UE 2.

5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

UE 2.5 : Sciences Biologiques EL BIYAALI Sania
Cours du Pr Pascale Cohen
Date : 22/10/2019

Analyses qualitatives et quantitatives des gènes

En cas de problème avec cette ronéo, merci de prévenir le VPI de l’AAEPL ([Link]@[Link]) et
le VP Formation de l’AAEPL ([Link]@[Link]) ou les ronéos girls/boys de votre promo.

5) Polymorphisme des longueurs de fragments de restriction (RFLP) 2

6) Électrophorèse des fragments de PCR 3
7) Southern Blot 4
• Marquage d'une sonde simple brin 4
• Marquage d'une sonde double brin 4
• Principe général du Southern Blot 5
8) Technique des oligonucléotides spécifiques d’allèles (ASO) 7
9) Dot-Blot inverse 8
10) PCR spécifique d’allèle 9
11) PCR multiplex 10
12) Empreintes génétiques 11
III. Analyse quantitative des gènes 12
1) Northern Blot 13
2) RT-PCR 15
3) PCR semi-quantitative 16
4) PCR quantitative 17
5) PCR en temps réel 17
6) Comparaison Northern Blot - RT-PCR 17

1 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

5) Polymorphisme des longueurs de fragments de restriction (RFLP)

Cette technique permet d’étudier la présence de polymorphismes en comparant des profils de

digestion (coupure) par des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction font partie de la famille des endonucléases. Les enzymes de restriction
clivent une petite séquence (souvent un palindrome), elles clivent les liaisons phosphodiesters au
niveau de la séquence spécifique que reconnait l’enzyme de restriction. Si le polymorphisme touche
un site de restriction particulier, le profil de digestion par l’enzyme de restriction correspondante sera
modifié.

Lorsque l’on a une mutation au niveau d’un site de restriction, l’enzyme ne sera plus capable de
couper dans ce site, puisque la séquence sera changée. Grâce à l’électrophorèse, on voit que
l’individu non muté fait apparaitre 3 bandes alors que l’individu muté fait apparaître 2 bandes.
L’enzyme n’a reconnu que 3 sites de restrictions pour le patient muté, puisque la mutation a modifié
un des sites de restriction (schéma de gauche).

Les réarrangements chromosomiques de type amplification ou délétion peuvent influencer la

présence et le positionnement de sites de restriction. Dans le schéma ci-dessous, on voit une délétion
au niveau de l’ADN de l’individu B. Les sites de restriction n’ont pas disparu, mais la longueur des
fragments de restriction a été modifiée (hauteur des bandes après migration à des distances plus ou
moins élevées du pôle négatif).

migration inchangée sur le

mutant fragment plus court car
migre plus loin

En aucun cas, cette technique ne permet de déterminer la séquence que l’on trouve sur les deux
fragments.

2 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

6) Électrophorèse des fragments de PCR

Si on réalise une électrophorèse d’acides nucléiques sur gel d’agarose, on fait migrer les fragments
d’ADN que l’on veut étudier de la cathode vers l’anode (les fragments d’ADN étant chargés
négativement). Une électrophorèse classique permet la séparation des fragments d’ADN en fonction
de la taille.

On met du bromure d’éthidium (BET) dans le gel, c’est un

agent intercalant de l’ADN qui se fixe spécifiquement à
l’ADN (il s’intercale entre les bases) quelle que soit la
séquence et émet une fluorescence mauve lorsqu’on
éclaire le gel avec des rayons ultra-violets.
On doit également placer dans un des puits de dépôt un
marqueur de taille comprenant des fragments de taille
connue, ces fragments serviront de témoins pour
déterminer la taille des fragments de nos échantillons.
On ajoute aussi un colorant bien visible dans chacun de
nos dépôts, il migre très rapidement (bleu de
Bromophénol). Cela permet de visualiser le front de
migration et d'arrêter l’électrophorèse avant que nos
fragments sortent du gel, on limite la distance parcourue
au bord de l'anode.
On ajoute également un agent qui permet d’augmenter la
densité de nos dépôts (glycérol ou sucre), l’échantillon
reste donc bien au fond du puit.
Après la migration, on examine le gel sous lumière UV à 254 nm et on photographie les fragments
d’ADN ayant migré.

gel visualisé sous lumière UV

3 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

7) Southern Blot

Le Southern Blot est une technologie inventée par Edward Southern.

