Médecine première année

Biochimie

Les enzymes.
I. introduction, définition.

Dans les conditions du milieu de la matière vivante aucune réaction ne devrait avoir lieu avec une vitesse
appréciable, pourtant il en existe.

Les enzymes, permettent ces réactions. Une enzyme est une entité moléculaire pour la grande majorité
de nature protéique présentant une activité catalytique spécifique d'une réaction.

On désigne par:
-- la lettre E l'enzyme
-- la lettre S le substrat ( substance sur laquelle va agir l'enzyme)
-- la lettre P le produit obtenu par réaction de l'enzyme.

Les enzymes catalysent un petit nombre de réactions, voire une réaction et sortent intactes à la fin des
schémas réactionnels.

II. Nature des enzymes

Les enzymes sont pour la plupart de nature protéique, cette partie protéique est appelée Apo-enzyme.

Cependant les enzymes pour exercer leur activité peuvent faire appel à des parties non protéiques, ce
sont
 les CoEenzymes
 les goupements prostétiques
 les cations métalliques ou cofacteur métaliques comme le zinc qui permet l'action de l'anhydrase
carbonique.

Les cofacteurs organiques: coenzymes et groupement prostétiques diffèrent sur leur facilité de
dissociation avec l'apoenzyme:
-- le groupement prostétique est lié à l'apoenzyme par des liaisons fortes
-- le coenzyme des liaisons sont plus fragiles. Certains de ses coenzyme sont des intermédiaire de
réactions: UDP, GDP guanidine diphosphate d'autres sont utilisés comme substrat lors de réactions
secondaires.

Si les enzymes sont les principale molécules capable de catalyse, elles ne sont pas les seules. Ainsi le
RNA (qui ne sont pas des protéines) présentent également une activité catalytique de nature
ribonucléique. On les appelle : ribosines. Ces risbosines peuvent mener leur action catalytique soit sur
elles mêmes, soit sur d'autres molécules.

III. Propriété des enzymes

1. Les propriétés en rapport avec les propriétés des protéines

Les propriétés générales des enzymes sont celles des protéines :

 possibilité de purification ou d'isolement par chromatographie d'affinité
 caractère amphotère ouvrant la possibilité à l'électrophorèse
2. Le pouvoir catalytique des enzymes

a. Les enzymes présentes des propriétés identiques aux catalyseurs minéraux.

Un catalyseur accélère les réactions thermo-dynamiquement réalisable. Il est présent en faible quantité et
reste inchangé à la fin des réactions.

b. Les enzymes permettent une plus grande vitesse de réaction.

Les réactions biochimiques catalysées par les enzymes pourraient avoir lieu sans elles, cependant elles
seraient très lente : 10^6 à 10^12 plus lentes.

c. Les enzymes permettent d'abaisser la valeur de l'énergie d'activation à fournir. ( cf. polycopié)

A + B --- > CD

A et B pour pouvoir être transformée en C et D doivent recevoir de l'énergie, c'est énergie constitue le
complément d'activation. Le complément d'activation correspond la quantité d'énergie pour permettre le
passage d'un complexe inactivé à un complexe activé.

La variation d'énergie libre ne dépend que de l'état initial et de l'état final de la réaction.

Catalyseur et enzymes réalisent leur activité catalytique en abaissant énergie d'activation. Plus
l'énergie d'activation est faible et plus la réaction sera rapide c'est-à-dire plus enzymes ou plus le
catalyseur sera efficace.

d. les enzymes ne modifie pas l'équilibre des réactions.

Les enzymes permettent d'accélérer les vitesses de réactions réversibles tant dans le sens "aller"
que dans le sens "retour" sans modifier l'équilibre.

e. Les enzymes se retrouvent inchangé à la fin des réactions.

E + S -- > ES -- > E + P

f. Le complexe: enzyme/substrat est spécifique des enzymes.

L'enzyme s'associe au substrat pour former un complexe intermédiaire qui en se dissociant permettra
d'obtenir le produit de la réaction est une enzyme régénérée.

g. L'activité des enzymes et régulée

Activité des enzymes et régulée par des effecteurs qui modifient la structure protéique.

h. Spécificité de l'enzyme par rapport au substrat.

C'est le pouvoir que possède une enzyme de catalyser et une réaction est une seule.
Cela se manifeste
 soit au niveau du type de réaction catalysées
 soit au niveau du substrat sur lequel elles agissent.

Ainsi chaque réaction est catalysée par une classe d'enzymes spécifiques.
Exemple:

 La peptidase est une enzymes qui catalyse indifféremment toutes les liaisons peptidiques qu'elle
rencontre.

 L'uréase agit principalement sur l'urée.

 On démontre qu'il existe également une stéréospécificité des enzymes pour le substrat. En effet,
les alpha glucosidase ne pourront hydrolyser que les liaisons alpha glucosidiques et non les lisions
beta glucosidiques

IV. Mécanismes d'action des enzymes

1. Notion de site actif

a. Définition

Région de l'enzyme qui est chargée de reconnaître le substrat et de le fixer puis de le faire subir la
réaction catalytique.

 Le site actif est composé de différents acides aminés que l'on peut classer en deux groupes.

b. Les acides aminés constitutifs du site de positionnement.

Le site de positionnement est le lieu qui attire le substrat et l'oriente pour qu'il puisse entrer en
contact avec l'enzyme pour être catalysé.

c. Les acides aminés spécifiques de la catalyse

Le site catalytique correspond à la partie de l'enzyme qui agit sur le substrat et qui réalise la réaction
catalytique, c'est-à-dire sa transformation en produit.

