UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

MEMOIRE
Année : 2022 Pour l'obtention du Diplôme N° d’ordre :
de Master ès Sciences et Techniques
Mention : Sciences et Techniques
Parcours : Sciences Biologiques
Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire
Option : Biochimie et Microbiologie Appliquée
Présenté et soutenu publiquement

Vendredi, 16 Décembre 2022

Par
NTSANA Rodinet
Titulaire d’une licence de Biologie Cellulaire et Moléculaire
THEME

Evaluation du Potentiel Bioremédiateur des

Bactéries du genre Bacillus isolées des Eaux
usées de la Brasserie de Brazzaville (BRASCO)
DIRECTEUR DE MEMOIRE
KAYATH Aimé Christian, Maître de Conférences CAMES, FST/UMNG (Congo)

CO-DIRECTEUR DE MEMOIRE
DIANZITOUKOULOU MATSIMA Louis Donald, Maître-Assistant CAMES, FST/UMNG
(Congo)

JURY
Président :
NGUIMBI Etienne, Professeur Titulaire CAMES, FST/UMNG (Congo)

Membres :
MOYEN Rachel Epouse OKOBO, Maître de conférences CAMES, FST/UMNG (Congo)
KAYATH Aimé Christian, Maître de Conférences CAMES, FST/UMNG (Congo)
DIANZITOUKOULOU MATSIMA Louis Donald, Maître-Assistant CAMES, FST/UMNG
(Congo)
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

DEDICACES
À ma très chère mère « Léonie DIMI » et ma très chère tante maternelle « Henriette
DIMI » autant de phrases, aussi expressives soient-elles, ne sauraient montrer le degré
d’amour et d’affection que j’éprouve pour toi. Tu m’as comblé avec ta tendresse et
affection tout au long de mon parcours. Tu n’as cessé de me soutenir et de m’encourager
durant toutes les années de mes études, tu as toujours été présente pour me consoler
quand il fallait, reçois ce travail en signe de ma vive gratitude.
À Mon Très Cher Père « Leonel Albert NTSANA » autant de phrases et d’expressions,
aussi éloquentes soient-elles, ne sauraient exprimer ma gratitude et ma reconnaissance. Tu
as su m’inculquer le sens de la responsabilité, de l’optimisme et de la confiance en soi face
aux difficultés de la vie. Tes conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. Ta patience
sans fin, ta compréhension et ton encouragement sont pour moi le soutien indispensable
que tu as toujours su m’apporter.
C’est à eux que je dois ma réussite, que Dieu leur donne vie pleine de joie, de bonheur et
de santé.

Rodinet NTSANA

i
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

REMERCIEMENTS
A Monsieur KAYATH Aimé Christian, maître de conférences CAMES, FST/UMNG pour
avoir dirigé ce travail avec patience, savoir-faire, rigueur et ardeur. Recevez l’expression de ma
profonde gratitude. Vous m’avez reçu à bras ouverts.
Je tiens également à témoigner ma reconnaissance au Docteur DIANZITOUKOULOU
MATIMA Donald, Maitre-Assistant CAMES, mon co-directeur de mémoire de m’avoir fait
l’honneur de suivre et d’aménager une partie de son temps pour la finalisation de ce document.
Au Professeur NGUIMBI Etienne. Vous m’avez fait l’honneur en acceptant de présider ce
jury et d’apporter des contributions intelligentes au novice scientifique que je suis.
De même, je tiens à remercier Madame MOYEN Rachel Epouse OKOBO, Maître de
conférences CAMES, en sa qualité d’examinateur pour son apport scientifique méticuleux afin
d’améliorer ce travail.
Mes remerciements vont aussi à l’égard du Doyen de la Faculté des Sciences et Techniques,
Professeur BOSSOTO Basile Guy Richard, qui m’a permis de soutenir ce mémoire.
Je témoigne ma reconnaissance auprès du Professeur TCHIMBAKALA GOMA Joseph,
Directeur Général de l’Institut National de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles
(IRSEN), pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser mon travail au sein de son Institut.
Une pensée au collectif des enseignants-chercheurs du parcours de Biologie Cellulaire et
Moléculaire de la Faculté des Sciences et Techniques pour leurs enseignements de qualité.
A tous les personnels de la Brasserie de Brazzaville et du laboratoire de Microbiologie
Appliquée et Biologie Moléculaire de l’IRSEN, un tout grand merci pour vos conseils avisés.
Je pense particulièrement à Monsieur Stech NZAOU, à Monsieur Yannick OKOUAKOUA,
à Monsieur Duchel KINOUANI, à Monsieur Doria KAYA-ONGOTO.
A toute promotion de Master 2021_2022 et pour toutes les années passées ensemble, je nous
dédie ce travail. Un grand merci pour la cohésion académique et sociale à toi CHRIST,
NDÉLANI, MARCUS, VARELLE, DIGNE MONA, FALONNE, MARTINA ET
AURÉOLE.
À mes Frères et sœurs : Bergel OKO NTSANA, Messi OKO NTSANA, Van Rayan OKO
NTSANA, Chancelle ITOUA BOUYA, Cornelle ITOUA DIMI, Juvelia ITOUA, Krishna
NGOH, José NGOH, Héléna AKOUELE, Arit Fav ELENGA, Dorian ELENGA, Çai-ira
jeansmelle MOUELENGA OMBELI, Rêche Richère OMBELI, Florida Lauriane
KOUNGOU AKONDZI et DOUMA ESSALA Ardèche.
À ma très cher Paule Ephrèse PEMESSO, merci pour le soutien matériel informatique.

ii
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

TABLE DE MATIERES
TABLE DE MATIERES .......................................................................................................... III
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. VI
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................. VIII
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 3
1. CONTEXTE ET JUSTIFICATION .................................................................................... 1
2. PROBLEMATIQUE ............................................................................................................ 1
1. OBJECTIFS ......................................................................................................................... 2
1.1. OBJECTIF GENERAL............................................................................................................ 2
1.2. OBJECTIFS SPECIFIQUES ..................................................................................................... 2
1.3. HYPOTHESES ...................................................................................................................... 2
CHAPITRE I .............................................................................................................................. 0
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................. 0
I.1. LES POLLUANTS D’ORIGINE INDUSTRIELS .............................................................................. 3
I.1.1. LES EAUX USEES INDUSTRIELLES........................................................................................ 3
I.1.3. IMPACT DES EAUX USEES .................................................................................................... 4
I.2. METHODES DE BIOREMEDIATION .............................................................................. 5
I.3. LES BACTERIES DU GENRES BACILLUS .................................................................... 6
I.3.1. GENERALITE SUR LES BACTERIES DU GENRE BACILLUS ..................................................... 6
I.3.2. L’HABITAT ......................................................................................................................... 6
I.3.3. LE METABOLISME ............................................................................................................... 6
I.3.4. TAXONOMIE ....................................................................................................................... 7
I.3.5. INTERET BIOTECHNOLOGIQUE ............................................................................................ 8
CHAPITRE II ............................................................................................................................. 4
I.4. MATERIEL ....................................................................................................................... 11
I.4.1. MATERIEL BIOLOGIQUES ................................................................................................. 11
I.4.2. MATERIEL DE LABORATOIRE ............................................................................................ 11
II. METHODES ....................................................................................................................... 11
II.1.1. CADRE, TYPE ET PERIODE D’ETUDE ................................................................................. 11
II.1.2. ÉCHANTILLONNAGE ........................................................................................................ 12
II.2. ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES ............................................................................ 12
II.2.1. LA TEMPERATURE ........................................................................................................... 12
II.2.1.1. LE POTENTIEL D’HYDROGENE (PH) ............................................................................. 12
iii
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

II.2.1.2. LA CONDUCTIVITE ELECTRIQUE (CE)........................................................................... 12

II.2.1.3. LA DEMANDE CHIMIQUE EN OXYGENE (DCO) ............................................................. 12
II.2.1.4. TURBIDITE ................................................................................................................... 13
II.3. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES ........................................................................... 13
II.3.1. ISOLEMENT ..................................................................................................................... 13
II.3.1.1. PREPARATION DE L’INOCULUM .................................................................................... 13
II.3.1.2. ENSEMENCEMENT DES INOCULUMS ET INCUBATION .................................................... 13
II.3.2. DENOMBREMENT ............................................................................................................ 14
II.3.3. PURIFICATION DES ISOLATS ................................................................................. 14
II.3.3.1. CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES ISOLATS ......................................................... 14
II.3.3.2. CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE DES ISOLATS ..................................................... 14
II.[Link]. ASPECTS MACROSCOPIQUES DES ISOLATS ................................................................. 14
II.[Link]. ASPECTS MICROSCOPIQUES DES ISOLATS .................................................................. 15
II.[Link]. TEST DE SPORULATION.............................................................................................. 15
II.3.4. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ................................................................................... 15
II.3.4.1. TEST DE KOH (TEST DE LA POTASSE) .......................................................................... 15
II.3.4.2. TEST DE CATALASE...................................................................................................... 15
II.4. PRODUCTION ENZYMATIQUE CASEINOLYTIQUE ............................................... 16
II.4.1. MISE EN EVIDENCE DE LA PRODUCTION D’ENZYME PROTEOLYTIQUE (BOITE A CASEINE) 16
II.4.1.1. PREPARATION DU GEL D’AGAROSE A 1 % AVEC LE LAIT ECREME ................................. 16
II.5. MISE EN EVIDENCE DE LA PRODUCTION DE BIOSURFACTANTS ................... 16
II.5.1. TEST D'EMULSIFICATION ................................................................................................. 16
II.5.2. EXTRACTION DES BIOSURFACTANTS .............................................................................. 17
II.5.3. ACTIVITES ANTIMICROBIENNES ...................................................................................... 17
PREPARATION DE LA CULTURE DU PATHOGENE A TESTER .................................................... 17
II.5.4. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DES BIOSURFACTANTS ................................................ 17
II.5.5. TEST DISPERSION D’HUILE .............................................................................................. 18
II.6. TEST DE TOLERANCE ET DEGRADATION AUX METAUX LOURDS ................. 18
PREPARATION DE LA CULTURE DES ISOLATS A TESTER ......................................................... 18
II.7. TEST DE DEGRADATION ET DE TOLERANCE DES HYDROCARBURES .......... 18
II.8. ETUDE DES INTERACTIONS MICROBIENNES ....................................................... 19
II.8.1. CO-CULTURE DES BACTERIES .......................................................................................... 19
CHAPITRE III ......................................................................................................................... 12

iv
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III. RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................................................... 20

III.1. RESULTATS DES ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES .......................................... 20
III.1.1. LE POTENTIEL D’HYDROGENE ....................................................................................... 20
III.1.2. LA TEMPERATURE.......................................................................................................... 20
III.1.3. LA CONDUCTIVITE ELECTRIQUE ..................................................................................... 21
III.1.4. LA TURBIDITE ................................................................................................................ 22
III.1.5. DEMANDE CHIMIQUE EN OXYGENE ............................................................................... 22
III.2. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES ........................................................................... 23
III.2.1. ISOLEMENT .................................................................................................................... 23
II.2.2. DENOMBREMENT ............................................................................................................ 24
III.2.1.1. PURIFICATION ............................................................................................................. 25
III.2.1.2. CARACTERISATION DES ISOLATS ................................................................................ 25
III.3. MISE EN EVIDENCE DE LA PRODUCTION D’ENZYME PROTEOLYTIQUE PAR
LES ISOLATS ......................................................................................................................... 26
III.4. MISE EN EVIDENCE DE LA PRODUCTION DE BIOSURFACTANTS .................. 27
III.4.1. TEST D'EMULSIFICATION ................................................................................................ 27
III.4.2. EXTRACTION DES BIOSURFACTANTS .............................................................................. 28
III.4.3. ACTIVITES ANTIBACTERIENNES DES BIOSURFACTANTS.................................................. 29
III.4.4. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DES BIOSURFACTANTS .............................................. 31
III.4.5. TEST DE DISPERSION D’HUILE ........................................................................................ 31
III.5. TOLERANCE AUX METAUX LOURDS .................................................................... 33
III.6. TOLERANCE AUX HYDROCARBURES ................................................................... 35
III.7.1. ETUDE DES INTERACTIONS BACTERIENNES ................................................... 37
III.8. DISCUSION .................................................................................................................... 41
III.9. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................ 45
ANNEXES ............................................................................................................................... 11

v
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Les applications des bactéries du genre Bacillus dans différents domaines ............... 8
Figure 2: Variation du pH moyen des eaux usées des différents points de prélèvement ......... 20
Figure 3: la température moyenne des eaux usées des différents points de prélèvement ........ 21
Figure 4: la conductivité électrique moyenne des eaux usées des différents points de
prélèvement .............................................................................................................................. 21
Figure 5: Variation de la turbidité moyenne des eaux usées des différents points de prélèvement
.................................................................................................................................................. 22
Figure 6: Variation spatiotemporelle de la demande Chimique en oxygène (DCO) en fonction
des points de prélèvement ........................................................................................................ 23
Figure 8: aspect macroscopique des colonies sur milieu Mossel ............................................. 23
Figure 7: Dénombrement bactériens ........................................................................................ 24
Figure 9: aspect macroscopique d’un isolat de Bacillus sp. sur Mossel .................................. 25
Figure 10: Résumé des caractéristiques phénotypiques des isolats de Bacillus sp. ................. 26
Figure 11: comportement des différents isolats dans la dégradation de la caséine .................. 26
Figure 12: Diamètres d’halo d’hydrolyse de l’activité protéolytique des isolats testés ........... 27
Figure 13: profil d’émulsification de quelques isolats de Bacillus sp. avec l’essence ............. 28
Figure 14: Index d’émulsification des isolats de Bacillus sp. en fonction de la densité optique
.................................................................................................................................................. 28
Figure 15: Profil de l’extrait du biosurfactant .......................................................................... 29
Figure 16: Pouvoir inhibiteur des pathogènes par des extraits de biosurfactants. ................... 30
Figure 17: Diamètres des zones d’inhibition des pathogènes par des biosurfactants extraits à
partir de la culture des isolats de Bacillus sp. Extraits à partir de la culture ............................ 30
Figure 18: caractérisation des biosurfactants de type glycolipide ............................................ 31
Figure 19: Dispersion d'huile du biosurfactant produit par les isolats de Bacillus. ................. 32
Figure 20: diamètres de dispersion d’huile : ............................................................................ 32
Figure 21: Activité des métaux lourds sur les isolats de Bacillus. ........................................... 33
Figure 22: comportement des différents isolats en présence des métaux lourds. .................... 35
Figure 23: Capacité des différents isolats dans la dégradation et la tolérance des hydrocarbures
.................................................................................................................................................. 36
Figure 24: co-culture bactériennes. .......................................................................................... 39
Figure 25: interactions bactériennes. ........................................................................................ 40

vi
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I: liste des abréviations, sigles, acronymes et symboles ............................................ viii
Tableau II: Classification des bactéries du genre Bacillus selon [31] ........................................ 7
Tableau III: caractérisation biochimique des biosurfactants .................................................... 31
Tableau IV: Profil de tolérance aux 4 hydrocarbures (gasoil, essence, huile SAE 90) et la
vaseline des isolats des bactéries du genre Bacillus ................................................................. 36
Tableau V: Caractéristiques macroscopiques et microscopiques des isolats de Bacillus ........ IX
Tableau VI: Composition des milieux de culture...................................................................... X
Tableau VII: Dénombrement en UFC/mL ..............................................................................XII

vii
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

LISTE DES ABREVIATIONS

Tableau I: liste des abréviations, sigles, acronymes et symboles
% Pourcent
°C Degré Celsius
µL Microlitre
ADN Acide Désoxyribonucléique
B. Bacillus
G+C Couple guanine et cytosine
mL Millilitre
mm Millimètre
M Marqueur de Poids Moléculaire
PBS Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate salin, en français)
pH Potentiel d’hydrogène
rpm rounds per minute (tours par minute, en français)
BA Bassin Affluent
sp. Specie. Fait référence à une espèce non précisée
CEA Canal effluent anaérobique
CE Conductivité électrique
HCL Acide chlorhydrique
mM Mili molaire
NaCL Chlorure de sodium
KCL Chlorure de potassium
NTU unités néphélométriques de turbidité
mg Milligramme
BS- Biosurfactant

viii
INTRODUCTION
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

1. Contexte et justification
La contamination des sols et des eaux par les hydrocarbures ainsi que par les eaux usées
industrielles est l'une des principales causes des problèmes environnementaux dans le monde
entier ; en raison de leur large distribution, de leur persistance, de leur composition complexe
et de leur toxicité [1].
Selon l'OMS en 2004, 80 % des maladies qui affectent la population de la planète sont liées à
la pollution des eaux. Aujourd’hui, de nombreuses maladies qui affectent la population de la
planète sont liées en partie à l’insuffisance de l’évacuation des eaux usées domestiques et
industrielles. Ces eaux usées constituant en l'absence d'un traitement efficace et rentable pour
l’environnement un danger croissant pour la santé humaine et le milieu naturel à cause de leurs
charges en matières chimiques toxiques et de microorganismes pathogènes [2]. La République
du Congo est un pays producteur, exploiteur de pétrole et membre de l’organisation des pays
exportateurs de pétrole dans le monde [1]. Certaines industries brassicoles en République du
Congo, le cas de la Brasserie De Brazzaville (BRASCO), dispose d’un garage de réparation
automobile et d’une station de vidange au sein à côté de la station de traitement des eaux. Le
constat est tel que les déchets (hydrocarbures et métaux lourds) générés par ces opérations de
vidange et de graissage sont délibérément ou accidentellement déversés dans l’environnement.
Les déversements sont responsables de l’altération des milieux aquatique et tellurique [3].
La contamination des sols et des eaux par les hydrocarbures ainsi que par les eaux usées
industrielles est l'une des principales causes des problèmes environnementaux dans le monde
entier.
Vu leur faible dégradabilité, leur nature cancérigène et leur durée de vie très longue, il est
impératif de trouver des solutions palliatives. Rechercher des microorganismes possédant des
aptitudes à dégrader ces hydrocarbures pour la bioremédiation des sols et des eaux, est une
perspective inclusive qui s’inscrit dans le cadre de notre projet d’étude.

