Méthode 3
Choix des produits
mesurés dans le lait
Identité des contaminants
• PCDD et PCDF
Les polychloro dibenzo-p-dioxines (PCDD) et dibenzofuranes (PCDF) sont deux familles de composés aromatiques
formés de trois cycles dont les structures de base sont représentées sur la figure ci-dessous. Dans les deux cas,
les 8 atomes d'hydrogène qui occupent les positions 1 à 4 et 6 à 9 peuvent être remplacés par un atome de chlore
conduisant ainsi à la formation de 210 composés différents répartis en 75 PCDD et 135 PCDF.
3
Dans cette étude, seuls les PCDD et PCDF ayant au moins quatre atomes de chlore en position 2, 3, 7 et 8 seront
mesurés en raison de leur toxicité et de leur bio-accumulation dans les graisses. Cela concerne 17 substances qui
sont les plus communément dosées, car les plus toxiques. On les étudie généralement grâce à un indice qui résume
en une seule valeur (I-TEQ 1 : en anglais équivalent toxique international) la contamination du milieu par le mélange
de ces 17 substances, pour chacune desquelles est appliqué un coefficient correspondant à sa toxicité (TEF :
facteur de toxicité en anglais ; cf. liste en annexe 1).
• PCB
Les polychloro biphényles (PCB) ont une formule de base représentée sur la figure ci-dessus, où chacun des dix
atomes d'hydrogène peut être remplacé par un atome de chlore, constituant ainsi 209 PCB.
Dans la famille des PCB, certaines positions occupées par des atomes de chlore confèrent aux molécules un
caractère toxique. Les positions caractéristiques de ces
composés sont repérées par rapport à la liaison qui lie
les deux noyaux aromatiques, à savoir ortho (1 et 1'),
méta (2 et 2') et para (3 et 3').
Le caractère toxique étant étroitement lié à la
configuration plane permettant la fixation au récepteur
Ah, tous les PCB pouvant adopter une configuration
plane auront un caractère toxique comme pour la
2,3,7,8-TCDD. Ce cas de figure se présente pour les
PCB ayant 2 atomes de chlore en position méta et 2
atomes de chlore en position para.
A l'inverse, la présence d'atome de chlore en position ortho diminue la possibilité d'adopter une configuration
plane et donc la toxicité de ces congénères diminue.
Dans cette étude, le choix des PCB à mesurer est basé sur celui retenu par l'Organisation Mondiale de la Santé
(WHO, Environmental Health in Europe, N°3) lors de l'étude des niveaux de contamination du lait maternel par les
PCDD, PCDF et PCB. En conséquence, en plus des dix-sept PCDD et PCDF, trois PCB non-ortho (77, 126 et 169),
deux PCB mono-substitués en position ortho (105 et 118) et six PCB dits “indicateurs” (28, 52, 101, 138,153 et 180)
seront mesurés.
1 I-TEQ = Somme (Concentration x TEF )
i i
23 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Exposition de l'homme
Les voies d'exposition des hydrocarbures aromatiques polychlorés de type PCDD, PCDF et PCB sont multiples :
aérienne, cutanée et alimentaire. En population générale, cette dernière semblerait être la voie principale (taux
d'absorption de 90%), avec une contamination particulière par les poissons, les crustacés, la viande, le lait et autres
produits laitiers.
Ce sont des composés très lipophiles, faiblement éliminés par l'organisme et qui par conséquent s'accumulent
et se stockent en particulier dans le foie et le tissu adipeux (toxiques cumulatifs). Lors de l'allaitement, ils sont
mobilisés et excrétés dans le lait maternel, essentiellement dans les graisses du lait. Ainsi leurs teneurs dans le lait
représentent qualitativement et quantitativement davantage le contenu des tissus adipeux de la mère que ce qui a
été ingéré durant la lactation et donc traduisent surtout l'exposition passée (Kodoma et al. 1980).
Le lait maternel a cet avantage de pouvoir être recueilli de façon non invasive et donc de pouvoir être utilisé à l'échelle
épidémiologique. Cependant, son utilisation nécessite une certaine rigueur. En effet, la distribution et l'exportation
de xénobiotiques dans le lait sont en relation avec le stade de la lactation, l'état nutritionnel de la mère, le moment
de la journée, voire le début ou la fin d'un allaitement. Il a été montré que la teneur en protéines et en lipides du lait
varie en sens inverse au cours de la lactation, le colostrum étant plus riche en protéines mais plus pauvre en lipides
que le lait mature, avec une progression du lait de transition au lait mature (Martinet et Houdebine 1989, Sim et Mac
Neil 1992). Ainsi la concentration de lipides varie de 2.9% dans le colostrum à 4.2% dans le lait mature. Pendant
l'allaitement, la quantité de lait excrétée par jour est d'environ 600 à 800 ml.
