Licence SVT 2ère année

Travaux pratiques
Module Technologique
Chromatographie

Année 2020-2021
 Introduction
 Le module technologique (S4-BG1) comprend 2 séances de Travaux Pratiques de 4 heures.
Les thèmes abordés au cours de ces séances sont liés à la chromatographie planaire, et aux
chromatographies liquide et gazeuse. Dans chaque séance, vous aurez deux manipulations à
réaliser :
Séance 1 : manipulations 1 et 2
Séance 2 : manipulations 3 et 4

 Le fonctionnement de ce module est le suivant :

 Un compte rendu par séance de TP et par binôme contenant les résultats de la
manipulation et quelques questions.

 Avant de commencer une séance de Travaux Pratiques, nous vous demandons de « relire » et
d’assimiler les différents points suivants abordés dans le polycopié de TP :
 matériel nécessaire à la préparation des solutions et au titrage,
 préparation de solutions,
 dilution de solutions,
 réalisation d’un titrage,
 appareillage,
 etc…

 Les objectifs principaux des travaux pratiques sont bien sûr d’apprendre à manipuler et vérifier
vos connaissances, mais ce ne sont pas les seuls. Il est aussi très intéressant de découvrir
expérimentalement des nouvelles méthodes d’analyse ainsi que des notions fondamentales.

 Vous l’avez compris, les Travaux Pratiques sont essentiels à la compréhension des différentes
notions abordées en cours.

 Vous devez donc vous poser des questions et profiter des séances de TP pour y répondre.

 Pendant la séance, il ne faut pas hésiter à faire appel à l’enseignant dès que vous rencontrez
une difficulté ou si vous désirez un complément d’information.
 La sécurité au laboratoire
Les étiquettes des produits chimiques présents dans le laboratoire portent
La chimie est une discipline expérimentale. Il faut donc respecter un des pictogrammes indiquant les dangers présentés par le produit considéré.
certain nombre de règles visant à assurer votre sécurité et celle de vos
camarades. Consignes de
Pictogramme Signification Exemples
 AVANT TOUTE MANIPULATION prudence
 Porter une blouse en coton est « obligatoire ». De nombreux
Tenir loin des
composés
 Attacher les cheveux. Substance organiques :
flammes ou des
 Observer les pictogrammes représentés sur les étiquettes des flacons étincelles.
inflammable Alcanes, alcools,
utilisés et respecter les consignes correspondantes, c’est à dire : Toujours refermer
éther éthylique,
les flacons après
- manipuler sous la hotte si nécessaire, acétate d’éthyle, …
usage.
- porter des lunettes de protection si nécessaire, le sodium…
- porter des gants si nécessaire. De nombreux
oxydants :
Substance Eviter tout contact
 PENDANT CHAQUE MANIPULATION dioxygène, nitrate
comburante avec les matières
d’ammonium,
NE JAMAIS combustibles.
chlorate de
 Tenter de reconnaître un produit par son odeur. potassium, …
 Goûter un produit chimique. Hexane, dichromate
 Observer le contenu d'un tube en plaçant ses yeux dans l'axe de celui- de potassium, Eviter tout contact
ci. Substance irritante propanol, avec la peau ou les
 PIPETER A LA BOUCHE notamment des solutions concentrées ou Substance nocive chloroforme, yeux.
toxiques. ammoniac diiode, Ne pas respirer les
acide oxalique, vapeurs.
 Prendre des produits solides avec les doigts (utiliser butanol, …
systématiquement des spatules).
IL FAUT ABSOLUMENT : Substance explosive Dichromate Eviter les chocs, les
 Porter des lunettes de protection lors de l’utilisation d’un montage d’ammonium, acide flammes et les
« quelconque » chauffant. picrique, … étincelles.
 Garder le plan de travail propre et rangé, La plupart des
 Refermer les flacons après usage. acides, soude,
Eviter tout contact
 APRES LA MANIPULATION Substance corrosive dibrome, eau
avec la peau, les
oxygénée, chlorure
yeux ou les
 RINCER son matériel puis le RANGER. de benzoyle,
vêtements.
chlorure d’acétyle,
 NETTOYER LA PAILLASSE. …
 ELIMINATION DES SOLUTIONS APRES MANIPULATION : Eviter absolument
- Verser les solutions toxiques dans des bacs de récupération Benzène, méthanol, tout contact avec la
prévus à cet effet. Substance toxique formol, peau et les yeux.
- Diluer les solutions rejetées à l’évier en laissant couler l’eau tétrachlorométhane, Eviter absolument
quelques instants. phénol, aniline, … de respirer les
 Se laver les mains. vapeurs.
 Annexe 1

