Elucidation du métabolisme des microorganismes par la

modélisation et l’interprétation des données

d’essentialité de gènes. Application au métabolisme de
la bactérie Acinetobacter baylyi ADP1.
Maxime Durot

To cite this version:

Maxime Durot. Elucidation du métabolisme des microorganismes par la modélisation et
l’interprétation des données d’essentialité de gènes. Application au métabolisme de la bactérie Acineto-
bacter baylyi ADP1.. Biochimie [q-bio.BM]. Université d’Evry-Val d’Essonne, 2009. Français. �NNT :
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 2009EVRY0017

ÉLUCIDATION DU METABOLISME DES

MICROORGANISMES PAR LA MODELISATION ET
L’INTERPRETATION DES DONNEES
D’ESSENTIALITE DE GENES.

APPLICATION AU METABOLISME DE LA BACTERIE

ACINETOBACTER BAYLYI ADP1.

MAXIME DUROT

Thèse de Doctorat
Spécialité : Bioinformatique, biologie structurale et génomique

Université Evry Val d’Essonne

École doctorale : Des génomes aux organismes

Soutenue le 12 octobre 2009 devant le jury composé de :

Jean-Pierre MAZAT rapporteur

Stefan SCHUSTER rapporteur
Antoine DANCHIN examinateur
Eytan RUPPIN examinateur
Vincent SCHACHTER directeur de thèse
Jean WEISSENBACH directeur de thèse
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

RESUME

Deux échelles d’observations sont traditionnellement utilisées pour étudier le

métabolisme des microorganismes: d’une part, à l’échelle locale, la caractérisation
individuelle des réactions ayant lieu dans la cellule et d’autre part, à l’échelle globale,
l’étude de la physiologie de la cellule. Ces deux échelles ont bénéficié de progrès
technologiques récents : l’analyse des génomes séquencés permet d’identifier une
large fraction des enzymes catalysant les réactions ; la physiologie des
microorganismes peut être étudiée à haut débit pour de nombreux environnements et
perturbations génétiques. Cependant, l’exploitation conjointe de ces deux échelles
demeure complexe car le comportement physiologique global de la cellule résulte de
l’action coordonnée de nombreuses réactions. Les approches de modélisation
mathématique ont toutefois récemment permis de relier ces deux échelles à l’aide de
modèles globaux du métabolisme.
Dans cette thèse, nous explorerons l’utilisation de ces modèles pour compléter la
connaissance des réactions à l’aide d’une catégorie particulière de données d’échelle
globale : les essentialités de gènes déterminées en observant les phénotypes de
croissance de mutants de délétion. Nous nous appuierons pour cela sur la bactérie
Acinetobacter baylyi ADP1 pour laquelle une collection complète de mutants de
délétion a été récemment constituée au Genoscope.
Après avoir présenté les étapes clés et les développements que nous avons effectués
pour reconstruire un modèle global du métabolisme d’A. baylyi, nous montrerons que
la confrontation entre phénotypes observés et phénotypes prédits permet de mettre en
évidence des incohérences entre les deux échelles d’observations. Nous montrerons
ensuite qu’une interprétation formelle de ces incohérences permet de corriger le
modèle et d’améliorer la connaissance du métabolisme. Nous illustrerons ce propos
en présentant les corrections que nous avons réalisées à l’aide des phénotypes de
mutants d’A. baylyi. Enfin, dans une dernière partie, nous proposerons une méthode
permettant d’automatiser la correction des incohérences causées par des erreurs
d’association entre gènes et réactions.

3
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

ABSTRACT

Model-based investigation of microbial metabolism to interpret gene

essentiality results, illustrated on Acinetobacter baylyi ADP1
metabolism.

Microbial metabolism has traditionally been investigated at two different scales: the
finest involves characterizing individually each reaction occurring in the cell; the
largest focuses on global cell physiology. Both scales have recently benefited from
technological advances: analyzing sequenced genomes identifies a large fraction of
reaction-catalyzing enzymes; cell physiology can be determined at high-throughput
for several environmental conditions and genetic perturbations. Combining both
scales remains, however, especially complex as the global physiological behavior of a
cell results from the coordinated action of a large network of reactions. Mathematical
modeling approaches have yet shown recently that genome-scale metabolic models
could help in linking both scales.
In this thesis, we explore the use of such models to expand the knowledge of reactions
with a specific type of high-level data: gene essentiality data, assessed using growth
phenotypes of deletion mutants. We will use as model organism the bacterium
Acinetobacter baylyi ADP1, for which a genome-wide collection of gene deletion
mutants has recently been created.
Following a presentation of the key steps and developments that have been required to
reconstruct a global metabolic model of A. baylyi, we will show that confronting
observed and predicted phenotypes highlight inconsistencies between the two scales.
We will then show that a formal interpretation of these inconsistencies can guide
model corrections and improvements to the knowledge of metabolism. We will
illustrate this claim by presenting model corrections triggered by A. baylyi mutant
phenotypes. Finally, we will introduce a method that automates the correction of
inconsistencies caused by wrong associations between genes and reactions.

5
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier en premier lieu Vincent Schachter, pour m'avoir tout d'abord
convaincu d'entreprendre cette thèse puis guidé scientifiquement ces quatre années. Il
aura été le garant de la présence de développements méthodologiques et théoriques
dans mes travaux, sachant me faire prendre du recul à bon escient lorsqu’il m’arrivait
de me perdre dans les détails de la biochimie d’Acinetobacter baylyi.
Professionnellement, je lui suis largement redevable de m'avoir introduit dans la vie
scientifique internationale à travers les collaborations, projets européens, séminaires
et conférences auxquels il m'a associé.

Je remercie de même Jean Weissenbach pour avoir accepté de diriger ma thèse et

permis le développement de mon sujet de recherche, relativement original au
Genoscope. Mes travaux se sont fondés sur les nombreux échanges qu’il aura su
favoriser avec les équipes expérimentales du laboratoire.

Un très grand merci à tous les membres de l’équipe Nemo, présents et passés, avec
qui j’ai travaillé au quotidien et pu échanger des idées sur mes travaux : F. Le Fèvre,
B. Pinaud, S. Smidtas, C. Combe, M. Heinig, V. Sabarly, P-Y. Bourguignon, G.
Vieira et R. Baran. Merci en particulier à François Le Fèvre avec qui j’ai partagé la
lourde tâche de parcourir le métabolisme entier d’A. baylyi et pour ses
encouragements de collègue de bureau.

Je remercie vivement l’ensemble de l’équipe Thesaurus Métabolique du

Genoscope, et en particulier Véronique de Berardinis et Marcel Salanoubat, pour

7
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

avoir apporté de la « réalité expérimentale » à mes travaux. Merci d’avoir passé de

longues heures à m’aider à mieux comprendre les habitudes d’A. baylyi et de ses
mutants !

Je remercie également Alain Perret et Christophe Lechaplais pour leurs

contributions expérimentales à cette thèse, ainsi qu’Annett Kreimeyer et Georges
Cohen pour avoir pris le temps de puiser dans leur formidable connaissance du
métabolisme pour répondre à mes questions.

Merci à l’Atelier de Génomique Comparative, et en particulier à David Vallenet

pour m’avoir donné une loupe pour explorer les génomes bactériens et à Claudine
Médigue pour m’avoir permis de conclure ma thèse dans son équipe.

L’aide de l’équipe informatique du Genoscope m’aura souvent été précieuse,

merci à eux pour leur support et leurs conseils.

Je remercie les membres du jury pour m’avoir fait l’honneur de leur présence à ma
soutenance et m’avoir aidé, par leur remarques et conseils, à améliorer mon
manuscrit.

Je suis très reconnaissant envers le Genoscope et le CEA pour m'avoir permis de

réaliser cette thèse conjointement avec mes activités professionnelles.

Enfin, un grand merci pour leur soutien sans faille à mes parents, ma sœur, ma
belle-famille et l’ensemble de mes proches que je ne saurai lister ici. Et, plus que tout,
merci à ma femme, Marie-Perrine, pour son amour qui aura toujours su me remotiver
dans les moments difficiles et pour avoir mené de front avec succès préparation de
mariage et soutien de conjoint en rédaction de thèse !

8
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

TABLE DES MATIERES

RESUME ........................................................................................................................................................3
ABSTRACT ...................................................................................................................................................5
REMERCIEMENTS ....................................................................................................................................7
TABLE DES MATIERES ...........................................................................................................................9
AVANT-PROPOS .......................................................................................................................................13
INTRODUCTION.......................................................................................................................................17
1 LE METABOLISME : LA CHIMIE DU VIVANT .......................................................................17
1.1 QUELQUES FAITS REMARQUABLES ................................................................................................17
1.2 LES ACTEURS DU METABOLISME ....................................................................................................22
1.2.1 Métabolites .............................................................................................................................22
1.2.2 Réactions ................................................................................................................................23
1.2.3 Enzymes ..................................................................................................................................24
1.2.4 Cinétique des réactions métaboliques ..................................................................................25
1.2.5 Contrôle des réactions métaboliques ...................................................................................28
1.2.6 Aspects thermodynamiques ...................................................................................................29
1.3 STRUCTURE ET ORGANISATION DU METABOLISME .......................................................................31
1.3.1 Le réseau métabolique...........................................................................................................31
1.3.2 Organisation globale du métabolisme..................................................................................34
1.4 METHODES D’EXPLORATION DU METABOLISME ...........................................................................37
1.4.1 Élucidation expérimentale des voies métaboliques .............................................................37
1.4.2 Méthodes bioinformatiques de reconstruction des réseaux métaboliques.........................39
1.4.3 Vers une étude globale du métabolisme ...............................................................................41
2 PHENOTYPES DE CROISSANCE ET ESSENTIALITE DE GENES .....................................44
2.1 PHENOTYPES DE CROISSANCE ........................................................................................................44
2.2 EXPLORATION GENETIQUE DES PHENOTYPES DE CROISSANCE .....................................................46
2.2.1 Techniques expérimentales ...................................................................................................47
2.2.2 Exploitation des données d’essentialité................................................................................53
3 MODELISATION DU METABOLISME .......................................................................................56
3.1 APPROCHES DE MODELISATION DU METABOLISME .......................................................................57
3.2 LES MODELES A BASE DE CONTRAINTES : RECONSTRUCTION ET APPLICATIONS .........................63
3.2.1 Article de revue ......................................................................................................................64
3.2.2 Compléments méthodologiques ............................................................................................65
3.3 MODELISATION DU METABOLISME ET PHENOTYPES DE CROISSANCE: ETAT DE L’ART ...............71
3.3.1 Modèles à base de graphe.....................................................................................................71

9
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

3.3.2 Modèles à base de contraintes..............................................................................................72

4 NOTRE ORGANISME MODELE : ACINETOBACTER BAYLYI ADP1 .................................73
4.1 CARACTERISTIQUES REMARQUABLES............................................................................................73
4.2 ANNOTATION DU GENOME .............................................................................................................76
4.3 COLLECTION DE MUTANTS DE DELETION ......................................................................................79
5 SYNTHESE ET OBJECTIFS DE LA THESE ...............................................................................83
RECONSTRUCTION D’UN MODELE GLOBAL DU METABOLISME D’ACINETOBACTER
BAYLYI ADP1 .............................................................................................................................................85
6 PROCESSUS DE RECONSTRUCTION.........................................................................................85
6.1 IDENTIFICATION DES ACTIVITES METABOLIQUES ..........................................................................88
6.2 ADAPTATION AUX « CONTRAINTES » DE MODELISATION .............................................................93
6.2.1 Fonctionnement des voies métaboliques ..............................................................................93
6.2.2 Équilibre des équations bilans..............................................................................................95
6.2.3 Conservation de l’énergie .....................................................................................................96
6.2.4 Localisation cellulaire.........................................................................................................101
6.2.5 Spécificité des métabolites ..................................................................................................102
6.2.6 Réversibilité des réactions ..................................................................................................105
6.2.7 Associations gènes-réactions ..............................................................................................106
6.2.8 Composition de la biomasse................................................................................................108
7 LE MODELE D’ACINETOBACTER BAYLYI .............................................................................116
7.1 COMPOSITION METABOLIQUE GLOBALE ......................................................................................117
7.2 PREDICTIONS QUANTITATIVES DE CROISSANCE ..........................................................................120
7.2.1 Comparaison des prédictions de taux de croissance à des mesures expérimentales......120
7.2.2 Sensibilité des prédictions de taux de croissance aux paramètres énergétiques ............124
7.3 DISPONIBILITE DU MODELE ..........................................................................................................126
EXPLOITATION DES PHENOTYPES DE CROISSANCE DE MUTANTS PAR LE MODELE
......................................................................................................................................................................129
8 ARTICLE : « ITERATIVE RECONSTRUCTION OF A GLOBAL METABOLIC MODEL
OF ACINETOBACTER BAYLYI ADP1 USING HIGH-THROUGHPUT GROWTH
PHENOTYPE AND GENE ESSENTIALITY DATA » .....................................................................130
9 SYNTHESE.........................................................................................................................................131
9.1 LE MODELE CONFRONTE EFFICACEMENT DONNEES PHENOTYPIQUES ET CONNAISSANCE DU
METABOLISME .........................................................................................................................................131
9.2 CADRE FORMEL D’INTERPRETATION DES INCOHERENCES ..........................................................133
9.3 EXPLOITATION DES INCOHERENCES NON CORRIGEES .................................................................135
9.4 LIMITES .........................................................................................................................................137
9.4.1 Interprétation des phénotypes de croissance faible...........................................................137
9.4.2 Incohérences d’origine métabolique non prises en compte..............................................140
10 EXTENSION DE L’INTERFACE WEB DE PREDICTION A D’AUTRES
ORGANISMES : CYCSIM .....................................................................................................................142
AUTOMATISATION DE L’INTERPRETATION DES INCOHERENCES D’ORIGINE
GENETIQUE.............................................................................................................................................144
11 LA METHODE AUTOGPR ..........................................................................................................144
11.1 PRINCIPE .....................................................................................................................................144
11.2 ALGORITHMES ............................................................................................................................154
11.2.1 Génération exhaustive des corrections GPR ...................................................................154
11.2.2 Test d’existence de correction GPR .................................................................................161
12 RESULTATS ....................................................................................................................................162
12.1 COMPLEXITE DES GPR DANS LES MODELES METABOLIQUES ...................................................164
12.2 STATISTIQUES GLOBALES SUR LES PROPOSITIONS D’AUTOGPR..............................................170
12.2.1 Confrontation des modèles aux données d’essentialité...................................................170

10
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

12.2.2 Tests simples d’existence de correction GPR ..................................................................172

12.2.3 Proposition exhaustive de corrections GPR ....................................................................176
12.3 COMPARAISON DES CORRECTIONS D’AUTOGPR AUX INTERPRETATIONS EXPERTES..............180
12.3.1 Comparaison aux corrections des modèles d’A. baylyi ..................................................181
12.3.2 Comparaison aux interprétations expertes des modèles de B. subtilis et S. cerevisiae 186
13 LIMITES ET PERSPECTIVES....................................................................................................191
13.1 REDUCTION DE LA COMBINATOIRE DES PROPOSITIONS DE CORRECTION .................................191
13.2 AMELIORATION DE LA SPECIFICITE POUR LES CORRECTIONS DE GENES NON-ESSENTIELS......192
13.3 AU DELA DES TROIS HYPOTHESES FONDAMENTALES D’AUTOGPR .........................................193
13.3.1 Associations gène-réaction prédéfinies............................................................................193
13.3.2 Composantes RESEAU et BIOMASSE fixes ....................................................................194
13.3.3 GPR constantes sur tous les milieux ................................................................................195
13.4 PERSPECTIVES D’UTILISATION DES DELETIONS MULTIPLES......................................................195
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................................................197
14 CONTRIBUTIONS PRINCIPALES ............................................................................................197
15 REVUE DE TRAVAUX SUR LE MEME SUJET EFFECTUES SUR LA PERIODE DE LA
THESE (2005–2009) .................................................................................................................................199
16 PERSPECTIVES .............................................................................................................................202
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..............................................................................................205
ANNEXE ....................................................................................................................................................227

11
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

AVANT-PROPOS

Les organismes vivants sont tous de formidables chimistes aux capacités souvent
insoupçonnées. Chaque cellule est le siège d’un nombre considérable de réactions qui
lui permettent de créer les molécules nécessaires à sa vie à partir des molécules de son
environnement. Cet ensemble de réactions biochimiques, que l’on appelle le
métabolisme des cellules, a attiré depuis longtemps la curiosité de l’homme. Non
seulement, d’un point de vue fondamental, il est essentiel d’aborder la chimie des
cellules pour en comprendre leur fonctionnement et leurs interactions avec le milieu
extérieur, mais également, d’un point de vue pratique, l’utilisation de leurs
métabolismes occupe une place significative dans les activités humaines. De la
fermentation alcoolique à la synthèse de biocarburants en passant par l’épuration des
eaux usées, les compétences biochimiques des organismes offrent des solutions
technologiques à de nombreux besoins.