On distingue également d'autres acides aminés dont le rôle n'est pas défini.

2. Mise en évidence du site actif

a. La méthode de diffraction au rayon X.

C'est la méthode la plus ancienne. Elle a permis de déterminer l'ensemble de la structure tertiaire de la
protéines et de préciser la position exacte les acides aminés du site actif et de la protéine.

Les premières analyse dès structure tertiaire des enzymes furent réalisée sur les ribonucléases et les
lisosines.

b. Méthode chimique de marquage

Cette méthode fait appel à des composés spécifiques de certaines fonctions des acides aminés. Il
présente la capacité de se fixer de manière irréversible à ces groupements spécifiques des acides
aminés. Cette fixation entraîne une inactivation de l'enzyme, par élimination, on définit donc les acides
aminés constitutifs du site actif.

Exemple: l'arsenico est spécifique de la cystéine/ l'acide iodo-acétique est spécifique de l'histidine.
c. Mutagénèse dirigée

Au niveau des gènes, on sait isolé les gènes qui code pour les enzymes. En modifiant ces gènes par
mutations ou délétion, puis en exprimant ces gènes, on obtient des enzymes modifier.

Ainsi on peut modifier ou déléter successivement différents acides aminés du site actif ce qui permet de
préciser le rôle de chacun d'entre eux :
 soit dans la reconnaissance du substrat ( site de positionnement)
 soit au cours de la phase catalytique ( site catalytique).

3. Le caractère du site actif.

a. Le site actif ne représente qu'une toute petite partie de la protéine enzyme.

On constate suites assez méthode d'études que peu d'acides aminés entre dans la constitution du
site actif ( au plus une dizaine) ce qui représente une toute petite partie de la protéine enzyme totale.

b. Les acides aminés constitutifs du site actif sont éloignés sur la structure primaire de la protéine n'est
rapprochée sur les structures secondaire et tertiaire.

On a mis en évidence également que le site actif était une entité tridimensionnelle constituée de
groupement d'acides aminés qui proviennent de la séquence linéaire des acides aminés de la protéine.
Cependant, on constate que les acides aminés constitutifs du site actif sont très éloignés les uns
des autres dans la structure primaire mais que le repliement des structures secondaire et tertiaire
permet de les rapprocher.

c. Les deux modèles d'interprétation des sites actifs

c.1 le modèle statique et rigide: théorie de Fischer.

Pendant longtemps on a décrit le site actif au moyen de la théorie de Fischer. Cette théorie supposant
qu'il existe d'emblée une complémentarité de structure entre le site actif est le substrat. C'est-à-
dire que le site actif est ajusté au substrat.

Cette théorie nous permettait de comprendre certaines propriétés des enzymes tels que la saturation de
l'enzyme par le substrat.

c.2 le modèle de l'agencement induit: modèle Kosland.

Le modèle de Kosland décrit un site actif flexible qui permet son adaptation au substrat. C'est-à-dire que
lorsque le substrat se présente au niveau de l'enzyme, il induit une modification de la conformation
site actif ce qui permet la complémentarité enzyme/substrat.

 C'est ce modèle apparu dans les années 70 qui a remplacé la théorie de Fischer.

4. Quels sont les types de liaisons impliquées dans la création du complexe enzyme/substrat.

On distingue deux types de liaisons différentes pour la phase de reconnaissance et pour la phase
catalytique.

a. Les liaisons de la phase de reconnaissance.

Les liaisons qui participent à la reconnaissance de l'enzyme avec le substrat sont relativement faibles et
non covalentes. Ce sont à exemple des liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, les
interactions dipôle-dipôle c'est-à-dire les forces de Van der Waals.
b. Les liaisons de la phase catalytique.

Les liaisons de la phase catalytique sont des liaisons plus forte c'est-à-dire des liaisons covalentes
ou de coordinences. ( 100 kcal par mol)

5. Mécanismes moléculaires de l'action catalytique.

Ces différentes des actions peuvent avoir lieu simultanément sur la même enzyme, certaines peuvent est
prépondérante, d'autres inexistantes.

a. L'effet de positionnement et de proximité.

La vitesse de réaction entre deux molécules augmente lorsqu'elles sont à proximité l'une de l'autre.
L'action catalytique est encore davantage facilitée lorsque le substrat est présent au niveau du site actif.

b. Catalyse covalente.

Les chaînes latérales de certain acides aminés présentent un certain nombre de groupements
nucléophiles. Ces groupements nucléophiles joue un rôle important dans la catalyse car il permet une
attaque des parties electrophyles du substrat. Il réalise ainsi la formation de liaisons covalentes entre
l'enzyme est le substrat ce qui aboutit à la formation du complexe intermédiaire enzyme/substrat.

Le complexe intermédiaire permet à son tour une attaque par un second composé nucléophiles qui libère
alors le produit et régénère l'enzyme.

L'ensemble de la catalyse covalente permet une diminution de l'énergie d'activation c'est-à-dire une
augmentation de la vitesse de réaction.

c. Catalyse acide/base.

Au cours de ses réaction, il y a transfert des protéines vers l'état de transition. Sous leur forme protonnée
les chaînes latérales des acides aminés agissent comme catalyseurs acides ( acide glutamique, histidine
etc.).

À l'inverse sous forme non protonée, les chaînes latérales de ces acides aminés font office de catalyseurs
basiques.

d. contrainte conformationnelle.

Elle est imposée à l'édifice tertiaire de la protéine enzyme. Ces contraintes conformationnelles ont pour
but de rapprocher l'un de l'autre un certain nombre d'acides aminés essentiels à la catalyse malgré leur
éloignement au niveau de la structure primaire de la protéine . Elles ont également pour but de protéger le
site actif en lui créant artificiellement un environnement hydrphobe soit riche en acides aminés apolaires.