Cette technique consiste à faire migrer nos fragments d’intérêts sur électrophorèse, tout ce qui a
migré est ensuite transférée du gel vers une membrane (nylon, nitrocellulose…), cette membrane est
appelée blot. Il faut ensuite détecter ce qui a été transféré sur cette membrane.
En Southern Blot, la révélation se fait par hybridation moléculaire, les fragments d’ADN sont révélées
à l’aide d’une sonde.
Une sonde est une séquence d’acides nucléiques simple brin, en général de petite taille, qui va aller
rechercher naturellement la séquence simple brin qui lui est complémentaire et anti-parallèle, c’est le
principe de l’hybridation moléculaire. La sonde sera marquée avant utilisation pour détecter le
signal d’hybridation.
Pour permettre l’hybridation moléculaire in vitro , il faut que la force ionique et la température de la
réaction optimisés (en se basant sur le Tm de la sonde).

Une sonde oligonucléotidique est :

- sensible
- spécifique
- se fixe sur un ADN dénaturé (simple brin) de séquence complémentaire et anti-parallèle
- elle est marquée :
• sonde froide : avidine-bovine (fluorescence ou chemiluminescence)
• sonde chaude : radioactive
- il existe plusieurs types de sondes :
• ADN (simple brin avant l’étape d’hybridation ou double brin, il faudra dans ce cas la dénaturer
avant hybridation)
• ARN (ribosonde)

• Marquage d'une sonde simple brin

L’oligonucléotide (20-30 nucléotides) de synthèse est dépourvu de phosphate en 5’.

On peut radiomarquer cet oligonucléotide à l’aide d’une enzyme, la T4 polynucléotide kinase qui
catalyse le transfert du phosphate en γ, d’une molécule d’ATP radioactive, marquée au 32P.
Si on met dans le milieu une molécule d’ATP marquée par du 32P en γ, la T4 polynucléotide kinase
va phosphoryler l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide avec le 32P, pour le marquer.

+ ADP

• Marquage d'une sonde double brin

Une sonde sous forme double brin doit passer sous forme
simple brin, on doit donc passer par l’étape de dénaturation en
élevant la température de l’ordre de 90°C. dénaturation de l’ADN (T°C = 100°C)
On refroidit ensuite brutalement pour que la sonde reste sous
forme simple brin : un refroisissment brutal va figer la hybridation des hexanucléotides
complémentaires et anti-parallèles de
configuration des brin sans que ceux-ci ne se réhybride, ce qui l’ADN matrice

aurait été le cas si on avait laissé refroidir doucement le

ajout du fragment de Klenow et de
système. dCTP* (marqué)

Ensuite, on ajoute dans le milieu réactionnel des amorces

(petites séquences simple brin hexanucléotidiques), c’est une
population aléatoire de séquences d’héxanucléotides ou * * brins marqués

hexamères qui représentent toutes les séquences possibles * *

constituées de 6 nucléotides.

4 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

L’hybridation se fait à 25°C, on met dans le milieu toutes les séquences statistiquement possibles, on
aura donc forcément des hexanucléotides complémentaires et antiparallèles au moins d’un des deux
brins de la sonde que je viens de dénaturer. On obtient des hybridations avec des lacunes.
L’étape d’après consiste à rajouter le fragment de Klenow (un fragment de l’ADN pol I qui contient
l’activité catalytique de l’enzyme) en présence de dNTP. Un des dNTP sera marqué au 32P.
L’ADN pol I va se positionner en 3’OH des amorces et va synthétiser dans le sens 5’→3’ la séquence
complémentaire et antiparallèle.
Si on décide de marquer spécifiquement un seul nucléotide comme le dCTP*, la polymérase va
forcément rencontrer un G sur l’ADN matrice, et un dCTP* sera ainsi introduit et marquera le fragment
simple brin, les fragments synthétisés au cours de l’élongation seront donc marqués radioactivement.

Remarque : Le marquage par la T4 polynucléotide kinase reste la technique la plus utilisée.

• Principe général du Southern Blot

Notre ADN génomique est constitué de 23 paires de chromosomes (chaque chromosome étant une
molécule d’ADN linéaire de très grande taille : 3x109 pb). On ne peut pas manipuler cette taille de
génome au niveau d'un tube réactionnel, il va falloir fragmenter cet ADN génomique en utilisant une
enzyme de restriction particulière (souvent une enzyme qui possède beaucoup de sites de restriction
dans notre fragment).

