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Effet de l’huile essentielle d’Origanum vulgare et de Thymus ciliatus sur

Pseudomonas aeruginosa VIM-2 carbapénèmase

Article in Phytotherapie · October 2014

DOI: 10.1007/s10298-014-0842-x

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Mounira Touati Youcef Hadef

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Djahoudi Abdelghani
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Phytothérapie
© Springer-Verlag France 2014
DOI 10.1007/s10298-014-0842-x

Article original

Effet de l’huile essentielle d’Origanum vulgare et de Thymus ciliatus

sur Pseudomonas aeruginosa VIM-2 carbapénèmase
S. Amrouni1, M. Touati1, Y. Hadef2, A. Djahoudi3
1
Laboratoire d’amélioration génétique des plantes, faculté des sciences, université Badji-Mokhtar, Annaba, Algérie
2
Laboratoire de chimie analytique, département de pharmacie, faculté de médecine, université Badji-Mokhtar, Annaba, Algérie
3
Laboratoire de microbiologie, département de pharmacie, faculté de médecine, université Badji-Mokhtar, Annaba, Algérie
Correspondance : adjahoudi@[Link]

Résumé : Les huiles essentielles (HEs) d’Origanum vulgare et

Introduction
de Thymus ciliatus, constituées de plus de 50 % d’alcools phé-
noliques (carvacrol et thymol), sont actives sur les souches de Pseudomonas aeruginosa est le troisième agent le plus incri-
Pseudomonas aeruginosa productrices de VIM-2 carbapénè- miné dans les infections nosocomiales en Algérie, notam-
mases à une concentration minimale inhibitrice moyenne de ment dans les pneumopathies nosocomiales acquises sous
1,7 mg/ml. Du fait que ce sont des plantes endémiques du ventilation mécanique (PNAVM) au niveau des unités de
Nord-Est algérien d’une part, et par leur richesse en HEs phé- soins intensifs [4]. Son pouvoir pathogène, opportuniste,
noliques d’autre part, Origanum vulgare et Thymus ciliatus est attribué à une large gamme de substances élaborées,
constituent une source incontournable de molécules bioactives. accentuée par une grande aptitude d’adaptation en milieux
Ainsi, elles pourraient contribuer à lutter contre les infections hostiles grâce à sa résistance naturelle aux antimicrobiens
sévères à Pseudomonas aeruginosa, face auxquelles l’arsenal mais aussi à sa capacité d’acquérir de nouveaux mécanismes
thérapeutique trouve souvent ces limites. de résistance [16].
Les infections par le bacille pyocyanique, dans les services
Mots clés : Huile essentielle – Origanum vulgare –
de réanimation, sont souvent traitées par les carbapénèmes,
Thymus ciliatus – Pseudomonas aeruginosa –
molécule à usage exclusivement hospitalier [25]. Alors qu’en
Carbapénèmases
Algérie, 12,30 % des souches isolées dans ces structures sont
résistantes à l’imipénème [4].
Effect of Essential Oil of Origanum vulgare
Cette résistance aux carbapénèmes est due à l’hydrolyse
and Thymus ciliatus against Pseudomonas aeruginosa du cycle β-lactame par les carbapénèmases. Chez Pseudomo-
Producing VIM-2 Carbapenemase nas aeruginosa, les enzymes les plus fréquemment mises en
Abstract: Origanum vulgare and Thymus ciliatus essential oils, cause sont des métallo-β-lactamase (MBL) de type VIM-2
consisting of more than 50% of phenolic alcohols (carvacrol [7]. Ces derniers, codés par des éléments génétiques mobi-
and thymol), are active against strains of Pseudomonas aerugi- les, sont transmis horizontalement, menant à des épidémies
nosa producing VIM-2 carbapenemases with an average mini- de gènes de résistance. Leur transfert vertical mène à des
mum inhibitory concentration of 1.7 mg/ml. Because they are impasses thérapeutiques [25].
endemic plants northeastern of Algeria on the one hand and Actuellement, un intérêt particulier est porté sur les subs-
produce high phenolic essential oils on the other hand, Origa- tances bioactives d’origine végétale, telles les huiles essen-
num vulgare and Thymus ciliatus are a key source of bioactive tielles (HEs). Ces dernières, par leur complexité, entravent
molecules. Thus, they could contribute to the fight against l’apparition de résistances microbiennes [14].
severe infections caused by Pseudomonas aeruginosa, which Parmi les plantes endémiques les plus abondantes du
deal with the therapeutic arsenal often find these limitsAu: Nord-Est algérien, on retrouve Origanum vulgare et Thy-
Meaning of this phrase is unclear.. mus ciliatus. Elles produisent des HEs riches en dérivés phé-
noliques, de carvacrol et de thymol, les plus actives molécu-
Keywords: Essential oil – Origanum vulgare – les antimicrobiennes décrites jusqu’à ce jour [14]. Ces
Thymus ciliatus – Pseudomonas aeruginosa – aromates pourraient-ils constituer une alternative aux anti-
Carbapenemases biotiques lors d’infections sévères à bacille pyocyanique
résistant et invasif dans les unités de soins intensifs.
2

