REPUBLIUE DU CAMEROUN

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MINISTERE DE LA SANTE
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ECOLE PRIVE DE FORMTION DES PRIVATE TRAINING SCHOOL
FOR MEDICAL AND HEALTH
PERSONNELS MEDICO-
PERSONNEL (PTSMHP) OF
SNITAIRES (EFOPSA) DE MOKOLO MOKOLO
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THEME:

TECHNIQUE DE CLONAGE

ENSEIGNANT : Dr KAFACHE

UE : METHODE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

NOM & PRENOM MATRICULES

KABALEY DJAMINAM EDOUARD 22TAM-2282
TILAGNA DIMICHEM 22TAM-1098
DOUDJA MOUSSA EVELE 22TAM-0430

ANNEE ACADEMIQUE

2024 2025
INTRODUCTION 5

I- TYPE DE CLONAGE 6

I.1. Clonage reproductif 6

I.1.1Principe 6

I.1.2 Étapes 6

I.1.3 Applications : 6

I.2 Clonage thérapeutique 9

I.2.1 Principe : 9

I.2.2 Étapes : 9

I.2.3 Applications : 9

I.2.4- Avantage : 9

I.2.5- Inconvénients : 9

I.3- Clonage moléculaire (clonage de l'ADN) 9

I.3.1- Principe : 9

I.3.2-Étapes : 9

2. Insertion dans un vecteur: Le fragment est inséré dans un vecteur (comme un plasmide). 10

I.3.3-Applications 10

I.3.4-Avantages 10

I.3.5- Inconvénients 10

II. OUTILS DE CLONAGE : 10

II.1.Les enzymes de restriction: 10

II .2- Vecteurs de clonage 11

II.2.1- Types de vecteurs 11

II.2.- Caractéristiques des vecteurs 12

II.3. Procédure de clonage selon les vecteurs utilisés : 12

II.3.1. Plasmide : 12

II.3.2. Le phage lambda (λ) 13

II.3.3. Cosmides : 14

III. APPLICATION DE TECHNIQUE CLONANAGE DE L’ADN: 17

IV- IMPORTANCE DE TECHNIQUE 17

CONCLUSION 18
 INTRODUCTION

Le terme clone est utilisé pour la première fois en 1903 par le botaniste H.J.
Webber en désignant des plantes reproduites par multiplication asexuée. Ce mot sera
ensuite réutilisé par J.B.S. Haldane. Le clonage moléculaire est la création de copies
exactes d'un fragment d'ADN spécifique en l'insérant dans un vecteur capable de se
répliquer dans une cellule hôte. Cela permet d'étudier des gènes, de produire des
protéines et de modifier génétiquement des organismes. Le processus implique des
enzymes de restriction pour couper l'ADN, des ligases pour unir les fragments et des
vecteurs pour transporter l'ADN inséré. Depuis plus de vingt ans, le clonage, ou la
reproduction exacte de gènes particuliers et de types individuels de cellules, est une
technique employée en biotechnologie afin de produire des médicaments et des
vaccins pour traiter plusieurs maladies.
 I- TYPE DE CLONAGE

I.1. Clonage reproductif

I.1.1Principe

Le clonage reproductif vise à créer un organisme entier qui est génétiquement identique à
l'organisme donneur. La technique la plus courante pour cela est le transfert nucléaire de
cellules somatiques (TNCS).

I.1.2 Étapes

1. Extraction de l'ADN : On prélève une cellule somatique (non reproductrice) de l'organisme

donneur.

2. Enlèvement du noyau : On retire le noyau de cette cellule, qui contient l'ADN.

3. Préparation de l'ovule : Un ovule est prélevé d'un donneur et son noyau est enlevé.

4. Insertion du noyau : Le noyau de la cellule somatique est inséré dans l'ovule énucléé.

5. Stimulation : L'ovule est stimulé pour commencer à se diviser et se développer en embryon.

6. Implantation : L'embryon est implanté dans l'utérus d'une mère porteuse où il peut se
développer jusqu'à terme.

I.1.3 Applications :

- Conservation des espèces menacées.

- Reproduction d'animaux de valeur pour l'agriculture ou la recherche.

I.1.4 Avantage :

- Permet la reproduction d'organismes génétiquement identiques.

I.1.5 Inconvénients :

- Coûteux et techniquement complexe.

- Problèmes éthiques importants.

 I.2 Clonage thérapeutique

I.2.1 Principe :

Le clonage thérapeutique a pour but de produire des cellules souches embryonnaires pour la
recherche et le traitement de maladies. Cette technique utilise également le transfert nucléaire
de cellules somatiques.

I.2.2 Étapes :

1. Extraction de l'ADN : Même processus que pour le clonage reproductif.

2. Développement de l'embryon : L'embryon cloné est cultivé jusqu'au stade de blastocyste.

3. Extraction des cellules souches: Les cellules souches sont extraites du blastocyste pour être
utilisées en recherche ou en traitement.