On réalise plusieurs étapes :

- on fait migrer les produits de restriction en gel d’agarose par électrophorèse, les fragments sont
séparés en fonction de leur taille. Le gel n’est pas dénaturant, il faut donc appliquer des conditions
dénaturantes pour dénaturer les brins, qui seront ensuite sous forme simple brin. On réalise donc
un traitement à la soude, qui permettra l’hybridation de la sonde sur les fragments simples
brins.
- on transfert les espèces moléculaires présentes sur le gel vers une membrane, on a besoin :
• un tampon de transfert
• la membrane
• le gel
• une pile de papier absorbant.
- le transfert des fragments se fait par capillarité : la pile de papier absorbant va réaliser une force
d’aspiration et faire migrer le tampon de transfert ainsi que les fragments d’ADN : cette force
d’aspiration permet le transfert des fragments d’ADN sur la membrane.
- il faut ensuite immobiliser les fragments d’ADN et créer une fixation covalente de l’ADN sur la
membrane. Cette fixation covalente peut se faire par différentes techniques :
• chauffer à 80°C pendant 2 heures
• exposition UV, qui permet la création de liaisons covalentes entre les fragments d’ADN et la
membrane de nylon particulière.
- on incube la membrane avec la sonde marquée radioactivement. Sur la membrane se trouve tous
les fragments d’ADN transférés, dénaturés et immobilisés. La sonde va se fixer sur une séquence
qui lui est complémentaire et antiparallèle, si cette séquence existe parmi tout les fragments, la
sonde va s’hybrider.
- on lave la membrane plusieurs fois pour éliminer toutes les liaisons non spécifiques, la sonde va
rester fixée sur la séquence complémentaire et anti-parallèle car elle a formé des liaisons
hydrogènes avec cette dernière, la sonde fixée sur sa séquence spécifique n’est pas éliminée par
le lavage. En revanche, si la sonde se fixe sur une séquence quelconque, elle sera éliminée par le
lavage.
- on réalise ensuite une auto-radiographie du gel, on positionne sur le gel un film auto-
radiographique que l’on va ensuite développer, qui va permettre de révéler la présence de bandes
et ainsi de déduire la taille des fragments d’ADN. Seuls les fragments qui contiennent une
séquence anti-parallèle et complémentaire sont révélés par autoradiographie, la sonde ne se fixe
pas ailleurs, même si les autres fragments sont sur la membrane, ils ne sont pas révélés.

5 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

L’utilisation de sonde de séquences connues permet de visualiser des fragments dont on sait qu'ils
contiennent la séquence complémentaire et anti-parallèle.

Ici, on peut voir que, après digestion par EcoRI, le fragment reconnu par la sonde bleue est le même
sur l’individu WT et muté. Mais, l’autre fragment reconnu par la sonde rouge est délété de 1500 pb,
sur le Western Blot on verra donc deux migrations différentes, le fragment qui migre le plus loin est le
plus court, il correspond donc au sujet muté. Le Southern Blot peut donc permettre de suspecter un
type de mutation, ici une délétion.
Le Southern Blot permet donc de détecter une séquence spécifique de l’ADN génomique afin, par
exemple, de mettre en évidence une mutation ou au contraire d’écarter l’hypothèse d’une mutation,
dans un gène donné.

6 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

Vidéo de l’expérience :
- on introduit des échantillons d’ADN dans des tubes 1 et 2
- on ajoute une enzyme de restriction différente dans chaque tube : les endonucléases fragmentent
l’ADN selon leur propre site de restriction
- on rajoute dans le tube du Bleu de Bromophénol, il sert à visualiser le front de migration, on peut
donc arrêter la réaction avant que les fragments d’ADN ne sortent du gel.
- on prélève l’échantillon, et on le dépose
- on fait une électrophorèse : les fragments d’ADN migrent en fonction de leur taille sur le gel
d’agarose
- on récupère le gel, on peut visualiser les bandes sous lumière UV (λ = 254 nm) correspondant aux
fragments qui ont migré car le bromure d’éthidium (BET) s’est intercalé dans tout les fragments
d’ADN.
- dénaturation des brins d’ADN par traitement dans la soude (traitement alcalin)
- une membrane de nitrocellulose ou de nylon est apposée sur le gel et du papier absorbant est
alors placé sur la membrane de nitrocellulose. Par capillarité, la solution est aspirée par le papier
absorbant et les fragments d’ADN simples brins vont être transférés sur la membrane de
nitrocellulose.
- on récupère la membrane, aucune bande est visible à l’œil nu. L’exposition aux UV permet la
formation des liaisons covalentes entre l’ADN simple et la membrane, cette liaison est réalisée avec
la chaleur pour les membranes de nitrocellulose.
- on ajoute dans le milieu la sonde radiomarquée qui va se fixer sur toutes les séquences
complémentaires et anti-parallèles, la visualisation se fait par autoradiographie

