CHAPITRE :
Introduction aux méthodes
de séparations
Madani MARIKO
Objectifs du cours
1. Citer les différentes méthodes de séparation
2.. Citer les différentes méthodes
chromatographiques et les techniques associées
3. Décrire le principe de la chromatographie
4. Citer trois applications de la CCM
Plan du cours
Introduction
1. Types de chromatographie
2. Chromatographie planaire (CCM)
3. Autres méthodes de séparation
Conclusion
Introduction
La chromatographie est une méthode de séparation des espèces
moléculaires contenues dans un mélange parfois très complexe
(pétrole, sang, parfum, extraits de plantes, médicaments etc.).
Elle met en jeu une phase stationnaire capable d’attirer les molécules
et une phase mobile capable de les entraîner.
La nature de la phase mobile, appelée aussi fluide vecteur,
caractérise le type de chromatographie (gazeuse, liquide,
supercritique)
Elle occupe une place très importante dans l’analyse des composés
chimiques 4
1. Types de chromatographie
Il y a essentiellement deux types de chromatographie :
La chromatographie en Phase Gazeuse use (CG);
Et la Chromatographie en Phase Liquide (CPL).
De nos ils associés à des instruments très sophistiqués,
modernes, de dernières générations
Ces techniques fuiront l’objet de vos cours d’analyse
instrumentale en classe supérieur
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1. Types de chromatographie
De façon particulière, le type de chromatographie liquide
(CL) se reparti en plusieurs techniques selon les
phénomènes physico-chimiques misent en jeu
Ainsi, on distingue parmi ce type :
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1. Types de chromatographie
Il y a aussi des techniques non instrumentalisées qui
se pratique plus couramment et sont faciles à mettre en
ouvres.
Il s’agit de la Chromatographie sur Couche
Mince (CCM) ou Chromatographie Planaire (CP) et
sur Colonne Ouverte. Ces dernières feront l’objet de
ce chapitre d’introduction aux méthodes
chromatographique et seront bien détaillées
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2. Chromatographie planaire (CCM)
2.1. Principe de la chromatographie
Repose sur l’équilibre de concentrations (des analytes ou solutés
présents dans l’échantillon à analyser, toujours en milieu liquide)
entre deux phases en contact notamment : la phase stationnaire et
la phase mobile en déplacement.
La séparation est basée sur déplacement différentiel des
constituants du mélange (taille, polarité, poids moléculaire, affinité,
structure….)
Les solutés parcourent ainsi la phase stationnaire avec des
temps proportionnels à ces rs propriétés intrinsèques
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2.1. Principe de la chromatographie
K correspond au rapport des concentrations du soluté A dans la
phase stationnaire Cs et la phase mobile Cm. 10
2.2. Mise en ouvre de la CCM
Après un dépôt de l’échantillon (10 à 20 µL) sur la plaque
Elle sera séchée et mise dans une cuve préalablement
conditionné en avec un solvant ou mélange de solvant.
La cuve reste hermétiquement fermée environ 1 heure
avant pour saturer l’atmosphère en vapeur d’éluant.
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2.2. Mise en ouvre de la CCM
Les différents composés chimiques se déplacent le long de
la phase stationnaire à l’aide du déplacement de la phase
mobile
Derrière le front du solvant avec des différentes de vitesses
qui dépendent:
Des forces électrostatiques (retenant plus ou moins les
composés sur la phase stationnaire)
Leurs solubilités
Leurs polarités vis-à-vis de la phase mobile et stationnaire
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2.3. Phase mobile
Plusieurs systèmes d’élution peuvent être sollicités selon le
type de substance chimique (milieux complexe) et des fois,
un seul solvant peut servir d’éluant (composé pur)
Dans tous cas possibles, la pratique exige tout d’abord une
optimisation de la phase mobile dans le seul but de faire un
choix judicieux (choix du solvant ou mélange de solvant le
plus approprié)0 13
2.3. Phase mobile
Exemples
Chloroforme /Méthanol /Acide ;
Toluène / acétate d’éthyle /Méthanol ;
Acétate d’éthyle/Ethanol/Eau ;
Acétonitrile/Acétate d’éthyle/Ethanol/Eau; ;
Acétate d’éthyle/Acide formique/Acide acétique glacial/ Ethyle
méthyl cétone/Eau;
Chloroforme/Acétone/Acide formique ;
Chloroforme/Acétone/ Acétate d’éthyle ;
Chloroforme. 14
2.4. Phase stationnaire
La chromatographie sur papier spécial (matière fibreuse ou
adsorbante) qui peut être découpé avec des ciseaux à la
dimension voulue n’est plus guère utilisée de nos jours que
dans quelques cas particuliers comme la chromatographie
des colorants.
En CCM, les plaques prêtes à l’emploi sont disponibles
chez de nombreux fabricants.
