLA montrent des signes
de DFT (Ringholz et al., 2005). De plus, un certain nombre de mutations ont été identifiées dans
des cas de SLA, de DFT et de SLA-DFT (figure 2 : A). Les mutations dans le gène C9ORF72 sont les
plus connues. D’autres mutations touchent des protéines jouant un rôle dans les voies de
dégradation protéique, essentielles pour assurer le maintien de la protéostasie. Il s’agit des
protéines : ubiquiline 2, p62, optineurine, VCP, CHMP2B et VAPB. Des mutations dans les gènes
codant pour les protéines TDP-43 et FUS, qui sont des protéines de liaison à l’ADN et à l’ARN
(impliquées notamment dans la régulation de la transcription et de l'épissage), ont aussi été
décrits dans ces cas pathologiques (Lattante et al., 2013). L'une des principales questions qui se
pose alors, est de savoir comment une même mutation génétique peut conduire à la SLA dans
certains cas, et dans d’autres cas à la DFT ou à la SLA-DFT. Certains suggèrent que les variantes
génétiques et l’environnement, mais pas seulement, pourraient être des facteurs influençant la
prédisposition à la SLA/DFT, mais des données directes manquent actuellement (Lattante et al.,
2015).

18
 D’un point de vue neuropathologique, 50% des patients atteints de DFT montrent des
inclusions de protéines, dont 45% des cas ont des inclusions positives pour TDP-43 (Mackenzie et
Rademakers, 2007) (figure 2 : B). Des études pathologiques post-mortem sur le cerveau de
patients atteints de SLA ont révélé que la plupart d'entre eux présentaient des inclusions positives
pour l’ubiquitine (sauf les patients atteints de SLA liée aux mutations de SOD1) et également des
inclusions positives pour TDP-43 (Mackenzie et al., 2007). Par conséquent, la présence d'inclusions
positives pour TDP-43 et de mutations touchant les mêmes gènes (codant pour des protéines
impliquées dans la dégradation protéique) dans la SLA et la DFT montrent que la perturbation de
l'homéostasie des protéines est une caractéristique clé de ces deux maladies.

Figure 2 : Chevauchements clinique, génétique et pathologique de la SLA (ALS) et de la DFT (FTD).

(A) Représentation schématique des gènes connus, impliqués dans la SLA et la DFT. Les principales causes
génétiques connues pour la SLA et la DFT sont représentées selon le pourcentage des mutations connues qui
donnent lieu à la SLA et la DFT (rouge pour la SLA et bleu pour la DFT).
(B) Représentation des protéines retrouvées dans les inclusions pathologiques de la SLA et DFT (en %). Présence
d’inclusions des protéines TDP-43 et FUS dans la SLA et la DFT, qui reflètent le chevauchement pathologique
entre ces deux maladies (d’après Mackenzie et Rademakers, 2007).

19
 La SLA et la DFT partagent donc certaines caractéristiques neuropathologiques, génétiques
et cliniques, laissant supposer que des voies neurodégénératives communes sont impliquées dans
ces deux pathologies. L’évidence croissante du chevauchement entre la SLA et la DFT sur les plans
cliniques et pathologiques a fait l’objet de discussion lors d’un atelier de recherches (« The second
international research workshop on FTD in ALS ») en 2007, qui a conduit à l’établissement de
nouveaux critères pour le diagnostic des syndromes fronto-temporaux (signes cognitifs et
comportementaux) observés chez les patients SLA (Strong et al., 2009). Ces critères sont organisés
en 4 axes dont l’axe II consiste à définir les dysfonctionnements cognitifs et comportementaux
associés à la SLA (Strong et al., 2009). Quatre catégories de patients atteints de SLA ont ainsi été
définies :

1) La SLA pure, où seule une dégénérescence des MNs apparaît en absence de syndrome
fronto-temporal ;
2) La SLA avec des déficiences cognitives ;
3) La SLA avec des déficiences comportementales ;
4) La SLA avec des signes de DFT (SLA-DFT) définis à partir des critères de Neary et al., 1998
présentés précédemment.

Aujourd’hui, ces deux pathologies représentent un vaste groupe de troubles

neurodégénératifs dont plusieurs symptômes cliniques se recoupent (Ferrari et al., 2011 ; Ling et
al., 2013).

1.3 Génétique de la SLA et mécanismes pathologiques

En raison du nombre important de gènes associés à la SLA, nous présentons dans ce rapport
uniquement les SLAf les plus étudiées (classées par ordre chronologique d’identification) (figure
3) et dont les gènes impliqués codent pour des protéines retrouvées dans les agrégats protéiques
localisés dans les MNs (principale caractéristique de la pathologie d’un point de vue histologique).
Ce choix fait le lien avec le projet de thèse qui consiste à générer et à caractériser un modèle de
SLA liée aux mutations du gène UBQLN2, codant pour la protéine ubiquiline 2, impliquée dans la
dégradation des protéines intracellulaires et détectée au sein des agrégats protéiques (Deng et
al., 2011).

20
 Figure 3: Graphique représentant les principaux gènes associés à la SLA, identifiés depuis 1993.
Le nombre cumulatifs de gènes identifiés et responsables de SLA (indiqué en ordonnée) a augmenté rapidement
durant ces 30 dernières années. La taille de chaque cercle reflète la proportion de tous les cas de SLA familiale
associés à un gène (20% pour SOD1 et 45% pour C9ORF72, par exemples). En bleu, sont représentés les gènes
associés à des formes familiales de SLA et, en rouge, les gènes associés à la SLA sporadique (Brown et al., 2017).

1.3.1 La SLA liée à SOD1 (ALS 1)

Les premières mutations responsables de SLAf ont été découvertes en 1993 dans le gène de
la SuperOxide Dismutase 1 (SOD1), localisé sur le chromosome 21. Il s’agit de 11 mutations faux-
sens identifiées dans 13 familles touchées par la maladie (Rosen et al, 1993). Actuellement, plus
de 150 mutations réparties dans les 5 exons du gène ont pu être identifiées, dont la plupart sont
des mutations faux-sens. Leur transmission entre générations se fait de manière dominante. Parmi
les différentes mutations faux-sens identifiées, la substitution A4V est associée aux symptômes
cliniques les plus sévères et à une espérance de vie très courte d’environ un an. Il s’agit de la
mutation la plus fréquente dans les cas de SLAf liée à la SOD1 aux USA (Ray et al., 2004). La
substitution D90A, en revanche, est associée à la progression la plus lente de la SLA liée à SOD1
(Andersen et al., 1996).

La SLA liée à SOD1 est la deuxième forme la plus courante et représente environ 20% des
SLAf. Le gène SOD1 code pour une métalloenzyme ubiquitaire de 153 acides aminés, la superoxide
dismutase 1 (SOD1), qui est principalement localisée dans le cytosol. Elle est constituée d’un
homodimère dans lequel chaque monomère contient un ion de zinc jouant un rôle structural et
un ion de cuivre intervenant comme cofacteur catalytique. Elle a un rôle déterminant dans la
dégradation des radicaux libres toxiques produits par la respiration mitochondriale. En effet, cette

21
enzyme catalyse la dismutation des anions superoxides (O2-) toxiques, qui ont été produits durant
la phosphorylation oxydative au niveau des mitochondries, en peroxyde d’hydrogène (H2O2) grâce
à des cycles d’oxydoréduction de l’atome de cuivre lié à chaque sous-unité de SOD1 (Pasinelli et
al., 2006) :

(1) SOD1 - Cu2+ + O2- → SOD1 - Cu+ + O2

(2) SOD1 - Cu+ + O2- + 2H+ → SOD1- Cu2+ + H2O2

Le plus souvent, les mutations du gène SOD1 altèrent son activité de dismutation. La
corrélation entre l’activité enzymatique, la progression clinique et le phénotype de la maladie n’a
pas encore été clairement démontrée (Pasinelli et al., 2006). Les inclusions protéiques dans le
cytoplasme des MNs dégénérescents sont caractéristiques de la maladie. Ces inclusions
contiennent des protéines mutées de SOD1. Dans les MNs, les mutations du gène SOD1
conduisent à la synthèse de protéines ayant des propriétés toxiques. Le mécanisme pathogénique
exact de la SOD1 mutée est encore inconnu, mais plusieurs hypothèses sur son rôle dans la SLA
ont été proposées suite aux études menées sur des modèles murins transgéniques. Les souris
invalidées pour le gène SOD1 ne développent pas la maladie, bien qu’elles présentent une
accélération de l’atrophie musculaire liée à l’âge avec une diminution de leur durée de vie
(Reaume et al., 1996). Ainsi, les propriétés toxiques de la SOD1 mutée ne sont donc pas liées à
une perte de la fonction de dismutation. Par ailleurs, différentes anomalies qui conduisent à la
mort de la cellule ont été observées. En effet, ces processus de mort peuvent être induits par
l’instabilité de la protéine mutante, par plusieurs défauts mitochondriaux à l’origine de la carence
énergétique de la cellule, la sensibilité accrue au glutamate, l’activation de l’apoptose, ainsi que
par l’inflammation des cellules non neuronales voisines (astrocytes). D’après ces observations, la
fonction délétère de la SOD1 mutée pourrait s’expliquer soit par son rôle perturbateur sur le
métabolisme de l’oxygène (figure 4 : Aberrant redox chemistry), soit par son instabilité
conformationnelle (figure 4 : Protein toxicity) (Pasinelli et al., 2006).

22
 Figure 4 : Hypothèses sur le rôle toxique de la protéine SOD1 mutée.
Aberrant redox chemistry (oxydation) : l’instabilité de la SOD1 mutée engendrerait des interactions avec des
substrats non conventionnels conduisant à des réactions d’oxydoréduction aberrantes. (1 et 2) Le peroxide
d’hydrogène (H2O2) ou l’ion nitronium (ONOO-) peut réagir avec la réduction de la SOD1 mutée (SOD1-Cu+). (3)
Le dioxygène (O2) peut réagir avec le zinc de la SOD1 mutée (ΔZn) pour générer un excès d’anions superoxydes
(O2-). (4) La protéine mutée peut également libérer son atome de cuivre ou de zinc, ce qui pourrait être toxique.
Protein toxicity (agrégation) : les mutations favoriseraient la dissociation des dimères de la protéine SOD1
entrainant ainsi, la formation de monomères instables pouvant alors former des agrégats protéiques toxiques
en empêchant l’activité chaperonne et/ou du protéasome (1). L’élimination des protéines ne serait alors plus
efficace. Les agrégats pourraient aussi séquestrer, inactiver ou augmenter la toxicité en interagissant avec
d’autres protéines cruciales (2) (d’après Pasinelli et al., 2006).

Modèles de rongeurs pour la SLA liée à SOD1

Le premier modèle animal transgénique pour la SLA a été développé en 1994, suite à la
découverte des mutations au niveau du gène SOD1 dans certaines formes de SLAf (Turner et al.,
2008). Il s’agit de souris transgéniques SOD1G93A, obtenues par l’introduction de plusieurs copies
du gène humain SOD1 muté en position 93 (substitution d’une glycine par une alanine) sous
contrôle du promoteur humain du gène SOD1. Ces souris développent une pathologie dont les
caractéristiques sont comparables à celles de la SLA humaine. Avant l’apparition des symptômes,
diverses anomalies sont observées comme une dégénérescence des jonctions neuromusculaires
entre 40 et 50 jours (Frey et al., 2000 ; Kennel et al., 1996), une gliose qui s’intensifie avec le temps,
une activation de la microglie à partir de 80 jours (Fischer et al., 2004) ainsi qu’une perte des MNs.
Ces caractéristiques pathologiques conduisent à des troubles moteurs à partir de 80 à 90 jours,
23
avec un déclin de la force musculaire et un tremblement des pattes postérieures (Frey et al., 2000 ;
Kennel et al., 1996). Une paralysie des pattes postérieures commence à apparaître vers 90 jours,
qui progresse rapidement en une paralysie sévère jusqu’au décès vers 130 jours (Vinsant et al.,
2013). Au niveau moléculaire, de nombreux agrégats intracellulaires ont été mis en évidence dans
les MNs et les astrocytes, comparables à ceux observés chez les patients (Watanabe et al., 2001).

Aujourd’hui, une dizaine de modèles de souris transgéniques ont été créés et expriment
l’une des 12 mutations du gène SOD1 humain suivantes: A4V, G37R, H46R, H48Q, L84V, D83G,
G85R, D90A, G93A, I113T, L126Z et G127X (Picher-Martel et al., 2016). Le phénotype
pathologique, l’âge auquel débute la maladie, ainsi que la survie sont variables d’un modèle à
l’autre. Cette hétérogénéité phénotypique serait dépendante du type de mutation, du niveau
d’expression de la SOD1 mutée, du genre et du fond génétique (Pfohl et al., 2015). Comme chez
l’Homme, la maladie apparait plus tardivement et la survie est prolongée chez les femelles par
rapport aux mâles (McCombe et al., 2010). La plupart de ces modèles reproduisent plusieurs
caractéristiques pathologiques de la SLA humaine : une paralysie fatale avec une dégénérescence
des MNs, une gliose et la formation d’inclusions ubiquitinylées positives pour SOD1 dans le
cytoplasme des MNs et des astrocytes de la moelle épinière (Picher-Martel et al., 2016). Quelques
modèles présentent des déficits cognitifs, notamment chez les souris SOD1G37R qui développent
des difficultés d’apprentissage à partir de 8 mois (Filali et al., 2011) et les souris SOD1G93A qui ont
un retard des capacités d’apprentissage et des troubles de la mémoire à long terme (Quarta et al.,
2015).

A l’origine de cette forme familiale, l’hypothèse d’une perte de la fonction de dismutation

de la protéine mutée SOD1 a d’abord été envisagée. Mais des études ont montré par la suite que
la délétion du gène SOD1 chez les souris (souris knock-out SOD1-/-) n’induisait pas de
neurodégénérescence ni de trouble moteur jusqu’à l’âge de 6 mois (Reaume et al., 1996).
Néanmoins, une axonopathie motrice distale a été observée chez ces souris (Shefner et al., 1999).
Les mutations dans le gène SOD1 s’accompagnent donc d’un gain de fonction toxique dont la
nature exacte reste encore à déterminer (Reaum et al., 1996). Par ailleurs, le rôle de la forme
sauvage de SOD1 dans la pathologie doit être également clarifié. En effet, plusieurs études ont
démontré que la SOD1 sauvage n’était pas impliquée dans la neurodégénérescence de la SLA, mais
que la surexpression de la SOD1 humaine sauvage chez les souris SOD1G93A induit une accélération
de la perte des MNs, une paralysie et une mort plus précoces que les souris surexprimant
uniquement la SOD1G93A (Jaarsma et al., 2000). Un phénotype similaire à la SLA a également été
décrit lorsque la SOD1 sauvage est exprimée au même niveau que la SOD1G93A chez un modèle
murin (Graffmo et al., 2013).
24
 Les modèles SLA-SOD1 ont permis de faire d’importants progrès dans la connaissance de
nombreux mécanismes physiopathologiques comme le stress oxydatif, les anomalies
mitochondriales, les perturbations du transport axonal ou encore les phénomènes d'agrégation
protéique. Néanmoins, ils modélisent les formes de SLAf liées au gène SOD1 muté et non les autres
formes familiales non liées à la SOD1 mutée ni les formes sporadiques de la SLA, en raison
notamment de l’absence de la protéine TDP-43 dans les inclusions cytoplasmiques (ou seulement
au stade terminal de la maladie) qui est pourtant un marqueur neuropathologique fondamental
de la SLA humaine (y compris la SLA-SOD1) (Robertson et al., 2007; Shan et al., 2009). Malgré cela,
ces modèles présentent de nombreux mécanismes biologiques impliqués dans la pathologie,
communs aux différentes formes familiales et sporadiques de la SLA, ce qui en fait des modèles
de référence encore aujourd’hui.

1.3.2 La SLA liée à TARDBP (ALS 10)

La découverte d’inclusions de la protéine nucléaire TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43)
dans le cytoplasme des MNs et des cellules gliales de patients atteints de formes familiales ou
sporadiques de SLA (hors SLA avec des mutations dans les gènes SOD1 et FUS) ou de DFT, suggère
une implication de cette protéine dans la physiopathologie de ces maladies (Arai et al., 2006 ;
Neumann et al., 2006). Cette observation a conduit plusieurs équipes scientifiques à rechercher
la présence de mutations au niveau du gène TARDBP codant pour la protéine ubiquitaire TDP-43.
Cette protéine multifonctionnelle est notamment impliquée dans la régulation de la transcription,
l’épissage, le transport de l’ARN, la biosynthèse des mircoARN ainsi que dans l’apoptose (figure 5)
(Buratti et Baralle, 2008 ; Ratti et Buratti, 2016). Les maladies neurodégénératives liées au dépôt
de TDP-43 sont appelées «protéinopathies TDP-43». De surcroît, la propagation de la
protéinopathie TDP-43 des MNs rachidiens et corticaux et des cellules gliales vers d’autres régions
corticales peut être comparée à la progression de la SLA (Brettschneider et al., 2013).

25
 Figure 5 : Représentation schématique des gènes et des mécanismes conduisant à la protéinopathie TDP-43
et l’implication de celle-ci dans la pathogénèse de la SLA.
(1) TDP-43 est une protéine de liaison à l’ADN et l’ARN, impliquée dans le traitement des ARN. Sa forme repliée
est localisée dans le noyau et intervient dans la régulation des épissages des ARN. Cette protéine agit également
dans le cytoplasme où elle est impliquée dans le traitement des ARN comme la réponse aux stress ou le transport.
(2) Les mutations de C9ORF72 entrainent une séquestration des protéines de liaisons à l’ARN. La SLA liée à
C9ORF72 montre ainsi une accumulation et une agrégation de la protéine TDP-43. (3) Les mutations de MATR3,
hnRNPA1 et hnRNPA2B1 induisent une protéinopathie TDP-43. Ces protéines interagissent directement avec
TDP-43 en influençant sur son repliement et sa fonction. (4) Les mutations de FUS causent la SLA,
indépendamment de la protéinopathie TDP-43, via les défauts de traitement des transcripts qui peuvent être des
cibles communes à TDP-43. (5) La délocalisation en excès des protéines TDP-43 dans le cytoplasme peut être
causée par (6) les mutations de TARDBP et (7) le stress environnemental, les deux conduisant également à la (8)
fragmentation de TDP-43. (9) La délocalisation et le clivage de TDP-43 favorisent leur mauvais repliement et leur
agrégation qui est associé à sa phosphorylation et ubiquitinylation anormales. (10) Le Système Ubiquitine
Protéasome (SUP) et l’autophagie permettent de maintenir l’homéostasie de TDP-43. Cependant, dans la SLA,
ces systèmes de dégradation des protéines ne parviennent pas à prévenir l’accumulation de TDP-43, favorisant
ainsi la formation d’agrégats complexes. (11) Les mutations de VCP, UBQLN2, et SQSTM1 peuvent nuire à la
dégradation des protéines. (12) Le traitement d’ARN aberrants, et en particulier la formation de granules de
stress, peut favoriser l'agrégation de TDP-43. (13) A l’inverse, le mauvais repliement de TDP-43 et son agrégation
peuvent nuire au bon traitement des ARN (d’après Scotter et al., 2015).

26
 En 2008, deux études réalisées sur 354 patients atteints de SLA sporadique ou familiale (non
liée à SOD1) ont identifié des mutations dans le gène TARDBP chez 5% d’entre eux (Kabashi et al.,
2008 ; Sreedharan et al., 2008). Plus d’une dizaine de mutations différentes ont été rapportées au
cours de ces études. Aujourd’hui, ce sont plus de 40 mutations (faux-sens pour la plupart) qui ont
été répertoriées dont les plus fréquentes sont G298S, A315T, M337V, G348C et A382T (Corcia et
al., 2012). Les effets de ces mutations ne sont pas encore complètement élucidés. Plusieurs études
ont toutefois démontré que la perte de fonction conditionnelle et partielle de TDP-43 peut induire
des défauts des MNs, un phénotype moteur progressif et la formation d’inclusions TDP-43 (Wu et
al., 2012 ; Iguchi et al., 2013 ; Kabashi et al., 2010). De même que la surexpression de la forme
sauvage de TDP-43 conduit à la formation d’inclusions cytoplasmiques de TDP-43 (protéinopathie
TDP-43) et au phénotype de la maladie, suggérant un gain de fonction toxique de TDP-43 (Wils et
al., 2010 ; Li et al., 2010 ; Ash et al., 2010). Aujourd’hui, l’hypothèse à la fois d’un gain et d’une
perte de fonction de TDP-43 pourrait définir les mécanismes pathologiques responsables de la
maladie.

Les mutations dans le gène TARDBP ainsi que dans d’autres gènes liés à la SLA, comme
C9ORF72, FUS, SQSTM1 et UBQLN2 sont impliqués dans la formation d’agrégats protéiques
positifs pour TDP-43 dans le cytoplasme des cellules du SNC (figure 5) (Scotter et al, 2015). En
condition normale, TDP-43 est une protéine majoritairement nucléaire mais dans le cas d’une
protéinopathie TDP-43, celle-ci est délocalisée dans le cytoplasme et se présente sous forme
agrégée anormalement hyperphosphorylée, ubiquitinylée et tronquée (figure 5) (Scotter et al,
2015).

Les inclusions cytoplasmiques positives pour TDP-43, observées dans le cerveau et la moelle
épinière de patients atteints de SLA et de DFT (Neumann et al., 2006 ; Igaz et al., 2008), sont
majoritairement composées de fragments phosphorylés correspondant à la partie C-terminale de
TDP-43 (CTFs : phosphorylated C-Terminal Fragments). Plusieurs études ont montré que des
mutations localisées dans la région C-terminale du gène TARDBP (Sreedharan et al., 2008 ;
Rutherford et al., 2008), un stress cellulaire (Zhang et al., 2007 ; Dormann et al., 2009) ou une
inhibition protéasomique (Huang et al., 2014) favoriseraient le clivage inapproprié de TDP-43,
générant ainsi, un fragment C-terminal de 25kDa capable d’induire la mort cellulaire par gain de
fonction toxique (Zhang et al., 2009). Dans des cas de SLAs, il a été démontré que lorsque le
nombre de MNs est important, la protéine TDP-43 est, le plus souvent, répartie de manière diffuse
dans le cytoplasme des MNs. En revanche, lorsqu’il y a une perte de MNs, la proportion de cellules
dans lesquelles TDP-43 est diffus dans le cytoplasme diminue alors que le nombre de celles avec

27
des inclusions positives pour TDP-43 ne change pas. La redistribution cytoplasmique de TDP-43
pourrait alors précéder la formation d’agrégats insolubles (Giordana et al., 2010).

Dans une étude réalisée en 2008, les inclusions cytoplasmiques ubiquitinylées de cellules
gliales de patients atteints de SLA ont été marquées par des anticorps reconnaissant des sérines
phosphorylées localisées à différentes positions (p379, p403/404, p409, p410, p409/410)
(Hasegawa et al., 2008). Du plus, des analyses biochimiques réalisées sur des fractions protéiques
insolubles ont montré que les anticorps dirigés contre les sérines phosphorylées ne
reconnaissaient pas la forme entière de TDP-43 (43kDa), mais marquaient ses formes
anormalement clivées de 25 et 45kDa. La phosphorylation en position 409/410 semble la plus
fréquente au sein des inclusions (Hasegawa et al., 2008 ; Inukai et al., 2008). La protéine TDP-43
phosphorylée (p409/410) a été détectée dans toutes les inclusions ubiquitinylées mais également
dans des granules (pré-inclusions) non ubiquitinylés, ce qui suggère que la phosphorylation de
TDP-43 précède l’ubiquitinylation (Neumann et al., 2009).

Modèles de rongeurs pour la SLA liée à TARDBP

Suite à la découverte de la protéine TDP-43 comme composant majeur des inclusions

retrouvées dans la plupart des formes sporadiques et familiales de SLA, plusieurs groupes de
recherche ont tenté de générer un modèle animal développant cette pathologie. Afin de
reproduire l’expression neuronale élevée de TDP-43 observée chez les patients (entre 1,5 et 2,5
fois supérieure à la normale), la forme humaine sauvage de TDP-43 a été surexprimée à des
niveaux similaires chez la souris. Les différents modèles présentent des phénotypes variables
suivant le niveau d’expression de TDP-43, mais aucun d’eux ne développe le phénotype complet
de la SLA humaine avec l’absence d’inclusion cytoplasmique positive pour la forme phosphorylée
de TDP-43 (ou une présence rare) et de dégénérescence liée à l’âge (Picher-Martel et al., 2016).

L’identification des différentes mutations dans le gène TARDBP, causant la SLA, a mené à la
génération de modèles murins exprimant la protéine mutée en quantité variable suivant le
promoteur utilisé. Parmi eux, les modèles SLA-TARDBPA315T et SLA-TARDBPG348C, qui expriment la
protéine humaine mutée à des niveaux trois fois supérieurs à la normale, développent
progressivement des déficits moteurs à partir de 9-10 mois et des troubles cognitifs comparables
aux cas de DFT. A 10 mois, des inclusions cytosoliques et nucléaires composées de TDP-43 et
d’ubiquitine ont été mises en évidence. Aucune paralysie n’a cependant été relevée chez ces
animaux qui ont une durée de vie normale (Swarup et al., 2011). Les différents modèles de SLA
liée aux mutations de TARDBP montrent seulement une corrélation entre les phénotypes observés

28
et les niveaux d’expression de TDP-43 mutée (pas de corrélation avec le type de mutation). Une
faible expression de TDP-43 conduit à des troubles moteurs liés à l’âge et à la formation
d’inclusions cytoplasmiques de TDP-43 dans les neurones mais sans paralysie, alors qu’une forte
expression de cette protéine provoque des symptomes précoces et une progression de la maladie
rapide sans véritable perte de MNs ni formation d’inclusions (Picher-Martel et al., 2016).

Enfin, un double modèle transgénique surexprimant à la fois la forme sauvage et la forme

mutée (Q331K) de TDP-43 a reproduit le plus grand nombre de caractéristiques de la pathologie
humaine (à l’exception de dégénérescence liée à l’âge), à savoir des inclusions cytoplasmiques
dans les neurones qui sont positives pour les protéines TDP-43, p62 et ubiquitine, une paralysie
précoce des membres avec une progression rapide conduisant à la mort vers l’âge de 2 mois
(Mitchell et al., 2015).

D’autre part, des modèles de SLA-TDP-43 ont été créés chez le rat, la Drosophile, les
nématodes et le poisson zèbre mais, là encore, les caractéristiques de la SLA n’ont pas toutes été
retrouvées (Picher-Martel et al., 2016).

1.3.3 La SLA liée à FUS (ALS 6)

L’identification des mutations de TDP-43 dans la SLA a rapidement été suivie par la
découverte de mutations dans une autre protéine de liaison à l’ADN et à l’ARN ; la protéine FUS
(FUsed in Sarcoma) (Kwiatkowski et al., 2009 ; Vance et al., 2009 ; Corrado et al., 2010). Le gène
FUS, localisé sur le chromosome 16 et composé de 15 exons, code pour une protéine de 526 acides
aminés qui est principalement nucléaire. Cette protéine contribue à la restauration de l’ADN ainsi
qu’à la régulation des processus de synthèse, de modification et de transport de l’ARN (figure 6)
(Aman et al., 1996).

29
 Figure 6 : Représentation schématique des fonctions physiologiques de FUS.
FUS est impliquée dans de multiples étapes du métabolisme de l’ADN et de l’ARN. (a) Elle a une activité
d'association homologue à l’ADN et est importante pour la réparation des ruptures du double brin. (b) Elle
interagit avec le complexe de pré-initiation de la transcription (ARN pol II et le complexe TFIID par exemples) et
avec des facteurs de transcription spécifiques de certains gènes (NF-kB par exemple). En outre, FUS se lie
directement à des séquences d'ADN spécifiques (TCCCCGT par exemple) dans la région promotrice de certains
gènes cibles. (c) FUS affecte l'épissage alternatif en interagissant avec les régions introniques à proximité des
sites d'épissage et en recrutant ensuite le spliceosome ou d'autres facteurs d'épissage, tels que les protéines
hnRNP ou SR, au pré-ARNm naissant. (d) FUS interagit avec la machinerie de transcription et d'épissage. (e) FUS
peut jouer un rôle dans l'exportation d'ARNm vers le cytoplasme. (f) Dans les neurones, FUS est impliquée dans
le transport d'ARNm spécifiques (d’après Dormann et Haass, 2013).

Plus de 50 mutations, pour la plupart faux-sens, ont été identifiées dans le gène FUS comme
étant responsables d’environ 4% des formes familiales et d’environ 1% des formes sporadiques
de la SLA. Seulement quelques descriptions cliniques de la pathologie liée à ces mutations ont été
effectuées et la corrélation phénotypique reste difficile à établir. De nombreux rapports suggèrent
que l'apparition de la maladie est plus précoce dans les cas de SLA liée à FUS. En effet, une étude
allemande réalisée sur plusieurs familles révèle un âge d’apparition de la maladie allant de 21 à
76 ans avec de nombreux cas avant l'âge de 40 ans (Waibel et al., 2013). La plupart des patients
développent un phénotype de SLA classique sans défaut cognitif ; cependant quelques études ont
présenté des patients développant des DFT avec dégénérescence des MNs et d’autres patients
avec démence sans que les MNs soient touchés. Ceci suggère, une fois de plus, que la SLA et la
DFT présentent des homologies cliniques, pathologiques et génétiques (Lattante et al., 2013).

30
 Comme TDP-43, FUS est principalement nucléaire avec une faible accumulation
cytoplasmique dans la plupart des types cellulaires. Des analyses post-mortem de cerveaux et de
moelles épinières de patients portant des mutations dans le gène FUS ont révélé la présence
anormale d’inclusions positives pour FUS dans les neurones et les cellules gliales. Ces inclusions se
sont révélées immunoréactives pour p62 et l’ubiquitine mais étonnamment négatives pour TDP-
43, suggérant que le processus de neurodégénération dirigé par les mutations de FUS est
indépendant de la délocalisation de TDP-43. Ces inclusions de FUS ont également été identifiées
dans le SNC de patients atteints de DFT. Une nouvelle fois, comme pour TDP-43, l’ubiquitinylation
des inclusions de FUS n’est pas toujours décelée (Saberi et al., 2015).

Modèles de rongeurs pour la SLA liée à FUS

Des modèles transgéniques de souris Knock-Out pour FUS (KO-FUS) ont été créés pour
étudier l'effet de la suppression de FUS. Les souris qui en résultent ne survivent que 24 heures ou
développent des déficits importants, comme la stérilité ou une instabilité chromosomique.
D’autres modèles de souris KO-FUS présentent des troubles neuropsychiatriques qui ne
correspondent pas à la SLA (Hicks et al., 2000). Une surexpression de la forme humaine et sauvage
de FUS, sous le contrôle du promoteur du prion murin, mène à un phénotype agressif des souris
homozygotes. Ces souris ont un niveau d’expression de la protéine environ deux fois plus
important et développent une faiblesse motrice jusqu’à la paralysie à l’âge de 8 semaines. Elles
présentent un taux élevé d’inclusions cytoplasmiques de FUS non ubiquitinylées, une perte de
MNs dans la corne antérieure de la partie lombaire de la moelle épinière, une atteinte des
jonctions neuromusculaires et une gliose (Kino et al., 2015).

D’autre part, des souris transgéniques surexprimant la forme sauvage ou mutée de FUS,
sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire, développent une gliose et une faiblesse musculaire.
Ces souris meurent de façon prématurée à l’âge de 30 jours mais ne présentent pas d’inclusion
protéique positive pour FUS ni de dégénérescence des MNs (Sephton et al., 2014).

1.3.4 La SLA liée à l’OPTN (ALS 12)

Trois mutations ont été identifiées dans le gène OPTN (optineurine) chez des patients
atteints de SLA familiale ou sporadique : une mutation non-sens Q398X et une mutation faux-sens
E478G localisées dans le domaine de liaison aux ubiquitines, ainsi qu’une délétion homozygote de
l’exon 5 (Maruyama et al., 2010). La protéine optineurine (OPTN), codée par ce gène, assure de
multiples fonctions dont celle de récepteur autophagique (Liu et al., 2014). Sur les 8 patients
étudiés, un seul présente des inclusions cytoplasmiques positives pour l’optineurine dans les MNs
(SLAf liée à la mutation E478G) (Maruyama et al., 2010). D’autres études réalisées sur les patients

31
porteurs des mutations Q398X et E478G n’ont pas détecté la protéine optineurine dans les
inclusions cytoplasmiques positives pour TDP-43, p62 et l’ubiquitine dans les neurones (Ito et al.,
2011 ; Kamada et al., 2014). En revanche, l’optineurine a été observée dans les inclusions
cytoplasmiques au niveau de la moelle épinière dans des cas de SLAs (hors mutations dans le gène
OPTN) et de SLAf liée à SOD1. En effet, l’optineurine co-localise avec l’ubiquitine et TDP-43 dans
les inclusions « skein-like » et avec l’ubiquitine dans les inclusions hyalines rondes chez des
patients atteints de SLAs (Maruyama et al., 2010 ; Osawa et al., 2011). Elle co-localise également
dans les inclusions hyalines de SOD1 (de type corps de Lewy) dans des cas de SLA liée à SOD1
(Maruyama et al., 2010). Néanmoins, les inclusions d’optineurine semblent relativement rares et
limitées à une minorité de SLA avec une protéinopathie TDP-43 ainsi que dans les cas de DLFT-TDP
suggérant qu’elle ne jouerait pas un rôle central dans la pathogénèse de la SLA et de la DLFT
(Hortobágyi et al., 2011).

Modèles animaux pour la SLA liée à l’OPTN

Les quelques modèles animaux générés jusqu’à présent ne reproduisent pas toutes les
caractéristiques de la maladie, comme le phénotype pathologique moteur dans un modèle de
souris transgénique qui exprime l’OPTN mutée (Gleason et al., 2011) ou encore un modèle de
poisson zèbre dans lequel l’expression de l’OPTN a été supprimée (Paulus et Link, 2014).

1.3.5 La SLA liée à l’UBQLN2 (ALS 15)

La SLA liée aux mutations du gène UBQLN2, ainsi que les modèles de SLA liée à l’UBQLN2,
sont présentés dans le paragraphe « 2 La SLA liée à l’UBQLN2 ».

1.3.6 La SLA liée à C9ORF72 (FTDALS 1)

En 2011, des expansions anormales de la répétition de l’hexanucléotide GGGGCC (G4C2) ont
été identifiées dans l’intron 1 du gène C9ORF72 (chromosome 9 open reading frame 72) chez des
patients atteints de SLA et/ou de DFT (DeJesus-Hernandez et al., 2011). A ce jour, cette mutation
est à l’origine du plus grand nombre de formes familiales de SLA/SLA-DFT (SLA : 39,3%, SLA-DLFT :
86%) et de formes sporadiques de SLA et/ou DFT (SLA : 7%, SLA-DLFT : 6%, DFT : 6%) pour de
nombreux pays comme les Etats-Unis, l’Australie et les pays européens (Zou et al., 2017 ; Gijselinck
et al., 2012 ; Majounie et al., 2012). La SLA liée à C9ORF72 fait partie des nombreuses maladies
génétiques neurologiques ou neuromusculaires engendrées par la présence de l’Expansion d’une
Répétition de Nucléotides (ERN) dans le génome. Le nombre d’hexanucléotides (G4C2) chez les
patients atteints de SLA-DFT est estimé entre 700 et 1600 contrairement aux individus sains qui
ne présentent qu’entre 2 et 23 répétitions (DeJesus-Hernandez et al., 2011). Le gène C9ORF72
code pour la protéine C9ORF72 qui est notamment impliquée dans la régulation de la voie

32
autophagique (Sullivan et al., 2016 ; Sellier et al., 2016 ; Yang et al., 2016) et pourrait également
intervenir dans le trafic endosomal (Farg et al., 2014).

Trois transcrits, les variants 1 à 3, sont produits par épissage alternatif du gène C9ORF72 qui
sont présents dans la plupart des tissus dont le cerveau (cytoplasme des neurones). Le variant 1
code pour l’isoforme b (courte), les variants 2 et 3 codent pour l’isoforme a (longue). Chez les
patients souffrant de SLA-DFT, ces expansions anormales entrainent une diminution significative
de la quantité des 3 variants d’ARNm produits dans différentes régions du SNC (cortex moteur,
cervelet, moelle épinière) par rapport aux individus sains (DeJesus-Hernandez et al., 2011;
Donnelly et al., 2013; Waite et al., 2014). Cela se traduit par une réduction significative de la
quantité de l’isoforme longue dans le cortex frontal (SLA ou SLA-DFT) et temporal (SLA-DFT) mais
pas dans le cortex moteur ni dans le cervelet. En revanche, l’isoforme courte est présente en
quantité significativement augmentée dans les régions corticales dans les cas de SLA (Xiao et al.,
2015).

Plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’expliquer la perte de fonction de la protéine
C9ORF72. D’une part, l’expansion de la répétition de l’hexanucléotide (G4C2) entrainerait des
modifications épigénétiques locales importantes induisant alors une diminution de l’utilisation du
promoteur endogène de C9ORF72. En revanche, les promoteurs alternatifs contenant moins de
sites d’initiation à la transcription et situés entre le promoteur endogène et l’expansion (G 4C2)n
seraient davantage utilisés (Sareen et al., 2013). D’autre part, l’ERN pourrait être responsable de
la formation de structures secondaires et tertiaires (exemples : structures en épingles à cheveux,
G-quadruplexes antiparallèles ou parallèles, motif-I, boucles R) créant une instabilité du génome
(figure 7). L’activité des ARN polymérases, notamment, pourrait ainsi être perturbée durant
l’initiation ou l’élongation de la transcription, conduisant à la formation de transcrits tronqués ou
avortés, et/ou à une réduction de leur quantité. Une transcription bidirectionnelle a également
été rapportée dans différentes maladies liées à la présence d’ERN. Les séquences ERN riches en
GC dans le gène C9ORF72 pourraient donc conduire à la formation de transcrits abortifs courts par
transcription bidirectionnelle, pouvant agir comme des ARNsi en réprimant l’expression du gène
C9ORF72 (figure 7). De plus, la présence de structures de type G-quadruplexe sur les transcrits
pourraient perturber leur traduction et produire alors des protéines contenant des répétitions
dipeptidiques (DPR : Dipeptide Protein Repeat) qui ont été observées au sein d’inclusions dans les
cellules du SNC (Haeusler et al., 2016).

33
Figure 7: Représentation schématique des structures secondaires et tertiaires perturbant la transcription du
gène C9ORF72 (d’après Haeusler et al., 2016).

L’expansion de l’hexanucléotide G4C2 pourrait aussi entrainer un mécanisme de gain de

fonction toxique par la production de foyers d’ARN (ou agrégats d’ARN) dans le noyau des cellules
du SNC (DeJesus-Hernandez et al., 2011). Plusieurs analyses histologiques post-mortem sur tissu
de patients porteurs de la mutation ont mis en évidence la présence, en grande quantité, de foyers
d’ARN principalement localisés dans le noyau des neurones du cortex frontal, de l’hippocampe,
du cervelet et de la moelle épinière (MNs périphériques) (DeJesus-Hernandez et al., 2011 ; Lagier-
Tourenne et al., 2013). Ils ont également été observés, mais en quantité plus faible, dans les
astrocytes, les cellules microgliales et les oligodendrocytes (Lagier-Tourenne et al., 2013 ;
Mizielinska et al., 2013). La transcription bidirectionnelle du gène C9ORF72 muté est à l’origine de
la production de transcrits antisens C9ORF72 portant l’expansion (C2G4)n, qui s’accumulent dans
les neurones et forment ces foyers nucléaires (Zu et al., 2013). Le rôle des foyers d’ARN dans la
pathogénèse n’a pas encore été clairement démontré. En effet, certaines études montrent que
leur formation ne s’accompagne pas de phénotype neurodégénératif (Peters et al., 2015), voire
même d’aucun phénotype pathologique (Gami et al., 2015), suggérant que les mécanismes de
gain de fonction des ARN C9ORF72 ne suffiraient pas à eux seuls à conduire à une
neurodégénérescence.

34
 Plusieurs études ont mis en évidence la séquestration de protéines dans les foyers d’ARN
C9ORF72, ayant la propriété de se lier à l’ARN, comme hnRNP A2/B1 (heterozygous nuclear
ribonucleoprotein A2/B1) connue pour interagir avec les séquences répétées riches en C/G des
ARN. La dérégulation de hnRNP A2/B1 peut entrainer la formation de foyers d’ARN dans d’autres
maladies neurodégénératives comme FXTAS. De plus, des études ont montré son interaction
directe avec la protéine TDP-43 (Buratti et al., 2005; Sofola et al., 2007).

Comme dans beaucoup de formes familiales et sporadiques de la SLA, la protéinopathie

TDP-43 est observée dans les cas de SLA-DFT liée à C9ORF72 où la protéine TDP-43, qui est
principalement nucléaire en condition normale, se retrouve délocalisée dans le cytoplasme sous
forme d’inclusions. La localisation de ces inclusions cytoplasmiques dans les différentes régions
du SNC est fortement liée au phénotype pathologique. En effet, les inclusions majoritairement
situées dans le cytoplasme des neurones périphériques de la moelle épinière sont plutôt associés
à la pathologie de la SLA. En revanche, les inclusions essentiellement retrouvées dans le
cytoplasme et les neurites des neurones du néocortex et des cellules granulaires du gyrus denté
(hippocampe) sont plutôt associées à la DLFT-TDP (Dégénérescence Lobaire Fronto-Temporale
avec protéinopathie TDP-43). D’autres inclusions localisées dans le cytoplasme et les neurites des
neurones de la couche granulaire du cervelet sont constituées d’ubiquitine mais pas de TDP-43
(DeJesus-Hernandez et al., 2011).

Actuellement, la corrélation entre la présence de foyers d’ARN et la protéinopathie TDP-43

est difficile à établir car seulement 30 à 60% des cellules avec des foyers d’ARN montrent une
délocalisation de TDP-43. De même que la proportion de cellules avec des foyers d’ARN contenant
des inclusions positives pour p62 (mais négatives pour TDP-43) est inférieure à 20% (Mizielinska
et al., 2013). Ainsi, l’expansion anormale de l’hexanucléotide G4C2 confère un gain de fonction se
traduisant par la formation de foyers d’ARN sens et d’ARN antisens de C9ORF72 avec une
délocalisation/agrégation de TDP-43 dans le cytoplasme.

Modèles murins de la SLA liée à C9ORF72

Une dizaine de modèles animaux ont été créés suivant différentes stratégies. Le premier
modèle a été généré chez la souris et porte des répétitions de 80 G 4C2 en amont d’un promoteur
spécifique des cellules du prosencéphale. Seules des inclusions positives pour l’ubiquitine ont été
détectées (pas d’inclusion positive pour TDP-43 ni de DPR) (Hukema et al., 2014). L’absence de
neurodégénérescence et de réduction de la survie chez un modèle de souris KO pour le gène
C9ORF72, suggère que la perte de fonction de C9ORF72 ne suffit pas pour provoquer la maladie
(Koppers et al., 2015). Plusieurs modèles murins portant un Chromosome Bactérien Artificiel (CBA)

35
avec des répétitions allant de 100 à 1000 G4C2, présentent des foyers nucléaires d’ARN et des DPR
dans les neurones et les cellules gliales. Néanmoins, leurs phénotypes comportemental et moteur
sont normaux (Peters et al., 2015 ; O’Rourke et al., 2015). Ainsi, le nombre de répétitions de
l’hexanucléotide G4C2 dans ces modèles pourraient être suffisant pour provoquer une
accumulation d’ARN mais pas un dysfonctionnement cellulaire conduisant à un phénotype
moteur. Deux autres modèles murins ont également été générés avec un CBA. Le premier, portant
des répétitions de 500 G4C2, présente des foyers d’ARN, une accumulation de DPR cytosoliques et
des déficiences cognitives à l’âge de 12 mois (Jiang et al., 2016). Le deuxième, portant des
répétitions de 450 G4C2, développent davantage de caractéristiques pathologiques de la SLA liée
à C9ORF72, à savoir une accumulation d’ARN, des inclusions positives pour TDP-43, une perte de
MNs, une dénervation des muscles, un comportement d’anxiété, une paralysie et une réduction
de la survie (Liu et al., 2016).

Chez la Drosophile, plusieurs modèles ont également été créés mais aucun d’eux ne
récapitule les différentes caractéristiques de cette forme de SLA. Par exemple, deux modèles
portant des répétitions allant de 36 à 103 G4C2 ou de 160 G4C2, présentent des foyers d’ARN et des
DPR causant une réduction de la survie mais pas de phénotype pathologique. Il a été suggéré, dans
ces deux modèles, que les DPR sont plus toxiques pour les cellules que les foyers d’ARN (Tran et
al., 2015 ; Mizielinska et al., 2014). La délétion du gène alfa-1 (ok3062), orthologue de C9ORF72
chez C.elegans, conduit à un phénotype moteur (Therrien et al., 2013). De plus, le croisement de
ce modèle alfa-1 (ok3062) avec un modèle C.elegans TDP-43A315T aggrave le phénotype moteur.
En revanche, le croisement du modèle alfa-1 (ok3062) avec un modèle C.elegans FUSS54Δ ne
l’aggrave pas (Ciura et al., 2013).

Les différents modèles animaux générés jusqu’à présent ne permettent pas d’affirmer que
la diminution de l’expression de C9ORF72 causée par l’ERN, entraine une neurodégénérescence
dans le cerveau et la moelle épinière. Par exemple, chez la souris adulte, présentant une forte
homologie de séquence avec le gène C9ORF72 humain (98%), aucune caractéristique
neuropathologique, ni trouble du comportement n’a pu être observé malgré une réduction
significative du niveau d’ARN C9ORF72 dans le cerveau et la moelle épinière (provoquée par
traitement avec des oligonucléotides antisens) (Lagier-Tourenne et al., 2013). De même que
l’extinction de C9ORF72 dans les neurones et les cellules de la glie chez des souris ne conduit pas
à une dégénérescence des MNs, à des dysfonctionnements moteurs ni à une réduction de leur
survie (Koppers et al., 2015).

36
1.3.7 La SLA liée à SQSTM1 (FTDALS 3)
Le gène séquestosome 1 (SQSTM1) est localisé sur le locus 5q35 et code pour la protéine
SQSTM1 (ou p62). Cette protéine, de 62kDa et constituée de 440 acides aminés, est impliquée
dans de nombreux processus cellulaires comme les différentes voies de signalisation impliquées
dans la survie, la mort, l’inflammation, la différenciation et le métabolisme cellulaire (Seibenhener
et al., 2007). Elle joue également un rôle important dans le processus d’autophagie puisqu’elle est
impliquée dans le recrutement et le positionnement des protéines ubiquitinylées vers le lysosome,
assurant ainsi leur dégradation et leur recyclage. P62 assure aussi le transport des protéines
ubiquitinylées vers la voie de dégradation par le protéasome (Seibenhener et al., 2004) Une
caractéristique de p62 est de se lier à la protéine autophagique MAP1-LC3 (Microtubule-
Associated Protein 1-Light Chain 3) par son domaine LIR (LC3 Interacting Region), et d’interagir
avec son domaine UBA (Ubiquitin-Associated domain) avec les substrats cellulaires ubiquitinylés
(figure 8) (Layfield et Hocking, 2004).