8) Technique des oligonucléotides spécifiques d’allèles (ASO)

C’est une technique utilisée lorsque la mutation que l’on recherche est connue. On a besoin de
deux sondes oligonucléotidiques marquées (complémentaires de l’allèle normal et muté).
On réalise deux hybridations moléculaires avec chaque sonde.
Pour chaque sonde, les conditions d’hybridation sont spécifiques (conditions particulières de la
sonde : température et force ionique optimisés).

Pour cette technique, on a réalisé au préalable une PCR avec des amorces qui encadrent la région
où se trouve la mutation. On souhaite ensuite déterminer si les fragments de PCR produits
comportent ou non la mutation. On a réalisé la PCR à partir de l’ADNc ou de l'ADN génomique de
l’individu. Ces produits de PCR vont être déposés en parallèles sur deux demi-membranes.

Sur le schéma ci-dessous, on voit la représentation de 3 cas de figures :

- si l’individu est homozygote WT (A/A)
- si l’individu est homozygote pour la mutation (G/G)
- si l’individu est hétérozygote (A/G)

La PCR s’effectue sur les 2 allèles, sur les 2 chromosomes de la même paire.
Chacune des membranes est hybridée soit avec une sonde oligonucléotidique qui s’hybride sur la
séquence wild type ou qui s’hybride avec la séquence mutée.
Finalement, le typage de l’individu est fonction du résultat observée sur les 2 membranes.

Il existe 3 cas de figures :

- si on un signal uniquement avec la membrane hybridée avec la sonde WT, cela signifie que
l’individu est homozygote A/A.
- si on a un signal uniquement sur la membrane hybridée avec la sonde mutée, alors l’individu est
homozygote muté G/G.
- si sur un individu, on a un signal aussi bien en présence de membrane hybridée avec une sonde
WT qu’en présence d’une membrane hybridée avec une sonde mutée, l’individu est alors
hétérozygote pour cette mutation.

7 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

Les conditions d’hybridations doivent être parfaitement contrôlées puisqu’il faut qu’elles soient
optimales. Si la mutation touche un seul nucléotide, la sonde wild type ne doit absolument pas
s’hybrider avec la séquence mutée, et inversement : aucun mésappariement n’est possible.

9) Dot-Blot inverse

C’est l’inverse de la technique ASO. Ici, c’est la sonde qui est immobilisées sur la membrane, le
produit de PCR est amplifié de façon à ce qu’il soit marqué par la biotine. On incube ce complexe
avec le mélange streptavidine-phosphatase alcaline, l’interaction streptavidine/biotine est très forte.
Il suffira ensuite d’incuber le substrat de la phosphatase alcaline qui va donner un produit coloré pour
permettre de visualiser s’il y a eu ou non une hybridation.
Si la phosphatase alcaline est fixée, il y a une coloration, cela veut donc dire qu’il y a eu accrochage
steptavidine/phosphatase alcaline et donc hybridation des produits de PCR avec la sonde
immobilisée sur la membrane.

streptadividine-phosphatase
alcaline
biotine

produit coloré

substrat
produit de PCR

sonde fixé au blot

ASO immobilisée sur membrane

avec produit de PCR

8 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

Cette technique de Dot Blot inverse est utilisée par différents kits qui permettent de détecter des
mutations, de réaliser différents typages :
- Inno-LiPA CF2TM : détection de 80% des mutations du gène CFTR
- Inno-LiPA DPQ, DQB et DRB : typage HLA
- Inno-LiPA Rif TBTM: détection de mutations responsables de la résistance à la rifampicine de
Mycobacterium tuberculosis
- Inno-LiPA ApoETM : génotypage de l’ApoE dans la maladie d’Alzheimer
- Inno-LiPA HPVTM : génotypage du papillomavirus (cancer du col de l’utérus)

On achète les sondes directement immobilisées sur les membranes et on travaille en marquage froid,
on n’incorpore pas de radioactivité, il n'y a donc pas de contraintes liées à la manipulation de
radioactivité.