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2.4. Phase stationnaire
Elles sont constituées d’un support inerte rigide ou
souple (plaque de verre, feuille d’aluminium, de
polyamide, etc.)
Sur lequel la phase stationnaire est déposée (gel de
silice) sous forme d’une couche mince (épaisseur de 200
à 250 µm).
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2.4. Phase stationnaire
Schéma simplifié de la surface d’un gel de silice est
donné ci-après :
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2.5. Dépôt - Elution - Révélation
La plaque CCM chargée d’échantillons dont la ligne de
dépôt se trouve tracé au crayon et les lieux de dépôt sur
la ligne repérés par des points; est bien séchées à l’aide
d’une étuve
Ensuite elle est placée dans la cuve de développement
bien fermée avec un couvercle adhésif
Le temps (monté capillaire de l’analyte) de migration est
chronométré pendant environ 15 mn
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2.5. Dépôt - Elution - Révélation
Lorsque l’élution s’approche de la limite du bord supérieur à 1 cm
qui représente le front du solvant, la plaque est immédiatement
retirée de la cuve et ce dernier est marqué avec un crayon
La plaque après séchage dans l’étuve à 100°C est en fin révélée
avec une solution révélatrice (KMnO4 ; vanilline sulfurique,
chlorure d’aluminium par exemple). C’est la méthode chimique
Ou encore sous UV-visible à 254 puis à 366 nm. C’est la méthode
physique
Les différents spots deviennent ainsi visible à l’œil nu s’ils en
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existent,
2.6. Montée capillaire- grandeurs cinétiques
La couche poreuse peut être assimilée à une multitude de petits
capillaires interconnectés et le liquide monte sur la couche en
remplissant d’abord les capillaires les plus petits.
On constate expérimentalement que la relation entre la distance Df
parcourue par le front du solvant et le temps t est de la forme
suivante :
La vitesse du front du solvant est donc :
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2.6. Montée capillaire- grandeurs cinétiques
La constante k est la constante de vitesse, elle a été explicitée et
s’écrit:
où b est la constante de proportionnalité entre la vitesse
d’avancement du front du solvant dDf/dt et la vitesse locale de
phase mobile, b est en général de l’ordre de 0,8,
B0 est la perméabilité de la couche,
dp le diamètre des particules du milieu poreux,
γ la tension superficielle du solvant de viscosité η,
θ est l’angle de mouillage car le dépôt se fait en plan incliné
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2.7. Conduite de la méthode
Ensemble (Cuve - Solvant – Plaque) en figure ci-
dessous
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2.7. Conduite de la méthode
Lecture et Rapport frontal (Rf)
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2.7. Conduite de la méthode
Force Eluotrope de quelques solvants
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2.8. Applications de la CCM
Tous les solutés qui peuvent être chromatographiés en
CLHP peuvent l’être en CCM
La CCM a souvent été utilisée comme technique
pilote dans la mise au point de systèmes
chromatographiques CLHP.
Étude de substances naturelles
Toxicologie d’urgence à l’hôpital.
Recherche de traces d’explosifs après attentat
Produits pharmaceutiques 25
3. Autres méthodes de séparation
3.1. Mise en ouvre de la CCO
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3.2. HPLC
3.3. CPG
3.4. Electrophorèse
Cette méthode est essentiellement utilisée dans le
monde médicale (laboratoire de biologie médicale)
pour séparer les constituent biologie (protéine et
hémoglobines par exemples)
Le déplacement des constituants se fait dans un
électrique
3.4. Electrophorèse
3.5. Centrifugation
Cette méthode est également utilisée dans les
laboratoires pour séparer les composés en fonction
de leurs poids moléculaires
Les composés les plus denses se déposent au fonds
tan disque les moins denses se retrouvent en
surface après centrifugation
Le nombre de tour de la centrifugeuse et le temps
de centrifugation jouent un rôle très important dans
3.5. Centrifugation
3.6. Evaporation
Evaporation: permet de séparé une phase liquide
d’une phase solide
Rotavapor
3.7. Extraction liquide-liquide
Avec des solvants non miscibles ayant des
solubilité différentes vis-à-vis à extraire (cas des
sirops et composés photochimiques)
3.8. Tri-Tamisage-Filtration
Le tris se fait à l’œil nu
Le tamisage utilise des tamis de maille différentes
selon la granulométrie souhaitée
Le tamisage est l’une des étapes incontournable
dans la fabrication des comprimés précisément à
l’étape de la granulation
Ces trois méthodes sont aussi utilisées par le
service de distribution des eaux potables
Conclusion
Les méthodes de séparation sont très utiles et
largement utilisées dans le monde entier.
Elles jouent un rôle crucial dans l’évolution de la vie
tan disque l’évolution scientifique a pu apporter une
instrumentation adéquate à la pratique pour une
amélioration de la santé humaine et animale
Ces différentes méthodes sont utilisées en routine
dans les tous les laboratoires dans le domaine du
contrôle, de la biologie et de la recherche)