1 ml/min. Les températures de l’injecteur et de la ligne de

Matériels et méthodes transfert ont été portées à 250 °C.
L’analyse a été réalisée en mode ionisation par impact
Souches bactériennes
électronique (EI) avec une énergie d’ionisation de 70 eV en
Dix souches de Pseudomonas aeruginosa, résistantes à l’imi- utilisant l’acquisition en mode scan (40–450u).
pénème par production d’enzymes de résistance aux carba- L’identification des chromatogrammes a été faite par
pénèmes, VIM-2 carbapénèmases, ont été utilisées comme interrogations de la banque de données NIST (National Ins-
test objet. Ces souches ont été isolées durant l’année 2011 titute of Standards and Technology). La méthode de norma-
au service de réanimation du centre hospitalo-universitaire lisation interne a été utilisée pour la détermination de la
de la ville d’Annaba (Algérie) [22]. quantité de chaque constituant.
Les gènes de résistances ont été mis en évidence au niveau
de l’unité des Rickettsies UMR CNRS 62366IRD 198, La
Timone, Marseille, par Real-Time-PCR et standard-PCR ;
ensuite, séquencés selon la méthode de Sanger modifiée, en
utilisant le kit Big Dye Terminator v3.1 Matrix Standard Kit Étude de l’activité antibactérienne
(Applied Biosystems, Foster City, CA, États-Unis) et le
séquenceur Automate ABI 3730 (Applied Biosystems), selon
les recommandations du constructeur. Aromatogramme
Les séquences obtenues sont analysées par le logiciel
« codan code aligner » et soumises via Internet, à l’aide du L’aspect qualitatif de l’activité antibactérienne de l’HE
logiciel Blast ([Link] pour compa- extraite sur les souches étudiées a été déterminé par
raison avec les séquences homologues, contenues dans la méthode de diffusion d’HE en milieu solide similaire à l’an-
banque informatique internationale dénommée tibiogramme selon les recommandations du Clinical Labo-
« GenBank ». ratory Standards Institue (CLSI) [3].
Des souches de référence de la collection américaine sen- Un disque imprégné de 20 µl de l’HE brute a été déposé
sibles aux antibiotiques, Pseudomonas aeruginosa sur milieu Mueller-Hinton (MH) préalablement ensemencé
ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC29213 et Escheri- à partir d’une suspension bactérienne de concentration
chia coli ATCC25922, ont été incluses comme témoins. équivalente au 0,5 McFarland (106–108 UFC).
Après incubation à 37 °C pendant 18 à 24 heures, l’acti-
vité est détectée par mise en évidence de zones d’inhibitions
HE autour des disques d’HE.

Matériel végétal
Les sommités fleuries d’Origanum vulgare et de Thy- Concentrations minimales inhibitrices (CMIs)
mus ciliatus, spontanées des régions montagneuses du
Nord-Est algérien, Djebel Houara (Guelma) et Djebel El
Les CMIs de l’HE extraite sur les souches étudiées ont été
Edough (Annaba) respectivement, ont été récoltées en mois
déterminées par méthode d’incorporation en milieu gélosé
de juin 2011. Les échantillons ont été séchés à l’air libre et à
selon les recommandations du CLSI [3,14].
l’abri de la lumière pendant dix jours [19].
Une gamme de dilution de l’HE testée a été réalisée dans
du diméthylsulfoxyde (DMSO). Les dilutions obtenues sont
Extraction des HEs additionnées de gélose MH, fondue au bain-marie et refroi-
Les HEs ont été obtenues par hydrodistillation du matériel die à 45 °C, de telle manière à obtenir les concentrations
végétal dans un appareil de type Linkens-Nickerson [19]. La d’HE par millilitre de milieu de culture suivantes : 2 %,
conservation de l’HE s’est faite à 4 °C et à l’obscurité. 1,5 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,25 %, 0,2 %, 0,15 %,
0,1 %, 0,075 %, 0,05 %, 0,025 % et 0,012 % [14].
Des spots de 2 µl d’un inoculum standardisé au
Étude analytique de l’HE 0,5 McFarland de concentration sont déposés sur les boîtes
L’analyse chromatographique de l’HE extraite a été réalisée de gélose à l’aide d’un applicateur multipoints. Le DMSO est
sur un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spec- utilisé comme contrôle négatif. Les boîtes sont incubées à
tromètre de masse de type Perkin Elmen-Claris 500 [1]. 37 °C pendant 24 heures.
La colonne utilisée était de type HP5-ms de 30 m de lon- La CMI est définie comme la plus faible concentration en
gueur, 0,25 mm de diamètre interne, l’épaisseur de film été présence de laquelle aucune croissance bactérienne similaire
de 0,25 µm. Les injections ont été faites en mode Splitless. à la croissance de la même souche sur la boîte témoin [3]
L’hélium a été employé comme gaz vecteur à un débit de Merci de vérifier la phrase.
 3