Figure 8: Représentation schématique de la protéine p62.

La protéine p62 renferme plusieurs domaines spécifiques : un domaine Protein Binding 1 (PB1), un domaine Zinc
finger (ZZ), un domaine TRAF6 Binding (TBS), un domaine LC3 Interacting Region (LIR), et un domaine Ubiquitin-
Associated Domain (UBA) (adapté de Rea et al., 2014).

Il y a de plus en plus d’évidences que la protéine p62 soit impliquée dans la

neurodégénérescence. En effet, elle a été précédemment reliée aux phénotypes
neurodégénératifs à travers sa localisation dans des agrégats cytoplasmiques ubiquitinylés dans
de nombreuses maladies, comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson (Salminen et
al., 2012 ; Geetha et al., 2012). D’autres études ont également révélé la présence d’inclusions de
p62 chez les patients atteints de SLA ou de SLA-DFT portant l'expansion de G4C2 dans le gène
C9ORF72 (Kwok et al., 2014). Les mutations du gène SQSTM1 sont généralement associées à la
maladie osseuse de Paget, maladie caractérisée par une augmentation du nombre et de l’activité
des ostéoclastes conduisant à des anomalies dans l’architecture de l’os (Smith, 1999).
Récemment, plusieurs mutations dans SQSTM1 ont été identifiées dans des cas de SLA-DFT
suggérant un rôle pour ce gène dans la pathogénèse de ces maladies. Les mutations de SQSTM1

37
restent relativement rares (3%) chez les patients souffrant de SLA-DFT, comparativement aux
mutations de TARDBP et FUS (Rubino et al., 2012).

Modèles animaux pour la SLA liée à SQSTM1

Les modèles in vivo créés pour la SLA liée à SQSTM1 permettent d’étudier spécifiquement
l’implication des voies de dégradation protéique par autophagie et par le protéasome (Narendra
et al., 2010 ; De Castro et al., 2013 ; Seibenhener et al., 2013). Chez la Drosophile, l’extinction du
gène orthologue à SQSTM1 conduit à un dysfonctionnement mitochondrial et une accumulation
d'ADN mitochondrial, accompagnés de troubles moteurs (Pimenta de Castro et al., 2012 ; De
Castro et al., 2013). Un modèle de souris knock-out pour SQSTM1 présente également un
dysfonctionnement mitochondrial entrainant une réduction de la production d'ATP. Cette
protéine joue donc un rôle essentiel pour le bon fonctionnement des mitochondries, qui sont
elles-mêmes essentielles pour les neurones car elles sont la principale source d'ATP (en raison de
la glycolyse limitée dans ces cellules) (Lee et Shin, 2011 ; Kwon et al., 2012 ; Seibenhener et al.,
2013). De plus, un nombre croissant d'études suggère que le dysfonctionnement mitochondrial
joue un rôle important dans la pathogénèse de la SLA et de la DFT (Lopez-Gonzalez et al., 2016 ;
Stoica et al., 2014 ; Stoica et al., 2016).

1.3.8 La SLA liée à l’UBQLN4

Depuis quelques années, l’identification de mutations dans les gènes codant pour des
ubiquilines suggère que celles-ci joueraient un rôle important dans la pathogénèse des maladies
du MN. Effectivement, plusieurs mutations dans le gène UBQLN2, codant pour l’ubiquiline 2, ont
été mises en évidence chez des patients atteints de SLAf, accompagnée ou non de DFT (Deng et
al., 2011). La description de cette mutation sera présentée dans le paragraphe suivant et de façon
plus approfondie, car l’étude de la SLA liée aux mutations de l’UBQLN2 représente l’objet principal
de ma thèse.

De façon intéressante, la mutation E54D dans le gène UBQLN1 (codant pour l’ubiquiline
1E54D) a été rapportée chez un patient atteint d’une maladie atypique du MN concordant avec le
syndrome de Brown-Vialetto-Van Laere (González-Pérez et al., 2012). Ces découvertes ont conduit
Edens et ses collègues à rechercher si l’ubiquiline 4, qui montre une forte homologie de séquence
avec l’ubiquiline 2, pouvait être également impliquée dans la SLA. Pour cela, un screening des 11
exons du gène UBQLN4 a été effectué à l’aide d’amorces sur un grand nombre de patients (267
cas de SLAf et 411 cas de SLAs). Une mutation faux-sens dans l’exon 3 de ce gène (c.269A>C) a
ainsi été identifiée dans un cas familial de SLA, conduisant à la substitution d’un acide aspartique
par une alanine (p.D90A) (Edens et al., 2017).

38
 Des études ont montré que les neurones qui expriment l’ubiquiline 4D90A ont un Système
Ubiquitine-Protéasome (SUP) déficient, se traduisant par une réduction du renouvellement des
protéines. Cette observation pourrait s’expliquer par le fait que la mutation D90A soit à proximité
du domaine de liaison au protéasome (UBL : Ubiquitine-Like domain), pouvant ainsi
compromettre l’interaction de l’ubiquiline 4D90A avec le protéasome. L’expression de l’ubiquiline
4D90A conduit également à une accumulation de β-caténine et une morphogénèse anormale des
MNs, ce qui suggère que l’ubiquiline 4D90A peut affecter le développement des MNs par
dérégulation de voie de signalisation dépendante de la β-caténine (Edens et al, 2017). En effet,
cette dernière est essentielle pour la régulation de multiple aspects du développement neuronal
comme la croissance des neurites (Votin et al., 2005), l’orientation axonale (Avile´s et Stoeckli,
2016; Maro et al.,2009) et l’innervation ciblée (Salinas et Zou, 2008; Wu et al., 2012). De plus, il a
été démontré précédemment que la voie du SUP assure la dégradation de la β-caténine et que la
perturbation de cette voie entrainerait une accumulation de la β-caténine (Aberle et al., 1997).
Ainsi, la perturbation du SUP et l’accumulation de β-caténine conduisant à la morphogénèse
anormale des MNs, pourraient être responsable d’un défaut de transmission du potentiel d’action
et de l’innervation ciblée rendant les MNs susceptibles à la dégénérescence (Edens et al, 2017).

Du fait que cette forme de SLAf ait été découverte tout récemment, aucun modèle animal
n’a encore été décrit.

1 La SLA liée à l’UBQLN2

2.1 L’ubiquiline 2
2.1.1 Le gène UBLQLN2 et la protéine ubiquiline 2
L’ubiquiline 2 est une protéine de 66kDa appartenant à la famille des ubiquilines qui
comprend les ubiquilines 1, 2, 3, 4 et L chez l’Homme et les ubiquilines 1 à 5 et L chez la souris.
L’ubiquiline 2 est codée par le gène UBQLN2, localisé sur le chromosome X (Xp11.21). Ce gène ne
contient qu’un seul exon de 1875pb sans séquence intronique (figure 9 : A) (Kaye et al., 2000 ;
Deng et al., 2011). L’ubiquiline 2 est présente dans un grand nombre d’espèces comme les levures,
les rongeurs, le chimpanzé et l’Homme (Zhang et al., 2014).

2.1.2 Localisation cellulaire

L’ubiquiline 2 est principalement localisée au niveau du cytosol (Zhang et al., 2009) mais elle
peut également être associée au réticulum endoplasmique et à la membrane plasmique (Wu et
al., 1999). Certaines études ont montré sa capacité à être transloquée dans le noyau (Hjerpe et
al., 2016). Le niveau d’expression de l’ubiquiline 2 est élevé lorsque la cellule est en phase de

39
mitose (métaphase à télophase) alors que les cellules non-mitotiques expriment faiblement la
protéine (Kleijnen et al., 2000).

2.1.3 Expression tissulaire

L’expression des ubiquilines varie en fonction des tissus. L’ubiquiline 1, par exemple, a une
expression ubiquitaire alors que l’ubiquiline 2 est présente dans un grand nombre de tissus mais
en quantités très variables. En effet, chez la souris son niveau d’expression est majoritairement
plus élevé dans différentes régions du SNC (moelle épinière, amygdale, cortex cérébral, cervelet,
striatum dorsal, hippocampe, hypothalamus, hypophyse, noyaux accumbens, bulbes olfactifs) et
la prostate. Chez l’Homme, elle est surtout présente dans plusieurs régions du cerveau (amygdale,
cortex préfrontal, glande pinéale, hypothalamus, hypophyse, cervelet, lobe occipital), avec un
niveau d’expression nettement moins élevé dans la moelle épinière. Des niveaux non négligeables
sont aussi observés dans la rétine, la prostate et l’utérus. Contrairement à la forme murine,
l’ubiquiline 2 humaine est également retrouvée en grande quantité dans les cellules et les tissus
du système immunitaire tels que les lymphocytes T (CD4+ ou CD8+), les cellules NK CD56+, les
cellules myéloïdes CD33+, les lymphocytes B CD19+, le thymus et la thyroïde. Quant à l’ubiquiline
4, elle est observée dans un grand nombre de tissus mais en très faible quantité. Enfin, les
ubiquilines 3, 5 et L chez la souris et les ubiquilines 3 et L chez l’Homme sont exclusivement
exprimées dans les testicules (Marín et al., 2014).

2.1.4 Structure
Comme toutes les ubiquilines, l’ubiquiline 2 possède un domaine UBL (Ubiquitin-Like
domain) en N-terminal qui se fixe sur la sous-unité 19S du protéasome, et un domaine UBA
(Ubiquitin-Associated domain) en C-terminal se liant aux chaines d’ubiquitine présentes sur les
protéines destinées à être dégradées par le protéasome (figure 9 : B). Il est également possible
que le domaine UBA de l’ubiquiline 2 permette d’interagir avec l’autophagosome, comme cela a
été démontré pour l’ubiquiline 1 (N’Diaye et al., 2009).

40
 Au centre de la séquence protéique, 4 motifs Sti1 (Stress induced protein 1) permettent la
liaison de l’ubiquiline 2 au domaine ATPase de la protéine chaperonne HSP70 (Heat Shock Protein
70), lorsque celle-ci est liée aux protéines ubiquitinylées étant mal-repliées et donc destinées à
être dégradées. Lors d’un stress cellulaire (un choc thermique, par exemple) certaines protéines
perdent leur conformation tri-dimensionnelle et peuvent former des agrégats insolubles et
toxiques pour la cellule. Pour prévenir cette agrégation, HSP70 et l’ubiquiline 2 sont activées et
vont recruter ces protéines toxiques afin qu’elles soient dégradées par le protéasome (Zhang et
al., 2014 ; Hjerpe et al., 2016).

A
5’ UTR 3’ UTR
Exon
281pb 1262pb
1875pb

B
1 624
UBL PXX UBA

STI-1
Figure 9: Représentation schématique du gène UBQLN2 et de la protéine ubiquiline 2 humaine.
(A) Le gène UBQLN2 est localisé sur le chromosome X et ne porte qu’un seul exon codant la protéine ubiquiline
2 (B) qui possède quatre domaines différents ; un « UBiquitin-Like domain » (UBL), 4 motifs Sti1 (Stress induced
protein 1), une région de 12 PXX (P : proline, X : autre acide aminé) répétés en tandem, et un « Ubiquitin-
Associated domain » (UBA) (adapté de Zhang et al., 2014).

Contrairement aux autres formes d’ubiquiline, l’ubiquiline 2 possède une région de 12 PXX
(P : proline, X : autre acide aminé) répétés en tandem, dont la séquence d’acides aminés est
fortement conservée chez plusieurs espèces (figure 9 : B). Bien que le rôle de cette région ne soit
pas encore totalement connu, il semblerait toutefois qu’elle soit impliquée dans les interactions
entre protéines (Ball et al., 2005). En effet, les motifs riches en proline sont fréquemment
impliqués dans des phénomènes d’association multi-protéiques complexes jouant un rôle dans
divers processus cellulaires clés tels que la croissance cellulaire, les réarrangements du
cytosquelette, la transcription et la signalisation post-synaptique. Les séquences riches en proline
ont tendance à former une hélice de polyproline de type II (PPII) dont la structure ressemble à un
prisme triangulaire (figure 10). Parmi les domaines protéiques reconnaissant ces structures, les
domaines SH3 (Src homology 3) par exemple, ont été identifiés dans un grand nombre de

41
protéines dans de nombreuses espèces dont l’Homme (332 protéines) et la souris Mus musculus
(163 protéines). Ces domaines, composés de 60 acides aminés, interviennent dans l’assemblage
des protéines et dans la régulation de l’activité protéique. La reconnaissance du domaine SH3 par
l’élément PPII est fortement sélective car la proline est une amine secondaire (un seul atome
d’hydrogène lié à l’azote) contrairement à tous les autres acides aminés qui sont des amines
primaires (deux atomes d’hydrogène liés à l’azote). De plus, les acides aminés constituant les
sillons étant très conservés, la spécificité des interactions se fait grâce aux deux boucles variables
RT-Src et N-Src (figure 10) (Zarrinpar et al., 2003).

Par ailleurs, les séquences 12PXX, spécifiques à l’ubiquiline 2, pourraient conduire à des
interactions différentes de celles des autres ubiquilines, ce qui justifierait sa présence en plus des
ubiquilines 1 et 4.

A Proline Autre acide aminé

B Hélice PPII C
Hélice PPII

Boucle
n-Src
Domaine SH3

Sillons

Boucle Boucles Sillons liant

RT-Src n-Src et RT-Src le dipeptide xP

Figure 10: Représentations schématiques de la structure et du mécanisme de liaison des hélices de

polyproline de type II (PPII) et des domaines SH3.
(A) La structure chimique de la proline diffère des autres acides aminés (amines primaires) par la présence d’un
noyau pyrrole (4 carbones : α, β, γ, δ et 1 azote : N) qui lui confère une fonction d’amine secondaire. (B) L’hélice
PPII est un ligand riche en proline arborant une structure en forme de prisme triangulaire. (B et C) Le domaine
SH3, quant à lui, se compose de deux sillons hydrophobes formés par des acides aminés aromatiques (en jaune)
et par deux feuillets β reliés l’un à l’autre de façon antiparallèle et possédant chacun trois brins β. L’interaction
se fait au niveau des sillons du domaine SH3 qui se lie chacun à un dipeptide xP de l’hélice PPII. Deux boucles
variables RT-Src et n-Src assurent la spécificité des interactions (d’après Zarrinpar et al., 2003).

42
2.2 Les fonctions de l’ubiquiline 2
2.2.1 Rôle de l’ubiquiline 2 dans le Système Ubiquitine-Protéasome (SUP)
Le Système Ubiquitine-Protéasome (SUP) assure la dégradation d’environ 80% des
protéines intracellulaires (Pickart, 2001) ; ce qui en fait la principale voie de dégradation
protéique. Elle est destinée aux protéines nucléaires et cytoplasmiques à durée de vie courte,
détériorées ou mal repliées (Hershko et Ciechanover, 1998 ; Kleiger et Mayor, 2014). Le
protéasome est impliqué dans une variété de fonctions cellulaires, tels que le contrôle de qualité
du protéome, la réponse au stress ou la régulation du cycle cellulaire. Ce processus de dégradation
se déroule en deux temps (figure 11) ; les protéines sont d’abord marquées par une chaine
d’ubiquitines, servant de signal de dégradation, puis une fois amenées au protéasome, celui-ci
dégrade les protéines en petits peptides grâce à des sites actifs peptidasiques localisés dans le
cœur catalytique du protéasome (Finley, 2009). Le protéasome est impliqué dans des
protéinopathies caractérisées par la présence anormale d’agrégats de protéines ubiquitinylées
dans les cellules. C’est notamment le cas dans certaines maladies neurodégénératives telles que
la SLA et les maladies d’Alzheimer et de Parkinson (Zabel et al., 2010 ; Tanaka et al., 2014).

Ub

Ub

Figure 11 : Représentation schématique de la prise en charge et de la dégradation des protéines mal repliées
par le Système Ubiquitine-Protéasome (SUP).
Les protéines mal repliées peuvent être soit des protéines natives qui ont été dénaturées ou détériorées, soit
des protéines nouvellement synthétisées pour lesquelles le repliement ne s’est pas fait correctement. En se liant
aux domaines hydrophobes, les protéines chaperonnes Hsp70 et Hsp40 favorisent le repliement des nouvelles
protéines synthétisées mais peuvent également faciliter la reconnaissance de protéines anormales (mal
repliées), conduisant à la fixation d’une chaine d’ubiquitines. Cette ubiquitinylation se fait grâce à un mécanisme
séquentiel enzymatique qui nécessite trois enzymes (E1, E2 et E3 ou Chip). Tout d'abord, l'enzyme E1 active le
résidu glycine C-terminal d'une ubiquitine de manière dépendante de l'ATP. L'ubiquitine activée est ensuite
transférée vers le site actif d'une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine (E2). Enfin, une ligase d’ubiquitine (E3

43
ou Chip) lie l'ubiquitine de l'enzyme E2 à un résidu lysine de la protéine mal repliée. En suivant cette cascade
enzymatique, d’autres ubiquitines s’ajoutent les unes après les autres à la suite de la première ubiquitine (au
niveau d’un résidu lysine de l’ubiquitine) formant ainsi une chaîne d'ubiquitines. Une chaîne d'au moins quatre
ubiquitines liées à la lysine 48 est le principal signal de dégradation. La protéine mal repliée polyubiquitinylée est
alors reconnue par la sous-unité régulatrice (19S) du protéasome 26S qui élimine la chaine d’ubiquitines et déplie
la protéine. Celle-ci est transférée dans le coeur catalytique (20S) du protéasome, contenant les sites actifs
protéolytiques, puis clivée en petits peptides (d’après Goldberg, 2003 ; Finley et al., 2009).

La voie de Dégradation des protéines Associées au Réticulum Endoplasmique (DARE) fait

notamment intervenir les protéines du SUP. Le rôle de la voie DARE est d’assurer un contrôle
qualité des protéines du Réticulum Endoplasmique (RE), vital pour maintenir l’homéostasie du RE
et par conséquent pour la survie cellulaire. Ce système est activé en condition de stress du RE afin
d’éliminer les protéines mal repliées qui s’accumulent dans le RE et de ne garder que les protéines
correctement repliées. Parmi les différentes protéines intervenant dans cette voie, la protéine
membranaire du RE, nommée Ubxd8 (Ubiquitin regulatory X domain-containing protein 8) se lie à
des protéines du RE mal repliées destinées à être dégradées par le protéasome (Zhang et al.,
2014).

L’ubiquiline 2 intervient dans la dégradation des protéines mal repliées via le SUP (figure
13 : B). Son rôle est de recruter les protéines poly-ubiquitinylées, grâce à son domaine UBA qui se
lie aux chaines d’ubiquitines, et de les amener au protéasome en se liant à la sous-unité S5a des
complexes régulateurs 19S du protéasome, grâce à son domaine UBL. Ainsi, l’ubiquiline 2 joue un
rôle important dans la dégradation des protéines via le SUP en dirigeant les protéines poly-
ubiquitinylées du cytosol vers le protéasome (Walters et al., 2002).

L’ubiquiline 2 est également impliquée dans la voie DARE où elle interagit avec l’Ubxd8 dans
le but de transloquer les protéines ubiquitinylées du RE, vers le cytosol afin de les amener jusqu’au
protéasome (figure 13 : B) (Xia et al., 2014). De plus, l’ubiquiline 2 interagit avec une autre
protéine membranaire du RE, surexprimée en condition de stress du RE, la protéine Herp
(Homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein) (Kim et al., 2008). L’ubiquiline 2 joue donc
un rôle dans la protection des cellules contre le stress du RE en intéragissant avec des protéines
de la voie DARE, afin d’amener les protéines mal repliées du RE au protéasome pour être
dégradées.

2.2.2 Rôle de l’ubiquiline 2 dans l’autophagie

L’autophagie est un processus de dégradation et de recyclage de diverses macromolécules
et organites cellulaires. En prenant en charge les protéines à durée de vie longue, elle intervient
de manière complémentaire à la voie du protéasome, qui lui assure la dégradation des protéines
à durée de vie courte. La voie autophagique joue un rôle important dans l’homéostasie des

44
cellules. Elle est également impliquée dans diverses réponses biologiques comme le
développement, le stress cellulaire, l’inflammation, la survie cellulaire et le vieillissement. Jusqu’à
présent, trois types d’autophagies ont été décrits :

-La micro-autophagie. Elle participe au renouvellement perpétuel des composants cellulaires dans
des conditions cellulaires normales (Ahlberg et Glaumann, 1985). Cette voie implique
l’invagination de la membrane lysosomale dans le but de séquestrer et dégrader des constituants
cytoplasmiques de petite taille par les hydrolases lysosomales (figure 12) (De Duve et Wattiaux,
1966). Cette voie est également impliquée dans la dégradation sélective des organites qui ne sont
plus nécessaires pour la cellule (Farré et Subramani, 2004).

-L’Autophagie Médiée par les protéines Chaperonnes (AMC). Elle est présente dans tous les tissus
et fonctionne dans les conditions cellulaires physiologiques, mais son activité est maximale dans
des conditions de stress (Massey et al., 2006). Lors de privation nutritionnelle, si la macro-
autophagie n’est pas suffisante pour assurer la dégradation aléatoire de composants
intracellulaires, fournissant des acides aminés nécessaires pour la synthèse de nouvelles
protéines, alors l’AMC intervient en renfort (Massey et al., 2006). De plus, elle assure de manière
sélective la dégradation de protéines cytosoliques altérées présentant des séquences consensus
KFERQ. Ces protéines sont alors prises en charge par la protéine chaperonne cytosolique HSC70
(Heat Shock Cognate protein 70) dont le rôle est d’assurer leur dépliement et leur transport
jusqu’au récepteur membranaire LAMP-2A (Lysosomal Associated Membrane Protein type 2A)
présent à la surface du lysosome pour être ensuite dégradées par les protéases lysosomales
(figure 12) (Kaushik and Cuervo, 2012). Les modifications du fonctionnement de cette voie
autophagique conduit au développement de certaines pathologies, dont des formes familiales de
la maladie de Parkinson (Cuervo et al., 2004).

-La macro-autophagie. Elle intervient préférentiellement en conditions de stress. Son rôle est
double, soit elle permet la génération de macromolécules essentielles et d’énergie lors de
privation nutritionnelle (Mizushima et al., 2005), soit elle permet l’élimination des composants
intracellulaires altérés. Cette voie agit dans de nombreux tissus et est notamment essentielle pour
assurer l’homéostasie neuronale (Hara et al., 2006 ; Komatsu et al., 2006). La macro-autophagie
assure principalement la dégradation de protéines à durée de vie longue et d’agrégats protéiques
(Komatsu et al., 2012). Pour cela, une double membrane appelée phagophore se forme dans le
cytosol puis va séquestrer ces protéines ou ces agrégats en formant une vésicule nommée
autophagosome (figure 12). Ce dernier fusionne ensuite avec le lysosome, formant ainsi un
autolysosome où les protéines et les agrégats sont alors dégradés par les hydrolases lysosomales.

45
Des études ont montré qu’un dysfonctionnement de cette voie autophagique peut être associé à
diverses pathologies comme des myopathies sévères (Nishino, 2003) et des troubles
neurodégénératifs (la SLA, les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, par exemples) (Rubinsztein
et al., 2005 ; Chen et al., 2012).

Figure 12 : Le système protéolytique.

Les protéines, devant être dégradées, sont internalisées dans des lysosomes à partir du milieu extracellulaire
(hétérophagie) ou de l'intérieur de la cellule (autophagie). La voie hétérophagique la mieux décrite est
l'endocytose. Il existe trois différents types d'autophagie: macro-autophagie, micro-autophagie et autophagie
médiée par les protéines chaperones (CMA). Dans la macro-autophagie, les composants intracellulaires sont
séquestrés par une membrane limitante formant une vacuole autophagique qui fusionne ensuite avec les
lysosomes. En micro-autophagie, les substrats sont directement internalisés par des invaginations de la
membrane lysosomale. Contrairement à cette dégradation "en vrac", lors de la CMA, les substrats protéiques
sont transférés dans les lysosomes les uns après les autres en se liant au récepteur lysosomal (LAMP-2A). Le
système ubiquitine-protéasome (UPS) est l'autre voie majeure pour la dégradation des protéines intracellulaires.
Les substrats protéiques se lient à l’ubiquitine et sont pris en charge par le protéasome (d’après Martinez-Vicente
et Cuervo, 2007).

Les niveaux intracellulaires des ubiquilines 1 et 2 pourraient être maintenus par deux
différentes formes d’autophagie. En effet, l’ubiquiline peut être dégradée par la voie macro-
autophagique mais aussi par la voie de l’AMC (figure 13 : A). Des études in vitro ont montré que
le blocage de l’AMC entraine, par exemple, une activation de la macro-autophagie. Autrement dit,

46
les voies de l’AMC et de la macro-autophagie pourraient agir de façon complémentaire afin de
réguler les niveaux intracellulaires d’ubiquilines (Rothenberg et al., 2010).

Des études ont démontré que les ubiquilines 1 et 2 sont impliquées dans la voie macro-
autophagique, notamment pour la conversion du LC3-I (forme cytosolique) en LC3-II (forme liée à
la membrane) ainsi que pour la maturation des autophagosomes en autolysosomes (N’Diaye et
al., 2009 ; Rothenberg et al., 2010) (figure 13 : A). La déplétion des ubiquilines 1 et 2 rend les
cellules plus susceptibles à une mort induite par privation de nutriments et retarde le transport
de l’autophagosome aux lysosomes (N’Diaye et al., 2009).

Figure 13 : Représentation schématique de l’implication de l’ubiquiline 2 dans la voie macro-autophagique et

la voie de Dégradation des protéines Associées au Réticulum Endoplasmique (DARE).
(A) L’ubiquiline 2 intervient dans la modulation de la macro-autophagie. Elle est elle-même dégradée par les
voies macro-autophagique et de l’AMC. (B) L’ubiquiline 2 recrute les protéines du cytosol et du RE afin de les
diriger jusqu’au protéasome pour leur dégradation. Elle peut aussi médier l'activité des protéines du RE,
impliquées dans la voie de DARE telles que Herp et Ubxd8. UBL: « Ubiquitin-like domain »; UBA: « Ubiquitin-
Associated domain »; Ubxd8: Ubiquitin regulatory X domain-containing protein 8; Herp: Homocysteine-induced
endoplasmic reticulum protein; LC3: Light Chain 3; CMA: Chaperone Mediated Autophagy (d’après Zhang et al.,
2014).

2.3 La SLA liée aux mutations dans le gène UBQLN2

Récemment, le gène UBQLN2 a été identifié par Deng et ses collaborateurs, comme étant
lié à la SLAf accompagnée ou non de démences. Cette découverte s’est faite grâce à une étude
réalisée sur 5 familles différentes touchées par la SLA (40 individus au total) pour lesquelles la
maladie se transmet par un mode dominant avec une pénétrance réduite chez les femmes et sans
transmission de père en fils (Deng et al., 2011).

2.3.1 Les mutations de l’UBQLN2 dans la SLA

Deng et ses collaborateurs ont associé le gène UBQLN2 à la SLA avec ou sans démence par
la mise en évidence de 5 mutations faux-sens dans la région PXX, toutes caractérisées par le

47
remplacement d’une proline par un autre acide aminé (figure 14). Par exemple, une cytosine a été
substituée par une adénine en position 1490 de l’ADN codant (c.1490C>A), entrainant le
changement de la proline en histidine en position 497 de la protéine (p.P497H). Les quatre autres
mutations sont les substitutions suivantes : c.1489C>T (p.P497S), c.1516C>A (p.P506T), c.1525C>T
(p.P509S) et c.1573C>T (p.P525S). Parmi ces mutations, celles nommées P497H et P506T montrent
une pénétrance complète, autrement dit, leur présence est toujours associée à la pathologie chez
les individus étudiés (Deng et al., 2011).

Par la suite, différentes études ont référencé d’autres mutations faux-sens responsables de
SLAf, localisées dans/ou à proximité de la région PXX ou bien dans le dernier domaine STI-1 de la
protéine (figure 14). De plus, des mutations faux-sens ont également été mises en évidence dans
des cas sporadiques de la maladie, situées dans un des domaines STI-1 ou dans des domaines non
fonctionnels de la protéine (figure 14).

P506T
P506S
P497H
P497S P509S
P189T Q425R P497L P525S
S155N A283T M446R P533L
T487I
V538L
UBL PXX UBA
STI-1 STI-1

Figure 14: Schéma représentatif des mutations de l’ubiquiline 2 identifiées chez des patients atteints
de SLA avec ou sans démence.
Les mutations identifiées dans les cas de SLA familiales (représentées en gras) sont des mutations faux-sens
principalement localisées dans le motif PXX, entrainant le remplacement d’une proline par un autre acide aminé.
Deux autres mutations ont été référencées; la substitution d’acide aminé M446R se situe dans un domaine STI-
1 et la substitution T487I en dehors d’un domaine fonctionnel connu. Il faut noter que le patient porteur de la
mutation M446R présente aussi une mutation dans le gène OPTN qui est également lié à la SLAf. De même qu’une
mutation dans le gène TARDBP, impliqué aussi dans des cas de SLAf, a été identifiée chez le patient porteur de
la mutation T487I. Cinq cas de SLA sporadiques sont dus à une mutation faux-sens localisée dans un des domaines
STI-1 ou en dehors des domaines fonctionnels de la protéine. Des signes de démence ont été diagnostiqués chez
certains patients porteurs des mutations P497H, P497S, P506T, P506S (d’après Deng et al., 2011 ; Synofsik et al.,
2012 ; Williams et al., 2012 ; Daoud et al., 2012 ; Vengoechea et al., 2013 ; Gellera et al., 2013 ; Fahed et al.,
2014).

2.3.2 Les caractéristiques physiopathologiques de la SLA liée à l’UBQLN2

Phénotype

Le diagnostic des patients présentant une SLA liée aux mutation de l’UBQLN2 est basé sur
les critères référencés d’EL-Escorial (Deng et al., 2011 ; Daoud et al., 2012 ; Gellera et al., 2013).

48
Notamment, l’âge auquel apparaissent les premiers symptômes est très variable, allant de 16 à 71
ans, avec une différence significative entre les hommes et les femmes (moyennes de 33,9 et 47,3
ans respectivement) et non en ce qui concerne la durée de la maladie (moyennes de 43,1 et 48,5
ans respectivement). A 70 ans, la pénétrance des 5 premières mutations identifiées est estimée à
90%. (Deng et al., 2011).

Parmi les patients porteurs du gène UBQLN2 muté, certains souffrent de démences
similaires au type de Démences Fronto-Temporales (DFT) qui se caractérisent notamment par des
troubles du comportement et de la fonction exécutive (Deng et al., 2011 ; Vengoechea et al.,
2013 ; Gellera et al., 2013 ; Fahed et al., 2014). Le degré de sévérité varie suivant les individus et
selon les différents stades de la maladie. Les signes de démence apparaissent progressivement et
précèdent parfois les symptômes moteurs observés chez tous ces patients (Deng et al., 2011).

Au début de la maladie, les formes bulbaire et spinale de la SLA peuvent aussi bien être
observées dans des cas familiaux et que sporadiques de SLA et ne dépendent pas de la localisation
de la mutation dans le gène UBQLN2 (Synofzik et al., 2012 ; Williams et al., 2012 ; Gellera et al.,
2013).

Au niveau histologique

Des analyses post mortem, sur des échantillons de moelle épinière, ont mis en évidence une
perte d’axones dans le tractus cortico-spinal ainsi qu’une perte de neurones dans les cornes
ventrales chez des patients exprimant l’ubiquiline 2P497H ou l’ubiquiline 2P506T (figure 15 : A et B).
Ces individus montrent également une neuro-inflammation dans les cornes ventrales se
manifestant par une astrocytose, autrement dit, une prolifération excessive et anormale des
astrocytes appelée astrogliose (figure 15 : C).

A B C

Figure 15: Photos représentatives de l’atteinte de la moelle épinière dans la SLA liée à l’UBQLN2.
Les analyses suivantes ont été réalisées sur des coupes de moelle épinière provenant d’un patient exprimant
l’ubiquiline 2P506T. (A) La coloration de la gaine de myéline au bleu de Luxol montre une perte importante de la
myéline au niveau des tractus cortico-spinaux (têtes de flèche). (B) Les colorations à l’hématoxyline et à l’éosine
mettent en évidence une perte de neurones de grande taille dans les cornes ventrales (flèches). (C)
L’immunomarquage de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), marquant les astrocytes, montre une importante
astrocytose dans les cornes ventrales (flèches) (d’après Deng et al., 2011).
49
 D’un point de vue histopathologique, la SLA liée à l’UBQLN2 se caractérise principalement
par la présence d’agrégats protéiques, ou inclusions, qui sont majoritairement localisés dans les
MNs de la moelle épinière. Ces inclusions, absentes chez les individus sains, ont une morphologie
typique ressemblant à des filaments d’où le terme d’inclusion en écheveau (ou « skein-like »
inclusion) (Deng et al., 2011).

Des analyses immunohistochimiques post mortem ont confirmé la présence d’inclusions

« skein-like » cytoplasmiques positives pour l’ubiquiline 2 dans les MNs spinaux de patients
atteints de SLA liée à l’UBQLN2 portant les mutations P497H ou P506T (figure 16) (Deng et al.,
2011). Dans ces inclusions localisées dans la moelle épinière, l’ubiquiline 2 co-localise avec
d’autres protéines telles que l’ubiquitine, p62, TDP-43, FUS et l’optineurine mais pas avec SOD1.
Ces observations indiquent que la voie de dégradation des protéines dans les cellules exprimant
l’ubiquiline 2 mutée est détériorée (Deng et al., 2011).

De plus, tous les cas sporadiques et familiaux de SLA, accompagnée ou non de démences,
qui ont été étudiés par Deng et ses collaborateurs, présentent aussi des inclusions « skein-like »
positives à l’ubiquiline 2 dans les neurones localisés dans les cornes ventrales de la moelle
épinière. L’ubiquiline 2 pourrait donc jouer un rôle important dans la formation de ces inclusions
pour les différentes formes de SLA. Les protéines TDP-43 et ubiquitine ont également été
retrouvées dans les inclusions d’ubiquiline 2 dans la moelle épinière de patients atteints de SLAf,
SLAs ou de SLAs/démence (Deng et al., 2011).

A B

Figure 16: Photos représentatives de la formation d’inclusions “skein-like” localisées dans les neurones de
moelle épinière chez un patient atteint de SLA liée à l’ubiquiline 2 P506T.
Les analyses immunohistochimiques ont été réalisées à l’aide de deux anticorps; (A) l’un reconnait la région C-
terminale de l’ubiquiline 2 (acides aminés 554 à 624) et (B) l’autre reconnait la région N-terminale de l’ubiquiline
2 (acides aminés 8 à 24). Les inclusions “skein-like” localisées dans le cytoplasme des neurones (flèches) et dans
les neurites (tête de flèche) sont positives pour l’ubiquiline 2. Barre d’échelle : 100μm (d’après Deng et al., 2011).

50
 Ces inclusions positives pour l’ubiquiline 2 ont également été retrouvées dans les neurites
et le cytoplasme de neurones localisés dans différentes régions de l’hippocampe (couche
moléculaire du gyrus denté, CA1 et CA3) dans des cas de SLA uniquement accompagnée de
démences, avec ou sans mutation de l’ubiquiline 2 (figure 17). Ces observations suggèrent que les
signes de démence sont liés à la formation d’inclusions d’ubiquiline 2 dans l’hippocampe, en
présence ou en absence de mutation dans le gène UBQLN2. En effet, chez les patients atteints de
SLA-DFT portant des mutations dans le gène UBQLN2, les inclusions d’ubiquiline 2 co-localisent
avec l’ubiquitine. Les individus n’exprimant pas l’ubiquiline 2 mutée montrent une co-localisation
de l’ubiquiline 2 avec l’ubiquitine et p62 dans les inclusions.

D’autre part, la protéine TDP-43 a été identifiée dans les inclusions cytoplasmiques positives
pour l’ubiquitine et p62, uniquement dans quelques cellules de la couche moléculaire du gyrus
denté. Quant à la protéine FUS, également impliquée dans des cas de SLA-DFT, elle n’a été
détectée dans aucune inclusion (Deng et al., 2011).

A B

C D

Figure 17: Photos représentatives des inclusions positives pour l’ubiquiline 2 observées dans l’hippocampe
P506T
d’un patient atteint de SLA liée à l’ubiquiline 2 .
Les analyses d’immunohistochimie montrent la présence d’inclusions positives pour l’ubiquiline 2
majoritairement localisées dans la région intermédiaire de la couche moléculaire du gyrus denté (A et B), CA3
(C) et CA1 (D). La figure B est un agrandissement de la région encadrée en figure A. Les flèches noires indiquent
la présence d’inclusions dans les neurites (B, C et D) et les têtes de flèche noire indiquent la présence d’inclusions
cytoplasmiques dans les cellules (C et D). Barres d’échelle : (A) 200μm, (B) 50μm, (C et D) 25μm (d’après Deng et
al., 2011).

51
 Ces résultats, montrant l’accumulation évidente de protéines, suggèrent donc qu’un
dysfonctionnement du renouvellement des protéines pourrait être responsable de la plupart des
cas de SLA et pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, le
développement de modèles appropriés de la SLA liée à l’UBQLN2 est une condition préalable à la
caractérisation des conséquences phénotypiques de ces mutations et à l'élaboration de stratégies
thérapeutiques adéquates.

2.3.3 Les modèles animaux de la SLA liée aux mutations de l’UBQLN2

La découverte de cette nouvelle forme familiale de SLA a suscité beaucoup d’intérêt de la
part des chercheurs travaillant sur la SLA, en raison du rôle majeur que pourrait jouer l’ubiquiline
2 dans le dysfonctionnement de la voie de dégradation des protéines et dans la formation des
agrégats protéiques toxiques pour les MNs. Afin de mieux comprendre l’implication de cette
protéine dans la pathogénèse de la SLA liée à l’UBQLN2, plusieurs modèles animaux exprimant
l’ubiquiline 2 mutée ont été générés et décrits dans la littérature scientifique ces dernières années.

Souris transgéniques exprimant l’ubiquiline 2P497H (Gorrie et al., 2014)

Le premier modèle de souris transgénique exprimant l’ubiquiline 2P497H a été généré par
microinjection d’œufs fécondés (croisement de souris C57BL/6 x SJL) avec un transgène contenant
la séquence d’ADN génomique de l’ubiquiline 2 humaine mutée (c.1490C>A soit p.P497H), dont
l’expression est contrôlée par le promoteur de l’ubiquiline 2 humaine. La lignée portant le plus
grand nombre de copies du transgène a été sélectionnée. Du fait de l’intégration du transgène
dans le chromosome Y, cette lignée a été composée uniquement de souris mâles. Les niveaux
d’expression entre l’ubiquiline 2 humaine et l’ubiquiline 2 murine endogène se sont avérés
similaires ; plus élevés dans le cerveau et la moelle épinière que dans le foie.

Les souris transgéniques âgées de 11 mois ont présenté des agrégats positifs pour les
protéines ubiquiline 2 et p62, principalement localisés dans les cornes dorsales (lamina II) de la
moelle épinière. Toutefois, les inclusions « skein-like » caractéristiques de la SLA, n’ont pas été
retrouvés dans les MNs situés dans les cornes ventrales de la moelle épinière. Les agrégats positifs
pour l’ubiquiline 2 ont aussi été observés au niveau de l’hippocampe (gyrus denté et CA) avec une
augmentation de leur taille et de leur nombre avec l’âge (observés à 2, 3 et 15 mois). A 15 mois,
la quantité d’agrégats est devenue importante dans les dendrites de la région du néocortex et du
cervelet. Les agrégats d’ubiquiline 2, observés dans la région de l’hippocampe, ont également été
positifs pour les protéines ubiquitine, p62 et OPTN, mais pas pour les protéines FUS et TDP-43.

Une spinopathie dendritique a pu être observée dans les régions de l’hippocampe et du

cortex cérébral des souris exprimant l’ubiquiline 2P497H, se caractérisant par la présence
52
d’inclusions protéiques dans les épines dendritiques (pathologie apparemment jamais rapportée
pour les maladies neurodégénératives). Le diamètre des épines dendritiques, des neurones
localisés dans la couche moléculaire du gyrus denté, a été 4 à 5 fois supérieur à la normale et leur
densité a été significativement réduite chez les souris transgéniques par rapport aux souris
contrôles à l’âge de 15 mois. De plus, un dysfonctionnement synaptique touchant la transmission
du signal au niveau des dendrites (postsynaptique) a été détecté. Toutefois, aucune
neurodégénérescence n’a été constatée au niveau de la couche de cellules granulaires du gyrus
denté chez les souris transgéniques.

Des souris double-transgéniques exprimant l’ubiquiline 2P497H et la GFP-ubG76V (servant de

substrat protéique ubiquitinylé) ont montré une accumulation de la GFP ubiquitinylée dans
l’hippocampe qui n’a pas été observée chez les souris simple-transgéniques exprimant
uniquement la GFP-ubG76V. De plus, les agrégats d’ubiquiline 2 ont également été positifs pour des
protéines du protéasome et de la GFP ubiquitinylée. L’accumulation de la GFP ubiquitinylée
témoigne donc d’un dysfonctionnement du système SUP, hors les fonctions postsynaptiques sont
régulées par le « turnover » des protéines synaptiques qui est assuré par le système SUP. Ainsi, le
dysfonctionnement de ce système dans les épines dendritiques pourrait conduire à un
dysfonctionnement synaptique.

D’un point de vue phénotypique, les souris transgéniques ont montré des déficiences
cognitives à l’âge de 11 mois. Lors du test du labyrinthe en Y, les souris transgéniques ont moins
souvent alterné leur exploration d’un bras à l’autre du Y (52%) par rapport aux souris non
transgéniques (78%). Les souris exprimant l’ubiquiline 2P497H ont donc eu une activité exploratoire
moins développée que les souris contrôles. Néanmoins, le nombre d’entrées dans un bras du Y a
significativement été plus élevé chez les souris transgéniques que chez les souris contrôles,
indiquant une absence de déficience motrice chez les souris transgéniques (>600j). L’absence
d’inclusion « skein-like » dans les MNs spinaux pourrait expliquer l’absence de phénotype moteur.
Une déficience de la mémoire temporelle a également pu être constatée par le test de
conditionnement à la peur, où le comportement de peur a été nettement moins important chez
les souris transgéniques par rapport aux souris contrôles (aussi bien quand les souris ont été
placées dans la même chambre que dans une nouvelle chambre). Une déficience de la mémoire
spatiale a aussi été observée chez les souris transgéniques lors du test de la piscine de Morris. En
effet, le temps et la distance parcourue par ces souris, pour atteindre la plateforme placée au
centre de la piscine, n’ont pas été significativement différents de ceux mesurés pour les souris non
transgéniques. Quand la plateforme a été retirée, en revanche, les souris transgéniques ont mis
plus de temps et ont parcouru une distance plus longue par rapport aux souris contrôles.
53
 Ce modèle murin transgénique exprimant l’ubiquiline 2P497H présente certaines
caractéristiques de la SLA-UBQLN2 comme la formation d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans
moelle épinière (à 11 mois) et dans le cerveau (à partir de 2 mois), une spinopathie dendritique,
ainsi que des déficiences cognitives (à 11 mois). Cependant, aucune neurodégénérescence ni
trouble moteur, qui font partie des principales caractéristiques de la pathologie, n’a été observé.

Rats transgéniques exprimant l’ubiquiline 2P497H (Wu et al., 2015)

Un deuxième modèle transgénique pour la SLA-UBQLN2 a été créé chez le rat. Il s’agit d’un
modèle double-transgénique portant un premier transgène renfermant le gène de la tétracycline
(tTA) sous le contrôle du promoteur murin Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase II alpha
(CaMkα2), et un deuxième transgène (20 copies insérées dans le génome) renfermant le gène
humain de l’ubiquiline 2 humaine (mutation P497H) précédé par le promoteur Tetracycline-
Response Element (TRE), permettant l’expression de l’ubiquiline 2 uniquement dans les neurones
du cerveau (figure 18). Ces animaux ont été traités avec de la Doxycycline durant le
développement embryonnaire afin d’éviter toute mort prématurée (au stade embryonnaire) qui
pourrait éventuellement être induite par l’expression de l’ubiquiline 2 mutée. Des rats simple-
transgéniques portant le transgène avec la séquence codant pour la tTA ont été utilisés comme
contrôle exprimant uniquement l’ubiquiline 2 endogène.

A CaMkα2 tTA

tTA Doxycycline tTA

(active) (inactive)

TRE P497H pA
B ubiquiline 2

Figure 18: Représentation schématisée du contrôle de l’expression du gène codant pour l’ubiquiline 2 mutée.
(A) Le transgène portant la séquence du gène qui code pour la tétracycline avec, en aval, le promoteur murin
CaMKα2. Lors du traitement des souris avec la Doxycycline, cette dernière se fixe à la tétracycline qui devient
alors inactive. En absence de traitement à la Doxycycline, la tTA va activer le promoteur TRE (B) permettant ainsi
l’expression du gène de l’ubiquiline 2 mutée (système Tet-Off).

Chez ce modèle, des analyses par western blot sur des échantillons de cortex ont montré la
présence des formes humaine et endogène de l’ubiquiline 2 dans la fraction soluble mais
également dans la fraction insoluble, alors que chez les rats contrôles, l’ubiquiline 2 endogène n’a
été détectée que dans la fraction soluble. Ceci suggère que l’ubiquiline 2 mutée a formé des
agrégats insolubles et pouvant piéger la forme endogène au sein des inclusions. Ensuite, les

54
analyses d’immunofluorescence sur l’ubiquiline 2 (humaine et de rat) ont montré une
accumulation d’inclusions se formant d’abord dans le cytoplasme puis dans le noyau des cellules
du gyrus denté et du cortex chez les rats exprimant l’ubiquiline 2 mutée (étude réalisée entre 20
et 130 jours). Les protéines TDP-43 et FUS, responsables de certaines formes familiales de SLA et
de DFT, n’ont pas été retrouvées au sein des inclusions.

Une réduction significative de la densité des neurones dans le gyrus denté et le cortex a été
observée chez les rats exprimant la protéine mutée (par rapport aux rats contrôles) mais
seulement à un âge avancé (130 jours) ; ce qui suggère que la formation des agrégats précèderait
la dégénérescence des neurones. Ces rats exprimant l’ubiquiline 2 mutée ont présenté une
structure corticale déformée avec des neurones privés de neurites. En réponse à la
neurodégénérescence, une prolifération des cellules astrocytaires (ou astrogliose) et
microgliales (ou microgliose) a également été observée à 130 jours (d’après des analyses
d’immunofluorescence).

En raison du rôle des ubiquilines dans l’autophagie, l’effet de l’expression de l’ubiquiline 2

mutée sur cette voie de dégradation a été étudié par des analyses d’immunofluorescence (à 20 et
130 jours) qui ont montré une accumulation progressive des protéines clés de l’autophagie : p62
et LC3-II. L’ubiquiline 2 mutée perturbe donc le fonctionnement de la voie autophagique. De
plus, l’ubiquiline 2 mutée a conduit à la réduction de la quantité de protéine EEA1 (early
endosome antigen 1), qui est un marqueur des endosomes précoces (80 jours), montrant ainsi son
interférence avec la voie endosomale.

