Bases du diagnostic moléculaire
D R C H A R LOT T E C H A R PE N TI E R U N I V E RS ITÉ PAR I S D I D E ROT
P R VI RG IN I E F E R R E U N I V E RS ITÉ D E N AN TES
D R B E N O I T V I S S EAU X U N I V E RS ITÉ PAR I S D I D E ROT
02/11/2018 AGENTS INFECTIEUX – PHASE SOCLE BASES DU DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE 1
Objectifs
• Connaitre le principe des différentes étapes de biologie moléculaire
(extraction, amplification, détection)
• Comprendre l’organisation du laboratoire et des contrôles à mettre en place
• Connaitre les principales applications des techniques de biologie moléculaire
dans le diagnostic médical
• Connaitre les informations apportées et leurs limites
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INTRODUCTION : méthodes directes vs. indirectes
Méthode diagnostique directe
• Mise en évidence du virus ou
d’un fragment du virus
• Le virus est présent dans le
prélèvement !
Méthode diagnostique indirecte
• Mise en évidence d’anticorps
dirigés contre le virus
• Le virus n’est plus
nécessairement présent !
Place et modalité de la biologie
moléculaire
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Une PCR… pourquoi faire ?
PCR QUALITATIVE PCR QUANTITATIVE
Détection d’un génome viral Détection ET quantification d’un génome viral
Applications : Applications :
• Diagnostic d’infection • Virus pour lesquels la quantification a un
• Virus pour lesquels la quantification n’apporte caractère pronostic
pas d’information supplémentaire • Virus pour lesquels un suivi de l’efficacité
• Typage moléculaire (données épidémiologiques) thérapeutique est nécessaire
Exemples : Exemples :
• HSV-1/2 • VIH
• Virus respiratoires • CMV, EBV
• Entérovirus • VHB
• (…) • VHC
• (…)
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Vue générale et organisation du laboratoire
Risque de contamination par les amplicons
Marche en avant pour le personnel et les échantillons
Pièce(s) pré-amplification (habillage, sens de circulation) Pièce(s) post-amplification (« pièce sale »)
Préparation de
l’échantillon et extraction Analyse
des acides nucléiques Addition des acides Amplification des acides
post-PCR
nucléiques dans les nucléiques
(détection en point final,
Préparation des milieux milieux réactionnels (thermocycleurs)
séquençage, …)
réactionnels (mix) de PCR
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Première étape : EXTRACTION des acides nucléiques
Prélèvement : EDTA Particules
• Conditions pré-analytiques virales
à respecter (délai, milieu de LCR
ARN
transport, anticoagulant)
Lyse :
• Destruction des tissus, Ecouvillon Cellules
membranes et capsides
Lyse : Purification :
Purification : Biopsie
•Colonnes
• Protéinase K
• Isoler les acides nucléiques • Lysosyme •Billes
des autres composants • Chimique •…
Tissus
• Sonication ADN
Nombreuses méthodes, LBA, •…
à choisir en fonction de Urine,
(...)
