Les cytokines : terme introduit par Cohen et coll.

en
1974 regroupent les anciens termes de lymphokines
et monokines.
Petites protéines, le plus souvent glycosylées,
messagers solubles représentant le langage des
cellules immunitaires. Elles sont produites de
manière basale par de très nombreuses cellules de
l'organisme et seront produites en quantité
beaucoup plus importantes par des cellules activées
(cellules immuno-compétentes), suite à une
agression ou un stress quelconque.
Clés esentielles à la compréhension de la
communication cellulaire au sein du système
immunitaire, et de ses relations avec d’autres
systèmes, les cytokines sont également des outils et
des cibles de l’immuno-intervention.
Différences entre cytokines et hormones ?

cytokines = messagers du système immunitaire.

hormones = messagers du système endocrine.
III- Récepteurs des cytokines et transduction du signal:
2 types de récepteurs existent:
- R. membranaires.
- R. solubles.
A. Transduction du signal via les récepteurs
membranaires:
La liaison de la cytokine au récepteur va activer plusieurs
voies de signalisation :
-La voie de la MAPK qui va entrainer la localisation de
Ap-1 dans le noyau.
-La voie NF-κB.
- « La voie JAK-STAT ».
 Remarque:
Les
différentes
combinaisons
entre JAK
(1,2,3, TyK2)
et STAT (1 à 7)
induisent des
réponses
cellulaires
différentes
(transcription
de gènes
différents).
Plusieurs classifications existent:
 Celle basée sur « la fonction ».
 Celle basée sur la structure.
Six familles de cytokines:
 Les interleukines (IL-1 à IL-39).
 Les interférons (Type I: α/β, type II: γ et type III: λ).
 Colony stimulating factors (G-CSF, M-CSF, GM-CSF).
 Transforming growth factors (TGF-β).
 Chémokines (C, CC, CXC, CX3C).
 Tumor necrosis factors (TNF-α).
 Depuis la découverte des cytokines, et au fur
et à mesure que se sont enrichies nos
connaissances sur les propriétés de ces
nouvelles molécules, s’est formé le concept
que les cytokines n’étaient pas seulement
des outils commodes pour la culture
cellulaire mais devaient être les médiateurs
physiologiques des communications
intercellulaires concourant à l’homéostasie
et utilisables en clinique. Cette prise de
conscience, commencée à propos de l’IL-2,
s’élargit à l’ensemble des cytokines bientôt
perçues comme un réseau interactif
complexe.
Un bref panorama des principales cytokines
thérapeutiques et leurs domaines
d’application clinique peut être dressé.
 L’aide à la reconstitution de la moelle:
L’érythropoïétine (EPO), le G-CSF et le GM-CSF sont
certainement (et de loin) les cytokines les plus
utilisées en clinique. Ces trois facteurs qui stimulent
la prolifération des cellules souches de la moelle
osseuse (cellules souches érythrocytaires pour EPO et
myéloïdes pour les CSF) sont, en effet, des produits
remarquables pour hâter la reconstitution
hématologique en globules rouges ou en
polynucléaires de patients traités par des fortes
doses de chimiothérapie. L’utilisation de ces
cytokines a rendu possible la mise au point de
protocoles antitumoraux plus agressifs sans
inconvénient pour les malades. Plusieurs études sont
en cours pour évaluer l’incidence positive de ces
facteurs sur la survie à long terme des patients.
La chimiothérapie peut aussi induire une thrombopénie.
Cette réduction du nombre des plaquettes constitue
une sérieuse limitation à certains protocoles.
Plusieurs compagnies ont en développement les
cytokines IL-3, IL-6 et IL-11 qui ont été reconnues
capables de stimuler la thrombopoïèse.
 L’immunothérapie anti-tumorale:
Plusieurs cytokines sont utilisées pour traiter
les patients atteints de tumeur. Au premier
rang vient évidemment l’IL-2.
L’administration d’IL-2 reste indiquée comme
ultime recours dans les mélanomes malins et
les cancers du rein permettant une
prolongation significative de la survie des
patients.
 L’utilisation de cytokines en pathologies
infectieuses et inflammatoires:
Une utilisation particulièrement remarquable de
l’IFNα, est le traitement des hépatites
chroniques B ou C.