D’un point de vue phénotypique, les rats exprimant l’ubiquiline 2 mutée ont présenté une
déficience de l’apprentissage spatial comparés aux rats contrôles, à 130 jours lors du test du
labyrinthe de Barnes. Comme observé dans le modèle généré par Gorrie et al. (2014), l’expression
de l’ubiquiline 2P497H a causé des déficits cognitifs.

Ce modèle de rat transgénique exprimant l’ubiquiline 2P497H présente certaines

caractéristiques de la SLA-UBQLN2. En effet, les analyses histologiques dans le cerveau ont révélé
une accumulation d’inclusions positives pour l’ubiquiline 2 dans le cerveau (entre 20 et 130 jours),
une astrogliose, une microgliose ainsi qu’une neurodégénérescence seulement à un stade avancé
dans la maladie (à 130 jours). Des analyses phénotypiques ont mis en évidence des déficits
cognitifs. Toutefois, aucune analyse sur la moelle épinière ou sur le muscle n’a été réalisée, et
aucun trouble moteur n’a été décrit dans ce modèle.

55
Souris transgéniques knock-in exprimant l’ubiquiline 2P520T (Hjerpe et al., 2016)

Un modèle de souris knock-in a été créé par transgénèse classique. Ces souris expriment
l’ubiquiline 2P520T murine (mutation équivalente à la mutation P506T identifiée chez l’Homme)
dont l’expression du gène est contrôlée par le promoteur endogène murin.

Les déficits cognitifs ont été accompagnés d’inclusions positives pour les protéines
ubiquiline 2 et p62 au niveau de l’hippocampe, du cortex et du tronc cérébral des souris knock-
in (d’après des analyses d’immunohistochimie réalisées entre 15 et 18 mois). L’ubiquiline 2 a été
détectée dans la fraction insoluble uniquement dans l’hippocampe et non dans le cortex ni le
cervelet (d’après des analyses par western blot effectuées entre 15 et 18 mois).

Comme précédemment démontré in vitro, l’expression de l’ubiquiline 2P520T dans le cerveau

des souris knock-in conduit à une baisse d’interaction de l’ubiquiline 2 avec la protéine HSP70
comparées aux souris sauvages.

Des déficiences cognitives ont été observées chez les souris knock-in durant des tests de
reconnaissance d’objet ; elles passent moins de temps que les souris sauvages pour distinguer un
nouvel objet d’un objet familier à l’âge de 12 mois, de même qu’elles étaient incapables de
distinguer un objet dans un nouvel environnement à 9 et 12 mois.

Aucune déficience motrice, en revanche, n’a été observée chez ce modèle lors des analyses
de la marche et au rotarod, excepté une légère foulée de longueur plus courte par rapport aux
souris sauvages.

Souris transgéniques exprimant l’ubiquiline 2P497S ou l’ubiquiline 2P506T (Le et al., 2016)

Dernièrement, deux modèles de souris transgéniques ont été générés par injection de
vecteurs d’expression, portant la séquence d’ADNc de l’ubiquiline 2 humaine mutée (mutations
P497S ou P506T responsables de SLA-DFT chez l’Homme), d’œufs fertiles hybrides
(B6C3/C57BL/6J). Selon le même procédé, des souris transgéniques exprimant l’ubiquiline 2
humaine sauvage ont été générées. Les lignées produites portent entre 1 à 5 copies pour chaque
construction.

A 8 mois, les niveaux d’ubiquiline 2P497S et d’ubiquiline 2P506T ont été significativement
supérieurs à celui de l’ubiquiline 2 humaine sauvage, dans la moelle épinière. De même que le
niveau de l’ubiquiline 2 endogène a été augmenté chez les souris exprimant la protéine mutée par
rapport à celles exprimant la protéine sauvage et les souris non transgéniques (d’après des
analyses de western blot).

56
 De nombreuses inclusions positives pour l’ubiquiline 2 ont été observées dans le cerveau
(cortex, hippocampe, striatum et tronc cérébral) et la moelle épinière de souris surexprimant
l’ubiquiline 2P497S ou P506T, et leur nombre a augmenté au cours du temps (d’après des analyses
d’immunohistochimie réalisées à 1, 8 et 12 mois). En revanche, les inclusions ont été rares chez
les souris exprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage et les souris non transgéniques où le
marquage de la protéine a été plus uniforme. Comme observé dans les modèles générés par
Ceballos-Diaz et al. (2015), l’ubiquiline 2 a co-localisé avec l’ubiquitine et la thioflavine S au sein
des inclusions observées dans le cerveau des souris exprimant l’ubiquiline 2P497S ou P506T.

Une neurodégénérescence a également été observée au niveau des cornes ventrales de la

moelle épinière et dans le cerveau (cortex moteur, gyrus denté et CA1) des souris exprimant
l’ubiquiline 2 mutée, dès le début de la maladie (à 3 mois) et qui s’est accentuée dans la moelle
épinière jusqu’à la fin de la maladie (à 8 mois). Dans la moelle épinière de ces deux modèles, une
prolifération des cellules astrocytaires et microgliales a aussi été mise en évidence à l’âge de 8
mois par des analyses de western blot.

La pathologie TDP-43 a été observée dans les MNs spinaux des souris surexprimant
l’ubiquiline 2 mutée qu’à un stade avancé dans la maladie (8 mois). La protéine TDP-43 n’a pas été
détectée dans le noyau des MNs, mais au sein d’inclusions cytoplasmiques positives pour
l’ubiquiline 2 et l’ubiquitine. Néanmoins, la pathologie de TDP-43 n’a pas été retrouvée dans
l’hippocampe.

La médiane de survie a été réduite à 246j et 305j pour les souris exprimant l’ubiquiline 2P506T
et l’ubiquiline 2P497S respectivement, alors que les deux lignées de souris exprimant l’ubiquiline 2
humaine sauvage ont une médiane de survie similaire à celle des souris non transgéniques. Les
souris exprimant l’ubiquiline 2P497S ou l’ubiquiline 2P506T ont également eu un poids
significativement inférieur (à partir de 26 et 18 semaines, respectivement) à celui des souris non
transgéniques.

Contrairement aux modèles décrits précédemment, un phénotype musculaire sévère a été

observé chez ces souris en fin de vie. En effet, une réduction de la masse musculaire et du diamètre
des myofibres (muscle gastrocnemius) a été mise en évidence chez les souris exprimant
l’ubiquiline 2P497S ou l’ubiquiline 2P506T, par rapport aux souris non transgéniques. Seule, une légère
baisse de la masse musculaire des souris exprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage a été observée.
De plus, les performances musculaires et la force d’agrippement des souris exprimant l’ubiquiline
2P506T ont été significativement diminuées à partir de 6 semaines par rapport aux souris non-
transgéniques. Chez les souris exprimant l’ubiquiline 2P506T, en revanche, ces phénotypes

57
musculaires sont apparus plus tardivement (vers 24 semaines). La surexpression de l’ubiquiline 2
mutée, mais pas de l’ubiquiline 2 sauvage, conduit donc à une atrophie et une faiblesse
musculaire.

La pathologie musculaire a été accompagnée de déficiences motrices se manifestant par

des difficultés pour se déplacer pouvant évoluer en une paralysie des pattes arrière vers l’âge de
7 mois (paralysie observée chez environ 40% des souris portant la mutation P497S et 10% des
souris portant la mutation P506T). De plus, un phénotype de « clasping » a été observé au niveau
des pattes avant et arrière des souris l’ubiquiline 2P497S ou P506T. Aucun de ces phénotypes n’a été
observé chez les souris non transgéniques ou exprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage.

La surexpression de l’ubiquiline 2P506T et de l’ubiquiline 2P497S conduit à des déficiences

cognitives dont des troubles de la mémoire observés lors du NOR-test, pendant lequel les souris
n’ont pas fait la distinction entre un nouvel objet et un objet familier (étude réalisée à 2-3 mois).

Ces modèles murins transgéniques exprimant l’ubiquiline 2P497S ou l’ubiquiline 2P506T

humaines récapitulent les principales caractéristiques de la SLA-UBQLN2. En effet, les analyses
histologiques ont mis en évidence la présence d’inclusions positives pour l’ubiquiline 2 dans le
cerveau (cortex, hippocampe, striatum et tronc cérébral) et la moelle épinière qui s’accumulent au
cours du temps (entre 1 à 12 mois). Une neurodégénérescence dans les cornes ventrales de la
moelle épinière et dans le cerveau (dès 3 mois), une astrogliose et une microgliose (à 8 mois) ainsi
que la protéinopathie TDP-43 dans les MNs spinaux ont également été observés. L’expression
transgénique de l’ubiquiline 2P497S ou de l’ubiquiline 2P506T chez les souris conduit à une réduction
de leur poids (à partir de 26 et 18 semaines, respectivement) et de leur survie (246j et 305j,
respectivement) ainsi qu’à des déficiences motrices (à 7 mois) et cognitives (2-3 mois). En fin de
vie, les souris présentent une atrophie musculaire (à partir de 3 mois) accompagnée d’une faiblesse
musculaire (à partir de 6 mois pour les souris exprimant l’ubiquiline 2P506T et 24 semaines pour celles
exprimant l’ubiquiline 2P497S).

Les modèles animaux décrits jusqu’à présent dans la littérature ne récapitulent pas
l’ensemble des caractéristiques histologiques, cognitives et motrices de la maladie humaine, à
l’exception du modèle transgénique généré dernièrement par Le et ses collaborateurs (2016)
(tableau 3).

58
 Tableau 3: Modèles de SLA liée à l’UBQLN2 avec leurs caractéristiques physiopathologiques.

Caractéristiques P497H P497H Souris Tg knock-in Souris Tg

Souris Tg Ub2 Rats Tg Ub2
physiopathologiques P520T P497S P506T
(Gorrie et al., 2014) (Wu et al., 2015) Ub2 Ub2 ou Ub2
de la SLA-UBQLN2 (Hjerpe et al., 2016) (Le et al., 2016)

Protéinopathie - Moelle épinière : - Moelle épinière : non - Moelle épinière : non - Moelle épinière : Ub2
agrégats Ub2 (+) et renseigné renseigné (+), Ubq (+), TDP-43 (+)
p62(+) dans cornes - Hippocampe et cortex : - Hippocampe et cortex: - Hippocampe et cortex
dorsales mais pas dans Ub2 (+) mais TDP-43 (-), inclusions Ub2 (+), (entre autres) :
MNs FUS (-) p62 (+) inclusions Ub2 (+),
- Hippocampe : agrégats Ubq (+)
Ub2 (+), Ubq (+), p62 (+),
OPTN (+) mais FUS (-) et
TDP-43 (-)

Neurodégénérescence - Moelle épinière : non - Moelle épinière : non Non renseigné - Moelle épinière :
renseigné renseigné présente
- Hippocampe : absente - Hippocampe et cortex: - Hippocampe et cortex:
présente présente

Neuroinflammation Non renseigné - Moelle épinière : non Non renseigné - Moelle épinière :
renseigné astrogliose et
- Cerveau : astrogliose et microgliose
microgliose - Cerveau : non
renseigné

Amyotrophie Non renseigné Non renseigné Non renseigné - Réduction de la masse

musculaire
- Réduction du diamètre
des fibres

Faiblesse musculaire Non renseigné Non renseigné Non renseigné - Réduction de la force
d’agrippement

Déficience motrice Absente Absente Absente - Difficultés à se déplacer

- Paralysie des pattes
arrière

Déficiences cognitives - De la mémoire spatiale - De la mémoire spatiale - De la mémoire - De la mémoire

- De la mémoire
temporelle
- De l’activité
exploratoire

Démences Non renseigné Non renseigné Non renseigné Non renseigné

Age d’apparition des - Agrégation : 2 mois - Agrégation : 20 jours - Agrégation : 15 mois - Agrégation : 1 mois
caractéristiques - Phénotype : 11 mois - Phénotype : 130 jours - Phénotype : 9 mois - Phénotype musculaire :
physiopathologiques 24 semaines (P497S) et 6
semaines (P506T)
- Phénotype moteur : 7
mois
-Phénotype cognitif : 2-3
mois
Tg : trangénique ; Ub2 : ubiquiline 2 ; Ubq : ubiquitine ; Non renseigné : caractéristique non évoquée dans la publication
scientifique ; Absente : caractéristique recherchée mais non observée dans le(s) modèle(s) en question.

59
3 Traitements et thérapie génique pour la SLA
Malgré l’avancée dans l’identification des gènes associés à la maladie et dans la
compréhension des mécanismes pathologiques de la SLA, il n’existe actuellement aucun
traitement efficace. Ces dernières décennies, les soins aux patients se sont concentrés
exclusivement sur les traitements symptomatiques et sur une amélioration physique. Le Riluzole,
un agent anti-glutamatérgique bloquant la libération pré-synaptique du glutamate, a été le
premier médicament approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement de
la SLA. Cependant, son efficacité est discutable, avec des avantages thérapeutiques minimaux
d'environ 3 à 4 mois d'augmentation de la survie (Ludolph et Ludolph, 2009 ; Glicksman, 2011 ;
Contestabile, 2011 ; Nagoshi et al., 2015).

Bien qu'il reste une avancée majeure à faire vers l'identification de nouveaux facteurs
génétiques impliqués dans la SLA, il est urgent de convertir l’information génétique déjà
disponible en thérapie efficace pour cette pathologie. L'étiologie de la SLA, comme d'autres
maladies neurodégénératives, est hautement multifactorielle, associée à une excitotoxicité
induite par le glutamate, un stress oxydatif, une inflammation, une perte de facteurs
neurotrophiques, des repliements et agrégations protéiques, un contrôle de la qualité des
protéines déficient et un dysfonctionnement mitochondrial (Dunkel et al., 2012). Malgré de
multiples études précliniques et essais cliniques, le mécanisme exact de la pathogénèse et de la
progression de la SLA reste inconnu. Ainsi, le développement d'une thérapie ciblée et efficace est
l'un des enjeux majeurs auxquels les scientifiques sont confrontés aujourd'hui (De Loach et al.,
2015). Voici un aperçu des différentes stratégies thérapeutiques pour traiter cette maladie
neurodégénérative multifactorielle.

3.1 Stratégies pharmacologiques pour la SLA

3.1.1 Stratégies ciblant l’excitotoxicité
Le principal neurotransmetteur excitateur du SNC est le glutamate. Une activation excessive
de ses récepteurs et une défaillance dans son élimination de la fente synaptique ou une sensibilité
post-synaptique accrue entraîne l'accumulation de médiateurs excitateurs causant des lésions
neuronales. Une telle neurotoxicité due à des médiateurs excitateurs, s'appelle l’excitotoxicité.
Cette activation induit un afflux important d'ions calcium qui endommagent la cellule par
activation de protéases, de lipases et de nucléases. L'excitotoxicité semble être également
responsable d'autres caractéristiques de la SLA, telles que la perturbation du calcium, l'activation
d'enzymes protéolytiques, des dysfonctionnements mitochondriaux et un déséquilibre
énergétique (Guo et al., 2003 ; Kawahara et Kwak, 2005 ; Matyja et al., 2006 ; Zhao et al., 2008).

60
D’autre part, la mutation de la SOD1 peut entrainer des perturbations dans l'homéostasie du
calcium. En effet, les agrégats de SOD1 liés à la mutation A4V forment des pores qui s'intègrent à
la membrane, entraînant un afflux de calcium. Ceci suggère que la SOD1 mutée peut contribuer
au dommage excitotoxique sans la contribution d'autre élément lié à la glutamatérgie (Allen et al.,
2012).

Le Riluzole inhibe la libération de glutamate et inhibe de manière non-compétitive les

récepteurs post-synaptiques NMDA et AMPA, ainsi que l'activation d'un processus de transduction
du signal dépendant de la protéine G. Ainsi, le Riluzole ralentit la progression de la maladie chez
les souris transgéniques SOD1G93A et augmente la survie des patients de quelques mois
(Contestabile et al., 2011). Une grande variabilité de son efficacité a conduit au développement
de dérivés plus stables. En effet, une vingtaine pro-médicaments du Riluzole a été identifiée et
évaluée pour leur utilisation probable dans le traitement de la toxicité du glutamate dans la SLA.

Plusieurs études ont suggéré que l’élimination du glutamate des synapses neuromusculaires
est perturbée chez les patients atteints de SLA en raison de la perte de l'EAAT2 (Transporteur
d’acide aminé excitatoire, également connu sous le nom de transporteur de glutamate, GLT1)
(Rothstein et al., 1995). De façon intéressante, il a été démontré que le niveau de GLT1 est
augmenté en présence d'antibiotiques bêta-lactames, tels que la pénicilline et ses dérivés. Le
Ceftriaxon, un antibiotique bêta-lactame de troisième génération, réduit l'excitotoxicité du
glutamate en augmentant l'activité du promoteur de GLT1. L’augmentation de l'expression et de
la fonction de GLT1 a été observée chez des souris SOD1G93A traitées avec du Ceftriaxon au début
des symptômes (Rothstein et al., 2005). Cependant, dans une étude réalisée sur une centaine de
patients atteints de SLA, le Ceftriaxon n'a pas amélioré la force musculaire ni les scores
d'incapacité (Beghi et al., 2006).

3.1.2 Stratégies thérapeutiques ciblant le stress oxydatif

Des lésions oxydatives ont été observées dans les modèles cellulaires et murins de la
maladie, dans les MNs de la moelle épinière et du cortex moteur, et dans le liquide
céphalorachidien de patients atteints de SLA (Shaw et al., 1995 ; Ferrante et al., 1997; Abe et al.,
1995 ; Abe et al., 1997). Plusieurs agents neuroprotecteurs ayant des capacités antioxydantes ont
été étudiés en relation avec la SLA. Par exemple, le Rasagiline, un inhibiteur de la monoamine
oxydase utilisé pour traiter la maladie de Parkinson (Olfield et al., 2007), présente des propriétés
neuroprotectives en régulant la transition de perméabilité de la mitochondrie et en augmentant
sa survie. Le Rasagiline, seule ou en combinaison avec le Riluzole, améliore à la fois les
performances motrices et la survie des souris SOD1G93A (Waibel et al., 2004). D’autre part,

61
l'Edaravone (ou Radicava), un antioxydant permettant l’élimination de radicaux libres, a un effet
neuroprotecteur. Il retarde la progression de la maladie, la dégénérescence des MNs et la perte
de poids, et permet également une réduction du nombre d’agrégats de SOD1 chez les souris
SOD1G93A (Ito et al., 2008). Son efficacité comme traitement de la SLA a été démontrée dans un
essai clinique de six mois mené au Japon. Lors de cet essai, 137 participants ont été répartis
aléatoirement pour recevoir soit l’Edaravone, soit un placebo. À la 24ème semaine, les patients
ayant reçu l’Edaravone ont montré un ralentissement dans la progression de la maladie par
rapport à ceux ayant reçu le placebo. En juin 2017, le médicament Radicava développé par
de Mitsubishi Tanabe Pharma a été approuvé par la FDA.

3.1.3 Stratégies thérapeutiques ciblant la neuroinflammation

La neuroinflammation est une manifestation pathologique commune des maladies
neurodégénératives et représente donc une cible thérapeutique potentielle importante (Yong et
Rivest, 2009). Dans la SLA, les dommages aux MNs conduisent à l'activation de la microglie, des
astrocytes et du système du complément conduisant à la neurodégénérescence (Troost et al.,
1990 ; Zhao et al., 2013). L'analyse du liquide céphalorachidien et de la moelle épinière provenant
de patients atteints de SLA a montré une augmentation de l'activation microgliale et de la diffusion
des lymphocytes T (Henkel et al., 2004; Sta et al., 2011), ainsi qu’une concentration plus élevée
de médiateurs inflammatoires (Kuhle et al., 2009). L'activation et la prolifération microgliales sont
également illustrées dans les modèles animaux de la SLA (Henkel et al., 2009). Les astrocytes
jouent un rôle clé dans la neuroinflammation en produisant plusieurs médiateurs inflammatoires,
comme la prostaglandine E2, le leucotriène B4 et l'oxyde nitrique (Hensley et al., 2006). En outre,
les astrocytes des patients atteints de SLA sont toxiques pour les MNs et cette toxicité est en partie
engendrée par la surexpression de gènes inflammatoires (Haidet-Phillips et al., 2011). Un certain
nombre d'agents neuroprotecteurs ciblant les voies inflammatoires de la SLA ont été développés.
Par exemple, le Tocilizumab est un agent anti-inflammatoire pour la polyarthrite rhumatoïde qui
réduit la neuroinflammation. Plus précisément, il s'agit d'un anticorps anti-interleukine 6 (IL-6) qui
réduit l'activation des macrophages, des monocytes et des lymphocytes T, diminuant ainsi la
production de cytokines pro-inflammatoires. Le blocage de la signalisation du récepteur IL-6 par
le Tocilizumab réduit ainsi la progression de la SLA.

3.1.4 Stratégies thérapeutiques ciblant la dégradation des protéines

La présence d’agrégats protéiques est l’une des caractéristiques pathologiques importantes
de la SLA. Les voies de dégradation des protéines, le SUP et l'autophagie jouent un rôle crucial
dans l'élimination des protéines mal repliées et dans la prévention de l'agrégation protéique
(Bennett et al., 2005). Plusieurs composés chimiques ont été capables de réduire les agrégats dans
62
des modèles animaux de SLA. Par exemple, l’Arimoclomol faisant partie de la famille des «drogues
intelligentes» permet l'expression de certaines protéines (heat shock protein) uniquement sous
des conditions de stress cellulaire. Le traitement post-symptomatique par Arimoclomol, a permis
de ralentir la progression de la maladie et d’obtenir une survie accrue chez les souris SOD1G93A
(Phukan, 2010 ; Kieran et al., 2004). De plus, le traitement administré en phase tardive, a amélioré
la fonction musculaire. Il a également été démontré que l'Arimoclomol réduit les agrégats
d'ubiquitine dans la moelle épinière de souris SOD1G93A (Kalmar et al., 2008). Des essais cliniques
en phase II / III sont en cours et ont montré une bonne tolérance du traitement (Cudkowicz et al.,
2008 ; Lanka et al., 2009).

3.1.5 Stratégies thérapeutiques visant les dysfonctionnements mitochondriaux

La mitochondrie est une organelle intracellulaire impliquée dans la production d'ATP,
l'homéostasie du calcium et la régulation intrinsèque de l'apoptose. Un grand nombre d'études
ont mis en évidence le rôle important des mitochondries dans la pathogénèse des maladies
neurodégénératives (Di Carlo et al., 2012; Keating, 2008 ; Lin et Beal, 2006). Il a été rapporté que
la teneur en ADN mitochondrial et l'activité des complexes des chaînes respiratoires sont
diminuées dans la moelle épinière des patients atteints de SLA (Wiedemann et al., 2002). La
dysfonction des mitochondries a également été rapportée dans les muscles squelettiques de
patients atteints de SLA (Wiedemann et al., 1998). Des études in vitro ont montré des
changements morphologiques et fonctionnels des mitochondries dans les cellules NSC-34
exprimant le SOD1 mutée (Menzies et al., 2002). Il a été observé que la capacité tampon du
calcium des mitochondries est affectée dans le cerveau et la moelle épinière des souris SOD1G93A
(Damiano et al., 2006). Les perturbations de l'activité tampon du calcium dans les MNs les rendent
vulnérables à l'excitotoxicité engendrée par le glutamate. De plus, les mitochondries sont la
principale composante cellulaire contrôlant l'apoptose. Il a été démontré que les agrégats de
SOD1 mutée se lient avec des éléments anti-apoptotiques mitochondriaux, tels que Bcl-2, et
activent l'apoptose par la libération prématurée du cytochrome C dans le cytoplasme (Pasinelli et
al., 2004). Des résultats récents suggèrent que TPD-43 mutée peut également endommager la
morphologie mitochondriale chez des souris transgéniques (Xu et al., 2010 ; Wang et al., 2013).
Le Pramipexole est un agoniste de la dopamine jouant un rôle important dans l'amélioration de la
réponse oxydative (Pattee et al., 2003). Il permet l'augmentation de la production d'ATP et la
réduction des espèces réactives d'oxygène et de l'apoptose (Bozik et al., 2011). Le Pramipexole a
prouvé une action neuroprotectrice à la fois in vitro et in vivo, mais a récemment échoué dans un
essai de phase III (Gribkoff et Bozik, 2008).

63
3.1.6 Stratégies thérapeutiques visant l’apoptose dans la SLA
Bien que controversé, il existe des preuves que l'apoptose mitochondriale semble jouer un
rôle dans la SLA (Pasinelli et al., 2000 ; Friedlander, 2003). En effet, la suppression de certaines
voies de l'apoptose mitochondriale chez les souris SOD1G93A a fourni de fortes preuves de son
implication dans la maladie (Reyes et al., 2010). Une meilleure compréhension et un ciblage de
ces voies apoptotiques pourraient être un atout pour les études thérapeutiques de la SLA. Le
Guanabenz est un médicament perméable à la BHE, approuvé par la FDA pour la médication anti-
hypertensive. Ce composé s’est révélé neuroprotecteur dans des modèles de SLA liée à TARDBP
(Vaccaro et al., 2013). Plus récemment, il a été étudié dans deux essais précliniques distincts
utilisant les souris SOD1G93A (Wang et al., 2014 ; Jiang et al., 2014). Les résultats de ces études
suggèrent que le Guanabenz réduit le stress du RE en activant la voie UPR (Unfolded Protein
Response) réduisant la quantité de SOD1 mutée.

3.1.7 Stratégies thérapeutiques via les facteurs neurotrophiques

Les facteurs neurotrophiques retardent l’apparition et la progression de la maladie en
favorisant la neuroprotection et la régénération dans des modèles murins (Ciesler et Sari, 2013).
Le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF-1) et le facteur neurotrophique dérivé de lignées
de cellules gliales (GDNF) régulent la survie et la différenciation des neurones conduisant à une
durée de vie allongée des souris transgéniques SOD1. Dans certains essais cliniques, l'IGF-1 a
ralenti légèrement la progression de la maladie, mais ces résultats n'ont pas été confirmés dans
des études ultérieures (Borasio et al., 1998 ; Lai et al., 1997). Un autre facteur neurotrophique, le
facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) retarde la progression de la maladie et
prolonge la survie chez les souris transgéniques SLA (Zheng et al., 2007) et dans les modèles de
rat (Storkebaum et al., 2005). Les facteurs neurotrophiques sont malheureusement peu efficaces
dans la SLA, en raison de leur faible biodisponibilité et de leur mauvaise transmission dans les
MNs.

64
 Figure 19: Les agents neuroprotecteurs et leur cible dans la pathogénèse de la SLA.
Dans cette image les différents mécanismes pathologiques ciblés par les stratégies thérapeutiques sont
représentés. Pour chaque voie, les molécules thérapeutiques sont listées (modifié à partir de Kumar et al., 2016).

3.2 Stratégies thérapeutiques non pharmacologiques

3.2.1 Thérapie par cellules souches
Les résultats des thérapies par cellules souches, pour le remplacement et la régénération
des neurones, ont apporté un grand espoir pour les patients atteints de SLA (Maragakis, 2010). De
nombreux travaux précliniques ont été effectués dans les modèles murins de la SLA par
transplantation de différents types de cellules comme les cellules souches embryonnaires (ESS),
les cellules souches neurales (NSC), les cellules de la moelle osseuse, les cellules souches
hématopoïétiques (HSC) et les cellules souches mésenchymateuses (MSC) (Giordano et al., 2007 ;
Kim et Vellis, 2009 ; Meamar et al., 2013 ; Thomsen et al., 2014). La disponibilité des cellules
souches pluripotentes induites (iPSC), qui peuvent être différenciées en populations neuronales
spécifiques, ouvrent un champ captivant pour la recherche neurologique et le développement de
stratégies thérapeutiques. Ces cellules permettent l’observation in vitro de l'initiation et de la

65
progression de la maladie, ainsi que l’élaboration de nouveaux traitements via l’utilisation des
propres cellules du patient (Mattis et Svendsen, 2011 ; Papadeas et Maragakis, 2009). En 2008, les
premiers iPSC humains de patients atteints de SLA ont été différenciés en MN (Dimos et al., 2008).
Une transplantation de cellules souches squelettiques adultes a également été testée dans des
cas de SLA (Mazzini et al., 2003). Bien que l'ère de la thérapie à base de cellules souches commence
à peine, plusieurs essais de thérapie cellulaire pour la SLA ont été réalisés dans différents pays à
travers le monde (Kumar et al., 2016).

3.2.2 Thérapie génique

La thérapie génique est une approche thérapeutique très prometteuse pour la SLA
puisqu'elle assure une délivrance spécifique de « médicaments » aux cellules endommagées et
surmonte la difficulté de franchir la BHE (Moreno-Igoa et al., 2010 ; Boillee et Cleveland, 2004 ;
Miller et Cleveland, 2003). Elle peut être utilisée pour délivrer les gènes codant pour des facteurs
neurotrophiques, des protéines anti-apoptotiques ou pour bloquer l'expression de gènes
défectueux (Abe et Warita, 1999 ; Moreno-Igea et al., 2010). Son avantage le plus important est
que certains vecteurs viraux peuvent être administrés directement ou systémiquement au SNC
pour transduire une cible cellulaire déterminée. Par exemple, le système rétrograde de
distribution des vecteurs dérivés du Virus Adeno Associé (AAV) pour l’IGF-1 et le GDNF a démontré
des avantages dans les modèles de souris SOD1 (Kaspar et al., 2003). Des injections
intramusculaires de lentivirus exprimant le VEGF ou l’agent anti-apoptotique Bcl-2 ont également
montré des résultats positifs dans les modèles de rongeurs (Azzouz et al., 2000 ; Azzouz et al.,
2004).

Une autre approche thérapeutique consiste à bloquer l'expression de gènes qui provoquent
la dégénérescence des MNs, tels que la SOD1 mutée. En effet, des oligonucléotides antisens
ciblant la SOD1 mutée, administrés chez les rats SOD1G93A, ont réduit le niveau de la protéine dans
le cerveau et dans la moelle épinière et ont retardé la progression de la maladie (Smith et al.,
2006). Sur la base de ces résultats, un essai clinique de phase I a récemment été réalisé par
administration intrathécale d'oligonucléotides chez des patients atteints de SLA familiale liée aux
mutations de SOD1 (Miller et al., 2013). D’autres parts, le vecteur AAV de sérotype 9 a été utilisé
pour délivrer des ARNsh dirigés contre la SOD1 chez les souris SLA après une seule injection
intravasculaire. Cette approche systémique a permis de prolonger la durée de vie des souris
SOD1G93A injectées à la naissance ou à l’âge adulte (Foust et al., 2013). Une autre étude utilisant
le sérotype rh10 de l'AAV pour exprimer le micro-ARN artificiel (miARN) a également montré un
ralentissement de la progression de la maladie et une survie prolongée chez les souris SOD1G93A
injectées par voie intrathécale à l'âge de 65 jours (Wang et al., 2014). Ces études et d'autres (Borel
66
et al., 2016 ; Stoica et al., 2016) ont révélé des résultats thérapeutiques encourageants et une
application possible en clinique.

L’équipe au sein de laquelle j’ai effectué ma thèse, a récemment développé une nouvelle
approche d’extinction de SOD1 mutante chez les souris SLA. L’inhibition de la transcription de la
SOD1 a été réalisée par saut d’un exon constitutif de la SOD1 (exon skipping) via l’utilisation
d’oligonucléotides antisens complémentaires aux séquences régulatrices de l’épissage. L'ARNm
en résultant contient alors un codon stop prématuré entrainant sa suppression par le système de
dégradation des ARNm non-sens (Nonsense-Mediated Decay ou NMD) (Chang et al., 2007 ; Ward
et al., 2014). Les oligonucléotides antisens dirigés contre la SOD1 mutée ont été insérés dans un
vecteur AAV de sérotype 10 et incorporés dans un petit ARN nucléaire modifié U7. Les vecteurs
AAV ont été délivrés dans le SNC et les organes périphériques, par la combinaison d’injections
intraveineuse et intracérébroventriculaire. Cette stratégie de saut d'exon a présenté un potentiel
thérapeutique élevé chez les souris SOD1G93A nouveau-nées (P1) et adultes (à l’âge de 50 jours).
Cette approche de thérapie génique a induit un saut d'exon de la SOD1 efficace dans la moelle
épinière, entraînant une réduction importante des niveaux d'ARNm et protéique de SOD1. La
survie des souris SOD1G93A a été prolongée, avec une augmentation moyenne de l'espérance de
vie de 92% et 58% pour les souris injectées à la naissance et à 50 jours, respectivement.
L'apparition de la maladie a également été retardée de 95 et 63 jours, respectivement, par rapport
aux souris non traitées. Enfin, l’inhibition de l’expression de la SOD1 mutée, via le vecteur AAV, a
empêché la perte de poids et a préservé la fonction motrice et la force des muscles squelettiques
(Biferi et al., 2017).

4 Les Adeno-Associated Virus (AAV) pour le transfert de gènes

Les vecteurs AAV recombinants (AAVr) présentent de nombreux avantages pour la thérapie
génique et le transfert de gène en général. En effet, ils sont non pathogènes étant donné qu’ils ne
contiennent plus de séquence virale et qu’ils sont capables de mener à l’expression de transgènes
à long terme. Aucune toxicité n’a été décrite et seule une faible réponse inflammatoire a été
observée après l’administration d’AAV dans le cerveau et la moelle épinière (Ruitenberg et al.,
2002).

4.1 Biologie de l’AAV

Les AAV sont de petits virus à ADN simple brin (4,7Kb), dépourvus d’enveloppe avec une
capside d’environ 25nm de diamètre (Bowles et al., 2006), appartenant à la famille des
Parvoviridae et au genre des Dependovirus (Berns et Parrish, 2007). Ils ont la particularité d’être
67
naturellement non-réplicatifs en l’absence d’un virus auxiliaire, également appelé virus « helper »
(un adénovirus ou un virus de l’Herpès) assurant leur réplication et la formation de la capside
(Muzyczka et Berns, 2001).

Le génome des AAV est constitué d’un ADN linéaire simple brin d’environ 4700b présentant
deux cadres de lecture, Rep et Cap, et trois régions promotrices (figure 20). Le gène Rep, sous
contrôle des promoteurs p5 et p19, code pour 4 protéines non structurales (Rep78, 68, 52 et 40)
(Büning et al., 2008).

rep cap
ITR ITR
p5 p19 p40
3’-OH 5’

Rep78

Rep68

Rep52

Rep40

VP1

VP2

VP3

Figure 20 : L’organisation du génome de l'AAV (modifié à partir de Büning et al., 2008).

Les protéines Rep78 et Rep68 possèdent la capacité de se fixer à l’ADN et exercent des
activités endonucléase, hélicase et ATPase, essentielles à la réplication du génome viral. Les deux
protéines Rep mineures, Rep 52 et Rep 40, sont impliquées dans l’encapsidation du génome viral
mais ne sont pas essentielles pour le cycle réplicatif du virus. Le gène Cap, sous contrôle du
promoteur p40, code pour les protéines structurales VP1, VP2 et VP3 qui composent la capside.
Ces gènes viraux sont encadrés par deux séquences terminales inversées et répétées, de 145
nucléotides, appelées ITR (Inverted Terminal Repeat) formant une structure secondaire en épingle
à cheveux aux extrémités 5’ et 3’. Les ITRs servent d’origine de réplication ainsi que d’amorce pour
la synthèse du brin complémentaire par l’ADN polymérase. En effet, les AAV ont naturellement
leur ADN sous la forme de simple brin (AAVsb), qui est répliqué de façon complémentaire lors de
l’infection dans la cellule hôte (Muzyczka et al, 2001 ; Sonntag et al, 2010).
En l’absence de virus helper, les AAV ont la capacité de rester sous forme d’épisomes ou de
s’intégrer de manière stable dans le génome de la cellule hôte au niveau d’un seul site spécifique
68
qui est localisé dans le chromosome 19 humain (Muzyczka et Berns, 2001). Les AAV rentrent alors
dans un état de latence jusqu’à ce qu’ils soient réactivés par surinfection de la cellule hôte d’un
virus auxiliaire (Berns et al, 1996).

4.2 Les sérotypes

Plusieurs sérotypes ont été découverts par analyse des différences situées au niveau des
protéines de la capside virale. Un nouveau sérotype est déterminé lorsque le virus ne réagit pas
avec des anticorps neutralisants dirigés contre les sérotypes existants et déjà caractérisés.
Actuellement, 12 sérotypes d’AAV ont été caractérisés et classés de l’AAV1 à l’AAV12. Plus d’une
centaine de variants ont été identifiés à partir de préparations d’adénovirus, d’origine humaine
ou de primates non-humains. Les différents sérotypes d’AAV décrits diffèrent dans la séquence en
acides aminés des protéines de leur capside ainsi qu’au niveau de la séquence nucléotidique des
ITRs (Gao et al., 2004 ; Grimm et al., 2003).

Les propriétés des différents sérotypes ont été essentiellement étudiées dans le contexte
de leur utilisation comme vecteur de transfert de gène. En effet chaque sérotype possède un
tropisme préférentiel d’infection qui est non exclusif pour un organe ou un type cellulaire. Par
exemple, l’AAV2 infecte un grand nombre de types cellulaires, mais peu les cellules ciblées pour
la thérapie génique comme le muscle, le foie et les cellules hématopoïétiques. Alors que l’AAV8
transduit de façon préférentielle le foie et le cœur ; l’AAV1 et l’AAV7 le muscle ; l’AAV5 la rétine ;
et l’AAV9 et l’AAV10 le cerveau et la moelle épinière (Gao et al., 2004 ; McCown, 2011).

4.3 Le cycle viral réplicatif

Après liaison à leur récepteur et corécepteur spécifique (comme l’héparane sulfate, la
laminine ou les intégrines), les particules d’AAV sont internalisées par endocytose, dans des
vésicules entourées de clathrine (figure 21). Une acidification de ces vésicules entraîne une
modification de la capside virale déclenchant l’externalisation d’un domaine protéique, ayant une
activité phospholipase, permettant la sortie des particules des endosomes et leur accumulation
autour du noyau cellulaire. L’entrée des AAV dans le noyau reste pour l’instant l’une des étapes
les moins bien connues. Le génome AAV est ensuite décapsidé et converti en ADN double brin par
la machinerie cellulaire. En l’absence de virus auxiliaire, le génome AAV sauvage persiste sous
forme épisomale ou est intégré au génome de la cellule hôte via les protéines Rep. Pour les AAV
recombinants, ne possédant plus le gène Rep, les épisomes circulaires représentent les formes
majoritaires dans le noyau des cellules transduites (Ding et al. 2005).

69
 Figure 21 : Étapes majeures du trafic intracellulaire des particules d’AAV (d’après Millet et al., 2013).

La polymérase de la cellule hôte utilise l’extrémité 3’ de l’ITR comme amorce pour la

synthèse du brin complémentaire (figure 22). La réplication de l’ADN viral fait intervenir trois
propriétés des protéines Rep78 et Rep68 : leur capacité à se lier sur le site RBE (Rep Binding
Element) de l’ITR ; leur activité hélicase dépendante de l’ATP, permettant la séparation des deux
brins d’ADN ; ainsi que leur activité endonucléase qui s’exerce sur un seul brin d’ADN au niveau
du site TRS (Terminal Resolution Site) de l’ITR. Les protéines VP1, VP2 et VP3 sont rapidement
synthétisées et s’assemblent sous forme de capsides vides dans le noyau. L’encapsidation du
génome viral se fait donc dans des particules préformées et fait intervenir l’activité hélicase des
protéines Rep52 et Rep40 (Timpe et al., 2005).

70
 3’ 5’

trs
4

+
5

ITR

Brin matrice ssAAV

Brin néosynthétisé

Figure 22 : Le cycle réplicatif de l'AAV.

(1) La polymérase de la cellule hôte synthétise le brin complémentaire à partir de l’ITR 3’ qui sert de matrice.
L’élongation du brin se poursuit jusqu’à la réplication de l’ITR 5’. Cette étape est généralement appelée
conversion du génome de l’AAV. (2) Les dimères d’ITRs se séparent et reforment des structures en épingle à
cheveux (isomérisation). (3) Une endonucléase (Rep) vient se fixer sur la séquence trs de l’ITR 3’ du brin matrice
et le clive. Avant la séparation des deux brins, la polymérase synthétise l’ITR 3’ du brin matrice. (4) Les deux brins
peuvent aussi bien repartir dans le cycle de réplication, (5) que rentrer dans une capside virale pour former un
virion.

4.4 Les AAV recombinants

Les vecteurs AAVr utilisés pour le transfert de gènes sont composés d’une part de la capside,
responsable des propriétés antigéniques et du tropisme cellulaire, et d’autre part du transgène
bordé par les séquences ITRs de l’AAV (en règle générale, les séquences ITR sont celles de l’AAV2).
Le transgène est constitué d’un ADNc sous le contrôle d’un promoteur et suivi d’une séquence de
polyadénylation.

La production des vecteurs recombinants est réalisée en apportant en trans les gènes Rep
et Cap (du plasmide « pHelper ») et les fonctions adénovirales auxiliaires (plasmide pXX6
contenant les gènes E2a, VAI et E4). Généralement, la production est réalisée par la tri-
transfection transitoire de cellules embryonnaires de rein humain 293 (HEK293) avec les plasmides
pXX6, pHelper et le plasmide transgène contenant la cassette d’expression du transgène bordée
par les deux ITRs de l’AAV2.

71
 Le mécanisme d’intégration des AAV étant dépendant de Rep, les vecteurs AAVr ne
possèdent pas théoriquement la capacité d’intégration au niveau du site spécifique des virus AAV
sauvages. En effet, de nombreuses études ont montré que le génome de l’AAVr persiste
principalement sous forme épisomale circulaire dans le noyau de la cellule. Cependant, une
intégration aléatoire du génome de l’AAVr peut avoir lieu dans certains cas (souvent observée
dans des cellules en division) mais cet évènement est relativement rare (Schultz et Chamberlain,
2008).

L’efficacité de transduction des vecteurs AAV, pour un type cellulaire donné, dépend de la
nature des récepteurs présents à la surface des cellules cibles ainsi que de la capacité de la cellule
à internaliser et à transporter l’AAV jusqu’à son noyau. Leur efficacité de transduction dépend
également du processus de décapsidation ainsi que de l’étape de conversion du génome, c’est-à-
dire du passage d’un ADN simple brin à un ADN double brin (Ferrari et al., 1996 ; Fisher et al.,
1996).

4.5 Développement de vecteurs AAVr double brin

Une des étapes clés pour une transduction efficace des cellules, est la conversion du génome
des AAV d’un ADN simple brin à un ADN double brin, qui est en partie dépendante des protéines
provenant du virus auxiliaire. En effet, lorsque l’AAV pénètre dans la cellule, les génomes viraux
restent à l’état de molécules simples brins dans le noyau, limitant l’expression du transgène. Pour
contourner l’étape limitante de la synthèse du brin complémentaire d’ADN, un mécanisme
alternatif a été envisagé : l’encapsidation d’ADN double brin (ou sc pour self-complementary).

Les AAV ont la capacité d’encapsider des molécules d’ADN simple brin de polarité positive
ou négative. De ce fait, si la taille du génome du vecteur recombinant est réduite à environ 2300
pb (la moitié de la taille du génome normal), les AAV peuvent encapsider dans un même virion
deux ADN simple brin pouvant s’apparier s’ils sont complémentaires (encapsidation d’un brin
positif et d’un brin négatif). Néanmoins, l’encapsidation de deux molécules d’ADN est un
phénomène relativement variable d’une préparation virale à l’autre ; c’est pourquoi une délétion
du site TRS sur l’ITR 3’ permet d’augmenter le nombre de molécules double brin encapsidées lors
de la production d’AAVr. En effet, lors de la synthèse du brin complémentaire, l’endonucléase Rep
se fixe sur le site TRS du brin matrice et le clive. Si ce site est délété, la coupure du brin ne peut
être exécutée ce qui conduit à la formation d’un ADN composée de deux ITRs sauvages localisés à
chaque extrémité de la cassette d’expression du transgène (un dimère composé de la séquence
répétée et inversée du transgène) et d’un ITR muté séparant les séquences complémentaires.

72
 Cependant, une des limites des vecteurs AAVdb repose sur la taille du génome encapsidé.
La taille du génome d’un AAVr est normalement limitée à 4700b ; elle est donc réduite de moitié
dans le cas d’un AAVdb, soit environ 2300pb (McCarty et al. 2001 ; McCarty, 2008).

5 Modèles animaux pour les maladies neurodégénératives via les

AAV
5.1 Avantages des vecteurs AAVr pour la modélisation animale
Comme alternative à la transgénèse classique, la création de modèle in vivo par transfert de
gènes via un vecteur viral pourrait être une alternative plus rapide et moins coûteuse. Ce principe
repose sur l’infection de cellules cibles par un virus renfermant le gène associé à la pathologie.
Parmi les différents vecteurs viraux utilisés, les AAVr ont montré leur efficacité à produire des
modèles animaux pour des maladies neurodégénératives. En effet, ces vecteurs suscitent
beaucoup d’intérêt en raison de leur capacité à traverser la BHE (Duque et al., 2009) et de
transduire le SNC, ou les organes périphériques après une injection intraveineuse chez les souris
nouveau-nées et adultes, ainsi que chez les mammifères de grande taille (Duque et al., 2009 ;
Foust et al., 2009). Par ailleurs, l’injection de vecteurs AAVr directement dans la moelle épinière
(Azzouz et al., 2000 ; Lepore et al., 2007 ; Franz et al., 2009) ou dans le cerveau permet de
contourner certaines difficultés posées par la dissémination des MNs dans tout le système nerveux
et par la présence de la BHE. L’injection directe de vecteurs AAVr par voie
intracérébroventriculaire (ICV), notamment, permet d’augmenter la diffusion du vecteur par le
liquide céphalorachidien et, par conséquent, l’expression du transgène dans l’ensemble du SNC
(Passini et al., 2003 ; Fedorova et al., 2006 ; Storek et al., 2006 ; Broekman et al., 2007).

5.2 Modèles animaux pour les maladies neurodégénératives via les AAVr
5.2.1 Modèle murin pour la SLA-DFT liée à C9ORF72
Parmi les maladies neurodégénératives modélisées par le transfert de gène à l’aide d'AAVr,
la SLA et la DFT familiales causées pour la majorité des cas par la mutation du gène C9ORF72, ont
été induites chez la souris (Chew et al., 2015). L’injection d’AAV9, renfermant 66 répétitions de
l’hexanucléotide GGGGCC, dans le SNC de souris sauvages nouveau-nées a permis d’induire de
nombreuses caractéristiques histopathologiques de la SLA-DFT liée à C9ORF72 ; à savoir des foyers
d'ARN nucléaires, des inclusions protéiques (portant des répétitions de poly (Gly-Pro), de poly
(Gly-Ala) et de poly (Gly-Arg)), la protéinopathie TDP-43, une perte des cellules neuronales
corticales et des cellules de Purkinje, une astrogliose ainsi qu’une diminution du poids cérébral

73
observés 6 mois après l’injection d’AAVr. Les 66 répétitions de l’hexanucléotide ont également
entrainé des anomalies comportementales similaires aux symptômes cliniques observés chez les
patients atteints de SLA-DFT liée à C9ORF72, comme l'hyperactivité, l'anxiété, un comportement
asocial et des déficits moteurs.