Chromatographie sur Couches Minces

I – Grandeurs fondamentales
En chromatographie sur couches minces (CCM), la phase stationnaire est déposée sous forme
de couche de faible épaisseur (0,1 mm à 2 mm) sur une plaque (verre, plastique, aluminium). La
phase mobile liquide parcourt la couche en la remontant par capillarité. La chromatographie est
effectuée généralement en cuve fermée. Les divers échanges qui s’effectuent dans ces conditions
entre les phases sont schématisés dans la fig. 1.

Echange
Phase
liquide (couche)
stationnaire
vapeur (cuve)

Saturation
de la cuve

Migration par
capillarité
Phase mobile

Fig. 1 : Représentation schématique des processus chromatographiques

La méthode ci-dessus est appelée « en chambre normale ».

Le mélange de constituants à séparer est déposé en solution, sous forme d’un spot (ou d’une
bande étroite), à l’aide d’un capillaire ou d’une microseringue, à 1 cm environ du bord de la
couche.

Cette extrémité de la couche est ensuite plongée dans le solvant qui couvre le fond de la cuve
(<1 cm d’épaisseur), et qui joue le rôle de phase mobile.

On laisse le front de phase mobile atteindre une hauteur équivalente à environ les ¾ ou les 4/5
de la longueur de la plaque. La couche est séchée et les produits présents sur la couche sont
révélés sous forme de spots (par la vapeur d’iode, par pulvérisation d’acide sulfurique et
chauffage, par irradiation UV pour les couches fluorescentes …).

Soit y la distance parcourue par le front de solvant, à partir de la ligne de dépôt de l’échantillon.
La mobilité d’un composé donné, qui a parcouru la distance x est caractérisée par le Rf (fig. 2) :

Fig. 2 : Dessin d’une plaque CCM après migration

 x
Rf 
y
Le Rf est théoriquement une constante caractéristique d’un composé dans un système donné
et dans des conditions précises (température, saturation de la couche …). La reproductibilité des
conditions est cependant difficile à obtenir. Pour caractériser un composé dans un mélange à
analyser, on est amené à réaliser une chromatographie du composé pur, sur la même couche, en
parallèle avec celle du mélange.

II – Phases stationnaires
Le mode chromatographique le plus utilisé en CCM est l’adsorption. Les deux adsorbants les
plus courants sont la silice et l’alumine. Leur cohésion, pour la constitution des couches minces est
obtenue grâce à l’adjonction de plâtre. Ce sont des adsorbants très polaires. (Dans une
chromatographie, les composés les plus retenus – ceux qui migrent le moins vite – seront les plus
polaires).

La silice est l’adsorbant ayant fait l’objet du plus grand nombre d’applications. Un des
principaux problèmes affectant la reproductibilité des expériences, est le taux de la couche en eau,
fonction du taux d’hygrométrie ambiante qui modifie l’activité de l’adsorbant (c'est-à-dire les forces
de rétention des produits à chromatographier). Il va sans dire qu’il faudra éviter toute trace d’eau
dans les solvants et matériels utilisés dans les chromatographies.

III – Phases mobiles

Les solvants utilisés comme phases mobiles sont caractérisés par leur polarité. Les solvants
les plus polaires auront une forte affinité pour la phase stationnaire et déplaceront donc le plus
facilement les composés à chromatographier. Une augmentation de la polarité de la phase mobile
favorise donc la migration. Une suite de solvants, classés par ordre de polarités croissantes,
constitue une série éluotropique (cf tableau 1).

On obtient en général de meilleures séparations en utilisant des mélanges de solvants de

polarités différentes. On peut ainsi constituer des séries éluotropiques de mélanges de solvants.
On remarquera que la polarité d’un mélange de solvants, à quantités égales, se rapproche le plus
de celle du solvant le plus polaire.