Comme indiqué ci-dessus, certains facteurs influencent les teneurs de PCDD, PCDF et PCB dans le lait, en
particulier : la teneur lipidique du lait, le poids maternel, la durée de lactation, la parité, l'âge maternel, les grossesses
multiples et d'autres facteur socio-économiques et saisonniers. Plus la durée de lactation est longue, la parité
élevée, la mère jeune, plus faibles sont les teneurs observées.
Type d'enquête
Le protocole repose sur une enquête descriptive transversale. La population d'étude est représentée par les
femmes allaitantes faisant dons de lait à un lactarium français. Compte-tenu des variations des teneurs en dioxines
dans le lait maternel, l'étude a été ciblée sur les femmes primipares, de moins de 35 ans, aux cours du deuxième
mois de l'allaitement.
Pour chaque femme éligible au terme de l'entretien initial effectué par le personnel du lactarium, un échantillon
de lait a été recueilli et analysé.
Les facteurs de risque et les caractéristiques socio-démographiques ont été recensés par auto-questionnaire.
Les principaux facteurs de risque d'exposition aux HAPC sont des :
• Facteurs de risques comportementaux :
la voie d'absorption étant principalement digestive, les personnes ayant une forte consommation d'aliments
riches en graisses (viandes, produits laitiers et surtout poissons) sont susceptibles de présenter des niveaux
d'exposition plus importants. Il en est de même des personnes consommant des produits locaux contaminés par
une source d'exposition.
• Facteurs de risques environnementaux :
bien que les données de la littérature ne soient pas claires, il semble que de petites différences puissent être
observées entre les niveaux de contamination selon la résidence en milieu urbain,rural et industriel. Les données
autour d'une source d'émissions (usine d'incinération d'ordures ménagères - UIOM -, industries métallurgiques)
laissent planer un doute.
24 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Nombre de sujets
nécessaires
La couverture de l'ensemble des départements par les lactariums n'étant pas homogène et le nombre de dons
dans chaque lactarium n'étant pas proportionnel à la taille de la population de la région concernée, il n'a pas semblé
opportun de réaliser un échantillon au niveau du département.
L'objectif principal étant d'obtenir un niveau moyen de concentrations dans le lait de femmes réparties le plus
largement possible sur l'ensemble du territoire français, une stratification par zone géographique définissant de grandes
régions a semblé plus adaptée.
Les lactariums ont donc été regroupés en fonction de leur proximité selon un découpage en 8 grandes régions
telles qu'elles sont définies par l'INSEE (zones d'études et d'aménagement du territoire, ZEAT).
3
De façon à ne pas imposer un surcroît de travail trop important pour certains petits lactariums, le nombre
d'échantillons de lait à recueillir a été déterminé proportionnellement à l'activité (au nombre de donneuses par an)
du lactarium.
Le nombre de sujets nécessaires par grande région a été défini en tenant compte de l'objectif descriptif et
explicatif.
A partir de l'étude OMS et des données hollandaises, les valeurs moyennes attendues se situeraient entre 15 et
25 pg ITEQ/g avec un écart-type de 7,5 pg ITEQ/g de graisse.
Selon différentes hypothèses relatives à la précision souhaitée (i), le nombre (n) de sujets nécessaire, est donné
pour une distribution normale par la formule :
e2 s2 e : variable normale réduite correspondant au risque a
n = ——— était : s : écart-type
i2
• si i=3 pg/g → n=25
• si i=2,5 pg/g → n=36
• si i=2 pg/g → n=56
Une incertitude de 3 pg serait du même ordre que celle relevée dans l'étude néerlandaise citée. Elle semble
acceptable pour une moyenne de 25 mais elle est plus discutable lorsque la moyenne est plus proche de 10 ou 15
dans l'hypothèse basse.
Le choix de 30 analyses par zone géographique a semblé un juste milieu et permettrait de tenir compte des
incertitudes quant à la précision de la mesure.
En privilégiant l'attitude explicative et ceci afin de répondre à l'objectif analytique, il est nécessaire de définir la
différence D entre des niveaux de risque que l'on souhaite mettre en évidence. Dans l'étude OMS, la différence entre
les types de régions variait selon les pays entre 5 et 10 pg. Le nombre de sujets nécessaire a été calculé pour trois
valeurs de D (5,7,10 pg) et pour deux valeurs de s (7,5 et 10 pg). En se plaçant en attitude bilatérale, avec une
puissance de 0,90 (1-b) et un a de 0,05, le nombre de sujets nécessaire selon la formule :
s2
n= 2 — (Z1-a/2 + Z1-b) 2
D2
est présenté dans le tableau ci-dessous pour les différentes combinaisons de D et s.
s = 7,5 s = 10
D=5 47 84
D=7 24 43
D = 10 12 21
Compte-tenu de ce tableau un effectif de 70 échantillons par niveau d'exposition, en fixant trois niveaux
d'exposition (soit 210 analyses en tout) permettrait de répondre à l'objectif analytique de la recherche et de
procéder à des comparaisons.