Cette étude montre donc la capacité d’induire le développement de caractéristiques

histologiques et phénotypiques de la SLA-DFT associée à C9ORF72 par le transfert du gène muté
dans les cellules du SNC à l’aide de vecteurs AAVr. Ce modèle est donc utile pour l'étude de la
physiopathologie de cette forme de SLA-DFT familiale ainsi que pour le développement de
nouvelles approches thérapeutiques.

5.2.2 Modèle de rat surexprimant p62

P62 fait partie des protéines les plus fréquemment détectées dans les inclusions intra-
neuronales de maladies neurodégénératives telles que la SLA (Fecto et al., 2011) et la DFT (Fecto
et Siddique, 2012 ; Le Ber et al., 2013), ainsi que dans les enchevêtrements neurofibrillaires pour
la maladie d’Alzheimer et dans les corps de Lewi pour la maladie de Parkinson (Kuusisto et al.,
2001 ; Geetha et al., 2012). Afin de savoir si la surexpression de la forme sauvage de p62 peut
induire la formation d’inclusions neuropathologiques et à la dégénérescence des neurones,
Jackson et ses collaborateurs ont généré un modèle de rat surexprimant la forme sauvage de p62
(Jackson et al., 2017). Pour cela, des AAV9 portant la séquence humaine sauvage de p62 ont été
injectés dans le cerveau de rats âgés de 12 semaines. La surexpression de p62 a alors induit la
formation d’inclusions cytoplasmiques positives pour p62 (abondantes dans le périkaryon et dans
les dendrites des neurones) seulement 5 jours après le transfert de gènes. Les inclusions
pourraient être responsables de l’hypertrophie des neurones observée trois semaines après
l’injection d’AAV9. Des inclusions positives pour l’ubiquitine et l’ubiquiline 2 (impliquées comme
p62, dans les voies de dégradation protéique) ont également été mises en évidence dans les
neurones du cerveau des rats modèles. Trois mois après l’injection d’AAV9, les rats ont développé
un phénotype comportemental pathologique relatif à la perte neuronale observée par les analyses
post-mortem.

Etant donné que p62 est communément retrouvée dans les inclusions neuronales des
patients atteints de forme familiale ou sporadique de la SLA (Deng et al., 2011), cette étude a
permis de modéliser la plupart des cas de SLA en surexprimant la forme sauvage de p62 dans les
neurones transduits par l’AAV9.

74
5.2.3 Modèles murins pour la SLA-DFT liée à l’UBQLN2
Pour étudier la SLA-DFT associée aux mutations de l’ubiquiline 2, trois modèles murins non
transgéniques ont également été générés par injection ICV de vecteurs AAV8 portant les
séquences d’ADN mutées de l’ubiquiline 2 humaine (AAV8-Ub2P497S ; AAV8-Ub2P497H ; AAV8-
Ub2P506T) chez des souris sauvages nouveau-nées (Ceballos-Diaz et al., 2015). Selon le même
principe, un modèle surexprimant la forme sauvage de l’ubiquiline 2 a aussi été généré à l’aide de
vecteur AAV8-Ub2. L’expression de ces gènes a été placée sous le contrôle du promoteur de
l’ubiquiline 2 humaine. Une séquence WPRE (Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional
regulatory element) a été ajoutée, en aval de ces gènes, afin d’augmenter la quantité de protéines
produites.
Chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée ou sauvage, les analyses du niveau
d’expression de l’ubiquiline 2 ont révélé une augmentation des formes murine et humaines de
l’ubiquiline 2 soluble, 6 mois après l’injection de vecteurs AAVr comparées à 3 mois. L’ubiquiline
2 humaine insoluble a été détectée uniquement chez les souris surexprimant la protéine mutée.
Dès un mois après l’injection d’AAV8-Ub2 ou d’AAV8-Ub2P497S ou P497H ou P506T
, l’ubiquiline 2 est
fortement exprimée dans les neurones localisés dans plusieurs régions du cerveau (dont le cortex,
l’hippocampe et le cervelet) par rapport aux souris injectées avec l’AAV8-EGFP (souris contrôles).
L’injection d’AAV8-Ub2 chez les souris sauvages a conduit à la formation d’agrégats positifs pour
l’ubiquiline 2 dans le cytoplasme des neurones (au niveau du soma et des dendrites), alors que
l’injection d’AAV8-Ub2P497S ou P497H ou P506T
, a conduit à la formation d’inclusions positives pour
l’ubiquiline 2 dans le noyau et le cytoplasme des neurones ainsi que des agrégats d’ubiquiline 2
au niveau du neuropile. Dans le cervelet des souris surexprimant la protéine mutée, l’ubiquiline 2
est nettement présente dans les dendrites des cellules de Purkinje où l’architecture branchique
semblait réduite par rapport à celle observée chez les souris injectées avec l’AAV8-Ub2. Les
agrégats d’ubiquiline 2 ont été observés uniquement dans les cellules neuronales ; l’ubiquiline 2
humaine (sauvage ou mutée) s’exprime donc spécifiquement dans les neurones. De plus, les
protéines ubiquitine et p62 ont été détectées dans les agrégats d’ubiquiline 2 observés dans le
cortex et l’hippocampe des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine (sauvage ou mutée). La
protéine TDP-43 phosphorylée, quant à elle, a été mise en évidence dans les agrégats
cytoplasmiques uniquement dans le cerveau des souris injectées avec l’AAV8-Ub2P506T. Malgré la
présence d’un nombre important d’inclusions chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée,
aucune neurodégénérescence n’a été observée à 6 mois. Cette absence de perte neuronale
pourrait s’expliquer par le faible pourcentage de neurones transduits (estimé entre 30 et 40%
maximum dans les régions les plus proches des ventricules) par rapport au modèle de Wu et ses

75
collaborateurs (2015) qui présente une neurodégénérescence. Toutefois, des troubles
neurologiques (un phénotype de « clasping ») et de la coordination motrice ont été observés chez
les souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée (3-4 mois post-injection).

L’injection de vecteurs AAV2/8 par voie ICV chez des souris sauvages nouveau-nées a donc
permis de générer des modèles surexprimant la protéine mutée (P497H, P497S ou P506T) et de
démontrer que la surexpression de ces formes mutées induit la formation d’agrégats insolubles,
une protéinopathie dans les neurones ainsi que des troubles comportementaux. Ainsi, ces
résultats soutiennent l’idée que les mutations de l’ubiquiline 2 lui confèrent un gain de fonction
"toxique" perturbant la protéostasie dans les neurones, qui pourrait contribuer à la pathologie de
la SLA. Toutefois ce modèle ne récapitule pas l’ensemble des symptômes moteurs et cognitifs de
la maladie.

5.2.4 Modèle porcin pour l’amyotrophie spinale (SMA)

Cette méthode a été utilisée pour la génération de modèles animaux de grande taille pour
des études précliniques, dont un modèle porcin de SMA.
La SMA est causée par des niveaux réduits de la protéine SMN, essentielle pour la survie des
MNs, entrainant une perte de MNs dans la moelle épinière accompagnée d’une faiblesse
musculaire (Burghes et Beattie, 2009 ; Arnold et Burghes, 2013). L’équipe de Burghes a induit une
réduction postnatale de SMN dans les MNs entraînant un phénotype SMA dans un animal de
grande taille via l’administration d’AAV9 (Duque et al., 2015). Pour réaliser cette étude, de porcs
sains âgés de 5 jours ont été injectés par voie intrathécale avec des vecteurs AAV9 renfermant des
ARNsh dirigés contre le gène SMN (Survival Motor Neurons) dans le but de réduire son niveau
d’expression.
Trois à quatre semaines après l’injection des vecteurs AAV9-SMNsh, les porcelets ont
développé une faiblesse musculaire, en particulier dans les membres postérieurs. Les signes
cliniques initiaux se sont caractérisés par une démarche anormale et une position debout difficile
à respecter pendant des périodes prolongées. Les porcelets ont ensuite perdu la capacité de se
tenir debout indépendamment en développant également une faiblesse dans leurs pattes avant.
L'atrophie et la faiblesse musculaire des membres postérieurs et les fasciculations se sont
développées en même temps. D’autre part, les porcelets se sont comportés normalement sans
aucune altération apparente de leur vigilance, leur appétit, leur capacité d'avaler ou de leur
capacité respiratoire.
Des analyses histologiques sur des animaux sacrifiés au stade final ont montré que
l’injection intrathécale de l’AAV9-SMNsh induit divers changements histopathologiques dans les

76
MNs spinaux. Par exemples, de nombreux MNs ont présenté une perte axonale importante, un
gonflement du corps cellulaire et une dégénérescence de la chromatine nucléaire. Une diminution
significative du nombre de MNs chez ce modèle SMA, comparé aux animaux contrôles, a
également été observée. Avec cette méthode un modèle de SMA de grande taille a donc été
généré.

En conclusion, les vecteurs dérivés de l’AAV permettent de générer rapidement des modèles
de maladies neurodégénératives, aussi bien chez de petits animaux que chez des animaux de plus
grande taille comme le cochon, pouvant être utilisés pour tester des drogues dans le cadre d’études
pré-cliniques.

77
OBJECTIFS

78
 L'une des caractéristiques pathologiques de plusieurs formes de SLA est la présence
d'agrégats de protéines ubiquitinylés dans les tissus affectés, tels que la moelle épinière, le cortex
fronto-temporal, l'hippocampe et le cervelet (Al-Chalabi et al., 2012). Le mécanisme impliqué dans
la formation de ces agrégats reste cependant inconnu.

En 2011, Deng et ses collaborateurs ont identifié cinq mutations dans le gène UBQLN2 (Deng
et al., 2011), codant pour une protéine de type ubiquitine, l’ubiquiline 2, dans des formes
héréditaires de SLA et de SLA-DFT liées au chromosome X. Au sein de mon laboratoire de thèse,
nous nous sommes intéressés à cette protéine en raison de son implication dans la voie de
dégradation protéique via la protéasome. En effet, l’étude des mutations liées à la maladie
pourrait aider à mieux comprendre le mécanisme de production des agrégats protéiques dans la
pathogénèse de la SLA.

De façon intéressante, les agrégats positifs à l’ubiquiline 2 ont été observés dans la moelle
épinière de patients atteints de SLA ainsi que dans le cerveau de patients atteints de SLA-DFT, avec
ou sans mutations du gène UBQLN2. Cela suggère que les inclusions positives à l’ubiquiline 2
pourraient participer à un processus pathologique commun impliqué dans la SLA familiale mais
aussi dans les formes plus fréquentes de SLA sporadique.

Le rôle de l’ubiquiline 2 dans la pathogénèse de la SLA et de la SLA-DFT n'est pas encore

complétement déterminé. Nous avons donc décidé de développer un nouveau modèle animal
pour la SLA liée aux mutations de l'UBQLN2, afin de mieux comprendre les mécanismes
pathologiques de cette forme de SLA et, de façon plus générale, d’analyser son implication dans
la pathogénèse des différentes formes de SLA. La génération de ce modèle animal pourra être
utile pour étudier la formation d'agrégats protéiques in vivo mais également pour élaborer de
nouvelles stratégies thérapeutiques pour la SLA et la SLA-DFT.

Objectif 1 – Génération du modèle animal

Mon projet de thèse a consisté, dans un premier temps, à générer un nouveau modèle animal
de SLA liée à l'UBQLN2. De récentes recherches menées dans mon laboratoire d’accueil sur le
transfert de gène à l’aide d’AAV, ont montré la capacité de l’AAV10 à transduire efficacement les
cellules du SNC telles que les MNs (Tanguy et al., 2015). Grâce à ces caractéristiques, des thérapies
innovantes pour les maladies du MN, et en particulier pour la SLA liée aux mutations du gène SOD1,
ont été développées (Biferi et al, 2017).

79
 Comme alternative à la transgénèse classique, nous avons donc choisi de créer notre modèle à
l’aide de vecteurs AAV10 afin de surexprimer, chez la souris, une forme mutée de l’ubiquiline 2
humaine (l’ubiquiline 2P497H) responsable de la SLA-DFT. Pour cela, nous avons injecté ces vecteurs
viraux renfermant la séquence d’ADNc de l’ubiquiline 2P497H humaine dans les ventricules cérébraux
de souris sauvages nouveau-nées, afin de transduire un maximum de cellules du SNC. En parallèle,
nous avons également généré un modèle surexprimant la forme sauvage de l’ubiquiline 2 humaine,
ainsi qu’un modèle exprimant la Green Fluorescent Protein (GFP) comme contrôle.

Objectif 2 – Caractérisation du modèle animal

Dans le but de caractériser ce nouveau modèle animal d’un point de vue histologique,
biochimique, phénotypique et comportemental, nous avons effectué différentes analyses pour
vérifier :

1) si la surexpression de l'ubiquiline 2 mutée ou sauvage provoque la formation d’agrégats

protéiques dans les cellules du cerveau et de la moelle épinière, comme observée chez les patients
décrits par Deng et ses collaborateurs 2011 ;

2) si le modèle in vivo récapitule l’ensemble des signes typiques de la SLA, avec ou sans DFT, dans
le cerveau, la moelle épinière et le muscle squelettique ;

3) si les mutations de l'ubiquiline 2 induisent des altérations perturbant ses interactions avec
d’autres protéines.

Objectif 3 – Essai d’un traitement sur le modèle

Diverses approches thérapeutiques pour réduire la formation d’agrégats pathologiques

dans les maladies neurodégénératives ont été développées au cours du temps (Tsai et Boxer,
2016). Le bleu de méthylène (BM), par exemple, est une molécule approuvée par la FDA pour
plusieurs pathologies (Schirmer et al., 2011). Le BM a montré des résultats très encourageants
pour réduire à la fois le nombre d’agrégats pathologiques mais également améliorer le phénotype
dans certaines maladies neurodégénératives, comme dans les maladies d’Alzheimer, de
Huntington et dans la DFT (Wischik et al., 1996; Arai et al., 2010; Sontag et al., 2012).

Nous avons donc testé le BM sur les souris injectées avec l’AAV10 exprimant l’ubiquiline 2
mutée ou sauvage, afin de démontrer s’il était capable de réduire les inclusions positives pour
l’ubiquiline 2. Ce test a été conçu comme ultime étape de validation de notre modèle et comme
vérification d’un possible intérêt thérapeutique du BM dans les cas de SLA liée à l’ubiquiline 2.

80
Projet collaboratif – Analyse des JNM dans un modèle de SLA liées aux
mutations de SOD1

Au sein de l’équipe, j’ai également travaillé sur un projet de thérapie génique, dont l’objectif
a été de réduire la quantité de la SOD1 humaine mutée dans le modèle de souris SOD1G93A. Le
traitement a consisté à injecter par voies intraveineuse (IV) et intracérébroventriculaire (ICV), chez
les souris nouveau-nées ou âgées de 50 jours, des vecteurs AAV10 renfermant une séquence
d’oligonucléotides antisens capable de provoquer un saut d’exon dans l’ARN pré-messager de la
SOD1 humaine. Ce saut d’exon a ainsi conduit à la formation d’un ARN messager avec un codon
stop prématuré activant la voie de dégradation des ARNm porteurs de codon non-sens (the
Nonsense-Mediated mRNA Decay pathway, NMD). L’efficacité de ce traitement a ensuite été
vérifiée par diverses analyses physiopathologiques comme l’analyse des jonctions
neuromusculaires (JNM). Cette étude a été effectuée grâce à un marquage par
immunofluorescence des neurofilaments et des récepteurs à l’acétylcholine présents sur les
plaques motrices. Le but de mon travail dans ce projet a été de regarder si l’amélioration du
phénotype moteur observée chez les souris traitées pouvait s’expliquer par la préservation des
JNM (Biferi et al., 2017).

81
Matériels
et
méthodes

82
1 Plasmides et clonage
Les séquences d’ADNc codant pour les formes sauvage et mutée de l’ubiquiline 2 humaine
ont été synthétisées par GeneART. La séquence mutée de l’UBQLN2 humaine code pour une
protéine portant la mutation Pro497His, qui a récemment été identifiée chez des patients atteints
de SLAf liée à l’UBQLN2 (Deng et al., 2011). Après la digestion des plasmides GeneART par les
enzymes de restriction BamHI et EcoRV, les séquences sauvage ou mutée de l'UBQLN2 ont été
insérées dans le plasmide d’expression pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen) à l’aide de la ligase d'ADN
Fast-Link (Epicenter), donnant ainsi les vecteurs d’expression pcDNA-Ub2 et pcDNA-Ub2Mut
respectivement.

Pour le clonage des plasmides AAV, les séquences codantes de l'ubiquiline 2 humaine
(sauvage et mutée) ont été amplifiées par PCR (Master Mix Phusion High-Fidelity PCR, Thermo
Scientific) avec les amorces UbqFw et UbqRev (tableau 4) à partir des vecteurs d’expression
pcDNA-Ub2 et pcDNA-Ub2Mut. La séquence codante de la GFP a été amplifiée par PCR (Master
Mix PCR, Promega) avec les amorces GFPFw et GFPRev (tableau 4). Ces séquences amplifiées ont
ensuite été insérées dans le site de restriction Nhe I d'un plasmide AAV simple brin à l’aide de
l'ADN ligase Fast-Link (Epicenter), en aval du promoteur ubiquitaire PGK (PhosphoGlycérate
Kinase) et d’une séquence intronique. La séquence codante de l’élément WPRE a été amplifiée à
partir du plasmide pG3_221112_GFP_alb (provenant de la banque de plasmides de Généthon) par
PCR (Master Mix PCR, Promega) avec les amorces FwWPRE et RevWPRE (tableau 4). Cette
séquence a ensuite été insérée dans le site de restriction BglII des plasmides précédemment
produits, contenant la séquence codante de la GFP, de l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou de
l’ubiquiline 2 humaine mutée, en amont de l’ADNc. Ces plasmides ainsi produits ont été appelés
AAV-GFP, AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut.

Tableau 4 : Séquence des amorces.

Amorce Séquence Taille de l’amplicon (pb) Fournisseur
UbqFw 5’ATAATAGCTAGCATGGCTGAGAACGGCGAGTC 3’ Eurogentec
1995
UbqRev 5’ ATAATAGCTAGCTCAGCTAGGCTGGCTGCCCA 3’ Eurogentec
FwWPRE 5’ ATAATAAGATCTAATCAACCTCTGGATTACAA 3’ Eurogentec
592
RevWPRE 5’ ATAATAAGATCTCAGGCGGGGAGGCGGCCCAA 3’ Eurogentec
GFPFw 5’ ATAATAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 3’ Eurogentec
741
GFPRev 5’ ATAATAGCTAGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA 3’ Eurogentec

83
2 Culture cellulaire, transfection et analyses
2.1 Lignées cellulaires
Les lignées cellulaires NSC-34 (Neuroblastoma x Spinal Cord cells), Neuro2a
(Neuroblastoma) et HEK293T (Human Embryonic Kidney cells) ont été cultivées dans du milieu
DMEM à 4,5g/L de glucose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco) avec 10% de SVF (Sérum
de Veau Fœtal, Gibco) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco). Les cellules ont été maintenues
à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2.

2.2 Transfection
Les cellules NSC-34 et Neuro2a ont été transfectées avec différents plasmides : pCMV-GFP
(nommé « vecteur GFP »), les vecteurs d’expression pcDNA-Ub2 ou pcDNA-Ub2Mut, les plasmides
AAV10-GFP, AAV10-Ub2 ou AAV10-Ub2Mut, à l’aide d’un agent de transfection, la Lipofectamine
(Invitrogen ; 18324-012), selon les instructions du fournisseur. La quantité de plasmide transfectée
pour les analyses par immunofluorescence était de 0,75µg et pour les analyses par western blot
de 3µg.
Pour les différents marquages par immunofluorescence, les cellules ont été fixées 72h après
transfection avec une solution de paraformaldéhyde à 4% (PFA 4%) / PBS 1X (Phosphate-Buffered
Saline, Gibco). Concernant les expériences de western blot, les cellules ont été collectées 48h
après transfection.

2.3 Immunofluorescence sur cellules

Les cellules NSC-34 et Neuro2a ont été fixées pendant 10 minutes dans une solution de PFA
4% / PBS 1X, perméabilisées pendant 10 minutes dans du tritonX-100 à 0,1% / PBS 1X puis
bloquées pendant 30 minutes dans de la BSA 5% / PBS 1X. Les cellules ont été incubées avec un
anticorps primaire anti-ubiquiline 2 de souris (1/500; H00029978-M03, Abnova) puis après lavage,
avec un anticorps secondaire anti-souris Alexa 594 (1/200).

84
3 Production de vecteurs AAVr
Les vecteurs AAV10 exprimant l’ubiquiline 2 sauvage (AAV10-Ub2) ou l’ubiquiline 2 mutée
(AAV10-Ub2Mut) ou la GFP (AAV10-GFP) ont été produits par tri-transfection de cellules HEK293T
selon le protocole décrit par Dominguez et al. (2011). Les cellules ont été transfectées avec le
plasmide helper adénoviral pXX6, le plasmide codant pour la capside AAV10rh (portant les gènes
rep2 et cap-Rh10) et le plasmide AAV codant pour l’ubiquiline 2 humaine (sauvage ou mutée) ou
la GFP. Les vecteurs viraux recombinants ont été purifiés par ultracentrifugation sur un gradient
d’iodixanol (Hermens et al., 1999). La préparation virale a été dessalée et concentrée avec des
unités de filtration (Amicon Ultra-Ultra cell 100K, Millipore). Les vecteurs ont ensuite été aliquotés
et stockés à -80°C. Les titres des vecteurs ont été déterminés par RT-PCR (Real Time Polymerase
Chain Reaction) et exprimés en nombre de génomes viraux par ml (gv/ml) (tableau 5).

Tableau 5 : Titre des vecteurs AAVr.

Vecteur AAVr produit Titre en gv/ml

AAV10-GFP 7,6.1012 gv/ml

AAV10-Ub2 3.1011 gv/ml

AAV10-Ub2Mut 5.1012 gv/ml

4 Expérimentations animales
4.1 Lignée murine
Les souris de type sauvage FVB, provenant du fournisseur JANVIER LABS ont été maintenues
dans les conditions standard d’élevage (21 ± 1°C, 66 ± 5% d'humidité, cycles de 12 heures de
lumière / 12 heures dans l’obscurité, nourriture et eau ad libitum). Toutes les expériences in vivo
ont été réalisées selon les directives européennes pour le soin et l'utilisation des animaux
expérimentaux et approuvées par le comité d’éthique pour l’expérimentation animale Charles
Darwin N.5 (numéro d’agrément : 04830.02).
Nos travaux ont été réalisés sur autant de femelles que de mâles. Les souris ont été
observées tous les jours et pesées une fois par semaine.

4.2 Injections d’AAVr

Les souris sauvages nouveau-nées FVB ont été injectées en Intra Cérébro Ventriculaire (ICV)
avec l’AAV10-GFP, l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut. Une première injection dans le ventricule
cérébral droit a été effectué à J0 et une deuxième injection dans le ventricule gauche a été effectué
à J1 (soit 7.1010 génomes viraux au total par souris, volumes injectés: 2 x 10μl). Cette
85
administration en ICV a été réalisée à environ 1 mm latéralement de la suture sagittale et à 1 mm
antérieurement de la suture coronale par perforation du crâne à l'aide d'une seringue Neuros
Hamilton (32G, longueur de l’aiguille 30mm).

4.3 Injection du bleu de méthylène (BM)

Les souris injectées avec les vecteurs AAV10-Ub2 et AAV10-Ub2Mut ainsi que les souris
contrôles non injectées ont reçu des injections intrapéritonéales d’une solution de BM/NaCl à
0,4mg/ml (4mg/kg par injection) ou d’une solution de NaCl à 0,9% comme contrôle, 3 fois par
semaine durant 1 mois.

5 Histologie
5.1 Immunofluorescence sur tissus
Les souris ont été sacrifiées à l’âge d’un ou deux mois, par anesthésie en surdosage avec un
mélange de Ketamine (100mg/kg) / Xylazine (10mg/kg) (Rompun) et perfusées par voie
transcardiaque avec du PBS 1X puis avec une solution de PFA 4% / PBS 1X. Les muscles Tibialis
anterior et triceps ont été prélevés après la perfusion avec du PBS 1X, puis congelés dans de
l’isopentane refroidi dans la carboglace. Le cerveau et la moelle épinière ont été fixés par une
perfusion de PFA à 4% / PBS 1X puis ont été prélevés. Les cerveaux et les moelles épinières ont
ensuite été déshydratés pendant 24h dans une solution de sucrose à 15% et 30% respectivement
avant d’être congelés dans de l'isopentane refroidi avec de la carboglace (température entre -45
et -50°C). Les tissus congelés ont été coupés en série au cryostat (sections de 16μm pour le
cerveau, 14μm pour la moelle épinière et 8μm pour les muscles) et conservés à -80°C.

Les cryosections de tissus de souris ont été fixées dans une solution de PFA 4% / PBS 1X
pendant 20 minutes et perméabilisées avec du TritonX-100 0,1% / PBS 1X pendant 10 minutes.
Après plusieurs lavages dans du PBS 1X, les sections ont subi une procédure de démasquage
antigénique avec deux incubations de 5 minutes à 85°C dans un tampon citrate (0,01M, pH6). Les
coupes ont ensuite été bloquées avec une solution de BSA à 5% / sérum normal de chèvre ou
d’âne à 10% / TritonX-100 à 0,1% / PBS 1X et incubées avec les différents anticorps primaires: anti-
GFP de lapin (1/1500; ab6556, Abcam), anti-ubiquilines 2 de souris (1/500; H00029978-M03,
Abnova), anti-ubiquitine de lapin (1/200; Z0458, Dako), anti-p62 de souris (1/250; H00008878-
M01, Abnova), anti-ChAT de chèvre (1/50; AB144P, Millipore), anti-laminine de lapin (1/300 ;
Dako, Z0097) et anti-GFAP de lapin (1/250; Z0334, Dako). Après plusieurs lavages, les sections ont
été incubées avec l’anticorps secondaire approprié : anti-chèvre Alexa 488 (1/750 ; Invitrogen,

86
A11055), anti-souris Alexa 488 (1/300 ; Invitrogen, A21121) ou Alexa 594 (1/500 ; Life
Technologies, A11032), anti-lapin Alexa 488 (1/200 ; Invitrogen, A11034) ou Alexa 594 (1/200 ;
Invitrogen, A11012).

5.2 Coloration des fibres oxydatives

Les fibres oxydatives de Tibialis anterior (sections de 8µm d’épaisseur) ont été mises en
évidence par coloration des fibres NADH positives avec une solution de NADH (0,4 mg/ml) / NBT
(0,8 mg/ml) diluée dans du Tris / HCl (0,1M pH7,4) à 37°C pendant 30 minutes. Le pourcentage de
fibres oxydatives NADH(+) a été déterminé pour chaque groupe et les pourcentages ont ensuite
été comparés statistiquement à l’aide du test de Student (n=3 par condition).

5.3 Analyses histopathologiques au microscope

Les images ont été acquises en utilisant un microscope confocal (LEICA DM2500) ou un
microscope à fluorescence (ZEISS Axio observer.A1, Nikon Eclipse Ti, Leica DFC300 FX).

Le comptage du nombre de MNs ChAT positifs (diamètre >20µm) a été effectué sur environ
60 coupes de moelle épinière (régions cervicale, thoracique, lombaire) de souris sacrifiées à un
mois, au microscope à fluorescence Nikon Eclipse Ti. La quantité moyenne de MNs ChAT positifs
a été ensuite calculée pour chaque groupe et les analyses statistiques ont été faites à l’aide du
test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=5 par condition).

Pour l’étude de l’astrogliose, l’intensité de fluorescence (exprimée en unité arbitraire) du

marquage de la GFAP sur les coupes de moelle cervicale, a été réalisée avec le logiciel Image J. La
moyenne d’intensité de fluorescence a ensuite été calculée pour chaque groupe et les analyses
statistiques ont été faites à l’aide du test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=3 par condition).

La mesure de l’aire et du nombre de fibres musculaires a été réalisée sur des coupes de
Tibialis anterior marquées par immunofluorescence de la laminine à l’aide du logiciel Image J. La
moyenne a été calculée pour chaque groupe et rapportée à l’aire totale de chaque section calculée
en micromètre carré et les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du test ANOVA, post-test
de Bonferroni (n=6 par condition). Le comptage du nombre d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2
(marquée par immunofluorescence) dans les cornes ventrales a été réalisé sur 10 coupes de
moelle épinière par souris (souris traitées au NaCl ou au BM) (6 pour la partie cervicale et 4 pour
la partie lombaire) à l’aide du logiciel Image J. La moyenne a ensuite été calculée pour chaque

87
groupe et les analyses statistiques ont ensuite été faites à l’aide du test de Student (n=3 par
condition).

5.4 Stéréologie
Des cerveaux des différents groupes de souris préalablement fixés en PFA ont été inclus en
agarose et coupés au vibratome en sections transversales de 40 µm d’épaisseur. Le volume de
chaque section a ensuite été mesuré à l’aide du logiciel Image J (en mm3) et la somme des volumes
a été calculée pour obtenir le volume du cerveau entier. De la même façon, le volume de la région
corticale du cerveau a été mesuré. Les analyses statistiques ont ensuite été faites avec le test de
Student, à partir des moyennes calculées pour chaque groupe (n=3 par condition).

6 Analyses protéiques
6.1 Western blot
A partir de cellules NSC-34, de tissus frais humains (échantillons de cortex et de moelle
épinière) et de muscles de souris (directement congelés en azote liquide), les protéines ont été
extraites à l’aide d’un tampon de lyse (1% RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) / 0,1% SDS
(Sodium Dodecyl Sulfate) / un inhibiteur de protéases (Roche ; 11 836 153 001). Les tissus frais ont
été lysés par broyage mécanique dans le tampon de lyse avec les tubes Lysis Matrix (6910-500,
MP Biomedicals) dans le FastPrep (MP Biomedicals, 116913500). Les extractions protéiques
réalisées sur les coupes de cerveau et de moelle épinière de souris ont été effectuées avec le kit
« Qproteome FFPE tissue kit » (Qiagen ; 37623) en suivant les instructions du fournisseur. Les
extraits protéiques ont été dosés avec le kit BioRad (5000111, selon les instructions du
fournisseur), entre 10 et 100 microgrammes d’extraits protéiques ont été déposés sur un gel de
polyacrylamide à 10% Bis-Tris (BIO-RAD ; 3450111) ou à 12% Bis-Tris (BIO-RAD ; 3450117) selon la
taille des protéines étudiées. La migration du gel a été effectuée dans une solution tampon XT-
MOPS (BIO-RAD ; 1610788) à 150 mV pendant 3 heures. Les protéines ont été transférées sur une
membrane en PVDF (Millipore, IPVH00010) ou en nitrocellulose (GE Healthcare, 10600002), selon
la taille des protéines étudiées. Les différentes membranes ont été incubées avec les anticorps
primaires suivants: anti-ubiquiline 2 de souris (1/1 000; H00029978-M03, Abnova), anti-α-tubuline
de souris (1/10 000; T5168, Sigma), anti-α-actine de lapin (1/1 000; A2066, Sigma), anti-GFP de
lapin (1/10 000 pour les cellules et 1/1 500 pour les tissus ; 6556, Abcam), anti-ubiquitine de lapin
(1/200; Z0458, Dako), anti-α-spectrine de souris (pour les cellules NSC-34 ; 1/4 000 ;
Millipore, MAB1622) ou anti-α-fodrine de lapin (pour les tissus humains ; 1/1 000 ;

88
NovusBiologicals, NBP1-53093). Les différentes membranes ont ensuite été incubées avec les
anticorps secondaires conjugués à la HPR (Horseradish Peroxydase) suivants : anti-souris (1/10
000; NA931V, GE Healthcare), anti-lapin (1/10 000; GE Healthcare, NA934V). Afin de révéler le
signal, les membranes ont été incubées avec le kit ECL« Super signal West Dura Extended duration
substrate » (Thermo Scientific). Les intensités des bandes de protéines ont été mesurées avec le
logiciel Image J. Les intensités des bandes des protéines d’intérêt ont été normalisées à celles des
protéines de ménage, puis les moyennes d’intensités ont été calculées pour chaque groupe et
analysées statistiquement à l’aide du test de Student.

6.2 Co-immunoprécipitation
Les protéines ont tout d’abord été extraites à partir d’échantillons de moelle épinière avec
le kit « Qproteome FFPE tissue kit » (Qiagen ; 37623) en suivant les instructions du fournisseur.
L’immunoprécipitation de l’ubiquiline 2 a été réalisée selon le protocole du kit
« Immunoprecipitation kit dynabeads protein G » (Life technologies, 10007D) avec un anticorps
anti-ubiquilines 2 murine et humaine (1/1 000; H00029978-M03, Abnova) à partir d’un
milligramme de lysat protéique. L’efficacité et la spécificité de l’immunoprécipitation de
l’ubiquiline 2 a été vérifiée par western blot.

6.3 Spectrométrie de masse

Les complexes « bille + anticorps + protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 » ont
été chargés sur un gel de polyacrylamide 4-12% (NuPAGE; Invitrogen) dans une solution tampon
MOPS. Les protéines ont été colorées au bleu de Coomassie et les bandes ont été coupées, traitées
comme décrit par Shevchenko et al. (1996), puis digérées avec de la trypsine (Promega, V5111)
pour être analysées par spectrométrie de masse hybride trappe d’ions-Orbitrap LTQ Orbitrap XL™
ETD (Thermo Scientific).
L’identification des protéines analysées par spectrométrie de masse a été faite à l’aide de la
base de données « DAVID Bioinformatics Resources, National Institute of Allergy and Infectious
Diseases (NIAID) ».

89
7 Analyses phénotypiques et comportementales
7.1 Survie et poids
Les souris ont été suivies quotidiennement et pesées une fois par semaine.
Les analyses statistiques ont été réalisées sur les courbes de survie à l’aide du test du log-rank
Mantel-Cox) avec la moyenne de survie à l’aide du test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=13
souris NI ou AAV10-Ub2Mut, n=18 souris AAV10-GFP et n=17 souris AAV10-Ub2), ainsi que sur les
courbes de poids à l’aide du test ANOVA, post-test de Bonferroni (à 4, 8 et 12 semaines après
l’injection des souris avec les AAVr) (n=16 souris non injectées, n=18 souris injectées avec l’AAV10-
GFP et n=19 souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut).
7.2 Masse musculaire
Les Tibialis anterior (TA) prélevés sur les souris sacrifiées 2 mois après l’injection de
vecteurs AAV10 ont été pesés. La masse du TA a été rapportée au poids des animaux et les
analyses statistiques ont été réalisées avec le test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=3 souris non
injectées ou injectées avec l’AAV10-GFP et n=5 souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-
Ub2Mut).

7.3 Analyse des propriétés contractiles du muscle

La force maximale absolue, la force maximale spécifique et la capacité d'activation maximale
ont été évaluées en mesurant la contraction musculaire isométrique in situ des muscles Tibialis
anterior (TA) en réponse à une stimulation nerveuse (comme l'ont décrit Mouisel et al., 2006). Les
souris âgées de 2 mois ont été anesthésiées par administration intrapéritonéale d'une solution de
pentobarbital (60 mg/kg). Le genou et le pied ont été fixés avec des pinces et des épingles en acier
inoxydable, et le tendon distal du TA a été attaché à un transducteur isométrique (Aurora
Scientific) à l'aide d'une ligature en soie, sous tension constante. Les réponses de force à la
stimulation électrique des muscles et des nerfs (impulsions d'onde carrée de 0,1 ms, fréquence
d'impulsion de 75 à 150 Hz et train de stimulation de 500 ms) ont été successivement enregistrées.
La force isométrique maximale absolue (exprimée en Newton ou N) a été déterminée à une
longueur optimale (longueur à laquelle la tension maximale a été obtenue pendant la tétanie) et
ensuite normalisée à la masse musculaire pour estimer la force maximale spécifique (ou force
tétanique exprimée en N/g). La moyenne de la force tétanique a été déterminée pour chaque
groupe et les analyses statistiques ont été faites avec le test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=6
souris non injectées, n=9 souris injectées l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut).

90
7.4 Test d’agrippement
Après une période d'adaptation de 2 semaines, la force musculaire de la souris a été évaluée
par le test d’agrippement (Bioseb GS3, France) 1 mois après les injections d’AAVr. La force
d’agrippement a été mesurée en posant, puis en retirant, la souris de la grille métallique de
l’appareil, reliée à un capteur (enregistrant la force en gramme) (figure 23). Cinq enregistrements
ont été réalisés par souris. Le score le plus bas et le score le plus élevé n‘ont pas été pris en compte
dans la moyenne de force d’agrippement. La force moyenne d’agrippement a été normalisée au
poids de l’animal et les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du test ANOVA, post-test de
Bonferroni (n=11 souris non injectées, n=6 souris injectées avec l’AAV10-GFP, n=10 souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 et n=9 souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut).

Figure 23 : Test d’agrippement.

7.5 Analyse de la marche (footprint test)

Les changements dans la coordination et l’équilibre moteur ont été évalués grâce à l’analyse
des empreintes de pas. Les pattes avant et arrière des animaux âgées de 2 mois ont été trempées
dans de la peinture rouge et bleue, respectivement. Chaque souris a été placée sur un couloir (50
cm de long sur 10 cm de large) le long duquel elle a été contrainte d’avancer, laissant ses
empreintes sur un papier blanc (figure 24). La longueur des pas et de leur chevauchement ont été
mesurés sur trois pas par souris et les moyennes ont été calculées pour chaque groupe. Les
analyses statistiques de ces moyennes ont été faites avec le test de Student (n=8 souris non
injectées, n=6 souris injectées avec l’AAV10-GFP ou l’AAV10-Ub2 et n=4 souris injectées avec
l’AAV10-Ub2Mut).
longueur d’un pas
chevauchement Pattes avant

Pattes arrière

Figure 24: Principe de mesure de la longueur et du chevauchement des pas

à partir des empreintes de souris.

91
7.6 Test d’anxiété clair/obscur
Les comportements d'anxiété ont été évalués à l’aide du test d’anxiété clair/obscur (Bioseb,
LE810 ; figure 25) sur des souris âgées de 6 semaines. Ce dispositif se présente de la façon
suivante: un compartiment obscur qui communique avec un compartiment éclairé par une
ampoule de 800 lux.
Avant chaque expérience, les souris ont été isolées dans une cage pendant 30 minutes
comme période d’adaptation avant l’exécution du test, afin qu’elles s’habituent à l’éclairage. Elles
ont ensuite été placées dans le compartiment obscur. Sur une durée de 5 minutes, les paramètres
suivants ont été enregistrés pour chaque animal :
1) le temps total dans le compartiment éclairé (en secondes);
2) le temps total dans le compartiment obscur (en secondes);
3) le temps de latence (temps mis avant la première entrée dans le compartiment éclairé,
en secondes);
4) le nombre d'entrées dans le compartiment obscur ;
5) le nombre d'hésitations entre un compartiment et l’autre.
Pour chacun de ces paramètres, la moyenne a été calculée pour chaque groupe et les analyses
statistiques ont été effectuées à l’aide du test ANOVA, post-test de Bonferroni (n=11).

Figure 25 : Cage utilisée pour le test d’anxiété clair/obscur.

7.7 Phénotypes de “clasping” et “spinning” (test de suspension par la queue)

La recherche de signes neurologiques a été effectuée 3, 6 et 9 semaines après l’injection des
animaux avec les AAVr. Pour cela, les souris ont été suspendues par la queue pendant 30 secondes
environ afin de déterminer la présence de « clasping » (rétraction des pattes arrière). En fonction
du phénotype observé, un score a été attribué à chaque animal de la façon suivante :
0 : pas de « clasping »
1 : « clasping » rapide et transitoire seulement après stimulation;
2 : « clasping » persistant des membres postérieurs après stimulation;
3 : « clasping » spontané des membres postérieurs sans stimulation;

92
 4 : « clasping » spontané des membres postérieurs et antérieurs;
5 : « clasping » persistant des membres postérieurs ou antérieurs pendant plus de 5
secondes après que les souris aient été replacées dans leur cage (Liu et al., 2011).

Pendant l’exécution du test de suspension par la queue un phénomène de « spinning » a

été observé; c’est-à-dire une rotation très rapide des souris sur elles-mêmes. Le pourcentage de
souris présentant un « clasping » ou un « spinning » a été déterminé pour chaque groupe et les
analyses statistiques ont été faites avec le test ANOVA, post-test de Bonferroni et le test de
Student respectivement (n=22 souris non injectées ou injectées avec l’AAV10-GFP, n=19 souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut).

8 Tissus humains
Des échantillons de cortex et de moelle épinière (conservés à -80°C), prélevés sur des
individus sains (témoins) et sur des patients atteints de SLA sporadiques (tableau 6), ont été
fournis par la plateforme de ressources biologiques GIE Neuro-CEB (dirigée par le Pr Danielle
SEILHEAN, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière).

Tableau 6 : Caractéristiques des individus contrôles (témoin) et des patients atteints de SLA sporadiques.
Nom N° Sexe Age Diagnostic Tissus
SLA1 A1102033 M 78 SLA sporadique Cortex F2 et moelle cervicale
SLA2 A1100494 F 83 SLA sporadique Cortex F2 et moelle cervicale
SLA3 A100928 M 41 SLA sporadique Cortex F2 et moelle cervicale
CTL1 A1400019 F 53 Témoin Cortex F2 et moelle cervicale
CTL2 A0800402 F 93 Témoin Cortex F2 et moelle cervicale
CTL3 A1101620 M 72 Témoin Cortex F2 et moelle cervicale

9 Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Les courbes
de survie ont été analysées avec le test du log-rank Mantel-Cox; la significativité statistique entre
les différentes conditions a été analysée avec le test de Student ou ANOVA (post-test de
Bonferroni) selon les expériences.

93
RESULTATS

94
1 Génération d’un modèle murin de la SLA-UBQLN2 par
surexpression de l’ubiquiline 2 humaine mutée
1.1 L’expression de l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée in vitro conduit à la
formation d’agrégats
Dans un premier temps, nous avons vérifié l’expression des séquences d’ADNc codant la
forme sauvage et la forme mutée (mutation P497H appelée ubiquiline 2P497H) de l’ubiquiline 2
humaine. La SLA se caractérise principalement par la mort des MNs et de la présence d’ubiquiline
2 dans les inclusions protéiques observées dans les MNs et le cerveau (Deng et al., 2011). Par
conséquent, nous avons vérifié l’expression des formes sauvage et mutée de l’ubiquiline 2
humaine dans une lignée de MNs murins, les NSC-34 (Neuroblastoma x spinal cord cells) ainsi que
dans une lignée de neurones murins, les Neuro2a (Neuroblastoma). Pour cela, nous avons inséré
la séquence d’ADNc sauvage ou mutée de l’ubiquiline 2 humaine dans un plasmide d’expression
(pcDNA™3.1/myc-His). Nous avons transfecté les cellules NSC-34 et Neuro2a avec les plasmides
renfermant la séquence sauvage ou mutée de l’ubiquiline 2 humaine (plasmides pcDNA-Ub2 et
pcDNA-Ub2Mut, respectivement). 72h après la transfection, nous avons vérifié l’expression de la
protéine par immunofluorescence.

Nous avons observé au microscope confocal (figure 26), un marquage rouge cytoplasmique
très intense avec des agrégats localisés dans le cytoplasme et dans le noyau des cellules
transfectées, en revanche, nous avons détecté qu’un léger marquage rouge cytoplasmique des
cellules non transfectées exprimant uniquement l’ubiquiline 2 endogène. Toutefois, aucune
différence du nombre, de la taille et de la localisation des agrégats n’a été constatée entre les
cellules transfectées avec l’ubiquiline 2 sauvage et l’ubiquiline 2 mutée.

95
 A pcDNA-Ub2 pcDNA-Ub2Mut
ubiquiline 2 / DAPI

NSC-34

Neuro2a

Figure 26 : Expression et localisation de l’ubiquiline 2 dans les cellules NSC-34 et Neuro2a

transfectées avec les plasmides pcDNA-Ub2 et pcDNA-Ub2Mut.
Analyses par immunofluorescence avec un anticorps primaire reconnaissant les formes humaine et murine de
l’ubiquiline 2, 72h après la transfection des cellules NSC-34 (A) et Neuro2a (B). Marquage de l’ubiquiline 2 en
rouge et marquage des noyaux en bleu (au DAPI). Les cellules transfectées avec le plasmide pcDNA-Ub2 ou le
plasmide pcDNA-Ub2Mut sont visibles par la formation d’inclusions protéiques positives pour l’ubiquiline 2 qui
sont principalement localisées dans le cytoplasme (indiquées par les flèches blanches) et dans le noyau
(indiquées par les flèches jaunes). Photos représentatives de trois expériences de transfection indépendantes
prises au microscope confocal (barre d’échelle: 100 µm).

L’expression de l’ubiquiline 2 humaine a également été vérifiée par western blot, 48h après
la transfection des cellules NSC-34 avec le plasmide pcDNA-Ub2 ou le plasmide pcDNA-Ub2Mut
(figure 27). Les cellules NSC-34 transfectées avec un plasmide renfermant la séquence codante de
la Green Fluorescent Protein (GFP), ont servi de contrôle négatif. Ces cellules transfectées
uniquement avec le plasmide GFP ont exprimé la GFP (27 kDa) ainsi que l’ubiquiline 2 murine (deux
bandes autour de 70kDa) marquée par un anticorps reconnaissant l’ubiquiline 2 murine et
l’ubiquiline 2 humaine. En revanche, les cellules transfectées avec le plasmide pcDNA-Ub2 ou le
plasmide pcDNA-Ub2Mut ont exprimé, en plus de l’ubiquiline 2 murine, la forme humaine de la
protéine, représentée par une seule bande d’environ 70kDa.

96
 Figure 27: Expression de l’ubiquiline 2 humaine 48h après la transfection des cellules NSC-34
avec les plasmides pcDNA-Ub2 et pcDNA-Ub2Mut.
Analyses par western blot montrant l’expression de l’ubiquiline 2 murine et humaine dans les cellules NSC-34
transfectées avec les plasmides GFP, pcDNA-Ub2 ou pcDNA-Ub2Mut. Les NSC-34 transfectées avec le plasmide
GFP expriment uniquement la protéine endogène (ubiquiline 2 murine), représentée par deux bandes autour de
70kDa, ainsi que la GFP (27kDa). L’ubiquiline 2 humaine, représentée par la bande située entre les deux bandes
correspondant à l’ubiquiline 2 murine, est exprimée uniquement dans les cellules transfectées avec les plasmides
pcDNA-Ub2 ou pcDNA-Ub2Mut. L’α-actine a été utilisée comme gène de ménage. kDa: kiloDalton. Les résultats
montrés ici sont représentatifs de deux expériences de transfection indépendantes.

Ces premiers résultats ont montré que les plasmides pcDNA-Ub2 et pcDNA-Ub2Mut
permettent l’expression de l’ubiquiline 2 humaine (sauvage ou mutée) dans les neurones et les
MNs de souris. De plus, nous avons montré que l’expression de ces protéines dans des cellules
NSC-34 et Neuro2a conduit à la formation d’agrégats nucléaires et cytoplasmiques. Nous avons
donc décidé d’exprimer les séquences humaines d’ubiquiline 2 sauvage ou mutée in vivo via les
vecteurs AAV.