Cette thèse aborde l’étude du métabolisme de manière pluridisciplinaire, associant

biochimie, génétique et modélisation mathématique. Traditionnellement, deux
échelles d’observations sont utilisées pour appréhender le métabolisme. D’une part,
les approches classiques de biochimie permettent de caractériser la chimie des
réactions ayant lieu dans les cellules. Ainsi au cours des dernières décennies et encore
aujourd’hui, un nombre croissant de réactions métaboliques sont élucidées de cette
manière, principalement chez les quelques organismes modèles. D’autre part, à une
échelle plus grande, l’observation de la physiologie des cellules permet d’en
caractériser la biochimie de manière globale : par exemple quelles molécules

13
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

extérieures sont requises et en quelles proportions pour permettre la croissance. Bien

que présentant le métabolisme sous deux échelles différentes, associer ces deux types
d’observations n’est pas chose simple. Le grand nombre et la complexité des
enchaînements de réactions métaboliques rendent en effet difficile la déduction de
caractéristiques métaboliques globales à partir de la seule connaissance des réactions
le composant. Dans ce but, des modèles mathématiques du métabolisme ont
récemment été introduits pour effectuer ce raisonnement de manière appropriée. Cette
thèse se propose d’approfondir l’utilisation des modèles du métabolisme dans
l’objectif d’élucider au mieux le métabolisme de microorganismes encore peu étudiés
en exploitant conjointement données physiologiques globales et caractérisations
locales de réactions.

Ce type d’approche est aujourd’hui rendu possible grâce à des avancées

technologiques récentes. D’une part, alors que les techniques expérimentales
traditionnelles de biochimie ont un débit beaucoup trop faible pour détecter
exhaustivement les réactions métaboliques de nouveaux organismes, le séquençage et
l’annotation de leurs génomes offrent une solution alternative efficace. L’avènement
des méthodes comparatives permet en effet de déduire la fonction biochimique d’une
proportion significative des gènes par homologie aux gènes connus chez les autres
organismes, et d’inférer ainsi une grande partie de ses réactions métaboliques. Mais
l’utilisation exclusive de ces méthodes trouve rapidement ses limites pour des
activités biochimiques spécifiques à l’organisme ou encore peu étudiées. D’autre part,
le débit des expériences sur la physiologie des organismes a également augmenté
récemment, en particulier pour les microorganismes. Nous utiliserons une catégorie
particulière de ces expériences, mêlant à grande échelle perturbation génétique et
caractérisation physiologique. Elles consistent à créer systématiquement un mutant de
délétion pour chacun des gènes d’un organisme. La capacité ou non de croître de
chacun de ces mutants dans des environnements chimiques donnés (leurs phénotypes
de croissance) offre une information utile quant au rôle du gène délété – et par
extension de la fonction biochimique inactivée – dans le métabolisme de la bactérie.
Cette thèse explore spécifiquement l’utilisation des modèles du métabolisme pour
compléter la connaissance du métabolisme obtenue par les données de séquences avec
les phénotypes de croissance expérimentaux. La bactérie Acinetobacter baylyi ADP1

14
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

(que nous nommerons simplement A. baylyi) nous accompagnera tout au long de ce

manuscrit, se prêtant comme sujet d’étude à la fois in vivo et in silico.

La première partie de ce manuscrit introduit les notions manipulées dans la thèse :

le métabolisme, les expériences de génétique et la modélisation mathématique du
métabolisme. Cette partie cherche à balayer l’état de l’art dans ces trois domaines et à
placer la contribution de la thèse dans le contexte des travaux antérieurs pertinents.

Dans une deuxième partie, nous présenterons de manière détaillée la

reconstruction du modèle métabolique global d’A. baylyi à partir de son annotation
génomique. Cette section décrit naturellement le processus ayant permis d’identifier
les activités métaboliques présentes chez cette bactérie, mais également les
spécificités associées à la modélisation retenue. Il nous a semblé en effet important de
nous attarder sur les hypothèses de modélisation et leurs conséquences sur la
construction des modèles. Alors même que de nombreux articles de revue présentent
comment reconstruire des voies métaboliques à partir d’une annotation d’un génome,
peu d’entre eux détaillent les points clés liés à la modélisation.

La troisième partie du manuscrit aborde l’exploitation des phénotypes de mutants

par les modèles métaboliques. Nous montrerons, toujours sur la base du métabolisme
d’A. baylyi, qu’en identifiant les incohérences entre les phénotypes prédits par le
modèle et les phénotypes observés, des erreurs dans la connaissance du métabolisme
peuvent être pointées précisément. Nous verrons dans quelle mesure ces erreurs
peuvent être corrigées à l’aide de ces données. Nous discuterons également à cette
occasion de la notion d’essentialité des gènes, et de ses liens avec le métabolisme et
l’environnement de la cellule.

La quatrième partie traite de l’automatisation de l’interprétation de ces

incohérences lorsqu’elles sont d’origine génétique. À travers une formalisation
rigoureuse du raisonnement portant sur l’association entre gènes et réactions, nous
montrerons qu’il est possible de déduire automatiquement les associations gènes -
réactions qui soient compatibles avec les phénotypes de mutants observés. Ces
raisonnements retrouvent une partie des interprétations effectuées « manuellement »
et forment une brique indispensable à l’interprétation métabolique à grande échelle
des phénotypes de mutants.

15
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Enfin, dans une dernière partie, nous reprendrons les principales conclusions de
nos travaux et les mettrons en perspective des évolutions de la discipline. La
thématique de la thèse étant en plein essor, nous réeffectuerons un tour d’horizon des
travaux similaires publiés à la fin de la thèse. Plus largement, nous discuterons
également de la place d’approches de modélisation dans la reconstruction du
métabolisme de nouveaux organismes, à l’heure où le débit des nouvelles
technologies permet de séquencer un génome bactérien en quelques jours.

16
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

INTRODUCTION

Ce chapitre a pour but d’introduire au lecteur les concepts biologiques et

mathématiques utilisés dans cette thèse et d’effectuer un état de l’art dans les
domaines couverts. Nous l’avons divisé en cinq parties. La première s’attache à
introduire les notions utiles à la compréhension du métabolisme des microorganismes
ainsi qu’à présenter l’état de l’art quant à son exploration. La deuxième partie se
concentrera sur l’utilisation des phénotypes de croissance pour étudier le métabolisme
et en particulier aux techniques de génétique à haut débit associées. Dans la troisième
partie, le lecteur trouvera une revue actuelle des méthodes de modélisation
mathématique appliquées au métabolisme, ainsi qu’une présentation détaillée du
cadre de modélisation que nous avons retenu : la modélisation à base de contrainte.
Dans la quatrième, nous présenterons les caractéristiques et les ressources disponibles
sur l’organisme modèle utilisé dans cette thèse, Acinetobacter baylyi ADP1. Enfin,
nous effectuerons en dernier lieu une synthèse de l’état de l’art et présenterons le sujet
de notre thèse dans ce contexte.

1 Le métabolisme : la chimie du vivant

1.1 Quelques faits remarquables
Une des caractéristiques majeures des organismes vivants est leur aptitude à
croître et à se reproduire par eux-mêmes. Pour ce faire, les processus mis en œuvre
sont en grande majorité de nature chimique (biochimique), impliquant une grande
variété de molécules. On désigne généralement par métabolisme les processus

17
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

biochimiques ayant pour rôle la synthèse et la dégradation de ces biomolécules ainsi

que la transformation d’énergie chimique. Cette définition distingue ainsi le
métabolisme d’autres processus chimiques à l’œuvre dans les cellules, tels que la
signalisation, la réplication et la transcription de l’ADN, ou l’assemblage des
protéines.

Le métabolisme est indispensable à la vie. D’un point de vue thermodynamique,

les organismes vivants sont des systèmes fondamentalement hors d’équilibre qui
nécessitent pour maintenir cet état d’échanger continuellement de l’énergie et de la
matière avec le milieu extérieur (nous aborderons ce point plus en détails section
1.2.6). Le métabolisme joue un rôle essentiel dans cet échange d’énergie et de
matière. Cependant, toutes les entités vivantes ne possèdent pas nécessairement de
métabolisme propre, encore que les nombreuses définitions d’ « être vivant » soient
parfois associées à sa présence1. C’est le cas des virus et dans une moindre mesure de
certaines bactéries parasites ; ceux-ci exploitent directement les ressources de leurs
hôtes. À titre d’exemple, la bactérie parasite Rickettsia prowazekii, qui vit
majoritairement dans le cytoplasme de son hôte, dépend très fortement du
métabolisme de ce dernier ; elle ne peut synthétiser elle-même la plupart de ses
constituants et profite dès que possible de l’énergie chimique de son hôte (Andersson
et al. 1998).

Néanmoins, dans leur très grande majorité, les cellules des organismes vivants
consacrent une grande partie de leurs activités à exploiter et à transformer les
molécules de leur entourage (leur environnement) pour en retirer de l’énergie et créer
les molécules qui serviront à leur propre construction. Ce sont ces réactions qui font
des organismes vivants de véritables chimistes.

1
Voir par exemple les nombreuses définitions proposées dans l’article Wikipedia sur
les organismes vivants : http://en.wikipedia.org/wiki/Life#Definitions .

18
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 1. Couches d’oxides de fer ayant précipité sous l’action de l’oxygène produit
par la photosynthèse. Photographie d’un échantillon issu de la péninsule supérieure du
Michigan (source http://en.wikipedia.org/wiki/Banded_iron_formation )

Le volume d’action du métabolisme peut être considérable. Pour ne prendre

qu’un exemple, nous rappellerons au lecteur qu’une très grande majorité du
dioxygène présent dans l’atmosphère terrestre est d’origine « biologique».
L’apparition de la photosynthèse dans l’arsenal métabolique du vivant a en effet
modifié significativement la composition de l’atmosphère, il y a environ deux
milliards d’années (Knoll 2003). La production massive de dioxygène par les
organismes photosynthétiques transforma alors l’atmosphère réductrice en une
atmosphère oxydante, laissant des traces visibles dans les couches géologiques de
l’époque (voir Figure 1). On estime que le flux actuel de création de dioxygène par la
photosynthèse permettrait de régénérer l’ensemble de l’oxygène atmosphérique en
2000 ans (Dole 1965).

Le métabolisme marque également par sa diversité. Certains organismes, et en

particulier des bactéries, ont été découverts dans des environnements très variés, au
sein desquels les molécules sources d’énergie et de matière diffèrent de manière
considérable. À titre illustratif, pour générer leur énergie, les bactéries tirent parti de
diverses manières des potentiels d’oxydoréduction des molécules de leur
environnement. Tandis que dans les milieux aérobies courants, les molécules
organiques sont généralement oxydées en utilisant l’oxygène comme accepteur
d’électron, en milieu anaérobie certains organismes remplacent ce dernier par d’autres
molécules organiques (par exemple lors de la fermentation) ou des formes oxydées de
l’azote (ex. : nitrate, nitrite), du soufre (ex. : sulfate ou sulfite) ou de métaux (ex. : fer,
manganèse, voire même certains métaux lourds). À l’inverse, on a découvert des

19
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

organismes pouvant remplacer les molécules organiques par d’autres donneurs

d’électrons2. Ces organismes génèrent leur énergie en oxydant par exemple les
molécules réduites de dihydrogène, de soufre (inorganique par ex.), d’azote
(ammoniaque) ou de fer.

Le répertoire des molécules organiques pouvant être « métabolisées » est lui-

même extrêmement large. On estime qu’environ un millier de molécules composent
le métabolisme primaire3 de la majorité des organismes. À cet ensemble, les
organismes supérieurs – en particulier les plantes et les champignons – ajoutent les
molécules de leur métabolisme secondaire4 dont on estime la diversité à plusieurs
centaines de milliers (Villas-Boas et al. 2007, pp.25-26). Les structures de ces
molécules sont souvent remarquablement complexes (voir Figure 2), leurs rôles
biologiques dépendant en grande partie de ces structures et se révélant parfois
extrêmement sensibles à tout changement de chiralité5. À cet effet, certaines voies de
synthèse du métabolisme sont particulièrement efficaces à produire spécifiquement
certains énantiomères donnés.

2
On les nomme lithotrophes, par opposition aux organotrophes.
3
Le métabolisme primaire regroupe les activités métaboliques participant au
développement et à la croissance de l’organisme, telles que la génération d’énergie et
la synthèse des constituants de la cellule. Ces activités sont relativement ubiquitaires
entre les organismes.
4
Le métabolisme secondaire regroupe les activités de synthèse de molécules ne
contribuant pas directement à la croissance de la cellule. Ces molécules ont par
exemple des rôles dans la communication ou les interactions écologiques.
5
Une molécule est chirale si elle n’est pas superposable à son image dans un miroir.
Les deux molécules images l’une de l’autre sont alors appelées énantiomères. Deux
énantiomères ont des formules développées identiques mais ont des structures
tridimensionnelles distinctes. Cette différence peut leur conférer des propriétés
physiques, chimiques ou biologiques distinctes.

20
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 2. La molécule de Taxol, utilisée en chimiothérapie. Cette molécule a été

découverte dans l’écorce d’une espèce d’if, Taxus brevifolia.

Similairement à ces capacités de synthèse, les organismes ont développé un

ensemble de réactions leur permettant de dégrader et d’utiliser à leur avantage un
large spectre de molécules. Ceci est notamment vrai pour les bactéries, lesquelles ont
développé un ensemble de stratégies pour croître dans des environnements chimiques
variés voire extrêmes. Leurs remarquables capacités d’adaptation les ont même
amenées à exploiter des molécules non naturelles produites par l’homme (molécules
xénobiotiques), tels que des composés organochlorés ou polyaromatiques (Janssen et
al. 2005; van der Meer et al. 1992) .

L’homme utilise depuis longtemps les compétences biochimiques des organismes.

Depuis leur utilisation pour la production de fromage, de bière et de vin par
fermentation (dont on retrouve des traces de pratique datant de la préhistoire
(McGovern et al. 1996)), les applications du métabolisme des microorganismes se
sont étendues à de nombreux autres domaines. La pratique de l’ingénierie du
métabolisme permet de produire efficacement une large gamme de produits par voie
biologique : compléments alimentaires, substances énergétiques, solvants,
antibiotiques, vitamines, polymères, pigments (Stephanopoulos et al. 1998, pp.203-
283). La voie de production biologique prend surtout son sens lorsque la synthèse
chimique se révèle difficile et coûteuse, comme cela est le cas par exemple pour le
1,3-propanediol (Tong et al. 1991), un précurseur de nombreux polymères à forte
valeur ajoutée, ou l’artémisinine (Ro et al. 2006), une molécule active contre le
paludisme. Les capacités de dégradation des microorganismes sont également
utilisées à des fins pratiques, l’exemple le plus flagrant étant leur utilisation
primordiale dans les processus d’épuration des eaux usées. L’aptitude des

21
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

microorganismes à s’adapter pour utiliser des substances variées en fait des candidats
prometteurs pour dégrader des polluants complexes, tels que les polychlorobiphényles
(PCB) ou les mélanges de benzène, toluène et xylène (BTX) (Stephanopoulos et al.
1998, pp.266-273).

1.2 Les acteurs du métabolisme

Avant de présenter plus en détail l’organisation du métabolisme au sein des
organismes, nous allons préalablement définir dans cette section les « acteurs »
impliqués. Nous rappellerons en outre au lecteur quelques notions physiques en
rapport avec les réactions biochimiques. En effet, le comportement du métabolisme
découle in fine de ces notions physiques ; les modèles mathématiques du métabolisme
s’appuient de ce fait de manière fondamentale sur la physique à l’œuvre, aux échelles
à la fois de la molécule (description des réactions) et de la cellule (cinétique et
thermodynamique).

1.2.1 Métabolites

On utilise généralement le terme de métabolite pour désigner les molécules

impliquées dans le métabolisme cellulaire. Ces molécules sont, dans leur grande
majorité, des molécules organiques, composées de carbone et d’hydrogène mais
également d’oxygène et dans une moindre mesure d’azote, de phosphore et de soufre.
À titre illustratif, la composition moyenne de la bactérie Lactobacillus lactis en ces
éléments (relativement au carbone) a été évaluée à C1H1,9O0,6N0,2P0,02S0,01 (Oliveira et
al. 2005). Cette composition n’est pas fixe et évolue notamment en fonction de
l’environnement de croissance de l’organisme, mais elle est indicative de l’ordre de
grandeur de la répartition de ces éléments6. La forte proportion du carbone dans la
composition des métabolites n’est pas anodine. En effet, les propriétés électroniques

6
On retrouve en réalité d’autres éléments dans la composition des cellules, souvent en
moindre quantité. Ce sont principalement des ions jouant le rôle d’électrolytes afin de
maintenir une pression osmotique et un pH constants et de favoriser l’import de
métabolites (potassium, sodium, calcium, manganèse, chlore). De nombreux métaux
de transition (fer, zinc, manganèse, molybdène, cuivre, cobalt, nickel) sont également
présents à l’état de trace ; ils sont néanmoins essentiels à l’activité de certaines
enzymes.
Cependant, dans la très grande majorité des cas, ces éléments n’entrent pas dans la
composition des métabolites.

22
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

de l’atome de carbone font qu’il établit facilement jusqu’à quatre liaisons covalentes
relativement solides ; cette caractéristique lui permet de générer une combinatoire
extrêmement grande de molécules organiques en assemblant plusieurs atomes de
carbone entre eux.

