Travaux pratiques

L’activité antifongique de plusieurs espèces bactériennes

Master biotechnologie végétale pour l’amélioration des plantes

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Valorisation agro-biotechnologique des bactéries du sol -L’antagonisme bactérien-
Master Biotechnologie végétale pour l’amélioration des plantes
Akraiche zineb et Rifqi imane 2023
 L’activité antifongique de plusieurs espèces bactériennes
contre Fusarium oxysporum
Akraiche Zineb, Rifqi Imane.
La Faculté des Sciences de l'Université Mohammed V Rabat, département de biologie.

Résumé
l’antagonisme bactérien d’une collection de souches appartenant à différents genres
bactériens vis-à-vis une souche de Fusarium oxysporum, l’agent la fusariose vasculaire a
été tester on utilisant différentes méthodes de confrontation pour révéler le mode d’action
éventuel des bactéries testées sur la croissance du champignon étudié.
Les bactéries de genre Stenotrophomonas et Bacillus ont montré in vitro une activité
antifungique prononcée contre [Link] ; la méthode de confrontation direct et
indirect relèvent un inhibition presque total (90% à 100% par rapport au témoin) ce qui
coïncident avec leur capacité à produire des enzymes extracellulaires liées au biocontrôle.
Amylase, protéase, cellulase, chitinase, estérases et lécitinase et les petits composés
organiques volatils (COV).

Mots clés
Fusarium oxysporum; l’antagonisme bactérien; bacillus; Stenotrophomonas; Bacillus; activité
antifongique.

Abstract
The bacterial antagonism of a collection of strains belonging to different bacterial genera
towards a strain of Fusarium oxysporum, the agent of vascular fusariosis, was tested using
different confrontation methods to reveal the possible mode of action of the tested bacteria
on the growth of the studied fungus.
Bacteria of the genus Stenotrophomonas and Bacillus showed in vitro a pronounced
antifungal activity against [Link]; the direct and indirect confrontation methods
show an almost total inhibition (90% to 100% compared to the control) which coincides
with their capacity to produce extracellular enzymes related to biocontrol. Amylase,
protease, cellulase, chitinase, esterase and lecitinase and small volatile organic compounds
(VOC).

Key words
Fusarium oxysporum; bacterial antagonism; bacillus; Stenotrophomonas; Bacillus;
antifungal activity.

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Introduction
En phytopathologie, l'antagonisme se réfère à l'action Il en existe un grand nombre d'espèces avec des
d'un organisme vivant qui supprime la croissance propriétés physiologiques et des habitats très variés
normale et l'activité, ou interfère avec celles-ci, d'un (terre, poussière, etc...). Certaines espèces sont
agent pathogène des plantes. C'est le cas d'un grand trouvées dans l'eau douce, d'autres dans l'eau de mer.
nombre de bactéries ou champignons. Il existe des espèces thermophiles, acidophiles,
psychrophiles, alcalinophiles. Les espèces
Le Fusarium oxysporum (Fo) est un complexe saprophytes sont responsables de multiples
d'espèces qui englobe des souches génétiquement et dégradations de produits alimentaires (sûrissement et
phénotypiquement diverses. caillage du lait, etc...). Certains d'entre eux ont des
La plupart des études sur le complexe d'espèces Fo rôles utiles comme producteurs d'antibiotiques
(FOSC) se sont concentrées sur les souches pathogènes (tyrothricine, polymyxines, bacitracine...).
pour les plantes, car elles provoquent des maladies
chez plantes importantes sur le plan agricole et Stenotrophomonas est un genre de protéobactéries (à
horticole. Dans une enquête auprès de communauté Gram négatif), aérobie et présentant une
internationale des pathologistes fongiques, Fo a été multirésistance naturelle aux antibiotiques et ils sont
classée cinquième dans une liste des 10 principaux très répandues dans l'environnement.
pathogènes fongiques des plantes en fonction de leur
l'importance scientifique et économique (Kang et al. Le but de ce travait et mettre en evidence l’activité
2014). antifongique contre Fusarium oxysporum des
bactéries surtout du genre bacillus et
Les Bacillus forment un genre de bactéries à gram Stenotrophomonas en utilisant des méthodes de
positif, appartenant à la famille des bacillacées confrontation direct et indirect.
(Bacillaceae), l’ordre des bacillales (Bacillales), la
classe des bacilles (Bacilli), le phyllum des firmicutes
(Firmicutes).
De forme bacilles, elles sont aérobies ou aéro-
anaérobies facultatifs, et tirent leur énergie par
respiration ou fermentation. Ces bactéries sont
capables de produire des endospores leur permettant de
résister à des conditions environnementales
défavorables.
Les Bacillus sont hétérotrophes, saprophytes et
ubiquitaires. Elles sont fréquemment retrouvées dans le
sol ou certaines espèces ont un rôle dans le cycle du
carbone et de l'azote. On peut trouver des Bacillus dans
des denrées alimentaires.