Ainsi, la proposition d'analyser 30 échantillons par grande région -soit 240 analyses en tout- a été retenue.
25 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Répartition des échantillons
par lactarium
Afin de tenir compte de bris de flacons lors du transport et/ou de difficultés ou d'incidents analytiques, le nombre
total d'échantillons à recueillir a été augmenté de 30. Ceci porte à 270 le nombre d'échantillons de l'étude. Celui-ci
a été établi en fonction de l'activité de chaque lactarium. Cette information est connue suite à la pré-enquête
conduite en 1997. La couverture géographique de chaque lactarium est variable. Elle peut se limiter à un département
ou couvrir un grand secteur géographique recouvrant plusieurs départements.
Le tableau 1 (cf. Chap.4, “Suivi de l’étude”) présente le nombre d'échantillons de lait fixé à chaque lactarium et
le nombre atteint à la fin de l'étude.
Contenu du questionnaire
Celui-ci a été élaboré conjointement par l'InVS et le CAREPS avec le concours de l'ADEME, et de deux référents
scientifiques de l'INSERM et de l'ENSP.
Le questionnaire est présenté en annexe 4. Il porte sur les principaux facteurs pouvant influencer les teneurs en
HAPC du lait maternel, c'est à dire des :
• Facteurs individuels (taille, poids, tabagisme maternel, âge, prise de médicaments),
• Facteurs liés à l'environnement :
- lieu de résidence (nom de la commune ou du lieu-dit et code postal) durant les 10 dernières années et type
d'habitat (centre ville ; rural ; banlieue ; périphérie d'une ville). Pour les communes de plus de 5 000
habitants, situation dans la commune (Est, Ouest, Nord, Sud, centre),
- existence d'une usine d'incinération (UIOM) ou d'une industrie potentiellement productrice de dioxines
dans un périmètre de 5 km autour du lieu de résidence,
- profession actuelle et passée et en particulier relation avec une industrie potentiellement productrice
de dioxines,
• Facteurs liés à l'alimentation.
Les questions posées concernent les habitudes alimentaires avant, pendant et après la grossesse. Les HAPCs
étant stockées durant de nombreuses années (demi-vie d'environ 7 ans) dans les graisses, présentes par la suite
dans le lait au moment de l'allaitement, ce sont surtout les habitudes alimentaires avant la grossesse qui sont
intéressantes à étudier. Cependant, afin de faciliter la remémoration par les femmes, les questions ont d'abord
porté sur les habitudes au moment de la participation de l'étude pour remonter à la période gestationnelle et enfin,
à la période antérieure à la grossesse.
Cette partie du questionnaire a été élaborée avec une diététicienne (Michèle Deheeger - INSERM U 290). Elle
concerne la fréquence de consommation (plusieurs fois par jour, tous les jours, tous les 2 jours, plus rarement, etc…)
et les quantités consommées de viandes, de poissons, d'œufs et de produits laitiers, aliments les plus riches en HAPC.
La consommation de produits locaux a aussi été demandée. Il s'agissait de préciser pour chaque type d'aliment le
lieu habituel d'achat (commerces locaux, marché, production locale), le but étant d'analyser une éventuelle relation
entre les HAPCs dans le lait maternel et la consommation de produits locaux pour les personnes habitant dans une
commune hébergeant une UIOM ou une autre source émettrice de dioxines.
Critères de sélection
Compte-tenu des caractéristiques des HAPC, des recommandations en matières de mesure de xénobiotiques
dans le lait maternel et des critères retenus dans l'étude européenne de l'OMS, les critères de sélection suivants
ont été retenus :
26 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
- mère primipare, a priori en bonne santé,
- âgée de moins de 35 ans,
- période d'allaitement de la 4e à la 8e semaine après l'accouchement,
- sans grossesse multiple (pas de jumeaux),
- avec allaitement exclusif,
- résidence au même endroit depuis au moins 5 ans (ce critère a été supprimé par la suite),
- non-utilisation de coquilles pour recueillir le lait,
- pas de stérilisation du tire-lait avec des pastilles de chlore.
Les deux derniers critères ont pour objectif d'éviter la contamination du prélèvement de lait par des hydrocarbures
polychlorés. 3
Modalités de réalisation
du prélèvement
Le prélèvement pouvait être obtenu en utilisant un tire-lait ou par pression manuelle directe du sein. Le tire-lait
utilisé ne devait pas avoir été stérilisé avec des pastilles de chlore et devait être rincé abondamment à l'eau claire.
Les règles d'hygiène habituelles devaient être respectées en évitant si possible l'utilisation de savon. Le rinçage
à l'eau claire du buste et des mains était recommandé.
La quantité minimale de lait recommandée est de 350 ml. En accord avec le laboratoire cette quantité minimale
a été fixée à 200 ml et le maximum à 400 ml pour éviter le bris possible lors de la congélation.