Exemple : mécanismes d'action de la chimiotrispsine.

La chimiotrispsine est:
-- une protéase
-- de poids moléculaire : 25 000
-- qui présente une spécificité enzymatique : elle hydrolyse de façon spécifique les liaisons peptidiques
adjacentes à des résidus aromatiques comme le tryptophane...
Afin d'augmenter sa vitesse de réaction elle utilise différent stratagème catalytique :
-- la catalyse acide/base
-- la catalyse covalente
-- la contrainte conformationnelle

 Application de la contrainte conformationnelle :

Les acides aminés qui constituent le site actif sont: la sérine, histidine, l'acide aspartique. Au niveau de la
structure primaire de la protéine ils sont très éloignés les uns des autres :
-- la sérine est en position 195
-- histidine est en position 57
-- l'acide aspartique est en position 102
cependant ils sont proches les uns des autres au niveau des structures secondaire et tertiaire de la
protéine.

On les appelle triade catalytique car sérine et histidines sont liées par une liaison hydrogène ainsi que
l'acide aspartique et l'histidine.

 Application de la catalyse acide/base et de la catalyse covalente

Condition que l'histidine et l'acide aspartique sont des catalyseurs acides car ils sont à l'origine d'un
mouvement de proton vers elles et exaltent le caractère nucléophile de la sérine. Ainsi les ions O- de la
sérine vont venir attaquer le carbone groupements carbonyl du substrat ( c'est-à-dire la liaison
peptidiques).

Il y a alors formation d'un intermédiaire covalent: l'acyl enzyme. Il y a scission de la liaison peptidiques,
puis libération groupements aminé.

Une molécule d'eau intervient et réalise le processus inverse en régénérant le site actif de l'enzyme. Le
substrat est alors libéré.
V. cinétique enzymatique

L'étude cinétique d'une réaction enzymatique consiste en l'étude de la vitesse de réaction et de

l'influence de différents paramètres susceptibles de la modifier.

A. Définition de la vitesse de réaction enzymatique

La vitesse de réaction enzymatique peut être définie :

 en fonction de la concentration de substrat transformé par unité de temps
 en fonction de la concentration en produit qui apparaît pas unité de temps.

S -- >P

V = - d[S] / dt = d[P] / dt

On peut la modifier en faisant varier la concentration en substrat.

Pour définir par un nombre la manière dont le substrat affecte la vitesse réactionnelle on détermine l'ordre
de la réaction.

a. L'ordre 0.

La vitesse est alors indépendante de la concentration en substrat [S]

On a donc : V= - d[S] / dt = constante

L'ordre 0 peut être observée au cours des phase stationnaire de la réaction, c'est-à-dire au cours des
phase où le site actif est sans cesse occupé par le substrat.

b. L'ordre 1: c'est l'ordre du milieu biologique

La vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration en substrat :

On a donc : V = - d[S] / dt = k.[S]

Avec k: constante de vitesse

2. L'activité enzymatique

L'activité enzymatique est mesurée en pathologie. Elle correspond à la mesure de vitesse de réaction
dans des conditions précises et standardisées.

On définis une U.I d'activité enzymatique comme la quantité de enzyme provoquant la

transformation d'une micro mol de substrat en une minute dans des conditions optimales de pH et
de concentration en substrat à une température de 37 degrés.

On détermine ainsi essentiellement des excès de substrat

1. La vitesse de réaction enzymatique en fonction du pH.

Les réactions enzymatiques sont sensibles aux pH.

En effet à des pH extrêmes la vitesse de réaction est nulle. En effet, il y a modifications irréversibles la
structure de l'enzyme, c'est-à-dire dénaturation de la protéine cette qui modifie la liaison entre l'apo-
enzyme est le coenzyme.

À l'inverse, il existe un pH d'activité maximal souvent proches du pH organiques ( neutralité) entre 6

et 8. Cependant, il peut varier ainsi : le pH d'activité maximal de la pepsine est proche de 1, le pH de
l'arginase est proche de 10.

Pour chaque enzyme il existe de la même manière un pH d'arrêt, il correspond à l'inactivation de

l'enzyme, pour des pH inférieurs à 4 et supérieurs à .

2. Vitesse en fonction de la température.

Les enzymes sont sensibles à la température.

(Courbe: cf. polycopié.)

-à basse température: on observe une augmentation de la vitesse de réaction si température augmente

-à de hautes températures: on observe inactivation de l'enzyme, courbe de dénaturation.

-- > globalement de la température augmente la vitesse de réaction augmente jusqu'à une certaine
limite.

Courbe en trait plein: résultant de deux courbes, permet de définir une température optimale qui dépend
du pH de la force ludique du milieu et du temps de réaction. Ainsi cette courbe montre que pour chaque
enzyme les courbes d'activation et de dénaturation s'équilibrent.

Explication: lorsque l'on fournit de l'énergie sous forme thermique on augmente la concentration
en complexe activé ce qui facilite la réaction.

3. Vitesse en fonction de la concentration en enzyme:

(Courbe: cf. polycopié)

À partir de cette courbe, on distingue deux parties différentes:

-- une première partie (T1), rectiligne qui met en évidence que la vitesse de réaction est proportionnelle à
la quantité en enzyme présente au début de la réaction.

-- une seconde partie (T2), la courbe tend alors vers une asymptote, il n' y a plus de relations de
proportionnalité. On observe un phénomène de saturation.