2. Problématique
Les déchets, issues des activités industrielles de la Brasserie du Congo, subissent des
traitements peu adéquats. De même, ces polluants sont parfois occasionnellement ou
accidentellement déversés dans l’environnement et ceux-ci sont responsable de l’altération des
écosystèmes des milieux aquatique et tellurique [1].
Pour la protection de l’environnement et dans le contexte de l’intégration de la République du
Congo aux organismes internationaux, il est impératif d’aligner notre pays sur les exigences de

1
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

la politique de protection de l’environnement et aux exigences de traitement biologique des

eaux usées produites par les industries brassicoles.
En République du Congo, les approches de biorémédiation sont encore en étude, comme en
témoigne le travail très récemment publié par ELENGA et al en 2021. Ce travail met en lumière
l’application de la biorémédiation dans la dépollution des sols pollués par les hydrocarbures.
C’est dans cet optique que nous nous sommes proposés de contribuer à l’évaluation du potentiel
biorémédiateur des bactéries du genre Bacillus isolées des eaux usées de la brasserie de
Brazzaville (Brasco).

1. Objectifs
Pour répondre à cette problématique, nous nous sommes fixés les objectifs suivants :

1.1. Objectif général

L’objectif général de ce travail est d’évaluer la capacité des Bacillus des eaux usées à dépolluer
l’environnement.

1.2. Objectifs spécifiques

Il s’agit de manière spécifique de :

 doser les paramètres physico-chimiques des eaux usées ;

 rechercher les isolats des eaux usées par les techniques classiques de microbiologie ;
 tester le potentiel Biorémédiateur des isolats caractérisés.

1.3. Hypothèses

 Les paramètres physico-chimiques des eaux usées de la brasserie sont dosés ;

 Les bactéries des eaux usées sont caractérisées par les techniques classiques de
microbiologie ;
 Les bactéries du genre Bacillus isolées des eaux usées sont pourvues des aptitudes
à être utilisé en biorémédiation.

Cette étude sera structurée en quatre parties. La première partie traite l’ensemble de
connaissances sur la thématique abordée. La deuxième partie décris le matériel ainsi les
approches expérimentales utilisée dans cette étude. La troisième partie décris les résultats
obtenus dans cette étude ainsi que la discussion ; Enfin, la quatrième partie présente le bilan de
cette étude ainsi que les différentes perspectives.

2
 Chapitre I
Revue bibliographique
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

I.1. Les polluants d’origine industriels

Avec la croissance démographique, les besoins économiques, d’énergie ainsi que

d’alimentation n’ont pas cessé de croitre depuis le début du 17 e siècle. Cela a été à l’origine de
la révolution des industries qui à contribuer à l’amélioration des conditions de vie de l’homme.
A ce jour, on distingue plusieurs sortes d’industries ; allant de la production et la transformation
des aliments, la recherche et la production d’énergie, etc [4]. Grâce à cela, certains problèmes
au quotidien de l’homme ont été résolus. Cependant, ces industries produisent dans la même
occasion des tonnes de déchets nuisant à l’environnement ainsi qu’au bien-être de l’homme [5].
Parmi les polluants nocifs à l’environnement, on peut énumérer :
 les déchets provenant des installations pétrolières et stations de vidange ;
 les eaux usées provenant des industries brassicoles et de production d’aliment.

I.1.1. Les eaux usées industrielles

L’eau est une ressource vitale qui répond aux multiples besoins de l’humanité. Elle est utilisée
pour satisfaire les besoins quotidiens de l’homme (consommation, hygiène, la cuisson des
aliments). De nombreux secteurs industriels utilisent l’eau dans la production et la
transformation alimentaire, la production d’électricité [6].
Cependant, si elle est contaminée par une variété de polluants comme des effluents industriels,
les déchets dérivés de pétrole, elle devient un agent vecteur susceptibles d’altérer les conditions
environnementales et de vie humaines [7].
Les effluents industriels contiennent des polluants inorganiques et organiques dangereux qui
causent une grave pollution des cours d'eau récepteurs ainsi que de l'environnement du sol
adjacent qui affecte l'ensemble des organismes vivants. Lorsqu'ils sont disposés dans le sol, ils
réduisent l'alcalinité du sol et augmentent la concentration de métaux lourds, comme le fer, le
cuivre, le mercure, l'argent, le nickel et le cadmium et autres métaux trace. Ceci est très
récalcitrant dans l'environnement et toxique pour de nombreux micro-organismes
environnemental [8].
L'introduction d'eaux usées, riches en matière organique et en nutriments essentiels, entraîne
des modifications de la microflore des eaux naturelle et cause parfois une eutrophisation même
si le milieu récepteur à un débit très élevé [9].
Les micro-organismes jouent un rôle majeur dans le cycle biogéochimique des métaux lourds
toxiques et également dans le nettoyage ou l'assainissement des environnements contaminés
par les métaux et d’autres polluants. Ils ont acquis une variété de mécanismes d'adaptation en

3
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

présence de ces polluants toxiques dans les eaux et les sols [10]. Les microorganismes présents
dans les eaux usées présentent des propriétés communautaires qui suggèrent que les eaux usées
constituent un nouvel écosystème. Ils présentent à la fois une opportunité en tant que point de
contrôle pour le traitement des eaux usées et un risque pour la santé humaine [11].
Les différents produits commerciaux comme le diesel, l'essence, l'hexane, le pétrole et les
molécules de type benzène peuvent être à l'origine de la pollution des sols [12]. Le rejet de ces
contaminants et leurs sous-produits dans l'environnement est l'une des principales causes de la
pollution mondiale. Les principales sources sont les éruptions volcaniques, les réservoirs de
stockage souterrains qui fuient, les services des stations-service, les déchets des industries
chimiques et pétrochimiques, les gaz d'échappement des véhicules ainsi que les garages, etc.
[13]. L'un des problèmes les plus graves en République du Congo résultant des activités des
garages est la mauvaise gestion des déchets pétroliers. Ces garages génèrent un million de
tonnes d'huile de moteur usagée, qui est ensuite rejetée négligemment dans l'environnement et
le transport maritime de ces déchets pétroliers cause un déséquilibre hydrique [13].

I.1.3. Impact des eaux usées

L'un des problèmes les plus critiques des pays en développement est la mauvaise gestion d'une
grande quantité de déchets générés par diverses activités anthropiques. Plus difficile est le
dangereux rejet de ces déchets dans le milieu ambiant. Les plans d'eau, en particulier les
réservoirs d'eau douce, sont les plus touchés. Cela a souvent rendu ces ressources naturelles
impropres à la fois à un usage primaire et/ou secondaire [9]. De nombreuses maladies qui
affectent la population de la planète sont liées en partie à l'insuffisance de l'évacuation des eaux
usées domestiques et industrielles. Ces dernières sont devenues de plus en plus énormes devant
le développement industriel, l'essor économique, l'expansion démographique et la grande
densité des zones urbaines. Ces eaux usées constituant en l'absence d'un traitement un danger
croissant pour la santé humaine et le milieu naturel à cause de leurs charges en matières
chimiques toxiques et de micro-organismes pathogènes (bactéries, virus, parasites…). Elles
constituent donc des menaces permanentes pour la santé aussi bien humaine qu'animale. Selon
l'OMS, 80 % des maladies qui affectent la population de la planète sont liées à la pollution des
eaux [14].
En raison des impacts dangereux des eaux usées industrielles sur l'eau, le sol, l'air et les produits
agricoles, le traitement des eaux usées et l'élimination appropriée des boues produites sont
indispensables du point de vue de la sécurité environnementale [15]. L'impact physico-
chimique sur la qualité de l'eau des cours d'eau se traduit par une conductivité élevée, par la
4
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

pollution des masses d'eau par les nitrates, les nitrites et le phosphore réactif soluble, par
l'apparition de tanin et de lignine, et par l'accumulation constante de matières inorganiques et
organiques en suspension dans le fleuve. Les rejets industriels dans les cours d'eau sont l'une
des causes de dégradation irréversible des systèmes d'eau de surface. En raison de leur rôle dans
l'évacuation des eaux usées industrielles, les cours d'eau font partie des masses d'eau les plus
vulnérables à la pollution [16].

I.2. Méthodes de bioremédiation

La bioremédiation est une option qui offre la possibilité de détruire les contaminants ou de les
rendre inoffensifs en utilisant l'activité biologique naturelle [17]. Les méthodes de remédiations
chimiques et biologiques sont utilisés depuis des années pour réhabiliter les sols et les eaux
contaminés par ces polluants organiques et inorganiques [12]. Les méthodes physiques et
chimiques ne sont ni respectueuses de l'environnement ni rentables [13]. Cependant, ces
technologies sont coûteuses et peuvent conduire à un grave déséquilibre de l’écosystème
aquatique et tellurique et à une décomposition incomplète des contaminants. Parmi les
différentes technologies de dépollution des sols ou des eaux, la biorémédiation et/ou la
biorestauration est l’une des meilleures approches. Il s’agit d’une méthode écologique et se fait
principalement par l’intermédiaire des communautés bactériennes naturelles de la flore
tellurique ou de la flore aquatique et/ou des eaux usées. Certains micro-organismes,
principalement des bactéries, ont évolué pour métaboliser ces contaminants en les utilisant
comme sources de nutriment et/ou d’énergie [12]. La biorémédiation peut se faire en deux
grandes familles :
 les procédés « in-situ », réalisés dans le sol ou l’eau en état ;
 les procédés « ex-situ », nécessitant l’évacuation.
Ces différents procédés sont dépendants d’un facteur temps, sachant que les traitements in-situ
demandent un temps plus long que ceux réalisés ex-situ [18].
La biorémédiation se déroule généralement en condition d’aérobie, cependant l’application des
systèmes de biorémédiation en condition d’anaérobie permet la dégradation d’un certain
nombre de molécules récalcitrantes. Les principales technologies utilisées dans la
biorémédiation sont les suivants : la bioaugmentation ; la biofiltration ; la biostimulation ; le
compostage ; la biolixiviation [5].
Cette technique utilise plusieurs micro-organismes, en raison de leur pouvoir d’adaptation ; ces
micro-organismes sont utilisés pour éliminer les composés xénobiotiques. Parmi les bactéries

5
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

utilisées en biorémédiation, nous pouvons citer celles appartenant aux genres Pseudomonas,
Alcalinogène, Sphingomonas et mycobactérium [5].
Une étude récente a montré l’implication des bactéries du genre Bacillus dans les procédés de
biorémédiation des sols pollués par les hydrocarbures [13].
La production des biosurfactants est l'une des stratégies utilisées par ces bactéries pour
influencer les environnements auquel elles sont présentes et de participer à la dépollution [13].

I.3. Les bactéries du genres Bacillus

I.3.1. Généralité sur les Bactéries du genre Bacillus

Ce genre est composé de bactéries Gram positives à faible pourcentage en couple GC.
Ces espèces sont capables de croitre en aérobiose, en anaérobiose et sont quasiment mobiles
par ciliature péritriche [19, 20], exceptées B. anthracis et B. mycoïdes, espèces avérées
immobiles [21]. Néanmoins, toutes les bactéries de ce genre sont capables d’élaborer des
endospores [22] ; ovales, sphériques pouvant ou ne pas altérer la morphologie cellulaire [21].
Les spores des Bacillus occupent des positions soit terminale, subterminale ou encore centrale
et elles représentent pour ces bactéries une condition de résistance au stress environnemental
[22]. Le genre Bacillus est constitué des espèces bactériennes moins exigeantes et facilement
cultivables sur gélose ordinaire [19, 20]. Selon le type du milieu, sa composition et les
conditions de cultures, plusieurs morphologies sont observées au sein des espèces de ce genre
[19].

I.3.2. L’habitat

Les espèces de Bacillus sont omniprésentes dans la nature et sont isolées de milieux aquatiques
(eaux marine, eaux douces, eaux usées), telluriques (sols pollués …), des végétaux, des
animaux, ainsi que dans l'air [23, 24]. Grace à leur aptitude à former les endospores, elles sont
capables de coloniser des milieux de vie conditions extrêmes : aux températures élevées, aux
pH acides et basique, aux concentrations de sel élevées ainsi que le système immunitaire de
nombreux animaux [25]. Enfin, ce genre est aussi isolé des aliments fermentés locaux, surtout
alcalins [26, 27].

I.3.3. Le métabolisme

Les Bacillus sont un genre bactérien diversifié et caractérisé par des cellules se développant en
aérobiose et en anaérobiose [28]. Cet ainsi qu’au sein du même genre, subsistent des bactéries
chimio-organotrophes, psychrophiles, mésophiles, thermophiles, alcalophiles, neutrophiles et
6
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

même acidophiles, possédant en plus de l’oxygène comme accepteur final d’électrons ; de

l’arsenic ou du sélénium. Le genre Bacillus est constitué des espèces bactériennes moins
exigeantes et facilement cultivables sur gélose ordinaire. Selon le type du milieu, sa
composition et les conditions de cultures plusieurs morphologies sont observées au sein des
espèces de ce genre.

I.3.4. Taxonomie

Bien que les bactéries du genre Bacillus soient parmi les espèces microbiennes les plus
importantes et étudiées [29]. Le fait que ce genre soit hétérogène, très diversifié et que les
membres de ce genre soient étroitement proches constitue un obstacle pour leur identification,
ainsi que leur classification [30]. Cela est sans doute à l’origine des reconstructions
phylogéniques fréquentes observées au sein de ce genre. Car, de nombreuses espèces
initialement assignées au genre Bacillus ont été affiliées aux familles apparentes les plus
proches notamment : Alicyclobacillaceae, Paenibacillaceae, Planococcaceae,
Thermoactinomycetaceae, Pasteuriaceae et Sporolactobacillaceae [30]. De nos jours, les
approches moléculaires comme le séquençage de l’ARNr 16S ont complètement révolutionné
le domaine de la phylogénie classique en donnant essence à une ère nouvelle la de phylogénie
moléculaire [30]. C’est à la base du séquençage du gène de l’ARNr 16S que [31] classèrent les
espèces du genre Bacillus dans neuf groupes de bactéries distincts, comme le montre le tableau
II.