L’utilisation de cytokines dans le déficit
immunitaire au cours de l’infection au VIH est
considérée avec prudence. En effet, le
rétablissement des fonctions immunes
déficientes est souhaitable, mais les causes de
ce dysfonctionnement sont mal comprises et les
modifications de l’équilibre des cytokines sont
encore l’objet d’investigations fondamentales et
de discussions. Différents protocoles cliniques
expérimentaux ont débuté ou sont projetés :
faibles doses d’IL-2, IL-4, IL-12.
Il est enfin un nouveau champ d’application des
cytokines qui se développe et paraît potentiellement
extrêmement intéressant : « la modulation
intentionnelle contrôlée » de l’équilibre des
cytokines. En effet, dans de nombreuses situations
pathologiques comme l’inflammation aiguë ou les
maladies autoimmunes et leur cortège
d’inflammation chronique, l’équilibre des cytokines
s’écarte de son équilibre homéostasique et amplifie
le désordre pathologique. L’inhibition ou la
neutralisation des cytokines IL-1 et TNF, qui jouent
un rôle particulier dans l’inflammation, a été réalisée
par divers produits recombinants ou issus des
biotechnologies. Les stratégies utilisées ont reposé
sur l’utilisation de l’inhibiteur physiologique de l’IL-1
(IL-1 récepteur antagoniste = IL-1 ra), du récepteur
soluble de l’IL-1, de molécules hybrides comportant
la partie du récepteur soluble du TNF fixant le ligand,
et enfin d’anticorps (généralement humanisés).
Une autre stratégie anti-inflammatoire est
théoriquement possible. En effet l’étude des
propriétés distinctives des lymphocytes T
auxiliaires de type Th2 et Treg a montré que
les cytokines qu’ils sécrètent inhibent la
réponse Th1 et l’inflammation. Ces résultats
ont permis de démontrer dans les modèles
expérimentaux l’efficacité des cytokines IL-
10, IL-4 et IL-13 pour améliorer ou guérir
différentes maladies auto-immunes et
inflammatoires. Inspirés de ces résultats
quelques essais cliniques débutent ou sont
programmés notamment avec l’IL-10
(polyarthrite, maladie de Crohn), puis l’IL-4
(polyarthrite)
 Lescytokines recombinantes sont identiques
ou très proches de la cytokine native par leur
composition en acides aminés. Elles peuvent
en différer de façon importante de par leur
glycosylation, sur un plan quantitatif
(glycosylée ou non) ou qualitatif.
1. Rôle:
 I'EPO a été identifiée comme le principal facteur
de croissance de la lignée érythrocytaire.
Synthétisée dans le foie chez l'embryon, puis
dans le rein chez l'adulte, cette glycoprotéine
est libérée dans la circulation sanguine pour
exercer son activité dans la moelle osseuse, sur
les progéniteurs érythroïdes, qui portent des
récepteurs membranaires spécifiques. Elle y
stimule leur prolifération et différenciation en
globules rouges matures (processus durant 5 à 9
jours) et participe ainsi à la régulation de
l'érythropoïèse par un effet dose-dépendant lié à
sa concentration dans le sang.
 La production d'EPO est stimulée par la
diminution du taux d'oxygène disponible pour
les tissus (détectée par des récepteurs
rénaux sensibles à la pression en oxygène).
 L'EPO est classés dans la classe des cytokines, molécules
définies comme étant généralement produites par les cellules
immunitaires et ayant une action sur ce système ainsi que sur
l'hématopoïèse. Cette classe de messagers chimiques se
distingue globalement des hormones par certaines
caractéristiques évoquées précédemment. Cela dit, il existe
des discussions entre spécialistes sur l'étendue de cette classe
et les messagers qui doivent y figurer.
 Concernant l'EPO, cette cytokine a pour particularité de ne pas
être produite par des cellules du système immunitaire. Cela
dit, elle partage une structure secondaire commune avec de
nombreuses cytokines, au sein de la sous-famille de type IL-2.