10) PCR spécifique d’allèle

Cette technique est utilisée pour différencier deux allèles pour la recherche d’un polymorphisme ou
d’une mutation particulière (spécificité de la mutation reliée aux choix des amorces).
La réalisation de la PCR va être fonction de ce qu’il se passe en 3’ de l’amorce : appariement ou
mésappariement.
S’il y a un mésappariement en 3’, le duplex ADN-amorce est déstabilisé, il n’y a pas donc pas
d’amplification par PCR ou l’extension par la Taq polymérase est considérablement ralentie (efficacité
très faible).

Pour un individu donné, on réalise deux PCR parallèles, pour chaque PCR, on utilise deux couples
d’amorces qui se différencie par un nucléotide en 3’ de l’amorce P1 et P2.
Dans la première PCR, l’amorce P1 contient le nucléotide en 3’OH qui est complémentaire de la
forme WT. Sur la deuxième PCR, on a toujours l’amorce P3 et on utilise une amorce P2 qui a 3’ le
nucléotide complémentaire de la séquence mutée (un C si la mutation est un G).

Le même ADN génomique est testé dans les deux PCR. En réalisant cette double PCR (PCR avec
amorces P1-P3 et PCR avec amorces P2-P3), on peut facilement déterminer quel est le génotype de
l’individu pour la mutation étudiée :
- si le sujet qui est homozygote WT, il y aura amplification grâce aux amorces P1-P3 mais pas
d’amplification avec les amorces P2-P3.
- si le sujet est hétérozygote, comme les 2 allèles sont présentes, on aura amplification avec les deux
couples d’amorces
- si le sujet est homozygote muté, le couple d’amorces P1-P3 ne permet pas l’amplification, mais les
amorces P2-P3 permettent l’amplification.

9 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

11) PCR multiplex

Cette technique consiste à amplifier simultanément plusieurs séquences cibles dans une même
réaction d’amplification. Chaque amplification doit être indépendante des autres, et il ne faut pas
qu’il y ait d’interférences entre elles. Chaque produit d’amplification doit avoir une taille différente pour
permettre une analyse sur gel d’agarose. Il faut également que tous les couples d’amorces
s'hybrident à la même température.

Pour un individu donné, avec une seule réaction de PCR, on cherche la présence ou absence de
polymorphismes localisés en divers endroits d’un gène donné.
On va utiliser dans la même réaction de PCR plusieurs couples d’amorces.
Chaque couple d’amorce va amplifier une région particulière du gène.
Pour que la PCR multiplex soit analysable et efficace, il faut que chaque amplification réalisée avec un
couple d’amorces s’effectue de manière indépendante des autres amplifications avec les autres
couples d’amorces.
Pour qu’on puisse analyser les produits réactionnels de chaque amplification, il faut que les produits
de PCR de chaque réaction (avec un couple) donnent un produit de PCR de taille différente pour
qu’on puisse analyser et différencier les fragments en gel d’agarose par électrophorèse.

Sur l’exemple ci-dessous, on réalise une seule PCR avec plusieurs couples d’amorces, on sait
exactement quelles bandes on devrait obtenir en fonction des amorces qu’on a choisi.
Si il manque une bande sur le gel, là ou on s’attendait à en voir une, on sait quel est le couple
d’amorce qui n’a pas pu induire l’amplification et donc suspecter une délétion par exemple.

Exemple : analyse de la dystrophine dans la myopathie de Duchenne.

Plusieurs types de polymorphismes peuvent toucher ce gène qui code pour la dystrophine.
Dans 70% des cas, les lésions du gène sont dûes à des délétions de 1 à plusieurs kb.
Il a été mis au point une réaction de PCR multiplex utilisant 18 couples d’amorces pour rechercher en
une seule étape sur les 18 exons de la dystrophine la présence ou non de délétions.

10 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

12) Empreintes génétiques

Il y a au niveau de l’ADN génomique des séquences répétées en tandem (répétées les unes à coté
des autres) ou en exemplaire unique un peu partout dans le génome (séquence Alu).
Le nombre de ces répétitions est variable d’un individu à l’autre mais est transmis par le père et la
mère. On réalise une réaction de PCR avec des amorces qui flanquent la région ou on trouve ces
répétitions, la taille des fragments sera donc directement fonction du nombre de répétitions.

Le nombre de répétition en un locus donné varie en fonction de l’individu.