Les étiquettes résistantes à la congélation apposées sur les flacons indiquaient ces niveaux minimum et maximum.
Aucun autre récipient intermédiaire ne devait être utilisé et il a été précisé aux participantes que le récipient ne devait
servir que pour les besoins de l'étude.
La quantité de lait nécessaire pouvait être obtenue en plusieurs fois, à condition de conserver l'échantillon de lait
au congélateur en ajoutant chaque prélèvement jusqu'à la collecte complète. Le lait ne devait pas être décongelé.
Les recommandations pour le recueil de lait sont présentées en annexe 5.
Le matériel de recueil est un flacon de 500 ml en verre avec un bouchon en téflon.
Le laboratoire d'analyse a vérifié de façon aléatoire que les flacons ne contenaient pas de dioxines ou PCB.
Méthode d’analyse
des échantillons de lait
Schéma général
L'analyse des 17 congénères chlorés en position 2, 3, 7, 8 qui rentrent dans le calcul de l'indice de toxicité
exprimé en équivalent 2, 3, 7, 8 TCDD est réalisée suivant le schéma page suivante.
Le lait maternel est pesé puis sa matière grasse extraite et pesée. En effet, les résultats étant exprimés par
rapport à la matière grasse, la première étape consiste à extraire la matière grasse des échantillons. Puis, une partie
aliquote de cette matière grasse, environ 3 grammes, est prélevée et soumise au protocole analytique. Le dosage
des PCDD et PCDF fait appel à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse haute
résolution.
27 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Détail de la méthode analytique
Principe de l'analyse
Pour l'analyse des PCDD/F dans le lait, le laboratoire CARSO applique depuis plusieurs années la méthode décrite
par Liem et coll. (centre collaborateur OMS).
Extraction de la matière grasse
Le but de cette première étape est d'éliminer la matrice et d'isoler la fraction contenant les composés d'intérêt, PCDD
et PCDF, qui en raison de leur caractère lipophile se retrouvent dans la matière grasse.
La quantité totale de lait collectée, soit environ 350 ml, est homogénéisée puis utilisée.
La quantité de lait (environ 350 ml) est décongelée, puis mélangée avec de l'oxalate de sodium et du méthanol ;
cette phase est suivie de l'extraction avec un mélange de solvants, éther diéthylique et éther de pétrole.
La matière grasse extraite est pesée puis conservée au congélateur à -20°C.
• Cas des PCDD et des PCDF
L'extraction donne un extrait brut qu'il est nécessaire de purifier pour éliminer la matière grasse et les autres
composés extraits conjointement avec les PCDD et les PCDF. Ceci est obtenu lors de différentes étapes de
chromatographie avec différents réactifs.
Environ 3 grammes de matière grasse sont prélevés pour l'analyse des PCDD et des PCDF. Une partie est
mélangée à des quantités connues d'homologues PCDD/F marqués au 13C afin d'obtenir une courbe d'étalonnage
("étalons internes de quantification").
La première étape du protocole de purification est une chromatographie sur charbon actif basée sur la méthode
décrite par Stalling et coll., qui permet de retenir sélectivement certains composés plans polyaromatiques tels que
les PCDD et PCDF et les PCB non-ortho ainsi que d'autres composés indésirables. Les autres composés sont moins
retenus et sont éliminés par des solvants spécifiques.
Ainsi lors de cette chromatographie, la matière grasse est éliminée et deux fractions sont récupérées contenant
les PCB non-ortho coplanaires et les PCDD/F respectivement. Ces deux fractions sont alors traitées indépendamment
l'une de l'autre.
Nous ne détaillerons pas les phases de l'analyse concernant les PCB, les résultats de dosages obtenus tardivement
n'ayant pu être intégrés dans le présent rapport.
28 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
La fraction PCDD/F dissoute dans un solvant non polaire est purifiée par chromatographie sur alumine. Les
PCDD et PCDF sont élués par un mélange de solvant, hexane-dichlorométhane. Cette dernière fraction est
évaporée puis dissoute dans un solvant compatible avec la mesure par chromatographie gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse haute résolution (HRGC-HRMS).
Deux étalons internes (taux de réapparition) sont introduits dans l’extrait, juste avant la mesure par HRGC/HRMS.
Quantification
,• Quantification des PCDD et des PCDF
La quantification par dilution isotopique est certainement la méthode de choix pour quantifier les PCDD et PCDF.
A cette fin, une quantité connue d'homologues marqués au carbone-13 est ajoutée à la portion de matière grasse
pour seize des dix-sept congénères toxiques. Le dix-septième congénère, 1,2,3,7,8,9-HxCDD, est quantifié par
étalonnage interne par rapport aux deux autres homologues toxiques marqués au 13C, 1,2,3,6,7,8-HxCDD et
1,2,3,4,7,8-HxCDD.