le thymol (57,66 %) puis le carvacrol (16,19 %) Merci de

Résultats vérifier la phrase. Le taux des monoterpènes hydrogénés
était de 19,95 %, représenté surtout par le O-cymène
Composition chimique des HEs extraites (12,04 %).
Les rendements moyens en HEs de l’Origanum vulgare et de
Thymus ciliatus sont de 2,7 % ± 0,06 et de 3,2 %. Constituant
une importante source de molécules bioactives. Pouvoir antibactérien de l’HE testée
L’analyse chromatographique par CPG/SM des HEs a
permis d’identifier une large gamme de composés rapportés Les valeurs des diamètres des zones d’inhibition (D) et des
dans le Tableau 1. CMIs des HEs testées sur les souches Pseudomonas aerugi-
Origanum vulgare a produit une HE caractérisée par nosa VIM-2, et des souches de références sont représentées
57,49 % d’alcools phénoliques représentés par le carvacrol dans le Tableau 2.
(33,85 %) et le thymol (23,64 %), suivis des monoterpènes La mesure des diamètres des zones d’inhibition qu’expri-
hydrogénés ; p-cymène (20,85 %) et γ-terpinène (12,03 %). maient l’HE d’Origanum vulgare et l’HE de Thymus ciliatus
Alors que, de Thymus ciliatus on a obtenu une HE com- donnait des valeurs extrêmes de 11,6 à 39,6 mm et de 11 à
posée de plus de 70 % d’alcools phénoliques, principalement 37,2 mm respectivement. Alors que les valeurs extrêmes des

Tableau 1. Composition chimique des HEs extraite

RT Nom Merci de vérifier Origanum vulgare Thymus ciliatus RT Nom Merci Origanum vulgare Thymus ciliatus
de vérifier

6,29 alpha-Thujene 0,53 – 20,94 Thymol 23,64 57,66

6,50 α-Pinene 0,31 – 21,08 Carvacrol 33,85 16,19
6,92 Fenchene 0,05 – 23,44 p-Menthene 0,13 –
7,79 3-Octenol 0,41 – 25,88 Caryophyllene 0,92 0,025
7,86 L-β-Pinene 0,15 – 27,26 α-Caryophyllene 0,05 –
7,90 NI – 1,49 28,24 γ-Cadinene – 0,12
8,23 β-Myrcene – 0,59 28,42 α-Curcumen – 0,11
8,60 α-Phellandrene 0,13 – 28,69 α-Guaiene 0,04 –
8,81 β-Terpinene 0,03 – 29,47 β-Bisabolene 0,55 –
8,90 3-Carene 0,83 – 29,70 β-Caryophyllene 0,29 –
9,02 Terpinolene 1,56 – 29,76 α-Cadinene – 0,12
9,13 α-Terpinene 0,09 0,68 30,08 δ-Cadinene – 0,25
9,19 β-Cymene 0,74 – 30,89 Linalylpropio- – 0,14
nate
9,34 p-Cymene 20,85 – 31,96 NI 0,02 –
9,40 O-Cymene – 12,04 Dérivés phénoliques 57,49 73,85
9,56 Limonène 0,38 0,22 Carbures 37,92 19,95
monoterpéniques
10,- γ-Terpinene 12,03 6,42 Alcools monoterpéniques 2,02 3,92
68
11,- Isoterpinolene 0,11 – Cétones monoterpéniques 0,19 0
84
12,- Linalol 1,04 2,87 Sesquiterpènes 2,21 0,62
28
15,- Borneol 0,12 0,63 Oxydes 0 0
10
15,- 4-Terpineol 0,65 0,42 Esters 0 0,14
58
15,- p-Cymonene 0,06 – Aldéhyde 0 0
71
16,- α-Terpineol 0,21 – Total 99,96 99,975
15
18,- 3-p-Menthanone 0,19 –
68

RT : temps de rétention ; Ori : Origanum vulgare ; Tc : Thymusciliatus.