Pour un individu donné, on réalise une réaction de PCR avec des amorces qui s’hybrident de part et
d’autre du locus que je veux étudier (le locus concerné par le polymorphisme). Le produit de PCR
obtenu va avoir une taille différente en fonction du nombre de répétitions. Chaque produit de PCR
d’un individu se différencie d’un autre seulement par quelques répétitions en plus, on a donc besoin
d’un gel hautement résolutif pour distinguer une répétition d’un triplet supplémentaire par exemple.
On obtient un « code barre » spécifique à chaque individu, dû à un nombre de répétitions spécifique
de chaque individu en un locus donné.
On peut ainsi faire des recherches de paternité en recherchant des homologies de ces « codes-
barres » entre le père présumé et l’enfant avec en parallèle le « code barre » de la mère.
On utilise également cette technique en criminalistique pour comparer les empreintes du présumé
coupable et celles retrouvées sur le lieu du crime. Néanmoins, on n’obtient jamais de réponse exacte
et certaine, seulement des probabilités

11 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

III. Analyse quantitative des gènes

Seulement une partie de l’information génétique va être utilisée dans une cellule ou organe donné.
Même si toutes nos cellules ont le même ADN génomique, seuls certains gènes seront exprimés,
c’est-à-dire transcrits en ARNm et traduits en protéines.
La majeure partie des fonctions biologiques qui sont présentes dans nos cellules sont portées par les
protéines. Sur nos 20 000-25 000 gènes, on considère qu’il n’y a pas plus de la moitié (10 000
gènes) qui sont exprimés au sein de la cellule.
La cellules va pouvoir s’adapter grâce aux points clés que sont les sites de régulation de
l’expression des gènes. Le point majeur de la régulation est au niveau de la production d’ARNm.
Beaucoup de technologies servent à estimer l’expression d'un gène en fonction de la quantité de
l’ARNm correspondant.

On peut étudier les variations qualitatives et quantitatives de l’expression de certaines gènes dans un
contexte tissulaire physiologique ou pathologique. D’un point de vue fondamental, cela permet de
comprendre les mécanismes de régulation de l’expression d’un gène donné.
Les variations d’expression de gènes peuvent être associées à :
- une dynamique biologique
- un stress
- une spécification tissulaire
- une exposition à un agent chimique ou pharmacologique
- un contexte pathologique

La demi-vie de l’ARN, la dégradation de l’ARNm et de la protéine font que tout ce qui a été produit va
disparaitre au bout d’un certain temps. Si la cellule est soumise à un stress, elle va activer l’expression
de certains gènes, certaines protéines seront donc produites pour répondre à ce stress.
Suivant le tissu, certains gènes seront plus ou moins exprimés.
La cellule ou le tissu réagit à l’exposition d’un agent chimique ou pharmacologique également en
modifiant l’expression des gènes. Un des grands challenges dans la recherche biomédicale est de
comprendre quelles sont les dérégulations d’expression génomique associé à un contexte
pathologique pour une cellule (si la cellule devient cancéreuse par ex, quels sont les gènes qui sont
dérégulés).

12 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

1) Northern Blot

En principe :
- les ARN sont extraits de l’échantillon.
- ils sont ensuite séparés en électrophorèse puis transférés sur une membrane (nitrocellulose ou
nylon).
- l’identification et la quantification d’un transcrit donné sont réalisées par hybridation avec une
sonde oligonucléotidique marquée.

Extraction des ARN totaux

(méthode à l’isothiocyanate de guanidium)

Purification

Purification des ARNm par chromatographie

Cellule ou Tissu d’affinité (polyU ou polyT)

Quantification (DO à 260nm)

Dépôt en quantité équivalente des différents échantillons (10-20 μg)

sur gel d'agarose en conditions dénaturantes (formaldéhyde ou glyoxal)

Électrophorèse

Remarque : le thiocyanate de guanidinium est utilisé pour lyser des cellules afin d’extraire ARN et ADN, et
où, en plus de son action de lyse, il empêche en les dénaturant l'activité d'enzymes RNases et DNases
qui pourraient endommager l'extrait.

Les ARNm eucaryotes ont tous une queue poly-A, ils peuvent donc être purifiés grâce à une
chromatographie d’affinité où la phase stationnaire est liée à une séquence polyU ou polyT, sur
lesquelles s'hybrideront les queues poly-A des ARNm de notre échantillon. Pour l'étape de l’élution,
on peut ajouter un tampon d'élution qui va déstabiliser les liaisons hydrogènes établies et récupérer
les ARNm purifiés.
Quand on dépose les ARN totaux, la visualisation des ARNr 28S et 18S et le fait qu’il n’y a pas une
accumulation de signal en bas du gel, qui serait caractéristique de petits ARN produits par digestion
par les RNAses permet de savoir que l’on a pas eu dégradation de notre échantillon, on a conservé
l’intégrité de l’échantillon, on le visualise avant transfert pour contrôler et refaire éventuellement la
manipulation si besoin.