-- > la vitesse de réaction augmente en fonction de la concentration en enzyme à condition de

mesurer les vitesses initiales de chaque expérience au temps T1.

4. Vitesse en fonction de la concentration en substrat

(Courbe: cf. polycopiés)

Dans un premier temps la vitesse de réaction augmente rapidement jusqu'au temps ayant cependant si
on continue à ajouter du substrat la courbe s'infléchit étend vers une asymptote : vitesse maximale.
-- > ce mode de fonctionnement correspond aux enzyme de type mihaéliennes.

C. La théorie de Mickaelis Menten

1. Les deux étapes de la théorie de Mickaélis Menten

Elle est mise en évidence par une étude quantitatif des variations de la vitesse de réaction enzymatique
en fonction de la concentration en substrat.

k1 k2
E + S === ES === E + P
k-1 k-2
étape rapide étape lente
réversible irréversible

k-2 : très faible, peut être négligée

k = k catalyse avec k cat k1

a. Première étape

La transformation du substrat en produit, se fait obligatoirement par le passage un état intermédiaire : le

complexe enzyme substrat.
Cette première étape réactionnelle est rapide et réversible.

On appelle k1, la constante de vitesse de cet réaction dans le sens " aller" elle s'oppose à la constante k-
1 du sens" retour"

b. Deuxième étape

La deuxième étape correspond à la formation du produit à partir du complexe activé.

C'est une étape relativement, partiellement réversible est très lente.
On défini également deux constantes de vitesse,k2 constantes de vitesse dans le sens "aller" et k-2
constantes de vitesse du sens "retour",cette dernière constante est très négligeable.

2. Loi d'actions de masse

Cette loi régit les équilibres réactionnels.

Lorsque l'on met en présence d'un équilibre, l'ajout de substrat modifie l'équilibre dans le sens se de la
diminution de la concentration du substrat ajouté.
Ce qui entraîne que les produits se forment plus facilement, l'enzyme est donc plus rapidement
régénérée.

3. Principe de l'état stationnaire

Dans les conditions de l'état stationnaire, l'enzyme est toujours saturée par son substrat. C'est-à-dire que
la concentration complexe intermédiaire enzyme/substrat est toujours la même alors que la concentration
en substrat et la concentration en produit peuvent varier.
 Vitesse de formation du complexe = vitesse de dissociation du complexe

[ES] = constante

Vm . [S]
V = ---------------- 1
Km . [S]

Vm: vitesse maximale

k-1 + k cat
Km = ------------------- : constante de mickaélis Menten caractéristique de l'enzyme E pour un
substrat S.
k1

On a donc pour :

-- > [S] Km, c'est-à-dire une faible concentration en substrat, première partie de la courbe

Vm.[S]
V = ------------- : la vitesse dont proportionnelle à la concentration en substrat, début de la courbe
de vitesse de réaction des enzymes mickaéliennes
Km

-- > [S] Km, c'est-à-dire une forte concentration en substrat, seconde partie de la courbe:
asymptote

V = Vm, c'est-à-dire que la vitesse de la réaction est maximale est indépendante de la

concentration substrat

On défini également V = Vm/2, c'est-à-dire Km = [S] pour laquelle la vitesse de réaction atteint la
moitié de la vitesse maximale.

Conclusion:

Pour une enzyme on définit donc deux constantes caractéristiques, Km et Vm avec:

-- Km: (concentration) spécifiques d'une enzyme pour un substrat donné, il reflète l'affinité de
l'enzyme pour le substrat. Ainsi le Km sera d'autant plus faible que l'affinité pour le substrat sera
grande.

4. L'utilisation du graphique de Line Weaxer Burk

Il permet de produire la cinétique des enzyme en prenant les inverses de la vitesse (1/ V) et de la
concentration substrat (1/ [S]).

Cette représentation présente l'avantage d'être plus facile à lire.

En effet, on définie:

-- Vm : par le point d'intersection de la droite avec l'axe des ordonnés

-- Km :par le point d'intersection de la droite avec l'axe des abssises.

VI. Les effecteurs enzymatiques

A. les inhibiteurs.

En plus de leur substrat les enzymes sont capables de fixer des substances dont elles ne peuvent
catalyser la conversion.
Ces substances sont appelées inhibiteurs.
Elles ralentissent ou arrêt l'activité catalytique de l'enzyme.

On distingue différents types d'inhibiteurs:

1. Les inhibiteurs irréversibles

 Ils sont souvent d'origine non biologiques elle présente pas d'analogies structurales avec le
substrat.
 Il se fixe de manière covalente sur la protéines enzymatiques de manière irréversible.

 Ce sont par exemple :

a. Les agents alcoylants

Débloqué stoppent le rôle des groupements thiols de la cystéine

b. La Di-iso-propyl-fluoro-phosphate ( DIFP)

 Elle estérifie l'hydroxyle de la sérine.

Ainsi, elle inhibe les protéases à sérine comme:

-- la trypsine
-- la chimiotrispsine
-- l'élastase

qui présentent une sérine au niveau de leur site catalytique.

 Par contre, elle n'a aucune action est donc n'inhibe pas les Zn protéases, comme :
-- les carboxylases
-- les protéases acides
-- la pepsine

qui ne possèdent pas de sérine au niveau de leur site catalytique

 De la même manière le lysosine, acides aminés catalytique n'est pas inhinbé par la DIFP car
possède comme acides aminés catalytiques: l'acide aspartique et l'acide glutamique.

2. Les inhibiteurs réversibles

 Ce sont des substances que qui ne réagissent pas de manière covalente avec l'enzyme.