1.2.2 Réactions

Les métabolites se transforment chimiquement au cours des réactions

métaboliques : des métabolites substrats réagissent entre eux pour donner des
métabolites produits. On représente généralement la réaction par son équation bilan,
laquelle met en évidence la stœchiométrie de la réaction, c’est-à-dire les proportions
dans lesquelles les métabolites sont consommés et produits (voir Figure 3).
L’équation bilan répertorie exhaustivement les substrats et produits impliqués par la
réaction. De ce fait, et étant donné que les transformations à l’œuvre sont purement
chimiques – celles-ci mettent uniquement en jeu des échanges d’atomes ou de
groupes d’atomes entre métabolites par modification de leurs liaisons chimiques – la
quantité de chaque élément et la charge globale est conservée : l’équation bilan est
dite équilibrée.

Figure 3. Equation bilan de la réaction catalysée par l’enzyme isocitrate

dehydrogénase. Extrait de BRENDA (http://www.brenda-enzymes.info).

On distingue souvent deux types de métabolites dans une réaction biochimique :

les substrats et produits principaux d’une part et les cofacteurs (ou coenzymes) d’autre
part. Le premier type désigne les métabolites directement transformés par la réaction
chimique : il s’agit par exemple de l’isocitrate, du 2-oxoglutarate et du CO2 dans le
cas de la réaction présentée sur la Figure 3. Les cofacteurs désignent quant à eux les
métabolites aidant la transformation chimique principale, que ce soit en apportant de
l’énergie, en agissant comme accepteur ou donneur d’électron (tels que NADP+ et
NADPH dans la réaction de la Figure 3) ou en favorisant le transfert de groupements
chimiques. Les transformations chimiques des cofacteurs sont réversibles et, comme

23
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

nous le verrons plus loin, une partie des activités métaboliques de la cellule consiste
justement à régénérer les cofacteurs en les retransformant dans leur état initial.

1.2.3 Enzymes

Aux cotés des métabolites, les enzymes constituent le deuxième acteur clé du
métabolisme. Ces dernières jouent en effet le rôle de catalyseurs sans lesquels la
plupart des réactions métaboliques ne pourraient se dérouler à des vitesses
compatibles avec la vie de la cellule. Le principe de la catalyse enzymatique repose
sur une interaction entre l’enzyme et les substrats qui favorise la stabilisation de l’état
de transition de la réaction (Koshland 1958). Cette stabilisation abaisse l’énergie à
fournir pour atteindre l’état de transition (énergie d’activation) et, de ce fait, un
nombre plus élevé de substrats d’énergie moindre pourront interagir, accélérant ainsi
la réaction (voir Figure 4).

Figure 4. Illustration de la diminution d’énergie d’activation d’une réaction par catalyse

‡
enzymatique. E, enzyme ; S, substrat ; S , état de transition ; P, produit ; !G, énergie
d’activation avec (!GC) ou sans (!GU) catalyse. Adapté de Wikipedia7.

Des mécanismes enzymatiques relativement différents permettent d’abaisser

l’énergie d’activation, allant d’une stabilisation par effet électrostatique au
rapprochement forcé des substrats. Nous n’entrerons cependant pas dans leurs détails
qui seraient hors du propos de cette thèse.

Il est cependant important de noter que, dans la grande majorité des cas, les
enzymes catalysent des réactions spécifiques alors que les métabolites peuvent

7
http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_catalysis

24
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

généralement réagir entre eux de diverses manières. En abaissant l’énergie

d’activation pour un chemin réactionnel donné – en stabilisant par exemple un état de
transition particulier – les enzymes favorisent alors spécifiquement une réaction
particulière par rapport aux autres. Le caractère spécifique de la catalyse enzymatique
est au moins aussi important dans le métabolisme que l’accélération de la vitesse des
réactions. Il lui permet en effet d’assurer la transformation des métabolites en des
produits particuliers, évitant la production d’autres produits qui en réduiraient le
rendement et pourraient s’avérer néfastes. En résumé, le double aspect spécificité et
accélération de la catalyse enzymatique donne à l’organisme le contrôle des
transformations métaboliques se déroulant dans la cellule.

À la grande variété de réactions métaboliques correspond une grande variété

d’enzymes. Afin d’organiser la description des enzymes identifiées, l’International
Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)8 élabore une classification
des enzymes basée sur le type de réaction catalysée : la classification EC (pour
Enzyme Commission). Bien que mise à jour lentement par rapport aux découvertes de
nouvelles activités enzymatiques, la classification EC est largement utilisée pour
décrire l’activité des enzymes et souvent, par extension, pour assigner une fonction
enzymatique à un gène.

Nombre EC Type d'enzyme Type de réactions catalysées

1.-.-.- Oxidoreductases Réactions d'oxidoréduction
2.-.-.- Transferases Réactions de transfert de groupes fonctionnels
3.-.-.- Hydrolases Réactions d'hydrolyse d'un substrat en deux produits
Réactions de coupure de liaisons covalentes par un
4.-.-.- Lyases
procédé autre que l'oxydation ou l'hydrolyse
Réactions de réarrangement intramoléculaire,
5.-.-.- Isomerases
isomérisation
Réactions de jonction covalente de deux molécules
6.-.-.- Ligases
utilisant l'hydrolyse d'ATP
Tableau 1. Premier niveau de la classification EC. Un nombre EC se compose de quatre
nombres représentant quatre niveaux de classification qui caractérisent de plus en plus
finement la réaction catalysée. Le premier niveau présenté ici distingue six grandes classes
de réactions. Le dernier niveau spécifie généralement les substrats précis de la réaction.

1.2.4 Cinétique des réactions métaboliques

Une bonne grandeur pour décrire le fonctionnement du métabolisme est la vitesse

des réactions métaboliques, également appelée flux. En effet, la survie des cellules

8
Voir http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/

25
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

dépend fortement de leur capacité à transformer en permanence les métabolites pour

produire l’énergie et construire ses constituants. Plus que les concentrations de tels ou
tels métabolites, les flux des réactions renseignent directement sur les conversions
métaboliques ayant lieu dans la cellule ; ils représentent en quelque sorte l’état
fonctionnel du métabolisme. Nous reviendrons plus en profondeur sur la notion de
flux et sa signification pour représenter l’état du métabolisme dans la section
introduisant la modélisation.

La vitesse d’une réaction s’exprime généralement avec l’unité mol.L-1.s-1 qui

décrit la quantité de substrats transformés par unité de volume de solution et par unité
de temps9. Cette unité est bien adaptée à la description des flux lorsque les réactions
se déroulent in vitro, mais l’est moins lorsqu’elle se déroulent dans des cellules ; on
lui substitue alors l’unité mmol.h-1.(g DW)-1 où DW représente la masse sèche des
cellules. Cette unité rapporte ainsi indirectement la quantité de substrat transformé par
unité de temps à la quantité de cellule.

La vitesse d’une réaction enzymatique dépend de nombreux facteurs :

concentration des substrats et produits, concentration de l’enzyme, efficacité
catalytique de l’enzyme, température, pH, pression, entre autres facteurs… Sans
vouloir exposer ici un état de l’art sur la cinétique enzymatique qui n’est pas le sujet
de cette thèse, nous souhaitons rappeler au lecteur à titre illustratif un modèle simple
de cinétique enzymatique qui permette d’appréhender l’influence de certains de ces
facteurs. Michaelis et Menten déterminèrent, de manière d’abord empirique, une
relation entre vitesse de réaction et concentration en substrat dépendant de deux
paramètres liés à l’enzyme (Michaelis & Menten 1913; Cornish-Bowden 2004) :

cS
v = v max
Km + cS

où v est la vitesse de réaction, cS la concentration en substrat et vmax et Km les deux

paramètres en question. ! Le premier paramètre, vmax, représente la vitesse maximale
que la réaction peut atteindre en présence d’une quantité fixe d’enzyme et pour un

9
La vitesse de la réaction dépend de l’écriture de son équation bilan. La vitesse de
production d’un produit (par la réaction) est en effet égale à la vitesse de la réaction
multipliée par le coefficient stœchiométrique du produit dans l’équation bilan.

26
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

quantité saturante du substrat. Ce paramètre dépend linéairement de la quantité

d’enzyme et traduit son efficacité à réaliser la transformation chimique. Définie en
termes de nombre de molécules de substrat converties par une enzyme en une
seconde, cette efficacité peut s’échelonner sur plusieurs ordres de grandeur, de 0.5 s-1
pour le lysozyme à 600 000 s-1 pour la carbonate déshydratase (Stephanopoulos et al.
1998; Barthelmes et al. 2007). Le second paramètre, Km, également appelé constante
de Michaelis, est égal à la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de la
réaction vaut ! vmax (voir Figure 5). Ce paramètre est indépendant de la quantité
d’enzyme et traduit l’affinité de l’enzyme au substrat (un Km plus faible traduit une
affinité plus élevée).

vmax

vitesse de
réaction v

1/2.vmax

Km concentration de substrat cS
Figure 5. Relation entre vitesse de réaction et concentration de substrat pour une
cinétique de type Michaelis-Menten.

Aux concentrations élevées de substrat (cS >> Km), la vitesse de la réaction tend
vers vmax. L’enzyme est saturée et la vitesse de la réaction dépend linéairement de sa
quantité. Aux concentrations faibles de substrat (cS << Km), la vitesse de la réaction
tend vers (vmax/Km).cS auquel cas elle dépend linéairement de la concentration en
substrat et en enzyme. La concentration Km délimite en quelque sorte les deux régimes
de fonctionnement.

La cinétique de Michaelis-Menten s’interprète avec un modèle de transformation

moléculaire simple où le substrat se lie réversiblement à l’enzyme avant d’être
transformé irréversiblement en produit (Briggs & Haldane 1925) :

27
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

k1 k2
E + S" ES $ E + P
k#1

En supposant que le complexe enzyme-substrat ES est à l’état stationnaire, la

relation de Michaelis-Menten est retrouvée avec :
!
k"1 + k 2
v max = k 2 .c E,tot et K m =
k1

où cE,tot représente la quantité totale d’enzyme.

!
La cinétique de Michaelis-Menten traduit un mécanisme réactionnel relativement
simple et en réalité beaucoup d’enzymes suivent des cinétiques bien plus complexes
(Cornish-Bowden 2004). Elle est en revanche illustrative des influences respectives
des enzymes et métabolites sur les flux de réaction et elle permet d’introduire les
phénomènes de contrôle des réactions.

1.2.5 Contrôle des réactions métaboliques

Que la cinétique d’une réaction enzymatique soit Michaelienne ou non, l’enzyme

en elle-même influence largement le flux de la réaction. Celui-ci dépend en effet à la
fois de la quantité d’enzymes présentes et de leur efficacité à catalyser la réaction.
Cette dépendance est exploitée de manière fondamentale par les organismes pour
contrôler leur métabolisme, que ce soit simplement pour activer ou inactiver des
réactions ou, de manière plus élaborée, pour ajuster finement la vitesse des réactions
en fonction de leurs besoins. Les processus biologiques de contrôle sont généralement
désignés sous le terme de régulation métabolique. On distingue typiquement deux
grandes catégories de contrôles : (1) l’ajustement de la quantité d’enzymes et (2) la
modulation directe de leur activité.

La régulation de la quantité d’enzymes s’opère communément en modulant les

vitesses de production et de dégradation des enzymes (Stephanopoulos et al. 1998,
pp.173-180). Des mécanismes complexes de régulation permettent en effet d’activer
ou d’inhiber la transcription et la traduction de protéines en réponse à un signal
particulier (par exemple la présence ou l’absence d’un métabolite particulier). Les
microorganismes utilisent largement ce type de mécanisme, notamment pour adapter
leur métabolisme aux environnements chimiques qu’ils rencontrent en ne produisant

28
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

que les enzymes appropriées à l’environnement. De même, en adressant les enzymes

à des localisations spécifiques dans l’organisme, celui-ci peut contrôler à quel endroit
les réactions se dérouleront, permettant par exemple d’éviter des interactions
chimiques indésirables entre métabolites.

De nombreux mécanismes permettent également de réguler l’efficacité catalytique

des enzymes. D’une part, les enzymes peuvent être totalement inactivées ou activées
par des modifications covalentes irréversibles de leur structure ; ces modifications
consistent fréquemment à les phosphoryler, ou à leur ajouter ou enlever divers
groupes fonctionnels par l’intermédiaire de protéines ou de métabolites particuliers.
D’autre part, et il s’agit de la classe de mécanisme la plus courante, des métabolites
inhibiteurs ou activateurs peuvent interagir avec l’enzyme – souvent de manière
réversible – pour modifier graduellement son activité. Divers mécanismes ont été
identifiés, chacun conduisant à des comportements cinétiques souvent distinguables
(Cornish-Bowden 2004). Ainsi, le métabolite régulateur peut tout aussi bien être un
analogue du substrat et agir en tant que concurrent pour l’accès au site actif de
l’enzyme, ou être différent et agir via un autre site sur la conformation de l’enzyme et
altérer son efficacité catalytique ou son affinité au substrat (cas des enzymes
allostériques).

Ces mécanismes de régulation agissent souvent de manière fine sur les flux des
réactions en réponse à des signaux variés. Ceux-ci sont indispensables à l’organisme
car ils lui permettent de réellement contrôler son « usine biochimique », pour
notamment assurer la stabilité de sa composition chimique, économiser la production
d’enzymes inutiles (en programmant par exemple leurs productions uniquement au
moments opportuns (Zaslaver et al. 2004)) et répondre aux changements ou stimulus
de leurs environnements (voire même les anticiper (Tagkopoulos et al. 2008; Mitchell
et al. 2009) !).

1.2.6 Aspects thermodynamiques

Du point de vue thermodynamique, les organismes vivants sont des systèmes

particuliers. Ils appartiennent à la classe des systèmes dissipatifs dont la
caractéristique principale est de maintenir voire d’accroître leurs états d’ordre interne
en prenant de l’énergie au milieu extérieur et lui retransmettant de l’entropie. Pour ce
faire, ces systèmes doivent se maintenir en permanence hors de l’état d’équilibre

29
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

grâce à leurs échanges avec leur environnement ; ils sont fondamentalement ouverts10
et tout arrêt de ces échanges conduit à leur disparition. Dans le cas des cellules
vivantes, le maintien de cet état hors d’équilibre leur permet de croître et d’assurer la
permanence de l’organisation de leur structure. Le métabolisme assure donc l’échange
continuel de matière et d’énergie avec l’environnement : il exploite en général11
l’énergie de métabolites d’énergie élevée et d’entropie faible importés de
l’environnement en les transformant en métabolites d’énergie plus faible mais
d’entropie plus élevée (von Stockar & Liu 1999; Stephanopoulos et al. 1998). De
manière à assurer un flux de transformation permanent, qui est donc
thermodynamiquement fondamental pour la vie de l’organisme, les réactions du
métabolisme sont également elles-mêmes hors d’équilibre.

L’enthalpie libre de réaction, notée !rG, permet de décrire le sens d’évolution

spontané des réactions. À température et pression constante, la réaction opère en effet
dans le sens de diminution de l’enthalpie libre, tel que !rG < 0. Dès lors que !rG
atteint zéro, le flux net de la réaction devient nul. Le métabolisme doit ainsi s’assurer
que les enthalpies libres des réactions sont bien négatives pour transformer les
métabolites avec un flux net positif.

L’enthalpie libre de réaction dépend de l’enthalpie libre standard de réaction

(!rG°) qui ne dépend que de la température et de la pression, et des concentrations de
ses substrats et produits :

" rG = " rG° + R.T.ln(Q)

où R la constante des gaz parfaits et Q est le quotient de la réaction :

!
p1" p1 .p2" p2 ...
Q=
s1" s1 .s2" s2 ...

!
10
Un système ouvert peut échanger de l’énergie et de la matière avec le milieu
extérieur, au contraire des systèmes isolés. Selon le second principe de la
thermodynamique, un système isolé évolue toujours de manière à augmenter son
entropie et tend invariablement à rejoindre son état d’équilibre.
11
Dans le cas de la photosynthèse, l’énergie ne provient pas des métabolites mais de
la lumière.

30
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

avec s1, s2 les activités12 des substrats, p1, p2 celles des produits et les !i leurs
coefficients stœchiométriques.

Deux « leviers » peuvent ainsi conduire à une enthalpie de réaction négative, le

quotient de réaction et l’enthalpie libre standard de réaction. D’une part, le quotient de
la réaction peut être diminué par un déséquilibre net de concentration dans lequel les
substrats sont en excès par rapport aux produits. En consommant par exemple les
produits au fur et à mesure de leur apparition, le métabolisme peut maintenir le
déséquilibre de concentration et assurer la continuité de la réaction. Cependant,
certaines conversions biochimiques possèdent des enthalpies libres de réaction trop
élevées pour être favorisées uniquement par un déséquilibre de concentrations (en
gardant des niveaux de concentrations « physiologiques »). Ceci est le cas par
exemple de réactions de biosynthèse des constituants de la cellule, pour lesquelles les
produits sont plus « énergétiques » que les substrats, conduisant à une enthalpie libre
standard de réaction élevée. Ces réactions sont rendues réalisables en les couplant
avec une réaction apportant de l’énergie, au premier rang desquelles figure
l’hydrolyse de l’ATP. La réaction combinée, dont le couplage s’effectue d’ailleurs
souvent au sein de la même enzyme (Stephanopoulos et al. 1998, pp.629-694),
possède alors une enthalpie libre standard de réaction moins élevée la rendant
thermodynamiquement réalisable aux concentrations physiologiques. Ce cas de figure
illustre l’importance des cofacteurs énergétiques et des processus métaboliques
associés à leur maintenance.

