15/11/2023
MICROBIOLOGIE II
(M29)
LICENCE D’ETUDES FONDAMENTALES
EN SCIENCES DE LA VIE / Semestre 5
Pr. Naima TAQARORT
Transferts génétiques : La
conjugaison
C’est un transfert actif de matériel génétique entre deux bactéries
vivantes :
Une bactérie donatrice (mâle F+) à une bactérie réceptrice (Femelle F-)
Assuré par le pilus sexuel dont le gène est plasmidique (le gène F :
Facteur de fertilité)
Les bactéries possédant le gène F sont les bactéries mâles et sont dites
F+
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Transferts génétiques : La
conjugaison
C’est un transfert génétique unidirectionnel d’un fragment
d’ADN chromosomique ou plasmidique.
Se fait par contact direct entre deux bactéries
« sexuellement » différenciée : Une donatrice = mâle et
une réceptrice = femelle
Les bactéries recombinantes sont appelées
TRANSCONJUGUANTS.
Transferts génétiques : La
conjugaison
Bactérie donatrice
Pilus
Bactérie réceptrice
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MM liquide
Eau glucose
Expérience de NH4Cl
LEDERBERG et TATUM K2HPO4
(1946) : MgSO4 FeSO4
CaCl2
MM solide
Eau glucose
NH4Cl K2HPO4
MgSO4 FeSO4
CaCl2
Agar
Les recombinants
LEDERBERG et TATUM ont mélangé deux types
de mutants auxotrophes d’E. coli qui ne sont
pas capables de se développer en milieu
Expérience de minimum : mutants exigeants seulement en
LEDERBERG et TATUM méthionine (met-) et biotine (bio-) et mutants
(1946) : exigeants seulement en thréonine (thr-) et
leucine (Leu-)
Après plusieurs heures de contact entre les
mutants met- bio- thr+ Leu+ et les mutants
met+ bio+ thr- Leu- sur milieu minimum, les
auteurs ont pu isoler des souches de E. coli
met+ bio+ thr+ Leu+ :
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Transferts génétiques : La
conjugaison
La possibilité d’apparition de mutants doit être, ici, exclue
car si elle survient avec une fréquence de 10-7 pour un
caractère, la mutation double ou triple apparaitrait avec une
fréquence respective de 10-14 ou de 10-21 ce qui ne
correspond pas au résultat observé.
Transferts génétiques : La
conjugaison
Les colonies apparues proviennent donc bien de recombinants,
c'est-à-dire de bactéries réceptrices qui ont acquis un ou
plusieurs nouveaux caractères appartenant à une bactérie
donatrice.
Il y a eu un transfert de matériel génétique entre les deux souches
et recombinaison entre les gènes parentaux.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
L’échange nécessite le contact physique entre
les bactéries (Davis 1950).
Ledebereg et Tatum n'avaient pas directement
prouvé que le contact physique des cellules est
nécessaire au transfert de gènes.
Ceci fut démontré par Bernard Davis L’expérience de Davis (1950)
(1950) qui construisit un tube en U
consistant en deux branches reliées à
leur base par un filtre de verre fritté
(membrane poreuse en verre dont les
pores font 0.22µm de diamètre).
Le filtre empêche un contact direct
entre les souches et laisse passer les
substances solubles (ADN libre,
nutriments).
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L’expérience de Davis (1950)
Le tube en U fut rempli de milieux
nutritifs et chaque branche fut inoculée
par une souche auxotrophe différente
de E. coli. Après 4 heures d'incubation,
les bactéries furent étalées sur un milieu
minimum.
Absence de culture :
aucune bactérie
prototrophe
L’expérience de Davis (1950)
Davis découvrit que lorsque les
deux souches auxotrophes
étaient séparées l'une de
l'autre par un filtre, le transfert
de gènes n'avait pas lieu.
Un contact direct était donc
requis pour la recombinaison
que Ledeberg et Tatum avaient
observée.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
La conjugaison est un transfert génétique polarisé
(unidirectionnel) : se fait toujours de la cellule
donatrice vers la cellule réceptrice (Hayes 1953).
C’est le facteur F (Fertilité) qui donne le caractère mâle
(F+) ou la polarité à la cellule donatrice.