Le choix de la phase mobile pour une séparation donnée est dicté par l’expérience. On essaie
d’abord une série éluotropique couvrant un domaine de polarité large ; puis en fonction des
résultats, on essaie une autre série dans le voisinage de polarité qui semble le mieux convenir à la
séparation, au besoin en utilisant des mélanges de solvants.
 Annexe 2

Chromatographie sur gel de silice

I – Préparation de la colonne
On préparera une colonne de silice 60A, qui servira à la
Phase
chromatographie des produits en utilisant une phase mobile (éluant)
mobile
préalablement défini par CCM.
Sable
On pèse environ m g de silice dans un bécher, voir le tableau
des corrélations entre la masse de silice et la masse de produit à
séparer.

La silice est mise en suspension avec la phase mobile, et cette Silice

suspension est versée dans la colonne. On rince le bécher avec un
peu de solvant précédent que l’on verse également dans la colonne.

La solution qui s’écoule de la colonne est recueillie dans un

bécher, et la colonne est tapotée avec une tige munie d’une Fritté
protection en caoutchouc, de façon à tasser la silice le plus
régulièrement possible.

Lorsque le tassement est réalisé (il doit encore rester une épaisseur importante de solvant au-
dessus de la silice), on verse du sable de façon constituer une couche de 0,5 cm d’épaisseur
environ.

II – Chromatographie
On laisse le niveau de la phase mobile atteindre le sable, et on ajoute le mélange à séparer à
l’aide d’une pipette Pasteur (mettre délicatement la solution du mélange à séparer, en veillant à
ne pas détériorer la couche de sable). Le meilleur moyen est de faire couler la solution sur les
parois de la colonne en répartissant de façon homogène sur tout le pourtour.

On laisse la solution pénétrer la colonne. On rince les parois de la colonne avec du solvant
versé avec une pipette Pasteur, toujours avec précaution. On laisse cette nouvelle fraction entrer
complètement dans la colonne.

On ajoute alors la phase mobile, d’abord à la pipette Pasteur, puis lorsque son épaisseur est
de quelque cm, on peut alors en rajouter plus rapidement jusqu’au sommet de la colonne (on peut
faire couler le liquide le long d’une tige en verre dont l’extrémité est appuyée sur la paroi de la
colonne).

On veillera par la suite à ce que la colonne de silice ne soit JAMAIS à sec.

Ensuite, recueillir les fractions dans des tubes en utilisant le support de tubes à essai en
effectuant régulièrement des CCM pour savoir s’il faut changer de tube.

Effectuer les CCM de chacune des fractions recueillies en parallèle, puis regrouper les
fractions contenant un produit avec le même Rf dans un ballon d’évaporateur et évaporer le
solvant.
 Annexe 3

Principe de la chromatographie en phase gazeuse (CPG)

C’est une technique permettant de séparer des constituants d’un mélange avec des
quantités de l’ordre de quelques µg à quelques mg. Elle est applicable aux substances pouvant
passer à l’état gazeux sans dégradation thermique.
La phase stationnaire est un solide adsorbant (chromatographie gaz-solide) ou, beaucoup
plus souvent un liquide très peu volatil (chromatographie gaz-liquide) imprégnant un support solide
inerte ou une paroi capillaire. La phase mobile est un gaz inerte vis-à-vis des solutés (gaz vecteur).

I - Appareillage
Détendeur
Four Détecteur
(régulation de la pression)

Système Enregistreur
Colonne
d'injection Intégrateur

FID
Gaz vecteur
(pressurisé à 200 bars)

Le mélange à analyser est introduit en faible quantité (de l'ordre du microlitre) à l'aide d'une
seringue dans la chambre d'injection chauffée à une température telle qu'il se vaporise, puis,
entraîné par le gaz vecteur, il traverse une colonne chauffée contenant un support solide finement
divisé et imprégné d'un liquide de faible volatilité ou d’une colonne capillaire chauffée dont la paroi
est recouverte d’un liquide de faible volatilité (phase stationnaire).
Les différents constituants du mélange progressent dans la colonne à des vitesses
différentes, et apparaissent donc successivement à la sortie de la colonne, puis traversent un
détecteur.
Plusieurs systèmes de détection sont utilisables (détecteur à ionisation de flamme, à
capture d'électrons, catharomètre, spectromètre de masse, ...).
Comme en chromatographie liquide, le passage des différents constituants du mélange sur
le détecteur se traduit finalement par des pics enregistrés et repérés en fonction du temps.
L'ensemble de ces pics constitue le chromatogramme.