Cette structure secondaire se caractérise par la présence de 4
hélices alpha. Par ailleurs, la structure du récepteur à l'EPO est
également commune avec les récepteurs des cytokines de types
1 et 2 (un dimère avec sur chaque monomère un domaine
d'activation de la voie de signalisation JAK/STAT). Le domaine
cytoplasmique C-ter possède un domaine de liaison à la
protéine kinase JAK qui va phosphoryler le récepteur à l'EPO,
permettant la fixation du facteur de transcription STAT qui est
à son tour phosphorylé par JAK. STAT sous forme phosphorylé va
se dimériser et migrer vers le noyau pour agir sur la
transcription.
2. Structure:
 L’EPO naturelle est une protéine fortement
glycosylée puisque sa fraction glycannique
représente environ 40% de sa composition
globale. L'EPO circulante est composée d'une
chaîne de 165 acides aminés. Son poids
moléculaire correspond à environs 30.4 kDa.
 Leclonage du gène de l'EPO humaine réalisé
en 1985, a permis de produire la cytokine
recombinante par culture de cellules CHO.
Celle-ci est commercialisée depuis 1988 sous
deux formes: « Epoetin-α et β », et est
maintenant largement utilisée en
thérapeutique humaine, notamment pour
redresser les anémies secondaires aux
insuffisances rénales chroniques. Son action
serait également très bénéfique dans
plusieurs autres pathologies, telles que
certains cancers, le SIDA et la polyarthrite
rhumatoïde.
 Notons également qu'un analogue de l'EPO, la
darbopoietine α, est récemment arrivé sur
le marché. Grâce à la modification par
"glyco-engineering", de certains acides
aminés de la chaine peptidique d'origine, des
sites de glycosylation supplémentaires ont
été générés et cette molécule comporte ainsi
5 chaînes N-glycanniques, ce qui lui permet
d'avoir une activité biologique in vivo plus
élevée et une durée d'action plus longue
dans l'organisme; le nombre de prises
hebdomadaires du médicament par le patient
s'en trouve par conséquent significativement
réduit.
3. Procédés de production:
 Systèmes d'expression: Les cellules
ovariennes de hamster chinois (CHO) sont les
hôtes de choix des différents procédés de
production commerciale de l'EPO
recombinante. En effet, les cellules CHO sont
utilisées pour produire les deux formes
pharmaceutiques principales (epoetin α et
β). Cette lignée cellulaire permet d'obtenir
les productivités les plus élevées tout en
assurant une fidélité de glycosylation
satisfaisante par rapport à l’EPO naturelle.
Plusieurs systèmes de culture en masse en
bioréacteur ont été mis au point. La culture
peux se faire en continu ou en discontinu.
 Purification:
Plusieurs types de procédés de purification de
l'EPO ont été mis au point.
La méthode de référence (Miyake et al., 1977)
comprend 7 étapes: chromatographie par
échange d'anions (DEAE-agarose),
précipitation à l'éthanol, traitement au
phénol, chromatographie par échange de
cations (sulfopropyl-sephadex), gel filtration
(sephadex G-100) et chromatographie
d'adsorption (hydroxylapatite).
 Il existe plusieurs isoformes de l'EPO,
définies par le nombre de molécules d'acide
sialique, leur comportement biologique et
leur demi-vie. Dès 1988, deux formes
d'érythropoïétines recombinantes humaines
(rHuEPO) sont disponibles comme outils
thérapeutiques. Il s'agit de l'époétine alpha
et bêta, c'est-à-dire la rHuEPO et sa version
améliorée. Il s’agit de la première génération
d'époétine. L' EPO recombinant est une copie
du gène de l'EPO naturelle, elle a donc les
mêmes caractéristiques chimiques que son
modèle. Le principal inconvénient de cette
EPO recombinante est la fréquence des
injections nécessaires car il en faut trois par
semaine pour être efficace.
 La NESP (novel erythropoiesis stimulating
protein), deuxième génération de rHuEPO,
est considérée comme la RhuEPO la plus
connue. Elle est égalment connue sous le
nom de Darbepoetin alpha se distingue par
la présence de vingt-deux molécules d'acide
sialique ce qui diminue sa clairance et rend
sa demi-vie 2 à 3 fois plus longue.
 L'utilisation à des fins thérapeutiques de
cytokines recombinantes pose toutefois un
certain nombre de problèmes.