Tableau II: Classification des bactéries du genre Bacillus selon [31]

Groupes Quelques espèces
B .amyloliquefasciens, B. licheniformis, B.
I
mojavensis, B. pumilus, B. subtilis
II B. anthrancis,B. cereus, B. thuringiensis
III B. infermus, B. simplex
IV B. aeolus, B. methanolicus
V B. fastidious, B. indicus
VI B. clausii, B. halodurans
VII B. arsenicus, B. barbaricus
VIII B. clarkii, B. cellulolyticus
IX B. halophilus, B. thermocloacae

7
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

I.3.5. Intérêt Biotechnologique

Le genre Bacillus figure parmi les groupes microbiens les plus importants et sollicités dans le
secteur industriel [20]. Grace à leur habilité à croître rapidement sur divers milieux sans recours
nécessaire aux facteurs de croissance, à former des spores, à excréter divers enzymes, composés
bioactifs ainsi que des métabolites essentiels [22, 32, 33]. Les bactéries du genre Bacillus
constituent des sources intéressantes et prometteuses de biomolécules en industrie [34].
Les enzymes secrétés par Bacillus sont très connus et largement utilisés en industrie. A eux
seuls, ils occupent près de 50% du marché total d’enzymes [20]. Des souches comme de B.
subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus représentent les bactéries les plus
décrites et utilisées à l’industrie [35]. Elles sont très connues par leur aptitude à produire des
exoenzymes comme les protéases, amylases et cellulases. Ces derniers sont largement employés
dans les processus de fabrication et de transformation de produits industriels [20]. C’est ainsi
que les protéases alcalines produites par B. subtilis sont fortement utilisées dans les industries
de détergents ; de tanneries et textiles [34].
En industrie pharmaceutique les bactéries du genre Bacillus sont impliquées dans la synthèse
de β-lactamases, des antibiotiques, des peptides antimicrobiens comme les bactériocines [36]..
Dans l’agriculture, le genre Bacillus intervient en tant qu’agents de biocontrôle et antagonistes
des germes responsables des phytopathologies [37].
En biorémédiation, les bactéries du genre Bacillus et leur biosurfactant sont utilisées pour la
remédiation des sols contaminé par les hydrocarbures [12].

Biosurfactants

Biorémédiation
Bacillus Antibiotiques
(Sols et Eaux)

Cellulases
Amylases
Protéases

Figure 1. Les applications des bactéries du genre Bacillus dans différents domaines

8
 Chapitre II
Matériel et Méthodes
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

I.4. MATERIEL
I.4.1. Matériel Biologiques

Dans ce travail, le matériel biologique utilisé est constitué des échantillons d’eaux usées
provenant de la brasserie de Brazzaville (BRASCO).

I.4.2. Matériel de laboratoire

Ce paragraphe fait état des appareils, milieux de cultures et réactifs utilisés dans le cadre de ce
travail. Les appareils ci-dessous ont été utilisés pour doser les analyses physico-chimiques :

 Appareillage
 Etuve ; Spectrophotomètre ; Autoclave ; Micro-onde ; Bain marie ; Turbidimètre ;
Conductimètre ; Reactor block DBR 200 ; Etc.
 Milieux de cultures
 Mossel; Lysogeny Broth (LB); PCA; Sabouraud; Chapman; Cétrimide; CTAB;
Vaseline et BH.
 Préparation des milieux de cultures (Voir annexe 1 pages X et XI)
 Réactifs
 Eau distillée ; Solution de potasse ; peroxyde d’hydrogène ; hydrocarbures ; vaseline
et métaux lourds.

II. METHODES

II.1.1. Cadre, type et période d’étude

Ce présent travail, est une étude transversale durant une période comprise entre Juin 2022 et
Novembre 2022

Deux (2) laboratoires ont servi de cadre pour ces travaux de recherche

 Laboratoire de Biologie Moléculaire et Microbiologie Appliquée, IRSEN (Institut de

Recherche en Sciences Exactes et Naturelles), Brazzaville, pour les analyses
microbiologiques et biochimiques ;
 Le laboratoire de traitement des eaux de la brasserie de Brazzaville (BRASCO) en
République du Congo, pour les analyses physico-chimiques.

11
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

II.1.2. Échantillonnage
Des échantillons des eaux usées de la brasserie ont été recueillis auprès de deux points au sein
de la brasserie, Brazzaville ; (1) au niveau du bassin affluent nommé BA (eaux usées avant
traitement) et (2) au niveau du Canal effluent Anaérobique nommé CEA (eaux usées après
traitement). Il s'agissait de l’eau contaminés par des effluents de brasserie quittant les chaînes
d’embouteillages. Les échantillons ont été prélevés de manière aseptique à l'aide de bocaux en
verre stériles hermétiquement fermés. Ces échantillons ont été étiquetés et analysés séparément.
Les échantillons ont été collectés une fois la journée à un intervalle de temps d’une semaine
pour obtenir différents isolats bactériens.

II.2. ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES

La qualité physico-chimique de l’eau informe sur la localisation et l’évaluation d’un niveau de
pollution et la résistance de la biodiversité indigène aux polluants organiques et inorganiques,
en fonction d’un ensemble de paramètre, basée sur des valeurs de références, elle s’apprécie à
l’aide de plusieurs paramètres. Pour la détermination des paramètres physico-chimiques tels
que la conductibilité électrique ; le pH, la température, la turbidité, la demande chimique en
oxygène (DCO), les méthodes appropriées ont été utilisées.

II.2.1. La température

La détermination de la température a été réalisée à l’aide d’un thermomètre incorporé à pH-

mètre, étalonné avant chaque manipulation. On lit directement la température exprimée en
degré Celsius (°C).

II.2.1.1. Le potentiel d’Hydrogène (pH)

Le pH des échantillons a été déterminé à l'aide d'une méthode potentiométrique en utilisant un

pH-mètre.[38].

II.2.1.2. La conductivité électrique (CE)

La conductivité électrique a été déterminée à l’aide d’un conductimètre électrique qui permet
aussi de mesurer également les solides totaux dissous. Les résultats sont exprimés en µS/cm.

II.2.1.3. La demande chimique en oxygène (DCO)

La DCO est la quantité d’oxygène nécessaire pour oxyder toutes les matières organiques
existantes dans l’eau. Selon la norme ISO 15705, la DCO définit le volume d’oxygène
12
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

équivalent à la masse de dichromate de potassium réagissant avec les matières oxydables de

l’eau dans les conditions de la méthode. La DCO a été évaluée par la méthode photométrique
en utilisant un kit DCO LCK 514 N’Tube Hach Lange GMBH dans une gamme de 100 à 2.000
mg/L. Un volume de 1 mL d’échantillon à analyser et 1 mL d’eau distillée a été versé dans un
tube DCO et 2 mL d’eau distillée dans un tube témoin. Les tubes ont été chauffés pendant 2
heures à une température de 150 °C dans le thermostat DRB200. La valeur de la DCO a été
mesurée par le spectrophomètre DRB 3900.

II.2.1.4. Turbidité

La turbidité a été mesurée avec le photomètre HAZEMETER VOS 4000, équipé d’un capteur
de turbidité optique à quatre faisceaux de l’onde lumineuse et d’une cuve dans laquelle a été
ajouté l’échantillon d’eaux usées à analyser. Le capteur permet d’enregistrer la valeur de la
turbidité d’eaux usées analysées

II.3. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES

II.3.1. Isolement

II.3.1.1. Préparation de l’inoculum

Le principe de la dilution repose sur l’obtention d’une solution finale de concentration

inférieure à celle de départ. Les eaux usées comme échantillon utilisé sont diluées dans une
solution d’eau physiologique stérile repartie dans 8 tubes à essai contenant chacun 9mL.
Excepter la solution mère constituée des eaux usées, 1 mL d’eaux usées est dissoute dans le
tube contenant 10 mL d’eau physiologique. Apres homogénéisation à l’aide d’un vortex
(VELP Scientifica, advanced vortex mixer, Italy), 1 mL de la solution mère est prélevé à l’aide
d’une micropipette et transféré dans 9 mL de contenant du tube suivant permettant d’obtenir
la dilution 10-1. Ainsi de suite jusqu’à obtenir respectivement les dilutions 10-2 ,10-3, 10-4, 10-
5
, 10-6 et 10-7 correspondant à la dilution la moins concentrée. Les différents types de dilutions
constituent l’inoculum.

II.3.1.2. Ensemencement des inoculums et incubation

Un volume de 100 µL de l’inoculum de chaque dilution a été aseptiquement prélevé avec une
micropipette puis déposé sur la surface du milieu gélosés Mossel contenu dans les boîtes de

13
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Pétri. À l’aide d’un étaloir, l’inoculum a été étalé sur la gélose. La boîte ainsi ensemencée a
été incubée dans une étuve (Mermmet, Germany) à 37 °C pendant 24 h ou 48 h en aérobiose.

II.3.2. Dénombrement

La technique consiste à déterminer la concentration en bactéries contenues dans une préparation

initiale résultant des dilutions décimales en série. La méthodologie utilisée dans ce travail est
celle de l’énumération directe c’est-à-dire la mesure du nombre de bactéries en ne prenant en
compte que les cellules viables. Les boites de Pétri présentant d’innombrable colonies sous
forme d’amas suite à une forte concentration des bactéries dans l’échantillon utilisé sont
écartées.
Les colonies obtenues sont comptées en UFC/mL utilisant la formule suivante :
UFC/mL = N/ V x d
N : nombre de colonies, V : volume d’ensemencement utilisé, d : dilution considérée.

II.3.3. Purification des isolats

Après 24 h d’incubation, les boîtes montrant les colonies isolées ont été choisies pour la
poursuite de l’étude. Seuls les isolats de couleurs jaunes ont été retenus pour la purification.
Les isolats ont été repiqués sur milieu Mossel en utilisant la technique de cadrant et incubées à
37 °C, pendant 24 h en aérobiose. Les colonies ont été repiquées 3 fois jusqu’à obtention des
colonies identiques.

II.3.3.1. Caractérisation phénotypique des isolats

La caractérisation phénotypique des isolats a été réalisée sur la base des caractéristiques
morphologiques (morphologie des colonies, morphologie cellulaire) et biochimiques (type de
Gram et production de la catalase) de ces derniers. A l’issue de la caractérisation, les isolats
purs obtenus et orientés vers le genre Bacillus sp. ont été conditionnés dans des tubes à
Eppendorf contenant du LB additionné de 50 % de Glycérol (v/v), puis ont été stockés à 4 oc
pour la poursuite de l’étude.

II.3.3.2. Caractérisation morphologique des isolats

II.[Link]. Aspects macroscopiques des isolats

Ce test consiste en l’observation directe à l’œil nu de l’aspect morphologique des colonies

obtenues sur le milieu de purification basé sur la forme, la taille, la pigmentation, la consistance

14
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

et le contour des colonies préalablement incubées pendant 24 h à 37 °C sur les milieux gélosé
Mossel, PCA.

II.[Link]. Aspects microscopiques des isolats

La détermination de la morphologie, l’arrangement cellulaire ainsi que la mobilité des isolats

sont appréciés après le dépôt d’une colonie sur une lame contenant une solution de l’eau
physiologique. Ensuite une lamelle est déposée sur la suspension liquide puis le tout est
visualisé au microscope optique (OPTIKA, Italie) à l’objectif 40 (G×400).

II.[Link]. Test de sporulation

Le test de sporulation est un test effectué dans le but de montrer la capacité qu’ont les bactéries
du genre Bacillus à former des spores. En effet, la culture liquide de 24 h de chaque isolat
purifié a été soumise à un choc thermique à 90 °C pendant 15 min dans un bain marie puis
étalée sur un milieu gélosé Mossel. Ensuite, les boîtes ont été placées à l’étuve à 37 °C pendant
24 h en aérobiose. L’isolat est déclaré sporogène après croissance et non sporogène dans le cas
contraire.

II.3.4. Caractérisation Biochimique

II.3.4.1. Test de KOH (test de la potasse)

Un test effectué pour déterminer l’appartenance d’une bactérie au Gram positif ou négatif, ce
test consiste en l’émulsion d’une colonie avec le réactif de KOH. Une goutte de solution
aqueuse de KOH à 3 % est placée sur une lame stérile. Lorsque la suspension présente un
caractère visqueux et filant la bactérie est qualifiée de Gram négatif (KOH positif) sur
l’hypothèse que la paroi des bactéries Gram négatif soit constituée de deux membranes avec
une couche pauvre en peptidoglycane donc sensible à l’action du KOH.
L’absence du caractère visqueux et filant montre que l’isolat correspond à une bactérie à Gram
positif (KOH négatif).

II.3.4.2. Test de Catalase

La catalase est une enzyme Ferro protéique dégradant le Peroxyde d’Hydrogène en Oxygène et
en Eau selon la réaction :
2H2O2 2H2O + O2

15
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Une fraction de la colonie à tester est mélangée dans une goutte d’eau oxygénée préalablement
déposée sur une lame propre. La présence de l’enzyme se traduit par un dégagement immédiat
des bulles gazeuses.

II.4. Production enzymatique caséinolytique

II.4.1. Mise en évidence de la production d’enzyme protéolytique (boite à caséine)

Plusieurs isolats de Bacillus libèrent dans le milieu extracellulaire des enzymes protéolytiques
qui peuvent aussi dégrader la caséine. Le milieu gélosé composé du gel d’agarose à 1 %, le
PBS et le lait écrémé permet de mettre en évidence la production d’enzymes caséinolytiques.
Cette production est détectée par la formation d’une tâche claire autour du puits contenant le
surnageant de l’isolat à tester montrant la dégradation de la caséine.

II.4.1.1. Préparation du gel d’agarose à 1 % avec le lait écrémé

1 g de poudre d’agarose a été pesé et mélangé avec 100 mL de PBS. Le mélange a été chauffé
au four à microonde (Haas, HMW20W) pendant 3 min jusqu’à dissolution complète de
l’agarose, puis refroidi au bain marie (CLIFTON, Italie) à 40 °C. Ensuite 10 mL de lait écrémé
ont été ajoutés dans le mélange. Après homogénéisation le mélange a été coulé dans les boîtes
de Pétri. Une fois solidifié, des puits ont été prudemment générés à l’aide d’un embout stérile
tout en évitant la perforation du fond du gel. La manipulation s’est déroulée dans les conditions
aseptiques pour éviter toute contamination.

II.5. Mise en évidence de la production de biosurfactants

II.5.1. Test d'émulsification

L'activité émulsifiante du biosurfactant produit par les isolats des bactéries du genre Bacillus a
été déterminée par la mesure de l'indice d'émulsion (E24). Le bouillon acellulaire a été mélangé
avec de l’essence à volume égal, respectivement, puis vortexé pendant 5 min [39].
L'échantillon a été laissé au repos pendant 24 h à température ambiante. Comme le montre
l'équation. L’indice d'émulsification (E24) a été calculé en divisant la hauteur de la couche
d'émulsion (He) par la hauteur totale de la colonne de liquide (Ht). De même, toutes les mesures
de cette partie ont été manipulées en triple à température ambiante et les résultats ont été
calculés en pourcentage.
𝑯𝒆
(E24)%= 𝑯𝒕 × 100

16
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Les isolats ayant un fort pourcentage d’émulsification ≥ 50 % ont fait l’objet d’une extraction
des biosurfactants et la suite de cette étude.
(E24) % = Index d’émulsification après 24 h ; He = Hauteur de l’émulsification ; Ht = Hauteur
totale

II.5.2. Extraction des biosurfactants

Les échantillons de culture de 72 h à 160 trs/min ont été centrifugés à 11 000 tr/min pendant 15
min pour éliminer les cellules bactériennes. Le surnageant a été additionné de HCl 6 M pour
atteindre un pH de 2,0. Une précipitation du surfactant a été formée par sédimentation pendant
une nuit à 4 °C. Le précipité a été recueilli par centrifugation à 11 000 tr/min pendant 15 min à
45 °C pour obtenir le surfactant brut. Le surfactant brut a été dissout dans du PBS 1X à
température ambiante et extrait à température ambiante et conservé à 4 °C [1].

II.5.3. Activités antimicrobiennes

Le pouvoir antibactérien des biosurfactants extraits a été recherché sur quatre (04) bactéries
pathogènes se trouvant dans des eaux usées des brasseries du Congo à savoir : Escherichia coli,
Bacillus Cereus, Staphylococcus sp., Pseudomonas sp.

 Préparation de la culture du pathogène à tester

100 µL de chaque pathogènes ont été ensemencés sur le milieu PCA et incubés pendant 24 h à
37 oC. Une colonie distincte a été ensuite transférée dans 4 mL d’eau physiologique stérile et
chaque suspension bactérienne a été fixée à une concentration cellulaire de 108 UFC/mL en
utilisant l’échelle de Mac Farland (0,5). De cela, 100 µL de la suspension bactérienne du
pathogène à tester ont été ensemencés par écouvillonnage sur le milieu MH, puis les boites ont
été séchées pendant 30 min sur paillasse à température ambiante. 75 µL de l’extrait de chaque
biosurfactant ont été ensuite déposés dans des puits et les boîtes ont été laissées sur paillasse
pendant 30 min. Enfin, les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24h. Le pouvoir d’inhibition
du biosurfactant est révélé par un halo clair autour de la zone du dépôt. Chaque test a été réalisé
en triplicate et le diamètre de chaque halo a été mesuré [1].

