2.
4 Les banques d’ADN contiennent tout le génome d’un organisme
Le concept de clonage moléculaire repose sur la faculté de présenter des mélanges très
complexes d’ADN, comme étant l’ensemble d’un génome, sous une forme plus maniable que
les énormes chromosomes d’une cellule. Si l’on peut remplacer ces très longs chromosomes
par des fragments aléatoires, les insérer dans des vecteurs comme les plasmides, puis les
multiplier dans une cellule hôte, ils représentent tout le génome. On parle alors d’une banque
(ou bibliothèque) d’ADN, collection des ADN dans un vecteur qui, ensemble, représentent le
mélange complexe.
En principe, le type de banque d’ADN le plus simple possible est une banque génomique
(représentation de l’ensemble du génome dans un vecteur). Ce génome est découpé au hasard
par une enzyme de restriction agissant à haute fréquence. En ne coupant pas totalement
l’ADN, tous les sites ne sont pas scindés et les sites de coupures sont aléatoires. Ces
fragments aléatoires sont ensuite insérés dans un vecteur et introduits dans les cellules hôte.
Les banques génomiques sont généralement construites dans des chromosomes bactériens
artificiels (BAC).
On peut créer différents types de banques en fonction des sources d’ADN utilisées. Chaque
clone ne contient qu’un seul ADN, et leur ensemble constitue la banque. IL faut se rendre
compte que, contrairement à une bibliothèque pleine de livres organisés et catalogués, une
banque d’ADN est une collection aléatoire de fragments d’ADN qui se chevauchent. Dans le
paragraphe suivant nous verrons comment retrouver une séquence d’intérêt dans une
collection aléatoire.
Figure 8 : Banque d’ADN génomique
UE Bio 300
Dr. KOMI KOUKOURA Komi, Enseignant-Chercheur/ESTBA –Département-AMB/UL
2.5 La transcriptase inverse peut donner une copie de l’ARN sous forme d’ADN
Outres les banques génomiques, les chercheurs souhaitent souvent isoler des gènes exprimés.
En raison de la structure des gènes eucaryotes, l’ARNm peut être beaucoup plus court que le
gène lui-même à cause de la présence des introns. Après la transcription par l’ARN
polymérase II, le transcrit primaire est épissé en ARNm. Ces pourquoi les banques
génomiques sont importantes pour comprendre la structure du gène, mais peu utiles quand on
souhaite l’expression du gène dans une bactérie, dont les gènes ne possèdent pas d’introns, ni
de mécanisme d’épissage.
Une banque ne contenant que les séquences exprimées comportent une quantité d’ADN
beaucoup moindre que le génome entier. L’ARNm isolé est à l’origine d’une banque d’ADNc
représentant les gènes exprimés dans un tissu donné à un stade donné du développement. On
peut obtenir cette banque des séquences exprimées grâce à une enzyme, la transcriptase
inverse.
La transcriptase inverse a été isolée d’un type de virus, les rétrovirus. Le cycle de
développement d’un rétrovirus implique la construction d’un ADN copié sur l’ARN de son
génome. On peut mettre à profit l’activité de l’enzyme du rétrovirus pour fabriquer des copies
d’ADN à partir de l’ARNm isolé. Ces copies de l’ARNm sont de l’ADN complémentaire :
ADNc (figure dessous). On obtient une banque d’ADNc en isolant d’abord l’ARNm des
gènes qui s’expriment, puis en synthétisant l’ADNc à l’aide de la transcriptase inverse.
L’ADNc est ensuite utilisé pour créer une banque, comme on l’a vu. Ces banques d’ADNc
sont extrêmement utiles et représentent souvent les gènes exprimés dans de nombreux tissus
ou cellules différents. Alors que toutes les banques génomiques d’un individu sont
identiques, les banques d’ADNc des mêmes cellules à des stades différents du
développement ou dans des tissus différents sont toutes distinctes.
Figure 9a : synthèse d’un cDNA à partir du mRNA
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UE Bio 300
Dr. KOMI KOUKOURA Komi, Enseignant-Chercheur/ESTBA –Département-AMB/UL
Figure 9b : synthèse d’un cDNA à partir du mRNA
2.6 L’hybridation permet d’identifier des ADN spécifiques dans des mélanges complexes
L’hybridation moléculaire est une technique fréquemment utilisée pour identifier des ADN
particuliers dans des mélanges complexes, comme les banques. L’hybridation repose sur
l’appariement spécifique des bases entre deux brins d’ADN. Si une molécule d’ADN est
dénaturée, c'est-à-dire si les deux brins sont séparés, ils ne se réassocient qu’avec des
partenaires possédant la séquence complémentaire. Cette propriété est mise à profit par les
biologistes moléculaires dans leurs expériences en utilisant une molécule d’ADN spécifique
connue pour rechercher son partenaire dans un mélange complexe.
Tout acide nucléique bicaténaire (ADN ou ARN) peut être marqué par radioactivité ou par un
autre marqueur décelable, comme un colorant fluorescent. On peut ainsi l’utiliser comme
sonde pour identifier son complément dans un mélange d’ADN ou d’ARN. Cette renaturation
est une hybridation, parce que la combinaison d’une sonde marquée et d’un ADN non
marqué produit une molécule hybride par appariement des bases.
Au cours du temps, diverses techniques ont été appliquées pour construire des sondes. Une
technique impliquait l’isolement d’une protéine d’intérêt et son séquençage chimique.
Disposant la séquence de la protéine, on pouvait prédire la séquence de l’ADN en se basant
sur le code génétique. On peut ensuite utiliser cette information pour synthétiser un ADN
pour servir de sonde.
- On peut isoler des clones particuliers à partir d’une banque (fig17.6)
Isoler un clone particulier de la collection aléatoire que représente une banque d’ADN est
comme trouver l’aiguille du proverbe dans une botte de foin. Pour cela, il faut connaitre un
peu le gène d’intérêt. Par exemple, parmi les premiers gènes isoles, beaucoup avaient une
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