1.3 Structure et organisation du métabolisme

1.3.1 Le réseau métabolique

D’un point de vue plus global, le métabolisme d’un organisme se compose d’un
nombre élevé de réactions (typiquement plus d’un millier de réactions distinctes pour
une bactérie « de taille moyenne » comme Escherichia coli (Keseler et al. 2009)) qui

12
Dans le cas des réactions en solution aqueuse, les activités s’identifient quasiment
aux concentrations, moyennant quelques corrections liées notamment à la force
ionique. On effectue également cette approximation dans le cas des réactions
biochimiques intracellulaires, bien que le « solvant » constitué par le milieu
cytoplasmique soit loin d’être aussi idéal qu’une solution aqueuse. Des corrections
sont cependant souvent requises pour corriger les déviations trop importantes
(Maskow & von Stockar 2005; Vojinovi" & von Stockar 2009).

31
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

convertissent un nombre tout aussi élevé de métabolites. Cependant, du fait que les
métabolites sont partagés par les réactions (produits par certaines et consommés par
d’autres), métabolites et réactions se structurent sous la forme d’un réseau,
couramment appelé réseau métabolique (voir Figure 6). Au sein de ce réseau, on peut
distinguer les enchaînements de réactions qui transforment étape par étape les
métabolites, formant en quelques sortes des chemins de conversion dans le
métabolisme. Comme mentionné ci-dessus à propos de la thermodynamique,
l’enchaînement des réactions a d’ailleurs une réalité bien physique, du fait que pour
maintenir les flux de conversion, les produits de chaque réaction doivent en
permanence être réutilisés pour maintenir le déséquilibre thermodynamique.
Cependant, une représentation complète du réseau métabolique telle que celle
présentée sur la Figure 6 illustre uniquement de manière statique le métabolisme. Elle
représente en effet l’ensemble des réactions chimiques pouvant avoir lieu, mais pas la
réalité des conversions chimiques ayant lieu à un instant t dans la cellule. Toutes les
conversions métaboliques possibles ne se réalisent pas toutes ensemble, mais plutôt
en fonction des besoins de la cellule. Le contrôle des réactions métaboliques présenté
ci-dessus joue à cet effet un rôle primordial pour orienter les conversions
métaboliques selon certains chemins bien précis.

Comme illustré sur la Figure 6, certains métabolites sont connectés à un nombre

de réactions nettement plus élevé que d’autres. Ceux-ci forment en quelque sorte des
points d’embranchement13 du réseau métabolique, à partir desquels commencent
plusieurs branches métaboliques. En contraste, d’autres métabolites ne sont reliés
simplement qu’à deux réactions, ne formant que des intermédiaires de voies de
conversion. Nous verrons rapidement dans la partie suivante sur la modélisation que
de nombreux travaux se sont attachés à étudier les propriétés topologiques des
réseaux métaboliques.

13
Le terme consacré en anglais, et parfois par abus en français, est « hub ».

32
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 6. Illustration d’un réseau métabolique global. Les nœuds (points) correspondent
à des métabolites et les liens (lignes) à des réactions (ou successions de réactions)
convertissant les métabolites. Les grandes catégories fonctionnelles du métabolisme sont
indiquées dans les encadrés. Dans le cercle : aperçu détaillé d’une partie du réseau
métabolique. Source des cartes : KEGG (http://www.genome.jp/kegg/atlas/) et Roche Applied Science
(http://www.expasy.ch/tools/pathways/).

De manière à obtenir une description fonctionnelle claire du métabolisme, les

biochimistes ont traditionnellement regroupé les réactions en voies métaboliques, qui
peuvent être vues comme des parties du réseau métabolique – souvent des
enchaînements linéaires de réactions. La grande majorité des voies métaboliques sont
définies pour correspondre à des fonctions métaboliques bien précises, mais cette
classification est arbitraire et varie souvent d’une personne à l’autre, reposant parfois

33
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

sur des critères historiques relatifs au contexte de leur découverte, organisationnels ou

purement subjectifs. Le découpage du réseau métabolique en voies fournit cependant
une vision modulaire du métabolisme qui a permis d’en appréhender le
fonctionnement global d’une manière simple.

1.3.2 Organisation globale du métabolisme

Sans chercher à rentrer dans le détail des voies composant le métabolisme, celui-ci
peut être décrit de manière simple en distinguant une partie catabolique et une partie
anabolique.

Les réactions du métabolisme catabolique ont pour fonction de dégrader

(cataboliser) des composés chimiques provenant principalement de l’environnement
de l’organisme14 pour fournir de l’énergie, des cofacteurs réducteurs et des
précurseurs nécessaires à la synthèse des constituants de la cellule. On peut y
distinguer également deux types de voies en fonction de « l’originalité » des
métabolites à cataboliser. D’une part des voies relativement ubiquitaires entre les
organismes sont en charge de produire massivement l’énergie de la cellule ainsi que
les précurseurs et cofacteurs à partir de métabolites communs ; elles sont parfois
désignées par le terme métabolisme central. Parmi les voies métaboliques appartenant
à cette première catégorie figurent notamment la glycolyse (produisant de l’énergie,
des cofacteurs réduits et des précurseurs par oxydation d’hexoses, généralement
glucose et fructose), le cycle de Krebs (ou cycle de l’acide citrique, voie métabolique
centrale produisant de l’énergie, des cofacteurs réduits et des précurseurs par
oxydation de l’acide citrique (voir Figure 7)), la phosphorylation oxydative (ou
respiration, produisant de l’énergie par oxydation des cofacteurs réduit généralement
grâce à l’oxygène du milieu) et des voies de fermentation (permettant de générer de
l’énergie et de réoxyder les cofacteurs réduits en milieu anaérobie).

14
le catabolisme peut également recycler des métabolites internes à la cellule.

34
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 7. Schéma du cycle de l’acide citrique (citrate), pour E. coli. L’acetyl-coA est
condensé avec l’oxaloacetate pour former le citrate. Celui-ci est progressivement oxydé et
perd deux carbones sous forme de CO2. Au cours d’un cycle, 1 ATP est produit, ainsi que 3
NADH et 1 QH2 (ubiquinol), potentielles sources d’ATP si oxydées par l’oxygène dans la
chaîne respiratoire. Adapté de Wikipedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Citric_acid_cycle)

Lorsque les métabolites du métabolisme central ne sont pas directement

disponibles dans l’environnement, ce qui est en réalité majoritairement le cas, des
voies plus spécialisées se chargent de les créer en dégradant les composés qui s’y
trouvent, tout en collectant l’énergie issue de cette dégradation. La répartition de ces
voies dans les organismes est beaucoup plus disparate car elle dépend fortement de
leurs milieux habituels de vie. Ainsi, les entérobactéries possèdent des voies de
dégradation spécialisées dans l’utilisation de nombreux sucres tandis que les bactéries
du sol disposent plutôt de voies de dégradation de composés issus des plantes,
comportant par exemple des cycles aromatiques. Alors que le panel de composés
« catabolisables » est extrêmement vaste, les voies de dégradation correspondantes
ont cependant en commun de produire in fine des métabolites communs (centraux)
pouvant être réutilisés ensuite par le reste du réseau métabolique.

Le métabolisme anabolique synthétise quant à lui les constituants de la cellule à

partir des précurseurs et cofacteurs créés par le catabolisme ou directement importés
de l’extérieur. Les cellules sont en effet constituées d’un assemblage hétérogène de
macromolécules aux fonctions nombreuses (voir Tableau 2) , notamment le maintien

35
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

de la structure de la cellule (lipides, peptidoglycane), la conservation et la

transmission d’information (ARN, ADN, protéines), la catalyse des réactions
biochimiques (protéines, ARN). Ces molécules sont nommées macromolécules car
celles-ci sont des molécules de grande taille formés en général par polymérisation de
métabolites élémentaires, par exemple les acides aminés pour les protéines, les acides
nucléiques pour l’ARN et l’ARN, et l’acetyl-coA pour les lipides. Les molécules
synthétisées par l’organisme ne servent pas toutes directement au fonctionnement de
la cellule, mais peuvent être utilisées également par l’organisme pour interagir avec
son environnement ou d’autres organismes. Certaines peuvent par exemple être
excrétées pour solubiliser l’environnement extérieur, aider à se sédentariser sur un
support (création de biofilms), ou éliminer des bactéries concurrentes (synthèse
d’antibiotiques). En résumé, le métabolisme anabolique comprend l’ensemble des
réactions permettant à l’organisme de créer l’arsenal de composés chimiques qui lui
seront utiles.

Fraction de la
Macromolécule
masse sèche totale
Protéine 55,0%
ARN 20,5%
ARNr 16,7%
ARNt 3,0%
ARNm 0,8%
ADN 3,1%
Lipide 9,1%
Lipopolysaccharide 3,4%
Peptidoglycane 2,5%
Glycogène 2,5%
Fraction soluble 3,9%
Tableau 2. Composition moyenne en macromolécules de cellules d’Escherichia coli.
Données issues de Neidhardt et Umbarger (1996).

Les précurseurs utilisés par le métabolisme anabolique sont quasiment universels

et appartiennent au métabolisme central. Cependant, comme mentionné plus haut,
certains organismes ne peuvent pas synthétiser par eux-mêmes tous les métabolites
requis à leur survie et doivent importer ceux-ci de leur environnement. D’autres
organismes sont au contraire extrêmement efficaces pour les synthétiser à partir de
molécules très basiques comme des composés à un seul carbone (CO2 ou CH4). De
même que pour les voies cataboliques, une partie des voies anaboliques est
relativement universelle entre les organismes – ce sont celles aboutissant aux

36
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

constituants ubiquitaires et vitaux des cellules. L’autre partie des voies anaboliques
est, au contraire, répartie très inégalement entre les organismes et brosse un éventail
beaucoup plus grand de molécules biologiques. En particulier, on trouve une très
grande variété de molécules issues du métabolisme secondaire chez les organismes
supérieurs et notamment celui des plantes qui ont développé un vaste arsenal de
défense « moléculaire ». Cependant, cette thèse étant focalisée sur le métabolisme des
microorganismes, nous ne ferons que l’évoquer occasionnellement.

1.4 Méthodes d’exploration du métabolisme

1.4.1 Élucidation expérimentale des voies métaboliques

Historiquement, l’identification des voies métaboliques débuta peu après la

découverte des premières enzymes à la toute fin du 19e siècle. Le développement de
méthodes de purification et de caractérisation des enzymes associées aux techniques
d’identification chimique et de marquage radioisotopique des métabolites ainsi qu’à
l’étude de la physiologie des microorganismes permit alors rapidement à un grand
nombre de biochimistes de découvrir les principales voies métaboliques de divers
organismes modèles. Ce travail, qui fut notamment très prononcé au milieu du 20e
siècle, généra une connaissance considérable sur l’enchaînement des réactions dans
les voies métaboliques mais aussi sur les caractéristiques catalytiques, cinétiques et
régulatoires des enzymes. La classification EC de l’IUBMB (voir 1.2.3) fut d’ailleurs
créée à la fin des années 50 pour fournir une classification et une nomenclature
uniformisée des enzymes, permettant d’organiser les nombreuses activités
enzymatiques déjà identifiées. Dans un deuxième temps (deuxième moitié du 20e
siècle), le développement des techniques de biologie moléculaire permit d’associer
des gènes aux enzymes identifiées et apportèrent un angle de vision complémentaire
sur le fonctionnement du métabolisme.

La somme des connaissances accumulées sur le métabolisme à la fin du 20e siècle

fut considérable et relativement complète pour quelques organismes modèles, au
premier rang desquels Escherichia coli pour les procaryotes (Neidhardt 1996) et
Saccharomyces cerevisiae pour les eucaryotes (Strathern et al. 1982). Pour ces
organismes modèles, la majeure partie des voies métaboliques fut décrite en détail,
permettant aujourd’hui d’appréhender la globalité de leur métabolisme. Cependant,
cette connaissance fut accumulée sous la forme d’un nombre tout aussi considérable

37
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

de publications. Pour organiser ces informations disparates, des initiatives de

regroupement de l’information au sein de bases de données ont vu le jour depuis une
vingtaine d’années. Deux grands types de bases de données liées au métabolisme ont
été développés. D’une part, des répertoires de données biochimiques sur les enzymes ;
les ressources les plus significatives sont BRENDA (Barthelmes et al. 2007) et
ENZYME (Bairoch 2000). D’autre part, des bases de données répertoriant selon
diverses organisations la biochimie des voies métaboliques. Parmi ces dernières,
KEGG (Kanehisa et al. 2007) et MetaCyc (Caspi et al. 2008) regroupent les voies
indépendamment des organismes, EcoCyc est spécifique au métabolisme d’E. coli
(Keseler et al. 2009), et UM-BBD se concentre sur les voies de dégradation
microbiennes (Ellis et al. 2006).

Malgré le développement de techniques d’investigation en biochimie de plus en

plus performantes – incluant notamment la chromatographie, la RMN et la
spectrométrie de masse – la découverte de nouvelles activités enzymatiques marqua le
pas à la fin du 20e siècle. D’une part, la majeure partie des voies métaboliques
principales des organismes modèles cultivables fut déjà élucidée, et d’autre part, les
centres d’intérêts majoritaires en biologie se sont déplacés plutôt sur des sujets de
biologie moléculaire.

Aujourd’hui, la recherche de nouvelles activités enzymatiques bénéficie cependant

d’un regain d’intérêt notable. Tout d’abord, l’augmentation rapide du nombre de
génomes et de métagénomes15 séquencés identifie une quantité toujours plus
importante de gènes de fonctions inconnues, dont une fraction significative code
vraisemblablement pour des enzymes métaboliques. Inversement, l’étude des
phénotypes de croissance (voir ci-dessous, chapitre 2), de la physiologie des
microorganismes et du contenu métabolomique16 des cellules (Dunn et al. 2005;
Breitling et al. 2008; Steuer 2006) permet d’identifier, parfois de manière ciblée, des

15
On désigne par métagénome tout matériel génétique d’une communauté
microbienne extrait directement d’un échantillon. Il contient ainsi indistinctement les
matériels génétiques des divers organismes présents dans cet environnement,
permettant leur étude en s’affranchissant de l’isolement des organismes et de leur
mise en culture, souvent difficiles voire impossibles.
16
Le métabolome, dans la lignée des termes en -ome (p.ex. génome, transcriptome,
protéome), désigne l’ensemble des métabolites présents dans une cellule.

38
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

activités métaboliques dont les gènes et enzymes sont inconnus17 (Lespinet &
Labedan 2006b; Lespinet & Labedan 2006a; Pouliot & Karp 2007). De nombreux
projets se sont développés récemment pour tenter de relier gènes et activités
enzymatiques sur ces deux bases. Les résultats attendus sont prometteurs, dans la
mesure où la disponibilité du matériel génétique pour de nombreux organismes, qu’ils
soient cultivables ou non, voire non identifiés à l’instar des métagénomes, ouvre la
voie à l’étude de l’activité d’enzymes auparavant difficilement accessibles. Les
méthodes expérimentales mises en œuvre incluent notamment le criblage d’activité de
banques d’enzymes (Kitagawa et al. 2005) sur des ensembles de substrats
(Saghatelian et al. 2004; Saito et al. 2006) et la recherche d’associations entre gènes et
phénotypes métaboliques (Aghaie et al. 2008).

1.4.2 Méthodes bioinformatiques de reconstruction des réseaux

métaboliques

La mise en évidence expérimentale des activités métaboliques opérant dans un

organisme constitue la preuve la plus directe de leur existence. Cependant, quand bien
même le débit des techniques expérimentales correspondantes a fortement augmenté
ces dernières années, celles-ci restent encore beaucoup trop lourdes à réaliser pour
élucider globalement le métabolisme de tout nouvel organisme.

La possibilité de séquencer des génomes complets à moindre coût offre

aujourd’hui une solution alternative efficace (Feist et al. 2009). En effet, le
développement du séquençage s’est accompagné de la mise en place de méthodes
bioinformatiques permettant d’une part de détecter les gènes sur la séquence du
génome et d’autre part d’inférer leurs fonctions, processus appelé annotation du
génome (Médigue & Moszer 2007). L’inférence de la fonction des gènes se base
essentiellement sur la recherche d’homologies avec les gènes de fonctions déjà
connues : deux gènes codant pour des séquences protéiques très proches ont de fortes
chances de coder pour des protéines de fonctions similaires. De cette manière, les
activités enzymatiques associées à certains gènes peuvent être propagées par
homologie aux gènes nouvellement séquencés, bien que la transitivité de ce processus
puisse induire des erreurs d’annotation. Afin d’augmenter la fiabilité des annotations

17
Activités orphelines

39
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

prédites, les processus actuels d’annotation automatique combinent les sources

d’informations (Médigue & Moszer 2007). En particulier, ceux-ci étudient par
exemple le contexte génomique18 des gènes pour confirmer et préciser les annotations
prédites. En moyenne, ces méthodes permettent de prédire une fonction pour 50 à 80
pour cent des gènes d’un organisme bactérien nouvellement séquencé (Serres et al.
2004).