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Matériel et méthode
Action par des substances volatiles
Souches bactériennes: les bactéries (Tableau 1), ont Cette technique permet de tester la présence et
été choisies pour étudier leurs effets sur le l’efficacité des substances diffusibles inhibitrices
champignon filamenteux Fusarium oxysporum. de l’agent pathogène et qui sont produites par les
Confrontation directe bactéries en question.
La méthode de confrontation par contact directe Les souches sont mises en préculture pendant 24h
consiste à cultiver le champignon mycélien et dans des tubes contenant du bouillon nutritif.
la bactérie côte à côte dans le milieu PDA: un Des boites de Petri contenant le milieu PDA sont
fragment de 0.5 cm de champignon est déposé préparées. Après solidification de la gélose,
en face de 5µl de suspension bactérienne. La distance des membranes de nitrocellulose type millipore
qui sépare les deux microorganismes est de 1cm. stériles (0.45µm de porosité) sont délicatement
Après une semaine d’incubation à 28C° on pourra déposées à la surface du milieu gélosé à l’aide de
déterminer l’inhibition de la croissance du pinces stériles. Ensuite 5µl de suspension
champignon étudié par l’utilisation de la formule bactérienne à tester est déposé sur la membrane et
suivante : laissé sur place jusqu’à l’absorption des
I= T-C/T * 100 gouttes. Les boites ainsi préparées sont incubées à
T= Diamètre du mycélium en absence de la bactérie 28C°.
C= Diamètre du mycélium en présence de la bactérie Après 48h d’incubation, la membrane (contenant la
(Figure 1). culture bactérienne) est retirée de la surface
du milieu de culture gélosé et un fragment du
Action par des substances diffusibles dans le milieu champignon de 0.5cm est déposé à la surface de
Cette technique permet de tester la présence et la gélose et ré-incubées pour une période
l’efficacité des substances diffusibles inhibitrices supplémentaire d’une semaine.
de l’agent pathogène et qui sont produites par les
bactéries en question. Action par des substances volatiles
Les souches sont mises en préculture pendant 24h Aussi dite confrontation indirecte, cette expérience
dans des tubes contenant du bouillon nutritif. permet d’étudier l’effet des souches sur le
Des boites de Petri contenant le milieu PDA sont champignon via des substances volatiles.
préparées. Après solidification de la gélose, A cet effet des précultures des bactéries sont réalisées
des membranes de nitrocellulose type millipore dans le bouillon nutritif liquide pendant
stériles (0.45µm de porosité) sont délicatement 24h. Une suspension bactérienne diluée est striée dans
déposées à la surface du milieu gélosé à l’aide de une boite de Petri contenant le milieu
pinces stériles. Ensuite 5µl de suspension YEM.
bactérienne à tester est déposé sur la membrane et Dans une deuxième boite de Petri contenant le milieu
laissé sur place jusqu’à l’absorption des PDA, on dépose au centre un fragment
gouttes. Les boites ainsi préparées sont incubées à de champignon de 0.5 cm. Les deux boites mises l’une
28C°. sur l’autre sont scellées par le parafilm
Après 48h d’incubation, la membrane (contenant la et incubées à 28 C° pendant une semaine.
culture bactérienne) est retirée de la surface La boite servant de témoin est réalisée de la même
du milieu de culture gélosé et un fragment du façon sauf que la bactérie est absent.
champignon de 0.5cm est déposé à la surface de
la gélose et ré-incubées pour une période
supplémentaire d’une semaine.
La boite témoin est préparée de la même façon mais

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 Tableau 1. souches bactériennes testées pour leurs activités antagonistes vis-à-vis des
champignons filamenteux.

Figure 1. Méthode de confrontation directe, le fragment de champignon au centre de la boite