II.5.4. Caractérisation biochimique des biosurfactants

Le méthylène-bromure de Cétyltriméthyl ammonium est un biosurfactant (tensioactif)

chimique capable d’interagir avec des tensioactifs anioniques en formant un halo clair au tour
du point de dépôt du tensioactif. La méthode sur gélose au bleu de méthylène-bromure de

17
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Cétyltriméthyl ammonium (CTAB) est un test utilisé pour le dépistage de la production de

glycolipides par les bactéries. Pour ce faire, 75 µL de l’extrait de chaque biosurfactant ont été
transférés dans les puits (6 mm) de gélose. Les boîtes ont été ensuite incubées à 37 oC pendant
24 h. La formation d'un halo bleu autour du puits confirme la présence de glycolipides produit
par la bactérie [40].
La composition du milieu sélectif CTAB-gélose bleu de méthylène était (g/L) : glucose 20,
peptone 10, poudre de bœuf 1, CTAB 5, bleu de méthylène 0,02, extrait de levure 0,5, Agar 17,
pH 7,2 dans 1 000 mL d'eau distillée.

II.5.5. Test dispersion d’huile

La capacité des tensioactifs biologique à déplacer les huiles (pétrole brute) est mis à profit dans
les industries de bioremédiation, dans le but de remédier aux problèmes des marées noires.
Pour ce faire, 50 ml d'eau distillée ont été ajoutée dans une boîte de Pétri de diamètre 15 cm.
Ensuite, 20 µL d'huile (moteur, l’essence et le gasoil) ont été déposé au centre de chaque boîte,
une fois le film d’huile stable formé, 10 µL du biosurfactant ont été déposés au centre du film.
Les boîtes de Pétri ont été étroitement observées à l’œil nu pour observer une zone de
déplacement d’huile. Ensuite, le diamètre de l’épandage d’huile a été mesuré [41].

II.6. Test de tolérance et dégradation aux métaux lourds

L’aptitude des isolats à tolérer les métaux lourds a été réalisé en utilisant : le Cuivre, l’Argent,
le Plomb, le Nickel, le Cobalt, le Zinc et le Mercure à différente concentrations (10 mM, 20
mM et 50 mM) [42].

 Préparation de la culture des isolats à tester

La culture des bactéries a testé a été ensemencée sur la gélose MH. Ensuite les puits de 6 mm
ont été générés dans chaque boîtes. Enfin, 75 µL de chaque métal ont été transférés dans chaque
puits et les boîtes ont été incubées à 37 ° C pendant 24 h. La résistance des bactéries aux métaux
lourds est révélée par l’absence d’un halo clair autour du puit par contre la présence d’un halo
autour du puit révèle que la bactérie ne tolère pas le métal (sensible).

II.7. Test de dégradation et de tolérance des hydrocarbures

Dans le but de tester la capacité des isolats de Bacillus à dégrader les hydrocarbures, ces derniers
ont été cultivés sur un milieu minéral contenant 2 % d’hydrocarbures comme étant la seule
source de carbone. Les hydrocarbures suivants ont été utilisés (Essence, Gasoil et Huile moteur
18
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

SAE 40). La composition du milieu en (g/L) : NaCL : 10, KCL : 0,2, MgSO4 7H2O : 0,42,
KH2PO4 : 0,83, NH4SO4 : 0,42, K2HPO4 : 1,25, Agar : 20 dans 1000 mL et Hydrocarbures : 2
%.
Dans chaque boîte de Pétri, la culture bactérienne de l’isolat a testé est étalé sur la surface de la
gélose par la méthode de strie serré. Les boîtes de culture ainsi ensemencées sont incubées à 37
°C pendant 48 h [1] .
La capacité de l’isolat à dégrader l’hydrocarbures est révélée par la présence de colonies
bactérienne sur la gélose, par contre l’absence de ces dernières montres que l’isolat ne tolère
pas l’hydrocarbure. Concernant la gelée de pétrole. Pour évaluer la capacité des bactéries à
dégrader la gelée de pétrole, les isolats ont été ensemencés sur gélose contenant : 2 g d’agar et
1 g de Vaseline.
Les cultures bactériennes à tester ont été ensemencées sur la surface de la gélose à vaseline
préalablement coulée sur boîte avec la méthode des stries serrés, puis incubé à 37 °C pendant
24 h. Le test est positif, lorsque l’isolat est capable de croître sur la gélose.

II.8. Etude des interactions microbiennes

Dans le but d’étudier les interactions entre les bactéries du genre Bacillus, Staphylococcus sp
et Pseudomonas sp, une culture mixte a été réalisée.

II.8.1. Co-culture des bactéries

Cette technique consiste à cultiver simultanément deux micro-organismes dans un même milieu
afin de comprendre la nature de leur interaction. Pour ce faire, 100 µL de la culture
exponentielle de chaque isolat testé ont été co-inoculés dans le bouillon (LB) et incubé pendant
72 h à une température de 37 °C. Les dénombrements ont été réalisés après chaque 24 h, sur les
milieux respectifs et la charge bactérienne de chaque isolat a été évaluée en UFC/mL [43].

19
 Chapitre III
Résultats et Discussion
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III. RESULTATS ET DISCUSSION

III.1. Résultats des analyses physico-chimiques

III.1.1. Le potentiel d’Hydrogène

Les échantillons des eaux usées prélevés dans le Bassin affluent (BA, eaux usées) présentent
la valeur moyenne du pH la plus élevée de l’ordre de 11,29 que ceux des échantillons des eaux
usées prélevés dans le Bassin d’effluent, canal effluent anaérobique (CEA, sortie) de l’ordre
de 6,54 (figure 3).
P o te n tie l d 'h y d r o g è n e (p H )

14
**
12

10

0
A A
B E
C

Figure 2: Variation du pH moyen des eaux usées des différents points de prélèvement
BA : Echantillon provenant du bassin Affluent (Eaux usées)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

III.1.2. La température

Les valeurs des températures des différents échantillons des eaux usées variaient entre 30 °C
pour le Bassin d’affluent et 30 °C pour le canal d’effluent anaérobique. Les résultats sont
présentés dans la figure 4.

20
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

40
ns

T e m p é r a tu r e (° C )
30

20

10

0
A A
B E
C

Figure 3: la température moyenne des eaux usées des différents points de prélèvement
BA : Echantillon provenant du bassin Affluent (Eaux usées)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

III.1.3. La conductivité électrique

La figure 5 montre la variation de conductivité électrique des eaux usées de la brasserie. La

mesure de la conductivité constitue une bonne appréciation du degré de minéralisation d’une
eau où chaque ion agit par sa concentration et sa conductivité spécifique. La valeur moyenne
de la conductivité électrique fluctue entre 1,95 μs/cm au niveau du bassin d’affluent (BA,
entrée) et de 1,31 μs/cm au niveau du canal effluent anaérobique (CEA).
C o n d u c tiv ité é le c triq u e (µ s /c m )

ns

3 .0

1 .5

0 .0
A
A

E
B

Figure 4: la conductivité électrique moyenne des eaux usées des différents points de
prélèvement
BA : Echantillon provenant du bassin Affluent (Eaux usées)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)
21
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.1.4. La turbidité

La valeur de la turbidité du Bassin d’affluent (BA, entrée) était de 13 NTU alors que celui du
canal anaérobique était de 12,44 NTU, comme le montre la figure 6.

15 ns

12
T u r b id ité (N T U )

0
A A
B E
C

Figure 5: Variation de la turbidité moyenne des eaux usées des différents points de
prélèvement
BA : Echantillon provenant du bassin Affluent (Eaux usées)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

III.1.5. Demande Chimique en Oxygène

La figure 7 montre la variation spatiotemporelle de la DCO en fonction des points de

prélèvement. Les moyennes des teneurs en DCO fluctuent entre 800 mg d’O2/L à la sortie canal
effluent anaérobique et 1750 mg d’O2/L à l’entrée bassin d’affluent pendant les trois (03)
campagnes de prélèvement. On observe la plus forte valeur en DCO pendant la deuxième
campagne de prélèvement au niveau du bassin d’affluent, suivi de la première dont les valeurs
sont de l’ordre de 600 à 2426 mg d’O2/L à la sortie canal effluent anaérobique.

22
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

ns
2400

2100

D C O (m g d 'o 2 /L )
1800

1500

1200

900

600

300

0
A A
B E
C

Figure 6: Variation spatiotemporelle de la demande Chimique en oxygène (DCO) en fonction

des points de prélèvement
BA : Echantillon provenant du bassin Affluent (Eaux usées)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

III.2. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES

III.2.1. Isolement

L’isolement sur milieu Mossel a permis d’observer divers profils de colonies, notamment des
colonies blanchâtres, rosâtres et jaunâtres après 24 h d’incubation à 37 °C.

Figure 7: aspect macroscopique des colonies sur milieu Mossel

23
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

II.2.2. Dénombrement

Dans cette étude, les dénombrements ont été réalisés sur cinq (5) milieux différents à savoir le
milieu Mossel, le milieu Chapman, le milieu PCA, le milieu Cétrimide ainsi que le milieu EMB.
La lecture des boîtes a été faite après 24 h et 48 h d’incubation à 37 °C.
Après 24 h, les résultats ont montré que les charges bactériennes variaient de 0,16.102 UFC/mL
à 3,44.102 UHC/mL. 1,82.104 UFC/mL Pour Bacillus sp., 1,01.106 UFC/mL pour la flore
mésophile aérobie totale, de 0,16.102 UFC/mL pour Pseudomonas sp., 3,44.102 UFC/mL pour
les Entérobactéries, ainsi 5,2.104 UFC/mL pour Staphylococcus sp.
Après 48 h d’incubation, les résultats ont montré que les charges bactériennes variaient de de
0,2.102 UFC/mL à 7,12.107 UHC/mL. 2,34.103 UFC/mL pour Bacillus sp., 7,12.107 UFC/mL
pour la flore mésophile aérobie totale, 0,2.102 UFC/mL pour Pseudomonas sp., 3,74.102
UFC/mL pour les entérobactéries, ainsi 5,76.103 UFC/mL pour Staphylococcus sp. Les
UFC/mL calculées ont été consignées dans la figure 7.

Figure 8: Dénombrement bactériens

Axe des valeurs x représente les Unités formant colonies (UFC)
Axe des valeurs y représente la croissance bactérienne en fonction du temps

24
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.2.1.1. Purification

A l’issue de l’isolement, 42 différentes colonies de Bacillus sp. ont été sélectionnées et purifiées
sur le milieu Mossel en vue d’une caractérisation par les techniques de microbiologie classique,
ainsi que des analyses ultérieures.

Figure 9: aspect macroscopique d’un isolat de Bacillus sp. sur Mossel

III.2.1.2. Caractérisation des isolats

Les isolats purifiés ont été caractérisés à base des critères morphologiques (macroscopie et
microscopie) et biochimiques.
Sur 42 isolats obtenus, tous soit 100 % ont été sporogènes, mobiles, à catalase positive, Gram
positifs et en forme de bâtonnet, pouvant être en paires ou en chaines et à une texture pouvant
être pâteuse, gluante et sèche. Les critères macroscopiques ont permis de distinguer 13 isolats
soient 30 % à contour arborissante, 22 isolats soient 52 % à contour ronde et 7 isolats soient
18% à contour ovale. La figure 9 illustre le profil des caractéristiques phénotypiques des isolats
des bactéries du genre Bacillus sp.

25
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

o v ale G ram +
arb o rissan te
C a r a c té r is a tio n

C atalase +
ro n d e
M o b ile
B ato n n e ts S p o re s
S p o re s
B ato n n ets
M o b ile
ro n d e
C atalase +
arb o rissa n te
G ram +

0 50 100 150

Figure 10: Résumé des caractéristiques phénotypiques des isolats de Bacillus sp.

III.3. Mise en évidence de la production d’enzyme protéolytique par les isolats

Dans le but de montrer la production des enzymes caséinolytiques par les bactéries, le test de
mise évidence a été réalité avec le lait écrémé. Sur 42 isolats isolés testé, soient 38 isolats
(90,47 %) ont montré une activité protéolytique positive et 4 isolats soient 9,53 % négatif. Une
hydrolyse réalisée après 24 h d’incubation à 37 °C s’est traduite par la formation d’un halo clair
au lieu de dépôt du surnageant. Les diamètres d’halo de lyse variaient entre 2,9 à 5,1 cm (figure
11). Les isolats : CEA11, CEA20, CEA21, CEA22, CEA23 et CEA25 ont montré une activité
majoritaire. La figure 11 illustre les résultats de l’hydrolyse.

A B
B CEA20

CEA11 CEA21 A

Figure 11: comportement des différents isolats dans la dégradation de la caséine

A : Absence d’halo montrant la non hydrolyse de la caséine ; B : Halo clair montrant
l’hydrolyse de la caséine par les bactéries (CEA11, CEA20 et CEA21)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

26
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG
CEA1
C- CEA2 CEA3
CEA42 5
CEA41 CEA4
CEA40 4,5 CEA5
CEA39 4 CEA6
CEA38 3,5 CEA7
3
CEA37 CEA8
2,5
CEA36 2 CEA9

CEA35 1,5 CEA10

1
CEA34 0,5 CEA11

CEA33 0 CEA12

CEA32 CEA13

CEA31 CEA14

CEA30 CEA15
CEA29 CEA16
CEA28 CEA17
CEA27 CEA18
CEA26 CEA19
CEA25 CEA20
CEA24CEA23 CEA22CEA21

Figure 12: Diamètres d’halo d’hydrolyse de l’activité protéolytique des isolats testés
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée). CEA20 : 5 % ;
CEA11 4 % ; CEA21 3,5 % ; CEA22 3,5 % ; CEA23 3,5 % et CEA25 3,5 %

III.4. Mise en évidence de la production de biosurfactants

III.4.1. Test d'émulsification

Pour mettre en évidence la capacité de production des biosurfactants par les isolats de Bacillus
sp, nous avons pu évaluer l’aptitude de ces bactéries à émulsionner les hydrocarbures (Essence).
La production des biosurfactants chez les bactéries du genre Bacillus est révélée par la présence
d’une zone émulsive. L’index d’émulsification après 24 h (E24) de la culture cellulaire a été,
déterminé. Sur 42 isolats testés, 33 soit 78,57 % ont été capables de produire les biosurfactants
contre 9 ou 21,43 % d’isolats négatifs. Les index d’émulsification variaient de 50 % et 100 %.
Cependant, seuls les isolats dont les index d’émulsification est ≥ 50 % ont été considérés pour
la suite des analyses.

27
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

C
A B Eau stérile
Bacillus sp CEA5

Figure 13: profil d’émulsification de quelques isolats de Bacillus sp. avec l’essence
A : contrôle positif (Bacillus sp) ; B : émulsion de l’isolat testé (CEA5) ; C : contrôle négatif
(Eau stérile)

DO

I n d e x d 'é m u ls ific a tio n

2 .0 150

In d e x d 'é m u ls ific a tio n (% )

D e n s ité o p tiq u e (D 0 )

1 .5
100

1 .0

50
0 .5

0 .0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 5 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 -
A A A A A A A A A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 C
E E E E E E E E E A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
C C C C C C C C C E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E
C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C

I s o la t s T e s t é s

Figure 14: Index d’émulsification des isolats de Bacillus sp. en fonction de la densité optique
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)
L’axe des valeurs x de 0 à 2.0 en rouge : densité optique indiquant la croissance bactérienne ;
l’axe des valeurs x de 0 à 150 en vert : index d’émulsification par les isolats de Bacillus

III.4.2. Extraction des biosurfactants

Les isolats de Bacillus ayant émulsifié l’essence avec la culture, dont les index d’émulsification
sont ≥ 50 %, ont été sélectionnés pour le test d’extraction du biosurfactant par précipitation à
l’acide chlorhydrique (HCl). Tous les isolats ont présenté un précipité comme le montre la
figure 15.
28
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

A
CEA 11 B
CEA 6

Figure 15: Profil de l’extrait du biosurfactant

A : Précipité du biosurfactant de l’isolat CEA6)

B : Précipité du biosurfactant de l’isolat CEA11)
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

Le précipité a été récolté dans du PBS 1X dans le but d’évaluer l’activité inhibitrice de l’extrait
du biosurfactant vis-à-vis des bactéries pathogènes.