1.2 La transfection des plasmides AAV-Ub2 ou AAV-Ub2Mut dans les cellules

NSC-34 conduit à l’expression de l’ubiquiline 2 humaine
Afin de produire des vecteurs AAV, nous avons construit des plasmides portant soit la
séquence d’ADNc humaine de l’ubiquiline 2 sauvage ou de l’ubiquiline 2 mutée (nommés
respectivement AAV-Ub2 ou AAV-Ub2Mut), soit la séquence d’ADN codant pour la GFP (plasmide
contrôle) entre les ITRs du génome viral (figure 28). Pour transduire efficacement les cellules du
SNC, les vecteurs AAVdb sont les plus utilisés car ils permettent une expression plus rapide du
transgène (suppression de l’étape de synthèse du deuxième brin de l’ADN) et une meilleure
efficacité de transduction (McCarty et al., 2003 ; Duqué et al., 2009 ; Foust et al., 2009). Toutefois,
la taille du génome des AAVdb est de 2,3 kb, ce qui restreint la capacité de clonage aux séquences
d’ADN de petite taille (Le Bec et Douar, 2006). La taille de l’ADNc codant pour l’ubiquiline 2
humaine faisant 1,8 kb, nous avons donc été contraints d’utiliser un AAVsb. Pour diriger
l’expression de l’ADNc de l’ubiquiline 2 humaine (sauvage ou mutée) ou la séquence d’ADN codant
pour la GFP, nous avons utilisé le promoteur ubiquitaire de la PhosphoGlycérate Kinase (PGK).
Pour augmenter la quantité de protéines produites, nous avons également ajouté un intron
97
chimérique de la β-globine en amont des gènes et une séquence WPRE (Woodchuck hepatitis virus
Post-transcriptional Regulatory Element) en aval des gènes (Loeb et al., 1999).

Figure 28: Représentation schématisée des plasmides AAV-GFP, AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut.

L’ADNc de l’ubiquiline 2 humaine sauvage (A) ou mutée (B) a été inséré sous le contrôle du promoteur ubiquitaire
PGK et cloné entre les ITR du génome AAVsb. Un plasmide AAVsb codant pour la GFP a également été produit
comme contrôle (C). ITR: Inverted Terminal Repeats; PGK: PhosphoGlycerate Kinase; intron: intron chimérique
de la β-globine de poulet; WPRE: Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element.

L’expression de l’ubiquiline 2 humaine a ensuite été vérifiée par western blot, 48h après la
transfection des cellules NSC-34 avec les plasmides AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut (figure 29).

Figure 29: Expression de l’ubiquiline 2 humaine suite à la transfection des cellules NSC-34
avec les plasmides AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut.
Analyse par western blot de l’expression des ubiquilines 2 murine et humaine, 48 h après la transfection des
cellules NSC-34 avec les plasmides AAV-Ub2 et AAV-Ub2Mut. La bande correspondant à la forme humaine de
l’ubiquiline 2 (d’environ 70kDa), en plus de celles correspondant à la protéine endogène, a été observée dans les
deux conditions de transfection. L’α-actine a été utilisée comme gène de ménage. kDa: kiloDalton.

98
1.3 Production et injection des vecteurs AAV10 dans les ventricules cérébraux de
souris nouveau-nées sauvages pour la génération du modèle animal
Pour générer notre modèle animal, nous avons utilisé des vecteurs AAV de sérotype 10 qui
présentent une importante capacité de transduction des cellules du SNC (étude réalisée au sein
de notre équipe), en particuliers dans l’hippocampe, le cortex et la moelle épinière après une
simple injection intraveineuse (IV) chez les souris nouveau-nées (Tanguy et al., 2015). Nous avons
ainsi produit des vecteurs AAV10 recombinants qui renferment la séquence d’ADNc humain de
l’ubiquiline 2P497H (AAV10-Ub2Mut) ou la séquence d’ADNc humain de l’ubiquiline 2 sauvage
(AAV10-Ub2) dans des cellules HEK293T. D’autres vecteurs portant la séquence codante de la GFP
(AAV10-GFP) ont également été produits.

Ces vecteurs ont ensuite été administrés par des injections Intra Cérébro Ventriculaires (ICV)
dans des souris nouveau-nées sauvages (FVB) à J0 et J1 (5.1013 vg/kg au total par souris). Nous
avons choisi d’injecter les vecteurs viraux par voie ICV afin d’avoir une meilleure efficacité de
transduction des cellules du SNC et des organes périphériques par rapport à l’injection en
intraveineuse (Meyer et al., 2015 ; Armbruster et al., 2016) (figure 30).

Figure 30: Représentation schématisée de l’injection en ICV des AAV10

chez les souris sauvages nouveau-nées.
(A) Pour générer le modèle animal, les souris ont reçu une première injection d'AAV10 dans le ventricule cérébral
droit à la naissance (jour 0) puis une deuxième injection dans le ventricule gauche le lendemain (jour 1). La dose
10
totale de vecteurs injectés est de 7.10 génomes viraux par souris. (B) Photographie d’un souriceau injecté avec
du bleu trypan dans les ventricules latéraux du cerveau. Dès quelques secondes après l’injection, le bleu diffuse
dans le cerveau et la moelle épinière. ICV: Intra Cérébro Ventriculaire.

99
1.4 L’injection de l’AAV10-GFP par voie ICV permet l’expression de la GFP dans le
SNC et le muscle squelettique des souris sauvages
Un mois après l’injection des souris avec l’AAV10-GFP, nous avons vérifié l’expression de la
GFP qui a été observée dans les cellules localisées dans différentes régions du cerveau (cortex,
hippocampe et cervelet), dans la moelle épinière et le triceps (figure 31). Ces observations
montrent donc que l’injection ICV de ce vecteur AAV10 simple brin permet l’expression du
transgène dans les cellules du SNC et du muscle squelettique.

100
 A GFP

Cortex Hippocampe Cervelet

B GFP C NI AAV10-GFP

GFP (27 kDa)

α-tubuline
(50 kDa)

Figure 31: Expression de la GFP dans le cerveau, la moelle épinière et le muscle squelettique
chez les souris injectées avec l’AAV10-GFP par voie ICV.
(A) Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-GFP, sur des coupes de cerveau un mois
après l’injection des souris sauvages FVB (n=6) avec l’AAV10-GFP par voie ICV. Les cellules localisées notamment
dans le cortex, dans l’hippocampe et dans le cervelet expriment la GFP. Ces régions sont mises en évidence par
un cadre blanc en pointillé sur les images de sections de cerveau (photographies du haut) avec leur
agrandissement (photographies du bas). (B) Analyses d’immunofluorescence de la GFP sur des coupes de moelle
épinière (région lombaire) provenant de la même souris qu’en A. Le signal positif pour la GFP est visible dans la
substance blanche et la substance grise. Les cellules situées dans les cornes ventrales de la moelle épinière, où
sont localisés les MNs, expriment également la GFP. (C) Analyses par western blot réalisées sur des extraits
protéiques de triceps prélevés un mois après l’injection ICV des souris sauvages nouveau-nées avec l’AAV10-GFP,
comparées à des souris non injectées (n=3 par condition). Ces analyses montrent que la GFP s’exprime aussi dans
les muscles squelettiques. Images représentatives, prises au microscope à fluorescence (barres d’échelle : 1 mm
pour le cerveau et 200 µm pour la moelle épinière).

101
2 Caractérisation physiopathologique du modèle murin de la SLA-
UBQLN2
Afin de générer le modèle animal et d’effectuer sa caractérisation physiopathologique, nous
avons injecté trois groupes d’animaux : un groupe avec l’AAV10-Ub2Mut, un groupe avec l’AAV10-
Ub2 et un groupe avec l’AAV10-GFP (figure 32). Nous avons aussi utilisé un quatrième groupe de
souris non injectées comme souris contrôles.

Figure 32: Représentation schématisée du protocole mis en place pour la caractérisation du modèle animal.
Pour la caractérisation du modèle, les souris sauvages ont reçu une injection ICV de vecteurs viraux (AAV10-GFP,
AAV10-Ub2 ou AAV10-Ub2Mut) à la naissance (J0) et à un jour (J1), et ont été comparées à des souris non
injectées. Un groupe de souris a été suivi pour déterminer la survie et l’évolution du poids. Un et deux mois après
l’injection, des souris ont été sacrifiées pour effectuer les analyses biochimiques et histologiques sur différents
tissus (cerveau, moelle épinière et muscle squelettique). D’autres souris ont été soumises à des analyses
phénotypiques pour vérifier la présence d’altérations de la force musculaire et de la motricité, de signes d’anxiété
et de troubles neurologiques. L’étude de la survie a été arrêtée 200 jours après l’injection. Le nombre de souris
utilisées pour chaque analyse est indiqué dans le schéma.

Au niveau histologique, la SLA accompagnée de démences se caractérise par une atrophie

du cerveau, une perte de MNs et une astrogliose dans la moelle épinière ainsi qu’une atrophie
musculaire (Deng et al., 2011 ; Gordon et al., 2013). Nous avons donc effectué des analyses
histologiques sur des coupes de cerveau, de moelle épinière et de muscle de souris sacrifiées un
et deux mois après l’injection des vecteurs AAV10, dans le but de vérifier si notre modèle
présentait également ces caractéristiques (figure 32).

Au niveau phénotypique, elle se caractérise par une faiblesse musculaire et des troubles
moteurs et comportementaux (anxiété et démence, notamment) (Deng et al., 2011 ; Gordon et
al., 2013). Nous avons donc réalisé des analyses phénotypiques et comportementales, un et deux
mois après l’injection des vecteurs AAV10, afin de vérifier si notre modèle présentait également
102
ces phénotypes pathologiques (figure 32). De plus, un groupe de souris a été suivi jusqu’à 200
jours après l’injection d’AAV10, pour réaliser les analyses de survie et de poids (figure 32).

2.1 L’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit l’expression

de l’ubiquiline 2 dans le cerveau et la moelle épinière des souris sauvages
Tout d’abord, nous avons vérifié l’expression de l’ubiquiline 2 humaine par western blot
dans le cerveau et la moelle épinière des souris injectées avec les vecteurs AAV10-GFP, AAV10-
Ub2 et AAV10-Ub2Mut, un et deux mois après l’injection (figure 33). Nous avons seulement
observé l’expression de l’ubiquiline 2 endogène murine chez les souris non injectées et les souris
injectées avec l’AAV10-GFP. Les animaux injectés avec les vecteurs AAV10-Ub2 ou AAV10-Ub2Mut
expriment la forme humaine de l’ubiquiline 2 qui est représentée par une bande d’environ 70 kDa,
comme observé pour les cellules NSC-34 transfectées avec le plasmide AAV10-Ub2 (contrôle
positif).

Figure 33: Expression de l’ubiquiline 2 humaine dans la moelle épinière et le cerveau

des souris injectées avec les vecteurs AAV10-Ub2 ou AAV10-Ub2Mut.
Analyses par western blot réalisées sur des extraits protéiques de cerveau (A) et de moelle épinière (B) de souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut, comparées aux souris non injectées. Cette analyse a été
effectuée sur 12 souris par condition, un mois (n=3 par condition) et deux mois (n=3 par condition) après
l’injection. Les résultats montrés sur cette figure sont représentatifs et ont été obtenus à partir d’extraits
protéiques de souris sacrifiées deux mois après l’injection. Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et l’AAV10-
Ub2Mut expriment l’ubiquiline 2 humaine, contrairement aux souris non injectées (NI) qui expriment
uniquement la forme murine. L’analyse sur les extraits protéiques provenant des cellules NSC-34 transfectées
avec le plasmide AAV-Ub2 est montrée comme contrôle positif. L’α-actine a été utilisée comme gène de ménage.
Un groupe de 6 souris a été injecté avec l’AAV10-GFP et analysé un mois (n=3) et deux mois après l’injection
(n=3). Comme pour les souris non injectées, ces souris expriment exclusivement la forme murine de l’ubiquiline
2 (résultats non montrés). kDa: kiloDalton.

103
 Bien que la même quantité de vecteurs ait été injectée, l’analyse par western blot a montré
des niveaux d’expression différents entre l’ubiquiline 2 humaine mutée et l’ubiquiline 2 humaine
sauvage. Nous avons donc quantifié le niveau d’expression de deux protéines suite à l’injection
des AAV10. Cette analyse a montré que la quantité d’ubiquiline 2 humaine mutée est supérieure
de 28,2% dans le cerveau et de 17,4% dans la moelle épinière des souris injectées avec l’AAV10-
Ub2Mut par rapport à la quantité d’ubiquiline 2 humaine sauvage chez les souris injectées avec
l’AAV10-Ub2. Cette différence suggère une accumulation de la protéine mutée, pouvant
s’expliquer par une réplication de la protéine de type prion.

2.2 L’injection d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV réduit la durée de vie et le poids des
souris sauvages
Nous avons également réalisé des analyses phénotypiques comme l’étude de la survie et le
suivi de prise de poids (figure 34). Les souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée ont survécu moins
longtemps (moyenne de survie en jours : 76,38±8,51j) que les souris non injectées (184,5±10,48j;
P<0,0001), que les souris injectées avec l’AAV10-GFP (180,2±13,61j; P<0,0001) et que les souris
surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage (154,7±17,70j; P<0,01) (figure 34 : A et B). Nous n’avons pas
observé de différence significative entre les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et les souris
contrôles (non injectées ou injectées avec l’AAV10-GFP). Aucune différence significative n’a été
observée entre les souris injectées avec l’AAV10-GFP et les souris non injectées. La médiane de
survie des souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée a été raccourcie à 80 jours (figure 34 : B).

De plus, leur poids a été divisé par deux (poids moyens en grammes : 7,63±0,42g) comparé
aux souris non injectées (16,27±0,61g; P<0,0001) et aux souris injectées avec l’AAV10-GFP
(17,18±0,42g; P<0,0001) à l’âge d’un mois (figure 34 : C). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2
ont également présenté un poids inférieur (10,08±0,45g), d’environ un tiers, comparé à celui des
souris non injectées (16,26±0,61g; P<0,0001) et des souris injectées avec l’AAV10-GFP
(17,18±0,42g; P<0,0001). A l’âge de deux mois, les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut ont
montré un poids significativement inférieur (15,00±0,92g) à celui des souris non injectées
(23,78±0,53g; P<0,0001), des souris injectées avec l’AAV10-GFP (22,08±1,04g; P<0,0001) et de
celles injectées avec l’AAV10-Ub2 (20,33±0,63g; P<0,0001). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2
ont montré une diminution de leur poids par rapport à celui des souris non injectées uniquement
(23,78±0,53g; P<0,05). Nous n’avons pas observé de différence entre le poids des souris non
injectées et celui des souris injectées avec l’AAV10-GFP.

104
 A B ****

Survie moyenne (jours)

****

Survie (%)
Non Injectées (n=13) **

****
50%

****
AAV10-GFP (n=18)

**
AAV10-Ub2 (n=17)
AAV10-Ub2Mut (n=13)

80

Jours NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10

C
+
++++
Poids (g) ####
Non Injectées (n=16)
AAV10-GFP (n=18)
AAV10-Ub2 (n=19)
AAV10-Ub2Mut (n=19)
****
§§§§ *
**** ¶¶¶¶
§§§§

Semaines

Figure 34: Réduction de la survie et du poids chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée.
Analyses du pourcentage de survie (A) et de la moyenne de survie (B) jusqu’à 200 jours après l’injection avec
l’AAV10-GFP (vert, n=18), l’AAV10-Ub2 (violet, n=17) ou l’AAV10-Ub2Mut (bleu, n=13) qui sont comparées aux
souris non injectées (rouge, n=13). (A) L’analyse des courbes de survie à l’aide du test du log-rank Mantel-Cox
montre une réduction significative de la survie des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris
non injectées (**** P<0,0001) et les souris injectées avec l’AAV10-GFP (**** P<0,0001) ou l’AAV10-Ub2 (**
P<0,01). Aucune différence significative n’est observée entre les souris injectées avec l’AAV10-Ub2, l’AAV10-GFP
et les souris non injectées. (B) La moyenne de survie des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut est
significativement réduite par rapport aux animaux non injectées (**** P<0,0001) et injectées avec l’AAV10-GFP
(**** P<0,0001) ou l’AAV10-Ub2 (** P<0,01). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par
ANOVA, post-test de Bonferroni. (C) Analyses du poids jusqu’à 200 jours après l’injection des souris avec l’AAV10-
GFP (vert, n=18), l’AAV10-Ub2 (violet, n=19) ou l’AAV10-Ub2Mut (bleu, n=19) comparées aux souris non injectées
(rouge, n=16). Le poids des souris injectées avec l’AAV10-Ub2 est significativement réduit par rapport à celui des
souris non injectées à quatre et huit semaines (++++ P<0,0001 et + P<0,05, respectivement) et des souris
injectées avec l’AAV10-GFP à quatre semaines (#### P<0,0001). Le poids des souris injectées avec l’AAV10-
Ub2Mut est également réduit par rapport à celui des souris non injectées à quatre et huit semaines (****
P<0,0001, dans les deux cas) et à douze semaines (* P<0,05), ainsi que par rapport aux souris injectées avec
l’AAV10-GFP à quatre et huit semaines (§§§§ P<0,0001, dans les deux cas). Il est également significativement
réduit chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut par rapport à celles injectées avec l’AAV10-Ub2 à huit
semaines (¶¶¶¶ P<0,0001). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par ANOVA, post-test de
Bonferroni à quatre, huit et douze semaines.

La surexpression de l’ubiquiline 2 mutée induit donc la mort prématurée des souris sauvages
et impacte leur croissance, alors que la surexpression de la forme sauvage de la protéine ne réduit
pas leur durée de vie, mais a néanmoins un effet sur leur poids un mois après l’injection.

En absence de signe pathologique évident et de perte de poids, nous avons décidé

d’interrompre le suivi des souris contrôles et des souris surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage sept
mois après l’injection ; ceci bien après avoir observé la mort de toutes les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 mutée.

105
2.3 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit la formation
d’agrégats dans le cerveau et la moelle épinière des souris sauvages
Nous avons ensuite analysé par immunofluorescence, l’expression de l’ubiquiline 2 dans le
cerveau et la moelle épinière des souris non injectées, injectées avec l’AAV10-GFP, l’AAV10-Ub2
ou l’AAV10-Ub2Mut, un et deux mois après l’injection. Pour les souris non injectées ou injectées
avec l’AAV10-GFP, nous avons détecté un faible marquage dans le cytoplasme des cellules du
cortex moteur et de l’hippocampe (gyrus denté et CA3) dû à l’expression de la protéine endogène
(figure 35). Nous avons observé la présence de petits agrégats cytoplasmiques et parfois
nucléaires chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2. Après l’injection d’AAV10-Ub2Mut, nous
avons observé la présence de nombreux agrégats de grande taille (inclusions) positifs pour
l’ubiquiline 2. Dans le cervelet des souris injectées avec l’AAV10-Ub2, nous avons détecté une
forte expression diffuse dans le cytoplasme des cellules de Purkinje ainsi que des agrégats localisés
dans la couche moléculaire (figure 36 : A). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut ont présenté
des inclusions dans la couche moléculaire et plus spécifiquement une forte expression de
l’ubiquiline 2 dans les dendrites des cellules de Purkinje (figure 36 : B).

106
 Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
ubiquiline 2 / DAPI
A

Cortex
moteur

ubiquiline 2 / DAPI
B

Gyrus
denté

ubiquiline 2 / DAPI
C

CA3

Figure 35: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans le cortex moteur et l’hippocampe
des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps primaire reconnaissant la forme humaine et murine
de l’ubiquiline 2, sur des coupes de cerveau: cortex moteur (A), gyrus denté de l’hippocampe (B) et la région CA3
de l’hippocampe (C) de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut,
comparées aux souris non injectées (n=6 par condition). Les souris non injectées expriment l’ubiquiline 2
endogène, visible par un léger marquage rouge cytoplasmique. Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 présentent
l’expression de l’ubiquiline 2 humaine (marquage rouge intense) dans les cellules neuronales du cortex moteur
(A) et de l’hippocampe (B et C) avec de petits agrégats cytoplasmiques et parfois nucléaires (indiqués par les
flèches blanches). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut présentent de nombreux agrégats et inclusions
(indiquées par les flèches jaunes) localisés dans le cortex moteur (A) et l’hippocampe (B et C). Images
représentatives, prises au microscope confocal (barres d’échelle : 25µm). Chaque photographie du bas est un
agrandissement de la région délimitée par un carré blanc en pointillé sur l’image correspondante du haut.

107
 AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
ubiquiline 2 / DAPI
A

Cervelet
B

Figure 36: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans le cervelet

des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps primaire reconnaissant les formes humaine et
murine de l’ubiquiline 2 sur des coupes de cervelet (A et B), de souris sacrifiées un mois après l’injection d’AAV10-
Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut (n=6). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 présentent une surexpression de
l’ubiquiline 2 (marquage rouge intense) dans le cytoplasme des cellules de Purkinje ainsi que des agrégats et
inclusions (indiqués par les flèches blanches et jaunes, respectivement) dans la couche moléculaire (A et B).
Suivant la région du cervelet observée, les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut présentent soit de nombreux
agrégats et inclusions positifs pour l’ubiquiline 2 dans la couche moléculaire (A) soit une très forte expression de
l’ubiquiline 2 dans les dendrites des cellules de Purkinje (indiquée par la flèche verte) et des agrégats et inclusions
dans la couche moléculaire (B). Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barres d’échelle
: 75µm). Chaque photographie de droite est un agrandissement de la région délimitée par un carré blanc en
pointillé sur la photographie correspondante de gauche.

Dans la moelle épinière, les souris non injectées ou injectées avec l’AAV-GFP n’ont présenté
qu’un léger marquage diffus d’ubiquiline 2 (figure 37). Pour les souris injectées avec l’AAV10-Ub2,
nous avons retrouvé le même profil d’agrégation cytoplasmique positive pour l’ubiquiline 2 que
dans leur cortex moteur et leur hippocampe. De même, dans la moelle épinière des souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, nous avons retrouvé de nombreux agrégats et inclusions comme
dans le cortex moteur et l’hippocampe.

108
 Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
ubiquiline 2 / DAPI

Moelle
épinière

Figure 37: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 dans moelle épinière
des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps primaire reconnaissant les formes humaine et
murine de l’ubiquiline 2, sur des coupes de moelle cervicale de souris sacrifiées deux mois après l’injection
d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut, comparées aux souris non injectées (n=6 par condition). Les souris non
injectées expriment l’ubiquiline 2 endogène, observable par un léger marquage rouge cytoplasmique. Les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 présentent une surexpression de l’ubiquiline 2 (marquage rouge intense) dans les
cellules avec de petits agrégats cytoplasmiques (indiqués par les flèches blanches). Les souris injectées avec
l’AAV10-Ub2Mut présentent de nombreux agrégats et inclusions (indiquées par les flèches jaunes) notamment
au niveau de la corne ventrale (présentée ici). Photographies représentatives, prises au microscope confocal
(barres d’échelle : 25µm). Chaque photographie du bas est un agrandissement de la région délimitée par un carré
blanc en pointillé sur la photographie correspondante du haut.

La surexpression de l’ubiquiline 2 mutée chez les souris sauvages conduit donc à la

formation d’agrégats composés d’ubiquiline 2 dans le cerveau et la moelle épinière, comme
observé chez les patients atteints de SLA-UBQLN2. Des agrégats ou inclusions se sont également
formés lorsque l’ubiquiline 2 sauvage est surexprimée. De façon intéressante, la formation de ces
agrégats a été nettement visible seulement un mois après l’injection d’AAV10-Ub2.

2.4 Les agrégats formés, suite à l’injection ICV d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut

dans le cerveau et la moelle épinière des souris sauvages, sont positifs pour les
protéines p62 et ubiquitine
Chez les patients atteints de SLA-UBQLN2, une agrégation anormale des protéines p62 et
ubiquitine a été décrite dans les cellules du cerveau et de la moelle épinière (Deng et al., 2011).
Ces protéines, comme l’ubiquiline 2, sont impliquées dans la voie de dégradation protéique via le
protéasome ou l’autophagie. Nous avons donc réalisé un marquage de ces protéines par
immunofluorescence, deux mois après l’injection de nos souris avec les vecteurs AAV10. Tout
d’abord, nous avons détecté la protéine p62 dans le cytoplasme et parfois dans le noyau des
cellules du cortex moteur et de l’hippocampe (gyrus denté et CA3) des souris non injectées ou
injectées avec l’AAV10-GFP (figure 38). Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2, nous l’avons
détectée au sein d’agrégats cytoplasmiques et parfois nucléaires. Chez les souris injectées avec
109
l’AAV10-Ub2Mut, nous avons observé de nombreux agrégats ainsi que des inclusions positifs pour
p62 dans le cortex moteur et l’hippocampe.

Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut

p62 / DAPI
A

Cortex
moteur

p62 / DAPI
B

Gyrus
denté

C p62 / DAPI

CA3

Figure 38: Présence d’agrégats positifs pour p62 dans le cerveau

des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-p62 sur des coupes de cerveau: cortex moteur
(A), gyrus denté de l’hippocampe (B) et la région CA3 de l’hippocampe (C) de souris sacrifiées deux mois après
l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut, comparées aux souris non injectées (n=6 par condition). Les souris
non injectées présentent de petits agrégats cytoplasmiques positifs pour p62 (indiqués par les flèches blanches)
dans les cellules du cortex moteur (A) et de l’hippocampe (B et C). Ils sont également présents chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2, mais leur taille est nettement plus importante que chez les souris non injectées.
Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, les agrégats sont beaucoup plus nombreux (A à C) que chez les
autres souris et peuvent former des inclusions (indiquées par les flèches jaunes) dans le cortex moteur (A) et la
région CA3 de l’hippocampe (C). Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barres d’échelle

110
: 25µm). Chaque photographie du bas est un agrandissement de la région délimitée par un carré blanc en pointillé
sur l’image correspondante du haut.

Dans la moelle épinière, les souris non injectées ou injectées avec l’AAV-GFP n’ont présenté
qu’un marquage cytoplasmique diffus de p62 (figure 39 : A). En ce qui concerne les souris injectées
avec l’AAV10-Ub2, nous avons retrouvé le même profil d’agrégation cytoplasmique de p62 que
celui observé dans leur cerveau (surtout du cortex moteur). Les nombreux agrégats et inclusions
observés dans le cortex moteur et l’hippocampe des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, ont
également été observés dans leur moelle épinière.

Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut

p62 / DAPI
A

Moelle
épinière
ubiquitine / DAPI
B

Figure 39: Présence d’agrégats positifs pour p62 et l’ubiquitine dans la moelle épinière
des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-p62 (A) et un anticorps anti-ubiquitine (B) sur
des coupes de moelle cervicale de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-
Ub2Mut, comparées aux souris non injectées (n=6 par condition). (A) Chez les souris non injectées, la protéine
p62 est essentiellement localisée dans le cytoplasme des cellules situées dans la corne ventrale (présentée ici)
de manière diffuse avec quelques petits agrégats (indiqués par la flèche blanche). Les souris injectées avec
l’AAV10-Ub2 présentent de plus gros agrégats positifs pour p62 dans le cytoplasme et parfois dans le noyau des
cellules. De nombreux agrégats et inclusions (indiquées par la flèche jaune) positifs pour p62 ont été observés
chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut. (B) Quant à l’ubiquitine, son expression est diffuse dans le
cytoplasme et le noyau des cellules chez les souris non injectées. Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2, des
agrégats positifs pour l’ubiquitine ont été observés dans le cytoplasme et le noyau des cellules. Chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, les agrégats sont plus nombreux et peuvent former des inclusions.
Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barres d’échelle: 25µm). Chaque photographie
du bas est un agrandissement de la région délimitée par un carré blanc en pointillé sur l’image correspondante
du haut.
111
 Ensuite, nous avons détecté l’ubiquitine de manière diffuse et localisée dans le cytoplasme
et le noyau des cellules du cortex moteur et de l’hippocampe (gyrus denté et CA3) chez les souris
non injectées ou injectées avec l’AAV10-GFP (figure 40). Dans ces mêmes régions du cerveau, nous
avons observé de gros agrégats cytoplasmiques et nucléaires positifs pour l’ubiquitine chez les
souris injectées avec l’AAV10-Ub2, et de nombreux agrégats ainsi que des inclusions chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut. Dans la moelle épinière, l’ubiquitine est présente de manière
diffuse dans le cytoplasme et le noyau des cellules chez les souris non injectées et les souris
injectées avec l’AAV10-GFP (figure 39 : B). Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2, nous avons
détecté l’ubiquitine au sein d’agrégats cytoplasmiques et nucléaires. Chez les souris injectées avec
l’AAV10-Ub2Mut, les agrégats sont plus nombreux et peuvent former des inclusions.

L’expression de l’ubiquiline 2 sauvage ou mutée chez les souris sauvages induit donc
l’agrégation des protéines p62 et ubiquitine dans le cortex moteur, l’hippocampe et la moelle
épinière, comme cela a été observé dans la plupart des formes sporadiques ou familiales de SLA
(Neumann et al., 2006 ; Arai et al., 2006 ; Mackenzie et al., 2007 ; Deng et al., 2011 ; Scotter et al.,
2015 ; Mitchell et al., 2015 ; Saberi et al., 2015 ; Mizielinska et al., 2014).

112
 Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
ubiquitine / DAPI
A

Cortex
moteur

ubiquitine / DAPI
B

Gyrus
denté

ubiquitine / DAPI
C

CA3

Figure 40: Présence d’agrégats positifs pour l’ubiquitine dans le cerveau

des souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-ubiquitine sur des coupes de cerveau: cortex
moteur (A), gyrus denté de l’hippocampe (B) et la région CA3 de l’hippocampe (C) de souris sacrifiées deux mois
après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut, comparées aux souris non injectées (n=6 par condition).
Chez les souris non injectées, l’ubiquitine est localisée dans le cytoplasme de manière diffuse ainsi que sous
forme de petits agrégats (indiqués par les flèches blanches) dans le cytoplasme et le noyau des cellules localisées
dans le cortex moteur (A) et l’hippocampe (B et C). Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2, certaines cellules
présentent de plus gros agrégats que chez les souris non injectées (surtout dans le cortex moteur (A)). Chez les
souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, ces agrégats sont beaucoup plus nombreux que chez les autres souris et
peuvent former des inclusions (indiquées par les flèches jaunes) essentiellement dans le cortex moteur (A) et la
région CA3 de l’hippocampe (C). Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barres d’échelle
: 25µm). Chaque image du bas est un agrandissement de la région délimitée par un carré blanc en pointillé sur
l’image correspondante du haut.
113
 De plus, nous avons réalisé des analyses de spectrométrie de masse sur les protéines co-
immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2, qui ont montré la co-localisation de l’ubiquiline 2 mutée
avec p62 et l’ubiquitine dans la moelle épinière des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut (figure
54), confirmant nos observations pour les analyses d’immunofluorescence.

Nous avons également réalisé des analyses d’immunofluorescence sur des coupes de
moelle épinière pour le marquage de la protéine TDP-43, qui est souvent retrouvée délocalisée et
agrégée dans le cytoplasme lors d’analyses post-mortem de patients atteints de SLA-UBQLN2
(Deng et al., 2011 ; Williams et al., 2012) ou d’autres formes familiales ou sporadiques de la
maladie (Neumann et al. 2006 ; DeJesus-Hernandez et al., 2011 ; Hortobagyi et al., 2011 ; Scotter
et al, 2015). Pour ces analyses, nous avons utilisé un anticorps reconnaissant la partie C-terminale
et un autre anticorps reconnaissant la partie N-terminale de TDP-43. Nous n’avons pas retrouvé
la protéine TPD-43 délocalisée dans le cytoplasme, ni détectée dans les agrégats protéiques des
cellules de moelle épinière dans notre modèle animal, un et deux mois après l’injection des
vecteurs. L’absence d’agrégat positif pour TDP-43 dans notre modèle n’exclue pas l’hypothèse que
ces agrégats puissent se former, suite à la surexpression de l’ubiquiline 2, à un âge plus avancé
dans la maladie comme cela a été remarqué par exemple dans les modèles transgéniques générés
par Le et ses collaborateurs (2016).

2.5 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une réduction
du volume cérébral et une astrogliose dans le cerveau des souris sauvages
Nous avons voulu mieux identifier les effets de la surexpression de l’ubiquiline 2 (sauvage
ou mutée) sur le cerveau des souris sauvages injectées avec les AAV10. En effet, les patients
montrant des signes de DFT présentent une atrophie de la région fronto-temporale du cerveau
(Ambikairajah et al., 2014). Etant donné que des signes de DFT ont été diagnostiqués dans des cas
de SLA-UBQLN2, nous avons effectué des analyses stéréologiques (figure 41 : A) afin de mesurer
la taille du cerveau des souris contrôles (non injectées ou injectées avec l’AAV10-GFP) et des souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut.

Nous avons pu ainsi remarquer que la surexpression de l’ubiquiline 2 (sauvage ou mutée)

induit une réduction du volume cérébral (respectivement : 254±19,7mm3 et 268,8±13,5mm3) par
rapport aux souris non injectées (349,5±12,1mm3 ; P<0,05 dans les deux cas) ou injectées avec
l’AAV10-GFP (359,1±19,3mm3 ; P<0,05 dans les deux cas) (figure 41 : B). La différence entre les
souris non injectées et les souris exprimant la GFP n’est pas significative. Le volume de la région
du cortex est significativement réduit chez les souris surexprimant la forme sauvage ou mutée de
l’ubiquiline 2 (116,5±12,2mm3 et 130,1±2,7mm3, respectivement) par rapport aux souris non

114
injectées (162,8±7,9mm3 ; P<0,05 dans les deux cas) et par rapport aux souris injectées avec
l’AAV10-GFP (180,5±10,1mm3 ; P<0,05 et P<0,01, respectivement) (figure 41 : C). Le volume du
cortex n’est pas différent entre les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et l’AAV10-Ub2Mut, ainsi
qu’entre les souris non injectées et les souris injectées avec l’AAV10-GFP.

A Non injectée

AAV10-Ub2

AAV10-Ub2Mut

Non injectée vs AAV10-Ub2Mut

B Taille du cerveau C Taille du cortex

* *
Volume (mm3)

Volume (mm3)
## # * *
# #

NI GFP Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10 AAV10

Figure 41: Réduction du volume cérébral des souris exprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Coupes stéréologiques de cerveau de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-
Ub2Mut, comparées aux souris non injectées (n=3 par condition), avec l’analyse du volume cérébral (B) et du
cortex (C). (A) Sur les coupes transversales de cerveau, une réduction du volume cérébral est visible à l’œil nu
pour les animaux injectés avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris contrôles, non injectées
(NI) ou injectées avec l’AAV10-GFP (non montré ici). Le calcul des volumes moyens du cerveau entier (B) et du
cortex (C) montre une réduction significative du volume cérébral et du volume cortical entre les souris
surexprimant l’ubiquiline 2 humaine (sauvage ou mutée) et les souris contrôles. Les résultats sont exprimés en
moyenne ± SEM et analysés à l’aide du test de Student (* et # P<0,05; ## P<0,01; * comparaison vs NI; #
comparaison vs AAV10-GFP).

Une des caractéristiques histopathologiques décrite dans la SLA est la réponse

inflammatoire des astrocytes, ou astrogliose (Vargas et Johnson, 2010). Nous avons donc effectué
un immunomarquage spécifique des astrocytes à l’aide d’un anticorps marquant la protéine acide
fibrillaire gliale (anti-GFAP) sur des coupes de cerveau (figure 42). Un mois après l’injection des
vecteurs AAV10-Ub2 et AAV10-Ub2Mut, les souris ont présenté une astrogliose dans le cortex
moteur et l’hippocampe.

Les souris surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage ou mutée ont donc présenté une diminution
de leur volume cérébral et une neuro-inflammation, typiques des cas de SLA-DFT (Ambikairajah et
al., 2014).

115
 Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
GFAP / DAPI

Figure 42: Astrogliose observée dans le cerveau des souris surexprimant

l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-GFAP marquant spécifiquement les astrocytes
sur des coupes de cerveau de souris sacrifiées un mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut,
comparées aux souris non injectées (n=3 par condition). Contrairement aux souris non injectées, celles injectées
avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut présentent une astrogliose dans les régions du cortex moteur et de
l’hippocampe. Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barre d’échelle : 500 µm).

2.6 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit la perte des
MNs et une astrogliose dans la moelle épinière des souris sauvages
L’une des principales caractéristiques de la SLA est la perte des MNs localisés dans la moelle
épinière (Shaw, 2005). Nous avons donc voulu déterminer si la surexpression de l’ubiquiline 2
humaine sauvage ou mutée pouvait induire une neurodégénérescence chez les souris injectées.
Pour cela, nous avons réalisé un marquage des MNs, par immunofluorescence, en utilisant un
anticorps anti-Choline Acétyle Transférase (ChAT) spécifique des MNs, sur des coupes de moelle
épinière (régions cervicale, thoracique et lombaire) de souris sacrifiées deux mois après l’injection
d’AAV10 (figure 43). Suite au comptage des MNs, nous avons pu remarquer que leur nombre a
été significativement réduit chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 par rapport aux souris non
injectées (respectivement : 9,51±1,06 versus 15,54±1,58 ; P<0,01) et cette différence a été encore
plus marquée chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut pour lesquelles le nombre de MNs a
été réduit de moitié par rapport aux souris non injectées (respectivement : 7,81±0,79 versus
15,54±1,58; P<0,001). Ces résultats indiquent donc que l’injection de vecteurs AAV10 codant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée induit une dégénérescence des MNs.

116
 A B
Dégénérescence des MNs
Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut dans la moelle épinière
ChAT / DAPI

Nombre de MNs
**

par section
***
# ##

NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10

Figure 43: Perte des MNs dans la moelle épinière des souris exprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps spécifique des MNs (anti-ChAT) sur des coupes
de moelle épinière (moelle lombaire) de souris sacrifiées un mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-
Ub2Mut, qui sont comparées aux souris non injectées (n=5 par condition). (B) Analyses du nombre moyen de
MNs par section de moelle épinière (sur toute la longueur) pour chaque groupe de souris (n=5 par condition). Le
nombre de MNs est significativement réduit chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 par rapport aux souris
contrôles, non injectées (NI) ou injectées avec l’AAV10-GFP, et cette réduction est encore plus significative chez
les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par ANOVA,
post-test de Bonferroni (# P<0,05; ** et ## P<0,01; *** P<0,001; * comparaison vs NI; # comparaison vs AAV10-
GFP). Photographies représentatives, prises au microscope confocal (barre d’échelle : 50µm).

Nous avons également mis en évidence une astrogliose, par immunofluorescence (anti-
GFAP), dans la moelle épinière, et en particulier au niveau des cornes ventrales des souris
surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée (intensités de fluorescence: 8,51±0,27u.a.
et 8,91±0,37u.a., respectivement) par rapport aux souris non injectées (6,90±0,17u.a.) (P<0,0001
dans les deux cas) et aux souris exprimant la GFP (6,57±0,12u.a.) (P<0,0001 dans les deux cas)
(figure 44).

Les souris surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage ou mutée ont donc présenté une perte de
MNs et une neuro-inflammation dans la moelle épinière, comme observé dans la SLA (Shaw,
2005 ; Vargas et Johnson, 2010).

117
 A Non injectée AAV10-GFP B
GFAP
Astrogliose
dans la moelle épinière

Intensité de fluorescence (u.a.)

**** ****

AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut

NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10

Figure 44: Astrogliose observée dans la moelle épinière des souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps marquant spécifiquement les astrocytes (anti-
GFAP) sur des coupes de moelle épinière (moelle cervicale présentée ici) de souris sacrifiées deux mois après
l’injection d’AAV10-GFP, d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut qui sont comparées aux souris non injectées (n=3
par condition). (B) Analyses de l’intensité moyenne de fluorescence du marquage des astrocytes calculée pour
chaque groupe de souris (n=3 par condition). L’intensité de fluorescence pour les souris injectées avec l’AAV10-
Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut est significativement augmentée comparée à celles des souris contrôles (non injectées
(NI) ou injectées avec l’AAV10-GFP). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par ANOVA, post-
test de Bonferroni (**** P<0,0001). Photos représentatives, prises au microscope à fluorescence (grande barre
d’échelle : 200µm et petite barre d’échelle : 20µm). Chaque photographie en bas à droite est un agrandissement
de la région délimitée par un carré blanc en pointillé sur l’image de moelle épinière correspondante.

2.7 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une perte de la
masse et une atrophie musculaires des souris sauvages
Chez les patients atteints de SLA, la perte progressive des MNs s’accompagne d’une atrophie
et d’une faiblesse musculaire. De façon intéressante, nous avons retrouvé ce phénotype
amyotrophique chez les souris surexprimant la forme sauvage ou mutée de l’ubiquiline 2
humaine. En effet, la masse du Tibialis anterior (rapport : masse musculaire en g / masse
corporelle en g) a été significativement réduite chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2
(0,0012±7,2e-5) et l’AAV10-Ub2Mut (0,0010±4,2e-5) par rapport aux souris non injectées
(0,0015±6,8e-5) (P<0,05 et P<0,01 respectivement) et aux souris injectées avec l’AAV10-GFP
(0,0015±7,3e-5) (P<0,05 et P<0,001 respectivement) (figure 45 : B). Toutefois, aucune différence
significative n’a été observée entre les souris surexprimant la forme sauvage ou mutée de
l’ubiquiline 2 humaine, ni entre les souris non injectées et les souris injectées avec l’AAV10-GFP.
Nous avons effectué un marquage par immunofluorescence de la membrane des fibres
musculaires (anti-laminine) (figure 45 : A) et nous avons calculé l’aire et le nombre moyens de
fibres sur des coupes transversales de muscle Tibialis anterior (figure 45 : C et D). Cette analyse a

118
révélé également une réduction significative de l’aire des fibres, d’environ 30%, chez les souris
surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage ou l’ubiquiline 2 mutée par rapport aux souris non injectées
(respectivement : 830,4±55,0 et 825,0±57,5 versus 1193±40,9; P<0,001). De plus, le nombre de
fibres est augmenté d’environ 50% chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut
par rapport aux souris non injectées (respectivement : 1231±80 et 1246±97,4 versus
843±28,9 fibres; P<0,01). Les différences entre les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-
Ub2Mut et les souris injectées avec l’AAV10-GFP ne sont pas significatives, ni entre les souris non
injectées et les souris injectées avec l’AAV10-GFP. Les souris surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage
ou mutée ont donc montré une perte de leur masse musculaire avec une réduction de la taille des
fibres.

A Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut

laminine / DAPI

B C D
Nombre de fibres / aire section µm²
Masse du TA (g) /masse corporelle (g)

Masse musculaire Taille des fibres musculaires Quantité de fibres musculaires

** ** **
* ### *** ***

NI GFP Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10 AAV10 AAV10

Figure 45: Observation d’une atrophie musculaire chez les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps anti-laminine marquant la membrane des fibres
musculaires sur des coupes de muscle Tibialis anterior (TA) de souris sacrifiées un mois après l’injection d’AAV10-
GFP, d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut qui sont comparées aux souris non injectées (NI) (n=6 par condition).
(B) Analyses de la masse musculaire du TA de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-GFP (n=3),
d’AAV10-Ub2 (n=5) ou d’AAV10-Ub2Mut (n=5), qui sont comparées aux souris NI (n=3). La masse du TA est
réduite chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris NI. (C) Mesure de
l’aire des fibres rapportée à l’aire de la section transversale du TA. (D) Comptage du nombre de fibres
musculaires par µm² réalisées à partir des images d’immunofluorescence (A). L’aire des fibres musculaires est
significativement réduite chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris
non injectées (C) ainsi que le nombre de fibres musculaires (D) dans le TA des souris injectées avec l’AAV10-Ub2
ou l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris NI. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par
ANOVA, post-test de Bonferroni (* P<0,05; ** P<0,01; *** et ### P<0,001; * comparaison vs NI; # comparaison
vs AAV10-GFP). Photographies représentatives, prises au microscope à fluorescence (barre d’échelle : 50µm).

119
 Enfin, nous avons caractérisé le statut oxydatif des fibres musculaires des souris injectées
comparées aux souris contrôles. Nous avons donc effectué une coloration des fibres positives au
NADH sur des coupes de Tibialis anterior (figure 46). Le comptage des fibres oxydatives NADH (+)
a révélé une augmentation de leur pourcentage chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2
comparées aux souris non injectées (respectivement : 68,34±2,53% versus 54,89±3,27% ; P<0,05).
Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, cette augmentation est encore plus importante
par rapport aux souris non injectées (83,99±2,47% versus 54,89±3,27% ; P<0,01). Cette analyse
montre que la diminution de la taille des fibres musculaires est accompagnée d’un changement
du statut oxydatif des fibres, signes présents dans les biopsies musculaires de patients atteints de
SLA suite à la dénervation (Bogdanov et al., 2000 ; Mitsumoto et al., 2008 ; Dupuis, 2009).

A B Fibres oxydatives
100%
Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut **
80% *
60% NADH(-)
40% NADH(+)

NADH 20%
0%
NI Ub2 Ub2Mut
AAV10

Figure 46: Augmentation du nombre de fibres musculaires oxydatives dans le Tibialis anterior des souris
surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Analyses des fibres oxydatives (colorées aux NADH) réalisées sur des coupes de Tibialis anterior de souris
sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut, qui sont comparées aux souris non
injectées (n=3 par condition). (B) Analyses du pourcentage de fibres oxydatives NADH (+) pour chaque groupe
de souris (n=3 par condition). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ont plus de fibres musculaires oxydatives
NADH (+) que les souris non injectées (NI). L’augmentation du nombre de fibres musculaires oxydatives est plus
important chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris NI. Les résultats sont exprimés
en moyenne ± SEM et analysés à l’aide du test de Student (* P<0,05; ** P<0,01). Photographies représentatives,
prises au microscope à lumière blanche (barre d’échelle : 500µm).

2.8 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit une réduction
de la force musculaire des souris sauvages
Nous avons également voulu comprendre si la perte de MNs et la perte de masse musculaire
se traduisaient par une faiblesse musculaire chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou
l’AAV10-Ub2Mut. Pour cela, nous avons mesuré la force contractile du Tibialis anterior après une
stimulation électrique du muscle (figure 47 : A). A l’âge d’un mois, la force contractile des souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 (55,36±4,46N/g) ou l’AAV10-Ub2Mut (47,49±2,50N/g) est
significativement réduite (baisse d’un tiers) par rapport aux souris non injectées (84,92±4,19N/g ;
P<0,001 et P<0,0001, respectivement).