Les fonctions enzymatiques prédites par les méthodes d’annotation constituent

une source primordiale de données permettant de reconstruire le réseau métabolique
de l’organisme étudié. Les méthodes classiquement utilisées pour annoter les
génomes sont cependant généralistes et ne précisent pas nécessairement le détail des
conversions métaboliques associées à une fonction enzymatique. De plus, la
spécificité des conversions catalysées par une enzyme prédite peut se révéler difficile
à établir sur la seule base d’homologie de séquences. Des méthodes dédiées à la
reconstruction du métabolisme à partir de génomes annotés ont été développées pour
répondre à ces faiblesses. Elles reposent sur des bases de données de réactions
métaboliques qui leur permettent d’énumérer les réactions potentiellement catalysées
par les fonctions enzymatiques annotées et d’en détailler la biochimie. Afin de
sélectionner les réactions les plus probables et de préciser leur spécificité, ces
méthodes examinent également leur contexte métabolique : l’existence d’une réaction
prédite peut en effet être confortée par la présence d’autres réactions impliquant ses
substrats et ses produits.

D’autres méthodes bioinformatiques ont été élaborées pour détecter les activités
métaboliques manquant dans le réseau métabolique reconstruit. Une partie d’entre-
elles se base sur la connaissance des voies métaboliques complètes pour détecter les
« trous » dans les voies constitués par les réactions manquantes. De nombreuses
méthodes ont également été développées pour combler ces trous et rechercher des

18
On appelle contexte génomique d’un gène toute information apportée par son
voisinage chromosomique. Il peut s’agir par exemple d’un type de fonction
biologique lorsque plusieurs gènes voisins possèdent des rôles contribuant à une
fonction biologique particulière. L’utilisation du contexte génomique peut être
renforcée par la recherche de synténies, c.-à-d. de groupes de gènes voisins co-
conservés chez différents organismes. La conservation groupée des gènes peut être un
indice du fait que les gènes contribuent ensemble à une fonction biologique.

40
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

gènes candidats, sur la base de leur contexte génomique, de leur occurrence

phylogénétique ou de leur expression.

Nous n’avons énuméré ici que les principales idées des méthodes
bioinformatiques de reconstruction des réseaux métaboliques. Nous en effectuerons
un état de l’art beaucoup plus détaillé plus loin dans le manuscrit, dans la revue
consacrée aux modèles globaux du métabolisme (voir section 3.2.1).

1.4.3 Vers une étude globale du métabolisme

L’efficacité des méthodes bioinformatiques de reconstruction du métabolisme

dépend directement de la variété de voies métaboliques et d’activités biochimiques
préalablement élucidées et de leur « proximité » avec l’organisme étudié.
L’accumulation considérable de connaissances sur les voies métaboliques fait
qu’aujourd’hui une part significative du métabolisme d’un organisme nouvellement
séquencé peut être reconstruite à l’aide de ces méthodes. À l’instar des organismes
modèles pour lesquels la majeure partie du métabolisme fut découverte par
expérimentation, la reconstruction in silico du métabolisme des organismes dont on
dispose de la séquence ouvre la voie à l’exploration globale de leurs voies
métaboliques et de leurs capacités de conversions. Il est évident que ces méthodes ne
peuvent détecter de novo des fonctions métaboliques originales, ces dernières n’ayant
jamais été identifiées auparavant et encore moins associées à un gène. Cependant, en
reconstituant rapidement la part déjà connue du métabolisme, ces méthodes
contribuent justement à en cerner la partie encore inconnue qui constitue souvent le
cœur d’intérêt de l’étude.

Le choix d’étudier le métabolisme d’un organisme en particulier est, dans de

nombreux cas, guidé par une caractéristique de sa physiologie : par exemple sa
capacité à exploiter un nutriment particulier, son efficacité accrue à survivre dans un
environnement donné ou son aptitude à produire un métabolite. Ces observations
traduisent généralement à l’échelle cellulaire des caractéristiques particulières de leur
métabolisme, caractéristiques dont l’élucidation est le but de ces études. De manière
plus générale, effectuer le lien entre des observations macroscopiques du métabolisme
d’une cellule – efficacité de conversion, vitesses de croissance ou de
consommation/production de métabolites, capacité de survie dans des environnements
chimiques donnés – et le détail des activités enzymatiques identifiées présente de

41
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

nombreux intérêts. D’une part, ces observations macroscopiques apportent des

informations supplémentaires sur le métabolisme, permettant d’évaluer la pertinence
des voies métaboliques reconstruites et de guider leur investigation. D’autre part, ces
observations sont la trace du fonctionnement in vivo du métabolisme et des flux de
conversions ayant réellement lieu dans la cellule. Elles complètent avantageusement
la vision statique des voies métaboliques en donnant des indications sur les
conversions réellement à l’œuvre.

Les techniques expérimentales d’investigation des « états cellulaires » ont en outre

considérablement progressées dans la dernière décennie, à la fois dans leurs
précisions et leurs débits (Joyce & Palsson 2006). Elles permettent ainsi d’étudier à
grande échelle le niveau de transcription des gènes (transcriptomique), la
concentration intracellulaire des protéines (protéomique), des métabolites
(métabolomique) et, pour l’instant dans une moindre mesure, le niveau des flux des
réactions métaboliques (fluxomique). Les données générées fournissent des
indications directes sur l’état des acteurs du métabolisme, offrant la capacité sans
précédent d’accéder aux états physiologiques internes de la cellule. Néanmoins, elles
nécessitent d’être intégrées, interprétées et combinées dans le contexte global du
métabolisme pour en tirer des conclusions pertinentes sur le fonctionnement
biochimique réel de la cellule.

La connaissance à grande échelle du métabolisme offre justement la possibilité

d’explorer globalement le fonctionnement du métabolisme et de le relier aux
comportements macroscopiques observés.

Afin de réduire la complexité des réseaux métaboliques, les biochimistes et les

microbiologistes ont traditionnellement utilisé le regroupement des réactions en voies
métaboliques pour raisonner globalement sur les conversions métaboliques (voir
1.3.1). Chaque voie métabolique y est vue indépendamment l’une de l’autre et est
caractérisée par son bilan, à savoir la transformation des métabolites d’entrées en
métabolites produits. En raisonnant sur les conversions des quelques métabolites clés
par ces voies métaboliques, un aperçu global de la physiologie de la cellule pouvait
alors être prédit et corroboré avec les observations réelles. De même, ce découpage du
métabolisme est régulièrement utilisé pour visualiser les données expérimentales dans

42
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

le contexte du métabolisme global (Kanehisa et al. 2006; Paley & Karp 2006;
Shannon et al. 2003).

Cette méthode de raisonnement trouve toutefois rapidement ses limites, pour au

moins deux raisons. Premièrement, la juxtaposition de voies métaboliques simplifie
souvent de manière exagérée les interconnexions existant entre processus
métaboliques. En effet, le bon fonctionnement d’une voie métabolique requiert
fréquemment l’exécution de conversions métaboliques « annexes », par exemple la
synthèse de précurseurs particuliers ou la régénération de métabolites cofacteurs. Un
raisonnement basé uniquement sur l’étude de l’enchaînement des voies métaboliques
risque ainsi de laisser de côté certaines interdépendances métaboliques jouant un rôle
significatif dans le comportement global. Ensuite, l’étude du fonctionnement réel du
métabolisme nécessite dans un grand nombre de cas de tenir compte de ses aspects
quantitatifs : comment se répartissent les flux de matière dans les voies métaboliques,
quelle quantité d’énergie est consommée par le fonctionnement de ces voies ? Quand
bien même il est possible de prendre manuellement en considération ces aspects
quantitatifs pour un nombre limité de voies métaboliques, étendre leur usage à
l’échelle du métabolisme entier nécessite l’emploi de méthodes plus systématiques.

Les modèles mathématiques du métabolisme répondent justement à ces deux types

de difficultés (voir section 3). Ils combinent généralement une description plus ou
moins détaillée des activités métaboliques présentes dans la cellule avec la capacité de
raisonner sur leurs états fonctionnels (concentrations de métabolites et d’enzymes,
flux de réactions) en appliquant les principes physiques déterminants. Ils ont ainsi été
particulièrement utilisés pour étudier la dynamique précise de voies métaboliques,
intégrer des données métaboliques expérimentales de diverses origines et prédire des
comportements métaboliques macroscopiques. Nous effectuerons une revue plus
complète des types de modélisation métabolique existant dans la section 3.

Notre thèse s’inscrit directement dans ce schéma. Son objectif est de développer
des outils et méthodes permettant au mieux d’interpréter un certain type
d’observations métaboliques macroscopiques – les phénotypes de croissance (voir
section 2) – à la lumière du réseau métabolique, en utilisant pour cela la modélisation
mathématique.

43
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

2 Phénotypes de croissance et essentialité de gènes

2.1 Phénotypes de croissance
On appelle phénotype toute caractéristique observable d’un organisme. Un
phénotype de croissance désigne ainsi toute caractéristique propre à la croissance des
microorganismes. Par exemple : dans quels environnements sont-ils capables de se
développer, à quelle vitesse ; dans quelles proportions les nutriments sont-ils
consommés, quels sont les composés produits. Alors que les approches d’exploration
du métabolisme présentées ci-dessus sont particulièrement adaptées pour décrire le
détail des conversions chimiques à l’œuvre, l’étude des phénotypes de croissance
fournit des informations d’échelle plus large mais néanmoins complémentaires sur le
fonctionnement du métabolisme.

Les expériences de cultures suivies de microorganismes permettent de mesurer à

intervalles de temps réguliers la composition chimique de l’environnement des
organismes, ainsi que la quantité de biomasse créée (voir Figure 8). À l’aide de ces
mesures, les échanges métaboliques entre les organismes et leur environnement
(consommation de substrats, excrétion de produits) peuvent être déterminés
quantitativement et reliés à leur vitesse de croissance. Ces observations de la
physiologie des organismes fournissent des informations importantes sur le
fonctionnement in vivo du métabolisme, quand bien même elles sont d’échelle
macroscopique. Par exemple, les suivis de la consommation d’oxygène et de substrat
carboné ainsi que de la production de dioxyde de carbone sont traditionnellement
utilisés pour évaluer le rendement de production énergétique des microorganismes
(Neijssel et al. 1996). De même, lorsque l’ensemble des échanges suivis est
suffisamment exhaustif, un bilan « d’utilisation du carbone » par le métabolisme peut
être effectué, permettant de déterminer quel usage est fait des nutriments carbonés par
les organismes. La répartition du carbone entre les molécules de dioxyde de carbone,
produits de fermentation et biomasse fournit des indications quant au régime
métabolique en cours dans les microorganismes.

44
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 8. Expérience de croissance suivie pour une population d’Escherichia coli

cultivée dans un fermenteur en condition aérobie. Tracé des concentrations de glucose,
biomasse, acétate et éthanol en fonction du temps.

Une autre classe d’expériences consiste à cribler à grande échelle la croissance des
microorganismes sur des milieux distincts. En utilisant des milieux minimaux19 dans
lesquels les métabolites sources de carbone, azote, phosphore et soufre sont testés de
manière systématique, ces expériences permettent de déterminer rapidement quels
métabolites sont exploités par l’organisme. Ces résultats sont utilisés de manière
courante par les microbiologistes pour classer les microorganismes et définir les
espèces20 ; ils fournissent également des indications quant à leurs environnements
naturels. De plus, le fait d’associer les métabolites aux types de contributions
métaboliques (apport en carbone, azote, phosphore ou soufre ; accepteur d’électron)
guide la recherche des voies métaboliques sous-jacentes.

Habituellement, ces expériences sont réalisées « manuellement » en testant la

croissance sur un ensemble de milieux minimaux préparés séparément. Cependant, la
société Biolog a récemment développé et commercialisé un procédé permettant
d’augmenter le débit de ces tests en utilisant des plaques à 96 puits contenant des

19
Un milieu minimal est un milieu de culture de composition contrôlée, couvrant de
manière minimale les besoins en nutriments de la cellule. Généralement, un milieu
minimal possède un seul type de métabolite contribuant à chaque apport de carbone,
azote, phosphore et soufre.
20
Voir http://www.bacterio.cict.fr/

45
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

milieux minimaux distincts. Ces milieux sont tous des variations autour d’une même
base, permettant de cribler de manière systématique les sources de carbone, azote,
soufre ou phosphore (Bochner 2009). Après inoculation, la croissance et l’activité
métabolique21 sont automatiquement suivies au cours du temps dans chacun des puits
(voir Figure 9). À l’heure actuelle, Biolog propose 20 plaques de phénotypage
différentes, représentant un ensemble de 1920 milieux. Parmi eux, 190 testent des
sources de carbone, 380 des sources d’azote et 95 des sources de soufre et de
phosphore. Les milieux restants évaluent la sensibilité des cellules à diverses
molécules chimiques, dont une majorité d’antibiotiques, ainsi qu’à des changements
de pH et de force ionique.

Figure 9. Activités métaboliques comparées de deux souches bactériennes sur 96

sources de carbone distinctes. En rouge et vert, cinétiques de croissance spécifiques à
chacune des souches. En jaune, partie commune de leurs cinétiques. Extrait de Bochner (2009)

2.2 Exploration génétique des phénotypes de croissance

Les phénotypes représentent des caractéristiques de l’organisme étudié, qui sont
souvent aisément observables. Le développement de la biologie moléculaire, et
notamment du génie génétique, a fourni des outils permettant d’investiguer ces
phénotypes et de rechercher des associations fonctionnelles entre eux et les gènes.
Une grande classe d’expériences développées dans cet esprit consiste à rechercher les

21
Dans la méthodologie Biolog, un rapporteur coloré de la respiration cellulaire (le
tetrazolium) est incorporé aux puits. Son niveau est suivi en parallèle à la quantité de
cellule obtenue par mesure de la densité optique (Bochner 2009).

46
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

pertes de phénotypes provoquées par la suppression d’un gène. Pour ce faire, elles
comparent les phénotypes de l’organisme sauvage avec ceux de l’organisme dont le
gène ciblé a été inactivé ou éliminé par génie génétique, organisme mutant. Ces
expériences permettent ainsi de mettre expérimentalement en évidence des liens de
causalité entre la présence d’un gène et l’occurrence d’un phénotype particulier.

S’agissant des phénotypes de croissance, l’altération recherchée la plus

significative est la létalité, c’est-à-dire la perte de la capacité à croître
consécutivement à l’inactivation ou l’élimination d’un gène. Ces gènes sont
généralement désignés comme essentiels22. De plus, la létalité peut n’être observée
que pour une partie des environnements testés, on parle dans ce cas de gènes
conditionnellement essentiels.

Dans cette section, nous donnerons un bref aperçu des principales techniques
expérimentales permettant de tester à grande échelle les effets de l’inactivation de
gènes, puis nous présenterons les principales applications de ces méthodes, en
particulier pour l’exploration du métabolisme.

2.2.1 Techniques expérimentales

Deux aspects de ces techniques expérimentales peuvent être distingués (bien qu’ils
ne soient pas complètement indépendants) : d’une part la méthode utilisée pour
inactiver ou éliminer les gènes et d’autre part la stratégie employée pour détecter à
grande échelle les gènes essentiels.

Inactivation des gènes

Trois catégories de techniques expérimentales permettent d’inactiver les gènes :

(1) l’insertion d’un transposon dans le gène, (2) la délétion totale du gène par
recombinaison et (3) l’inactivation des transcrits par ARN interférents.

Le mécanisme de transposition23 offre un outil d’inactivation génique puissant et

relativement simple à utiliser (Hayes 2003). Le principe de l’inactivation consiste à

22
Par opposition aux gènes non-essentiels. La terminologie principalement utilisée en
anglais est « essential genes » et « dispensable genes ».
23
Les transposons sont des séquences ADN pouvant se déplacer, et a fortiori,
s’intégrer de manière autonome dans le génome. Le mécanisme de transposition

47
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

insérer le transposon au sein de la séquence du gène ciblé de manière à empêcher la

transcription de sa séquence complète (voir Figure 10). Les sites d’insertion des
transposons étant difficilement contrôlables et modifiables en fonction des gènes
ciblés, les techniques d’inactivation génique emploient des stratégies d’insertion
aléatoire des transposons dans le génome. D’un point de vue pratique, les transposons
utilisés sont donc choisis pour pouvoir s’insérer de la manière la moins biaisée
possible à n’importe quel endroit du génome. Différentes stratégies expérimentales
ont été développées pour favoriser la transposition ; d’une part des stratégies in vivo
utilisant des plasmides ou des phages introduisant les séquences ADN des transposons
dans les cellules, et d’autre part des stratégies in vitro, réalisant tout ou partie de la
transposition hors de la cellule avant intégration dans le génome (Reznikoff &
Winterberg 2008). Les techniques d’inactivation par transposition présentent
l’avantage de pouvoir « inactiver » très facilement de nombreux sites dans le génome,
de manière non ciblée. Combinées avec des méthodes efficaces de sélection des
mutants (voir ci-dessous), ces techniques permettent de révéler rapidement des
altérations chromosomiques délétères. L’interprétation de « l’altération
chromosomique » provoquée par l’insertion d’un transposon n’est cependant pas
forcément évidente. D’une part, l’inactivation du gène par insertion n’est en effet pas
forcément réalisée et, d’autre part, l’insertion peut provoquer des effets polaires
perturbant la transcription de gènes éloignés du site d’insertion, mais présents dans le
même opéron. D’autre part, le biais d’insertion des transposons, même faible, rend
inaccessibles à l’étude certaines régions du génome et perturbe l’analyse statistique
des études par insertion aléatoire (Hayes 2003).

repose sur l’utilisation d’une enzyme, la transposase, capable d’exciser puis

d’intégrer le transposon dans la séquence ADN.