III.4.3. Activités antibactériennes des biosurfactants

L’activité antimicrobienne des extraits des biosurfactants obtenus a été recherchée sur quatre
(04) souches pathogènes de référence (Escherichia coli, Staphylococcus sp., Bacillus Cereus,
et Pseudomonas sp.). L’apparition d’une zone d’inhibition autour du puits du dépôt du
biosurfactant est révélatrice d’une activité inhibitrice positive.
Les résultats obtenus montrent que les biosurfactants des isolats de Bacillus testés possèdent
une activité antibactérienne, cette activité varie en fonction de chaque biosurfactant testé et de
la bactérie pathogène.

29
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

A B D

CEA6 CEA20
CEA11
CEA6
CEA5 CEA7 CEA11
CEA17
CEA 8 CEA8

Extrait du Biosurfactant
Contrôle (antibiotique)

Figure 16: Pouvoir inhibiteur des pathogènes par des extraits de biosurfactants.
A : Staphylococcus sp. (CEA5, CEA6, CEA7, CEA8 et CEA11), B : Bacillus Cereus (CEA6,
CEA11, CEA17, CEA20 et CEA8) et D : Shigella boydi. CEA : Echantillon provenant du
canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)
Sur les 42 biosurfactants extraits à partir de la culture des isolats de Bacillus sp., 15 soit 35,71
% ont montré un pouvoir inhibiteur sur la croissance de tous les pathogènes, à l’exception des
isolats CEA7, CEA8, CEA11, CEA15, CEA17, CEA18 et CEA21 sur Escherichia coli. Dans
tous les cas, les diamètres des halos d’inhibitions mesurés variaient de 1,3 à 4,3 cm soient 13 à
43 mm. La figure 17 illustre les diamètres d’halo d’inhibition en cm de chaque biosurfactant.
D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )

8
S ta p h y lo c o c c u s s p p

B a c i ll u s c e r e u s
6
P seu d o n om a s spp

4 E s c h e r ic h a c o li

0
1

7
5

-
C
1

3
A

A
E

E
C

E x t r a it s d e b io s u r f a c t a n t s t e s t é s

Figure 17: Diamètres des zones d’inhibition des pathogènes par des biosurfactants extraits à
partir de la culture des isolats de Bacillus sp. Extraits à partir de la culture
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée). L’axe des valeurs
de x correspond aux diamètres d’inhibition de l’extrait du biosurfactant en cm et l’axe des
valeurs de y : extrait de biosurfactant testé portant le code des échantillons des isolats de
Bacillus.

30
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.4.4. Caractérisation biochimique des biosurfactants

La caractérisation biochimique des extraits de biosurfactants obtenus a été réalisée en utilisant

la méthode de CTAB au bleu de méthylène qui est un test de mise évidence des glycolipides.
Sur les 15 extraits de biosurfactants testés, 5 soit 33,33 % des extraits ont été positifs à ce test
(figure 16 et tableau 2).

A B
CEA28 SDS

Figure 18: caractérisation des biosurfactants de type glycolipide

A : Test positif de l’isolat CEA28 ; B : contrôle positif SDS.
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

Tableau III: caractérisation biochimique des biosurfactants

BS-CEA : extrait du biosurfactant de l’isolat provenant du canal effluent anaérobique
Le + indique une réaction positive à la nature du biosurfactant
BS : indique l’extrait du biosurfactant

Isolats Recherche des glycolipides

1 BS-CEA28 +
2 BS-CEA23 +
3 BS-CEA11 +
4 BS-CEA18 +
5 BS-CEA27 +

III.4.5. Test de dispersion d’huile

La méthode de déplacement d'huile permet de mesurer l’activité de surface d’une solution

tensioactive. Plus le diamètre du cercle déplacé est grand, plus l'activité de surface du tensioactif
est élevée. Sur les 15 extraits, 14 extraits ont montré une activité positive. Le biosurfactant
produit par la culture de l’isolat CEA6 a montré une activité de surface plus élevée au niveau
31
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

du gasoil, le diamètre du cercle déplacé était de 5,13 cm. Les résultats du déplacement d'huile
par les biosurfactants sont illustrés à la figure 19.

CEA5 CEA6

A
B

Figure 19: Dispersion d'huile du biosurfactant produit par les isolats de Bacillus.
A : dispersion de l’Essence par l’extrait du biosurfactant par l’isolat CEA5 ; B : dispersion du Gasoil
par l’extrait du biosurfactant de l’isolat CEA6. CEA : Echantillon provenant du canal Effluent
anaérobique (Eaux Traitée). Le trait en rouge montre le sens de dispersion d’huile.
M esure d'E pandage d'huile (C m )

7 A
6

A5 E6 A7 A8 A11 A15 A17 A18 A20 A21 A23 A27 A28 A36 A37 C- C+
CE CA CE CE CE CE CE CE CE CE CE CE CE CE CE

Is o la t s T e s té s (G a s o il)
M e s u r e d 'E p a n d a g e d 'h u ile ( C m )

8
B
7

5 6 7 8 -
A E A A 1 1 1 5 1 7 1 8 2 0 2 1 2 3 2 7 2 8 3 6 3 7 C C
+
E A E E A A A A A A A A A A A
C C C C E E E E E E E E E E E
C C C C C C C C C C C

I s o l a t s T e s t é s ( E s s e n c e )

Figure 20: diamètres de dispersion d’huile :

A : avec le Gasoil, B : avec l’essence. L’axe des valeurs de x : mesure de dispersion d’huile par de
l’extrait du biosurfactant en cm ; l’axe des valeurs de y : isolats de Bacillus testés. CEA : Echantillon
provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

32
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.5. Tolérance aux métaux lourds

La figure 20 montre le profil réactionnel des bactéries du genre Bacillus vis-à-vis des métaux
lourds. La résistance ou la sensibilité aux différentes concentrations aux métaux lourds varie
d’un isolat à un autre. Les résultats de cette étude ont montré la sensibilité à l’argent de la
majorité des isolats testés à l’exception de l’isolat CEA37 qui a révélé une résistance totale à
ce métal. Par contre, les isolats (CEA5, CEA6, CEA7, CEA8, CEA11, CEA20, CEA21,
CEA27, CEA28, CEA36) ont révélé une résistance aux métaux lourds (Plomb, Nickel, Cobalt,
Zinc, Cuivre et Mercure) à l’exception de quelques isolats qui ont montré une sensibilité à ces
métaux à une concentration de 50 mM.

Argent CEA5
A
B Nickel
CEA6
CEA20
Cobalt
Mercure
CEA36 Argent
Zinc

Figure 21: Activité des métaux lourds sur les isolats de Bacillus.

A : Sensibilité par l’argent et B : Tolérance par le Nickel (CEA5) ; le Mercure (CEA6) ; le Cobalt
(CEA20) et le Zinc (CEA36). CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux
Traitée)
D ia m è tr e s d 'in h ib in itio n (c m )

4 A
CAE5 C EA20

CEA6 C EA21
3
CEA7 C EA237

2 CEA8
C EA27
C EA11
C EA28
1 C EA15
C EA36
C EA17
C EA37
0 C EA18
M

M
m

m
0

0
1

A rgen t

33
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

CEA5 CEA6
D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )
2 .0 CEA7 CEA8
B
C EA11 C EA15
1 .5
C EA17 C EA18

C EA18 C EA20
1 .0
C EA21 C EA23

C EA27 C EA28
0 .5
C EA36

0 .0
M M M
m m m
10 20 50
P lo m b
D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )

4 E
CEA5 C EA20

CEA6 C EA21
3
CEA7 C EA23

2 CEA8 C EA27
C EA11 C EA28

1 C EA15 C EA36

C EA17 C EA37
0 C EA18
M

M
m

m
0

0
1

Z in c
D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )

2 .0 D
CEA5 C EA21

CEA6 C EA23
1 .5
CEA7 C EA27

1 .0 CEA8 C EA28

C EA11 C EA36

0 .5 C EA17 C EA37

C EA18
0 .0 C EA20
M M M
m m m
10 20 50

C o b a lt

34
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )

1 .0 C
CAE5 C EA 20

0 .8 CAE6 C EA 21

CAE7 C EA237
0 .6
CEA8 C EA 28
0 .4 C EA 11
C EA 36
C EA 17
0 .2 C EA 37
C EA 18
0 .0
M M
m m
10 50
N ic k e l
D ia m è tre s d 'in h ib in itio n (c m )

3 F
CEA5 C EA20

CEA6 C EA21

2 CEA7 C EA23

CEA8 C EA27

C EA11 C EA28
1
C EA15 C EA36

C EA17 C EA37
0 C EA18
M M M
1 0m 2 0m 5 0m

C u iv r e
D iam è tres d 'in h ib in itio n (c m )

1 .5
G CEA5 C EA37

CEA6 C EA20

1 .0 CEA7
C EA21
CEA8
C EA23
C EA11
0 .5 C EA27
C EA15
C EA28
C EA17
C EA36
0 .0 C EA18
M

M
m

m
0

0
1

M ercu re

Figure 22: comportement des différents isolats en présence des métaux lourds.
A : Argent, B : Plomb, C : Nickel, D : Cobalt, E : Zinc, F : Cuivre, G : Mercure. L’axe des valeurs de
x : diamètres d’inhibition du métal en cm ; l’axe des valeurs de y : concentrations du métal considéré.
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

III.6. Tolérance aux hydrocarbures

Les résultats de ce travail, ont montré que les isolats (CEA11, CEA20) ont été capable de croitre
sur milieu minéral supplémenté de gasoil, d’huile SAE 90 et l’essence. L’isolat CEA28 a été

35
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

capable de croitre sur l’essence et l’huile à moteur, ensuite les isolats CEA21, CEA18, CEA6.
Par contre, les isolats CEA17 et CEA15 ont été capables de croitre sur le gasoil et l’huile à
moteur SAE 40. Le Tableau II montre la croissance en présence du Gasoil, l’Essence et de
l’huile à moteur SAE 90 des 15 isolat des bactéries du genre Bacillus.
Concernant la gelée de pétrole (vaseline), quatre (04) soient 34 % des isolats (CEA5, CEA6,
CEA7 et CEA28) ont montrer une croissance plus prononcée, sept soient 46% ont révélé une
croissance faible (CEA11, CEA15, CEA17, CEA18, CEA21, CEA23 et CEA27 et trois ont
montrer une croissance très fable soit 20% (CEA8, CEA20 et CEA37).

CEA11

CEA11
CEA8

A B C
Figure 23: Capacité des différents isolats dans la dégradation et la tolérance des hydrocarbures

A : croissance et tolérance de la vaseline (CEA5, CEA6, CEA17, CEA18, CEA11 et CEA15) ; B :

croissance et tolérance de l’essence (CEA11) et C : croissance et tolérance sur le gasoil (CEA11).
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

Tableau IV: Profil de tolérance aux 4 hydrocarbures (gasoil, essence, huile SAE 90) et
la vaseline des isolats des bactéries du genre Bacillus
CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)

ISOLATS Gasoil Essence Huile à moteur Vaseline

CEA5 + - - +++
CEA6 + - - +++
CEA7 - - - +++
CEA8 - - + +
CEA11 + + + ++
CEA15 + - + ++
CEA17 + - + ++
CEA18 + - - ++
CEA20 + + + +
CEA21 + - - ++
CEA23 - - + ++
CEA27 - - + ++
CEA28 - + + +++
CEA36 - - - ++
CEA37 - - - +
+ : croissance et - : absence de croissance : +++ = Croissance plus modérée ; ++ = Croissance moyen modérée ; + =
Croissance faiblement modérée.

36
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.7.1. Etude des interactions bactériennes

Les co-cultures ont été réalisées pour étudier l'interaction microbienne entre les isolats de
Bacillus et les souches de références telles que Pseudomonas sp. et Staphylococcus sp. bactéries
présentes dans les eaux usées. La figure 24 illustre le profil interactif entre les bactéries du genre
Bacillus et les pathogènes utilisées pour l’étude.

 Bacillus sp (CEA5) et Staphylococcus sp.

Après la réalisation des co-cultures, des dénombrements ont été effectués pendant les périodes
de 24h à 72 h d’incubation et les concentrations microbiennes ont été déterminées.
Après incubation, le nombre de cellules de CEA5 variait de 8.106 UFC/mL à 24 h de 9,00.107
UFC/mL à 48 h pour finir à 3,12.108 UFC/ mL après 72 h. Par contre, le nombre de cellules de
Pseudomonas co-cultiveés avec CEA5 variait entre 1,30.106 UFC/mL et 1,37.106 UFC/mL
respectivement de 24 h à 48 h avec une légèrement augmentation de 4,00.106 UFC/mL à 72 h.

 Bacillus sp. (CEA5) et Pseudomonas sp.

Le nombre de cellules de l’isolat CEA5 co-cultivé avec Pseudomonas sp. augmente de façon
exponentiel de 24 h à 48 h après dénombrement de 5,70.104 UFC/mL et 5,40.107 UFC/mL puis
décroit légèrement de 1,80.107 UFC/mL après 72 h. Alors que, le nombre de cellules de
Pseudomonas croît légèrement de 24 h à 72 h dont les concentrations ont été estimées
respectivement à 1,40.106 UFC/mL, 3,30.107UFC/mL et 1,22.108 UFC/mL.

 Bacillus sp. (CEA6) et Staphylococcus sp.

L’isolat CEA6 croît exponentiellement de 24 h à 48 h, les valeurs des UFC sont comprises
respectivement à 5,00.104 UFC/mL et 6,50.107 UFC/mL, cette croissance reste stable à 72 h
avec à 7,20.107 UFC/mL. Par contre le nombre de cellule de Staphylococcus sp augmente
légèrement en corrélation avec CEA6 de 24 h à 48 h dont les valeurs sont respectivement
estimées à 2,72.105 UFC/mL, 4,80.106 UFC/mL et décroit à 72 h à 1,60.107 UFC/mL.

 Bacillus sp. (CEA6) et Pseudomonas sp.

L’isolat CEA6 co-cultivé avec Pseudomonas sp. croît de façon exponentielle jusqu’à 48 h avec
des nombres de cellules estimés à 2,08.106 UFC/mL à 24 h et à 5,70.107 UFC/mL à 48 h. Le
nombre de cellules décroit rapide de 48 h à 72 h dont la valeur est estimée à 2,86.107 UFC/mL.
Par contre, à 24 h aucune croissance n’a été avec Pseudomonas en présence de l’isolat (CEA6),

37
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

mais le nombre de cellules augmente exponentiellement de 48 h à 72 h dont les valeurs sont

estimées à 4,90.107 UFC/mL à 48 h et 7,90.107 UFC/mL à 72 h.

 Bacillus sp. (CEA11) et Staphylococcus sp.

La concentration cellulaire de l’isolat CEA11 co-cultivé avec Staphylococcus sp. variait de
6,00.106 UFC/mL à 24 h et 2,30.107 UFC/mL, cette croissance décroit de 5,52.106 UFC/mL à
72 h. Concernant Staphylococcus sp. la croissance à 24 h a été estimée à 2,00.104 UFC/mL, ce
nombre s’annule à 48 h puis augmente en 72 h à 7,56.106 UFC/mL.

 Bacillus sp. (CEA11) et Pseudomonas sp.

La co-culture de CEA11 avec Pseudomonas sp suit le même profil de croissance. Pour CEA11,
la concentration cellulaire variait 1,37.106 UFC/mL à 24 h, 1,68.107 UFC/mL à 48 h et 8,20.106
UFC/mL à 72 h et celle de Pseudomonas variait de 6,90.105 UFC/mL à 24 h, 1,52.106 UFC/mL
à 48h et 4,40.105 UFC/mL à 72 h.

 Bacillus sp. (CEA20) et Staphylococcus sp.

L’isolat CEA20 co-cultivé avec Staphylococcus sp a une croissance modérée par rapport à
Staphylococcus sp. Pour CEA20 la concentration cellulaire variait de 7,37.106 UFC/mL à 24 h,
1,68.107 UFC/mL à 48 h et 2,16.106 UFC/mL à 72 h et celle de Staphylococcus sp. variait de
3,00.104 UFC/mL à 24 h, 6,60.106 UFC/mL à 48 h et nulle à 72 h.

 Bacillus sp. (CEA20) et Pseudomonas sp.

La concentration de CEA20 co-cultivé avec Pseudomonas sp. de 8,98.106 UFC/mL à 24 h,

1,71.107 UFC/mL à 48 h et 4,52.106 UFC/mL à 72 h et celle de Pseudomonas sp. variait
lentement de 1,80.105 UFC/mL à 24 h, 1,21.107 UFC/mL à 48 h et 7,00.105 UFC/mL à 72 h.

 Bacillus sp. (CEA28) et Staphylococcus sp.