120
 Nous avons aussi effectué le test d’agrippement (« Grip test ») permettant de mesurer la
force d’agrippement des quatre pattes des souris (figure 47 : B). Seulement un mois après
l’injection, les résultats obtenus ont également montré une diminution significative de la force de
traction exercée par les quatre membres (force en g/ poids en g) chez les souris surexprimant la
forme sauvage ou mutée (7,3±0,3 et 6,6±0,5, respectivement) de l’ubiquiline 2 par rapport aux
souris non injectées (8,9±0,3 ; P<0,05 et P<0,001, respectivement). Cette différence est également
significative entre les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut et celles injectées avec l’AAV10-GFP
(8,8±0,4 ; P<0,01), mais elle n’apparait pas significative entre les souris injectées avec l’AAV10-
Ub2 et l’AAV10-GFP (7,3±0,3 versus 8,8±0,4, respectivement). Aucune différence n’a été notée
entre les souris non injectées et celles injectées avec l’AAV10-GFP, ainsi qu’entre les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 et celles injectées avec l’AAV10-Ub2Mut.

Grâce à ces deux analyses, nous avons mis en évidence une faiblesse musculaire qui se
manifeste par une perte des propriétés contractiles du muscle Tibialis anterior et une réduction
de la force d’agrippement chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 sauvage ou mutée.
Force d’agrippement (g) / poids (g)

Propriété contractile du Grip test

A Tibialis anterior (TA) B
***
Force tétanique (N/g)

* ##
***
****

NI Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10 AAV10

Figure 47: Observation d’une faiblesse musculaire chez les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
(A) Analyses de la force tétanique du TA deux mois après l’injection des souris avec l’AAV10-Ub2 (n=9) ou
l’AAV10-Ub2Mut (n=9) comparées aux souris non injectées (NI, n=6). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2
montrent une diminution significative de la force tétanique par rapport aux souris NI, et cette diminution est
encore plus significative pour les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut. (B) Analyses de la force d’agrippement
un mois après l’injection des souris avec l’AAV10-GFP (n=6), l’AAV10-Ub2 (n=10) et l’AAV10-Ub2Mut (n=9)
comparées aux souris NI (n=11). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 montrent également une diminution
significative de leur force d’agrippement par rapport aux souris contrôles (NI ou injectées avec l’AAV10-GFP) et
cette diminution est nettement plus significative pour les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux
souris contrôles. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés par ANOVA, post-test de Bonferroni
(* P<0,05; ## P<0,01; *** P<0,001; **** P<0,0001; * comparaison vs NI; # comparaison vs AAV10-GFP).

121
2.9 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des troubles
moteurs chez les souris sauvages
Nous avons recherché d’éventuels troubles moteurs chez les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine par le test du « footprint ». Lors de ce test, les souris avancent en ligne
droite laissant leurs empreintes sur du papier blanc grâce à de l’encre mise sur leurs pattes (figure
48). Avec cette méthode, nous avons pu observer une diminution de la longueur des pas chez les
souris qui ont reçu des injections d’AAV10-Ub2 par rapport aux souris non injectées (5,07±0,17cm
et 5,61±0,13cm, respectivement ; P<0,05) et qui était encore plus importante chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut (4,73±0,16cm; P<0,001). En revanche, la distance des pas qui se
chevauchent n’a pas été significativement différente entre les souris qui surexpriment l’ubiquiline
2 humaine et les souris non injectées.

A B

Non injectée
Test du footprint
Longueur des pas (cm)

8,00

6,00 * ***
AAV10-Ub2 4,00

2,00

0,00
NI Ub2 Ub2Mut

AAV10-Ub2Mut AAV10

Pattes avant Pattes arrière

Figure 48: Observation de troubles moteurs chez les souris surexprimant

l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses de la démarche des souris par le test du footprint (A) avec l’analyse de la longueur des pas (B) réalisées
deux mois après l’injection des souris avec l’AAV10-Ub2 (n=6) ou l’AAV10-Ub2Mut (n=4), qui sont comparées aux
souris non injectées (NI, n=8). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 font des pas significativement plus petits
que les souris NI, et cette réduction est significativement plus importante chez les souris qui ont reçu des
injections d’AAV10-Ub2Mut. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés à l’aide du test de
Student (* P<0,05; *** P<0,001).

122
2.10 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des signes
d’anxiété chez les souris sauvages
L’un des premiers signes de démence observé dans la SLA est l’anxiété qui amène les
patients à s’isoler de la société (Strong et al., 2009 ; Raaphorst et al., 2012). Nous avons donc
recherché la présence de signes d’anxiété chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2. Pour cela,
nous avons analysé le comportement des souris grâce au test d’anxiété clair/obscur dans une cage
divisée en deux compartiments : l’un exposé à la lumière et l’autre dans l’obscurité. Dans un
premier temps, nous avons isolé les souris dans une cage pendant 30 minutes (période
d’adaptation à la lumière) et dans un deuxième temps, nous avons placé les souris dans le
compartiment obscur de la cage. A partir de ce moment, nous avons mesuré sur une période de 5
minutes : le temps de latence (temps passé dans le compartiment obscur avant d’entrer pour la
première fois dans le compartiment éclairé), le temps total passé dans le compartiment éclairé et
le nombre d'entrées dans le compartiment éclairé (figure 49). Les souris injectées avec l’AAV10-
Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut ont mis plus de temps avant d’entrer pour la première fois dans le
compartiment non éclairé, comparativement aux souris non injectées (respectivement :
178,3±39,3min et 206,7±37,1min versus 28,4±7,1min ; P<0,01 et P<0,001) et aux souris injectées
avec l’AAV10-GFP (respectivement : 178,3±39,3min et 206,7±37,1min versus 50,4±8,2min ;
P<0,05 et P<0,01) (figure 49 : A). De plus, les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut ont passé
moins de temps dans le compartiment éclairé que les souris non injectées (respectivement :
47,6±18,4min et 113,9±10,8min ; P<0,05) (figure 49 : B). En revanche, chez les souris injectées
avec l’AAV10-Ub2, le temps passé dans le compartiment éclairé n’a pas été significativement
différent de celui des souris non injectées (66,4±22,5min et 113,9±10,8min). Enfin, les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 et l’AAV10-Ub2Mut (3,4±1,3 et 2,5±1,0, respectivement) sont entrées
moins souvent dans le compartiment éclairé que les souris non injectées (12,3±1,1) (P<0,001 dans
les deux cas) et les souris injectées avec l’AAV10-GFP (8,1±1,2) (P<0,05 dans les deux cas) (figure
49 : C).

La surexpression de l’ubiquiline 2 sauvage et de l’ubiquiline 2 mutée conduit à un phénotype

anxieux, comme observé dans les cas de SLA avec DFT.

123
 Temps dans le Nombre d’entrées dans le
A Temps de latence (s) B compartiment éclairé (s) C compartiment éclairé

***
**
*
****
****

NI GFP Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut NI GFP Ub2 Ub2Mut

AAV10 AAV10 AAV10

Figure 49: Observation de signes d’anxiété chez les souris surexprimant

l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses des signes d’anxiété six semaines après l’injection des souris avec l’AAV10-GFP, l’AAV10-Ub2 ou
l’AAV10-Ub2Mut, qui sont comparées aux souris non injectées (NI) (n=11 par condition), à l’aide du test d’anxiété
clair/obscur où le temps de latence (A) et le temps passé dans le compartiment éclairé (B) ont été mesurés, et le
nombre d’entrées dans le compartiment éclairé (C) a été compté. Ce test a révélé des signes d’anxiété chez les
souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut qui ont mis plus de temps avant d’entrer pour la première
fois dans le compartiment éclairé (A), qui ont passé moins de temps dans le compartiment éclairé (B) et qui sont
rentrées moins souvent (C) dans le compartiment éclairé par rapport aux souris NI. Les résultats sont exprimés
en moyenne ± SEM et analysés par ANOVA, post-test de Bonferroni (* P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; ****
P<0,0001).

2.11 L’injection d’AAV10-Ub2 et d’AAV10-Ub2Mut par voie ICV induit des troubles
neurologiques chez les souris sauvages
Les troubles neurologiques dans plusieurs modèles murins de maladies
neurodégénératives, comme les maladies de Huntington et d’Alzheimer, sont mis en évidence par
un phénotype anormal de repliement des pattes, appelé « clasping ». Ce phénotype traduit des
dysfonctionnements neurologiques notamment dans la région corticale du cerveau qui
influencent le contrôle moteur (Carter et al., 1999 ; Braff et al., 2001 ; Liu et al., 2011). Grâce au
test de suspension par la queue, nous avons mis en évidence des troubles neurologiques aussi
bien chez les souris injectées avec l’AAV10 codant pour la forme mutée que celles injectées avec
l’AAV10 codant pour la forme sauvage de l’ubiquiline 2 (figure 50). En effet, seulement trois
semaines après l’injection, 72% des souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et 76% des souris injectées
avec l’AAV10-Ub2Mut ont montré un phénotype de « clasping ».

124
 A B Clasping
**** **** ****
Non injectée AAV10-Ub2Mut

Pourcentages
Non Injectées (n=22)
AAV10-GFP (n=22)
AAV10-Ub2 (n=19)
AAV10-Ub2Mut (n=19)

3 semaines 6 semaines 9 semaines

Figure 50: Observation d’un phénotype « clasping » chez les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses du phénotype « clasping » lors du test de suspension par la queue (photos représentatives en A) et
pourcentage de souris faisant du « clasping » (B), à trois, six et neuf semaines après l’injection des souris avec
l’AAV10-Ub2 (violet, n=19) ou l’AAV10-Ub2Mut (bleu, n=19), comparées aux souris AAV10-GFP (vert, n=22) et
aux souris non injectées (NI, rouge, n=22). (B) Dès trois semaines après l’injection, le pourcentage de souris
faisant du « clasping » (A, photo de droite) est significativement supérieur chez les souris injectées avec l’AAV10-
Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut par rapport aux souris contrôles (A, photo de gauche). Les résultats sont exprimés en
pourcentage ± SEM et analysés par ANOVA, post-test de Bonferroni (**** P<0,0001).

Lors de ce test, nous avons également observé un phénotype de rotation anormale appelé
« spinning » chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée qui est
également considéré comme un signe de trouble neurologique (Trushina et al., 2006) (figure 51).
Deux mois après l’injection, 44% des souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et 34% des souris injectées
avec l’AAV10-Ub2Mut ont montré un phénotype de « spinning ».

Spinning
60%
*
50%
* Non Injectées (n=22)
40%
Pourcentages

AAV10-GFP (n=22)
30%
AAV10-Ub2 (n=19)
20% AAV10-Ub2Mut (n=19)
10%

0%
2 mois

Figure 51: Observation d’un phénotype « spinning » chez les souris surexprimant
l’ubiquiline 2 humaine sauvage ou mutée.
Analyses du phénotype « spinning » lors du test de suspension par la queue, deux mois après l’injection des
souris avec l’AAV10-Ub2 (violet, n=19) ou l’AAV10-Ub2Mut (bleu, n=19) comparées aux souris injectées avec
l’AAV10-GFP (vert, n=22) ou non injectées (rouge, n=22). Le pourcentage de souris injectées avec l’AAV10-Ub2
ou l’AAV10-Ub2Mut faisant du « spinning » est significativement supérieur à celui des souris non injectées. Les
résultats sont exprimés en pourcentage ± SEM et analysés à l’aide du test de Student (* P<0,05).

125
3 Etude in vivo des interactions de l’ubiquiline 2 mutée avec
d’autres protéines par spectrométrie de masse
3.1 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée in vivo induit une augmentation de son
interaction avec des sous-unités du protéasome
Afin de déterminer les interactions spécifiques entre l’ubiquiline 2 et les autres protéines,
nous avons réalisé des immunoprécipitations de l’ubiquiline 2 à partir de lysats protéiques de
moelle épinière provenant de souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut et de souris
non injectées. Suite à l’incubation des extraits protéiques avec l’anticorps spécifique des formes
humaine et murine de l’ubiquiline 2, nous avons validé l’efficacité de l’immunoprécipitation par
western blot. Cette analyse a montré un enrichissement de l’ubiquiline 2 dans les échantillons
traités avec l’anticorps anti-ubiquiline 2, par rapport aux lysats traités avec l’IgG contrôle (figure
52).

Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut

Lysat Non Lysat Non Lysat Non
total liée Ub2 IgG liée Ub2 IgG liée Ub2 IgG
total total

Ub2 murine ̴
Ub2 humaine ( 70kDa)
̴
( 70kDa)
IgG (chaine lourde)

Figure 52: Vérification de l’efficacité d’immunoprécipitation par western blot.

Analyses par western blot de l’ubiquiline 2, montrant l’efficacité d’immunoprécipitation réalisées à partir
d’extraits de moelle épinière de souris injectées avec l’AAV10-Ub2 (n=2) ou l’AAV10-Ub2Mut (n=4), deux mois
après l’injection et comparées aux souris non injectées (n=3) du même âge. Pour chaque condition, le premier
puits du gel correspond au lysat total chargé comme témoin positif; le deuxième correspond aux protéines non
liées après incubation avec l’anticorps anti-ubiquiline 2; le troisième montre l’enrichissement protéique suite à
l’immunoprécipitation avec l’anticorps anti-ubiquiline 2 et le quatrième montre le lysat protéique suite à
l’incubation avec l’IgG contrôle (contrôle négatif). Les carrés rouges identifient l’ubiquiline 2. kDa: kiloDalton.

126
 Les lysats issus de l’immunoprécipitation ont été chargés sur un gel de polyacrylamide.
Après migration et coloration des protéines, le gel a été découpé en plusieurs fragments afin
d’identifier les protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 par spectrométrie de masse
(figure 53).

A B

KDa

Ub2 humaine

IgG
(chaine lourde)

IgG Spectromètre de masse

(chaine légère)

Gel de polyacrylamide (4-12%)

Figure 53: Migration sur gel des protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 de moelle épinière
pour l’analyse par spectrométrie de masse.
(A) Migration sur gel de polyacrylamide des protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 de moelle
épinière de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 (n=2) ou d’AAV10-UbMut (n=4), comparées
aux souris non injectées (n=3). Les protéines sont révélées grâce à la coloration au bleu de Coomassie, mettant
ainsi en évidence les formes humaine et murine de l’ubiquiline 2 (bandes d’environ 70kDa). L’anticorps anti-
ubiquiline 2 (chaines lourde et légère) utilisé pour l’immunoprécipitation est également visible sur le gel. Le gel
a ensuite été découpé en fragments afin d’identifier et quantifier les protéines co-immunoprécipitées avec
l’ubiquiline 2, à l’aide d’un spectromètre de masse (B).

Grâce à cette analyse, nous avons identifié plusieurs protéines interagissant spécifiquement
avec l’ubiquiline 2 mutée ou sauvage chez les souris injectées par rapport aux souris non injectées
(figure 54). Nous avons notamment observé une modification des interactions entre l’ubiquiline
2 mutée et les protéines constituant les sous-unités régulatrices et catalytiques du protéasome
(figures 54 et 55).

Les analyses par spectrométrie de masse ont aussi permis de montrer l’interaction entre
l’ubiquiline 2 mutée et les protéines p62 et ubiquitine (figure 54) confirmant les résultats
précédemment obtenus par immunofluorescence.

127
 Protéines interagissant uniquement avec l’ubiquiline 2 sauvage
Ub2 Microtubule-associated protein 1B (Map1b)
Ub2 Cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase (Acot7)
Ub2 ATP-citrate synthase (Acly)
Ub2 Hexokinase-1 (Hk1)
Ub2 Alpha-internexin (Ina)
Ub2 Voltage-dependent anion-selective channel protein 3 (Vdac3)
Ub2 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (Vdac1)
Ub2 Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 1 (Pacsin1)
Ub2 Myosin-10 (Myh10)
Ub2 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 (Mapre2)
Ub2 UPF0534 protein C4orf43 homolog

Protéines interagissant uniquement avec l’ubiquiline 2 mutée

Ub2Mut 26S protease regulatory subunit 6B (Psmc4)
Ub2Mut 26S protease regulatory subunit 7 (Psmc2)
Ub2Mut Ub2Mut 26S protease regulatory subunit 10B (Psmc6)
Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 3 (Psmd3)
Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 (Psmd4)

Ub2 Ub2Mut
Ub2Mut
26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6 (Psmd6)
26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 (Psmd7)
Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 (Psmd11)
Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 12 (Psmd12)
11 70 33 Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 13 (Psmd13)
Ub2Mut 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14 (Psmd14)
Ub2Mut Proteasome subunit beta type-2 (Psmb2)
Ub2Mut Proteasome subunit beta type-3 (Psmb3)
Ub2Mut Proteasome subunit alpha type-2 (Psma2)
Ub2Mut Proteasome subunit alpha type-4 (Psma4)
Ub2Mut Proteasome subunit alpha type-6 (Psma6)
Ub2Mut Proteasome subunit alpha type-7 (Psma7)
Ub2Mut Proteasome subunit alpha type-7-like (Psma8)
Ub2Mut Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5 (Usp5)
Ub2Mut Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 (Usp14)
Ub2Mut Ubiquitin-protein ligase E3A (Ube3a)
Ub2Mut Ubiquitin-conjugating enzyme E2 L3 (Ube2I3)
Ub2Mut Sequestosome-1 (P62)
Ub2Mut ATP synthase subunit b, mitochondrial (Atp5f1)
Ub2Mut V-type proton ATPase catalytic subunit A (Atp6v1a)
Ub2Mut Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase (Ngly1)
Ub2Mut Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial (Prdx3)
120
Nombre de protéines

Ub2Mut Tudor domain-containing protein 6 (Tdrd6)

Ub2Mut 14-3-3 protein gamma (Ywhag)
100 Ub2Mut TOM1-like protein 2 (Tom1I2)
Ub2Mut Probable G-protein coupled receptor 97 (Gpr97)
80 Ub2Mut MutS protein homolog 4 (Msh4)

60 Ub2Mut Elongation factor 1-alpha 2 (Eef1a2)

40
20
0 NI Ub2 Ub2Mut

Figure 54: Liste de protéines identifiées suite à l’analyse par spectrométrie de masse.
Analyses de spectrométrie de masse réalisées sur les protéines co-immunoprécipitées avec l’ubiquiline 2 de
moelle épinière de souris sacrifiées deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 (en vert, n=2) ou d’AAV10-Ub2Mut
(en rouge, n=4), comparées aux souris non injectées (en gris, n=3). 91 protéines ont été identifiées dans les lysats
de souris injectées avec l’AAV10-Ub2, 112 avec l’AAV10-Ub2Mut et 85 dans les lysats de souris non injectées.
Parmi ces protéines, 33 ont été retrouvées uniquement dans les échantillons AAV10-Ub2Mut (liste en rouge) et
11 dans les échantillons AAV10-Ub2 (liste en vert). Plus de la moitié des protéines interagissant uniquement avec
l’ubiquiline 2 mutée, sont des protéines du protéasome (en bleu dans la liste). Des ubiquitines (en violet) ainsi
que la protéine p62 (en orange) ont également été mises en évidence chez les souris exprimant l’ubiquiline 2
humaine mutée.

128
 26S Proteasome
Capture polyubiquitinated proteins

Lid
Deubiquitilate 19S regulatory particle

Base
Unfold and open α-ring

Proteolysis 20S Core particle

Base

19S regulatory particle

Lid

Figure 55 : Schéma du protéasome montrant les protéines interagissant uniquement

avec l’ubiquiline 2 mutée.
Les protéines identifiées par spectrométrie de masse et interagissant uniquement avec l’ubiquiline 2 mutée sont
indiquées par une étoile rouge. Le schéma a été réalisé à l’aide de la base de données « DAVID Bioinformatics
Resources, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) ».

Compte tenu de la perturbation de l’interaction de l’ubiquiline 2 avec le protéasome mise

en évidence par spectrométrie de masse, suite à la surexpression de l’ubiquiline 2 mutée dans la
moelle épinière, nous avons voulu vérifier si un dysfonctionnement a également été induit dans
le cerveau des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut. Pour cela, nous avons effectué des analyses
de western blot montrant une augmentation du niveau de protéines ubiquitinylées chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, comparées aux souris non injectées et aux souris injectées avec
l’AAV10-Ub2 (figure 56).

La surexpression de l’ubiquiline 2 mutée induit donc très probablement un effet toxique en

bloquant la dégradation des protéines ubiquitinylées via le protéasome, que ce soit dans la moelle
épinière ou dans le cerveau.

129
 Cerveau
Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
Ub2 murine
Ub2 humaine ̴70 kDa

ubiquitine

α-actine (42 kDa)

Figure 56: Western blot montrant l’accumulation anormale d’ubiquitine dans le cerveau
des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut.
Analyses par western blot réalisées à l’aide d’un anticorps anti-ubiquitine et d’un anticorps anti-ubiquiline 2 sur
des extraits protéiques de cerveau deux mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-Ub2Mut, comparées
aux souris non injectées (n=3 par condition). Ces analyses montrent une quantité d’ubiquitine plus importante
dans le cerveau des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut par rapport à celle des souris non injectées ou
injectées avec l’AAV10-Ub2. L’α-actine a été utilisée comme gène de ménage. kDa: kiloDalton.

3.2 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée induit une perte de son interaction avec
l’α-spectrine in vivo
De manière intéressante, l’analyse protéomique a aussi montré que la surexpression de
l’ubiquiline 2 mutée entraine une perte de son interaction avec certaines protéines clés pour le
maintien des structures membranaires, comme l’α-spectrine (figure 57 : A). Nous nous sommes
tout particulièrement intéressés à cette protéine car elle est localisée au niveau de l’axone des
neurones, et assure le maintien de la stabilité du cytosquelette et de ses propriétés mécaniques
entre autres (figure 57 : C) (Xu et al., 2013). De plus, elle possède un domaine SH3 permettant
d’interagir avec des domaines riches en proline, comme évoqué précédemment dans
l’introduction (figure 57 : B). La mutation P497H dans le domaine riche en proline (PXX) de
l’ubiquiline 2 pourrait alors empêcher l’interaction de celle-ci avec le domaine SH3 de l’α-
spectrine.

En conclusion, les analyses de spectrométrie de masse ont montré que la mutation de

l’ubiquiline 2 entrainerait, d’une part, un gain de fonction toxique de la protéine se traduisant par
une accumulation des protéines ubiquitinylées ; et d’autre part, une perte de fonction se
traduisant par une perte d’interaction avec des protéines importantes pour la physiologie
neuronale. Ces deux mécanismes : gain de fonction et perte de fonction pourraient donc avoir un
rôle primordial dans la physiopathologie de cette forme de SLA.

130
 Protéines perdant l’interaction avec l’Ub2Mut
A
NI & Ub2 Neurofilament medium polypeptide (Nefm)
NI & Ub2 Phosphoglycerate kinase 1 (Pgk1)
NI & Ub2 Actin, aortic smooth muscle (Acta2)
NI & Ub2 14-3-3 protein beta/alpha (Ywhab)
NI & Ub2 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1 (Atp1b1)
NI & Ub2 Spectrin alpha chain, brain (Sptan1)
NI & Ub2 Dynamin-1 (Dnm1)
NI & Ub2 V-type proton ATPase subunit B, brain isoform (Atp6v1b2)
NI & Ub2 Spectrin beta chain, brain 1 (Sptbn1)
NI & Ub2 Ubiquilin-4 (Ubqln4)

B C

α-spectrin SH3 β-spectrin

Spectrin
heterotetramer
β-spectrin SH3 α-spectrin

Figure 57: Perte d’interaction de l’ubiquiline 2 avec l’α-spectrine chez les souris
surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée.
(A) Liste des protéines perdant l’interaction avec l’ubiquiline 2 mutée, identifiées par l’analyse de spectrométrie
de masse. (B) Schéma de la structure de l’ -spectrine sous la forme de hétérotétramère, composée de deux
chaines alpha et deux chaines beta. Les chaines alpha possèdent un domaine SH3 au niveau des répétitions de
spectrine 9 et 10. (C) Schéma de la structure tridimensionnelle de la membrane de l’axone, constituée de
spectrine sous forme de tétramère (ou hétérotétramère) formant des chaines positionnées parallèlement le long
de l’axone. Des anneaux composés d’actine et d’adducine sont également présents entre les tétramères de
spectrine (B : modifié à partir de Brown et al., 2015; C: d’après Xu et al., 2013).

3.3 La surexpression d’ubiquiline 2 mutée induit une accumulation de l’α-spectrine

dans des lignées cellulaires
Suite à la perte d’interaction de l’ubiquiline 2 mutée avec l’α-spectrine, observée par
l’analyse protéomique, nous avons vérifié si cela pouvait modifier la quantité d’α-spectrine dans
les cellules. Pour cela, nous avons analysé le niveau d’expression de cette protéine, par western
blot, dans les cellules NSC-34 transfectées avec les vecteurs GFP, pcDNA-Ub2 ou pcDNA-Ub2Mut
(figure 58). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la quantité d’α-spectrine (sa forme
complète de 250kDa et une de ses formes clivées de 120kDa) dans les cellules exprimant la forme
mutée de l’ubiquiline 2 humaine par rapport aux cellules non transfectées. Cette accumulation de
l’α-spectrine pourrait être due à la perte de son interaction avec l’ubiquiline 2 qui ne pourrait donc
pas l’amener au protéasome pour être dégradée.

131
 B
5
Spectrine complète (250 kDa)
*

Intensité relative
4

moyenne
3
2
1
A NSC-34 0
NT GFP Ub2 Ub2Mut
NT GFP pcDNA-Ub2 pcDNA-Ub2Mut

Spectrine clivée (150 kDa)

α-spectrine complète 0,8

Intensité relative
0,6

moyenne
α-spectrine clivée 0,4
0,2
0
Ub2 murine NT GFP Ub2 Ub2Mut
Ub2 humaine
Ub2 murine
Spectrine clivée (120 kDa)
1
0,8 ***

Intensité relative
α-tubuline
0,6

moyenne
0,4
0,2
0
NT GFP Ub2 Ub2Mut

Figure 58: Accumulation des formes complète et clivées de l’α-spectrine dans les cellules NSC-34
transfectées avec le vecteur pcDNA-Ub2Mut.
(A) Analyses de western blot réalisées à l’aide d’un anticorps anti-α-spectrine, sur des lysats protéiques des
cellules NSC-34 transfectées avec le vecteur GFP, pcDNA-Ub2 ou pcDNA-Ub2Mut (48h après la transfection)
comparées aux NSC-34 non transfectées (NT). (B) Analyses de l’intensité moyenne des bandes obtenues par
western blot (A), calculées pour chaque condition de transfection. Une accumulation de la forme complète
(250kDa) et d’une forme clivée (120kDa) de l’α-spectrine a été observée dans les cellules exprimant l’ubiquiline
2 humaine mutée, comparées aux cellules NT. Concernant la forme clivée de 150kDa, la différence d’intensité
entre les cellules transfectées avec le vecteur pcDNA-Ub2Mut et les cellules NT n’est pas significative à cause de
la variabilité des valeurs des cellules NT. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés à l’aide du
test de Student (*p<0,05; ***p<0,001).

3.4 Les niveaux protéiques de l’α-spectrine sont modifiés dans les extraits de
cerveaux de patients atteints de SLA sporadique
L’ubiquiline 2 semble avoir un rôle dans les formes familiales et sporadiques de SLA ( Deng
et al., 2011 ; Brettschneider et al., 2012). Nous nous sommes donc demandé si une dérégulation
des niveaux d’expression d’ubiquiline 2 et d’α-spectrine pourrait être observée chez des patients
atteints de SLAs. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons réalisé des analyses de western blot
sur des lysats protéiques de cortex cérébraux provenant de trois patients atteints de SLAs et de
trois individus contrôles (figure 59 : A). Ainsi, nous avons trouvé une augmentation du niveau
d’ubiquiline 2 dans le cortex cérébral des patients comparé à celui des individus contrôles (figure
59 : B et C). De plus, nous avons mis en évidence une accumulation de la forme complète de l’α-
spectrine ainsi que de sa forme clivée de 150 kDa dans deux patients atteints de SLAs comparés à
deux individus contrôles. Nous avons rencontré un problème d’extraction protéique pour un
individu contrôle et un patient atteint de SLAs (figure 60), réduisant ainsi le nombre de cas pris en

132
compte dans cette analyse (deux par condition). Ces résultats sont donc à confirmer avec d’autres
cas de SLAs et d’individus contrôles afin d’être en mesure d’effectuer des analyses statistiques.

B C
Forme complète de la spectrine Forme complète de la spectrine
3 2

Intensité relative
2,5

Intensité relative
1,5

moyenne
2
1,5 1
1
0,5
0,5
0 0
CTL1 CTL2 CTL3 SLA1 SLA2 SLA3 CTL SLA
A Cortex
CTL1 CTL2 CTL3 SLA1 SLA2 SLA3 Forme clivée de la spectrine Forme clivée de la spectrine
3,5 1,6
α-spectrine 3 1,4

Intensité relative
(272 kDa) Intensité relative 2,5 1,2

moyenne
1
2
α-spectrine 0,8
1,5 0,6
(150 kDa)
1 0,4
Ubiquiline 2 0,5 0,2
0 0
(~70 kDa)
CTL1 CTL2 CTL3 SLA1 SLA2 SLA3 CTL SLA
α-tubuline
(50 kDa)
Ubiquiline 2 Ubiquiline 2
2 1,4
1,2
Intensité relative

Intensité relative
1,5 1

moyenne
0,8
1
0,6
0,4
0,5
0,2

0 0
CTL1 CTL2 CTL3 SLA1 SLA2 SLA3 CTL SLA

Figure 59: Accumulation des formes complète et clivée de l’α-spectrine dans le cortex
de patients atteints de SLA sporadiques.
(A) Analyses de western blot réalisées à l’aide d’un anticorps anti-α-spectrine et d’un anticorps anti-ubiquiline 2,
sur des lysats protéiques de cortex cérébral provenant de patients atteints de SLAs et d’individus contrôles. (B)
Analyses de l’intensité de bandes pour chaque patient et individu contrôle. (C) Analyses de l’intensité moyenne
des bandes pour chaque groupe (uniquement SLA2 et SLA3, CTL2 et CTL3 pris en compte). Les échantillons SLA2
et SLA3 présentent une quantité plus importante de la forme complète et d’une forme clivée de l’α-spectrine
(272kDa et 150kDa, respectivement) par rapport aux individus contrôles (CTL2 et CTL3) dans la région corticale
du cerveau. La quantité d’ubiquiline 2 est également plus élevée chez les patients malades (SLA2 et SLA3)
comparée aux individus contrôles (CTL2 et CTL3). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM.
Cortex
CTL1 CTL2 CTL3 SLA1 SLA2 SLA3

Figure 60: Révélation au rouge Ponceau des protéines du cortex d’individus contrôles ou atteints de SLAs,
sur la membrane de transfert.
Révélation au rouge Ponceau des protéines du cortex d’individus contrôles et de patients atteints de SLAs, sur la
membrane de transfert. La quantité de protéines pour les échantillons CTL1 et SLA1 est moins importante que
pour les autres, malgré une même quantité de protéines chargées pour tous les échantillons.

133
4 Test d’un traitement au bleu de méthylène sur le modèle murin
de la SLA-UBQLN2
Plusieurs études ont montré la capacité du bleu de méthylène (BM) à réduire le nombre
d’agrégats pathologiques et à améliorer le phénotype dans des modèles in vivo des maladies
d’Alzheimer et de Huntington (Paban et al., 2014 ; Sontag et al., 2012). Pendant un essai clinique
de phase 2, le BM a eu un effet bénéfique sur le phénotype cognitif de patients atteints de la
maladie d’Alzheimer (Wischick et al., 2015). Suite à ce résultat, le BM a été testé en phase 3
d’essais cliniques (Gauthier et al., 2016 ; essai clinique : NCT01689246) ainsi que sur des cas de
DFTvc (essai clinique : NCT01626378).

Nous avons donc choisi de tester le BM sur notre modèle afin de voir s’il pouvait également
réduire le nombre d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 et éventuellement avoir un intérêt
thérapeutique dans le cas de la SLA-UBQLN2. Ce test nous a aussi permis de voir si notre modèle
in vivo est approprié pour le test de composés thérapeutiques. Pour réaliser ce traitement, nous
avons administré une solution de BM en intrapéritonéale aux souris injectées avec l’AAV10-Ub2
ou l’AAV10-Ub2Mut et aux souris non injectées, à 4 jours (3 injections/semaine durant un mois,
4mg/kg par injection). Comme contrôle négatif, nous avons administré une solution de NaCl à
0,9%.

4.1 Le traitement au BM réduit les agrégats d’ubiquiline 2 dans la moelle épinière

des souris injectées avec l’AAV10-Ub2, mais les augmente chez les souris
injectées avec l’AAV10-Ub2Mut
Après un mois de traitement au BM (ou NaCl), nous avons quantifié le nombre d’agrégats
positifs pour l’ubiquiline 2 sur des coupes de moelle épinière (figure 61). Chez les souris injectées
avec l’AAV10-Ub2, le traitement au BM permet de diminuer le nombre d’agrégats par rapport aux
mêmes souris traitées au NaCl (181,60±38,91 et 276,13±24,58, respectivement ; P<0,05).
Néanmoins, leur quantité d’agrégats reste significativement supérieure à celle des souris non
injectées et traitées au NaCl (181,60±38,91 et 12,60±4,09, respectivement ; P<0,001).

Chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, en revanche, le traitement au BM augmente

fortement le nombre d’agrégats (plus de 50% d’augmentation) par rapport à celles traitées au
NaCl (4505,67±434,57 et 2094,17±221,17, respectivement ; P<0,0001). Le BM ne permet donc pas
de réduire la formation des agrégats induite par la surexpression de l’ubiquiline 2 mutée. Nous
pouvons supposer que ce traitement est efficace pour réduire la formation d’agrégats de petite
taille mais qu’en présence d’agrégats de grande taille, le BM favorise au contraire leur formation.

134
 Non injectée AAV10-Ub2 AAV10-Ub2Mut
A ubiquiline 2

NaCl

Bleu de
méthylène

Agrégats et inclusions d’ubiquiline 2 dans

C la moelle épinière
Nombre d’agrégats par section

8000
7000 ****
6000 ****
**** NaCl
5000
4000 *** Bleu de
3000 **** méthylène

2000 *
1000
0
NI Ub2 Ub2Mut
AAV10

Figure 61: Analyse du nombre d’agrégats d’ubiquiline 2 suite au traitement au BM.

(A) Analyses d’immunofluorescence réalisées avec un anticorps reconnaissant les formes humaine et murine de
l’ubiquiline 2 sur des coupes de moelle épinière de souris un mois après l’injection d’AAV10-Ub2 ou d’AAV10-
Ub2Mut, comparées aux souris non injectées, et ayant reçu des injections intrapéritonéales de BM ou de NaCl
(contrôle négatif) (n=3 par condition). (B) Analyses du nombre d’agrégats positifs pour l’ubiquiline 2 par section
de moelle épinière (n=3 par condition). Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et traitées au BM montrent une
diminution du nombre d’agrégats par rapport aux souris injectées avec l’AAV10-Ub2 traitées au NaCl. Toutefois,
la quantité d’agrégats des souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et au BM restent significativement supérieure à
celle des souris sauvages injectées avec du NaCl. Pour les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, le traitement
au BM augmente fortement le nombre d’agrégats par rapport à celles traitées au NaCl. Les résultats sont
exprimés en moyenne ± SEM et analysés à l’aide test de Student (* P<0,05; *** P<0,001; **** P<0,0001).
Photographies représentatives, prises au microscope à fluorescence (grande barre d’échelle : 200µm et petite
barre d’échelle : 40 µm). Chaque image en bas à droite est un agrandissement de la région délimitée par un carré
blanc en pointillé sur la photographie de moelle épinière correspondante.

135
 Etude de l’effet d’un nouveau traitement pour la SLA liée aux
mutations de SOD1 sur les jonctions neuromusculaires

des souris SOD1G93A.

Pendant mes travaux de thèse, j’ai participé à l’étude de l’effet thérapeutique d’une
nouvelle thérapie génique élaborée au sein de mon laboratoire d’accueil, pour la SLA liée aux
mutations de SOD1.

Comme décrit dans le chapitre introductif, environ 20% des cas de SLA familiale sont
associés à des mutations du gène de la Superoxyde Dismutase 1 (SOD1) (Rosen et al., 1993), lui
conférant des propriétés neurotoxiques responsables de la pathogénèse. En effet, les souris
SOD1G93A transgéniques surexprimant le gène SOD1 humain muté (hSOD1) présentent les
symptômes typiques de la pathologie humaine (Gurney et al., 1994).

La suppression de la protéine hSOD1 mutante représente une des approches

thérapeutiques les plus prometteuses de ces dernières années. Plusieurs preuves de concept ont
été développées dans les modèles murins de SLA utilisant des oligonucléotides anti-sens (Smith et
al., 2006) ou, plus récemment, le vecteur viral associé à l’adénovirus (AAV) synthétisant de petits
ARN interférents. Cependant l’efficacité de ces traitements n’a été que partielle (Foust et al.,
2016 ; Wang et al., 2014).

Au sein de mon laboratoire, nous avons élaboré une stratégie pour réduire la hSOD1 par
modulation de l’épissage (saut d’exon) de son pré-ARN messager (ARNm) grâce à des séquences
antisens (AS-hSOD1). Celles-ci génèrent l’apparition d’un codon stop prématuré dans le transcrit
de la hSOD1, entrainant alors sa dégradation par le mécanisme d’élimination des ARNm non-sens
(Non-sense Mediated Decay - NMD).

Afin de tester l’efficacité de cette stratégie, nous avons injecté des souris nouveau-nées (à
1 jour) ou adultes (à 50 jours) avec un AAV de sérotype 10 exprimant les AS-hSOD1 (AAV10-AS-
hSOD1). L’injection par voies IV et ICV de l’AAV10-AS-hSOD1 a permis le saut d’exon de l’hSOD1
dans la moelle épinière, entrainant une réduction de 75% de son ARNm et de 70% de sa protéine,
comparée aux souris non traitées.

Le phénotype des souris SOD1G93A, injectées à la naissance ou à 50 jours, a considérablement

été amélioré avec une augmentation moyenne de l'espérance de vie de 92% et 58%
respectivement, comparée aux souris contrôles. Chez les souris injectées, l'apparition de la

136
maladie a également été retardée avec une préservation de leurs fonctions motrices et de leur
force musculaire.

Dans ce contexte, j’ai étudié l’effet de cette thérapie sur les jonctions neuromusculaires des
souris traitées, comparées aux souris non traitées et aux souris sauvages. J’ai pu démontrer une
préservation des jonctions de 64% chez les souris traitées à la naissance dans le muscle extensor
digitorum longus et de 48% chez les souris injectées à l’âge adulte dans le muscle gastrocnemius
par rapport aux souris non traitées. La publication scientifique qui décrit ce résultat est présentée
en annexe.

137
 Discussion
et
perspectives

138
 En conclusion, nous avons généré et caractérisé, au cours de ma thèse, un modèle de SLA-
DFT liée aux mutations de l’UBQLN2 à l’aide de vecteurs AAV. Nous avons étudié les défauts
d’interaction de la protéine mutée de l’ubiquiline 2 dans le contexte pathologique et nous avons
déterminé deux mécanismes possibles responsables de la maladie, gain de fonction et perte de
fonction. Nous avons ainsi testé chez le nouveau modèle le BM, un composé déjà utilisé en essai
clinique pour d’autres maladies neurologiques.
Les résultats que nous avons obtenus montrent que le modèle de SLA-DFT généré par
injection d’AAV codant pour l’ubiquiline 2 mutée sera utile pour mieux comprendre les
mécanismes moléculaires de cette pathologie complexe et pour élaborer de nouvelles thérapies.

J’ai effectué ce travail au sein de l’équipe de recherche dirigée par le Dr. Barkats, qui
développe des stratégies pour cibler le SNC à l’aide de vecteurs viraux, notamment les AAV. Plus
précisément son laboratoire est spécialisé dans la compréhension physiopathologique et la mise
en place de stratégies thérapeutiques des maladies du MN, comme la SMA et la SLA. Cette
dernière a fait l’objet de ma thèse.

La SLA est la maladie du MN la plus courante chez l’adulte (Mc Guire et al., 1996 ; Pasinelli
et al., 2006), caractérisée par leur perte progressive dans le cortex moteur, le tronc cérébral et /
ou la moelle épinière (Pasinelli et al., 2006). Malgré le nombre élevé d'essais précliniques et
cliniques réalisés au cours des deux dernières décennies (Zinman et Cudkowicz, 2011), aucun
traitement efficace n'est actuellement disponible, à l'exception du médicament Riluzole qui offre
seulement un bénéfice modeste (Bensimon et al., 1994) et l'Edaravone récemment approuvé par
la FDA dont les effets sont encore à démontrer (Ito et al., 2008 ; Hardiman et al., 2017).
Les cas de SLA sont majoritairement de forme sporadique (90-95%) et plus rarement de
forme familiale (5-10%) (Renton et al., 2014). Le gène responsable de la maladie est connu dans
environ 70% des cas de SLAf et plus de 100 gènes ont été associés à sa pathogénèse (Al-Chalabi et
al., 2013; mutations référencées dans la base de données « ALSoD database ») ; alors que les
connaissances sur les formes sporadiques de la maladie sont plus limitées. La SLA a longtemps été
considérée comme une maladie spécifique du MN, mais des résultats récents ont mis en évidence
l'interaction synergique d’altérations dans d’autres types cellulaires, comme les cellules gliales et
musculaires responsables de l'exacerbation du phénotype pathologique (Ferraiuolo et al., 2011).
Actuellement, la SLA est donc considérée comme un trouble multi-systémique dans lequel les MNs
ont tendance à être affectés en premier et le plus sévèrement (Ferraiuolo et al., 2011).

139
 De nombreuses questions sans réponse restent encore à étudier pour comprendre cette
pathologie complexe et trouver des traitements efficaces. Les recherches que nous avons menées
dans l'équipe du Dr. Barkats visent à étudier la physiopathologie de la SLA en modélisant l'une de
ses principales caractéristiques pathologiques ; la formation d'agrégats de protéines. En effet, les
agrégats de protéines ubiquitinylées sont détectés dans les tissus affectés des patients atteints de
différentes formes de SLA, tels que la moelle épinière, le cortex fronto-temporal, l'hippocampe et
le cervelet (Al-Chalabi et al., 2012).

En 2011, Deng et ses collaborateurs ont identifié dans des formes héréditaires dominantes
de SLA avec DFT, liées au chromosome X, cinq mutations dans le gène UBQLN2 (Deng et al., 2011),
codant pour la protéine ubiquiline 2. L'identification de ces mutations liées à la SLA, dans une
protéine directement impliquée dans la voie de la dégradation des protéines, pourrait aider à
comprendre la pathogénèse de la maladie. De plus, la pathologie de l'ubiquiline 2 a été décrite
dans la moelle épinière de cas de SLA et dans le cerveau de patients atteints de SLA-DFT, avec ou
sans mutations de l’ubiquiline 2, suggérant un processus pathogène commun associé aux
inclusions positives à l’ubiquiline 2 dans les SLAf et SLAs.
Le rôle pathologique de l'ubiquiline 2 dans la pathogénèse de la SLA avec ou sans démence
n'est pas encore bien déterminé. Nous avons donc décidé de développer un modèle animal pour
la SLA liée à l’UBQLN2, afin de comprendre les mécanismes pathologiques de sa mutation,
d’étudier la formation d'agrégats de protéines in vivo et d'élaborer de nouvelles stratégies
thérapeutiques pour la SLA et la SLA-DFT.

1) Transfert de gène à l’aide de vecteurs AAV pour la génération de

modèles animaux
Afin de générer un modèle murin pour cette forme de SLA et SLA-DFT, nous avons utilisé
des AAV10 pour le transfert du gène UBQLN2 chez des souris sauvages. Nous avons produit des
AAV10 renfermant l’ADNc humain de l'ubiquiline 2 sauvage ou mutée (ubiquiline 2P497H), sous le
contrôle du promoteur PGK, dans un génome simple brin d’AAV. Le promoteur PGK a été choisi
pour sa capacité à diriger une expression élevée et constitutive de gènes ectopiques (Régulier et
al., 1998). En particulier, la stabilité de l'expression de transgènes par PGK confère à ce promoteur
un grand avantage sur celui du cytomégalovirus, pour lequel une diminution significative de
l’activité de transcription au cours du temps a été rapportée (Tenenbaum et al., 2004). Dans le
SNC, un vecteur lentiviral exprimant lacZ, sous contrôle du promoteur PGK, a montré in vivo une
expression préférentielle dans les neurones, justifiant davantage notre choix (Déglon et al., 2000).
140
 Afin d’obtenir une expression efficace de l'ADNc in vivo, nous avons également inséré un
intron chimérique immédiatement en aval du promoteur PGK (figure 28). Des études ont en effet
montré que les introns hétérologues permettent d’augmenter l'expression des gènes en
influençant l'initiation ou l'élongation de la transcription (via des amplificateurs ou d'autres
éléments agissant en cis), en améliorant la stabilité de l'ARNm dans le noyau (via le processus
d'épissage des ARNm) ou en facilitant l'ouverture des domaines chromosomiques (Brinster et al.,
1988 ; Palmiter et al., 1991).
En outre, toujours dans le but d’augmenter l'expression du transgène, nous avons ajouté la
séquence de l’élément régulateur post-transcriptionnel WPRE, en aval de l'ADNc. Cet élément
stimule l'expression des séquences virales sans intron et permet l’expression efficace et à long
terme de transgènes pour la thérapie génique (Loeb et al., 1999).
Parmi les différentes mutations de l’ubiquiline 2 décrites par Deng et ses collaborateurs,
nous avons choisi de surexprimer l'ADNc de l’ubiquiline 2 portant la mutation P497H car elle
montre une pénétrance complète (Deng et al., 2011).
L'AAV10 recombinant a été administré par injection ICV bilatérale chez des souris FVB
nouveau-nées. Un AAV10 codant pour la GFP, injecté dans les mêmes conditions, a été utilisé
comme témoin. Cette méthode de transfert de gènes assure une transduction importante du SNC,
ainsi que des tissus périphériques et en particulier du muscle squelettique, comme en témoignent
les analyses d’expression de la GFP (figure 31) et comme reporté dans la littérature (Meyer et al.,
2015 ; Armbruster et al., 2016).
La modélisation de maladies neurodégénératives via l'AAV représente une stratégie
alternative intéressante comparée aux lésions neurochimiques (Ferrante et al., 1993) ou à la
transgénèse classique (Dayton et al., 2012). En effet, l'injection de vecteurs viraux permet de
générer plus rapidement un modèle animal avec un coût plus réduit que le développement et le
maintien de lignées transgéniques. L'utilisation de différents sérotypes et de différentes doses
d'AAV permet de moduler la sévérité de la maladie et de cibler spécifiquement certains types
cellulaires en fonction du tropisme des vecteurs viraux (Klein et al., 2008). Un autre avantage
important de cette stratégie est la possibilité de modéliser la maladie à un âge spécifique, afin
d’étudier l’effet des mutations au cours du temps (Klein et al., 2010). Enfin, cette méthode peut
être utilisée dans toutes les espèces animales et particulièrement chez les mammifères de grande
taille dans le cadre d’études précliniques (Duque et al., 2015).
Pour la génération de notre modèle animal, nous avons décidé d'induire une expression
ubiquitaire de l'ADNc de l'ubiquiline 2 en raison de la nature multi-systémique de la SLA. Toutefois
le transfert de gène à l’aide d’AAV pourrait être utile pour comprendre la contribution spécifique

141
des organes dans la pathogénèse, grâce à l’utilisation de promoteurs spécifiques. L’expression
spécifique de l'ubiquiline 2 dans le muscle squelettique, par exemple, pourrait aider à définir la
contribution de ses mutations ainsi que l'altération de son expression au phénotype
amyotrophique. Par extension, il pourrait également être intéressant d’utiliser cette méthode
pour étudier le lien entre l'altération de la protéostasie et la maladie dans différents types
cellulaires ou organes.
L'expression somatique de la mutation permettrait aussi de comprendre les mécanismes
pathologiques en excluant les possibles effets compensatoires intervenant pendant le
développement, comme cela peut se produire lors de l'utilisation de souris transgéniques.