48
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 10. Illustration du mode d’action d’un transposon. Le transposon, préalablement

excisé de son vecteur et attaché à la transposase, se lie au gène cible. La transposase
catalyse alors l’intégration du transposon dans la séquence de l’ADN ciblé, altérant la
structure du gène X. Illustration issue de Reznikoff & Winterberg (2008).

Afin de maîtriser au mieux l’inactivation des gènes, l’excision précise et totale du

gène de la séquence génomique est parfois privilégiée, même si le coût humain et
matériel est nettement supérieur à celui des méthodes de transposition. Les techniques
utilisées à cet effet s’appuient généralement sur les processus de recombinaison
homologue permettant de remplacer la région génomique ciblée par une séquence de
substitution introduite dans la cellule, portant un marqueur de sélection destiné à
identifier les mutants corrects (de Berardinis et al. 2008; Baba et al. 2006; Giaever et
al. 2002). La séquence de substitution peut ensuite être éliminée pour réduire les
effets polaires et pouvoir répéter le processus de délétion à un autre endroit du
génome. Nous détaillerons plus loin dans ce manuscrit un exemple de protocole de
délétion utilisé pour la bactérie Acinetobacter baylyi (section 4.3). Bien que très
précise, chaque délétion doit cependant être réalisée individuellement, rendant le
processus laborieux pour la délétion systématique de nombreux gènes (du fait du
nombre important de constructions génétiques spécifiques à réaliser).

Enfin, un dernier grand type de technique utilisé consiste à inactiver, non pas le
gène directement, mais ses transcrits à l’aide d’ARN interférents. Largement utilisée
dans le cas des cellules eucaryotes et notamment d’organismes supérieurs
(Dykxhoorn et al. 2003), cette technique est employée également avec succès chez les
bactéries (Engdahl et al. 1997; Ji et al. 2001; Forsyth et al. 2002). Elle permet
d’inactiver spécifiquement l’action du gène ciblé avec des risques moindres
d’interactions avec celles d’autres gènes. L’inactivation n’est souvent cependant que

49
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

partielle, une petite partie des transcrits pouvant ne pas être détruite et maintenant une
expression faible mais bien présente.

Stratégies de détection des gènes essentiels

De manière générale, la recherche d’essentialité des gènes se base sur l’étude des
phénotypes de croissance des mutants obtenus par les techniques d’inactivation
précédentes. Les méthodes d’étude des phénotypes de croissance (voir la section
précédente) s’appliquent donc également au cas des mutants. Des stratégies
particulières ont néanmoins été développées pour augmenter l’efficacité de la
recherche des gènes ayant un impact significatif sur la croissance.

Il est tout d’abord utile de distinguer deux manières d’évaluer l’aptitude à croître
des mutants, dont les différences ont des conséquences significatives sur
l’interprétation de leurs résultats (Gerdes et al. 2006). D’une part, la croissance des
mutants peut être évaluée de manière clonale, séparément pour chacun d’entre eux. Le
phénotype observé correspond alors directement à l’aptitude brute à croître du mutant.
Celle-ci peut également être quantifiée (voir partie précédente) afin de comparer non
seulement l’aptitude mais aussi l’efficacité à croître. D’autre part, le second type de
test consiste à évaluer l’aptitude à croître des mutants au sein de populations de
cellules mélangeant mutants et souches sauvages. Dans cette configuration, la
croissance s’effectue en compétition avec les autres souches ; on observe les effets
des mutations sur la valeur sélective des individus. L’essentialité des gènes est donc
définie ici par rapport à leur contribution à l’efficacité de survie de l’organisme (gènes
essentiels au succès reproducteur), et non plus seulement par rapport à leur seule
capacité à croître (gènes essentiels à la survie). Le choix de la méthode dépend alors
de l’exploitation faite des résultats. La première identifie de manière nette les gènes
indispensables au phénotype observé, permettant d’investiguer leurs liens, tandis que
la seconde, plus large, permet d’identifier des gènes de contributions moindres mais
potentiellement importantes du point de vue évolutif.

La stratégie la plus directe de détection des gènes essentiels consiste à inactiver

systématiquement chacun des gènes du génome et à tester les phénotypes de
croissance des mutants correspondants. Cette approche requiert de pouvoir générer les
mutants de manière ciblée. Pour cette raison, les techniques majoritairement utilisées
sont les délétions par recombinaison homologue et l’interférence par ARN (Carpenter

50
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

& Sabatini 2004), mais des protocoles ont également été développés sur la base de
transposons (Kang et al. 2004; Reznikoff & Winterberg 2008; Kobayashi et al. 2003).
L’avantage principal de cette stratégie réside dans sa couverture complète du génome,
tous les gènes sont systématiquement testés (aux impossibilités expérimentales près).
De plus, les mutants créés sont généralement conservés et peuvent être aisément
phénotypés ultérieurement pour de nouvelles conditions expérimentales, bénéficiant
par exemple alors du débit apporté par des méthodes du type Biolog. E revanche, la
création systématique d’un mutant pour chaque gène est une opération lourde, de
débit faible.

Afin d’augmenter le débit de l’expérience, des stratégies basées sur l’inactivation

aléatoire (ou « shotgun ») des gènes – par transposon (Reznikoff & Winterberg 2008)
ou ARN interférent (Ji et al. 2001) – ont été développées. Le principe de ces stratégies
consiste à générer un nombre suffisamment élevé de mutants d’inactivation24 afin
que, statistiquement, chacun des gènes ait une probabilité significative d’avoir été
inactivé (ou plutôt, une probabilité faible de ne pas avoir été inactivé). En observant
ensuite dans les mutants viables à quels endroits sur le génome se retrouvent les
transposons (voir Figure 11) ou correspondent les ARN interférents, les gènes non-
essentiels peuvent être déterminés. La couverture statistique suffisante des
inactivations (appelée saturation) permet alors de déduire que les gènes jamais
impactés sont essentiels dans les conditions de l’expérience. Comme mentionné plus
haut, le test de croissance des mutants peut être réalisé de manière clonale ou au sein
d’une population. La méthode de « genetic footprinting », relativement répandue pour
rechercher les gènes spécifiquement associés à un phénotype particulier, correspond à
ce dernier cas (Smith et al. 1995; Hare et al. 2001). Les lieux d’insertions des
transposons (déterminés par PCR25, voir Figure 11) sont comparés pour deux
populations similaires mais cultivées dans des environnements distincts. Les

24
Dans le cas des transposons, la non spécificité de l’insertion garantit dans une
certaine mesure la couverture aléatoire des inactivations. Dans le cas des ARN
interférents, des banques aléatoires d’ARN antisens sont généralement créées par
fractionnement aléatoire de la séquence génomique (Ji et al. 2001).
25
PCR : « Polymerase Chain Reaction ». Méthode d’amplification d’une région
précise de l’ADN à partir d’oligonucléotides délimitant les extrémités de la région et
servant d’amorces à l’ADN polymérase. La région amplifiée est appelée produit de
PCR.

51
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

différences significatives de fréquence d’insertion à certaines localisations du génome

révèlent alors l’essentialité conditionnelle des gènes correspondants. Le principal
inconvénient des stratégies aléatoires est la faible maîtrise de l’inactivation des gènes,
rendant parfois difficile l’interprétation de l’origine de l’essentialité.

Figure 11. Méthode de « genetic footprinting ». Les lieux d’insertion des transposons sont
déterminés par la longueur des produits de PCR entre les amorces choisies à des endroits
connus du génome et les amorces placées dans les transposons. Les zones vides du gel
d’électrophorèse correspondent aux régions génomiques n’ayant pas retenu d’insertion après
sélection des mutants, révélant une possible essentialité des gènes présents à ces loci.
Demi-flèches, amorces de PCR ; losanges, lieux d’insertion des transposons. Figure extraite de
Scholle & Gerdes (2008).

Ces stratégies furent appliquées à un nombre pour l’instant relativement restreint

d’organismes (voir Tableau 3). Cependant, leur accessibilité est en constante
amélioration, et il est probable qu’elles occuperont une place plus importante dans la
boîte à outils des biologistes moléculaires (Carpenter & Sabatini 2004). S’agissant des
résultats d’essentialités existants, il est utile de mentionner les initiatives ayant pour
but de les centraliser (Yamazaki et al. 2008; Zhang & Lin 2009).

52
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Test de
Méthode
Organisme croissance des Référence
d’inactivation
mutants
A. baylyi ADP1 Délétion ciblée Clones (de Berardinis et al.
2008)
M. genitalium, M. Transposon, Population (Hutchison et al. 1999)
pneumonia aléatoire
M.genitalium Transposon, Clones (Glass et al. 2006)
aléatoire
M. pulmonis Transposon, Clones (French et al. 2008)
aléatoire
S. aureus ARN interférent, Clones (Ji et al. 2001)
WCUH29 aléatoire
S. aureus ARN interférent, Clones (Forsyth et al. 2002)
RN4220 aléatoire
H. influenzae Rd Transposon, Population (Akerley et al. 2002)
aléatoire
S. pneumoniae Disruption ciblée Clones (Thanassi et al. 2002)
Rx-1
S. pneumoniae Délétion ciblée Clones (Song et al. 2005)
D39
M. tuberculosis Transposon, Population (Sassetti et al. 2003)
H37Rv aléatoire
B. subtilis 168 Disruption ciblée Clones (Kobayashi et al. 2003)
E. coli K-12 Transposon, Population (Gerdes et al. 2003)
MG1655 aléatoire
E. coli K-12 Transposon, ciblée Clones (Kang et al. 2004)
MG1655
E. coli K-12 Délétion ciblée Clones (Baba et al. 2006)
MG1655
P. aeruginosa Transposon, Clones (Jacobs et al. 2003)
PAO1 aléatoire
P. aeruginosa Transposon, Clones (Liberati et al. 2006)
PA14 aléatoire
S. typhimurium Disruption aléatoire Clones (Knuth et al. 2004)
H. pylori G27 Transposon, Population (Salama et al. 2004)
aléatoire
F. novicida Transposon, Clones (Gallagher et al. 2007)
aléatoire
Tableau 3. Études expérimentales à grande échelle de l’essentialité des gènes pour
des organismes bactériens. Données issues et complétées à partir de Gerdes et al (2006).

2.2.2 Exploitation des données d’essentialité

Historiquement, les premières études d’essentialité de gènes chez les bactéries

furent motivées par la recherche de cibles thérapeutiques pour des médicaments anti-
infectieux (Ji et al. 2001; Thanassi et al. 2002; Forsyth et al. 2002; Hare et al. 2001;
Arigoni et al. 1998; Reich et al. 1999; Chalker & Lunsford 2002). De nombreuses
études furent ainsi conduites pour des bactéries pathogènes, notamment dans le cadre
des recherches de groupes privés.

53
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Toujours à des fins d’applications pratiques, l’étude des phénotypes d’inactivation

de gènes est également utilisée en ingénierie du métabolisme. Elle permet d’identifier
des mutations optimisant l’efficacité de production (ou de dégradation, selon
l’objectif recherché) de l’organisme utilisé en neutralisant par exemple des voies
alternatives en compétition pour les ressources ou des régulations inhibitrices (Park et
al. 2008).

Plus fondamentalement, les études portant sur l’évolution des organismes, et

notamment de leurs génomes, ont exploité avec intérêt les résultats d’essentialité des
gènes. Un grand nombre d’entre elles ont ainsi cherché à établir des corrélations entre
l’essentialité des gènes et leurs caractéristiques évolutives, par exemple la vitesse
d’évolution ou les biais de leurs séquences, leur conservation entre les espèces ou leur
position dans le génome (Fang et al. 2005; Gong et al. 2008; Papp et al. 2004;
Harrison et al. 2007; Rocha & Danchin 2003). Ces analyses sont motivées par
l’exploration des mécanismes d’évolution ; la distinction entre gènes essentiels et
gènes non-essentiels permet d’une part d’estimer l’impact de la valeur sélective des
gènes sur leur évolution et d’autre part d’évaluer l’importance de la robustesse aux
perturbations génétiques comme caractère marquant de l’évolution. Une autre partie
des études liées à l’évolution se sont basées sur l’hypothèse que les gènes essentiels
représentent des fonctions universellement requises, devant donc être retrouvées dans
chaque organisme. En combinant données d’essentialité et analyses de la conservation
des gènes entre organismes, ces études ont cherché à élucider des scénarios évolutifs
et à reconstruire des génomes ancestraux (Koonin 2003). De manière connexe, de
nombreuses initiatives ont été entreprises pour construire des génomes minimaux, à la
fois via des méthodes bioinformatiques ou expérimentales (Koonin 2003; Glass et al.
2006; Mushegian & Koonin 1996).

Enfin, et plus proche du sujet de cette thèse, les phénotypes de croissance de

mutants sont aussi largement utilisés pour rechercher les fonctions de gènes et
comprendre le fonctionnement de processus biologiques. Ces approches sont basées
sur la recherche de liens de causalités spécifiques entre la présence d’un gène et
l’occurrence d’un phénotype, afin de guider soit la recherche des gènes impliqués
dans la réalisation d’une fonction particulière (approche de génétique classique), soit
la recherche de fonctions biologiques associées à un gène particulier (approche de

54
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

génétique inverse, voir Figure 12). À ces deux types d’approches correspondaient
traditionnellement des types d’expériences distinctes, par exemple le « genetic
footprinting » en génétique classique ou le phénotypage à haut débit en génétique
inverse. La réalisation de banques de mutants d’inactivation à grande échelle permet
désormais de lier les deux approches, où les phénotypes de chacun des mutants
peuvent être systématiquement testés (Carpenter & Sabatini 2004). Ces approches
sont utilisées à des fins exploratoires (Aghaie et al. 2008) mais également de
confirmation ou d’invalidation de fonctions de gènes, lorsque celles-ci sont attribuées
sur la base d’indices faibles (de Berardinis et al. 2008; Joyce et al. 2006; Baba et al.
2006). Les processus métaboliques se prêtent bien à l’utilisation de ces approches
(Gerdes et al. 2006), qui ont d’ailleurs largement contribué à l’identification des gènes
impliqués dans les voies métaboliques connues. En effet, des tests phénotypiques
caractérisant assez précisément une fonction métabolique peuvent être élaborés en
combinant complémentation par des substrats et inactivation de voies métaboliques.
Une formalisation de cette démarche a d’ailleurs été récemment développée et mise
en pratique dans un robot réalisant automatiquement à la fois les raisonnements et les
expériences correspondant à ce type d’approche (King et al. 2009; King et al. 2004).

Figure 12. Principes des approches de génétique classique et de génétique inverse.

Toutes ces études reconnaissent cependant l’existence de difficultés dans

l’utilisation des données d’essentialités de gènes. Tout d’abord, comme souligné plus
haut, l’effet phénotypique d’une inactivation de gène s’interprète parfois de manière

55
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

ambiguë. La non-viabilité d’un mutant dépend en effet fortement des conditions de

croissance de celui-ci et de sa mise en compétition ou non au sein d’une population de
cellules. L’environnement de croissance a de plus un effet majeur sur l’essentialité
des gènes, surtout pour ceux jouant un rôle dans le métabolisme. Cet aspect est mis à
profit pour justement identifier les gènes spécifiques à un environnement dans un
organisme donné, mais il brouille les comparaisons d’essentialité entre organismes
(Gerdes et al. 2006). Enfin, et surtout, l’essentialité d’une fonction biologique dans un
organisme n’implique pas nécessairement l’essentialité du ou des gènes associés à sa
réalisation. La présence de mécanismes alternatifs ou de gènes de fonctions
redondantes peut en effet rendre chacun des gènes individuellement non-essentiels.
Cette robustesse aux perturbations génétiques motive par ailleurs de nombreuses
études (Papp et al. 2004; Kuepfer et al. 2005; Deutscher et al. 2006; Stelling et al.
2004; Kitano 2007) mais rend la recherche de fonctions essentielles plus délicate. Le
recours aux délétions multiples permet d’aller un cran plus loin dans cette recherche
(Tong et al. 2004; Butland et al. 2008), mais l’explosion du nombre de combinaisons
à tester rend impossible l’utilisation naïve de ces approches.