13 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

Après la migration on récupère notre gel, on sait que les ARN n’ont pas été dégradés, on va ensuite
transférer les ARN sur une membrane, de la même manière que pour un Southern Blot.
On récupère ensuite notre membrane sur laquelle sont fixés tous nos ARN, on va alors ajouter une
sonde spécifique qui va aller s'hybrider sur les séquences qui lui sont complémentaires et anti-
parallèles. Pour rappel, la sonde sera préalablement marquée au 32P par exemple. L’hybridation doit
se faire dans les conditions optimales, elle est suivie par des étapes de lavage pour éliminer les
éventuelles interactions non spécifiques. Enfin, la révélation se fait par autoradiographie avec un film
sensible aux rayons X.

Sur l’autoradiogramme ci-contre on peut voir que notre gène X

d’intérêt est exprimé dans le cerveau, dans le rein mais pas dans le
coeur ou dans le foie. On peut distinguer une différence de signal
en position 1, mais pour pouvoir conclure que l’ARN en question
est moins exprimé dans le cerveau que dans le rein, il faut être sûr
que l’on a déposé la même quantité d’échantillon dans les deux
puits : c’est étape de normalisation. Il faut donc faire une
deuxième hybridation avec une deuxième sonde nucléotidique qui
va s’hybrider contre la séquence d’un transcrit de gène
ubiquitaire. C’est un transcrit que l’on retrouve en quantité
équivalente dans toutes les cellules de notre organisme. Ici en
position 2, on voit qu’il y a la même quantité d’ARN ubiquitaire
dans tous nos puits, on peut donc affirmer que l'on a mis la même 1
quantité d’échantillon dans tous nos puits.
Ensuite, pour comparer la quantité d’ARN dans nos deux puits en
position 1, il faut comparer les intensités de fluorescence des
2
deux bandes. Il existe des appareils pour mesurer l’intensité d’une
bande, pour chacune des intensité on normalise la valeur par
l’intensité de la bande témoin (en position 2).
L'autoradiogramme peut aussi nous donner d’autres indications.
Par exemple, si pour une même sonde et donc pour un ARN
donné, on retrouve plusieurs bandes à des migration différentes,
on peut suspecter un épissage alternatif.

Pour résumer le Northern Blot permet de :

- affirmer la présence ou l’absence d’un ARN dans un échantillon donné.
- apprécier les quantités d’un même ARN suivant l’échantillon, et ainsi d’étudier l’expression génique
dans plusieurs tissus.
- mettre en évidence l’existence de plusieurs ARN de tailles différentes pour un même gène,
conséquence d’un épissage alternatif.

Néanmoins cette technique manque de sensibilité alors que la quantité de matériel au départ est
seulement de quelques μg.

14 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

2) RT-PCR

La RT-PCR est une technique régulièrement utilisée en laboratoire.

Elle fait intervenir une réverse transcriptase (ADN polymérase ARN dépendante). C’est une enzyme
qui va synthétiser de l’ADN par polymérisation en prenant pour matrice une séquence d’ARN.

Comme la réverse transcriptase nécessite une amorce pour commencer la synthèse d’ADN. Dans la
réverse transcription, différents types d’amorces pourront être utilisés :
- une amorce oligodT : une amorce constituée d’une succession de résidus T, qui s’hybride sur la
queue poly-A des ARNm, la réverse transcriptase se positionne en 3’OH de l’oligodT pour
synthétiser la séquence complémentaire et anti-parallèle.
- une amorce spécifique du transcrit que l’on recherche, qui s’hybride sur une séquence interne du
transcrit.
- une population d’amorces hexanucléotidiques, il y aura au moins une amorce dans la population
qui s’hybridera sur la séquence que l’on veut rétrotranscrire.