La concentration cellulaire de CEA28 co-cultivé avec Staphylococcus sp. croit

exponentiellement par rapport à Staphylococcus sp. Pour CEA28, elle variait de 9,00.106
UFC/mL à 24 h, 4,00.107 UFC/mL à 48 h et décroit de 2,64.106 UFC/mL à 72 h et celle de
Staphylococcus sp. était visible à 24 h et variait de 1,00.104 UFC/mL mais cela était nulle à 48
h et 72 h.

38
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

 Bacillus sp. (CEA28) et Pseudomonas sp.

La croissance de CEA20 co-cultivé avec Pseudomonas sp. était peu plus modérée par rapport
à Staphylococcus sp. et variait de 7,00.106 UFC/mL à 24 h, celle-ci décroit légèrement en
suivant presque la même évolution avec Pseudomonas sp. et variait de 3,52.106 UFC/mL de
1,52.106 UFC/mL à 24 h, 1,30.105 UFC/mL à 48 h et 1,12.106 UFC/mL à 72 h.

B C
A

Figure 24: co-culture bactériennes.

A : croissance de Staphylococcus sp co-cultivé avec Bacillus sp. ; B : croissance de Bacillus sp. co-
cultivé avec Staphylococcus sp. et Pseudomonas sp. ; C : croissancede Pseudomonas sp. co-cultivé
avec Bacillus sp. CEA : Echantillon provenant du canal Effluent anaérobique (Eaux Traitée)
B)

9
CEA6 S ta p h y lo c o c c u s s p p
8
L o g U F C /m L

4
24H 48H 72H

T e m p s (h )

C
D
9
CEA5 8 .5
P seu d o n om a s spp CEA6 P seu d o n om a s spp
8
8 .0
lo g U F C /m L

lo g U F C /m L

7 7 .5

6 7 .0

5 6 .5

6 .0
4
24 H 48 H 72 H
24 H 48 H 72 H
T e m p s (h )
T e m p s (h )

39
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

F
8 G 8 .0
C EA20 S ta p h y lo c o c c u s s p p
C EA11 P seudom onas spp
7 .5
7

lo g U F C /m L
lo g U F C /m L

7 .0

6 6 .5

6 .0
5
5 .5

4 5 .0
24h 48h 72h 24 H 48 H 72 H
T e m p s (h )
T e m p s (h )
H
E
8 8
C EA11 S ta p h y lo c o c c u s s p p C EA20 P seudom onas spp

7 7
lo g U F C /m L
lo g U F C /m L

6
6

5
5

4
4 24h 48h 72h
24 H 48 H 72 H
T e m p s (h )
T e m p s (h )

I 8 K
8
C EA28 S ta p h y lo c o c c u s s p p C EA28 P seudom onas spp
7 7
lo g U F C /m L
lo g U F C /m L

6
6
5

5
4

3 4
24h 48h 72h 24h 48h 72h
T e m p s (h ) T e m p s (h )

Figure 25: interactions bactériennes.

A : Staphylococcus sp. et Bacillus sp. (CEA5) ; B : Bacillus sp. (CEA6) et Staphylococcus sp. ;
C : Pseudomonas sp. et Bacillus sp. (CEA5) ; D : Bacillus sp. (CEA6) et Pseudomonas sp. ; E :
Bacillus sp. (CEA11) et Staphylococcus sp. ; F : Bacillus sp. (CEA11) et Pseudomonas sp. ; G :
Bacillus sp. (CEA20) et Staphylococcus sp. ; H : Bacillus sp. (CEA20) et Pseudomonas sp. ; I :
Bacillus sp. (CEA28) et Staphylococcus sp. ; K : Bacillus sp. (CEA28) et Pseudomonas sp.
CEA : Isolat bactériens provenant des eaux usées du canal effluent anaérobique.

40
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.8. DISCUSION
Le but de cette étude était d'évaluer le potentiel bioremédiateur des espèces de Bacillus isolées
des eaux usées de la brasserie de Brazzaville.
Au cours de cette étude, la qualité physico-chimique des échantillons d’eau a été évaluée en
recherchant les paramètres comme : la température, le pH, la conductivité électrique, la turbidité
et la DCO.
La valeur moyenne du pH des échantillons durant les deux compagnes de prélèvement variait
de 6,54 à 11,29 pour le bassin Affluent (BA) et le canal Effluent anaérobique (CEA)
respectivement. Les résultats obtenus au cours de ce travail sont proches de ceux trouvés par
[44], qui ont trouvé une valeur de pH > 9,5, en travaillant sur l’étude de l’impact des effluents
industriels sur la station d’épuration des eaux usées municipales de Vaal, en Afrique du Sud.
Nos résultats de pH sont supérieurs de ceux trouvés par Olajumoke A et al en 2010 [38], qui
ont obtenu des variations de pH allant de 6,25 à 7,17, en travaillant sur l’évaluation de l'impact
des effluents de brasserie sur la qualité de l'eau à majawe, Ibadan, sud-ouest du Nigeria.
La température globale des eaux analysées était de 30 °C au niveau de deux zones de
prélèvement. Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par [42], qui en travaillant sur la
caractérisation de Bacillus licheniformis résistant à plusieurs métaux et son utilisation
potentielle dans les eaux usées industrielles contaminées par l'arsenic ont obtenus les
températures comprises entre 20 et 32 °C.
Il est important de signaler aucune différence significative de température n’a été observée au
niveau des deux zones de prélèvement (t student p=0,6884).
La conductivité électrique est probablement l'une des plus simples et des plus importantes pour
le contrôle de la qualité des eaux usées. Les résultats ont montré que les valeurs de la
conductivité électrique variaient entre 1,95 μs/cm et de 1,31 μs/cm. Nos résultats sont différents
de ceux trouvées par [45], qui ont obtenus des valeurs de conductivité électrique variant entre
219 μs/cm à 3920 μs/cm en travaillant sur les eaux de surface à la station d’épuration de l’oued
Moulouya ( Maroc orientale).
Dans cette étude, nous avant aussi évalué la turbidité des échantillons d’eau. Les valeurs
moyennes de la turbidité varient entre 13 NTU avant traitement et 12,44 NTU après traitement.
Nos résultats sont différents de ceux trouvées par [46], qui ont obtenus des valeurs de turbidité
allant de 1,31 NTU à l’entrée et 0,41 NTU après traitement et largement aux normes Marocaine
du ministère de l’environnement pour le rejet d’eaux usées industrielle. Cette turbidité élevée
pourrait s’expliquée par la présence d’une charge importante en bactéries indicatrices de

41
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

contamination d’origine fécale et d’une teneur élevée en matière colloïdale d’origine minérale
ou organique [46].
La demande chimique en oxygène représente la quantité d’oxygène consommée par les matières
oxydables chimiquement contenues dans l’eau. Elle est représentative de la majeure partie des
composés organiques mais également des sels minéraux oxydables (sulfures, [Link]).
Les teneurs en DCO enregistrées au niveau des eaux étudiées sont comprises entre 1750,66
mg/l au niveau du bassin affluent et 800 mg/l au niveau du canal effluent anaérobique. Nos
résultats sont différents des résultats trouvés par [45], qui ont obtenus des valeurs de DCO
comprises entre 17 mg/L et 47 mg/L, en travaillant sur l’étude physico-chimique des eaux
superficielles de l’oued Moulouya (Maroc oriental) dans plusieurs station d’épuration d’eaux
usées.
Les analyses microbiologiques des eaux usées ont permis l’obtention de 42 isolats bactériens.
Sur la base de caractéristiques morphologiques et biochimiques. Ces 42 isolats ont été assignés
au genre Bacillus. La présence des bactéries du genre Bacillus dans les eaux usées a été déjà
rapportées par [47, 48].
Dans cette étude, nous avons montré l’aptitude de bactéries à produire les protéases en utilisant
comme substrat la caséine. Les résultats ont montré que 90,47 % d’isolats ont été capables de
produire les protéases. Cette propriété à produire les protéases a été déjà montré par [49], en
travaillant sur les bactéries du genre Bacillus isolées du sol. Cette propriété est exploitée dans
la digestion de la matière organique lors de la phase de la digestion anaérobique au cours de
traitement des eaux usées.
Les biosurfactants sont produits par une variation importante de divers micro-organismes et
possèdent des structures de différentes propriétés chimiques et de surface. Dans ce travail, nous
avons montré la capacité des isolats de Bacillus à produire les biosurfactants par le biais d’un
test d’émulsification avec l’essence. Des index d’émulsification (E24) allant de 5 à 100 % ont
été obtenus à partir de la culture cellulaire. Ces resultats sont en accord avec ceux trouvés par
[12], qui ont montré la capacité des Bacillus à produire des biosurfactants par le biais d’un test
d’emulsification avec l’essence dont les index d’émulsification (E24) variaient de 10 à 100 %.
Cette capacité pourrait permettre leur utilisation dans la biorémediation des sols pollués par des
hydrocarbures ou des métaux lourds et pour la dépollution des eaux usées pour la réutilisation
dans divers domaines.
De même, nous avons montré l’activité antimicrobienne des extraits de biosurfactant des isolats
de Bacillus vis-vis des quatre bactéries pathogènes à savoir Eschericha coli, Pseudomonas,

42
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Staphylococcus et bacillus cereus. Le pouvoir inhibiteur des biosurfactants testés variait de

chaque biosurfactant et en fonction du pathogène testé. Cependant une grande sensibilité a été
enregistrée de souches de Staphylococcus et Pseudomonas. De façon globale, les diamètres
d’halos d’inhibition variaient de 13 à 43 mm. Ces résultats sont similaires à ceux trouvés par
[12], qui ont évalué l’activité inhibitrice des biosurfactants de Bacillus sur 3 pathogènes à savoir
Esherichia coli, Bacillus cereus et Shigella flexneri.
Ces biomolécules pourraient être utilisés dans l’optimisation du processus d’élimination des
bactéries pathogènes présentes dans les eaux usées ou dans la rétention des métaux lourds.
De plus, nous avons montré la capacité des biosurfactants isolés à partir de Bacillus à disperser
les huiles comme l’essence, le gasoil et l’huile à moteur SAE 40. 93,33 % des extraits de
biosurfactants ont été capables de disperser toutes les huiles précitées, à l’exception du
biosurfactant extrait à partir de l’isolat CEA7 qui a manifesté aucune activité. Les diamètres
des halos de dispersion d’huile variaient de 0,53 cm à 5,13 cm. Ces résultats sont proches à
ceux trouvés par Ghazal MF et al en 2017 [50], qui a montré la capacité des extraits de
biosurfactants produit par les isolats de Bacillus à déplacé l’huile et la plus grande valeur de
déplacement était de 7,5 cm. De même, [12], ont montré que les biosurfactants des Bacillus
isolés des sols contaminés par les hydrocarbures étaient capables de disperser les mêmes huiles.
Cette propriété de dispersion d’huile pourrait être utilisé dans les industries de pétrolières, dans
la résolution des problèmes liés aux marées noires.
La nature des biosurfactants extraits dans ce travail a été mise en évidence en utilisant des
procédés biochimiques, notamment, la technique de Sigmund Magler qui est spécialisé dans la
détection de glycolipides [40]. Les résultats ont montré que 33,33 % de biosurfactant extrait
était de nature glycolipidique. Il est rapporté dans la littérature que les Bacillus produisent
différents types de biosurfactants y compris les glycolipides [51].
Dans ce travail, nous avons montré la capacité des bactéries à dégradé les hydrocarbures comme
la vaseline, l’essence, le gasoil et l’huile à moteur SAE 40. Les résultats ont montré que tous
les isolats testés ont été capables de dégrader la gelée de pétrole. En effet, ces isolats ont été
capables de croître sur milieu minéral supplémenté de la gelée comme seule source de carbone.
De même, 53,33 % des isolats testés ont été capables de dégrader les hydrocarbures contenus
dans le gasoil et l’huile à moteur. 20% des isolats ont montré une aptitude à métaboliser
l’essence. Nos résultats sont en accord avec ceux trouvés par [12], qui ont montré le taux de
croissance des isolats de Bacillus sur 2 % d’essence, diesel, benzène, d’hexane et d’olive.

43
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Dans le but d’évaluer l’aptitude des isolats à cohabité en présence des métaux lourds, ces
derniers ont été soumis à un test de tolérance vis-à-vis de sept métaux lourds à différentes
concentrations. Les résultats de ce test ont montré que, la sensibilité ou la tolérance des isolats
vis-à-vis des métaux lourds variaient en fonction de chaque isolat testé et de la concentration
en métaux lourds utilisé. Une sensibilité accrue à l’argent a été observée chez 14 isolats sur 15
suivie du cobalt dont 7 isolats sur 15 ont manifesté la sensibilité mais seulement à 50 Mm. 6
isolats sur 15 ont été sensible au cuivre à 50 mM. Cependant, une grande tolérance aux métaux
comme nickel, mercure, le plomb et le zinc a été observé chez les isolats testés. Nos résultats
sont similaires à ceux trouvés par [42], qui ont montré une résistance chez les bactéries du genre
Bacillus aux métaux lourds comme Cr, Co, Zn, Se, Mn, Cd et Arc à différentes concentrations
testées.
Dans cette étude, nous avons également évalué les interactions directes entre les bactéries du
genre Bacillus et les bactéries pathogènes présentes dans les eaux usées par co-culture. Les
résultats ont clairement montré des interactions de type compétitive (antagoniste) entre les
souches de Bacillus testées vis-à-vis de Staphylococcus sp. et de Pseudomonas sp. Nos résultats
sont conformes à ceux trouvés par [52], qui ont montré les mêmes types d’interactions en
cultivant ensemble les bactéries du genre Bacillus et certaines bactéries des eaux usées. Cette
même observation a été faite par Fley-Klett et al en 2011, qui ont observé une interaction de
type compétitive pour les sources : de carbone, d’azote et de fer entre les levures et les bactéries
isolées du sol [53]. De même, Wei Liang Xu en 2020 avait remarqué aussi ces types
d’interactions entre les bactéries lactiques et les levures concernant les nutriments. Ces deux
micro-organismes produisaient des substances métaboliques inhibitrices pour leur croissance à
tous les deux [54].

44
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

III.9. Conclusion et Perspectives

Au terme de notre étude, nous pouvons dire que nos objectifs ont été atteint et que les bactéries
du genre Bacillus isolées des eaux usées de la brasserie de Brazzaville (BRASCO) pourraient
être les bons candidats pour les industries de bioremédiation.

Cette étude avait pour objectif d’évaluer le potentiel biorémédiateur des bactéries du genre
Bacillus isolées des eaux usées de la brasserie de Brazzaville. A l’issue des résultats obtenus
dans ce travail, nous pouvons retenir que les objectifs fixés ont été atteints.
En effet, nous avons dans un premier temps isolé et caractérisé les isolats de Bacillus provenant
de différents échantillons d’eaux usées, puis nous avons montré leur capacité à produire des
protéases et des biosurfactants ainsi que diverses activités biologiques de ces biomolécules
notamment leurs pouvoirs antimicrobiens contre Staphylococcus sp., Pseudomonas sp.,
Escherichia coli et Bacillus Cereus. De même, ces biosurfactants montrent les propriétés de
dispersion des huiles. Parmi les biosurfactants produit, une partie est composé des glycolipides.
De plus, ces isolats de Bacillus possèdent des aptitudes à dégrader les hydrocarbures comme
essence, gasoil, vaseline et l’huile à moteur SAE 40 et à tolérer les métaux lourds comme le
nickel, le plomb, le mercure, le cobalt, le cuivre et le zinc. Les interactions de ces isolats vis-à-
vis des bactéries pathogènes sont de nature compétitive (antagoniste). Et enfin, ces isolats de
Bacillus grâce aux potentiels montrés représenterait un atout pour les industries de
biotechnologie, de biorémédiation, d’assainissement des eaux usées et de décontamination des
sols pollues par les hydrocarbures.
Par rapport aux résultats obtenus de cette étude, diverses perspectives ont été ouvertes. Ainsi
dans le but d’approfondir ce travail, nous envisageons dans l’avenir de :
- identifier et séquencer les gènes impliqués dans la dégradation des hydrocarbures ;
- optimiser la production des enzymes impliqués dans la dégradation d’hydrocarbures ;
- purifier et caractériser les biosurfactants à potentiel dispersant par les techniques comme
l’HPLC ;
- identifier par les technologies de l’ADN les isolats aux potentiels intéressants ;
- évaluer l’aptitude de décontamination des sols pollués en consortium.