2) Caractéristiques des modèles de souris surexprimant la forme

sauvage ou mutée de l’ubiquiline 2 humaine
Suite à l’administration ICV des vecteurs AAV10-Ub2 et AAV10-Ub2Mut, nous avons analysé
l'expression de l'ubiquiline 2 humaine dans les extraits protéiques de cerveau et de moelle
épinière, un mois après l'injection (figure 33). Malgré l’injection de la même quantité de vecteurs,
nous avons observé un niveau d’expression protéique de l'ubiquiline 2 humaine mutée plus élevé
par rapport à celui de l'ubiquiline 2 humaine sauvage. Cette accumulation d’ubiquiline 2 mutée
pourrait être due à un mécanisme de propagation de type prion qui a déjà été décrit pour la SOD1
mutée (Chattopadhyay et al., 2008 ; Ayers et al., 2016). Nous avons également observé qu'après
l'injection d'AAV10, les niveaux d'ubiquiline 2 humaine sauvage étaient similaires à ceux de la
protéine murine endogène. Les niveaux de la protéine mutante sont, en revanche, 2,5 fois
supérieurs dans le cerveau et 3 fois supérieurs dans la moelle épinière, par rapport à ceux de la
protéine endogène. Ce niveau élevé d’expression de l’ubiquiline 2 mutée pourrait être
responsable du phénotype sévère des souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut, par rapport au
phénotype observé chez les modèles animaux décrits précédemment (Le et al. 2016).
Les analyses d'immunofluorescence ont mis en évidence la présence d'inclusions positives
pour l'ubiquiline 2 dans le cerveau et la moelle épinière des animaux surexprimant l'ubiquiline 2
mutée (figures 35 à 37), comme chez les patients atteints de SLA avec démence observés par Deng
et ses collaborateurs (2011). Des agrégats de plus petite taille, ont également été observés dans
les tissus provenant de souris injectées avec la forme sauvage de l’ubiquiline 2. Les inclusions et
les agrégats observés suite à la surexpression des deux formes d’ubiquiline 2 sont positifs pour les
protéines p62 et ubiquitine (figures 38 à 40), cela confirmant l’hypothèse du dysfonctionnement
de l'ubiquiline 2 dans la protéostasie et l'autophagie.

142
 Suite à l’expression des deux formes de l’ubiquiline 2, les agrégats ont suivi un schéma de
distribution spécifique avec une accumulation dans le cortex, l'hippocampe et le cervelet. La
reproductibilité du profil d’agrégation dans notre modèle ainsi que dans les autres modèles de
rongeurs exprimant l’ubiquiline 2 mutée (Gorrie et al., 2014 ; Ceballoz-Diaz et al., 2015 ; Wu et al.,
2015 ; Hjerpe et al., 2016 ; Le et al., 2016), suggère que ces régions sont plus sujettes à l'expression
et à l'accumulation d’inclusions positives pour l’ubiquiline 2. Cependant les mécanismes à la base
de ce phénomène sont encore à élucider.
Lors des analyses d’immunofluorescence de l’ubiquiline 2, la présence de gros agrégats a
rendu difficile l’identification des cellules neuronales des souris surexprimant la forme mutée.
Nous avons donc supposé que les inclusions induites par la surexpression de l’ubiquiline 2 mutée,
engendrent une neurodégénérescence.
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons effectué un marquage spécifique des MNs dans
la moelle épinière et mis en évidence leur perte dans les régions cervicale, thoracique et lombaire.
De façon intéressante, la mort des MNs a été observée à la fois chez les animaux injectés avec
l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut avec un phénotype moins sévère pour les souris exprimant la
forme sauvage (figure 43).
Les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut ont montré un phénotype très sévère, avec une
mort prématurée, comparées aux souris contrôles (figure 34). Au contraire, nous n’avons pas
observé de mortalité précoce des souris injectées avec l’AAV10-Ub2 pendant l’étude. Toutefois,
nous ne pouvons pas exclure qu'en suivant ces animaux au-delà de sept mois, nous n'aurions pas
révélé un effet sur la survie.
Les souris injectées avec les deux formes d’ubiquiline 2 ont montré une perte de poids
significative seulement un mois après l’injection (figure 34). La perte de poids observée chez les
souris injectées avec l’ubiquiline 2 mutée a été progressive jusqu’à la fin de leur vie, contrairement
à ce qui a été observé chez les souris injectées avec la forme sauvage qui retrouvent un poids
normal à partir de deux mois. Probablement, la surexpression de l’ubiquiline 2 sauvage a un effet
notoire dans les premières semaines de vie des souris, mais cet effet est atténué au cours du
temps par des mécanismes compensatoires.
Les souris surexprimant la forme sauvage ou mutée de l'ubiquiline 2 ont développé une
faiblesse musculaire et une perte de masse musculaire (figure 45). Nous avons également observé
une diminution progressive de la force musculaire (figure 47) concordant avec la perte de MNs.
Nous avons aussi mis en évidence une altération de leur démarche, significativement différente
de celle des souris non injectées (figure 48).

143
 Lors du test de suspension par la queue les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-
Ub2Mut ont aussi présenté des troubles neurologiques tels que le « clasping » (figure 50) et le
« spinning » (figure 51). Ces phénomènes ont également été décrits dans d'autres modèles murins
pour des maladies neurodégénératives telle que la maladie de Huntington (Zacharoff et al., 2011)
ou dans d’autres conditions neurologiques (Trushina et al., 2006).
Afin d’évaluer des signes de démence, les souris ont été soumises à un test d’anxiété
clair/obscur, révélant un fort phénotype anxieux chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée
(figure 49). Ce test a été effectué lorsque les souris étaient encore capables de marcher. En effet,
chaque souris s’est déplacée au moins une fois d'un compartiment à l'autre pendant l’exécution
du test, indépendamment du type d’injection reçu. Avant le passage dans la cage clair/obscur, les
souris ont eu une période d'adaptation à l’isolement et à l’éclairage. Cette étape a permis de
réduire le stress provoqué par le passage dans un nouvel environnement. Les souris non injectées
et les souris injectées avec l’AAV10-GFP ont montré une activité normale pendant le déroulement
de l’expérience, en se déplaçant avec curiosité d’un compartiment à l’autre dès le début. Les souris
contrôles ont ensuite choisi de rester dans le compartiment éclairé en exerçant une activité
motrice spontanée. Au contraire, les souris injectées avec l’ubiquiline 2 ont préféré rester dans le
compartiment obscur, représentant une forme de protection à l’environnement extérieur. Ce
comportement peut être considéré comme un symptôme d’anxiété. Nous n’avons pas effectué
d’autres tests comportementaux, comme par exemple le test de mémoire, mais il est possible que
nos souris développent des troubles de la mémoire, vu la présence d’agrégats dans l’hippocampe.
Lors des différentes analyses, nous avons comparé les souris injectées avec l’AAV10-GFP aux
souris non injectées, nous n'avons pas observé de différences significatives, indiquant que les
effets observés chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2 et l’AAV10-Ub2Mut sont bien
spécifiques de l’expression du transgène UBQLN2 et non du vecteur. Cependant, lors du test
d’anxiété (figure 49) et de l’analyse histologique des fibres musculaires (figure 45), nous avons
observé une tendance vers le phénotype pathologique des souris injectées avec l’AAV10-GFP.
L’expression de la GFP pourrait avoir donc un effet physiologique sur certaines fonctions.
Dans l’ensemble, la surexpression de l'ubiquiline 2 sauvage a conduit à un phénotype
pathologique moins sévère que celui généré par la surexpression de l’ubiquiline 2 mutée. Cela
suggère que l’ubiquiline 2 peut avoir un rôle primordial pour la physiologie de la cellule et donc
que son altération pourrait jouer un rôle important dans les différentes formes de SLA, y compris
sporadiques.

144
3) Intérêt du modèle surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée
par rapport aux modèles existants
Depuis l’identification des premières mutations dans le gène UBQLN2 chez les patients
atteints de SLA et SLA-DFT, plusieurs groupes de recherche ont généré des modèles animaux de
SLA-UBQLN2 (Gorrie et al., 2014 ; Ceballoz-Diaz et al., 2015 ; Wu et al., 2015 ; Hjerpe et al., 2016 ;
Le et al., 2016). Malgré ces efforts, aucun modèle ne récapitule simultanément les altérations
histologiques, les défauts cognitifs et moteurs typiques de la SLA-DFT. En particulier, des modèles
transgéniques de souris et de rat exprimant l’ubiquiline 2P497H, présentent des déficiences de la
mémoire, mais pas de perte de MNs (Gorrie et al., 2014 ; Wu et al., 2015). Dans ces lignées, les
agrégats d’ubiquiline 2 ont été observés dans l'hippocampe de manière similaire à ceux observés
chez les patients portant des mutations de l’ubiquiline 2. D’autre part, un modèle de souris knock-
in exprimant l’ubiquiline 2P520T, a développé des déficiences cognitives et des inclusions
d’ubiquiline 2 dans le cerveau, mais n'a pas non plus montré de signes de mort des MNs (Hjerpe
et al., 2016). Les souris injectées avec des AAV2/8r, portant les mutations P497S ou P506T de
l’ubiquiline 2, ont présenté des altérations de coordination par rapport aux souris surexprimant
l’ubiquiline 2 sauvage ou l’ubiquiline 2P497H (Ceballoz-Diaz et al., 2015). Cependant, la cause de la
variation de leur performance motrice n'a pas été décrite et la dégénérescence des MNs n’a pas
été étudiée.
Deux modèles de souris transgéniques, récemment générés (Le et al., 2016), exprimant
l’ubiquiline 2P497S ou l’ubiquiline 2P506T humaines, sont les premiers qui ont montré des déficiences
de la mémoire, une perte des MNs tout en reproduisant certaines des caractéristiques
histologiques de la maladie humaine. Ils pourraient donc être des modèles d’intérêt pour les
recherches sur la SLA-DFT. Ces modèles de souris développent une accumulation progressive
d'agrégats protéiques à partir de l’âge d’un mois jusqu’à huit mois (stade final). La durée de vie
est raccourcie à 246 jours pour les souris exprimant l’ubiquiline 2 portant la mutation P497S et à
305 jours pour celles exprimant l’ubiquiline 2 portant la mutation P506T.
Le modèle de souris généré dans notre laboratoire présente un phénotype plus sévère que
ceux générés par d’autres groupes et notamment par Le et ses collaborateurs (2016). En effet, les
agrégats et les inclusions sont déjà nombreux à l’âge d’un mois et l'accumulation de signes
pathologiques conduit au décès prématuré des souris à l'âge de 76 jours en moyenne. Notre
modèle de souris a donc développé des défauts typiques de la SLA et de la SLA-DFT à un âge plus
précoce comparé aux modèles de souris transgéniques. Par conséquent, après une caractérisation
détaillée, nous concluons que le modèle AAV10-Ub2Mut pourrait être un modèle précieux pour

145
tester des médicaments pour cette forme spécifique de SLA ainsi que pour étudier in vivo les voies
d'agrégation.

4) Absence de « pathologie TDP-43 » dans le modèle surexprimant

l’ubiquiline 2 humaine mutée
L’une des caractéristiques pathologiques communes retrouvée dans environ 97% des cas de
SLA (tant dans les cas sporadiques que dans les formes familiales), est une réduction de la quantité
de protéines TDP-43 dans le noyau et son accumulation dans le cytoplasme des MNs spinaux au
sein d’inclusions ubiquitinylées (Neumann et al., 2006 ; Arai et al., 2006 ; Mackenzie et al., 2007 ;
Scotter et al., 2015). Cette pathologie n'est par contre pas observée dans les cas de SLA liées à des
mutations dans les gènes SOD1 et FUS (Mackenzie et al., 2007 ; Seelaar et al., 2010 ; Urwin et al.,
2010 ; Scotter et al., 2015). Cela a conduit à l’hypothèse de l’existence d’un lien entre les
altérations de TDP-43 et la pathogenèse de la majorité des cas de SLA (Mackenzie et al., 2007 ;
Seelaar et al., 2010 ; Urwin et al., 2010 ; Van Langenhove et al., 2012 ; Scotter et al., 2015).
La « pathologie TDP-43 » est également une caractéristique commune de certaines formes
de DFT où elle est observée dans le cerveau des patients lors d’analyses post-mortem (Neumann
et al., 2006 ; Mackenzie et al., 2007 ; Mackenzie et Neumann, 2016). De plus, Deng et ses
collaborateurs (2011) ont détecté la présence de TDP-43 dans les agrégats d'ubiquiline 2 dans la
moelle épinière d’un patient porteur de la mutation P506T. En revanche, dans les différents
modèles de rongeurs pour la SLA-UBQLN2, la présence de TDP-43 dans les inclusions positives à
l’ubiquiline 2 est variable. En effet, deux études ont montré que TDP-43 est absente des inclusions
d’ubiquiline 2 (Gorrie et al., 2014 ; Wu et al., 2015) alors que deux autres ont observé sa présence
aux âges tardifs de six et huit mois (Ceballoz-Diaz et al., 2015 ; Le et al., 2016).
Bien que nous ayons utilisé deux anticorps différents pour TDP-43, l’un reconnaissant la
partie C-terminale et l’autre reconnaissant la partie N-terminale, nous n'avons pas détecté sa
présence au sein des inclusions d’ubiquiline 2 dans le cerveau ni dans la moelle épinière des souris
injectées avec l’AAV10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut. D'autres recherches sont donc nécessaires pour
déterminer quelle est l’implication de TDP-43 dans notre modèle et par extension dans la SLA.
Nous pouvons tout de même supposer que les mécanismes liés à la progression de l’âge et/ou à
l’accumulation de signes pathologiques pourraient participer à la formation de la « protéinopathie
TDP-43 ». En effet, l'absence de la pathologie de TDP-43 chez nos souris pourrait s’expliquer par
la rapidité d’apparition de symptômes pathologiques, contrairement à ce qui a été observé dans
d’autres modèles murins à des stades plus avancés (Ceballoz-Diaz et al., 2015 ; Le et al., 2016).

146
 Pour vérifier cette hypothèse dans notre modèle, nous pouvons envisager de moduler la
maladie des souris surexprimant l’ubiquiline 2 mutée, en modifiant les doses d'AAV injectées. En
réduisant la quantité d’ubiquiline 2 surexprimée chez les souris sauvages, nous pourrions diminuer
les effets pathologiques et probablement prolonger leur durée de vie. Avec cette méthode nous
pourrions donc déterminer la relation entre TDP-43 et l'accumulation d'ubiquiline 2 au cours du
temps et éventuellement déterminer son implication dans la SLA et la SLA-DFT.

5) Investigation du mécanisme pathologique de l’ubiquiline 2: gain

de fonction et perte de fonction
Les mécanismes par lesquels les mutations de l’ubiquiline 2 provoquent la SLA ne sont pas
encore connus. Le knock-out du gène UBQLN2 chez le rat ne produit aucun phénotype, en excluant
d’abord l’hypothèse d’une perte de fonction (Wu et al., 2015). En effet, les mutations de
l’ubiquiline 2 semblent entraîner le phénotype SLA à travers un mécanisme de gain de fonction
provoquant des conséquences néfastes sur la physiologie cellulaire. Il a déjà été démontré que la
surexpression des ubiquilines 2 mutées est responsable de la SLA par une altération de la
dégradation protéique via le protéasome, par une perturbation de la dégradation protéique
associée au réticulum endoplasmique (DARE) et par une anomalie des processus d’autophagie
(Deng et al. 2011 ; Xia et al., 2014 ; Gorrie et al., 2014 ; Chang et Monteiro, 2015 ; Ceballos-Diaz
et al., 2015). Ces défauts dans la protéostasie semblent résulter d'une incapacité des protéines
mutées à délivrer les protéines poly-ubiquitinylées au protéasome pour être dégradées (Chang et
Monteiro, 2015 ; Ceballos-Diaz et al., 2015 ; Osaka et al., 2016). Ce dysfonctionnement pourrait
expliquer la présence d'ubiquitine et d’ubiquiline 2 dans les inclusions qui sont observées dans la
maladie.
L’accumulation d'inclusions positives pour l’ubiquiline 2 pourrait être interprétée comme
un gain de fonction toxique induite par les mutations. D’un autre côté, cela pourrait être considéré
comme une perte de fonction, car les protéines mutées ne peuvent accomplir leur rôle
physiologique dans les cellules. D'autres études ont d’ailleurs démontré que les mutations de
l’ubiquiline 2 dans la SLA-DFT entravent les liaisons de la protéine avec ses partenaires
physiologiques, évoquant l’hypothèse d’un mécanisme de perte de fonction (Xia et al., 2014 ;
Gilpin et al., 2015 ; Hjerpe et al., 2016).
Afin de comprendre quelle est la contribution de l'ubiquiline 2 mutée dans la pathogénèse
de la SLA, nous avons analysé par spectrométrie de masse les protéines co-immunoprécipitées
avec l’ubiquiline 2 dans la moelle épinière de nos souris modèles. Une interaction entre l'ubiquiline
2 mutée et les sous-unités du protéasome a été mise en évidence, confirmant ainsi le rôle de
147
l'ubiquiline 2 dans la voie de la dégradation du protéasome (figure 54). Ce constat a été renforcé
par l'observation d’une accumulation de protéines ubiquitinylées dans le cerveau des souris
surexprimant l’ubiquiline 2 mutée (figure 56). De manière intéressante, les résultats
protéomiques ont montré une perte d'interaction de l'ubiquiline 2 mutée avec une protéine
nécessaire pour le maintien des structures membranaires et de la forme des neurones, l’α-
spectrine (figure 57). Plus spécifiquement, la perte d'interaction avec l’α-spectrine a été
exclusivement observée après l’immunoprécipitation de l’ubiquiline 2 à partir de lysats protéiques
de moelle épinière des souris surexprimant la forme mutée de l’ubiquiline 2.
Afin de confirmer les données obtenues par les analyses de spectrométrie de masse sur l’α-
spectrine, nous avons analysé les lysats protéiques de cellules transfectées avec l’ubiquiline 2
sauvage ou mutée. Dans les cellules transfectées avec le plasmide pcDNA-Ub2Mut, nous avons
observé une augmentation de la forme complète et des formes clivées de l’α-spectrine (figure 58).
Nos résultats suggèrent donc que lorsque la liaison entre l’α-spectrine et l’ubiquiline 2 est perdue,
l’α-spectrine n'est pas livrée au protéasome pour être dégradée et, par conséquent, s’accumule
dans la cellule.

L’ensemble de ces résultats suggère que dans le modèle surexprimant l’ubiquiline 2 mutée,
les deux mécanismes pathologiques de gain de fonction et de perte de fonction sont mimés.
Grâce à la mise en place de ce nouveau modèle, des recherches supplémentaires sur les
mécanismes moléculaires pourraient être effectuées et donner des informations précieuses sur la
pathogénèse de la SLA.

Suite à l'observation de la dérégulation de l’α-spectrine dans ce modèle de souris, nous

avons voulu vérifier si l’altération de cette voie était également présente dans les tissus de
patients atteints de SLAs. Pour cela, nous avons obtenu des échantillons de cortex de trois témoins
et de trois patients provenant de la plateforme de ressources biologiques GIE Neuro-CEB (Hôpital
de la Pitié-Salpêtrière) que nous avons ensuite extraits.
Malheureusement, la qualité de l'extraction protéique ne nous a pas permis d’obtenir des
résultats concluants. Nous avons tout de même observé une accumulation d’ubiquiline 2, de la
forme complète et des formes clivées de l’α-spectrine chez deux patients, comparés à deux
témoins (figure 59). Ces données confirment un rôle possible de l’ubiquiline 2 dans les formes
sporadiques de la SLA, mais aussi qu’une autre protéine, l’α-spectrine, pourrait être impliquée
dans le processus pathologique.

148
 Actuellement aucune mutation du gène SPTAN1 (codant pour l’α-spectrine) n’a été
identifiée dans les patients atteints de SLA, mais des mutations ont été associées à des troubles
neurologiques (Fadi et al., 2012). Il reste à déterminer si l'altération de ce gène peut être
directement liée à la SLA, ou si celle-ci est la conséquence de l’accumulation de défauts dus à la
surexpression de l’ubiquiline 2 ou à d’autres facteurs.

L'étude protéomique nous a également permis d’identifier des protéines qui interagissent
spécifiquement avec la forme sauvage de la protéine. Une analyse plus approfondie des protéines
et des voies impliquées pourrait aider à mieux comprendre le rôle potentiel de l’ubiquiline 2 dans
le cas de la SLA sans mutation de l’ubiquiline 2.

6) Administration du BM chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2

humaine sauvage ou mutée comme paradigme pour le test de
thérapies
Comme précédemment discuté, plusieurs modèles animaux pour la SLA liée à l’UBQLN2 ont
été générés et caractérisés. Cependant aucun d’entre eux n’a été utilisé pour tester des stratégies
thérapeutiques. Pour une validation complète de notre modèle, nous avons décidé de vérifier si
les souris injectées avec l’AA10-Ub2 ou l’AAV10-Ub2Mut répondaient à un traitement connu pour
réduire les agrégats protéiques.
Le Bleu de Méthylène (BM) est un composé chimique qui inhibe la monoamine oxydase et
est utilisé pour le traitement de la malaria, la méthémoglobinémie et comme colorant médical
(Ginimuge et Jyothi, 2010).
Il agit comme un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase et de la guanylate cyclase (Ginimuge
et Jyothi, 2010). Le BM peut également améliorer la fonction mitochondriale en agissant en tant
qu’antioxydant (Kelner et al., 1988). De plus, il a été démontré qu’il est capable de traverser la
BHE, lorsqu’il est administré par voie intrapéritonéale (O’Leary et al., 1968). Plusieurs études ont
montré que le BM peut avoir des effets neuroprotecteurs pour différents troubles neurologiques,
comme la maladie d'Alzheimer (Wischik et al., 1996; Atamna et Kumar, 2010; Medina et al., 2011),
la maladie de Parkinson (Wen et al., 2011), l'ischémie cérébrale (Wiklund et al., 2007; Miclescu et
al., 2010; Wen et al., 2011), l'amnésie (Riha et al., 2011) et le trouble bipolaire (Naylor et al., 1981;
Narsapur et Naylor, 1983; Eroglu et Caglayan, 1997).
Plus spécifiquement, le traitement avec le BM a montré des résultats très encourageants
pour réduire le nombre d'agrégats pathologiques et induire l'amélioration du phénotype dans le

149
cas des maladies d'Alzheimer et de Huntington. En effet, le BM administré à l’apparition des
symptômes sur un modèle murin d'Alzheimer s’est avéré neuroprotecteur avec une diminution
du nombre et de la taille des plaques amyloïdes dans l'hippocampe et le cortex ainsi qu’une
amélioration des fonctions cognitives (Paban et al., 2014). Dans le cas de la maladie de Huntington,
le BM est également capable de réduire la formation d'oligomères d’huntingtine et leur
accumulation dans les neurones corticaux primaires. Son efficacité a également été démontré in
vivo chez le modèle murin R6/2 par une augmentation de la survie, un maintien du poids, une
amélioration des performances motrices et du phénotype comportemental (Sontag et al., 2012).
L'incubation de BM, à très faible concentration, a été suffisante pour réduire de manière
significative les niveaux de protéine tau, à la fois dans des cultures ex vivo de cerveau de souris
modèle de DFT et dans des modèles cellulaires. Il a modifié les niveaux de plusieurs facteurs de
l’autophagie, dont p62, suggérant que le BM est un inducteur puissant de cette voie de
dégradation des protéines. Une analyse plus approfondie des voies de signalisation induites par le
BM a suggéré un mode d'action similaire à la rapamycine (médicament classiquement utilisé pour
induire l’autophagie). Ces résultats ont été récapitulés dans un modèle de souris transgénique de
tauopathie lorsque le BM a été administré par voie orale à différentes doses pendant deux
semaines. Ces données ont donc appuyé à nouveau l'utilisation du BM comme agent
thérapeutique des maladies neurodégénératives (Congdon et al., 2012).
Le BM utilisé sur deux modèles de SLA de C. elegans et de poisson-zèbre exprimant les gènes
humains mutés de TDP-43 ou de FUS a eu un effet protecteur sur le dysfonctionnement neuronal
et le stress oxydatif (Vaccaro et al., 2012). De plus, l’utilisation du BM sur une lignée cellulaire
dérivée de neuroblastome (SH-SY5Y) a engendré une diminution de 50% le nombre d’agrégats
positifs à TDP-43 (Yamashita et al., 2009).
Malgré certaines propriétés neuroprotectrices, le BM n’a pas entrainé d’effet bénéfique sur
le modèle SOD1G93A, sans prévenir l’agrégation de la SOD1 (Lougheed et Tumbull, 2011 ; Audet et
al., 2012). Le rôle de cette drogue comme traitement efficace dans tous les contextes de SLA reste
donc controversé.

En raison des effets neuroprotecteurs du BM et de sa capacité à réduire la formation

d’agrégats protéiques pathologiques et à améliorer les phénotypes cognitifs et moteurs dans
diverses maladies neurodégénératives, nous avons choisi de le tester dans notre modèle de SLA-
UBQLN2. Après administration intrapéritonéale de BM chez la souris surexprimant l’ubiquiline 2
humaine (sauvage ou mutée), nous avons observé deux effets opposés (figure 61). Chez les souris
surexprimant la protéine sauvage, traitées avec le BM, le nombre d’agrégats a été réduit par

150
rapport à celles non traitées (injection de NaCl). Ceci est probablement dû à la morphologie de
petite taille et à la localisation intracellulaire des agrégats positifs pour l’ubiquiline 2. En revanche,
le traitement n’a pas été assez efficace pour induire une disparition complète des agrégats par
rapport aux souris contrôles. De manière surprenante, le BM a augmenté la présence d'inclusions
chez les souris surexprimant l’ubiquiline 2 humaine mutée. Ce résultat pourrait s'expliquer par le
fait que le BM favoriserait la formation d’agrégats protéiques, induits par la surexpression de la
forme mutée de l’ubiquiline 2, en créant un environnement favorable à l’agrégation. L’étude des
phénomènes observés dans notre modèle de souris aiderait à comprendre pourquoi le BM n’a pas
été efficace dans les modèles de SLA (Audet et al., 2012) et a échoué dans l’essai clinique chez les
patients atteints de différentes formes d’Alzheimer (Gauthier et al., 2016).

7) Conclusions et perspectives
En conclusion, nous avons généré un modèle valide pour l'étude de la SLA liée à l’UBQLN2,
via le transfert de gène à l’aide d'AAV. Nous avons caractérisé ce modèle de façon approfondie,
en analysant ses altérations histologiques, ses symptômes phénotypiques et comportementaux.
Nous avons essayé de comprendre le mécanisme par lequel la mutation de l’ubiquiline 2 est
capable d'induire la maladie et nous avons testé l'effet d'un médicament approuvé par la FDA
contre la formation d’agrégats. Tous les résultats obtenus confirment que ce modèle pourrait être
utile pour comprendre le mécanisme pathologique responsable de la maladie, mais aussi pour
tester rapidement l’effet de possibles agents thérapeutiques sur la formation des agrégats.
L'utilisation du vecteur AAV représente un outil polyvalent permettant de moduler la
maladie et d’analyser de nombreux aspects encore inconnus, telle que la contribution spécifique
de certains types cellulaires, de tissus ou d’organes dans la pathogénèse. Avec cette méthode,
nous pourrons ainsi suivre et étudier la cinétique de formation des agrégats in vivo.
La génération de ce modèle et des autres modèles pour la SLA-UBQLN2 ainsi que les études
du rôle physiologique de l’ubiquiline 2, sont des étapes clés dans la compréhension des
mécanismes responsables de la maladie.
L’identification des mécanismes impliqués aidera à développer de nouvelles thérapies et les
modèles qui récapitulent fidèlement les aspects clés de la maladie seront des outils précieux pour
atteindre ces objectifs.
En perspective, ce modèle sera utilisé pour tester de nouvelles thérapies. Comme première
étape, un criblage de molécules thérapeutiques in vitro sera effectué pour identifier des candidats
qui seront évalués in vivo. Plus concrètement, un modèle cellulaire sera produit par transduction
de MNs dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à l’aide de vecteurs AAV10

151
exprimant l’ubiquiline 2 mutée. Un criblage de composés thérapeutiques sera ensuite effectué
pour déterminer leur capacité à réduire les agrégats positifs à l’ubiquiline 2. Une fois identifiés, les
composés efficaces seront administrés chez les souris injectées avec l’AAV10-Ub2Mut.

152
BIBLIOGRAPHIE

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« ALSoD database » : http://alsod.iop.kcl.ac.uk/

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ANNEXE

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Original Article

A New AAV10-U7-Mediated Gene Therapy

Prolongs Survival and Restores Function
in an ALS Mouse Model
Maria Grazia Biferi,1 Mathilde Cohen-Tannoudji,1 Ambra Cappelletto,1 Benoit Giroux,1 Marianne Roda,1
Stéphanie Astord,1 Thibaut Marais,1 Corinne Bos,1 Thomas Voit,3 Arnaud Ferry,1,2 and Martine Barkats1
1Centre of Research in Myology (CRM), Institut de Myologie, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, Inserm UMRS974, GH Pitié Salpêtrière, Paris 75013, France;
2Sorbonne Paris Cité, Université Paris Descartes, Paris 75006, France; 3NIHR GOSH Biomedical Research Centre, Great Ormond Street Institute of Child Health, University
College London, and Great Ormond Street Hospital Trust, London WC1N 1EH, UK

One of the most promising therapeutic approaches for familial revealed the absence of serious adverse effects, highlighting the feasi-
amyotrophic lateral sclerosis linked to superoxide dismutase 1 bility of this strategy in humans.7 Significant SOD1 reduction has also
(SOD1) is the suppression of toxic mutant SOD1 in the affected been provided by injection of lentiviral vectors encoding short hairpin
tissues. Here, we report an innovative molecular strategy RNA targeting human SOD1 (SOD1-shRNA) into the spinal cord
for inducing substantial, widespread, and sustained reduction parenchyma or multiple muscle groups of SOD1G93A mice.8,9 These
of mutant human SOD1 (hSOD1) levels throughout the body approaches resulted in a substantial increase in ALS mouse survival,
of SOD1G93A mice, leading to therapeutic effects in animals. but their clinical applicability remains questionable, due notably to
Adeno-associated virus serotype rh10 vectors (AAV10) were the difficult translation of the vector administration routes to patients.
used to mediate exon skipping of the hSOD1 pre-mRNA by
expression of exon-2-targeted antisense sequences embedded More recently, the self-complementary adeno-associated virus (AAV)
in a modified U7 small-nuclear RNA (AAV10-U7-hSOD). Skip- serotype 9 vector was used to deliver SOD1-shRNA in ALS mice after
ping of hSOD1 exon 2 led to the generation of a premature a single intravascular injection.10 This systemic AAV9 approach was
termination codon, inducing production of a deleted transcript successful in extending the lifespan of SOD1G93A mice injected at birth
that was subsequently degraded by the activation of nonsense- or later.10 Another study using AAV serotype rh10 to express artificial
mediated decay. Combined intravenous and intracerebroven- microRNA (miRNA) also showed slowing of disease progression and
tricular delivery of AAV10-U7-hSOD increased the survival extended survival in SOD1G93A mice intrathecally injected with the vec-
of SOD1G93A mice injected either at birth or at 50 days of age tor at 65 days of age.11 These and other12,13 recent AAV studies have
(by 92% and 58%, respectively) and prevented weight loss and provided encouraging therapeutic results and the potential of feasible
the decline of neuromuscular function. This study reports the translation to the clinic. However, these approaches have only led to
effectiveness of an exon-skipping approach in SOD1-ALS incomplete rescue and better SOD1-silencing approaches in mice are
mice, supporting the translation of this technology to the treat- still needed to provide promising treatment options to patients.
ment of this as yet incurable disease.
Transcriptional SOD1 silencing can be achieved by skipping of a
INTRODUCTION constitutive SOD1 exon (exon skipping) using ASOs complementary
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common adult-onset to splicing regulatory elements on the primary transcript. The result-
motor neuron (MN) disorder, characterized by MN degeneration, severe ing deleted mRNA, containing a premature termination codon, is
paralysis, and death within 3–5 years after diagnosis.1 No treatment is then degraded by the endogenous cellular surveillance nonsense-
currently available, except the drug Riluzole, which offers only a modest mediated decay pathway.14,15
survival benefit.2 ALS is epidemiologically classified into sporadic (90%–
95%) and familial (5%–10%) forms (fALS);3 approximately 12% of fALS Here, we report the high therapeutic potential of this exon-skipping
cases are caused by over 180 mutations in the superoxide dismutase 1 strategy in both newborn (P1) and adult (P50) SOD1G93A mice using
(SOD1) gene, conferring a toxic gain of function to the mutant protein.4,5

Continuous infusion of antisense oligonucleotides (ASOs) into the Received 15 December 2016; accepted 25 May 2017;
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brain ventricles has been reported as a promising approach to induce
Correspondence: Maria Grazia Biferi, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06,
significant SOD1 silencing in SOD1G93A rats, but only 10 days of sur-
Inserm UMRS974, Centre of Research in Myology (CRM), Institut de Myologie,
vival extension was achieved with infusion prior to disease onset.6 A GH Pitié Salpêtrière, Paris 75013, France.
phase I clinical study using intrathecally delivered ASOs to patients E-mail: [email protected]

Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017 ª 2017 The American Society of Gene and Cell Therapy. 1
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Molecular Therapy

Figure 1. hSOD1 Exon Skipping Reduces mRNA Levels In Vitro

(A) Schematic representation of E2 skipping in the hSOD1 pre-mRNA induced by specific antisense oligonucleotides (hSOD1-ASO1 to 5). The 9,310-bp hSOD1 gene (Gene ID
6647) comprises five exons separated by four introns, encoding a 153-aa protein. E2 skipping leads to the formation of a premature termination codon (PTC) in exon 4 of the
hSOD1-skipped mRNA (DE2 hSOD1), 92 nt upstream of the last exon/exon junction (exon 4-exon 5), inducing its degradation by nonsense-mediated decay (NMD) activation.
(B) Semiquantitative RT-PCR analysis of HEK293T cells transfected with the five hSOD1-ASOs, showing DE2 hSOD1 mRNA production. H2O, non-transfected cells (NT), and
a scrambled control (ASO-CTR) were used as negative controls. Arrowheads indicate full-length (355 bp) and DE2 (258 bp) hSOD1 mRNA forms (the shown gel is one replicate
of the experiment shown in Figure S1B). The bar graph on the right represents results of qRT-PCR analysis of full-length hSOD1 mRNA expression levels from another set of
ASO-transfected HEK293T cells. hSOD1 mRNA was amplified using a specific probe mapping within exon 1-2 of the human SOD1 gene. Results correspond to the percent
reduction of full-length hSOD1 mRNA induced by the different ASOs relative to NT. Data are expressed as the mean ± SEM of four independent transfection experiments.
Differences between groups were analyzed by one-way ANOVA analysis, followed by Tukey’s post hoc test (**p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001).

the administration of ASOs against mutant human SOD1 (hSOD1) treated mice. Finally, AAV10-U7-hSOD1 delivery prevented weight
inserted in an AAV10-U7 vector (AAV10-U7-hSOD1). The AAV loss and preserved motor function and skeletal muscle force.
vector was co-injected into the central nervous system and the periph-
eral organs, combining intravenous (i.v.) and intracerebroventric- RESULTS
ular (i.c.v.) injections. This gene therapy approach induced efficient Specific Antisense Sequences Promote hSOD1 Exon Skipping
hSOD1 exon skipping in the spinal cord, resulting in a large reduction In Vitro
of hSOD1 mRNA and protein levels. SOD1G93A mice survival was We rationally designed five steric, blocking RNA-based ASOs that
prolonged, with a mean increase in life expectancy of 92% and 58% masked the splicing acceptor site (SA) in intron 1 or exonic splicing
for mice injected either at birth or 50 days of age, respectively. Disease enhancer sequences (ESEs)16 in exon 2 (E2) to promote efficient E2
onset was also delayed by 95 and 63 days, respectively, relative to un- skipping (Figures 1A and S1A). Skipping of hSOD1 E2 generates a

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frameshift in the mRNA transcript, with production of a premature Co-i.v./i.c.v. Administration of AAV10-U7-hSOD1 in Newborn
stop codon in exon 4 (E4), 92 nt upstream of the E4-E5 junction (Fig- SOD1G93A Mice Prolongs Survival and Delays Disease Onset
ure 1A). The deleted transcript (DE2 hSOD1) is a likely substrate To test the therapeutic efficacy of hSOD1 exon skipping, we injected
for the endogenous cellular surveillance nonsense-mediated decay SOD1G93A mice on postnatal day 1 (PND1) with 4.5 ! 1014 vg/kg
pathway and is subsequently degraded because the premature stop of AAV10-U7-hSOD1 (n = 15) or AAV10-U7-CTR vectors (n =
codon is located greater than 55 nt upstream of the last exon-exon 17) co-injected into the temporal vein (i.v., 4 ! 1014 vg/kg) and lateral
junction.17 ventricles (i.c.v., 5 ! 1013 vg/kg) (co-i.v./i.c.v.) (Figure 3A). All
AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mice survived substantially
The ASOs were chemically modified (20 -O-methyl phosphoro- longer than did non-injected (NI) (n = 12) or AAV10-U7-CTR-
thioate [20 OMePS]) to increase their stability, resist nuclease and injected mice (239 days versus 118 days or 125 days, respectively;
RNase H degradation,18 and their ability to promote E2 skipping p < 0.0001), for an extension of the median lifespan of 121 and
was evaluated (hSOD1-ASO). A scrambled fluorescently (FAM)- 114 days, respectively. No statistically significant difference was found
labeled ASO was used as control (ASO-CTR). After ASO transfec- between the lifespans of AAV10-U7-CTR-injected and NI mice
tion into HEK293T cells, RT-PCR analysis revealed a 258-nt band (Figure 3B).
corresponding to the DE2 hSOD1 mRNA variant in the samples
transfected with hSOD1-ASO and a 355-nt product corresponding The mean lifespan of AAV10-U7-hSOD1-injected mice was 95%
to the complete hSOD1 mRNA in all samples (Figures S1B and and 92% longer than that of NI or AAV10-U7-CTR-injected mice,
S1C). Although all ASOs resulted in a substantial reduction of respectively (Figure 3C).
hSOD1 mRNA levels relative to non-transfected cells, ASO1 and
ASO4 showed the highest efficiency (Figure 1B). These two ASOs, AAV10-U7-hSOD1 delivery also slowed the weight loss observed in
targeting different ESE regions in E2, were both used in the following NI SOD1G93A mice at the end stage (23.9 ± 1.1 g versus 20.5 ±
studies to expand the masked sequence and maximize steric hin- 0.9 g at 17 weeks, p < 0.05) (Figure 3D), and, importantly, AAV10-
drance to splicing factors. U7-hSOD1-injected mice gained weight until "25 weeks of age, at
which point weight reached a plateau. The weights of AAV10-treated
AAV10-U7-Mediated Delivery of Antisense Sequences in SOD1G93A mice and wild-type (WT) mice were statistically signifi-
SOD1G93A Mice Reduces hSOD1 Protein and mRNA Levels cantly different at 25 weeks of age (25.6 ± 1.4 g versus 30.7 ± 1.4 g,
We sub-cloned the two AS sequences corresponding to ASO1 respectively; p < 0.05) (Figure 3D).
and ASO4 into the optimized U7-snRNA cassette (U7-AS-1/AS-4),
previously described by Schumperli et al.19, to protect them from AAV10-U7-hSOD1 delivery significantly delayed disease onset, based
degradation. The embedding of ASOs into the U7snRNP particle on the age of peak body weight, by "102 and 95 days relative to NI
has been reported to improve their nuclear entry and incorporation and AAV10-U7-CTR-injected mice, respectively (199.5 days versus
into the spliceosome and increase their stability in vivo.19,20 We 97.5 days and 104.5 days; p < 0.0001) (Figure 3E). No statistically
then engineered the U7-AS-1/AS-4 cassette or a control AS, previ- significant difference was observed between disease onset of
ously tested in vivo,21 into the AAV backbone, and the corresponding AAV10-U7-CTR-injected and NI mice (Figure 3E). The mean disease
AAV10 vectors were produced (AAV10-U7-hSOD1 or AAV10-U7- progression, defined as the time from disease onset to death, was
CTR) (Figure 2A). significantly delayed by 14 days in AAV10-U7-hSOD1-injected
mice (36.6 ± 4.9 days) relative to NI mice (23.1 ± 1.7 days,
We locally injected the AAV10-U7-hSOD1 or the AAV10-U7-CTR p < 0.05) and AAV10-U7-CTR-injected mice (22.8 ± 3.7 days,
vectors (4.7 ! 1012 viral genome [vg]/kg, two sites, 4.8 ! 1010 per p < 0.05) (Figure 3F).
site in 5 mL) into the lumbar spinal cord of 50-day-old SOD1G93A
mice to analyze the efficiency of AAV10-U7-hSOD1 in reducing Co-i.v./i.c.v. Administration of AAV10-U7-hSOD1 in Newborn
hSOD1 mRNA and protein levels in vivo. As expected, we found SOD1G93A Mice Reduces hSOD1 Levels and Preserves
the DE2 hSOD1 mRNA variant in the spinal cords of AAV10- Pathological Signs
U7-hSOD1-injected animals 1 month after injection, with a more We analyzed the efficacy of E2 skipping for the silencing of hSOD1 in
than 80% reduction of full-length hSOD1 mRNA for each injected the spinal cords of SOD1G93A mice, co-i.v./i.c.v. injected at birth, both
mouse (Figure 2B) and a 70% average reduction in hSOD1 protein at 112 days of age (n = 3) and at the end stage (n = 3) (Figure S3). We
relative to AAV10-U7-CTR-injected animals (Figure 2C). Due to observed a significant reduction of full-length hSOD1 mRNA at both
the high degree of homology between hSOD1 and murine SOD1 ages relative to those of NI mice (76% and 65% reduction at 112 days
sequences, ASOs were designed to be human specific, with AS-1/ of age and end stage, respectively; p < 0.0001) and AAV10-U7-CTR-
AS-4 presenting a total of ten mismatches to the mouse SOD1 injected mice (77% and 66% reduction at 112 days of age and end
mRNA (Figure S2A). Accordingly, the endogenous SOD1 pro- stage, respectively; p < 0.0001) (Figure S3A). The levels of hSOD1
tein levels were unchanged in all injected animals, confirming protein were also reduced by 71% and 66% in the spinal cord of
the specificity of AAV10-U7-hSOD1 for the hSOD1 form (Figures AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mice at 112 days of age
S2B and S2C). relative to those of NI mice and AAV10-U7-CTR-injected mice,

Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017 3

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Molecular Therapy

Figure 2. AAV-U7-Mediated hSOD1 Exon Skipping Reduces mRNA and Protein Levels In Vivo
(A) Design of the AAV vectors used to target hSOD1 (AAV10-U7-hSOD1) or control (AAV10-U7-CTR) sequences. The antisense sequences (ASs) corresponding to
ASO1 and ASO4 were embedded into the optimized human U7 small nuclear RNA (snRNA)19,20 and cloned between two AAV inverted terminal repeats (ITRs). (B)
The upper panel corresponds to a semiquantitative RT-PCR analysis of mRNA extracted from the spinal cord (SC) of SOD1G93A mice, in which the lumbar SC was
injected with 4.7 ! 1012 vg/kg of AAV10-U7-hSOD1 (n = 3) or AAV10-U7-CTR (n = 2). The lower panel shows results of the corresponding qRT-PCR analysis,
showing lower levels of full-length hSOD1 mRNA in SC from AAV10-U7-hSOD1-injected mice than AAV10-U7-CTR-injected controls. Data are expressed as the
mean ± SEM. (C) Western blot (WB) analysis of hSOD1 protein expression in SOD1G93A mice, in which the SC was injected with AAV10-U7-hSOD1 (n = 3) or
AAV10-U7-CTR (n = 3) (4.7 ! 1012 vg/kg). Antibody specificity for the human form of SOD1 was demonstrated by the absence of signal in protein extracts from WT
mice. a-Tubulin was used as a loading control. The lower panel corresponds to the densitometric analysis of WB results, showing the significant reduction of
hSOD1 levels in the AAV10-U7-hSOD1-injected SCs. Values are expressed as the mean ± SEM, and differences between groups were analyzed by the Student’s t
test (**p < 0.01).

respectively (p < 0.05). However, we detected no significant difference protein, we detected no protein signal at the presumed size of the
in hSOD1 protein levels at the end stage among AAV10-U7-hSOD1- truncated protein (6.05 kDa) (Figure S4A). As expected, with the
injected, AAV10-U7-CTR-injected, or NI animals, despite the sig- same antibody, we confirmed that the levels of the hSOD1 protein
nificant decrease of mRNA, suggesting progressive accumulation of were reduced by 76% in AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A
residual amounts of mutant hSOD1 protein in the treated mice mice relative to those of NI mice at 112 days of age (p < 0.0001)
(Figure S3B). (Figure S4B).

We investigated the possible production of a protein from the Double-immunofluorescence analysis of spinal cord sections using
truncated SOD1 mRNA after the prolonged expression of AAV10- antibodies against hSOD1 and either choline acetyl transferase
U7-hSOD1 in the spinal cords of SOD1G93A mice injected at birth (ChAT) (a marker of MNs) or glial fibrillary acid protein (GFAP)
(n = 4) (Figure S4). If the DE2 hSOD1 mRNA is translated into protein, (a marker of astrocytes) confirmed the reduction of hSOD1 protein
the latter will have a different amino acid sequence downstream of the levels in individual MNs from AAV10-U7-hSOD1-injected mice at
end of exon 1 and will be made of 55 amino acids. Using the hSOD1- 112 days of age, but also in astrocytes, another cell type involved in
specific antibody, recognizing the N-terminal portion of the hSOD1 ALS pathogenesis22 (Figure S5).