3
Les extraits purifiés reçoivent un ou plusieurs étalons internes marqués au 13C également appelés "étalons
internes de sensibilité". Ils permettent de mesurer les taux de réapparition des étalons internes de quantification
introduits dans la portion de matière grasse utilisée pour l'analyse.
Ces étalons de sensibilité sont 13C-1,2,3,4-TCDD et 13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD.
L'analyse par HRGC/HRMS des PCDD et PCDF comprend la séparation des congénères sur une colonne non
polaire de 50 mètres de long suivie de la mesure quantitative de chaque congénère par spectrométrie de masse à
une résolution 10000 (ou 100 ppm). CARSO réalise ces analyses sur un spectromètre de masse haute résolution
AUTOSPEC modèle ULTIMA (Micromass, Manchester). Cet appareil est le plus sensible du marché pour l'analyse
des PCDD/F. Il est équipé d'un chromatographe FISONS et d'un passeur automatique d'échantillons. Cet ensemble
instrumental permet de procéder à un étalonnage complet avec quatre solutions d'étalonnage pour les PCDD/F lors
de chaque séquence analytique. En outre, chaque série d'analyses peut également comporter outre les solutions
d'étalonnage encadrant les échantillons réels, un blanc de procédure et un échantillon de contrôle qui peut être un
matériau certifié ou un composé régulièrement analysé.
Assurance Qualité et Contrôle de Qualité
Pour l'assurance qualité de l'analyse des PCDD/F, les critères de spécificité de chacun des congénères toxiques
sont contrôlés pour chaque échantillon. Dans la limite du possible, un blanc de protocole ou un blanc d'instrumentation
(CGHR/SMHR) et un échantillon de contrôle seront inclus dans chaque série d'analyses et ceci en plus des
solutions d'étalonnage qui sont systématiquement introduites. De plus, les taux de réapparition des étalons internes
de quantification ajoutés avant traitement de la matière grasse seront mesurés par rapport aux deux étalons
internes de sensibilité.
Comparaison interlaboratoire
Dans le cadre de cette étude, il est apparu souhaitable de disposer d'éléments sur la qualité des résultats du
laboratoire d'analyse (laboratoire CARSO, Lyon). A cette fin, 20 échantillons de lait ont été transmis au RIVM,
laboratoire hollandais et centre coordonnateur du programme européen de l'OMS de mesure des hydrocarbures
aromatiques polycycliques chlorés dans le lait maternel et au laboratoire municipal et régional de Rouen, autre
laboratoire français susceptible de mesurer les dioxines et furanes dans le lait maternel.
La graisse extraite de 20 échantillons de lait parmi les 244 échantillons collectés au cours de l'étude a été
adressée aux deux laboratoires participant à l'étude de comparaison pour le dosage des PCDD et PCDF.
Codification des questionnaires
et flacons
Un numéro d'identification à 4 chiffres a été attribué par chaque lactarium à chaque participante. Ce numéro est
constitué d'un code correspondant au numéro du lactarium et d'un numéro de prélèvement attribué par chaque
lactarium en fonction de l'ordre d'arrivée des inclusions.
En complément, une clé constituée du code du lactarium et des 3 premières lettres du nom de la participante a
été attribuée afin de limiter les erreurs dans l'attribution des numéros d'identification.
Les codes de chaque lactarium ont été préinscrits sur les questionnaires et sur les flacons par le CAREPS avant
l'envoi.
29 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Analyse statistique
Elle comprend la comparaison des dosages entre trois laboratoires, une analyse descriptive de la population et
des PCDD/F assurée essentiellement par le CAREPS et une étude des facteurs d'exposition aux “dioxines” assurée
par l'InVS.
Comparaison interlaboratoire
Les valeurs inférieures à la limite de détection ont été traitées de deux façons : soit la valeur a été considérée comme
nulle (nd=0) soit la valeur a été considérée comme égale à la limite de détection (nd=lod).
Les tests de comparaison ont porté sur les TEQ PCDD, les TEQ PCDF. Afin de limiter les disparités entre chaque
laboratoire pouvant être dues aux limites de détection, les concentrations inférieures à la limite de détection ont été
considérées comme nulles.
Dans un premier temps, une présentation descriptive de la distribution des dosages des trois laboratoires a été
effectuée : moyenne, écart-type, médiane, minimum et maximum et représentation graphique sous forme de box-
plot (“boîte à moustache”).
Dans un deuxième temps, est effectuée la comparaison statistique des dosages des laboratoires.
Elle comprend la comparaison des distributions qui s'est faite au moyen de tests non paramétriques, compte-tenu
de la petite taille de l'échantillon (20 mesures). L'utilisation du test de rang de Friedman pour séries appariées a permis
de comparer globalement les résultats des trois laboratoires. Cette approche a été complétée par des comparaisons
deux à deux (test de Wilcoxon pour séries appariées) quand le test de Friedman était significatif.