45
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Références
1. Elenga-Wilson PS, Kayath CA, Mokemiabeka NS, Nzaou SAE, Nguimbi E, Ahombo.
G: Profilage d'isolats indigènes de Bacillus produisant des biosurfactants dans la
biorestauration de sols contaminés par des produits pétroliers et de l'huile d'olive.
International Journal of Microbiology 2021:15.
2. Lalami AEO, Zanibou A, K. Bekhti3 FZ, Merzouki M: Contrôle de la qualité
microbiologique des eaux usées domestiques et industrielles de la ville de Fès au Maroc
(Microbiological Control wastewater domestic and industrial city of Fes Morocco) J
Mater Environ Sci 2014, 5(S1):2325-2332.
3. Koshlaf E, Ball AS: Soil bioremediation approaches for petroleum hydrocarbon
polluted environments AIMS Microbiology 2017, 3(1):25-49.
4. Azubuike C, Chikere C, Okpokwasili G: Bioremediation techniques-classification
based on site of application : principles, advantages, limitations and prospects. World
Journal of Microbiology and Biotechnology 2016, 32( 11):180.
5. Abdelly C: Bioremédiation / Phytoremédiation. Thèse, Université de Tunis ( Tunisie)
2007:1-33.
6. Iram S, Kanwal S, Ahmad I, Tabassam T, Suthar V, [Link]-ul-Hassan:
Évaluation des paramètres physico-chimiques des échantillons d'eaux usées. Environ
Monit Assess 2013, 185(3):2503-2515.
7. Mahesh S, Basha Pa, Kavitha B: isolement et caractérisation des bactéries isolées des
eaux d'égout municipales de nandyal, kurnool, ap, inde. Microbiol Biotechnologies Env
Sc 2017, 19(3):773-777.
8. Rani N, Sangwan P, Joshi M, Sagar A, Bala K: Microbes : un acteur clé de l'industrie
Traitement des eaux usées. Elsevier Inc 2019:83-102.
9. Kanu, Ijeoma, Achi, Ok: les effluents industriels et leur impact sur la qualité de l'eau
des réception des fleuves au nigeria. Journal of Applied technology in Environmental
Sanitation 2 0 1 1, 1(1): 7 5 - 8 6.
10. Selvi AT, [Link], Devi RA, Madhan B, Kannappan S, Chandrasekaran B:
Isolement et caractérisation des bactéries des effluents de tannerie Station d'épuration et
leur tolérance aux métaux lourds et Antibiotiques. asiatique j exp biol sci 2012, 3 (1):34
- 41.
11. LaMartina EL, Mohaimani AA, Newton RJ: Les communautés bactériennes des eaux
usées urbaines s'assemblent dans des états stables saisonniers BMC 2021 116(9).

46
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

12. Elenga-Wilson PS, Kayath CA, Mokemiabeka NS, Nzaou SAE, Nguimbi E, Ahombo.
G: Profilage d'isolats indigènes de Bacillus produisant des biosurfactants dans la
biorestauration de sols contaminés par des produits pétroliers et de l'huile
d'[Link] Journal of Microbiology 2021, 2021:1-15.
13. Paola Sandra Elenga Wilson GJO-B, Christian Aimé Kayath* KMM, Étienne Nguimbi
GA: Évaluation qualitative et quantitative d'une surfactinebiosurfactantdans la
Bioaugmentation de sols contaminés au pétrole brut dans les garages en République du
Congo. Journal international de la bioremédiation et de la biodégradation
environnementales 2022, 10 (1):1-11.
14. Lalami AEO, Zanibou A, Bekhti K, [Link], Merzouki M: Contrôle de la qualité
microbiologique des eaux usées domestiques et industrielles de la ville de Fès au Maroc
(Contrôle Microbiologique eaux usées domestiques et industrielles ville de Fes Maroc)
J Mater Environ Sci 2014, 5(S1): 2325-2332.
15. Zahra Aghalari H-UD, Mika Sillanpää, Juan Eduardo Sosa-Hernandez, Roberto Parra-
Saldívar: Efficacité des systèmes de traitement des eaux usées pour éliminer les agents
microbiensÿ: une revue systématique. 2020:1/11.
16. Ipeaiyeda A, Onianwa P: Impact des effluents de la brasserie sur la qualité de l'eau de
la rivière Olosun à Ibadan, Nigeria. Chimie et écologie 2009 25(3):189–204.
17. Olaniran AO, Balgobind A, Pillay B: Biodisponibilité des métaux lourds dans le sol :
impact sur la biodégradation microbienne des composés organiques et stratégies
d'amélioration possibles. Int J Mol Sci 2013, 14:10197-10228
18. Perchet Mg-T: etude de bioremédiation des sédiments contamines par des composes
organiques nitres persistants. 2008:1-202.
19. De Vos P, Garrity,, G.M. J, Krieg NR, Ludwig W, Rainey FA, Schleifer KH,
WhitmanW.B. a: bergey’s manual of Systematic Bacteriology,The Firmicutes. springer
2009, Volume Three(Second Edition).
20. Zeigler D.R. , and Perkins JB: The Genus Bacillus. Practical handbook of microbiology
2008(Second Edition):309-326.
21. Logan NA, De Vos P: Genus I. Bacillus Cohn 1872, 174AL . Bergey's manual of
systematic Bacteriology. John Wiley & Sons, Inc, in association with Bergey’s Manual
Trust( (Eds De Vos, P,Garrity, GM, Jones, D, Krieg, NR, Ludwig, W, Rainey, FA,
Schleifer, KH, Whitman,WB) 2009, volume htree(second edition):1-164.

47
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

22. Nicholson WL, Nobuo M, Horneck G, Melosh HJ, Setlow P: Resistance of Bacillus
Endospores to Extreme Terrestrial and Extraterrestrial Environments. microbiology and
molecular biology reviews 2000, 64(3):548–572.
23. Kayath CA, Nguimbi E, Tchimbakala JG, Mamonékéné V, Lebonguy AA, Ahombo G:
Towards the Understanding of Fermented Food Biotechnology in Congo Brazzaville.
Advance Journal of Food Science and Technology 2016, 12(11):593-602, 2016.
24. Maughan H, Géraldine Van der Auwera b c: La taxonomie des bacilles à l'ère
génomique révèle que les phénotypes sont essentiels bien que souvent trompeurs.
elsevier Infection, génétique et évolution 2011, 11 789–797.
25. Starostin KV, Demidov EA, Bryanskaya AV, Efimov VM, Rozanov AS, & Peltek SE:
Identification of Bacillus strains by maldi tof MS using geometric approach. Scientific
Reports 2015, 16989 (5).
26. Tamang JP, Watanabe K, Holzapfel WH: Diversity of Microorganisms in Global
Fermented Foods and Beverages. Frontiers in Microbiology 2016, 7(377).
27. Franz CMAP, Hucha M, Mathara JM, Abriouel H, Benomar N, Reid G, Galvez A,
Holzapfel WH: African fermented foods and probiotics. International Journal of Food
Microbiology 2014, 190: 84–96.
28. Su Y, Liu C, Fang H, Zhang D: Bacillus subtilis : une usine cellulaire universelle pour
l'industrie, l'agriculture, les biomatériaux et la médecine BMC 2020 19(173):1-12.
29. Maughan H, Van der Auwera G: Bacillus taxonomy in the genomic era finds phenotypes
to be essential though often misleading. Infection, Genetics and Evolution 2011 11 789–
797.
30. Das S, Dash HR, Mangwani N, Chakraborty J, Kumari S: Understanding molecular
identification and polyphasic taxonomic approaches for genetic relatedness and
phylogenetic relationships of microorganisms. Journal of Microbiological Methods
2014, 103:80–100.
31. Wang W, Sun M: Phylogenetic Relationships Between Bacillus Species And Related
Genera Inferred From 16s Rdna Sequences. Brazilian Journal of Microbiology 2009,
40:505-521.
32. De Vos P, Garrity,, G.M. J, Krieg NR, Ludwig W, Rainey FA, al e: bergey’s manual
of Systematic Bacteriology,The Firmicutes. springer 2009, Volume Three(Second
Edition).

48
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

33. Caulier S, Nannan C, Gillis A, Licciardi F, Bragard C, al e: Overview of the

Antimicrobial Compounds Produced by Members of the Bacillus subtilis Group
Frontiers in Microbiology 2019, 10(302).
34. Gurung N, Ray S, Bose S, Rai V: A Broader View: Microbial Enzymes and Their
Relevance in Industries, Medicine, and Beyond. BioMed Research International 2013,
2013.
35. Cutting SM: Bacillus probiotics. Food Microbiology 2010, 28( (2011)): 214-220.
36. Caulier S, Nannan C, Gillis A, Licciardi F, Bragard C, Mahillon J: Overview of the
Antimicrobial Compounds Produced by Members of the Bacillus subtilis Group
Frontiers in Microbiology 2019, 10(302).
37. Dunlap CA: Taxonomy of registered Bacillus spp. strains used as plant pathogen
antagonists. Biological Control 2019, 134:82-86.
38. Olajumoke A, Oluwatosine A, Olumuyiwa O, Abimbola F: évaluation de l'impact des
effluents de brasserie sur la qualité de l'eau à majawe, ibadan, sud-ouest du nigeria.
Chercheur, Département de biochimie, Université d'Ibadan 2010;, 2(5):21-28.
39. Wu B, Xiu J, Yu L, Huang L, LinaYi, Ma Y: Production de biosurfactant parBacillus
subtilisSL et son potentiel de récupération assistée du pétrole dans des réservoirs à faible
perméabilité. Rapports scientifiques 2022, 12(7785).
40. Ibrahim HMM: Characterization of biosurfactants produced by novel strains of
Ochrobactrum anthropi HM-1 and Citrobacter freundii HM-2 from used engine oil-
contaminated soil. Egyptian Journal of Petroleum 2018, 27:21–29.
41. Phulpoto IA, Yu Z, Hu B, Wang Y, Ndayisenga F, Li J, Liang H, Qazi MA: Production
et caractérisation de biosurfactant de type surfactine produit par une nouvelle
soucheBacillus nealsoniiS2MT et son potentiel pour l'assainissement des sols
contaminés par le pétrole. BMC 2020 [Link]-12.
42. Sher S, Sultan S, Rehman A: Caractérisation de Bacillus licheniformis résistant à
plusieurs métaux et son utilisation potentielle dans les eaux usées industrielles
contaminées par l'arsenic. Sciences appliquées de l'eau 2021 [Link]-69.
43. Fifani B, Steels S, Alice Delacuvellerie, Delacuvellerie A, Deracinois B, Phalip V,
Delvigné F, Jacques P: Coculture de Trichoderma harzianum et Bacillus velezensis
Basé sur les modules métaboliques d'alimentation croisée Production de lipopeptides.
MDPI, micro-organismes 2022, 10, 1059:1-18.

49
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

44. Iloms E, Ololade OO, Ogola HJO, Selvarajan R: Étude de l'impact des effluents
industriels sur la station d'épuration des eaux usées municipales de Vaal, en Afrique du
Sud. Int J Environ Res Santé publique 2020, 17, 1096:1-26.
45. Makhoukh1 M, Sbaa M, Berrahou A, Clooster Mv: contribution a l’etude physico-
chimique des eaux superficielles de l’oued moulouya (maroc oriental). Larhyss Journal
2011, 09 149-169.
46. Mokeddeme, Belhachemi M, Merzougui T, Nabou N, Merzougui F: See discussions,
stats, and author profiles for this publication at: Caractérisation physico-chimique des
eaux de surfaces de la region de Béchar (Sud. Ouest Algérien). Algerian Journal of
Environmental Science and Technology 2017, 3.(3-A):73-78.
47. Mahesh S, Basha Pa, Kavitha B: isolement et caractérisation des bactéries isolées des
eaux d'égout municipales de nandyal, kurnool, ap, inde. Asian Jr de Microbiol
Biotechnologies Env Sc 2017, 19(3):772-777.
48. Palela M, Ifrim G, Bahrim G: caractérisation microbiologique et biochimique du
microbiote des eaux usées de laiterie et de brasserie. Les Annales de
l'UniversitéDunarea de Josdu Fascicule VI de Galati - Technologie alimentaire,
nouvelle série, II (XXXI) 2008:23-30.
49. Nguimbi E, Ahombo G, Moyen R, Ampa R, Vouidibio A, . ea: Optimization of growth,
fibrinolytic enzyme producrion and PCR amplification of encoding fibrinolytic enzyme
gene in Bacillus amyloliquefaciens isolated from Ntoba mbodi at Brazzaville.
International Journal of Science and Research, 2014: 2799-2803.
50. Ghazal MF, Moussa LA, Makboul HE, Fayed SA: Projection de certainsBacillesDes
souches pour leurs capacités à produire des biosurfactants. Der Pharma Chemicala 2017
9(8):6-12.
51. Thavasi R, Jayalakshmi S, Balasubramanian T, Banat IM: Production and
characterization of a glycolipid biosurfactant from Bacillus megaterium using
economically cheaper sources. World J Microbiol Biotechnol 2008, 24:917–925.
52. Rahimi S, Modin O, Roshanzamir F, Neissi A, Alam SS, Seelbinder B, Pandit S,
IvanMijakovic LS: La co-culture de Bacillus subtilis et de la communauté microbienne
des eaux usées dans un système bioélectrochimique améliore la dénitrification et la
formation de butyrateJournal de génie chimique 2020, 397 (1).

50
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

53. Frey-Klett P: Bacterial-fungal interactions: hyphens between agricultural, clinical,

environmental, and food microbiologists. Microbiology and molecular biology reviews.
2011, 75(4):583-609.
54. Guo L: Production technology, nutritional, and microbiological investigation of
traditionally fermented mare milk (Chigee) from Xilin Gol in China. Food science &
nutrition 2020, 8(1):257-264.

51
ANNEXES
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

ANNEXES N°1
Tableau V: Caractéristiques macroscopiques et microscopiques des isolats de Bacillus
Isolat Forme Texture Forme microscopique Mobilité Test de Gram Catalase Sporulation
macroscopique

CEA1 Arborissante Pâteuse Bâtonnet court en chaîne + + + +

CEA2 Arborissante Gluante Bâtonnet court + + + +
CEA3 Arborissante Gluante Long bâtonnet + + + +
CEA4 Ovale Gluante Bâtonnet + + + +
CEA5 Ronde Gluante Bâtonnet en chaîne + + + +
CEA6 Ovale Pâteuse Bâtonnet + + + +
CEA7 Ovale Pâteuse Long bâtonnet + + + +
CEA8 Arborissante Gluante Long bâtonnet + + + +
CEA9 Ronde Sèche Long bâtonnet en chaine + + + +
CEA10 Ronde Pâteuse Bâtonnet en chaine de 2,3 + + + +
CEA11 Ronde Pâteuse Bâtonnet + + + +
CEA12 Ronde Pâteuse Long bâtonnet + + + +
CEA13 Ronde Sèche Bâtonnet court + + + +
CEA14 Ronde Pâteuse Bâtonnet long + + + +
CEA15 Ovale Pâteuse Bâtonnet en chaine de 2, + + + +
3
CEA16 Ronde Pâteuse Bâtonnet court en chaine + + + +
de 2, 3
CEA17 Ronde Gluante Bâtonnet court + + + +
CEA18 Ronde Gluante Bâtonnet court + + + +
CEA19 Arborissante Sèche Bâtonnet + + + +
CEA20 Ronde Gluante Bâtonnet long + + + +
CEA21 Ronde Sèche Bâtonnet court + + + +
CEA22 Ronde Pâteuse Bâtonnet court + + + +
CEA23 Arborissante Pâteuse Bâtonnet + + + +
CEA24 Ovale Gluante Bâtonnet court + + + +
CEA25 Arborissante Pâteuse Bâtonnet long + + + +
CEA26 Ovale Pâteuse Bâtonnet court + + + +
CEA27 Arborissante Sèche Bâtonnet long + + + +
CEA28 Ronde Gluante Bâtonnet + + + +

CEA29 Ronde Gluante Bâtonnet + + + +

CEA30 Ronde Gluante Bâtonnet court et + + + +
Long
CEA31 Ronde Pâteuse Long bâtonnet en chaine + + + +
CEA32 Arborissante Pâteuse Bâtonnet court en chaine + + + +
CEA33 Arborissante Pâteuse Long bâtonnet en chaine + + + +
CEA34 Arborissante Pâteuse Bâtonnet en chaine de 2, + + + +
3,4
CEA35 Ronde Pâteuse Bâtonnet court + + + +
CEA36 Ronde Pâteuse Long bâtonnet + + + +
CEA37 Ovale Pâteuse Long bâtonnet + + + +
CEA38 Ronde Pâteuse Long bâtonnet + + + +
IX
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

CEA39 Arborissante Pâteuse Bâtonnet court + + + +

CEA40 Arborissante Pâteuse Bâtonnet court + + + +
CEA41 Ronde Pâteuse Bâtonnet court + + + +
CEA42 Ronde Pâteuse Bâtonnet court + + + +

Tableau VI: Composition des milieux de culture

Mossel Usage Composition pour 950 mL de Préparation
l’eau distillée
Milieu sélectif et différentiel,- - Peptone : 10 g Suspendre 45 g de
permet d’isoler les bactéries - - Extrait de viande : 1 g milieu dans 950 mL
de genre Bacillus. - - Mannitol : 10 g d’eau distillée ; -
- - Chlorure de sodium : 10 g Chauffer puis
- - Rouge phénol : 0,025 g stériliser à
- - Agar : 14 g l’autoclave à 121°C
- pH= 7.2 pendant 15 minutes
; - Refroidir à 50°C.
LB Usage Composition pour 1 Litre de Préparation
l’eau distillée
Milieu à large spectre, adapté- -Tryptone :10 g Suspendre 20 g de
pour la culture et la - - Extrait de levure: 5 g milieu dans 1 L
conservation de diverses - - NaCl : 5 g d’eau distillée ;
bactéries. - pH= 7. Homogénéiser,
chauffer puis
stériliser à 121 °C
pendant 15 min ;
refroidir à
température
ambiante.
MH Usage Composition pour 1 Litre de Préparation
l’eau distillée
Gélose riche servant à la Peptone : 17,5 g Dissoudre 38 g du
réalisation des activités Extrait de viande : 2 g milieu dans 1L
antimicrobiennes. Amidon: 1,5 g d’eau distillée.
Agar: 17 g Porter à ébullition
pH : 7,3 en agitant jusqu’à
dissolution
complète.
Autoclaver 15 min
à 121°C
BH Usage Composition pour 1 Litre de Préparation
l’eau distillée
Milieu non sélectif, utilisé Peptone : 10 g Dissoudre 37 g du
pour la culture d’un grand Infusion de cœur de bœuf : 5g milieu dans 1 L
nombre de microorganismes. Glucose : 2 g d’eau distillée.
Chlorure de sodium 5 g Porter à ébullition
Hydrogénophosphate de sodium : en agitant jusqu’à
2,5 g dissolution
pH : 7,4 complète.