4

Tableau 2. Diamètres des zones d’inhibition et CMI des HEs étudiées

Souches bactériennes testées HE d’Origanum vulgare HE de Thymus ciliatus

D (mm) CMI (mg/ml) D (mm) CMI (mg/ml)

Pseudomo- S67 18,3 1,39 18,5 1,83

nas aeruginosa S71 25,4 1,39 22,8 1,83
VIM2 S74 18,8 0,92 14,3 1,83
S139 24,9 1,85 16 1,83
S228 23,8 1,85 13 1,83
S229 30,2 1,85 15 1,83
S230 14,2 1,85 14,2 1,83
S231 20,3 1,85 14 1,37
S232 20,5 2,31 11 2,28
S233 11,6 1,85 15,5 1,37
Moyenne 20,8 ± 5,5 1,71 ± 0,4 15,4 ± 3 1,78 ± 0,3
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 16,6 1,39 13,5 1,83
Escherichia coli ATCC25922 34,1 0,46 37,2 0,46
Staphylococcus aureus ATCC29213 39,6 0,46 28 0,23

D : diamètre de zone d’inhibition ; CMI : concentration minimale inhibitrice.

CMI étaient comprises entre 0,46 et 2,31 mg/ml et 0,23 et le carvacrol seul (16,19 %) ne représente que près de la moi-
2,28 µl/ml pour les deux essences respectives. tié de la quantité retrouvée dans l’HE de l’origan (33,85 %),
ce qui pourrait indiquer une meilleure sensibilité du Pseu-
domonas au carvacrol.
Discussion Ce dernier possède une activité inhibitrice de l’ATPase
[12] qui induit la dissipation de la force proton-motrice,
Composition chimique des HEs touchant le fonctionnement de la cellule bactérienne
[21,24].
Le même chémotype exprimait par Origanum vulgare de Par ailleurs, la sensibilité des souches résistantes aux car-
notre étude, carvacrol, thymol, p-cymène, γ-terpinène, a bapénèmes testées aux HEs extraites est comparable à celle
été rapporté dans une étude marocaine avec des pourcenta- observée avec la souche de référence Pseudomonas aerugi-
ges comparables [9]. D’autres études européennes rappor- nosa ATCC27853 sensible aux carbapénèmes, ce qui suggère
taient un chémotype thymol, p-cymène, γ-terpinène. Dans que la résistance aux antibiotiques n’a aucune relation avec
ce cas, le carvacrol n’est retrouvé qu’en petites proportions la sensibilité aux HEs, indiquant des cibles bactériennes dif-
(0,2–15 %) [6,15]. férentes [14].
Par rapport à plusieurs autres études, l’HE de Thy- Aussi, Pseudomonas aeruginosa est moins sensible aux
mus ciliatus étudiée renfermait une forte teneur en carvacrol HEs étudiées que les autres espèces testées (Tableau 2). Ce
et en O-cymène ; cependant, une très faible teneur en α- qui concorde avec les résultats de plusieurs autres travaux
terpinène [2,13]. [10]. Cette sensibilité réduite serait attribuée à la structure
particulière de la membrane externe de ce genre, particuliè-
rement imperméable aux molécules hydrophobes, combinée
Activité antibactérienne des HEs aux mécanismes d’efflux, ce qui augmenterait les CMIs
Les valeurs exprimées par les deux HEs étudiées indiquaient effectives [5,18].
une bonne activité anti-Pseudomonas. Cette action antibac-
térienne serait attribuée aux dérivés phénoliques qui les
caractérisent (carvacrol et thymol) [11,14,20]. Ces derniers Conclusion
peuvent déstabiliser la membrane cytoplasmique interférant
ainsi avec le métabolisme énergétique et l’intégrité cellulaire Les HEs d’Origanum vulgare et de Thymus ciliatus récoltées
[8,17,23]. des régions montagneuses du Nord-Est algérien sont riches
Cependant, les valeurs exprimées indiquent une sensibi- en éléments phénoliques surtout le carvacrol. Leur action
lité plus au moins importante du Pseudomonas à l’HE de sur Pseudomonas aeruginosa résistant aux carbapénèmes
l’origan (21,6 mm, 1,71 mg/ml), alors que l’HE du thym ouvre la perspective d’usage de ce type de molécules pour
(15,43 mm, 1,78 mg/ml) renferme une proportion plus la prévention et la lutte contre l’apparition, la transmission
importante en alcools phénoliques (73,85 %). Par ailleurs, et la dissémination de bactéries résistantes, mais aussi pour
 5

la biodécontamination du matériel médical. Toutefois, elle 11. Fadli M, Saad A, Sayadi S, et al. (2012) Antibacterial activity of Thy-
reste tributaire d’évaluation de la toxicité et des aspects mus maroccanus and Thymus broussonetii essential oils against nosoco-
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