Tout d'abord, il s'agit d'une thérapeutique pour
l'instant coûteuse et dont la voie
d'administration incontournable est la voie
parentérale. Or, la demi-vie des cytokines est
en général courte, de l'ordre de quelques
heures. Ceci constitue un obstacle à leur
utilisation, par exemple dans des pathologies
chroniques et, a fortiori, dans des pays en
développement qui sont pourtant des
candidats potentiels importants à ce type
d'intervention.
Ensuite, le rapport entre les effets thérapeutiques observés
et les effets secondaires n'est pas optimal. Ceci tient au
fait que les cytokines sont naturellement des médiateurs
d'action loco-régionale, ayant un maximum d'effets au
niveau de leur site de production et peu d'effets de type
systémique. Or, l'administration actuelle des cytokines par
voie parentérale revient à hypertrophier les manifestations
de type endocrinien, presque toujours néfastes, par
rapport à l'effet thérapeutique recherché, loco-régional.
D'où l'intérêt des nouvelles modalités d'administration,
actuellement en cours d'étude, visant à corriger ce
déséquilibre.
L'administration de cytokines recombinantes par voie sous-
cutanée, plutôt que par voie intraveineuse, constitue
également un progrès important. Enfin, de nouvelles
formulations sont en cours d'investigation clinique, afin
d'accroître la durée de vie des cytokines injectées. On
peut donc espérer voir se dégager, dans les prochaines
années, de meilleures indications des traitements par
cytokines recombinantes et, surtout, de nouvelles
modalités d'administration qui permettront d'améliorer la
tolérance et l'efficacité de ces drogues.
 Dans certaines situations, on cherche à inhiber l'effet délétère des
cytokines produites naturellement. Plusieurs types d'antagonistes de
cytokines sont actuellement à l'étude.
 Parfois, ces antagonistes sont des cytokines elles-mêmes
recombinantes. C'est par exemple le cas de l'IL10, lorsqu'elle est
administrée à des patients atteints de maladie de Crohn dans un but
anti-inflammatoire et pour diminuer les réactions granulomateuses
induites par le TNF-alpha, l'interféron gamma et l'IL12 produits au
sein des lésions.
 Il peut également s'agir de récepteurs solubles de cytokines. Ces
substances, en se fixant sur les cytokines circulantes, vont empêcher
l'action de ces dernières sur leurs récepteurs membranaires. Par
exemple, les récepteurs solubles du TNF sont actuellement évalués
pour leurs propriétés anti-inflammatoires, dans la polyarthrite
rhumatoïde et dans la maladie de Crohn. Ils ont été greffés par
génie génétique sur des charpentes protéiques venant
d'immunoglobulines afin d'en prolonger la demi-vie.
 Un autre type d'antagonistes de cytokines est représenté par des
anticorps monoclonaux. En se fixant sur les cytokines circulantes, ils
vont bloquer leur effet. C'est ainsi que les anticorps anti-TNF ont
démontré leur activité anti-inflammatoire dans la polyarthrite
rhumatoïde et les anti-IL6 dans la maladie de Castleman et les
syndromes lymphoprolifératifs.
 Enfin, plus récemment, sont apparues des
protéines recombinantes qui correspondent à
des cytokines mutées : elles ont gardé la
capacité de se fixer sur le récepteur de la
cytokine mais ont perdu tout effet agoniste. De
ce fait, elles agissent comme des inhibiteurs
des cytokines naturelles, par simple
compétition. Il faut, en particulier, mentionner
la création récente de chimiokines mutées qui
présenteraient des propriétés à la fois anti-
inflammatoires et inhibitrices de la pénétration
intracellulaire du VIH (ce virus utilisant les
récepteurs des chimiokines pour infecter les
cellules).
 Les différents antagonistes de cytokines
mentionnés jusqu'à présent ont tous un
inconvénient : ils sont de nature protéique et,
donc, particulièrement coûteux et nécessitant
une voie parentérale d'administration. Il est
extrêmement vraisemblable que nous verrons
apparaître, dans les prochaines années, d'autres
substances, non protéiques et administrables par
voie orale, se fixant sur les récepteurs de
cytokines et bloquant leur effet. De fait, un
certain nombre de ces composés sont déjà en
cours d'investigation, comme des antagonistes
des récepteurs des chimiokines.