Les résultats de chaque laboratoire ont ensuite été corrélés aux deux autres afin de mettre en évidence une
éventuelle déviation systématique.
Enfin, le coefficient de variation (CV) entre les trois laboratoires est présenté pour étudier la variation relative des
mesures. Pour chaque échantillon, la moyenne et l'écart-type des trois mesures ont été calculés ainsi que le CV (écart-
type/moyenne). La moyenne des CV sur les 20 valeurs permet de tenir compte de l'ensemble des mesures.
Étude descriptive
Elle comprend :
• La description de la population :
- caractéristiques individuelles (l'âge de la mère ; la prise de poids pendant la grossesse ; la corpulence avant
et après la grossesse, exprimée par l'indice de Quetelet (Poids (kg)/(Taille (m))2 ; le tabagisme (récent et
passé)...),
- et socio-économiques (le niveau d'étude, la catégorie socioprofessionnelle et le fait d'avoir une profession
à risque d'exposition aux dioxines),
- état de la grossesse (âge gestationnel, poids de l'enfant, période d'allaitement, etc.),
- en fonction de certains facteurs de risque (lieu d'habitation, consommation alimentaire).
• Caractérisation du lieu d'habitation en ce qui concerne :
l'urbanisation : cet aspect a été abordé de plusieurs façons :
- en demandant à la mère de préciser si elle habite ou habitait en zone rurale (bourg, village, habitat
dispersé), centre ville ou en banlieue et périphérie d'une ville,
- en déterminant rétrospectivement, à partir des données INSEE, la taille de la commune concernée, son
appartenance ou non à une unité urbaine (regroupement de communes) et si oui la taille de celle-ci.
l'industrialisation :
certaines industries sont émettrices de PCDD et/ou PCDF. Les plus connues sont l'industrie métallurgique et les
usines d'incinération d'ordures ménagères.
30 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
Dans une moindre mesure, l'industrie textile, l'industrie du papier, l'industrie pétrolière, l'industrie des pesticides
et du traitement du bois contribuent aussi aux émissions de ces produits (ATSDR, 1993). Ces composés étant très
volatils, ils peuvent être transportés sur de grandes distances. Il est donc nécessaire, dans une approche globale,
de tenir compte de l'importance de l'industrialisation du lieu d'habitation de chaque participante. Dans ce but et en
l'absence de données permettant de connaître pour chaque commune concernée les industries qui influencent la
qualité de l'air, des données INSEE portant sur les zones d'emploi ont été utilisées (ATLAS zones d'emploi, CD-ROM,
INSEE - 1998). Ceci a été effectué en partenariat avec la Direction de l'Aménagement du Territoire et des Affaires
Régionales (DATAR), le Ministère de l'Emploi et de la Solidarité, le Ministère de l'Equipement, des Transports et du
Logement, la Caisse d'Allocations Familiales (cf. annexe 9). La France est découpée en 348 zones d'emploi dont
chacune correspond à un découpage basé sur des données économiques. Pour chaque zone il est possible de
connaître la densité du tissu industriel (secteur tertiaire exclu).
Ainsi à chaque commune d'habitation actuelle et passée des participantes, on a attribué une densité industrielle
correspondant à celle de la zone d'emploi à laquelle elle appartient. Afin de tenir compte de la durée d'exposition
3
(temps passé dans la commune), un indice d'exposition à l'industrialisation à été calculé. Cet indice (E) tient compte
à la fois de la durée (Dx) de présence dans la commune (x) et de la densité industrielle (Ix) de la même commune
et peut se résumer ainsi :
E= S Dx x Ix
1→x
le rôle des usines d’incinération et de l’industrie métallurgique
Grâce aux données collectées par l'ADEME (Département Observatoires des Déchets et Planification), il a été
possible de connaître le lieu d'implantation (nom de la commune), le type de procédé (incinération avec ou sans
récupération d'énergie), la date d'ouverture et la date de fermeture de l'ensemble des usines d'incinération à partir
de 1995 (cf. annexe 10).
Certaines informations complémentaires ont été apportées par le Ministère de l'Environnement (Direction de la
Prévention des Pollutions et des Risques, DPPR).
De même, les communes d'implantation des principales industries métallurgiques sont connues. Par ailleurs, dans
un souci d'anonymat, l'adresse exacte de résidence des participantes n'a pas été demandée. Dans ce contexte, l'option
de départ consistant à déterminer la distance entre le lieu de résidence et la ou les UIOM ou industries présentes
dans un certain rayon autour de l'habitation n'a pas été conservée. Ce choix est justifié par l'imprécision de l'adresse
et par l'impossibilité de tenir compte d'autres facteurs tels que le rôle des vents dominants et la morphologie du terrain.
En accord avec le conseil scientifique, il a simplement été décidé de tenir compte de la présence ou non d'une UIOM
ou industrie dans la commune de résidence et de la durée de résidence. Les participantes ont donc été classées
en fonction de la durée d'exposition à une source durant les 10 dernières années.