Dans le cas du métabolisme, la connaissance des voies métaboliques et des

associations entre gènes et activités réactionnelles peut aider à interpréter
correctement les résultats d’essentialité au regard de l’environnement et des
potentielles redondances (Gerdes et al. 2006). Cependant, comme déjà mentionné plus
haut, la complexité du métabolisme et le grand nombre de résultats à interpréter
rendent ces analyses souvent difficiles à réaliser. La modélisation du métabolisme
peut justement assister l’investigateur dans cette tâche en réalisant ces raisonnements
automatiquement. Ceci constitue le sujet des travaux de notre thèse qui s’inscrit dans
un mouvement global d’initiatives en ce sens, dont nous effectuerons une revue dans
la partie suivante.

3 Modélisation du métabolisme
Dans cette section, nous donnerons tout d’abord une rapide vue d’ensemble des
méthodes de modélisation du métabolisme – avec un point de vue orienté vers la prise
en compte de l’ensemble du métabolisme de la cellule – avant de présenter plus en
détail la méthode de modélisation retenue dans cette thèse. En dernier lieu, nous

56
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

effectuerons un état de l’art à la date du début de la thèse – fin 2005 – sur

l’exploitation des phénotypes de croissance et des essentialités de gènes à l’aide des
modèles métaboliques.

3.1 Approches de modélisation du métabolisme

Largement employées en physique, mécanique ou chimie, la modélisation et la
simulation informatique ne sont en comparaison utilisées que depuis récemment en
biologie, à l’exception notable de l’écologie et de l’épidémiologie dans lesquelles les
mathématiques occupent une place significative depuis longtemps (May 2004). Les
systèmes physico-chimiques étudiés en biologie ont en effet longtemps été jugés
difficiles à aborder par ces approches du fait de leur grande complexité et surtout de la
part importante d’inconnu dans leur fonctionnement. Cependant, depuis quelques
décennies, des progrès considérables ont été effectués dans leur compréhension grâce
notamment aux avancées technologiques qui permettent de caractériser un nombre
toujours croissant de leurs acteurs et interactions. La reconnaissance toujours présente
(et même accrue) de la complexité de ces systèmes associée à la disponibilité
d’informations sur leurs acteurs ont alors motivé le développement d’approches plus
formelles pour la compréhension globale de ces systèmes26 dans lesquelles les
mathématiques et la modélisation jouent un rôle primordial. Le projet Physiome,
consacré à l’étude du fonctionnement du cœur par la modélisation à différentes
échelles – moléculaire, cellulaire, de l’organe entier – et de différentes composantes –
mécanique, biochimique, électrique –, est un exemple phare de ce type d’approche
(Noble 2002; Hunter & Borg 2003).

S’agissant du métabolisme, une variété relativement large de méthodes de

modélisation ont été élaborées, dont la nature dépend souvent à la fois des questions
posées et de la « culture » scientifique – informatique, mathématique, physique – de
leurs auteurs. En première approximation, on peut distinguer ces méthodes selon le
niveau de détail de leurs prédictions (Figure 13) (Stelling 2004).

26
Désignées communément sous le terme de biologie des systèmes (Kitano 2002;
Stelling 2004).

57
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 13. Formalismes de modélisation du métabolisme classés selon leurs niveaux

de détails. (a) modélisation sous forme de graphes, construits à partir d’informations sur les
interactions entre les acteurs du métabolisme, (b) modélisation à base de contraintes, tenant
compte des relations quantitative entre flux de réaction lorsque le métabolisme opère en
régime stationnaire, (c) modélisation cinétique, représentant l’évolution temporelle des
quantités d’enzymes et de métabolites. Les illustrations sur la ligne inférieure représentent
des résultats typiques de ces méthodes : (a) métabolites centraux (liés à un grand nombre de
métabolites) en rouge dans un réseau métabolique, (b) ensemble des valeurs de flux
réactionnels possibles en régime stationnaire (pour plus de détails su ce formalisme, voir
section 3.2), (c) dynamique de la concentration de métabolites. Figure issue de Stelling (2004).

La méthode de modélisation a priori la plus naturelle pour un physicien consiste à

décrire l’évolution dans le temps des quantités de métabolites et d’enzymes ; il s’agit
de la modélisation cinétique ou modélisation quantitative (Di Ventura et al. 2006).
Pour cela, des modèles mathématiques de la cinétique des enzymes (voir la section
1.2.4 et Cornish-Bowden (2004)) sont utilisés pour représenter les dépendances entre
ces grandeurs, le plus souvent sous la forme d’équations différentielles. Leur
résolution analytique est le plus souvent impossible sauf dans les cas très simples. On
utilise alors la simulation informatique pour obtenir une solution numérique – des
courbes d’évolution dans le temps des grandeurs – ou des outils théoriques, tels que
les analyses de bifurcation et de stabilité, pour caractériser le comportement du
système (Di Ventura et al. 2006). La complexité des modèles cinétiques varie
significativement, en fonction des hypothèses simplificatrices formulées et de la taille
du réseau métabolique considéré. Ainsi, certains modèles prennent en compte la
localisation spatiale des molécules dans la cellule (Lemerle et al. 2005; Moraru et al.
2008) tandis que d’autres (la majorité) supposent une répartition homogène. De
même, la sensibilité des processus aux fluctuations aléatoires peut nécessiter un

58
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

traitement stochastique de ces phénomènes, rendant leur résolution plus complexe (Di
Ventura et al. 2006; Gillespie 2007). Les modèles cinétiques ont été employés avec
succès pour analyser le comportement dynamique de petits systèmes métaboliques et
prédire leurs réponses à des perturbations (Klipp et al. 2002; Zaslaver et al. 2004).
Leurs applications les plus significatives jusqu’à présent portent toutefois plutôt sur
les processus de signalisation ou de régulation transcriptionnelle (Di Ventura et al.
2006; Barkai & Leibler 1997; Bonneau et al. 2007).

Les phénotypes de croissance sont une manifestation globale du fonctionnement

du réseau métabolique. Leur étude requiert donc de tenir compte de l’ensemble des
réactions. La modélisation cinétique ne peut satisfaire actuellement cette contrainte.
D’une part, les comportements cinétiques des enzymes ne sont de loin pas tous
caractérisés27 et reposent sur de nombreux paramètres numériques souvent
inconnus28. D’autre part, le nombre de réactions impliquées rend les analyses
extrêmement complexes et souvent difficiles à réaliser, même par simulation
numérique. Pour ces raisons, des cadres de modélisation de moindres capacités
prédictives – prédictions moins précises ou hypothèses plus restrictives – mais aux
formalismes utilisables à des tailles de réseaux métaboliques plus importantes ont été
élaborés.

L’analyse du contrôle métabolique a pour objectif de quantifier les dépendances

entre les différentes grandeurs d’un système métabolique – flux de réaction,
concentrations de métabolites ou d’enzymes – fonctionnant en première
approximation autour d’un régime stationnaire (Kacser & Burns 1973; Heinrich &
Rapoport 1974; Fell 1992). Ce type d’analyse détermine typiquement des coefficients
de contrôle exprimant dans quelle mesure les variations de certaines grandeurs
influent sur les autres grandeurs et le comportement global du système. L’application
de ce type d’analyse à des voies métaboliques linéaires a par exemple pu montrer que
le contrôle du flux à l’état stationnaire d’une voie métabolique de ce type se répartit
entre les différentes enzymes de cette voie et n’est pas simplement déterminé par une

27
Même si des initiatives cherchent à établir des cinétiques « génériques » pour les
enzymes (Liebermeister & Klipp 2006).
28
Malgré l’existence de bases de données centralisant les informations sur ces
paramètres (Barthelmes et al. 2007; Wittig et al. 2006).

59
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

seule d’entre elle29, « l’étape limitante » (Fell 1992). D’un point de vue plus global et
plus proche des phénotypes de croissance, ce type d’analyse a également été utilisé
pour étudier les dépendances entre l’efficacité à se reproduire d’organismes et les flux
dans certaines de leurs voies métaboliques clés (Dykhuizen et al. 1987). Néanmoins,
ces analyses nécessitent toujours de déterminer un nombre relativement élevé de
paramètres numériques (quantifiant les dépendances), bien que plus réduit que ceux
des modèles cinétiques. Pour cette raison, l’analyse du contrôle métabolique est
majoritairement appliquée dans deux cas de figures distincts : (1) la démonstration
théorique d’un type de comportement métabolique et (2) l’étude précise du
comportement d’un ensemble de quelques voies métaboliques en exploitant des
données expérimentales.

À un niveau de simplification supplémentaire se situe la modélisation à base de

contraintes (Price et al. 2004), que nous avons adoptée dans cette thèse et dont nous
présenterons le formalisme et les références majeures dans la section suivante (section
3.2). Ce cadre de modélisation se concentre exclusivement sur l’étude des régimes
stationnaires du métabolisme, mais sans chercher à quantifier leurs dépendances aux
variations des grandeurs du système tel que le fait l’analyse du contrôle métabolique.
Dans un souci de simplicité, il décrit le fonctionnement du métabolisme uniquement
avec les flux de réaction. Plutôt que de chercher à déterminer la valeur précise de ces
flux, tâche difficile et nécessitant une grande quantité d’information (c’est un des
objectifs des modèles cinétiques), le principe de ces modèles consiste au contraire à
exploiter au mieux l’information disponible pour affiner progressivement la
caractérisation des flux métaboliques. Ces modèles raisonnent ainsi sur des ensembles
de valeurs de flux possibles compte tenu de l’information disponible : peu
d’information résulte en de grands ensembles de valeurs possibles tandis que l’ajout
d’information réduit leurs tailles (et affine donc la connaissance des flux).
L’information est prise en compte dans ces modèles sous forme de contraintes
mathématiques sur les flux. Celles-ci peuvent simplement définir des plages de
valeurs connues (ou mesurées) pour certaines réactions ou traduire des dépendances
complexes entre flux. L’hypothèse de régime stationnaire entre dans ce dernier cas ;

29
La répartition du contrôle n’est cependant pas homogène et, quand bien même il
n’existe pas une unique étape limitante, le but de l’analyse du contrôle métabolique
est de déterminer lesquelles contribuent le plus significativement au contrôle.

60
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

elle se traduit mathématiquement par des relations linéaires entre flux exprimant la
conservation de la matière. Le principal atout de cette méthode est donc de pouvoir
gérer le manque d’information et de pouvoir ainsi être appliquée pour des systèmes de
tailles plus conséquentes que pour les modèles cinétiques. Dans la pratique, son
utilisation pour des réseaux métaboliques globaux permet d’obtenir des prédictions
intéressantes sur la valeur de leurs flux, notamment grâce au fait que la contrainte de
régime stationnaire puisse être appliquée à cette échelle30 et contribue à affiner
significativement la caractérisation des flux. Nous reviendrons plus en détail sur ce
cadre de modélisation dans la partie suivante.

La représentation du réseau métabolique sous forme de graphe permet d’en

simplifier encore plus sa modélisation (voir Figure 13). Un graphe est un concept
mathématique et informatique permettant de représenter des liens (éventuellement
orientés) entre objets ; il se compose simplement d’un ensemble d’objets et d’un
ensemble de liens entre objets31. Les développements de la théorie des graphes ont
apporté un vaste panel de méthodes pour explorer leurs propriétés : recherche de
chemins entre objets à travers les liens du graphe, statistiques topologiques, recherche
de motifs topologiques caractéristiques, décomposition en sous-graphes de densités de
liens plus élevées… De par sa nature, le réseau métabolique se prête bien à
l’utilisation des graphes. Il peut être représenté sous la forme d’un graphe simple où
les objets sont les réactions ou les métabolites et les liens indiquent que les réactions
(respectivement les métabolites) partagent un ou plusieurs métabolites
(respectivement une ou plusieurs réactions). Il peut être également représenté de
manière plus complète en utilisant un graphe à deux types d’objets32 dans lequel à la
fois les métabolites et les réactions sont représenté ; les liens associent alors les
métabolites aux réactions auxquelles ils participent (voir Figure 14).

30
La seule information requise est la stœchiométrie des réactions, qui est en général
connue dans le métabolisme.
31
La nomenclature usuelle appelle les objets nœuds et les liens arêtes.
32
Graphe biparti.

61
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 14. Représentations sous forme de graphes d’un réseau métabolique

théorique. Les métabolites sont représentés par des cercles et désignés par des nombres,
les réactions représentées par des carrés et désignées par des lettres. À gauche,
représentation sous forme d’un graphe biparti ; au centre, graphe simple de métabolites ; à
droite, graphe simple de réactions.

La simplicité des graphes métaboliques permet leur utilisation dès lors que les
réactions du réseau métabolique sont connues. C’est pourquoi ils ont connu un intérêt
prononcé au moment où les réseaux métaboliques globaux de plusieurs organismes
ont été reconstruits, à la suite du séquençage et de l’annotation de leurs génomes. Une
première catégorie d’études s’est principalement attachée à analyser la structure de
ces graphes, dans le but de mettre en évidence des propriétés structurelles communes
entre organismes (Jeong et al. 2000) ou de décomposer les réseaux en modules
fonctionnels similaires à la notion de voie métabolique (Ravasz et al. 2002). Une
seconde catégorie d’études a quant à elle été consacrée à élaborer des algorithmes
permettant d’explorer les capacités de conversion des réseaux métaboliques en
fonction de leurs environnements. Ces études – basées sur des méthodes dites
d’expansion de réseau – permettent typiquement de générer l’ensemble des
métabolites pouvant être potentiellement synthétisés par un réseau de réactions à
partir d’un ensemble initial de métabolites (Handorf et al. 2005; Romero & Karp
2001; Raymond & Segrè 2006). La simplicité extrême des graphes métaboliques
limite cependant leurs capacités prédictives. Les aspects quantitatifs, et notamment la

62
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

stœchiométrie des réactions, sont en effet ignorés malgré leur importance dans la
compréhension du fonctionnement métabolique (de Figueiredo et al. 2009). Ils sont
donc majoritairement utilisés lorsque la reconstruction des réseaux métaboliques ne
peut être effectuée que de manière grossière – notamment pour les études
comparatives de nombreux réseaux – ou lorsque la taille des réseaux nécessite une
modélisation « allégée ».

Des initiatives ont cependant cherché à améliorer les capacités prédictives des
graphes métaboliques en les étendant au sein de cadres de modélisation
informatique33 plus élaborés (Fisher & Henzinger 2007). Parmi ces derniers, les
réseaux de Petri se sont révélés être particulièrement bien adaptés à l’étude du
métabolisme, permettant notamment d’aborder de façon qualitative la dynamique de
certaines voies métaboliques (Simão et al. 2005; Hofestädt 2003; Reddy et al. 1996;
Koch et al. 2005). Ces cadres de modélisation passent toutefois encore difficilement à
l’échelle du métabolisme cellulaire tout entier, pour lequel prédomine l’utilisation des
graphes ou des modèles à base de contraintes.

3.2 Les modèles à base de contraintes : reconstruction et

applications
Cette partie présente de manière détaillée la modélisation à base de contraintes.
Elle couvre trois aspects : (1) le formalisme mathématique sous-jacent, (2) la
reconstruction pratique de ces modèles, notamment les méthodes et ressources
bioinformatiques de reconstruction des réseaux métaboliques (évoquées dans la
section 1.4), et (3) ses principales applications. Dans un premier temps, nous invitons
le lecteur à lire un article de revue – que nous avons rédigé au cours de la thèse pour
le journal FEMS Microbiology Reviews (Durot et al. 2009) – traitant des deux

33
Un modèle informatique se distingue d’un modèle mathématique de par son
exécution directe par un ordinateur (Fisher & Henzinger 2007). Les modèles
mathématiques sont généralement exprimés par des équations dont la résolution n’est
pas nécessairement simple à réaliser. L’informatique peut aider à leur résolution en
utilisant des programmes dédiés (notamment la simulation numérique). A l’inverse,
les modèles informatiques sont exprimés sous la forme d’un langage ou d’un
algorithme pouvant être directement exécuté par l’ordinateur. Ils se basent sur la
description d’états et spécifient sous quelles conditions ces états évoluent. Ils sont
donc par construction de nature qualitative.

63
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

derniers aspects. Nous donnerons dans un deuxième temps des précisions au lecteur
sur le cadre mathématique de la modélisation.