l’échantillon
Héparine
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Première étape : EXTRACTION des acides nucléiques
Extraction manuelle Extraction automatisée
Méduse d’ADN par Exemples
extraction d’extracteurs
phénol/chloroforme semi-automatisés
(non utilisé en diagnostic) ou automatisés
Extraction sur
colonne de silice
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Deuxième étape : AMPLIFICATION par Polymerase Chain Reaction (PCR)
Objectif : Acides
nucléiques
: Dénaturation (95°C)
• Amplification spécifique du gène cible extraits
+
Les amorces : Amorces
« Cycles » de
sens et
• Séquence nucléotidique courte différentes
+ anti-sens : Hybridation amorces (+/-50 °C)
• Assure la spécificité (séquence ciblée du gène Polymérase
températures
recherché)
• Assure la sensibilité (région génomique +
Nucléotides
conservée)
+ : Elongation (72°C)
La polymérase : Tampon, ions
• Enzyme permettant la synthèse du brin pour la polymérase, …
complémentaire à haute température (≈ 72°C)
Les cycles de température : 4e 5e 6e n
cycle cycle cycle cycle
• Répétition de 3 étapes sur un thermocycleur
16 32 64 2n
• Dénaturation (séparation des doubles brins) ADN ADN ADN ADN
• Hybridation (fixation des amorces spécifiques)
• Elongation (synthèse du brin complémentaire)
T°C
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Deuxième étape : AMPLIFICATION par Polymerase Chain Reaction (PCR)
Il existe plusieurs autres techniques d’amplification non basées
ou dérivant de la PCR « classique »
RT-PCR (Reverse Transcription – PCR) :
• Permet d’amplifier un fragment d’ARN
(et non d’ADN)
• Ajout d’une étape de transcription inverse
(reverse transcription en anglais) assurée
par une reverse transcriptase Amplification du signal :
• bDNA - ADN branché
• (…)
PCR isothermale :
• LAMP – Loop-mediated isothermal amplification (ADN)
PCR classique • TMA – Transcription mediated amplification (ARN)
• NASBA – Nucleic acid sequence based amplification
ARN ADN (ARN)
• (…)
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Troisième étape : DÉTECTION en point final
plateau Echelle
de taille
Quantité d’ADN
300 pb
200 pb
100 pb
Nombre de cycles
Thermocycleur Courbe d’amplification Migration électrophorétique Révélation du gel d’agarose
Comment vérifier que l’on a bien amplifié le gène cible (= présence du génome de l’agent pathogène recherché) ?
Méthode de révélation en point final
• A la fin des cycles de PCR (35 à 40 cycles), on atteint généralement la phase de plateau (épuisement de la PCR)
• Prélèvement d’une fraction du mélange réactionnel et dépôt sur gel
• Migration électrophorétique (séparation des amplicons en fonction de leurs tailles)
• Révélation du gel par utilisation d’agent intercalant (fluorescence des doubles brins d’ADN)
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Quatrième étape : COMMENT TYPER à partir d’un produit de PCR ?
1. Hybridation moléculaire sur bandelette : typage d’HPV , VHC, …
Génotype
VHC : 4 1a 3 1b 2
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Quatrième étape : COMMENT TYPER à partir d’un produit de PCR ?
2. Séquençage du génome amplifié VIH, VHC, Entérovirus, ...
Typage (BLAST, phylogénie, …)
Epidémiologie fine
Détection de mutation(s)
associée(s) à la résistance
aux antiviraux
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Détection en temps réel…
Le principe de la PCR est conservé, seule la T° de dénaturation
technologie de détection est modifiée.
Elle permet l’observation de la CINETIQUE de
production des amplicons
T° d’hybridation
Là encore il existe plusieurs technologies… Nous R Q
n’aborderons ici que les méthodes utilisant des
sondes d’hydrolyse
Dans cette approche, utilisation d’une « sonde » : T° de polymérisation
Amorce spécifique du génome cible avec Synthèse de nouveaux
Q
un fluorochrome « Reporter » (R) et un brins et lyse de la sonde à
chaque nouveau brin
« Quencher » (Q) qui absorbe la lumière émise par
R tant qu’il est à proximité immédiate
A chaque cycle,
l’émission de
fluorescence
R Q augmente
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Détection en temps réel…
• Acquisition de la courbe de fluorescence en temps réel
• Sélection d’un seuil dans la phase exponentielle de la courbe d’amplification
• Détermination des Ct (Cycle threshold)
Phase plateau
4
Fluorescence
3
Phase exponentielle
2
Ct (Cycle threshold)
= intersection amplification et seuil
1
Seuil de détection
(threshold)
10 2O 24 3O 4O 5O
Nombre de cycles de PCR
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Détection en temps réel et QUANTIFICATION
• Calcul de la droite d’étalonnage à partir de la gamme