II – Détecteur à ionisation de flamme (FID)

C’est le détecteur considéré comme pratiquement universel pour les composés organiques.
Le courant gazeux issu de la colonne pénètre dans la flamme d’un petit brûleur alimenté
par un mélange d’hydrogène et d’air. Ce détecteur détruit l’échantillon dont la combustion produit
des ions et particules chargées, responsables du passage d’un très faible courant ionique entre
deux électrodes. Ce signal est ensuite amplifié par un électromètre (fig.1).
 Annexe 4

Principe de la chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)

I-Appareillage

La chromatographie est effectuée sur une colonne fermée (fig. 1). La phase mobile est
constituée d’un mélange de solvants aspirés dans deux flacons par deux pompes dont les débits
sont commandés par un module de programmation. On a ainsi un débit global constant et la
possibilité de variation continue de la composition de la phase mobile (appelée parfois gradient de
phase mobile).

pompe A

chambre de mélange

module
gradient

colonne
détecteur
vanne d'injection enregistreur
pompe B intégrateur
Fig.1

Les solutés à séparer sont introduits, en solution, par l'intermédiaire d'une vanne d'injection. Ces
solutés sont repérés, à la sortie de la colonne à l'aide d'un détecteur. Ce dernier émet un signal
dont l'intensité est proportionnelle à la concentration du soluté élué. L'enregistrement des signaux
(pics) en fonction du temps constitue un chromatogramme. La détermination des aires des pics du
chromatogramme, à l'aide d'un intégrateur permet d'accéder à l'analyse quantitative du mélange.
On peut travailler en conditions isocratiques (composition de phase mobile constante) avec
un appareil simplifié ne comprenant qu’une seule pompe, qui aspire un mélange de solvants de
composition préétablie.

L'efficacité d'une colonne de chromatographie varie en première approximation avec la

finesse de la granulométrie de la phase stationnaire. Avec des particules de diamètre inférieur à 10
µm, on atteint un domaine d'efficacité (plusieurs milliers de plateaux théoriques pour une colonne
de 10 à 30 cm) qui caractérise la chromatographie à haute performance.
En contrepartie de la finesse des particules de phase stationnaire, la colonne est
relativement peu perméable à la phase mobile, et on doit utiliser de hautes pressions (plusieurs
dizaines de bars) pour la faire circuler. Ceci implique l'utilisation de pompes puissantes et de
tubulures et colonnes en acier. Les solvants utilisés comme phases mobiles doivent être dégazés
(pour éviter le désamorçage de la pompe) et filtrés (afin de ne pas obstruer les filtres frittés qui
maintiennent la phase stationnaire dans la colonne).
La grande efficacité implique qu'il faut très peu de phase stationnaire pour réaliser une
séparation (colonne de 10 à 30 cm de long et 0,3 à 0,5 cm de diamètre). Les temps de rétention
seront ainsi relativement courts, ce qui permet par ailleurs des économies de solvant.
 II- Le chromatogramme

La sortie d'un soluté sur le chromatogramme

sera repérée par un pic, théoriquement de forme Inj
gaussienne. Le chromatogramme est donc constitué
d'une succession de pics (Fig. 2) pour l'analyse d'un
mélange.
Fig. 2

to
Le sommet d'un pic sert de repère, pour le soluté correspondant, tR1à son temps
tR2 detR3rétention
tr, temps moyen passé par le soluté dans la colonne. Après l'injection, il y a une période (durée t0)
pendant laquelle aucun pic ne peut apparaître, c'est le temps nécessaire à la traversée de la
colonne par le front de la phase mobile. En théorie, on peut déterminer t0 en injectant un soluté qui
voyagera à la même vitesse que la phase mobile (qui ne sera pas du tout retenu par la phase
stationnaire).
Les temps de rétention varient avec de nombreux facteurs, dont la nature des phases
mobile et stationnaire, bien entendu, mais également le débit et les dimensions de la colonne. On
définit une autre grandeur caractéristique de chaque soluté qui ne dépend théoriquement que de la
nature des phases mobile et stationnaire: le facteur de capacité k', qui peut être déterminé à partir
du chromatogramme :
t  to
k' = r
to
L'efficacité d'une colonne (pouvoir de séparation des solutés) peut être définie à partir de la
largeur des pics observés sur le chromatogramme. Celle-ci croît avec le temps de rétention. On
définit l'efficacité d'une colonne par le nombre de plateaux théoriques N :