4 Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017

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A Intracerebroventricular B C
(ICV)
NI Mean survival
AAV10-U7-CTR

Intravenous AAV10-U7-hSOD1

Percent survival
(IV) ****

Days
NI AAV10 AAV10
PND1 SOD1G93A mouse U7-CTR U7-hSOD1
Days

D E F
Disease duration
WT NI
NI AAV10-U7-CTR
AAV10-U7-CTR AAV10-U7-hSOD1
Percent unaffected

AAV10-U7-hSOD1
Body weight (g)

Days
NI AAV10 AAV10
U7-CTR U7-hSOD1
Weeks Days

Figure 3. Combined i.v./i.c.v. Delivery of AAV10-U7-hSOD1 Prolongs Survival in Neonatal SOD1G93A Mice
(A) Schematic representation of AAV10 delivery into the temporal vein (i.v.) and lateral ventricles (i.c.v.) (co-i.v./i.c.v.) of SOD1G93A mice on PND1. The mice were injected with
a total dose of 4.5 ! 1014 vg/kg of AAV10-U7-hSOD1 or AAV10-U7-CTR vectors (i.v., 4 ! 1014 vg/kg, and i.c.v., 5 ! 1013 vg/kg). (B) Kaplan-Meier survival curves of
SOD1G93A mice co-i.v./i.c.v. injected with either AAV10-U7-SOD1 (red, n = 15) or AAV10-U7-CTR (green, n = 17) and NI mice (blue, n = 12). Differences between the curves
were analyzed using the log rank Mantel-Cox test, showing a significant difference between AAV10-U7-SOD1-injected mice and either AAV10-U7-CTR-injected or NI mice
(****p < 0.0001). (C) Bar graph indicating a significant difference between the mean survival of AAV10-U7-SOD1- and either AAV10-U7-CTR-injected mice or NI mice (235.6 ±
11 days versus 120.1 ± 2.3 days and 122.9 ± 1.6 days, respectively). Data are expressed as the mean ± SEM, and differences between groups were analyzed by one-way
ANOVA analysis followed by Tukey’s post hoc test (****p < 0.0001). (D) Body weight curves of AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mice (red) compared to AAV10-U7-
CTR-injected SOD1G93A mice (green), NI SOD1G93A mice (blue), and WT mice (pink) (n = 8 in each sex-balanced group, Student’s t test, *p < 0.05). (E) Kaplan-Meier curves
showing the significant delay in median disease onset (based on the age at body-weight peak) in mice injected with either AAV10-U7-hSOD1 (red, n = 14) relative to NI mice
(blue, n = 8) and AAV10-U7-CTR-injected mice (green, n = 14). Differences between the curves were analyzed by the log rank Mantel-Cox test (****p < 0.0001). (F) Mean
duration of disease of mice injected with either AAV10-U7-hSOD1 (red, n = 14) or AAV10-U7-CTR (green, n = 14) and of NI mice (blue, n = 8), showing the significant
extension of disease duration in the AAV10-U7-hSOD1-treated animals. Results are expressed as the mean ± SEM, and the differences between groups were determined by
one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test (*p < 0.05).

Skeletal muscles have also been shown to be involved in the pathogen- glial cells (38.3 ± 2.2 versus 151.1 ± 6.0 and 138.5 ± 4.7 for NI and
esis of ALS;23 thus, we further quantified the level of hSOD1 silencing AAV10-U7-CTR, respectively; p < 0.0001) (Figures 4A and 4B, lower
in the triceps muscle. We found 40% lower hSOD1 mRNA levels in panels).
the triceps muscles of AAV10-U7-hSOD-injected SOD1G93A mice
than in those of NI or AAV10-U7-CTR-injected mice (n = 3; p < We assessed skeletal muscle denervation by analyzing the
0.01) (Figure S6A). occupancy of neuromuscular junctions (NMJs) in AAV10-U7-
hSOD1-injected SOD1G93A mice, NI SOD1G93A mice, and WT
We then quantified the main neuropathological features of ALS mice at 112 days by double staining of the extensor digitorum
observed in SOD1G93A mice, such as MN loss, astrogliosis, and micro- longus (EDL) muscles for bungarotoxin (BTX) (binding to the
glia activation.24 AAV10-U7-hSOD1 delivery significantly prevented nicotinic acetylcholine receptor of NMJ) and neurofilament (NF)
ChAT+ MN degeneration at 112 days of age (11.8 ± 0.4 versus 9.7 ± (fibrillar component of the axons) (Figure 4C). After AAV10-
0.2 and 8.7 ± 0.2, for NI and AAV10-U7-CTR delivery, respectively; U7-hSOD1 injection, 64.0 ± 3.2% of endplates were innervated
p < 0.0001) (Figures 4A and 4B, upper panels), reduced the intensity in SOD1G93A mice, with no significant difference to WT mice
of GFAP fluorescence (astrocytosis) (27.7 ± 1.8 versus 54.0 ± 1.9 and (80.3 ± 7.0%) (Figure 4D, left panel). Conversely, NI SOD1G93A
49.5 ± 2.3 for NI and AAV10-U7-CTR, respectively; p < 0.001) mice presented 31.5 ± 8.5% of innervated endplates and were
(Figures 4A and 4B, middle panels), and decreased the number of significantly different from both AAV-treated and WT mice (p <
ionized calcium-binding adaptor molecule 1 positive (Iba1+) micro- 0.05 and p < 0.01; respectively) (Figure 4D, left panel). Endplates’

Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017 5

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Model, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.05.017

Molecular Therapy

A B C

E F

Figure 4. AAV10-U7-hSOD1 Injection in Newborn SOD1G93A Mice Rescues the ALS Phenotype
(A) Representative transverse sections of the ventral horn of the lumbar spinal cord from SOD1G93A mice injected at birth with AAV10-U7-hSOD1 or AAV10-U7-CTR and
processed for immunofluorescence at 112 days of age using anti-ChAT (upper panels), anti-GFAP (middle panels), or anti-Iba1 (lower panels) antibodies. Scale bar, 25 or
75 mm, as indicated. (B) Quantitative analysis of the number of ChAT-positive motor neurons (upper panel, n = 6, 50 sections per mouse), the mean fluorescence intensity of
GFAP immunostaining (middle panel, n = 6, three sections per mouse), and the number of Iba1-positive cells (lower panel, n = 6, three sections per mouse) in AAV10-U7-
hSOD1- or AAV10-U7-CTR-injected SOD1G93A mice, NI SOD1G93A mice, and WT mice. Data are expressed as the mean ± SEM. ****p < 0.0001, one-way ANOVA followed
by Tukey’s post hoc test. (C) Representative NMJ of the EDL muscles from WT mice and SOD1G93A mice, injected at birth with AAV10-U7-hSOD1 or NI, and analyzed for
whole mount immunofluorescence at 112 days. Endplates were identified by 594-conjugated BTX (red); terminal axons were identified by anti-NF antibody (green). Full
arrowheads indicate innervated endplates; empty arrowheads indicate denervated endplates. Scale bar, 25 mm. (D) Quantification of innervated endplates (left panel) and
endplate areas (right panel) in WT, AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mice, or NI SOD1G93A mice (n = 4; "50 BTX-positive endplates per animal were randomly chosen
and analyzed). Data are expressed as the mean ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test. (E) Representative transverse
sections of the TA muscle from AAV10-U7-hSOD1- or AAV10-U7-CTR-injected SOD1G93A mice processed for anti-laminin immunofluorescence at 112 days of age. Scale
bar, 200 mm. (F) Frequency distribution curves of myofiber areas in the TA muscle of AAV10-U7-hSOD1-or AAV10-U7-CTR-injected SOD1G93A mice, NI mice, and WT mice.
N = 3 mice per group. Data are expressed as the mean ± SEM. **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p < 0.0001 for NI compared to WT; ###p < 0.001 and ####p < 0.0001 for
AAV10-U7-CTR compared to WT; xp < 0.05 and xxxxp < 0.0001 for AAV10-U7-hSOD1 compared to NI; {p < 0.05 and {{{{p < 0.0001 for AAV10-U7-hSOD1 compared to
AAV10-U7-CTR; two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test (treatment and frequency).

surface was preserved in AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A Furthermore, measurement of tibialis anterior (TA) muscle sections
mice (480.5 ± 50.52 mm2) compared with NI and WT animals showed a 53% greater mean section area in AAV10-U7-hSOD1-
(324.3 ± 12.48 mm2, p < 0.05 and 580.3 ± 17.13 mm2) (Figure 4D, treated mice (4.6 ! 106 ± 0.3 ! 106 mm2) than in either AAV10-
right panel). U7-CTR-injected (3.0 ! 106 ± 0.2 ! 106 mm2; p < 0.05) or NI

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Figure 5. Combined i.v./i.c.v. Injection of AAV10-U7-hSOD1 Rescues Survival of Adult SOD1G93A Mice
(A) Kaplan-Meier survival curves of SOD1G93A mice co-i.v./i.c.v. injected at PND50 with AAV10-U7-SOD1 (4.5 ! 1014 vg/kg total, n = 25) or NI (n = 24), sex-
balanced group. The median lifespan was significantly longer for mice treated with AAV10-U7-hSOD1 than for NI mice (186 days versus 123 days; ****p < 0.0001,
log rank Mantel-Cox test). (B) Comparison of the mean survival of AAV10-U7-SOD1-injected (red, n = 25) and NI mice (blue, n = 24) (195 ± 6.7 days versus
122.8 ± 0.9 days). Data are expressed as the mean ± SEM, ****p < 0.0001, Student’s t test. (C) Comparison of the body weight curves of AAV10-U7-hSOD1-
injected and NI SOD1G93A mice (n = 24 per sex-balanced group). **p < 0.01; ****p < 0.0001, Student’s t test. (D) Kaplan-Meier curves illustrating the onset of
disease, defined by the age at the peak body weight, for AAV10-U7-hSOD1-injected (red, n = 24) and NI (blue, n = 24) SOD1G93A mice. The median time of disease
onset was significantly delayed for the AAV10-U7-hSOD1-injected mice relative to that of NI mice. Differences between the curves were analyzed by the log rank
Mantel-Cox test; ****p < 0.0001.

(3.0 ! 106 ± 0.4 ! 106 mm2; p < 0.05) mice (Figure 4E). The frequency vation is already present,27,28 by co-i.v./i.c.v. injecting 50-day-old
distribution curves of myofiber diameters, determined by anti-lami- SOD1G93A mice (n = 25) with the vector (i.v., 4.2 ! 1014 vg/kg and
nin immunofluorescence analysis, revealed a shift toward larger 3.0 ! 1013 vg/kg, respectively). The median survival of AAV10-U7-
fibers in the TA of AAV10-U7-hSOD1-treated mice relative to hSOD1-treated mice was extended by 63 days relative to NI controls
controls, with a distribution of small caliber fibers similar to that of (n = 24) (186 days versus 123 days; p < 0.0001) (Figure 5A), and the
WT mice (Figure 4F). The alteration in muscle fiber composition mean life expectancy was extended by 58% (195.0 ± 6.7 days versus
induced by denervation25 was also prevented in the AAV10-U7- 122.8 ± 0.9 days; p < 0.0001) (Figure 5B). AAV10-U7-hSOD1 delivery
hSOD1-treated SOD1G93A mice, as revealed by immunostaining for also significantly prevented weight loss starting at 15 weeks of age in NI
type IIa myosin heavy chain (MHC-IIa), representing the myosin iso- SOD1G93A mice (24.2 ± 0.6 g versus 21.0 ± 0.6 g, p < 0.01) (Figure 5C).
form predominantly expressed in TA fast fibers of SOD1G93A mice, Disease onset was delayed by 71.5 days in the AAV10-U7-hSOD1-in-
compared to type IIb or IIx MHC isoforms.26 The treatment signifi- jected mice relative to the NI mice (165.0 days versus 93.5 days; p <
cantly reduced the number of MHC-IIa-positive fibers (7.8 ± 0.9% of 0.0001) (Figure 5D). There was no significant increase in the duration
total fibers) relative to NI and AAV10-U7-CTL-injected mice (13.0 ± of disease progression between AAV10-U7-hSOD1-injected mice and
1.2% and 13.0 ± 1.3%, respectively) (Figure S6B). NI mice (31.7 ± 1.8 days and 28.2 ± 3 days, respectively; p = 0.33).

AAV10-U7-hSOD1-Mediated Gene Therapy Rescues 50-Day-Old Widespread AAV10-U7-hSOD1-Mediated hSOD1 Suppression

ALS Mice Survival Delays Disease Signs in Adult SOD1G93A Mice
We further investigated the potential therapeutic effects of AAV10-U7- We observed a significant reduction of hSOD1 mRNA and protein
hSOD1-mediated SOD1 silencing in adult mice, when muscle dener- levels in both the CNS and peripheral organs of mice injected with

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Molecular Therapy

A B

C D

Figure 6. Combined i.v./i.c.v. Injection of AAV10-U7-hSOD1 Preserves Neuromuscular Function in Adult SOD1G93A Mice
(A) Photographs illustrating the phenotype of a NI SOD1G93A mouse at 124 days of age displaying kyphosis, closed eyes, self-grooming defects, and lower limb paralysis
(upper panel), and of a 174-day-old AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mouse (whose phenotype was similar to WT mice) (lower panel). (B) Absolute and specific
maximal forces in response to muscle stimulation (direct stimulation), and maximal activation capacity that was a functional index of neuromuscular transmission measured in
112-day-old AAV10-U7-hSOD1-injected SOD1G93A mice, age-matched WT mice, and 112-day-old NI SOD1G93A mice (n = 3 per group). Data are expressed as the mean ±
SEM. **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001, one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test. (C) Grip strength was assessed twice a week from the day of treatment in
injected (red) and NI (blue) SOD1G93A mice (n = 24 per group) as well as in age- and sex-matched WT animals (pink, n = 10). Data are expressed as the mean per week ± SEM.
The difference between injected and NI mice was statistically significant at 15 weeks of age (*p < 0.05, Student’s t test). (D) Spontaneous motor activity monitored during 12 hr
overnight in AAV10-U7-hSOD-injected (n = 17), NI SOD1G93A mice (n = 14), and WT mice (n = 16) (sex-balanced groups) at 120 days of age. The analyzed parameters were
the time spent moving (left panel), distance covered (middle panel) (cm), and number of rearings (right panel). Individual data for WT (circles), NI (squares), and AAV10-U7-
hSOD1 (triangles) are indicated, as well as the mean values ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001, one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test.

AAV10-U7-hSOD1 at the age of 50 days (n = 3) relative to NI mice 16.0 ± 2.0% of innervated endplates; p < 0.001; Student’s t test)
(n = 3) (Figure S7), similar to the results of SOD1G93A mice in- (Figure S8B).
jected at birth and confirming the consistent targeting of multiple
tissues. Histopathological analysis of the spinal cord and TA mus- A further comparison of the contractile properties of the TA mus-
cle in SOD1G93A mice injected at the age of 50 days also showed cle from AAV10-U7-hSOD1-injected and NI mice confirmed the
35% more MNs relative to age-matched NI mice (Figure S8A) impact of hSOD1 silencing on neuromuscular function. The absolute
and a total area and frequency distribution of the myofiber maximal force generated during isometric TA muscle contraction af-
area in the TA muscle that was similar to that of WT mice ter direct stimulation of the TA muscle of 112-day-old AAV10-in-
(Figure S8C). jected mice was double that of NI mice (79.2 ± 3.1 g versus 35.6 ±
5.1 g; respectively, p < 0.01), but still lower than that of WT mice
The overall phenotype of the treated SOD1G93A mice was consider- (130.5 ± 10.0 g, p < 0.001) (Figure 6B, left panel). However, when
ably improved relative to that of NI mice, as illustrated in Figure 6A, the absolute force was normalized to muscle mass, the specific
with 36% of SOD1G93A-treated mice never showing signs of hind- maximal force was 69% greater in treated than in NI mice (1.8 ±
limb paralysis. When present, the duration of paralysis, calculated 0.1 g versus 1.1 ± 0.1 g; p < 0.01) with no statistically significant dif-
as the time from muscle rigidity onset to death, was significantly ference from that of WT mice (2.1 ± 0.1 g) (Figure 6B, middle panel).
extended by the treatment (16.7 ± 2.7 days versus 10.0 ± 1.4 days Moreover, the maximal activation capacity of the TA muscle (defined
in NI; p < 0.05; Student’s t test), although there was no increase in dis- as the percentage of force generated in response to sciatic nerve stim-
ease duration in the AAV10-U7-hSOD1-injected mice, suggesting a ulation relative to muscle stimulation) was more than 100% higher in
potential beneficial effect of the treatment on muscle innervation.9 treated mice than in NI controls (101.6 ± 3.1 versus 41.2 ± 10.0; p <
This was confirmed by the observation of NMJ protection in the 0.0001), and was not different from that of WT mice (90.3 ± 11.0)
gastrocnemius muscle of SOD1G93A mice injected with AAV10-U7- (Figure 6B, right panel), demonstrating the functional maintenance
hSOD1 at 50 days relative to NI SOD1G93A mice (48.0 ± 2.5% versus of neuromuscular transmission and functional force generation.

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We confirmed the beneficial effect of AAV10-U7-hSOD1 on neuro- Unlike chemically modified ASOs, for which the short lifetime re-
muscular function by analyzing muscle strength in a grip test, quires their regular re-injection and which can cause toxicity,7,29
showing the maintenance of muscle force over the lifespan of treated our AAV-U7 strategy to deliver AS molecules allows sustained ther-
mice that had a significantly greater grip force than did NI mice (5.6 ± apeutic effects in injected animals and reduction of neuroinflamma-
0.2 g versus 4.5 ± 0.3 g, p < 0.05) and no statistically significant differ- tory signs. The loco-regional delivery of an AAV-U7-mediated
ence from that of WT mice (6.5 ± 0.3, NS), at 15 weeks of age (Fig- exon skipping approach is currently in clinical development for
ure 6C). The analysis of spontaneous motor activity in an actimeter the restoration of truncated dystrophin in patients with Duchenne
also showed the complete rescue of the overall activity of the treated muscular dystrophy, and the first preclinical results showed a good
mice, which was significantly greater than that of NI mice and similar safety profile in large animals.30,31 The therapeutic effect observed
to that of WT mice (Figure 6D; Movie S1). In contrast, motor coor- in our study could also be due to the high AAV dose used (4.5 !
dination of the SOD1G93A mice measured by the rotarod test was 1014 vg/kg), initially tested in proof of concept studies in newborn
only partially restored by AAV10-U7-hSOD1 delivery because the la- mice and then scaled up in adult mice. Indeed, thanks to the com-
tency to fall of the injected mice was still significantly higher than that bination of the two delivery routes (i.c.v. and i.v.), it was possible to
of NI mice at 15 weeks of age (31.0 ± 3.3 s versus 21.4 ± 2.2 s, p < 0.05), inject larger AAV quantities compared to studies in which the two
but remained lower than that of WT mice (59.2 ± 2.6 s; p < 0.0001) delivery routes were used independently. Dose-finding studies will
(Figure S9). be necessary to determine the optimal AAV dosage for the transla-
tion of this therapy in large animals before translation to humans.
DISCUSSION Results from both preclinical and clinical studies showed that
In summary, we showed the efficacy of a new gene therapy higher doses allow better therapeutic effects in neuromuscular dis-
approach for silencing mutant hSOD1 expression throughout orders (C. Le Guiner, personal communication; J.R. Mendell et al.,
the body of SOD1G93A mice by AAV10 delivery of a U7-AS 2016, Am. Soc. Gene Cell Ther., conference),32 but difficulties to
construct that functionally skips exon 2 of hSOD1 out of frame. manufacture high vector doses and potential immunotoxicity
Survival and the results of functional tests exceeded any reported remain obstacles to overcome the development of whole-body
results from previous hSOD1-silencing approaches. This increased rescue strategies.
effect is likely due to the combination of a more efficient gene-
silencing method and the targeting of both central and peripheral The efficacy and the clinical feasibility of our innovative SOD1-
tissues. silencing approach highlights its considerable and realistic potential
for ALS treatment, although some concerns regarding safety and
The reduction in mutant SOD1 levels induced by AAV10-mediated the regulatory process of the combined central and peripheral
exon skipping was much greater than those reported in previous mode of AAV delivery should be considered. The therapeutic trans-
studies using AAV9- or AAV10-mediated RNA interference,10,11,13 lation of this strategy could thus benefit from a direct comparison of
with a nearly 70% reduction of hSOD1 protein levels in the spinal the three administration routes, namely, i.v., i.c.v., and co-i.v./i.c.v.,
cord. using equal AAV doses. This will imply the injection of highly
concentrated AAV productions to respect the volume limitations in
This effect is most likely due to the use of U7-delivered antisense brain ventricles compared to those of the bloodstream.
molecules, acting at the pre-mRNA level and hampering the forma-
tion of a full-length hSOD1 mRNA and its toxic product. To establish The use of AAV in clinical and preclinical studies has demonstrated
whether the described exon-skipping approach outperforms RNA- transgene expression for several years.33,34 Furthermore, to prolong
interference techniques (artificial miRNA or short hairpin RNA), a the AAV-mediated therapeutic effect, different strategies are
direct comparison of the different molecular strategies tested under currently developed to allow vector re-administration and escape
the same conditions (e.g., same amount of vectors and delivery route) to the immune response, such as exosome-embedded AAVs35 or
is needed. These studies will be helpful to identify the best method for the use of tolerogenic nanoparticles.36 In our study, we appreciated
hSOD1 reduction in vivo. the prolonged AAV-mediated effect on hSOD1 mRNA at the end
stage of treated animals (more than 250 days), although the major
Moreover, co-delivery of the therapeutic vector into the cerebrospinal part of treated animals died developing progressive signs of limb pa-
fluid and bloodstream resulted in efficient SOD1 silencing in tissues ralysis. This finite therapeutic effect observed in treated SOD1G93A
known to be involved in SOD1G93A-mediated toxicity, including mice is likely due to the accumulation of a residual amount of pro-
MNs and glial cells in the spinal cord24 and skeletal muscle fibers.23 tein produced by the unskipped mRNA, attributable to the
Appropriate biodistribution studies, determining the histotypes tar- described prion-like properties of mutant hSOD1.37,38 Complete
geted by the co-i.v./i.c.v. delivery of AAV10, will enable the identifi- SOD1 suppression could be achieved by combining several U7-AS
cation of the specific cell populations responsible for the therapeutic cassettes, as recently described by Schümperli and colleagues39 for
effect. This will be possible in the immediate future, taking advantage SMA or by coupling other methods to suppress SOD1, such as
of a tagged AAV10-U7-hSOD1 co-expressing the AS molecules and a RNA interference or single chain antibodies40 counteracting protein
reporter gene. aggregation.

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Molecular Therapy

One-third of treated mice died from atypical ALS, without any sign we performed western blot analysis with an antibody raised against
of classical limb paralysis, rather showing a weight loss phenotype the full recombinant protein and confirmed the SOD1 suppression
without ambulatory alterations, similar to the phenotype described of the total protein in AAV10-U7-hSOD1-injected mice (Figure S10).
by Stoica et al.13 This variability within the treated group could be
due to stochastic distribution of the vector, which could have prefer- Different studies have suggested the involvement of WT SOD1 mis-
entially preserved limb motor units for yet unknown reasons. folding in sporadic ALS,22,45,46 but this involvement was not confirmed
by one recently published study.47 Thus, the therapeutic application of
The antisense sequences injected in SOD1G93A mice were able to spe- AAV10-U7-mediated exon skipping may not be limited to the 12% of
cifically silence hSOD1, without affecting endogenous SOD1 levels, fALS patients who present with SOD1 mutations, but may also be
thanks to the presence of ten mismatches between the human and applicable to some sporadic patients when hSOD1 accumulation is
mouse sequences. Such discrimination will not be possible in man confirmed. This gene-silencing strategy could further be applied to a
because the described exon-skipping method will not distinguish be- number of neurological disorders caused by “gain-of-function” gene
tween the product of the mutant or WT allele. Consequently, hSOD1 mutations. In particular, because an U7-AS therapy has been demon-
exon skipping could be virtually applied to all patients with SOD1 strated to be effective in the context of a trinucleotide repeat expansion
mutations, demonstrating SOD1 accumulation. Whether the partial pathology, namely Myotonic dystrophy type 1,48 we can speculate that
knockdown of functional SOD1 is detrimental to normal cellular it could be further applied to other diseases cause by repeated nucleo-
physiology is still a controversial matter.41 SOD1 knockout mice do tide expansion and in particular to another form of ALS not linked to
not develop evident pathological phenotypes,42 and the first clinical SOD1, the most common form of dominantly inherited ALS linked to
trial using infused ASO against total hSOD1 has proven safe.7 The C9Orf72 mutations49 caused by hexanucleotide repeat expansion.
use of in vitro models, such as induced pluripotent stem-cell-derived
motor neurons,43 could help in the identification of potential toxic MATERIALS AND METHODS
manifestations after such treatment. Moreover, a possible therapeutic Animals
solution to solve this problem would be to co-administer with the Animals were maintained following the European guidelines for
AAV10-U7-hSOD1, an antisense-resistant SOD1 coding sequence. the care and use of experimental animals and approved by the
Charles Darwin N.5 Ethics Committee on Animal Experiments
Interestingly, AAV10-U7-mediated exon 2 skipping mimicked a nat- (agreement number 04830.02). High copy SOD1G93A mice, B6SJL-
ural event observed in a Canadian SOD1-linked ALS family, carrying Tg (SOD1*G93A)1Gur/J (JACKSON SN 272650), were purchased
a heterozygous or homozygous deletion in a specific ESE sequence of from Jackson Laboratory. The Colony Management Considerations
SOD1 E2.44 In this family, natural skipping of E2 reduced transcrip- published in “Working with ALS Mice” were taken into account for
tion of the mutant SOD1 allele, explaining the low penetrance of the the maintenance of the strain. SOD1G93A mice were genotyped by
mutation. This mutation was found in ALS patients or carriers who PCR and assessed for hSOD1 genome copy number. To take into
had low levels of toxic hSOD1 protein and were either weakly affected account the effect of gender on disease progression,51 sex-balanced
or unaffected.44 In these patients, an exon 3 skipped form, which was groups of animals were injected.
never detected in our experiments, was observed.
AON Design
When we tested the ASO in vitro, we observed some variability in ESE finder 3.0 software52 was used to determine the ESEs in E2 of
exon-skipping efficacy. In some experiments, such as in the one hSOD1. This software can predict binding sites for the most abundant
shown in Figure S1B, the DE hSOD1 mRNA was much more evident SR proteins (SF2/ASF, IgM-BRCA1, SC35, SRp40, and SRp55). The
in ASO2-treated cells relative to ASO1-treated cells. The thorough consensus sequence for the SA was identified in the first hSOD1 intron.
qPCR analysis on total mRNA levels (Figure 1B) showed a major ef- Five RNA-based ASOs masking these sequences on hSOD1 pre-mRNA
ficacy in reducing the full-length RNA by the ASO1 sequence that was were rationally designed. The ASOs were designed following the specific
chosen for in vivo testing. One possible explanation for the lack of rules published by Aartsma-Rus et al.53 and using the RNAstructure 5.3
correspondence between the presence of the skipped form and the software. Each ASO was designed to be 20 nt long and to have the highest
full-length hSOD1 mRNA reduction could involve other mechanisms melting temperature (Tm) and the highest binding energy between the
than nonsense-mediated decay, such as nuclear RNA surveillance ASO and the target E2 sequence. ASO 1: 50 -CCCACACCUUCACUG
pathways for decay, as described by Ward et al.14 in the example of GUCCA-30 ; ASO 2: 50 -GGCCUUCAGUCAGUCCUUUA-30 ; ASO
STAT3 exon skipping. 3: 50 -CUGGUCCAUUACUUUCCUUU-30 ; ASO 4: 50 -CCAUGCAG
GCCUUCAGUCAG-30 ; and ASO 5: 50 -CUGCUGUAUUAUCUCCA
To evaluate SOD1 knockdown, we used an antibody recognizing the AAC-30 . A scrambled ASO sequence was also selected as a negative con-
N-terminal region of the human SOD1 protein. The specific epitope is trol (ASO-CTR: 50 -GCUCAUUCGCUUUCAUUCUU-30 ).
unknown and could detect some amino acids within exon 2. In this
case, the effect on the protein would be attributed to the lack of a spe- Cell Transfections
cific portion of the protein rather than to total suppression of hSOD1 HEK293T cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine
protein. To corroborate the observed effect on protein suppression, serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin at 37# C in 5% CO2 and

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20 -O-methyl phosphorothioate (20 OMePS) ASOs were purchased iScript cDNA Synthesis kit protocol (Bio-Rad). E2 skipping in
from Eurogentec and re-suspended in H2O RNase-free water at a final the hSOD1 mRNA was revealed by RT-PCR analysis of 200 ng of
concentration of 1 mg/mL. Cells were transfected with 5 mg of each cDNA using the following primers (Eurogentec):
ASO with Oligofectamine (Invitrogen) following the manufacturer’s
instructions. The cells were harvested, 48 hr after transfection, for Primer Fw1, matching the hSOD1 exon 1: 50 -CTAGCGAGT
RNA extraction. TATGGCGAC-30 ;
Primer Rev 4/5, matching the hSOD1 exon 4-exon 5 boundary:
AAV Productions
50 -GCCAATGATGCAATGGTCTC-30 .
The DNA sequences corresponding to the two best-performing ASOs
were juxtaposed and cloned into pAAVsc_U7DTex23 (kindly pro-
For qRT-PCR (qPCR) analyses, cDNA was synthesized from 200 ng
vided by GENETHON) using PCR-mediated mutagenesis, as previ-
of RNA using the High Capacity cDNA RT Kit (Life Technologies)
ously described.20 The scAAV serotype 10 vectors were produced using
following the manufacturer’s instructions. Amplified cDNA (30 ng)
the tri-transfection method, as described in Dominguez et al.54 Vector
was mixed with 10 mL of Taqman Universal PCR Master Mix II -
titers were determined by qPCR on ITRs and expressed as vg/mL.
2X (Life Technologies) and 1 mL of FAM probe for hSOD1 (TaqMan
Gene expression assay Hs00533490m1, Life Technologies). For
AAV Injections
in vitro studies, 1 mL of VIC probe for human glyceraldehyde 3-phos-
SOD1G93A mice of 50 days of age were used for direct injection into
phate dehydrogenase (GAPDH) (Taqman Gene expression assay
the lumbar spinal cord. Mice were anesthetized by an intraperitoneal
Hs03929097_g1, Life Technologies) was used as endogenous control,
injection of a ketamine/xylazine mixture (100 mg/kg ketamine and
and for in vivo analysis, 1 mL of VIC probe for mouse hypoxanthine-
10 mg/kg xylazine; 0.1 mL per 20 g of body weight). Injections
guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) (Taqman gene expres-
were performed as reported by Raoul et al.8, and a total volume of
sion assay Mm00446968_m1, Life Technologies) was used as endog-
10 mL (two sites, 5 mL per site) containing 9.5 ! 1010 vg (4.7 !
enous control. Each sample was deposed in triplicate in a 96-well plate
1012 vg/kg) of each vector was injected per mouse.
(Applied Biosystems). The thermal cycling conditions were: 1 min at
60# C and 10 min at 95# C, followed by 39 cycles of 15 s at 95# C and
Combined i.c.v. and i.v. injections were performed in newborn
1 min at 60# C in the StepOne Plus Real Time PCR System (Applied
mice with a total of 7.8 ! 1011 vg (4.5 ! 1014 vg/kg). Each mouse
Biosystems).
was injected with 70 mL of vector solution in the temporal vein
and 10 mL in the lateral ventricles (unilateral injection, coordinates:
The relative quantity of hSOD1 mRNA was calculated using the delta
$1 mm anterior-posterior, ± 1mm medio-lateral, and $1 mm
Ct/delta Ct method, taking into account the PCR signal of the target
dorso-ventral from bregma) using a Hamilton syringe (32G and
gene transcript of each sample (normalized to the endogenous con-
30-mm length needle).
trol) relative to that of the control sample. The qPCR analyses were
performed with the StepOne software v2.3 (Life Technologies).
A total of 7.8 ! 1012 vg (4.5 ! 1014 vg/kg) was administered to
50-day-old adult mice using the combined i.c.v. and i.v. delivery
route. A roughly 20 mL viral suspension was stereotactically injected Western Blot Analyses
into the lateral ventricles ($0.2 mm anterior-posterior, ± 1 mm me- Protein extracts from cells or freshly frozen tissues (see above) were
dio-lateral, and $1.8 mm dorso-ventral from bregma). An average prepared using a lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0.5%
of 320 mL of viral solution was injected into the tail vein or the retro- sodium deoxycholate, 1% NP40, and 0.1% SDS) supplied with a pro-
bulbar sinus using an insulin syringe (29G, Terumo). tease inhibitor cocktail (Complete Mini, Roche Diagnostics). Protein
lysates were quantified using the DC protein assay kit (BioRad).
RT-PCR and qPCR Analyses 15-mg proteins (except for western blot in Figure S4) were separated
For in vivo analyses of mRNA levels, animals were anesthetized by intra- on a 12% polyacrylamide gel (Criterion XT 12% bis-Tris, Bio-Rad)
peritoneal injection of ketamine (200 mg/kg, Imalgene, Merial) and xy- and analyzed by western blot using anti-a-tubulin (T5168, Sigma-
lazine (20 mg/kg, Rompun 2%, Bayer) at 112 days of age or at the end Aldrich), anti-actin (A2066, Sigma-Aldrich), anti-human SOD1 (sc-
stage and transcardially perfused with PBS. Tissues (spinal cord, skeletal 8636, Santa Cruz Biotechnology), and anti-human SOD1 (556360,
muscle, forebrain, brain stem, cerebellum, liver, and heart) were BD Pharmingen) antibodies. Peroxidase-conjugated mouse (VWR),
removed, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at $80# C. rabbit (VWR), or goat (Life Technologies) immunoglobulin (Ig) anti-
sera were used as secondary antibodies. Western blots were developed
Total RNA was extracted either from frozen tissues or transfected using the SuperSignal West Dura kit (Life Technologies), and densito-
HEK293 cells using the NucleoSpin RNA II RNA extraction kit (Ma- metric analyses were performed using ImageJ software.
cherey-Nagel) and quantified with a DeNovix DS-11 spectophotometer.
Histological Analyses and Microscopy
For RT-PCR analyses, cDNA was synthesized from 1 mg of total RNA Animals were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine
using oligo (dT) and random hexamer primers, according to the (100 mg/kg, Imalgene, Merial) and xylazine (10 mg/kg, Ronpun

Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017 11

 Please cite this article in press as: Biferi et al., A New AAV10-U7-Mediated Gene Therapy Prolongs Survival and Restores Function in an ALS Mouse
Model, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.05.017

Molecular Therapy

2%, Bayer) at 112 days of age or at the end stage and transcardially cord sections. The myofiber area and number were quantified using
perfused with PBS. The TA and gastrocnemius muscles were removed ImageJ software. Fiber areas were calculated in square pixels and
and perpendicularly or horizontally, respectively, placed on a cork then converted into mm2. Cell counting and morphological analyses
support with tragacanth, frozen in cold isopentane, and stored at were performed in a blinded manner.
$80# C. Mice were then perfused with 4% paraformaldehyde (PFA)
(Sigma-Aldrich) in PBS. The spines were explanted and stored in NMJ Analysis
4% PFA at + 4# C for at least 24 hr, then transferred into a PBS-sucrose For whole-mount staining of the EDL muscles, the protocol described
solution (30%) and stored for at least 24 hr at 4# C. Spinal cords were in the SOP SMA.M_1.2.003 of “Treat-NMD neuromuscular network”
extracted, embedded in Tissue-Tek (OCT; Sakura Finetek), and was used with slight modifications. EDL muscles were freshly ex-
frozen in cold isopentane (between $45# C and $50# C). 14-mm-thick planted, washed in PBS, and incubated on a rotating shaker (Stuart
sections were serially cut from the whole spinal cord at $22# C. rotator SB3) for 10 min in a solution containing 500 mg/mL of 594-
conjugated BTX (Life Technologies # B-13423) in PBS. After PBS
8-mm-thick cryosections were serially cut from TA muscles using a washings, muscles were fixed with 4% PFA in PBS for 15 min and
cryostat (Leica Microsystems) at $24# C, starting from the proximal dissected under a stereomicroscope (Zeiss). Non-specific epitopes
origin, and stored at $80# C. Cryosections were fixed with 4% PFA were blocked in a solution containing 5% BSA, 0.1% Triton X-100,
and permeabilized in 0.1% Triton X-100 in PBS. Only spinal cord sec- and 10% normal goat serum for 30 min. The monoclonal antibody
tions were also subjected to antigen retrieval with citrate buffer anti-NF (1:200, MAB5254) was incubated overnight at +4# C. After
(10 mM citric acid, pH 6) at 85# C. Non-specific epitopes were blocked washings, EDL muscles were incubated with goat anti-mouse 488
in a solution containing 5% BSA (IgG free, protease free, Jackson (1:200, Life Technologies A-21121) and mounted on slides with
Laboratory), 0.1% Triton X-100 and 10% normal donkey serum FluoroMount-G.
(Millipore) (for ChAT), 10% normal goat serum (Life Technologies)
(for GFAP, Iba1, hSOD1, and Laminin), or 1% FBS (Life Technolo- 20-mm-thick cryosections were serially cut from gastrocnemius
gies) (for IIa-MHC) in PBS. The following primary antibodies were muscles using a cryostat at $24# C and stored at $80# C. Sections
used in the corresponding blocking solution overnight at +4# C: were fixed with cold acetone, incubated with 594-conjugated BTX,
goat anti-ChAT (1:50; AB144P); rabbit anti GFAP (1:250; Dako and then processed for anti-NF immunofluorescence, as described
#Z033401); rabbit anti-Iba1 (1:400, Wako #019-19741,); mouse above.
anti-hSOD1 (1:100, BD Pharmigen #556360), rabbit anti-Laminin
(1:400; Sigma-Aldrich #L9393), and mouse anti-MHC-IIa (undiluted Fluorescence images along the z axis were taken by a Leica SPE
SC-71, DSHB #AB2147165). After washing, tissues were incubated confocal microscope. Z stacks were done using ImageJ software,
with the appropriate fluorescent-conjugated secondary antibodies: and images were processed as described above. Endplates were scored
donkey anti-goat 488 (1:750, Life Technologies # A-11055, for as innervated when BTX and NF signals co-localized and were scored
ChAT), goat anti-rabbit 488 (1:750, Life Technologies # A-11008, as denervated if they showed only BTX staining. Endplate areas were
for GFAP, Iba1, and Laminin), goat anti-mouse 594 (1:200, Life Tech- measured using ImageJ software and were calculated in square pixels
nologies # A-11005 for hSOD1), or goat anti-mouse Cy3 (1:400, Jack- and then converted into mm2.
son #115165206 for MHC-IIa), combined with DAPI staining
(1:5,000, Sigma-Aldrich). Slides were mounted with FluoroMount- Analyses of Muscle Contractile Properties
G Mouning Medium (Interchim). Absolute maximal force, specific maximal force, and maximal
activation capacity were evaluated by measuring the in situ isometric
Skeletal muscle images were obtained using an epifluorescence muscle contraction of the TA in response to nerve stimulation (as
microscope (Leica Camera AG), digitized with a Nikon camera, described by Ferry et al.55). Mice were anesthetized by intraperitoneal
and acquired using MetaMorph software. Spinal cord images were administration of a pentobarbital solution (60 mg/kg). The knee
obtained using a Leica SPE confocal microscope (Leica Camera and foot were fixed with clamps and stainless steel pins, and the
AG). Photographs were contrast enhanced by applying the bright- distal tendon of the TA muscle was attached to an isometric trans-
ness/contrast regulation of the Photoshop CS 8.0 software (Macintosh ducer, dual-mode lever (Aurora Scientific) using a silk ligature, under
version, Adobe). Double immunofluorescence images were obtained constant tension. Force responses to muscle and nerve electrical stim-
by superimposing two or three single-color images of the same field. ulation (square wave pulses of 0.1-ms duration, pulse frequency of
75–150 Hz, and stimulation train of 500 ms) were successively re-
ChAT-positive motor neurons (with a diameter >20 mm) were manu- corded. Absolute maximal isometric force was determined at optimal
ally counted in the ventral horn of the cervical, thoracic, and lumbar length (length at which maximal tension was obtained during the
spinal cord segments using an epifluorescence microscope (Leica tetanus) and then normalized to the muscle mass to estimate specific
Camera AG). Astroglial activation was evaluated by measuring the maximal force. We also compared the maximal tetanic force pro-
fluorescence intensity of the GFAP staining in the gray matter of duced following stimulation of either the sciatic nerve or the muscle
the spinal cords using ImageJ software. Microglial activation was eval- directly. If neuromuscular transmission is impaired, indirect muscle
uated by counting the Iba-1-positive cells in the gray matter of spinal stimulation would be expected to produce lower maximal tetanic

12 Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017

 Please cite this article in press as: Biferi et al., A New AAV10-U7-Mediated Gene Therapy Prolongs Survival and Restores Function in an ALS Mouse
Model, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.05.017

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force values than when the muscle is stimulated via the nerve. In this analyses, Aurore Besse for her technical assistance, and Ilaria Di Emi-
study, we used this comparison as a functional index of the capacity dio for the illustrations. We also thank G. Haase and M. Crescenzi for
of the neuromuscular transmission to maximally activate the muscle critical reading of the manuscript. This work was funded by the As-
(maximal activation capacity). sociation Française contre les Myopathies (AFM), the University
Pierre et Marie Curie (UPMC), the Institut National de la Santé et
Behavioral Analyses de la Recherche Médicale (INSERM), the Centre National de la Re-
Body weight, strength, motor coordination, and spontaneous activity cherche Scientifique (CNRS), the Association Institut de Myologie
were assessed twice a week. The grip strength of the four limbs was (AIM), the Otto per Mille Waldensian Church, and the Association
evaluated using a grip strength meter (Bioseb) to determine the pour la Recherche sur la Sclérose Latérale Amyotrophique (ARSLA).
peak force (in grams) generated when the mouse is pulled back T.V. is supported by the NIHR GOSH Biomedical Research Centre.
from a metal gird. For each test, five measures per animal were re-
corded. Motor coordination was assessed using an accelerating REFERENCES
rotarod instrument (Bioseb), starting at 4 rpm/min. The time spent 1. Pasinelli, P., and Brown, R.H. (2006). Molecular biology of amyotrophic lateral
on the rotarod before falling was recorded in two runs per animal. sclerosis: insights from genetics. Nat. Rev. Neurosci. 7, 710–723.
At 17 weeks of age, the spontaneous activity of mice was assessed 2. Bensimon, G., Lacomblez, L., and Meininger, V.; ALS/Riluzole Study Group (1994). A
overnight (12 hr) using an actimeter to record the number of crossed controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral sclerosis. N. Engl. J. Med. 330,
585–591.
infrared light beams, and data were analyzed using Track software
(Bioseb). 3. Renton, A.E., Chiò, A., and Traynor, B.J. (2014). State of play in amyotrophic lateral
sclerosis genetics. Nat. Neurosci. 17, 17–23.

Survival was determined as the time when the mouse was unable to 4. Rosen, D.R., Siddique, T., Patterson, D., Figlewicz, D.A., Sapp, P., Hentati, A.,
Donaldson, D., Goto, J., O’Regan, J.P., Deng, H.X., et al. (1993). Mutations in
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Statistical Analyses 5. Scarrott, J.M., Herranz-Martín, S., Alrafiah, A.R., Shaw, P.J., and Azzouz, M. (2015).
Statistical significance was assessed using the Student’s paired t test, Current developments in gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Expert Opin.
one-way ANOVA, or two-way ANOVA, depending on the experi- Biol. Ther. 15, 935–947.
mental protocols, as stated in the figure legends. Survival and dis- 6. Smith, R.A., Miller, T.M., Yamanaka, K., Monia, B.P., Condon, T.P., Hung, G.,
ease-onset curves were compared using the log-rank Mantel-Cox Lobsiger, C.S., Ward, C.M., McAlonis-Downes, M., Wei, H., et al. (2006).
Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J. Clin. Invest.
test. Results were considered to be significant for p values under
116, 2290–2296.
0.05. All statistical tests were performed using Prism software (version
7. Miller, T.M., Pestronk, A., David, W., Rothstein, J., Simpson, E., Appel, S.H., Andres,
4.0, GraphPad). The therapeutic study of AAV-U7-hSOD1 delivery
P.L., Mahoney, K., Allred, P., Alexander, K., et al. (2013). An antisense oligonucleo-
in adult SOD1G93A mice was designed following the Prize4Life criteria tide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotro-
and the recommendations published by Scott et al.56 phic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-in-man study. Lancet Neurol. 12,
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SUPPLEMENTAL INFORMATION 8. Raoul, C., Abbas-Terki, T., Bensadoun, J.C., Guillot, S., Haase, G., Szulc, J.,
Supplemental Information includes ten figures and one movie and Henderson, C.E., and Aebischer, P. (2005). Lentiviral-mediated silencing of SOD1
through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model
can be found with this article online at http://dx.doi.org/10.1016/j. of ALS. Nat. Med. 11, 423–428.
ymthe.2017.05.017.
9. Ralph, G.S., Radcliffe, P.A., Day, D.M., Carthy, J.M., Leroux, M.A., Lee, D.C., Wong,
L.F., Bilsland, L.G., Greensmith, L., Kingsman, S.M., et al. (2005). Silencing mutant
AUTHOR CONTRIBUTIONS SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an
M.G.B. and M.B. planned, designed, interpreted the experiments, and ALS model. Nat. Med. 11, 429–433.
wrote the manuscript. T.V. intellectually contributed to the study and 10. Foust, K.D., Salazar, D.L., Likhite, S., Ferraiuolo, L., Ditsworth, D., Ilieva, H., Meyer,
supervised the revision process. M.G.B., M.C.-T., C.B., and A.C. car- K., Schmelzer, L., Braun, L., Cleveland, D.W., et al. (2013). Therapeutic AAV9-medi-
ated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in
ried out experiments. M.G.B., M.R., B.G., and T.M. maintained the models of inherited ALS. Mol. Ther. 21, 2148–2159.
animals and performed behavioral analyses and injections. M.C.-T.
11. Wang, H., Yang, B., Qiu, L., Yang, C., Kramer, J., Su, Q., Guo, Y., Brown, R.H., Jr.,
and S.A. produced the AAV vectors. A.F. performed the electrophys- Gao, G., and Xu, Z. (2014). Widespread spinal cord transduction by intrathecal injec-
iological analyses. tion of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.
Hum. Mol. Genet. 23, 668–681.
CONFLICTS OF INTEREST 12. Borel, F., Gernoux, G., Cardozo, B., Metterville, J.P., Toro Cabreja, G.C., Song, L., Su,
The authors declare no competing financial interests. Q., Gao, G.P., Elmallah, M.K., Brown, R.H., Jr., et al. (2016). Therapeutic rAAVrh10
mediated SOD1 silencing in adult SOD1(G93A) mice and nonhuman primates.
Hum. Gene Ther. 27, 19–31.
ACKNOWLEDGMENTS
13. Stoica, L., Todeasa, S.H., Cabrera, G.T., Salameh, J.S., ElMallah, M.K., Mueller, C.,
The authors sincerely thank Bruno Cadot (Center of Research in
Brown, R.H., Jr., and Sena-Esteves, M. (2016). Adeno-associated virus-delivered arti-
Myology) for his help in microscopy image acquisition, Yannick ficial microRNA extends survival and delays paralysis in an amyotrophic lateral scle-
Tanguy for taking the mouse photographs and help in the statistical rosis mouse model. Ann. Neurol. 79, 687–700.

Molecular Therapy Vol. 25 No 9 September 2017 13

 Please cite this article in press as: Biferi et al., A New AAV10-U7-Mediated Gene Therapy Prolongs Survival and Restores Function in an ALS Mouse
Model, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.05.017

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