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 Résultats
Discussion
Confrontation directe Les 3 méthodes (la confrontation directe, Action par
La croissance de Fusarium oxysporum est inhibé des substances diffusibles dans le milieu et l’action
lors de son exposition au majorité des souches par des substances volatiles) rélevent que les
bactériennes par rapport au témoin B0. bactéries qui ont un grand effet inhibiteur sur la
Les souches B13, B19, B28 et B29 ont inhibé croissance de Fusarium oxysporum appartient au
presque totalement la croissance de Fusarium genre: Stenotrophomonas ou Bacillus.
oxysporum alors que B3, B14 et B15 ont un effet les bactéries de genre bacillus produit des
négligable sur cette croissance metabolites antifongique responsablent de l'inhibition
la croissance du champignon est inibée de 10% à de la croissance et de la lyse des hyphes de Fusarium.
80% pour les autres souches bactériennes par La bactérie antagoniste B. subtilis a montré un
rapport au témoin (Figure 2). pouvoir inhibiteur de germination des spores de
Fusarium et un mode d'antagonisme multivarié
Action par des substances diffusibles dans le contre les Fusarium spp. phytopathogènes, en
milieu produisant de la chitinase, des volatiles tel que l'acide
La croissance de Fusarium oxysporum est cyanhydrique et d'autres molécules antifongiques,
inhibée de 90% à 100% lors de son exposition dont la caractérisation est en cours (Gargouri-
aux substances diffusibles des souches: B8, B9, Kammoun et al.,2016 et khan et al.,2018).
B13, B16, B19, B27 et B29 par rapport au les petits composés organiques volatils (COV) émis
témoin B0. par Stenotrophomonas maltophilia,
Les souches B2, B14, et B15 n’ont presque pas Stenotrophomonas rhizophila et Bacillus subtilis
d’effet sur la coissance du champignon. influencent négativement la croissance mycélienne
Les autres souche ont inhibé de façon du champignon du sol Rhizoctonia solani Kühn.
significative la croissance de Fusarium Dans les conditions d'essai, ils ont permis de réduire
oxysporum (Figure 3). la croissance de 30 % (kai et al., 2007).
La plupart des isolats de S. maltophilia ont une
Action par des substances volatiles activité antifongique et les composés antifongiques
L’inhibition maximale de la croissances de maltophiline et xanthobaccine ont été décrits. Les
Fusarium oxysporum est obtenue sous l’action Stenotrophomonas spp. produisent également des
des souches B6, B16 et B17: inhibition de 90% à composés organiques volatils (COV) ayant une
98% par rapport au témoin B0. activité antifongique. Les souches de S. maltophilia
Les souches B3, B13, B14, B15 et B19 ont un ont un potentiel hydrolytique élevé; elles produisent
effet négligable sur la croissance de Fusarium diverses protéases, chitinases, glucanases, DNases,
oxysporum. RNases, lipases et laccases (Ryan et al., 2009).
Les autres souches on une inhibition qui variée
de
15% à 70% par rapport au témoin (Figure 4).

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 Figure 2. L’indice d’inhibition calculé en utilisant la technique de confrontation direct pour 29 souches
bactériennes Les valeurs sont la moyenne de trois répétitions avec une barre d'erreur standard ±. Les valeurs en
tête de la barre avec un alphabet différent reflètent une différence significative à (p = 0.05).

Figure 3. L’indice d’inhibition calculé en utilisant la technique d’action par substances diffusibles pour 29 souches
bactériennes Les valeurs sont la moyenne de trois répétitions avec une barre d'erreur standard ±.).

Figure 4. L’indice d’inhibition calculé en utilisant la technique d’action par substances volatiles pour 29 souches
bactériennes Les valeurs sont la moyenne de trois répétitions avec une barre d'erreur standard ±.).

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 Conclusion Références bibliographiques
Les antagonistes bactériens sont des bactéries qui Gargouri-Kammoun, L. et al. “Bio-suppression
affectent négativement la croissance d'autres de la fusariose du Maïs et réduction des
organismes. De nombreux antagonistes inhibent mycotoxines DON par des bactéries
la croissance des champignons par divers antagonistes du genre Bacillus.” Journal of
mécanismes: la production d'enzymes lytiques New Sciences (2016): n. pag.
extracellulaires, de sidérophores, d'acide Kai M, Effmert U, Berg G, Piechulla B.
salicylique, d'antibiotiques et de métabolites Volatiles of bacterial antagonists inhibit
volatils, tels que l'acide cyanhydrique. mycelial growth of the plant pathogen
Il est Intéressant de caractériser les biomolécules Rhizoctonia solani. Arch Microbiol. 2007
à l'origine de l'inhibition de la croissance May;187(5):351-60. doi: 10.1007/s00203-006-
fongique et de déterminer les conditions 0199-0. Epub 2006 Dec 16. PMID: 17180381.
optimales de production et les purifier Khan N, Martínez-Hidalgo P, Ice TA,
Les métabolites antifongiques semblent Maymon M, Humm EA, Nejat N, Sanders ER,
également intéressants dans le domaine le Kaplan D, Hirsch AM. Antifungal Activity
domaine agricole pour lutter contre les of Bacillus Species Against Fusarium and
champingnons pathogéne en evitant l’utilisation Analysis of the Potential Mechanisms Used in
des antifongiques chimiques. Biocontrol. Front Microbiol. 2018 Oct
2;9:2363. doi: 10.3389/fmicb.2018.02363.
PMID: 30333816; PMCID: PMC6176115.
Ryan RP, Monchy S, Cardinale M, Taghavi S,
Crossman L, Avison MB, et al. The versatility
and adaptation of bacteria from the genus
Stenotrophomonas. Nat Rev Microbiol 2009;
7(7): 514-525. PMid:19528958.
[Link]
Kang, Seogchan & Demers, Jill & Jimenez-
Gasco, Maria del Mar & Rep, Martijn. (2014).
Fusarium oxysporum. 10.1007/978-3-662-
44056-8_5.

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