N = 16 ( tr )2 (w largeur du pic à la base)

w

w
Fig. 3
Afin de pouvoir comparer des colonnes de longueurs différentes, on définit un autre
paramètre appelé hauteur équivalente à un plateau théorique HEPT ou H :
H = L/N.
La résolution R traduit la qualité effective de la séparation de deux pics voisins d’un
chromatogramme :
2  t R,2 - tR,1 
R 
w b,1  w b,2
avec tR,i et wb,i, respectivement le temps de rétention et la largeur à la base du pic (i).
A une résolution R = 0.5, deux maxima peuvent encore être perçus séparément. Pour l’analyse
pratique, la résolution ne devrait de préférence pas excéder R = 1.5, des valeurs supérieures ne faisant
que prolonger inutilement les analyses.

III- Modes de chromatographie

Il s'agit des différents mécanismes de la chromatographie :

a) l'adsorption : phase stationnaire polaire (silice ou alumine)/phase mobile peu polaire.
Les molécules de solutés se fixent par leurs parties polaires sur la surface de la phase
stationnaire. Elles sont en compétition avec les molécules de la phase mobile pour les sites
d’adsorption.
b) le partage : la phase stationnaire est théoriquement liquide. Il s'agit en fait le plus
souvent de phases greffées sur silice, ce qui évite leur entraînement par la phase mobile.
Les solutés s'échangent entre phases mobile et stationnaire selon leurs solubilités
respectives (coefficient de partage P).
Selon la polarité de la phase stationnaire on a :
- la chromatographie à polarités en phases normales : phase stationnaire polaire (comme en
adsorption)/phase mobile peu polaire.
- la chromatographie à polarités en phases inversées : phase stationnaire apolaire/phase
mobile polaire.
c) l'échange d'ions : phase stationnaire porteuse de groupements ioniques/phase mobile
de solution aqueuse tamponnée. Les solutés sont obligatoirement des ions.
d) la perméation de gel (ou exclusion) : un gel poreux sélectionne les molécules de
solutés selon leurs dimensions : le chemin suivi par les solutés dépendra de leur possibilité de
pénétration dans les pores du gel. Les grosses molécules auront moins de chemin disponible à
parcourir et seront éluées plus rapidement.

IV- Applications

Par rapport à la chromatographie en phase gazeuse, la C.L.H.P. permet l’analyse soit de

substances thermiquement instables (puisque l’opération s’effectue à température ambiante), soit
de substances peu volatiles, de masse moléculaire élevée. Elles est donc particulièrement
adaptée à l’analyse des molécules d’intérêt biologique, comme les vitamines, les sucres et les
acides aminés, qui peuvent être analysés directement, sans devoir être transformées au préalable
en dérivés thermiquement stables et volatils.
Cependant, les molécules n’ayant pas de groupements chromophores ne sont pas
détectées par un détecteur UV-Visible qui reste le détecteur le plus commun avec cette technique.
Il existe d’autres détecteurs qui peuvent être associés à la C.L.H.P. : détecteur fluorimétrique,
détecteur électrochimique, détecteur conductimétrique, détecteur de radioactivité, et plus
récemment détecteur de masse.
 Séance 1 : Manipulation n° 1

Identification de pesticides par

Chromatographie sur Couches Minces

I – Généralités
I-1 – Objectifs
La manipulation a pour but de déterminer la composition d’un mélange de pesticides. On
essaiera tout d’abord de mettre au point la séparation des constituants du mélange. Ensuite, on les
identifiera par comparaison de leurs Rf avec des échantillons de produits purs chromatographiés
en parallèle. Enfin, à partir des conditions de chromatographie trouvées, on réalisera une
chromatographie à deux dimensions du mélange.

II – Manipulation
Les chromatographies seront effectuées sur des plaques de silices imbibées d’un indicateur
fluorescent, ce qui permettra la révélation des spots des solutés par irradiation UV à 254 nm.

II-1 – Analyse d’un mélange de pesticides

2.1.1– Matériel
Cuves normales ; plaques rectangulaires sur support d’aluminium ; solvants pour phases
mobiles (série éluotropique : cyclohexane, dichlorométhane, éther diéthylique, acétone,
méthanol) ; échantillon de mélange de pesticides (dont le nombre est inconnu) à analyser.

2.1.2– Pesticides possibles dans le mélange à séparer

Benodanil, bentazone, dinoterbe, monalide, oxadiazon, terbacile, atrazine.