• Consommation de produits animaux (cf. annexe 4 Questionnaire) :
Pour chaque type d'aliment, on disposait à partir du questionnaire, de la taille de la portion, de la fréquence
mensuelle de consommation, de la consommation locale, ainsi que du pourcentage de lipides et d'une concentration
moyenne de dioxines estimée à partir du panier de la ménagère de la direction générale de l'alimentation (cf.
annexe 8). Les quantités d'aliments consommées retenues pour l'étude étaient celles habituellement consommées
dans les années précédant la grossesse.
Les variables alimentaires étudiées comprenaient ainsi :
- la taille des portions par repas (en grammes) de viande, de poisson, de fromage, de lait (avant la grossesse) ;
- la fréquence mensuelle de consommation de poisson gras, maigre, de coquillages et crustacés, de boeuf,
de porc, de charcuterie, de volaille, de lait, yaourt, fromage et d'œufs ;
- les quantités mensuelles consommées des différents aliments ou groupe d'aliments exprimées en grammes
et en grammes de lipides.
N.B : les produits de pêche : poissons maigres et gras, coquillages et crustacés ; les laitages : lait, yaourts, fromages.
- le pourcentage de la quantité consommée par aliment ;
Ex : pourcentage de poisson consommé par mois (quantité de poisson consommée par mois rapportée à la quantité
totale consommée de poisson, de coquillages et de crustacés, de viande, de laitages et d'œufs).
31 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
- le pourcentage de lipides consommé par aliment par rapport à la consommation d'origine animale ;
Ex : pourcentage de lipides de poisson consommé par mois (quantité de lipides de poisson consommée par mois
rapportée à la quantité totale de lipides consommée de poisson, de coquillages et crustacés, de viande, de laitages
et d'œufs).
• La description de l’imprégnation aux HAPCs :
- pour les 17 congénères (en pg/g de graisse)
- en équivalents toxiques (pg TEQ/g de graisse).
L'analyse a porté sur les données brutes : distributions, moyennes arithmétiques, géométriques, percentiles.
Relations entre les niveaux d'HAPC
et des facteurs d'exposition
Cette étude comprend trois étapes.
Dans un premier temps sont étudiées des caractéristiques individuelles, propres à chaque femme et à chaque
échantillon de lait, associées aux niveaux d'HAPC. Ces caractéristiques sont alors appelées facteurs de confusion
car elles peuvent perturber les relations observées entre les HAPC et des facteurs d'intérêt comme l'urbanisation.
A titre d'exemple, la relation entre les HAPC et l'urbanisation peut être mal appréhendée si on ne tient pas compte
de l'âge, qui est lié d'une part aux HAPC (les HAPC s'accumulent dans l'organisme avec l'âge) et d'autre part à
l'urbanisation (l'âge des femmes primipares en zone rurale peut être différent de celui des femmes primipares des
zones urbaines).
La deuxième étape consiste à étudier les facteurs d'intérêt, c'est à dire les caractéristiques de résidence et
d'alimentation, en tenant compte des facteurs de confusion identifiés dans l'étape précédente.
La dernière étape comprend l'étude simultanée des différents facteurs d'intérêt afin d'identifier ceux qui ont un rôle
propre.
• 1. Étude des facteurs de confusion
(caractéristiques liées à la mère et au recueil du lait)
• Facteurs liés au recueil de lait :
La composition du lait se modifie au cours de l'allaitement. C'est le cas de la teneur en lipides, mais aussi des
PCDD/F qui diminuent avec le temps de lactation puisque le lait constitue une voie d'excrétion et donc d'élimination
de ces substances. Rappelons que les PCDD/F, substances lipophiles, sont dosées dans les graisses du lait.
Les diverses variables étudiées ont été les suivantes :
- durée de la collecte de lait en jours ;
- nombre de séances de recueil ;
- nombre de semaines entre la naissance et le début du recueil ;
- nombre de semaines entre la naissance et la fin du recueil.
Ces variables étaient assez homogènes en raison des critères d'inclusion ; en effet la période d'inclusion était assez
courte, entre la 4e et la 8e semaine après l'accouchement.
- l'âge gestationnel ;
- ainsi que diverses combinaisons avec l'âge gestationnel et les durées de recueil ;
- les lipides du lait (en g ou %).
32 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
• Caractéristiques de la mère
Les PCDD/F s'accumulant au cours du temps dans les tissus adipeux, nous avons étudié l'impact des
caractéristiques individuelles de la mère décrites ci-dessus (cf. description de la population).
L'influence de facteurs liés au comportement et au milieu socioéconomique a été également explorée.