 On n'en distingue deux types:

a. Les inhibiteurs compétitifs

 E + S ==== ES === E + P

E + I === EI

[E].[I]
ki = -----------
[EI]

Leur structures sont analogues à celles des substrats, ce qui expliquent qu'ils agissent sur le site actif et
entre en compétition avec le substrat.
Ces inhibiteurs ne peuvent pas être transformés par l'enzyme en produit quelconque.

Conséquences:

 Avec les inhibiteurs compétitifs le Km est augmenté mais la Vm reste inchangée ( pas
modifiée).
 Le K'm > Km
 l'inhibition peut être levée en présence d'un très large excès de substrat. En effet, la
concentration en inhibiteurs lorsqu'on a un excellent substrat est négligeable par rapport à
la concentration substrat.

b. Les inhibiteurs réversibles non compétitifs

 Ce sont des composés biologiques de la structure est très différente de celle du substrat. Il agisse
pas sur le site actif, en effet, le substrat et inhibiteurs peuvent se lier simultanément à l'enzyme
sans qu'il y ait de compétition entre le substrat et l'inhibiteur.

 Comme pour les autres inhibiteurs, ils ne pourront être transformés en produit quelconque.

Conséquences:

 La Vm est diminuéé mais le Km reste inchangé.

 Un très large excès extra ne pourra le lever l'inhibition.

Exemple: les métaux lourds sont des inhibiteurs non compétitifs des groupements thiols de certaines
enzymes.

B. les activateurs
Définition: ce sont des substances qui favorisent l'activité catalytique de l'enzyme.

Ils sont de différents types:

1. Activateur par des ions

 Mg2+ : activateur des kinases et des phosphatase

 Zn 2+: activateur de l'anhudrase carbonique
 Cl-: activateur de l'amylase

Ces enzymes ne peuvent agir qu'en présence de ces ions activateurs. En effet, il participent à la
stabilisation de la structure de tertiaire de la protéine enzymatique.

2. Activateurs par protection du site actif de l'enzyme

Ce sont des composés comme le glutathion et la cystéine qui protègent les groupements nécessaires à la
catalyse enzymatique.

Le glutathion et la cystéine protègent les groupements thiols présent au niveau du site actif.

3. Avivateurs anti-inhibition

Substances qui permettent de lever une inhibition.

Exemple: les ions Cn- lèvent l'inhibition exercée sur l'uréase par les sels de cuivre.

4. Activation par action sur les sou unités enzymatiques.

Schéma:

L'Amp cyclique de venir se fixer à la sous unités régulatrices et la détachée de la sous unités catalytique,
ce qui provoque la libération du site actif.

C. Les effecteurs allostériques

Ce sont des substances de faible poids moléculaire qui ont peu de ressemblance avec le substrat où le
coenzyme.
Il réalise une action spécifique, c'est-à-dire qu'un composés réalisent une seule action.
Il agisse sur des enzymes allostériques à cinétique non-mikaelienne.
Il agisse au niveau d'un site particulier de l'enzyme: le site régulateur ou site allostérique.

 Il existe deux types d'effecteurs allostériques:

-- les inhibiteurs qui diminuent l'affinité de l'enzyme pour le substrat
-- les activateurs qui augmentent l'affinité de l'enzyme pour le substrat

VII. Les enzymes allostériques.

1. Définition
Enzymes dont l'activité catalytique peut être modifiée par la présence d'effecteurs allostériques.

Ces enzyme possède un site actif responsable de l'activité catalytique de l'enzyme. Il possède également
un ou plusieurs site régulateurs ou allostéiques qui peuvent être fixés sur des chaines polypeptidiques
différentes où vient de se placer les effecteurs. De la même manière que le site catalytique est spécifique
du substrat, le site régulateur est spécifique de l'effecteurs.

Ces enzymes sont de nature oligomériques, c'est-à-dire formé de l'assemblage d'un nombre variable
d'unités: les protomères réunies par des liaisons covalentes. Ces protomères sont associés de manière à
ce que la molécule possède un axe de symétrie.

2. Quelles sont les preuves de l'existence de différents sites allostériques ?

a. Par la dénaturation spécifique de sites allostériques

On peut dénaturer spécifiquement le site allostérique de certaines enzymes. Ces enzymes vont devenir
insensible à l'action des effecteurs allostériques sans que la catalyse ne soit modifiée. C'est-à-dire qu'il n'y
a pas d'altération du site catalytique.

b. Avec les techniques de mutagénèse dirigéé.

On sait qu'il existe des enzyme mutées qui concervent leur activité catalytique normale mais qui ne sont
plus sensibles aux effecteurs allostériques.

3. Une cinétique allostérique sigmoïde.

Lorsque l'on étudie la vitesse de fonctionnement de ces enzymes on observe une courbe sigmoïde. Cette
courbe est caractéristique des enzyme allostériques.

( courbe: cf. polycopié)

Vo 1
-------- = ------ [S]^n : équation de Hill
Vm k

n: coefficient de Hill, il exprime le caractère allostérique de l'enzyme, plus n est grand l'allure de la
sigmoïde est importante.
n augmente le degré de coopérativité du siote actifs de l'enzyme.

On peut distinguer deux étapes dans le fonctionnement de ces enzymes allostériques:

a. Première partie:

Au départ les enzymes allostériques présentent peu d'affinité pour le substrat.

b. Seconde partie:

C'est la fixation d'une première molécules de substrat qui facilite la fixation de la seconde et ainsi de suite,
on parle de coopérativitée positive.

-- > cette courbe en S être obtenue lorsque l'on étudie le comportement de l'affinité de
l'hémoglobine ou l'oxygène.