2.1.3– Mode opératoire – Mise au point de l’analyse

 Placer 10 mL de chacun des solvants dans les 5 cuves. Pendant que l’atmosphère des
cuves se sature en atmosphère de solvant, préparer les plaques CCM.
 Tracer sur 5 plaques rectangulaires un trait fin au crayon, à 1 cm d’un bord étroit, en prenant
garde de ne pas endommager la silice. Sur chaque plaque, appliquer le contenu d’un capillaire de
5 µL de la solution du mélange des composés à étudier, au centre de cette ligne (vider le contenu
en plusieurs fois, de façon à obtenir le spot le moins large possible). Laisser le solvant s’évaporer.
 Plonger dans les phases mobiles l’extrémité des plaques qui portent les spots de solutés.
Fermer les cuves. Laisser monter les phases mobiles le long des plaques jusqu’à environ 4/5 de
leur hauteur.
 Retirer les plaques. Les laisser sécher, puis les placer sous la lampe UV (254 nm). Repérer
les tâches en les entourant d’un trait de crayon.
 Vider les cuves de leurs solvants dans le récipient prévu à cet effet, sauf la cuve contenant
la phase mobile (éluant 1) qui permet une bonne séparation d’un groupe de 3 ou 4 solutés.
 Déposer sur deux plaques plus larges un spot de mélange et des spots des solutés purs (3
ou 4 par plaque, les 7 étant représentés sur les 2 plaques). Chromatographier en utilisant l’éluant
le plus apte à séparer les produits.
Déterminer les Rf des solutés ayant correctement migré et identifier les pesticides du
mélange.
 Refaire une CCM du mélange des solutés et des solutés purs sur une même plaque en faisant
migrer avec le mélange dichlorométhane / ether diéthylique 1/1 (éluant 2).

Déterminer les Rf des solutés qui sont bien séparés par le mélange de solvants. Déduire
l’ordre de mobilité des 7 pesticides.

Remarque : l’un des pesticides fluoresce sous irradiation UV à 360 nm. Il pourra être très
facilement repéré dans le mélange par cette propriété.

II-2 – Chromatographie sur couche mince à deux dimensions

2.2.1– Mode opératoire
 Placer 10 mL de dichlorométhane dans la cuve.
 Fermer la cuve. Tracer deux traits fins au crayon, à 1cm de 2 bords perpendiculaires d’une
plaque carrée.
 Déposer le spot du mélange à l’intersection de ces deux traits.
 Laisser évaporer le solvant. Déposer la plaque dans la cuve, un bord portant un trait
trempant dans le dichlorométhane. Laisser monter la phase mobile jusqu’aux 4/5 de la plaque.
 Sortir la plaque, la laisser sécher. Vérifier la migration des solutés par irradiation UV (254
nm), sans les repérer.
 Remplacer dans la cuve le dichlorométhane par le mélange dichlorométhane-éther utilisé
précédemment. Faire migrer les solutés perpendiculairement à la première migration.
 Après révélation des spots sous rayonnement UV, noter leur emplacement sur la plaque.

Dessiner la carte de séparation des pesticides du mélange, en notant l’identité de

chaque spot.

III – Compte-rendu
 Dessiner toutes les CCM effectuées en précisant les éluants utilisés.
 Noter les Rf calculés pour chaque composé.
 Justifier le choix du premier éluant.
 Comparer les CCMs après migration avec l’éluant 1 et avec l’éluant 2. Justifier la différence en
vous basant sur les polarités.
 Identifier les différents pesticides observés.
 Quel est le pesticide le plus polaire et pourquoi ?
 Séance 1 : Manipulation n°2

Séparation de composés organiques par colonne

chromatographique sur gel de silice
I – Généralités
A la suite de réaction en chimie organique, il est souvent nécessaire de purifier les produits de
réaction en ayant recours à des colonnes sur gel de silice. Cette technique est également utilisée
lorsque des composés pouvant potentiellement avoir des activités biologiques sont isolés du milieu
naturel. Un mélange de fluorénone, d’acide benzoïque et de composés inconnus ont été retrouvés
dans un laboratoire. Ce mélange sera analysé par chromatographie sur couches minces puis
isolés par colonne chromatographique sur gel de silice.