Expérience de Hayes (1953)
A Str s + B Str r A Str r + B Str s
Incubation
Traitement streptomycine
Recombinants Pas de recombinants
Souche A : T+ L+ B1+ Ph- B-
Souche B : T- L- B1- Ph+ B+
T= Threonine, L= Leucine, Ph=Phenyl alanine, B= Biotine, B1= vitamine B1
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Transferts génétiques : La
conjugaison
La Streptomycine stérilise le croisement A Strr X B Strs
Par contre, elle n’a aucun effet sur le croisement A Strs X B Strr
dont les descendants sont devenus prototrophes pour les cinq
facteurs considérés.
Les deux souches parentales ne jouent pas le même
rôle au cours du croisement, d’où la notion de
différenciation sexuelle
Elles contiennent un agent
Les bactéries A sont infectieux capable de passer
"donatrices" de gènes. Elles se d’une bactérie à une autre. Cet
comportent comme des mâles. agent est appelé facteur sexuel
ou facteur F (facteur de fertilité),
et les bactéries qui le possèdent
sont dites F+ (bactérie mâle).
Les bactéries B sont " réceptrices" de gènes.
Elles jouent le rôle de femelles. Elles ne
possèdent pas de facteur de fertilité, elle sont
dites F-
La recombinaison génétique se produit dans
les bactéries F-
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Le facteur F est constitué d’ADN. Sa longueur représente 2% de
celle du chromosome d’E.coli. La présence du facteur F entraine
la synthèse spécifique du pili appelée pili F ou pili sexuel.
Les pili F servent de «câbles
d’amarrage» permettant
l’accouplement. Ce n’est que par la suite
qu’un véritable pont cytoplasmique se
constitue en vue du transfert.
Le transfert
du facteur F
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Transferts génétiques : La
conjugaison
Mécanisme du transfert
» Contact paroi à paroi entre F+ et F- et formation d’un pore par
lequel s’effectue le transfert.
Transferts génétiques : La
conjugaison
Mécanisme du transfert
» Coupure par une endonucléase
codée par F en un site spécifique
(oriT) sur un brin spécifique .
» L’hélicase déroule le duplex à partir
de l’extrémité 5’ libre.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
Mécanisme du transfert
» L’ADN polymérase utilise le brin non
coupé comme matrice et prolonge
l’extrémité 3’ du brin coupé par
addition des nucléotides dans le sens
5’-3’; l’extrémité 5’ étant déplacée
progressivement.
Transferts génétiques : La
conjugaison
Mécanisme du transfert
» Le brin coupé pénètre dans la cellule
réceptrice où il sert de matrice pour
une synthèse de fragment d’Okazaki.
Dans la donatrice, le brin perdu est
remplacé par synthèse d’ADN (modèle
du cercle roulant). F- devient F+.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
Insertion de F dans le chromosome
» Région tra : fonctions de transfert (pilis,
endonucléase, hélicase).
» Région Rep : fonctions de réplication,
oriS : origine de réplication végétative,
oriT : origine de réplication conjugative,
inc : incompatibilité.
» Trois éléments transposables dans son
génome IS2, IS3 et Tn1000.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
Le facteur F est répliqué et transféré à la
réceptrice.
C’est lui qui décide du transfert notamment par
la formation du pilus.
Il contient une origine de réplication,
des gènes de fertilité et une région
homologue du chromosome bactérie.
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Transferts génétiques : La
conjugaison
Si le facteur F est intégré dans le chromosome bactérien, la bactérie devient
Hfr (Haute fréquence de recombinaison)
Le facteur F étant circulaire, un simple Crossing-Over peut l’intégrer dans le
chromosome
Transferts génétiques : La
conjugaison
Les souches Hfr
» Découverts par CAVALLI et HAYES (1950). Dans la souche Hfr, le plasmide
F s’est intégré dans le chromosome bactérien.
» Ce sont des dérivés de bactéries F+ capables de transférer certains
caractères génétiques (marqueurs chromosomiques) à une fréquence
beaucoup plus élevée (10-3) que lors des croisements F+ x F- (10-6) :
transfèrent les marqueurs génétiques plus que les F+
» Hfr = Haute fréquence de recombinaison. La fréquence de recombinaison
est 100 à 1000 fois plus élevée.