4. Autorégulation de l'enzyme
Il existe une autorégulation de l'enzyme. En effet, lorsque l'on est en présence de beaucoup le substrat
elle s'active, à l'inverse s'il on est en présence de moins de substrat, l'enzyme s'inhibe et diminue son
activité catalytique.

Finalement tout se passe dans le fonctionnement allostérique comme si il est est deux conformations de
l'enzyme:

a. La conformation relâchée: R
Sous cette conformation l'enzyme présente grande affinité pour le substrat.

b. La conformation tendue: T
Sous cette conformation l'enzyme présente une faible affinité pour le substrat.

-- > la transition allosétrique correspond donc à une très légère modification de la structure quoi permettre
de la conformation de la protéine enzymatique qui modifie donc la cinétique enzymatique.

5. Deux modèles d'explication (cf. polycopié)

Ces deux modèles d'explication sont définis à partir d'une enzyme présentant deux sous unités
régulatrices et un site actif.

a. Le modèle de Momod Wyman Changeux

Dans ce modèle, la symétrie de la molécule est conservée à tout moment, c'est-à-dire que les
changements de conformation intéressent toutes les sous unités en même temps, elles sont donc
toutes dans le même état conformationnel.

T-T ou R-R mais jamais R-T

La fixation d'une molécules de substrat va déplacer l'équilibre de transition allostérique en faveur de la

forme R-R: forme favorable pour l'activité, c'est-à-dire qui augmente l'affinité de l'enzyme pour le substrat.

b. Le modèle de Koshland, modèle induit de Koshland

Dans ce modèle, la symétrie de la molécule n'est pas toujours conservée, les sous unités peuvent
ne pas être toutes dans le même état conformationel.

La fixation d'une molécules de substrat fait passer la sous unités sur laquelle le substrat est fixé de la
forme T à la forme R sans modifiées la conformation des autres sous unités.
Le site actif des autres sous unités reste sous la forme T.
s'est enzyme présente une affinité pour le substrat plus forte que lorsque l'enzyme est globalement sous
la forme T-T.

-- > conclusion:

Quel que soit le modèle les enzymes allostériques présente des remaniements conformationels en
fonction de la concentration en substrat.

Les effecteurs allostériques mettent en jeu la transistion allostérique entre T et R.

- les inhibiteurs déplacent l'équilibre vers la forme deT: moindre d'affinité de l'enzyme pour le
substrat: ce qui se traduit par une diminution de l'activité de l'enzyme.(déplacement de la courbe
vers la droite)
- les activateurs déplacent l'équilibre vers la forme R, entrainant l'activation de l'enzyme.
(déplacement de la courbe vers la gauche)

R == T : transition allostérique

6. La régulation enzymatique

Les enzymes allostériques permettent souvent une régulation métabolique de chaînes de réaction.

Le métabolique terminal d'une chaîne de réaction peut constituer un effecteur inhibiteur. En effet, il va
provoquer un changement de conformation de l'enzyme allostérique présente en début de chaînes
réactionnelle, cela empêchera la fixation du substrat de la première enzyme de la chaîne réactionnelle.
On appelle ce mécanisme rétro inhibition ou feed-back.

L'existence d'un tel mécanisme présente l'avantage de stoppée une cascade réactionnelle à sa source et
ainsi permettre l'économie d'énergie pour la cellule.

De la même manière il existe un mécanisme de rétro activation.

VIII. Les isoenzymes

1. Définition

Les isoenzymes correspondent à des formes moléculaires multiples d'une même enzyme. C'est-à-
dire qu'elles catalysent les mêmes réactions, agissent avec les mêmes substrats et donnent le
même produit.

Elles diffèrent entre elles

- par leurs caractéristiques cinétique: Km ou Vitesse différente.
- par leur constitution protéique
- par leurs propriétés physiques différentes
- par leur localisation.

En effet, certaines isoenzymes sont cytoplasmiques d'autres ces mitochondriales. Leur localisation peut
être également variable en fonction des tissus, on trouve ainsi des isoformes hépatique ou cardiaque.
Enfin certaines iso forme peuvent être embryonnaires/foetale alors que d'autres ne sont présentes que
dans les tissus adultes.

2. Utilisation

Pour les distinguer, les séparées, on utilise l'électrophorèse car elle présente des pHi différents car elles
sont constituées de protéines différentes. Cette méthode de séparation au moyen de l'électrophorèse est
utilisé dans l'élaboration des diagnostics.

3. Exemple d'utilisation des isoenzymes

créatine phosphate + ADP -------- > Crétaine + ATP

CPK
La CPK elle enzyme qui catalyse la déposphorilation de la créatine phosphate pour donner de la crétine et
de l'ATP.
La CPK est un dimère formé de deux sous unités M (muscle) et B (brain = cerveau)

La CPK présente différentes isoformes:

- MM: abondant dans le muscle squelettique et en moindre quantité dans le muscle cardiaque
- MB: essentiellement présente dans le myocarde et en faible proportion dans le muscle squelettique
- BB: abondantes dans le cerveau

-- > La CPK est utilisé pour le diagnostic des pathologies touchant le myocarde: infarctus du myocarde.

 Le passage de l'isoenzyme dans le plasma signent une lésion cardiaque de manière plus
précoces que la CPK totale. En effet, dans un sérum normal, la fraction de CPK MB ne
représente que 2 à 3 % de la fraction totale de CPK. Suite à un infarctus la fraction de CPK MB
augmente et s'élève en moyenne de 20 %. ( remarque: aujourd'hui le dosage de la CPK MB n'est
plus utilisé, on préfère doser la troponine qui est beaucoup plus précoce)

 La fraction CPK BB est également utilisé dans le suivi des interventions neuro-chirurgical.
 Enfin la fraction CPK MM est très présente chez des patients atteints de myopathie.