II – Manipulation
II-2 – Analyse du mélange par chromatographie sur couches minces
Réaliser deux CCM du mélange brut en utilisant tout d’abord comme éluant du
dichlorométhane, de l’éther diéthylique, de l’acétate d’éthyle ; pour chaque CCM, procéder comme
ce qui est indiqué :
 Verser l’éluant dans la cuve chromatographique et fermer la cuve pour la saturer en vapeur
de solvant.
 Déposer, à l’aide d’un capillaire, quelques micro-gouttes de votre échantillon d’extrait brut et
à coté placer la solution de fluorénone et d’acide benzoïque sur la même ligne de base.
 Placer votre plaque dans la cuve et laisser éluer.
 Révéler sous lampe UV.
 Noter les tâches repérées.

II-3 – Séparation du mélange par chromatographie sur colonne

 Préparer une colonne à chromatographie sur gel de silice en utilisant une masse de 20g de
silice.

 La silice est mise en suspension dans 50 ml du solvant adéquate (à choisir en fonction des
résultats CCM ; à DISCUTER avec l’enseignant). Peser 300 mg de mélange et les dissoudre avec
un minimum d’éluant. Déposer sur la colonne avec une pipette. Eluer avec 75 ml de solvant.
 Isoler le premier composé, puis changer l’éluant (70 ml) pour accélérer la migration du
second composé.
 Recueillir le deuxième composé
 Placer les fractions dans des ballons préalablement tarés puis évaporer.
 Déterminer les masses.
III – Compte-rendu
 Dessiner la CCM en identifiant les différents composés.
 Calculer les Rf pour chacun des constituants.-
 Déterminer le pourcentage de chaque produit dans l’échantillon initial.
 Indiquer quel est le composé le plus polaire d’un point de vue structure et de par vos
observations (expliquer !)
 Lors de chromatographie sur colonne, si vous aviez utilisé du méthanol comme éluant, la
séparation aurait-elle été meilleure ?
 Séance 2 : Manipulation n°3

Dosage de différents esters d’acide gras présents dans les

huiles végétales.

I – Généralités
I-1 – Objectifs
Le but de cette manipulation consiste à doser les esters d’acides gras présents dans différentes
huiles végétales. Ces esters d’acide gras sont souvent sous forme de triglycérides qu’il faut
transestérifier pour pouvoir les analyser en chromatographie gazeuse. Afin de déterminer le
pourcentage de chaque ester, vous vous baserez sur la méthode de normalisation interne vue en
cours.

I-2 – Les huiles végétales

Les huiles végétales sont composées de différents triglycérides. Ce sont des grosses molécules,
non volatiles, qui ne peuvent pas être analysés en chromatographie en phase gazeuse. Ainsi une
transestérification permet d’abaisser fortement le point d’ébullition des nouveaux esters et de
volatiliser ainsi plus facilement les molécules.

R
O H
O O O
R Transestérification H
Triglycérides O O + R CO2Me Ester d'acide gras

O O
O H
R

Ainsi dans les huiles, il n’est pas rare de retrouver les esters d’acides gras suivants :

Masse Esters Masse

Esters méthylés Formule Formule
moleculaire méthylés moleculaire
C18-2 doubles
palmitate 270 C16-saturé linoléate 294
liaisons (9-12)

C18-3 doubles
stéarate 298 C18-saturé linolénate 292 liaisons
(9-12-15)

C18-1double
oléate 296 arachidate 326 C20-saturé
liaison

II – Manipulations
II-1 : Transestérification
Choisissez l’une des quatre huiles disponibles (chaque binôme prend une huile différente).

Protocole de transestérification

- Dans un grand tube à essai surmonté d’un réfrigérant, 0,3g (environ) d’huile est pesé.
- Ajouter 6mL de cyclohexane et agiter l’ensemble.
- Ajouter 2mL de la solution de soude (1mol/L dans méthanol), puis chauffer 10 minutes au bain-
marie à 60°C.
- Ajouter 2mL d’une solution d’acide chlorhydrique à 1mol/L dans le méthanol. Bien agiter.
- Après décantation, transvaser dans une ampoule à décanter et récupérer la phase cyclohexane
contenant les esters méthyliques d’acides gras.
- Laver avec 5ml d’eau et sécher cette solution sur sulfate de sodium.
- Filtrer sur coton dans un petit erlenmeyer.
- L’extrait est dilué 10 fois avec de l’acétate d’éthyle.