Parmi les différents facteurs ci-dessus, ceux qui influençaient significativement les niveaux de PCDD/F ont été pris
en compte lors de l'analyse des facteurs environnementaux et alimentaires
• 2. Étude des facteurs d’exposition
ajustés sur les facteurs de confusion
• Étude des caractéristiques alimentaires
3
Sachant qu'environ 90 % de l'apport en dioxines proviendrait de l'alimentation, et notamment des graisses
d'origine animale, quels sont les aliments qui contribuent le plus à cet apport ?
Validation du questionnaire alimentaire
Elle comprend l'étude des relations :
- entre l'âge, la corpulence après la grossesse, les lipides du lait et la quantité de lait avec les quantités
consommées ;
- et des quantités d'aliments consommées en fonction du lieu de résidence (centre ville, banlieue, zone
rurale ; région) et leur comparaison avec d'autres études (communication personnelle du CREDOC, centre
de recherche pour l'étude et l'observation des conditions de vie).
Relations PCDD/F, PCDD, PCDF et congénères avec les variables alimentaires
Il a été possible d'étudier l'influence de chaque type d'aliment sur les HAPC en utilisant les quantités mensuelles
consommées exprimées en grammes, en grammes de lipides et en I-TEQ de dioxines, ainsi que la contribution en
pourcentage de ce même aliment par rapport à la consommation totale de produits d'origine animale. Les relations
présentées dans ce document sont celles qui demeuraient cohérentes avec diverses variables pour un même type
d'aliment, et étaient robustes, c'est à dire résistaient à l'analyse de sensibilité (qui consistait à l'exclusion de points
extrêmes).
• Étude des caractéristiques de résidence
L’urbanisation
L'émission de dioxines due à l'urbanisation, au trafic automobile, a-t-elle une influence sur les niveaux de PCDD/F
du lait maternel ?
L'exposition récente a été explorée par l'étude des caractéristiques d'urbanisation de la résidence actuelle
(centre ville, banlieue, zone rurale ; durée de résidence ; taille de l'unité urbaine à laquelle appartient la commune
de résidence (définie par l'INSEE) ; taille de sa population ; grande région de résidence (Sud-Est, Sud, Nord, Ile de
France, Est, Ouest, Centre)). Nous avons également étudié le fait de résider et de travailler à la fois dans un même
type d'urbanisation (centre ville, banlieue, zone rurale).
L'exposition plus ancienne a été explorée en considérant les résidences des 10 dernières années. Nous avons
étudié le nombre d'années de résidence :
- dans une commune rurale ou urbaine (selon la définition de l'INSEE) ;
- en centre ville, en banlieue et en zone rurale (selon la réponse au questionnaire) ;
- dans une commune de plus de 100 000 habitants.
L’industrialisation
L'émission de dioxines par les industries a-t-elle une influence sur les niveaux de PCDD/F du lait maternel ?
Pour l'exposition récente, nous avons étudié pour la commune actuelle l'influence des critères cités précédemment,
c'est à dire la densité d'industries au km2, la présence d'une industrie émettrice de dioxines dans les 5 km autour
du lieu de résidence et la présence dans la commune de résidence d'une UIOM ou d'une industrie émettrice de
dioxines.
33 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
L'exposition passée sur les 10 dernières années a été explorée par l'indicateur E (somme des produits de la durée
de résidence par la densité d'industrie au km2) et la durée d'exposition cumulée à une UIOM ou industrie émettrice
de dioxines.
• 3. Étude simultanée
des caractéristiques de résidence et d’alimentation
Cette étude devait permettre de préciser si l'influence de l'urbanisation et de l'industrialisation sur les teneurs de
toxiques dans le lait maternel demeure après prise en compte de l'alimentation et réciproquement.
L'analyse statistique multivariée a été réalisée avec le logiciel de statistique S-Plus (version 4.5), afin d'étudier au
mieux les différentes relations qui ne sont pas systématiquement linéaires (effet seuil, aplatissement de la relation,...).
En effet, l'étude de l'influence des différents facteurs de risque étudiés (urbanisation, industrialisation et alimentation)
sur les niveaux des HAPC dans le lait maternel a été réalisée en utilisant les modèles additifs généralisés (Hastie
1990), qui sont une extension des modèles linéaires généralisés (Mc Cullagh et Nelder 1989). Ils permettent par des
fonctions de lissage non paramétriques une plus grande souplesse dans la modélisation des variables et ne
nécessitent aucune hypothèse a priori sur la forme de la relation étudiée. L'analyse des résidus a permis de vérifier
la qualité de l'ajustement. Ainsi, une transformation logarithmique était nécessaire pour assurer la normalité des résidus
et la stabilité de la variance. L'analyse de variance (ANOVA) a été utilisée pour tester la significativité statistique des
résultats.
Aspects éthiques
Cette étude a reçu l'autorisation de la CNIL le 10 septembre 1998 sous le n° 998115.
34 • É TUDE SUR LES DIOXINES ET LES FURANES DANS LE LAIT MATERNEL EN F RANCE