IX. Utilisation des enzyme, enzymes et pathologies.

1. Origine de ce procédé de diagnostic.

La plupart des enzyme exercent leurs fonctions dans les cellules. Cependant elles peuvent être présente
dans le sérum du fait du renouvellement cellulaire qui libère les enzymes des constituants intracellulaires.
Les enzymes libérées pourront subir un catabolisme ou être éliminées par les voies biliaires. Donc la
présence dans le plasma de ces enzyme dépend de deux facteurs: le catabolisme et la libération
cellulaire.

En général, une enzyme est présente en quantité importante dans le sérum s'il y a présence de liaison
cellulaire.

-- > Le dosage de ces enzymes présente donc un intérêt majeur pour l'étude des pathologies et la
mise en place des diagnostics.

Les dosages sont réalisés en mesurant l'activité enzymatique exprimée en UI.

2. Exemple d'utilisation

En pratique, le sérum est mis en présence du substrat a dosé et des enzyme est les coenzyme
nécessaire à la réaction.

a. Mesure de la quantité de substrat qui disparaît.

On peut alors mesurée, soit la quantité de substrat qui disparaît:

Exemple: dosage de la choliestérase

Benzoylcholine + H20 ----------- > acide benzoïque + choline

Le substrat absorbe alors à 240 nanomètres contrairement aux produits qu'il attend pas à 240
nanomètres. Au réalise donc la mesure de la diminution de l'absorption de la solution à 240
nanomètres.

b. Mesure de la quantité de produits qui se forme

On peut également mesurer la quantité de produits qui se forme.

Exemple: phosphatase alcaline

nitro 4 phényl phosphate ------------ > nitro 4 phénol + phosphate

PAC
(incolore) (coloré)

On mesure donc l'apparition de la coloration c'est-à-dire la quantité de produits qui apparaît au

cours de la réaction.

c. utilisation de la méthode de spectrophotométrie

Aujourd'hui il existe une méthode de spectrophotométrie qui utilise des longueurs d'onde basses. Cette
technique permet de mesurer la modification quantitative de l'état du coenzyme.

Exemple: dosage de la lacticodeshydrogénase. LDH

acide pyruvique + NADH + H <======> acide lactique + NAD

L'absorption du NAD oxydé (NADH2) se fait à 340 nanomètres contrairement au NAD réduit (NAD).
Cette mesure permet donc d'accéder à l'activité enzymatique de la LDH.

Si on constate une augmentation de l'activité enzymatique, cela nous permet d'apprécier l'étendue et la
gravité des lésion car la quantité d'enzymes libérée permet une première approximation de la proportion
de masse cellulaire détruite.

 Une approximation de l'intensité de la nécrose cellulaire.

Il existe un ordre dans la libération des enzyme, suivant l'intensité de la nécrose cellulaire.
En effet les premières enzymes libérées lors d'une nécrose sont les enzymes cellulaires. Si la nécrose
cellulaire est plus importante il y aura alors libération d'enzymes mitochondriales. Cela nous permet de
dater approximativement l'apparition de la lésion car les différentes enzymes libérées lors d'une nécrose
cellulaire on des demi vies différentes.

Exemple: dosage d'enzymes cardiaques

-- CPK (créatine phospho kinase)

-- LDH (lacticodeshydrogénase)
-- GOT (glutamine oxalo acétique transférase)

Dans un premier temps, on pourra doser l'activité de la CPK. Son activité augmente rapidement dans les
six heures qui suivent l'infarctus. Elle apparaît dès la troisième heures. Sa demi vie est courte, elle
disparaît rapidement dans les 48 heures qui suivent l'infarctus.

1) Dans un deuxième temps de pourra doser l'activité de la LDH. La LDH apparaît plus tard, cependant sa
demi vie est plus importante.
2) Enfin de pourra doser l'activité de la GOT dont l'activité apparaît après la demi vie de la CPK.
3) Grâce à ce procédé, il nous est possible de connaître le lieu de la lésion cellulaire et leur approximative
de son apparition.

 Une localisation de la nécrose cellulaire

La mesure de l'activité enzymatique ou permet également de connaître l'origine tissulaire de la

pathologies. En effet il existe des enzyme spécialisées pour un tissus donnés. C'est le cas par exemple de
l'amilase qui signe une pancréatite aïgue ou encore de la phosphatase acide qui signe un cancer de la
prostate.

d. Utilisation des isoenzymes

- Une augmentation de la fraction CPK MB oriente le diagnostic vers une atteinte cardiaque, une
augmentation de la fraction CPK MM signe une atteinte musculaire.

- De la même manière, la lactico deshydrogénase possède 5 isoformes: LDH 1, LDH 2, LDH 3, LDH 4,
LDH 5.
En temps normal, on observe dans le sérum:

- 20 à 30% de LDH 1
- 32 à 33% de LDH 2
- 20 à 25% de LDH 3
- 7 à 10 % de LDH 4 et LDH 5

Les isoformes 1 et 2 signent une atteinte cardiaque contrairement aux isoformes 4 et 5 qui signe une
atteinte hépatique.

e. Une diminution de l'activité enzymatique, signe d'un dysfonctionnement

On observe également des cas particulier ou en cas de pathologies il y a diminution de l'activité

enzymatique.