II-2 : Analyse par CPG

Conditions opératoires pour GC-FID : Détecteur : FID ; Injecteur : manuel, mode split ;
Colonne: DB-Wax, longueur 10m, diamètre interne 0,1mm ; Phase stationnaire: polyethlèneglycol
(très polaire). Injecteur et détecteur : 250 °C ; Four : 170 °C pendant 1min puis gradient de 4
°C/min jusqu’à 212°C, gradient de 20 °C jusque 250 °C et enfin 5min à 250 °C.

Analyse du mélange témoin

Ci- joint la composition du témoin. Par ailleurs chaque ester a été injecté indépendamment les uns
des autres. Leur temps de rétention (indicatif) est indiqué dans le tableau :
Esters méthylés Temps de % masse
retention
myristate 3,15 1
palmitate 4,85 4
stéarate 7,30 3
oléate 7,58 45
linoléate 8,22 15
linolénate 9,17 3
arachidate 10,28 3
behenate 12,97 3
erucate 13,15 20
lignocérate 14,55 3

Analyse de votre huile estérifiée

Injecter dans les mêmes conditions l’huile que vous avez estérifiée.

III – Compte-rendu

 Indiquer l’huile que vous avez utilisée.

 A quoi sert le gradient de température ?
 Quels sont les esters d’acide gras présents ?
 Faire un tableau indiquant les aires de chaque composé dans le mélange témoin et dans
l’huile étudiée.
 Qu’est-ce que la normalisation interne ?
 Calculer les pourcentages de chaque ester d’acide gras par normalisation interne (utiliser le
linoléate comme référence).
 Séance 2 : Manipulation n°4

Dosage du mélange caféine- théophilline- théobromine dans

une soulution injectable par HPLC

I – Généralités
I-1 – Objectifs

Le but de cette manipulation consiste à doser la caféine, la théophilline et la théobromine dans le

thé. Pour ce faire, une gamme étalon est préparée puis injectée en HPLC.

I-1 – Caractéristiques de ces alcaloïdes

Il existe de nombreux alcaloïdes dans le thé dont la caféine qui est le principal. La théophilline et la
théobromine sont également présents dans le thé. Ces composés sont également présents dans
le café. Nous avons reconstitué un mélange de ces 3 formules, détectables et dosées par HPLC.

Masse T°Fusion Sécurité Log Kow

Moléculaire (°C)
( g/mol )
Théophyilline 180.16 270 R 22 -0,02

Théobromine 180.16 290 R 22 -0,78

Caféine 194.18 235 R 22 0,156

Théobromine Théophylline Caféine

II – Manipulations
II-1 : Préparation de la gamme étalon
Une solution mère (fournie) a été préparée par dissolution de caféine, de théophylline et de
la théobromine dans un mélange méthanol 40%-eau 60% avec de l’acide acétique 0,5%. La
concentration de chacun des composés est de 100 mg/l.
Une gamme d’étalonnage doit être préparée à partir de cette solution. Les concentrations des
solutions filles préparées dans des fioles jaugées de 50 ml sont indiquées dans le tableau suivant.
 FIOLE 1 2 3 4 5
Volume Solution
Mère (ml)
[Solution Mère]mg/l 100 100 100 100 100
[Solution Fille]mg/l 1 5 10 15 20

Les solutions sont complétées au trait de jauge avec de l’eau désionisée.

II-2 : Analyse HPLC

Conditions opératoires en chromatographie HPLV avec détection UV-Visible :

Pompe binaire Waters 1525
Injecteur Rhéodyne avec boucle 20µl
Colonne Merck Lichrosphère RP 18 de 12,5 cm de longueur et 0,4 cm de diamètre
Détecteur UV Waters 2489 λ=272nm
Logiciel : Breeze
Eluant : méthanol 40%/eau 60% avec acide acétique à 0,5% avec un débit 1ml/min.

Les différentes solutions préparées sont injectées. Les graphiques aire = f (concentrations) sont
tracés pour chacun des alcaloïdes.

Une solution inconnue composée de théobromine, théophyline et caféine sera ensuite injectée.

III – Compte-rendu

 Quelle(s) condition(s) doivent remplir les alcaloïdes pour être analysés quantitativement?
 Commenter les trois graphiques obtenus ?
 Déterminer les concentrations de chacun des alcaloïdes dans la solution inconnue.
 Quel type d’étalonnage est–il utilisé dans ce TP?
 Commenter l’ordre d’élution de chaque composé par rapport à la phase utilisée?