X
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

Autoclaver 15 min
à 121°C
Sabouraud Usage Composition pour 1 L d’eau Préparation
distillée
Gélose non sélective utilisée Peptone : 10 g Dissoudre 15 g du
pour cultiver les champignons Agar : 15 g milieu dans 1 L
et plus précisément en pH : 5,6 d’eau distillée.
microbiologie médicale, les Porter à ébullition
levures, les moisissures et les en agitant jusqu’à
dermatophytes dissolution
complète.
Autoclaver 15 min
à 121°C
Chapman Usage Préparation
Composition pour 1 L d’eau
distillée
Milieu sélectif et différentiel Peptone : 10 g Dissoudre 15 g du
employé en microbiologie Extrait de bœuf : 1 g milieu dans 1 L
pour la culture des bactéries Chlorure se sodium : 75 g d’eau distillée.
halophiles et halotolérantes D-mannitol : 10 g Porter à ébullition
Rouge de phénol : 25 mg en agitant jusqu’à
Agar : 15 g dissolution
complète.
Autoclaver 15 min
à 121°C
Cétrimide Usage Préparation pour 1 L d’eau Préparation
distillée
Milieu sélectif et différentiel Peptone de gélatine : 20 g Dissoudre 15 g du
utilisé pour l’isolement et Chlorure de magnésium : 1,4 g milieu dans 1 L
l’identification de Sulfate de potassium : 10 g d’eau distillée.
Pseudomonas aeruginosa à Glycérol : 10 Ml Porter à ébullition
partir d’eau et d’échantillons Agar : 13,6 g en agitant jusqu’à
clinique dissolution
complète.
Autoclaver 15 min
à 121°C

XI
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

ANNEXES 2
Tableau VII: Dénombrement en UFC/mL
Dénombrement après 24 h
Milieux de cultures Echantillons Eaux usées
Mossel 1,82.104 UFC/mL
PCA 1,01.106 UFC/mL
Cétrimide 0,16.102 UFC/mL
EMB 3,44.102 UHC/mL
Chapman 5,2.104 UFC/mL

Dénombrement après 48 h
Milieux de cultures Echantillons Eaux usées
Mossel 2,34.103 UFC/mL
PCA 7,12.107 UFC/mL
Cétrimide 0,2.102 UFC/mL
EMB 3,74.102 UFC/mL
Chapman 5,76.103 UFC/mL

XII
 UNIVERSITE MARIEN NGOUABI
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

N° d’ordre :
Année : 2022

PROJET DE RECHERCHE DE MASTER

Mention : Sciences Techniques

Parcours : Sciences Biologiques

Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire

Option : Biochimie et Microbiologie Appliquée

THEME

Evaluation du Potentiel Bioremédiateur des Bactéries du

genre Bacillus isolées des eaux usées de la Brasserie de
Brazzaville (BRASCO)
Mots clés : Biorémédiation ; Eaux usées ; Bacillus ; interactions bactériennes ;
environnement.

NTSANA Rodinet
DIRECTEUR DE MEMOIRE
KAYATH Aimé Christian, Maître de Conférences CAMES, FST/UMNG (Congo)

CO-DIRECTEUR DE MEMOIRE
DIANZITOUKOULOU MATSIMA Louis Donald, Maître-Assistant CAMES, FST/UMNG
(Congo)
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

1. Contexte et justification
La contamination des sols et des eaux par les hydrocarbures ainsi que par les eaux usées
industrielles est l'une des principales causes des problèmes environnementaux dans le monde
entier ; en raison de leur large distribution, de leur persistance, de leur composition complexe
et de leur toxicité, ce qui entraîne des problèmes de santé publique [1].
Selon l'OMS en 2004, 80 % des maladies qui affectent la population de la planète sont liées à
la pollution des eaux. Aujourd’hui, de nombreuses maladies qui affectent la population de la
planète sont liées en partie à l’insuffisance de l’évacuation des eaux usées domestiques et
industrielles. Ces eaux usées constituant en l'absence d'un traitement efficace et rentable pour
l’environnement un danger croissant pour la santé humaine et le milieu naturel à cause de leurs
charges en matières chimiques toxiques et de micro-organismes pathogènes (bactéries, virus,
parasites [2]. La République du Congo est un pays producteur, exploiteur de pétrole et membre
de l’organisation des pays exportateurs de pétrole dans le monde. Le pétrole représente la
première source de débouchée économique pour le pays. Les besoins croissants en
hydrocarbures, en particulier pour le transport d’automobiles ont été responsable du phénomène
d’expansion et de création de garages et des stations de vidanges peu conformes aux règles de
gestion de l’environnement dans la ville de Brazzaville [1]. Le constat fait, les déchets
(hydrocarbures) générés par ces opérations de vidange et de graissage sont délibérément ou
accidentellement déversés dans l’environnement et ceux-ci sont responsable de l’altération des
milieux aquatique et tellurique [3]. De même, certaines industries brassicoles en République du
Congo, le cas de de la Brasserie du Congo (BRASCO) à Brazzaville, dispose d’un garage de
vidange au sein de la station de traitement des eaux. Cependant, le même constat a été aussi
observé, les déchets de la vidange (hydrocarbures) et de graissage peuvent gagner la station de
traitement au moyen du canal du bassin d’affluent et perturbé le processus d’épuration des eaux
avant leur rejet dans le fleuve Congo [3].
La contamination des sols et des eaux par les hydrocarbures ainsi que par les eaux usées
industrielles est l'une des principales causes des problèmes environnementaux dans le monde
entier.
Vu leur faible dégradabilité, leur nature cancérigène et leur durée de vie très longue, il est
impérative de rechercher des microorganismes possédant des aptitudes de dégrader ces
hydrocarbures afin de les associer à la biorémédiation des sols et des eaux. C’est dans cette
perspective que s’inscrit notre projet d’étude.

XIII
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

2. Problématique
La République du Congo fait partie des pays exploiteur des hydrocarbures.
Cependant, les effluents et déchets issues de ces activités industrielles subissent des traitements
peu adéquats. De même, ces polluants sont parfois occasionnellement ou accidentellement
déversés dans l’environnement et ceux-ci sont responsable de l’altération des écosystèmes des
milieux aquatique et tellurique [1].
La contamination des sols et des eaux par les hydrocarbures organiques et les eaux usées
industrielles est l'une des principales causes des problèmes environnementaux dans le monde,
à cause de leur large distribution, de leur persistance, de leur composition complexe et de leur
toxicité, entraînant aussi de nombreux problèmes en santé publique [3].
Pour la protection de l’environnement et dans le contexte de l’intégration de la République du
Congo aux organismes internationaux, il est impératif d’aligner notre pays sur les exigences de
la politique de protection de l’environnement et aux exigences de traitement biologique des
eaux usées produites par les industries brassicoles, industries pétrolières et autres domaines.
En République du Congo, les approches de biorémédiation sont encore en pleine début d’étude
et seul un travail publié par ELENGA et al en 2021 met en lumière l’application de la
biorémédiation dans la dépollution des sols pollués par les hydrocarbures. C’est dans cet
optique que nous nous sommes proposés comme étude l’évaluation du potentiel biorémédiateur
des bactéries du genre Bacillus.

1. Objectifs
Pour répondre à cette problématique, nous nous sommes fixés les objectifs suivants :

1.1. Objectif général

Evaluer le potentiel biorémédiateur des bactéries du genre Bacillus isolées des eaux usées de la
brasserie de Brazzaville.

1.2. Objectifs spécifiques

 Analyser les paramètres physico-chimiques des eaux usées.
 Caractériser les isolats des eaux usées par les techniques classiques de microbiologie.
 Evaluer le potentiel Biorémédiateur des isolats caractérisés.
1.3. Hypothèses
 Les paramètres physico-chimiques des eaux usées de la brasserie comme le pH, la
conductivité électrique, la DCO et la température peuvent être analyser
 Les eaux usées sont caractérisables par les techniques classiques de microbiologie ;
XIV
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

 Les bactéries du genre Bacillus des eaux usées sont pourvues des aptitudes de
biorémédiation ;

I. MATERIEL ET METHODES
I.1. Matériel

Matériels Biologiques Autres Matériels Milieux de Cultures

Échantillons d’eaux usées La verrerie du laboratoire ;
Milieu Mossel ; PCA (plat count agar) ;
provenant de la brasserie Reactor Block DRB 200
Luria broth (LB) ; Gélose Chapman ;
de Brazzaville (DCO) ;
Gélose EMB ; Gélose Sabouraud ;
Turbidimètre HAZEMETER VOS
Eau physiologique ;
4000 ; pH-mètre L-Pm-04 ;
Conductimètre, marque
yokogawa SC-72 SC Meter

I.2. Méthodologie de l’étude

I.2.1. Analyses physico-chimiques
I.2.1.1. La température
I.2.1.2. Le potentiel d’Hydrogène (pH)
I.2.1.3. La conductivité électrique (CE)
I.2.1.4. La demande chimique en oxygène (DCO)
I.2.1.4. Turbidité

I.3. Méthodes classiques de Microbiologie

I.3.1. Isolement des Bacillus sur milieu Mossel
I.3.1.2. Caractérisation phénotypique de ces isolats

I.3.1.3. Caractérisation macroscopique et microscopique des isolats

I.[Link]. Caractérisation biochimique
I.[Link].1. Test de catalase,
I.[Link].2. Test de Gram (KOH),

II.4. Production enzymatique caséinolytique

I.4. Sélection des isolats produisant des Biomolécules par le test d’émulsification
II.4.1. Extraction des Biomolécules et Test de l’effet antimicrobien des biomolécules
II.4.1.1. Caractérisation biochimique des biosurfactants
XV
 Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

II.5. Test de dispersion d’huile

II.6. Test de tolérance et dégradation aux métaux lourds

II.7. Test de dégradation et tolérance des hydrocarbures
II.8. Etude des interactions microbiennes

III. Résultats attendus

III.1.1. Les analyses des paramètres physico-chimiques des eaux usées sont faites.
III.1.2. Les bactéries sont isolées et caractérisées
III.1.3. L’évaluation du potentiel Biorémédiateur des isolats est réalisée.

III.2. Chronogramme d’activités

Intitule du projet de mémoire de Master
Candidat : NTSANA Rodinet
Directeur de mémoire : KAYATH Aimé Christian
Activités 2022
Juin Juillet Aout Septembre Octobre Novembre
Elaboration du projet de recherche
Recherche documentaire
Analyse des paramètres physico-

Soutenance
Demande de
chimiques des eaux usées
Caractérisation des isolats des eaux
usées par les techniques classiques
de microbiologie
Evaluation du potentiel
Biorémédiateur des isolats
caractérisés
Rédaction du mémoire et correction

II.2. Modalité de diffusion des résultats

Les résultats issus de ces travaux feront l’objet :
 Publication des articles scientifiques
 Communication Scientifique
 Soutenance publique

II.3. Financement
Ce projet de recherche est financé par un collectif d’enseignants de l’Université Marien
NGOUABI et l’institut de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN).

XVI

5
Rodinet NTSANA : MEMOIRE DE MASTER/Faculté des Sciences et Techniques/UMNG

II.4. Structures impliquées

Les différentes activités de ce projet seront exécutées au sein des laboratoires de Microbiologie
Appliquée et de Biologie Moléculaire de l’institut de Recherche en Sciences Exactes et
Naturelles (IRSEN de Brazzaville) et au laboratoire de traitement des eaux de la brasserie de
Brazzaville (BRASCO), République du Congo.

XVII
 Résumé
Dans le but d’évaluer le potentiel biorémédiateur des bactéries du
genre Bacillus isolées des eaux usées de la brasserie de Brazzaville
(BRASCO), 42 isolats de Bacillus ont été obtenus puis caractérisés
par les techniques classiques de microbiologie comme les critères
morphologiques (macroscopie et microscopie), les critères
biochimiques (le test de Gram et le test de catalase) et un test
sporulation. Les capacités de ces 42 bactéries à produire les
protéases et les biosurfactants ont été testé. 90,47 % des isolats ont
été aptes à produire les protéases. De même, 78,57 % ont été
capables de produire les biosurfactants avec les index d’émulsification variant de 5 % à 100 %.
Les biosurfactants extraits ont été capables d’inhiber la croissance des bactéries telles que
Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Bacillus Cereus et Escherichia coli isolées des eaux
usées. De même, ces biosurfactants ont été capable de disperser les hydrocarbures comme
l’essence, le gasoil et l’huile à moteur SAE 40. Une partie de ces biosurfactants était de nature
glycolipidique. Les isolats testés sont susceptibles à dégrader les hydrocarbures comme
l’essence, le gasoil, l’huile à moteur SAE 40 et la vaseline. Ces isolats ont été capables de de
croitrent à différentes concentrations de sept métaux lourds comme le nickel, le plomb, le
cuivre, le mercure, le cobalt, l’argent et le zinc. Les interactions entre les isolats de Bacillus et
les bactéries pathogènes sont de nature compétitive.
Mots clés : Biorémédiation ; Eaux usées ; Bacillus ; interactions bactériennes ; environnement.

Abstract
In order to assess the bioremedial potential of bacteria of the Bacillus genus isolated from
wastewater from the Brazzaville brewery (BRASCO), 42 Bacillus isolates were obtained and
then characterized by conventional microbiology techniques such as morphological criteria
(macroscopy and microscopy), biochemical criteria (the Gram test and the catalase test) and a
sporulation test. The capacities of these 42 bacteria to produce proteases and biosurfactants
were tested. 90.47% of the isolates were able to produce proteases. Similarly, 78.57% were able
to produce biosurfactants with emulsification indexes ranging from 5% to 100%. The extracted
biosurfactants were to inhibit the growth of bacteria such as Pseudomonas sp., Staphylococcus
sp., Bacillus Cereus and Escherichia coli isolated from wastewater. Similarly, these
biosurfactants were to disperse hydrocarbons such as gasoline, diesel and SAE 40 motor oil.
Some of these biosurfactants were glycolipid in nature. The isolates tested are likely to degrade
hydrocarbons such as gasoline, diesel, SAE 40 motor oil and petroleum jelly. These isolates
were able to grow at different concentrations of seven heavy metals such as nickel, lead, copper,
mercury, cobalt, silver and zinc. Interactions between Bacillus isolates and pathogenic bacteria
are competitive in nature.
Keywords: Bioremediation; Waste; Bacillus; bacterial interactions; environment.