Cette diminution de l'activité enzymatique est le résultat d'un déficit en enzyme qui peut être acquise ou
héréditaire.
C'est le cas par exemple de la phényl alanine hydroxylase.

phényl alanine -------------- > tyrosine

phényl alanine hydroxylase

Chez les nouveau-nés l'absence de phényl alanine hydroxylase entraîne une accumulation de phényl
alanine dans les tissus. la phényl alanine présente un caractère toxique pour les cellules nerveuses et est
donc responsable d'un retard mental. De plus, le fonctionnement de la phényl alanine hydroxylase
empêche la formation de tyrosine, hors la tyrosine est le précurseur de la mélanine. Les enfants souffrant
donc de phnéyl cetonurie ou phényl idiotie auront une peau claire et des cheveux blonds.

X. les enzymes utilisées en tant qu'outils.

1. Technique de dosage par immuno-enzymologie: methode "sandwitch"

Cette technique permet de doser le substrat lorsqu'il est présent en très faible concentration. Auparavant
utilisaient des techniques de radio immunologies.
Pour doser les antigènes ou des anticorps, on peut les lier de façon covalente à des enzymes sans faire
perdre aux anticorps ou aux antigènes leur pouvoir immunologique est sans faire perdre enzymes de son
activité catalytique.

Application:

1. Un anticorps (1) spécifique de l'antigène sérique a dosé est fixée sur un support solide. L'antigène
contenu dans le sérum vient se fixer un anticorps par une réaction immunologique. Suite à cette fixation
on réalise un lavage du sérum en excès.

2. Un anticorps (2) portant l'enzyme vient réagir avec l'antigène fixée sur l'anticorps (1). Au réalise un
nouveau lavage pour éliminer l'excès d'anticorps (2) marqués. (étape immuno saturation)

3. On mesure l'activité enzymatique. L'activité enzymatique est mise en évidence par un changement de
couleur entre le substrat et le produit: changement de couleur en présence de chromogènes. Ainsi
l'intensité de coloration est importante plus la concentration en antigènes est grande.

-- > cette mesure nous permet donc de doser les analytes présent en très faible concentration.

2. les enzymes de restriction

Les enzyme de restriction constitue de véritables ciseaux moléculaires, capable de couper l'ADN en des
endroits spécifique, toujours les mêmes pour une enzyme de restriction donnée.
Leur utilisation aboutisse à la coupure du molécules en différents fragments facilement repérables.

Application: diagnostic prénatal de la drépanocytose

Rappel: drépanocytose, sujets atteints porteurs d'une hémoglobine pathologique appelés Hb S. Cette hémoglobine HbS est
constitué de deux chaînes alpha normales et de deux chaînes beta mutés. La mutations se situent au niveau du sixième codon du
gène de la beta globuline. ( thimine remplacé en adénine cette qui se traduit par la mutations en six de la valine au lieu que de la
glutamine). Cliniquement la présence de cette hémoglobine muté Hb S se caractérise par la déformation des globules rouges qui
adoptent une forme de faucille. Cette pathologie touche les populations originaires d'Afrique noire, de l'île de Madagascar ou de l'île
de la Réunion.
On utilise donc des enzyme de restriction pour réalisées un diagnostic précoce de cette pathologie
héréditaire.

L'enzyme de restriction utilisée est la MST II. C'est enzyme présente la particularité de couper le gène de
la globuline à trois niveaux: X, Y et Z ce qui a pour conséquence l'obtention de deux fragments de taille
différente:
- un fragment qui fait 1.15 Kb
- un fragment de 0.20 Kb

En présence du gène de l'hémoglobine muté Hb S, au niveau du sixième codon, la mutation empêche

l'enzyme de reconnaître la séquence normale. Il n'y a donc pas de coupure en Y et on obtient ainsi un
seul fragment de 1.35 Kb.

Intérêt de cette méthode pour le diagnostic prénatal: l'ADN peut provenir de n'importe quel cellule foetale,
j'ai donc possibilité d'un diagnostic très précoce. ( exemple: villosités choriales huit semaines)

XII. Classification des enzymes.

On utilise le plus souvent des noms d'usage, peu informatif sur la nature du substrat où la nature de la
réaction catalysée. Cependant il a été mis en place une nomenclature internationale qui permet de
préciser la nature du substrat et la réaction catalysée, lactase deshydrogénase.

Cette classification internationale permet:

-- de caractériser une enzyme par son nom
-- de caractérisé l'enzyme par un code numérique précédée par les lettres EC est formée de quatre
chiffres qui correspondent à la nature de la classe des enzymes.

Exemple : Ec.111.27 Lactase dshydrogénase

LDH
CH -CH0h-COOH <========> CH3-C0-COOH

NAD NADH,H

Classe I: transferts d'électron depuis un substrat donnaient jusqu'à un composé récepteurs: accepteur
terminal

Classe II: transfert d'un groupement depuis une molécule à une autre. Il existe différents types selon la
nature du groupement transporté.

Classe II: catalyse des réactions de coupure des liaisons faisant intervenir de l'eau, au niveau des
premières liaisons du substrat
Classe IV: catalyse des coupures de liaisons par élimination de groupements C-C;C-N;C-O;C-S

classe V: catalyse des réactions de ré- arrangement intra moléculaires

Classe VI: entraîne une condensation de deux molécules qui utilisent un nucléoside triphosphate comme
l'ATP comme source d'énergie

- le deuxième chiffre correspond à la sous classe: fonction du groupement chimique qui sert de donneur

- le troisième chiffre est fonction du groupement chimique qui sert d'accepteur, c'est la sous sous classe

-le dernier numéro unique le numéro d'ordre de l'enzyme dans la classe et la sous classe considérée.