» Elles ne transfèrent pas le statut de donneur aux bactéries réceptrices
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Transfert
d’information par
l’Hfr
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Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
» Jacob et Wollman (1957) : méthode de cartographie des gènes
bactériens par « conjugaison interrompue ».
» Hfr strs et F-strr sont utilisées.
» Les conjugants sont étalés sur streptomycine et un milieu minimum
pour sélectionner un auxotrophe particulier.
» Les donneurs sont tués par la streptomycine et seuls les
recombinants d’un type particulier survivent.
Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
L’expérience :
Hfr F-
Arg+ Pro+ Strs X Arg- Pro- Strr
» On croise une E. coli Hfr sauvage, prototrophe pour l’arginine et la
proline, et sensible à la streptomycine, avec une réceptrice auxotrophe
pour ces deux acides aminés, et résistante à cet antibiotique.
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Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
L’expérience :
» Puis on prélève, toutes les minutes, deux petits volumes de la
coculture qu’on étale, après les avoir fortement agités afin de rompre
les ponts cytoplasmiques.
» Le premier sur un milieu minimum additionné de streptomycine et de
proline, le deuxième sur un milieu minimum additionné de
streptomycine et d’arginine.
Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
Les résultats :
On observe le résultat suivant : des colonies
apparaissent sur le premier milieu à partir du
quatrième prélèvement, tandis que des colonies
n’apparaissent sur le second milieu qu’à partir du
dixième prélèvement.
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Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
L’interprétation :
il faut attendre quatre minutes pour voir apparaître des
recombinants [arg+], toute conjugaison interrompue avant quatre
minutes ne permet pas d’en avoir; le site muté chez la réceptrice
est donc localisé entre trois et quatre minutes de temps minimal
de conjugaison, à partir du site de l’origine de transfert de la Hfr.
Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
L’interprétation :
Il faut attendre dix minutes pour voir apparaître des
recombinants [pro+], toute conjugaison interrompue avant dix
minutes ne permet pas d’en avoir; le site muté chez la réceptrice
est donc localisé entre neuf et dix minutes de temps minimal de
conjugaison à partir du site de l’origine de transfert de la Hfr.
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Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
L’interprétation :
La distance entre les sites de mutation arg et pro est égale à 6
minutes (environ 240 000 pb puisqu’il faut environ 100
minutes pour faire passer les 4,2 millions de pb du génome de
E. Coli, soit environ 40 000 pb par minute).
Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
Remarque :
La streptomycine joue le rôle de marqueur de sélection des
réceptrices et permet de bloquer la croissance des Hfr sauvages
prélevées dans la coculture et qui, en absence de l’antibiotique,
donneraient des colonies dans toutes les boîtes d’étalement, les
rendant ininterprétables.
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Cartographie génétique des bactéries par les
expériences de conjugaison interrompue
C’est à partir de ce protocole simple que Jacob et Wollman ont
cartographié les centaines de mutations différentes d’incapacité
de croissance sur lactose dans les recherches qui les conduisirent
à la définition de leur modèle de l’opéron lactose.
Hfr thr+strSaziRtonRgal+lac+ x F-thr-strRaziStonSgal-lac-
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Hfr thr+strSaziRtonRgal+lac+ x F-thr-strRaziStonSgal-lac-
Les gènes les plus proches de l’origine
sont transférés en premier
Les gènes les plus éloignés ne sont
transférés qu’à une petite partie de la
population
Des courbes de fréquence de
recombinants pour chaque
marqueur sont représentés en
fonction du temps.
La valeur du plateau
(nombre max de
recombinants pour
l’allèle) dépend de :
1. L’efficacité de
transfert
2. La probabilité de
recombinaison
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» Augmentation du nombre
de recombinants avec le
temps.
» Chaque allèle du donneur
apparaît chez le receveur à un
instant précis après le début
du croisement.
» Plus l’allèle pénètre plus tard,
plus le nombre maximal de
recombinants est faible.
La détermination de l’ordre des gènes permet de
réaliser les cartes génétiques
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Cartes génétiques d’ E. coli en utilisant la minute (instant d’apparition
de l’allèle) comme unité de distance. Etalonnage du chromosome
bactérien en 100 minutes .
La superposition de plusieurs cartes génétiques indique que
le chromosome d’E. coli est circulaire
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