• Calcul des quantités d’acides nucléiques initialement présentes dans les échantillons
Echantillon avec une
3000 forte quantité 6
Nombre de copies/mL en log
initiale de virus
2500
5
Fluorescence
2000
4
1500 Echantillon avec
une faible quantité 3
1000
initiale de virus
500 2
0 1
-500 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Nombre de cycle Nombre de Ct
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PCR et multiplexage
PCR simplex vs multiplex
• Une PCR simplex ne recherche qu’un seul fragment de génome pour un pathogène ciblé
• Une PCR multiplex recherche simultanément plusieurs fragments génomiques différents pour
un/plusieurs pathogène(s) ciblé(s)
Quelques exemples : FilmArray Biofire®
bioMérieux Une seule prise d’essai :
• Plus facile et plus rapide
• Certains tests < 1 heure
… Mais :
• Complexe +++
-Nombre élevé d’amorces
-Interaction entre amorces
-Compétitions de PCR
AnyplexTM -(…)
Seegene • Coût élevé (surtout en test unitaire)
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Biologie moléculaire et ses NOMBREUX TÉMOINS
VÉRIFICATION DE LA QUALITÉ DE VÉRIFICATION DE L’ABSENCE DE
L’AMPLIFICATION CONTAMINATION
• Témoin positif d’extraction : ajouté avant • Témoin négatif d’extraction : ajouté avant
l’extraction l’extraction (eau, tampon, matrice négative, …)
• Témoin positif d’amplification : ajouté lors de la • Témoin négatif d’amplification : ajouté lors de la
réalisation des mélanges réactionnels réalisation des mélanges réactionnels (eau)
• Témoin d’inhibition (contrôle interne) : acide
nucléique connu ajouté dans chaque échantillon
avant extraction pour s’assurer de l’absence
d’inhibiteur de PCR
Témoin Témoin positif Témoin positif
d’inhibition d’extraction d’amplification
Témoin négatif Témoin négatif
extraction d’amplification 17
BILAN de la biologie moléculaire
AVANTAGES LIMITES
• Détecte les virus non cultivables • Impact de la diversité génétique virale et de ses
évolutions
• Evolution constante des technologies, de leur
standardisation et de leur automatisation • Validation des trousses réactifs impérative avec
panel représentatif de la diversité virale
• Technique très sensible et très spécifique
• Ne détecte que ce l’on pense à rechercher
• Quantification possible
• Détection d’un génome non informative sur le
• Technique d’urgence (de 1h à 24h) caractère infectieux
• Peut permettre l’obtention de la séquence du • Danger des contaminations par les amplicons
génome viral pour des analyses très spécialisées (personnel expérimenté, habillage, locaux)
(étude de résistance, épidémiologie,
phylogénie…) • Coût
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POINTS CLES
• Ces techniques permettent de détecter +/- de quantifier les acides nucléiques viraux
présents dans l’échantillon testé
• La plupart des techniques se déroulent en trois étapes :
- Extraction (isoler l’acide nucléique)
- Amplification (multiplier la quantité du gène cible)
- Détection (détecter +/- caractériser le gène amplifié)
• Ces techniques sont sensibles au risque de contamination et nécessitent des locaux adaptés
et du personnel entrainé
• Ces techniques requièrent de valider plusieurs types de contrôles (amplification,
contamination)
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REFERENCES
Pour aller plus loin…
• REMIC – Référentiel en Microbiologie Médicale (2018 – en cours de réédition)
• Traité de Virologie Médicale (en cours de réédition)
• Fields Virology (6th edition, 2013)
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QUIZ
Quelle(s) est(sont) le(s) proposition(s) exacte(s) à Quelle(s) est(sont) le(s) proposition(s) exacte(s) à
propos des techniques de PCR : propos des techniques de PCR :
1. La PCR est plus sensible que la détection 1. La détection en point final permet la
antigénique quantification des acides nucléiques viraux
2. La RT-PCR permet d’amplifier des virus à ARN 2. La lecture des PCR en temps réel est assurée
3. Les PCR multiplexes permettent d’identifier par un migration électrophorétique sur gel
plusieurs agents pathogènes sur une seule prise 3. L’interprétation des PCR qualitatives est faite
d’essai par comparaison à une gamme d’étalonnage
4. Les PCR quantitatives sont toujours plus 4. Le témoin d’inhibition permet de vérifier
informatives que les PCR qualitatives l’absence de contamination
5. La biologie moléculaire est souvent plus 5. Une sonde d’hydrolyse pour la PCR en temps
robuste à la diversité virale que la sérologie réel est une amorce couplée à un reporter et un
quencher
Réponses : 1, 2, 3 Réponse : 5
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