La reverse transcriptase a besoin de dNTP, elle va réaliser la synthèse de l’ADN complémentaire à la

matrice d’ARN, appelé l’ADNc. Les reverse transcriptase les plus courantes sont celles qui sont
purifiés à partir de virus de cellules eucaryotes :
- AMV : extraite de cellules infectées par le Virus de la Myelomastose Aviaire
- MMLV : extraite de cullules infectées par le Virus de la Leucémie Murine de Moloney

La reverse transcriptase a une activité :

- polymérase 5’→3’
- pas d’activité exonucléase 3’→5’
- RNase H : plus ou moins marquée, qui peut poser problème car peut
affecter la matrices ARN.

Il existe une reverse transcriptase spécifique, l’activté RNase H a été

supprimée, on a une meilleure efficacité de reverse transcription sans que
l’ARN matrice ne soit affecté.

Pour synthétiser l’ADNc à partir d’ARNm eucaryotes, on va d’abord

ajouter un type de primer dans le milieu (voir ci-dessus).
Ces amorces vont s’hybrider sur toutes les séquences complémentaires
et anti-parallèles dans la population d’ARNm.
On ajoute ensuite la reverse transcriptase, les dNTPs pour synthétiser
l’ADNc, on se retrouve avec un complexe ARN-ADNc.
On sépare les brins, on ajoute une deuxième amorce spécifique de l’ADNc
qui vient d'être synthétisé et une Taq polymérase. On retrouve ensuite un
schéma classique de PCR, on va amplifier l’ADN compris entre les deux
amorces choisies.

15 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

Comme nous l’avons vu dans le cours précedent, l'amplification atteint un maximum au bout
d’environ 30 cycles. Si on veut faire une PCR quantitative, il va falloir se mettre dans des conditions
où on est dans une amplification proportionnelle à la quantité de départ du transcrit dans le milieu
réactionnel, on va donc arrêter la PCR avant d'atteindre ce plateau.

Exemple : si on amplifie une séquence donnée, on arrête la PCR à 20, 25, 30 cycles, et on dépose sur le
gel d’électrophorèse notre produit d’amplification, pour suivre l’évolution des quantités synthétisées.
Au bout d'une dizaine de cycle de PCR (sur le gel on a 11 et 17 cycles), la quantité dADN synthétisée
n’est pas encore suffisante pour être visualiser à l’œil nu sur gel d’électrophorèse.
Plus les cycles s'enchainent, plus la quantité d'ADN synthétisée augmente et on visualise une bande à
partir de 23 cycles. À 27 et 30 cycles, la taille de la bande est à peu près identique, on a atteint un
plateau.

Pour comparer la quantité de transcrit sur lequel j’ai réalisé la PCR à la quantité d’'un autre transcrit : il
faut se positionner à un nombre de cycles compris entre 20 et 25 cycles pour être dans la partie
linéaire de l’amplification, les résultats seront plus précis.

3) PCR semi-quantitative

On dépose les produits de RT-PCR des différents tissus sur gel

d’agarose. Après exposition aux UV, on regarde l’intensité de la
bande au niveau de ces transcrits, pour estimer la quantité d’un
ARN suivant le tissu.

Il faut bien faire la différence entre :

- semi-quantification : transcrit du récepteur aux cannabinoïdes
est 2,5 fois plus exprimé dans les cellules U373 par rapport au
cerveau (logiciel permettant de faire le ratio).
- quantification absolue : il y a x copies du transcrit de
récepteur aux cannabinoïdes dans les cellules U373 par rapport
au cerveau

Cette technique permet seulement une semi-quantification.

16 sur 17
UE 2.5 : Sciences Biologiques Biologie Moléculaire

4) PCR quantitative

Ici, on peut déterminer le nombre de copies d’un ARN cible par cellules (quantification absolue).
Il faut établir une droite étalon grâce à un ADN de quantité connue. On réalise des PCR différentes
avec des concentrations connues et croissantes de notre ADN standard puis on établit la courbe
standard, également appelée droite étalon.

La droite étalon est réalisée sur une série de 5 dilutions d’un standard d’ADN de quantité connue.
L’intensité du signal observé pour notre échantillon permet ensuite de déduire la concentration d’ADN
correspondante.

5) PCR en temps réel

Traité en ED avec Dr H. Lincet.

6) Comparaison Northern Blot - RT-PCR

Northern Blot RT-PCR

Matériel de départ μg ng-pg

Seuil de sensibilité (molécules) 106 10-100

Précision (erreur sur la mesure) 30 % 5-10%

Même si on réalise encore des Northern Blot au laboratoire la RT-PCR reste la technique de choix
pour mesurer l’expression d’un gène donné, rechercher un transcrit et le quantifier par semi-
quantification ou en quantification absolue.

17 sur 17