I.2.3 Applications :

- Traitement de maladies dégénératives.

- Recherche sur les cellules souches et la médecine régénérative.

I.2.4- Avantage :

- Potentiel de traitement pour des maladies incurables.

- Réduction des risques de rejet lors de greffes.

I.2.5- Inconvénients :

- Risque de formation de tumeurs.

- Problèmes éthiques liés à l'utilisation de cellules souches embryonnaires.

I.3- Clonage moléculaire (clonage de l'ADN)

I.3.1- Principe :

Le clonage moléculaire consiste à copier des fragments d'ADN pour la recherche. Cette
technique est couramment utilisée en biotechnologie et en génétique.

I.3.2-Étapes :

1. Isolation de l'ADN: Un fragment d'ADN d'intérêt est isolé.

 2. Insertion dans un vecteur: Le fragment est inséré dans un vecteur (comme un
plasmide).

3. Introduction dans une cellule hôte: Le vecteur est introduit dans une cellule hôte (souvent
une bactérie).

4. Multiplication: La cellule hôte se divise, produisant de nombreuses copies du fragment d'ADN.

I.3.3-Applications

- Production de protéines recombinantes.

- Étude des fonctions génétiques.

- Recherche sur les maladies génétiques.

I.3.4-Avantages

- Permet une analyse précise des gènes.

- Utilisé pour la production de médicaments.

I.3.5- Inconvénients

- Limité à la copie de fragments d'ADN.

- Risque de contamination croisée.

II. OUTILS DE CLONAGE :

II.1.Les enzymes de restriction:

Joindre les molécules d’ADN ensemble pour le clonage dépend de l’utilisation

d’enzymes de bactéries appelées endonucléases de restriction. Ces enzymes coupent
les molécules d’ADN au niveau de séquences spécifiques, généralement 4 à 8 bases.
Les séquences reconnues sont des palindromes. Ceci signifie que la séquence est la
même lorsqu’on la lit dans le sens 5’ vers 3’sur les deux brins. Chaque enzyme a une
séquence cible spécifique. Par exemple, l’enzyme EcoRI, qui est issue de la bactérie
E.coli coupera n’importe quelle molécule d’ADN portant la séquence GAATTC. Les
autres endonucléases de restriction reconnaissent des séquences différentes. La
coupure réalisée par l’enzyme de restriction n’est généralement pas franche, c’est-à-dire
que les deux brins de la double hélice sont coupés à quelques bases de distance. Ceci
crée des portions simples brins qui dépassent, et qu’on appelle extrémités cohésives ou
bouts collants. Certaines enzymes de restriction coupent l’ADN en laissant dépasser
une extrémité 5’ et d’autres laissant dépasser une extrémité 3’. Il existe des enzymes
qui coupent de façon franche les deux brins au même endroit (Figure 1). Noter que
même lorsque les molécules sont jointes par des extrémités cohésives, elles ne sont
pas liées de façon covalente. Une enzyme appelée ADN ligase, est utilisée pour
catalyser la formation d’une liaison phosphodiester entre deux molécules d’ADN, les
recombinant ainsi de façon permanente. Il existe plusieurs systèmes pour cloner des
molécules d’ADN, en fonction du type de vecteur utilisé. Chacun présente ses propres
caractéristiques et utilisations.

Figure 1 : Action d’enzymes de restriction sur l’ADN.

II .2- Vecteurs de clonage

II.2.1- Types de vecteurs

- Plasmides : Petites molécules circulaires d'ADN présentes dans les bactéries, faciles à
manipuler et à introduire dans des cellules hôtes.

- Phages : Vecteurs dérivés de bactériophages, capables d'infecter les bactéries et de

transporter de grandes quantités d'ADN.

- Cosmides : Combinaison de plasmide et de phage, capable de cloner des fragments

d'ADN de grande taille.

II.2.- Caractéristiques des vecteurs

Les vecteurs de clonage ont des sites de clonage multiple (MCS) contenant plusieurs
sites de restriction, des marqueurs de sélection (comme la résistance aux antibiotiques)
et des origines de réplication pour se répliquer dans les cellules hôtes.

II.3. Procédure de clonage selon les vecteurs utilisés :

II.3.1. Plasmide :

Les plasmides forment le type le plus commun de vecteur de clonage. La procédure de

clonage peut être divisée en plusieurs étapes comme suit (Figure 2). Le plasmide est
digéré par une enzyme de restriction qui le coupe en un site unique et transforme la
molécule circulaire qu’il était en une molécule linéaire avec des extrémités cohésives.

L’ADN étranger à cloner est lui aussi digéré par la même enzyme de restriction pour
produire les mêmes bouts collants,

Le plasmide et l’ADN étranger sont mixés, des molécules plasmides sont jointes à des
molécules d’ADN étranger via leurs extrémités cohésives communes et on obtient des
plasmides recombinants circulaires,

L’ADN ligase est utilisé pour joindre de façon covalente les deux,

Le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie hôte (généralement E. coli) par
un processus appelé transformation,

Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur des plaques d’agar et les colonies
des bactéries composées de cellules ayant correctement intégré le plasmide
recombinant croissent,
Des colonies individuelles sont séparées et cultivées en milieu liquide. De grandes
quantités de plasmides peuvent alors être purifiées à partir des cultures et on peut
récupérer l’ADN cloné pour l’analyse.
Figure 2 : Représentation schématique du clonage d’ADN via des plasmides.

II.3.2. Le phage lambda (λ)

Le phage λ a été adapté à une utilisation comme vecteur de clonage. La portion centrale
de l’ADN de λ, qui n’est pas essentielle à l’infection, est détruite, laissant des fragments
5’ et 3’ appelés bras (Figure 3). La région ayant subit la délétion peut être remplacée par
l’ADN étranger pour produire un phage à ADN recombinant (Figure 3). Celui-ci est inséré
dans les capsides phasiques in vitro par un processus appelé empaquetage qui
suppose de mélanger l’ADN du phage recombinant avec un extrait d’empaquetage
contenant les protéines de la capside du phage et des enzymes nécessaires à la
fabrication. Des particules de phages recombinants sont produites et elles infectent E.
coli avec une grande efficacité. Les cellules infectées sont étalées sur une plaque
d’agar et produisent un feuillet continu de bactéries appelé une couche qui contient de
petites zones de la taille d’une épingle à cheveux. Ces zones correspondent aux plages
de lyse produites par l’infection phagique. Des plages individuelles peuvent être isolées
et utilisées pour générer des quantités importantes d’ADN cloné par infection de
cultures fraiches d’E. coli.

Le principal avantage de λ en tant que vecteur de clonage est que la taille des
fragments qui peuvent y être insérés est bien supérieure à celle des inserts
plasmidiques. Le phage λ peut en effet héberger des fragments long jusqu’à 25Kpb, à
comparer aux 10Kpbmaximales des inserts dans les vecteurs plasmidiques. Cette
possibilité de cloner de plus larges fragments a conduit au développement de la
principale utilisation de λ dans la construction de banques
d’ADN.

Figure 3 : (a) Le phage λ (b) Utilisation

du phage λ comme vecteur de clonage (
 II.3.3. Cosmides :

Ce type de vecteur combine des caractéristiques rencontrées chez les plasmides

et le phage λ.

Les cosmides ont tous les trais normaux des plasmides, y compris un MCS et des
gènes conférant une résistance à des antibiotiques, mais ils incluent aussi des
séquences issues de λ appelées séquences cos. Elles sont situées aux deux extrémités
de la molécule d’ADN de λ et sont responsables de son insertion dans la capside du
phage. Cloner avec des cosmides combine des caractéristiques associés à l’utilisation
de λ et de plasmides comme vecteur de clonage (Figure 4). L’ADN des cosmides est
clivé par une enzyme de restriction et lié à l’ADN étranger. Le cosmide recombinant est
ensuite empaqueté dans les capsides de λ et utilisé pour infecter E. coli. Les cosmides
ne contiennent pas tous les gènes de λ et ne forment donc pas de plages après
infection. Au lieu de cela, les cellules infectées sont cultivées sur de l’agar contenant
des antibiotiques et les colonies résistantes contenant des cosmides recombinants
sont isolées et peuvent être amplifiées de la même façon que des plasmides. Les
cosmides ont l’avantage d’être capable d’héberger de très gros inserts. Sachant que les
cosmides sont petits, typiquement 8Kpb et que la capside de λ peut accueillir 52Kpb,
les inserts cosmidiques peuvent mesurer jusqu’à 44Kpb
Figure 4 : Cloner avec des vecteurs cosmidiques .
 III. APPLICATION DE TECHNIQUE CLONANAGE DE L’ADN:

Le clonage de l’ADN est une technique puissante qui a apporté d’importantes

contributions dans de nombreux domaines de la recherche biologique, principalement :

-L’identification de gènes impliqués dans des maladies ;

-La cartographie des génomes ;

-La production de protéines recombinantes ;

-Les organismes génétiquement modifiés.

IV- IMPORTANCE DE TECHNIQUE

Le clonage moléculaire est essentiel pour :

- Recherche génétique : Étudier la fonction des gènes et leur régulation.

- Production de protéines recombinantes : Produire des protéines pour des applications

thérapeutiques et industrielles, comme l'insuline et les enzymes.

- Thérapie génique : Corriger les mutations génétiques responsables de maladies.

- Création d'OGM : Modifier les organismes pour améliorer leurs traits, tels que la
résistance aux maladies ou l'augmentation de la production.
 CONCLUSION

En conclusion la technique de clonage est une méthode puissante qui offre de

nombreuses possibilités pour la recherche et la thérapie ; mais qui nécessite
également une réflexion éthique et morale approfondie pour éviter le risque et les
conséquences négatives.