3.2.1 Article de revue

64
REVIEW ARTICLE

Genome-scale models of bacterial metabolism: reconstruction and

applications
Maxime Durot, Pierre-Yves Bourguignon & Vincent Schachter
Genoscope (CEA) and UMR 8030 CNRS-Genoscope-Université d’Evry, Evry, France

Correspondence: Vincent Schachter, Abstract

Genoscope (CEA) and UMR 8030 CNRS-
Genoscope-Université d’Evry, 2 rue Gaston
Genome-scale metabolic models bridge the gap between genome-derived bio-
Crémieux, CP5706, 91057 Evry, Cedex, chemical information and metabolic phenotypes in a principled manner, provid-
France. Tel.: 133 1 60 87 25 92; fax: 133 1 ing a solid interpretative framework for experimental data related to metabolic
60 87 25 14; e-mail: [email protected] states, and enabling simple in silico experiments with whole-cell metabolism.
Models have been reconstructed for almost 20 bacterial species, so far mainly
Received 30 July 2008; revised 22 October through expert curation efforts integrating information from the literature with
2008; accepted 22 October 2008. genome annotation. A wide variety of computational methods exploiting meta-
First published online December 2008.
bolic models have been developed and applied to bacteria, yielding valuable
insights into bacterial metabolism and evolution, and providing a sound basis for
DOI:10.1111/j.1574-6976.2008.00146.x
computer-assisted design in metabolic engineering. Recent advances in computa-
Editor: Victor de Lorenzo
tional systems biology and high-throughput experimental technologies pave the
way for the systematic reconstruction of metabolic models from genomes of new
Keywords species, and a corresponding expansion of the scope of their applications. In this
metabolic network; systems biology; review, we provide an introduction to the key ideas of metabolic modeling, survey
computational methods; genome-scale the methods, and resources that enable model reconstruction and refinement, and
metabolic models; metabolic engineering; chart applications to the investigation of global properties of metabolic systems,
omics data integration. the interpretation of experimental results, and the re-engineering of their
biochemical capabilities.

aimed at harnessing these activities, and the perspective of

Introduction applications to white and green biotechnology have triggered
The flow of genome sequencing, metagenome sequencing a strong renewed interest in the exploration of bacterial
and other high-throughput experimental efforts aimed at metabolism. In addition to charting the range of naturally
exploring the space of microbial biochemical capabilities has evolved chemical transformations, relevant research ques-
been steadily growing in recent years. At the time of writing, tions include the following: How does the global metabolism
more than 1800 bacterial genome-sequencing projects of a bacterium react to changes in its environment? What
have been initiated and nearly 650 have been completed kind of joint metabolic operation of distinct species can help
(http://www.genomesonline.org, http://www.ebi.ac.uk/integr8). sustain a bacterial community? How can genomic and
Combined with increasingly efficient annotation methods, biochemical information be best exploited to gain insights
these set the stage for the systematic identification of most into the relationship between an organism’s genotype and its
enzymes encoded in the genomes of the corresponding phenotype? For instance, can we predict changes in metabo-
bacterial species. A variety of so-called ‘-omics’ technologies lism-related phenotypic traits caused by simple or complex
now routinely provide large-scale functional clues on mole- genotype modifications? How did metabolic processes
cular interactions and cellular states, offering snapshots of evolve? How can metabolic networks be efficiently repro-
the dynamic operation of metabolism under specified con- grammed for a variety of utilitarian purposes?
ditions, and adding to the store of accumulated knowledge Investigations of a bacterium’s metabolism are typically fed
on microbial biochemistry and physiology. by knowledge (ultimately from observations) at two different
Simultaneously, the expected wealth of new biochemical scales of description of the chemistry at work within cells. The
activities, the progress of metabolic engineering techniques larger scale focuses on the physiology of the whole bacterial

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Genome-scale models of bacterial metabolism 165

cell. For instance, which media is it able to grow on? What are speaking, a model of a natural system is one of many
the relative quantities of chemical nutrients it requires for possible mathematical representation of that system,
growth? How efficient is the cell at converting chemicals from explicitly describing some of its features and supporting
the environment into its own components? Such metabolic predictions on some other features, the latter being typically
capabilities result from the coordinated action of the enzymes time- or environment dependent. In this particular case,
expressed in the respective species, the knowledge of which knowledge of the metabolic network alone is not quite
belongs to the finer, molecular scale. Each of the correspond- sufficient to predict the metabolic capabilities of a cell. Also
ing biochemical conversions can be identified either directly needed are a structured (mathematical) representation of
by performing enzymatic assays, or indirectly, from the that network, together with a set of rules and possibly
genome sequence, through a homology relationship with quantitative parameters enabling simulations or predictions
proteins whose function has been previously elucidated. To- on the joint operation of all network reactions in a given
gether, the reactions that have been demonstrated to poten- environment, and in particular predictions on the values of
tially occur in the cell form the metabolic network of the metabolite fluxes and/or concentrations (Papin et al., 2003).
organism. Metabolic networks can thus be viewed as lists The above, in short, constitutes a metabolic model.
of those molecular mechanisms (reactions) and associated Constraint-based genome-scale models of metabolism
molecular components (enzymes, substrates, and products) (Palsson, 2006) are a category of models precisely aimed at
that are most directly related to the metabolic capabilities assessing the physiological states achievable by a given meta-
mentioned above. bolic network, and at uncovering their biochemical imple-
For a given bacterial species, confronting knowledge from mentation in terms of metabolic fluxes. They offer an
these two scales, molecular vs. cellular, can reveal inconsis- idealized view of the cell as a set of ‘pipes,’ with metabolites
tencies. For instance, it may happen that no sequence of flowing through each pipe, and biochemical conversions
identified reactions is capable of producing one of the taking place at junctions between pipes. Some metabolites
essential cell components from the set of compounds avail- can also be exchanged with the environment, flowing in or out
able in a defined growth medium, even though the species is of the system through dedicated pipes that can be opened or
known to grow on that medium. Furthermore, when the two shut, and may have upper bounds on their throughput. The
scales are consistent, their relationship can be investigated cell is required to achieve balanced production and consump-
further in order to enumerate the possible implementations tion of all the intermediate substrates and products involved
of the physiology that the metabolic network can achieve. in its metabolism: what flows in a junction must flow out.
Biochemists have traditionally performed such investigations Constraint-based models can help investigate in a sys-
by modularizing the set of reactions intometabolic pathways, tematic manner most of the research questions listed at the
typically grouping together reactions that allow the conver- start of this introduction, because they provide a way to
sion of one or more ‘input’ metabolites into ‘output’ meta- explore the consequences on the operation of the entire
bolites. Pathways boundaries are somewhat arbitrary, even metabolic network of the piecemeal information available
though inputs and outputs tend to be metabolites involved in on each of its parts. They are especially well suited to ‘what
several reactions. Pathway-based analyses are thus focused on if ’ experiments involving genetic or environmental pertur-
the possible fates of a restricted number of compounds, and bations, such as: how would the cell behave in an environ-
are amenable to manual expertise thanks to the simplification ment with a different chemistry than the ones that have been
brought by the modularized view (Huanget al., 1999; Teusink experimented on? How would one or more deletions affect
et al., 2005; Risso et al., 2008). its metabolic capabilities? Which deletions would maximize
Yet, metabolic pathways typically involve a large number the production of both metabolite x and biomass?
of ‘side metabolites’ such as cofactors and byproducts of Before a model for a given species can be used to gain new
chemical reactions, and metabolism is as much about insights into its metabolic capabilities or evolutionary
converting nutrient into cell components as it is about history, it must first be built from the scattered genomic,
regenerating cofactors and recycling (or secreting) ulti- biochemical, and physiological information available on
mately unused byproducts. The latter transformations typi- that species up to a point where known physiology can be
cally involve several pathways, and are dependent on the predicted from biochemistry without major mistakes. This
stoichiometry and rates of the reactions. Manual approaches process is sometimes known as ‘model reconstruction’; its
are insufficient to assess their feasibility by a given network endpoint is a functional genome-scale model, i.e. a struc-
for at least two reasons: metabolic networks are too large, tured representation of the current state of knowledge
and the question requires a quantitative analysis. on the metabolism of the respective species (Reed et al.,
Bridging that gap between knowledge of the metabolic 2006a). The model provides a framework to interpret new
network structure and observed metabolic phenotypes is experimental data gathered at the cellular or molecular scale.
precisely where metabolic models come into play. Generally That data may be incompatible with the current model, in

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which case either or both should be questioned, leading to most intracellular metabolites are high in bacterial cells
possible revisions or improvements. If, on the other hand, (Stephanopoulos et al., 1998). At the time scale considered
data and model are compatible, the new evidence may still here, their concentrations have therefore generally reached
narrow down the set of possible metabolic behaviors of the steady levels, and remain constant as long as environmental
cell, thus enriching the model (Covertet al., 2004). conditions do not change. As a consequence, the law of
This review article covers both the reconstruction of conservation of matter constrains the production and con-
genome-scale metabolic models and their applications sumption rates of these metabolites to be balanced. These
to basic and applied research in microbiology. Following a assumptions are usually summarized under the expression
primer on constraint-based models, we will review the state steady-state hypothesis and the corresponding constraint on
of the art in model reconstruction. Next, we will survey the reaction rates as a mass balance (or stoichiometric) con-
main applications of metabolic models, from phenotype straint (Stephanopoulos et al., 1998). Obviously, this rea-
predictions to data interpretation or metabolic engineering. soning applies only to metabolites that are neither taken in
Practical aspects of direct relevance to the working micro- from an external pool (e.g. nutrients) nor excreted from the
biologist will be covered by a sketch of the main dedicated cell or accumulated in large quantities (e.g. cell components
database and software resources. We will conclude the such as nucleic acids, amino acids, or some lipids). For each
review with a discussion on future directions in the field. metabolite that can be ‘balanced,’ the mass balance con-
straint can be expressed mathematically by a linear equation
P
relating reaction rates of the form sjnj = 0, where sj is the
Foundations of genome-scale metabolic
stoichiometric coefficient of the metabolite in reaction j, and
modeling nj the rate of reaction j.
The metabolic state of a cell and its variation over time can In addition to mass balance constraints, reactions that are
be described by metabolite concentrations and reaction known to be thermodynamically irreversible in vivo are
rates, which can be viewed as the ‘endpoints’ of metabolic constrained to have a non-negative reaction rate. Similarly,
operation. These quantities are related by the law of con- upper bounds on the reaction rates can be known from
servation of matter, which states that the net production rate measurements or theory and included in the model as
of a metabolite equals the sum of the rates of the reactions additional constraints on the reaction fluxes (Reed &
consuming or producing it, weighted by the associated Palsson, 2003).
relative stoichiometric coefficients. Conversely, enzyme Mass balance, irreversibility and upper-bound constraints
kinetics express reaction rates as complex functions of result from the application of simple laws of physics to
metabolite concentrations and enzymatic activities, which individual reactions or metabolites from the network. These
vary over time as a result of transcriptional and metabolic constraints propagate from reaction to reaction throughout
regulation (Smallbone et al., 2007). Deriving meaningful the metabolic network; the constraint-based modeling
predictions from these two types of equations for large framework is designed to automatically compute the result-
metabolic systems is a very challenging proposition, not ing balance. To that end, it makes use of a succinct
only because of the mathematics, but also because many of mathematical representation of all reaction stoichiometries:
the parameters are not known, difficult to measure, and the stoichiometric matrix (see Fig. 1). In this matrix, columns
possibly context dependent. In practice, these pitfalls restrict represent reactions and rows metabolites. The stoichio-
the use of kinetic modeling to metabolic systems much metric coefficient of a metabolite within a reaction is
smaller than ‘whole-cell’ metabolic networks, which typi- included at the intersection of the corresponding row and
cally include hundreds of reactions for a bacterium. column (see Fig. 1). Reaction rates are represented in
Constraint-based models bypass these difficulties by constraint-based models by single numbers, the reaction
focusing on the average reaction rates achievable by cells fluxes, which are normalized by the weight of the cells
grown in steady or slowly varying environmental condi- harboring the reactions to account for the size of the colony
tions. Rates are typically averaged over minutes, fitting with (a reaction flux is typically expressed with the Unit
the typical time scale of uptake or secretion rates measure- mmol h!1 g!1 dry wt). Because the goal is to describe the
ments. Such averages are not affected by transient states joint operation of many metabolic reactions, it is convenient
because the characteristic relaxation time of metabolic to define a flux distribution as a collection of reaction fluxes
systems – i.e. the time it takes for chemical reactions within covering the entire system. Under the steady-state approx-
the cell to reach a steady state – is much shorter than a imation, the concentrations of balanced metabolites being
minute. Moreover, because environmental changes and constant, a flux distribution carries sufficient information to
variations of enzyme concentrations occur on longer time completely describe a state of the system. Using the stoichio-
scales, one need not take into account regulatory changes to metric matrix, a simple matrix equation – summarizing all
assess average reaction rates over minutes. Turnover rates of mass balance equations shown above – can then be used to

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Genome-scale models of bacterial metabolism 167

Fig. 1. Genome-scale modeling of metabolism. A metabolic network (top left) is transformed into a model by defining the boundaries of the system, a
biomass assembly reaction, and exchange fluxes with the environment (top right). Using the corresponding stoichiometric matrix (bottom right), the
achievable flux distributions compatible with enforced constraints can be found (a particular one is depicted in the bottom left figure).

enforce the mass balance constraints on all reactions fluxes: feasible) by the cell, whereas a distribution that violates at
S.n = 0, where S is the stoichiometric matrix and n the flux least one of these constraints is not. The simplicity of the
distribution represented as a vector. system of linear equations that represent constraints is one
A precise definition of the boundary of the system to be of the main strengths of the framework, because it permits
modeled is also needed to formulate an explicit mathematical fast assessments of the feasibility of a flux distribution using
representation. The system typically includes the whole cell a computer and standard algorithms.
and its vicinity, in order to encompass all the exchanges of The simplicity of constraint-based models comes at the
matter between the cell and its environment. Transport expense of a number of limitations in their predictive
reactions that allow for exchange of specific metabolites with capabilities. Such models focus solely on reaction fluxes,
the extracellular space through the membrane are also in- and completely ignore the influence of metabolites and
cluded in the model. Environmental conditions are then enzymes. In reality, however, enzyme kinetics, and tran-
modeled by acting on the balance of the external metabolites: scriptional or metabolic regulation may significantly influ-
metabolites that are available from the environment can be ence reaction fluxes. Regulation can for instance limit the
taken up by transporters while the others can only be excreted. use of a pathway by downregulating some of its enzymes
A flux distribution that is compatible with all the con- when particular environmental conditions are met. These
straints in a given environment is considered achievable (or mechanisms, if they could somehow be taken into account,

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would eliminate flux distributions otherwise allowed by con- Initial reconstruction of metabolic models
straint-based models. In other words, models may allow ‘false-
positive’ metabolic states, which respect the enforced meta- The most reliable evidence from which the presence of a
bolic constraints but are inconsistent with other biological metabolic reaction in a species can be inferred is experimental
processes. Several attempts have been made to extend the proof of the respective biochemical activity. Such biochemical
constraint-based modeling framework, in order to account for results have been accumulated for several decades, mostly from
regulatory interactions (Covert et al., 2001), signaling pro- dedicated experiments targeting well-defined activities. As a
cesses (Lee et al., 2008b), the first and second laws of consequence, the corresponding reactions have often been
thermodynamics (Beard et al., 2002, 2004), or metabolite precisely and reliably characterized. Exploiting these results to
concentrations (Kümmel et al., 2006b; Henry et al., 2007). reconstruct the whole metabolism of an organism is a labor-
Nevertheless, these extensions require the inclusion of addi- intensive task, however, as it requires processing a high volume
tional experimental data and may result in more complex of literature. Most existing metabolic models have been recon-
mathematical formulation hindering their practical use. structed in this manner and for extensively studied organisms.
Some predictions of constraint-based models may be For instance, the most complete bacterial model available to
wrong in cases where modeling assumptions do not hold. date – namely iAF1260, the latest model of Escherichia coli
For instance, some metabolites do accumulate in the cell, and metabolism – includes references to more than 320 articles
the mass balance assumption clearly does not hold for these. (Feist et al., 2007). Two types of databases centralize biochem-
In general, the concentration of specific metabolites may be ical knowledge: enzyme-centric ones, which collect functional
high enough relatively to the fluxes they are involved in for the information acquired on enzymes, for example BRENDA
mass balance approximation to become clearly false. (Barthelmes et al., 2007) or SwissProt (Boutet et al., 2007);
In practice, many of the analytical methods that have and pathway databases, aimed at describing the biochemistry
been developed for constraint-based models focus on defin- of metabolic processes, for example EcoCyc for E. coli
ing and characterizing sets of feasible flux distributions. metabolism (Karp et al., 2007) or UM-BDD for microbial
Others focus on a single distribution. The diversity of flux biodegradation pathways (Elliset al., 2006) (see Table 1).
distributions compatible with constraints in a given envir- These biochemical clues are typically incomplete rela-
onment can be viewed as reflecting the diversity of the tively to the set of all possible activities, especially for less
metabolic states the cell may find itself in. Nevertheless, the studied organisms. In addition, while technologies aiming at
space of feasible flux distributions features biologically high-throughput characterization of biochemical activities
informative properties whose determination requires ade- are improving, they are not yet mature enough to provide
quate techniques; these will be introduced in the next reasonably good coverage. Genes corresponding to enzymes
sections of this review. that have been experimentally characterized have never-
theless been identified. Their homologues in the genome of
such species can be identified using comparative genomics
methods, thereby indicating the presence of the associated
Building the models biochemical activities.
The level of detail necessary to build a constraint-based model The traditional path to inferring metabolic reactions from
of a bacterium’s metabolism is relatively low; the only the genome of an organism is gene-centric, at least in its first
information required is the precise reaction stoichiometries steps. Nearly all available genome sequences are now system-
and directions, in order to account for mass balance and atically processed through automated annotation pipelines,
irreversibility constraints. To reflect the global biochemical which identify coding sequences and infer functional annota-
capabilities of the organism, the model also needs to encom- tions. Covering all relevant methods would be beyond the
pass the complete set of metabolic activities that can occur scope of this article, but thorough reviews can be found else-
within it – or a reasonable approximation thereof. This where (Médigue & Moszer, 2007). Basically, coding sequences
comprehensiveness requirement and the high number of are first identified using highly efficient gene-finding algo-
metabolic reactions make the actual construction of such rithms [such as GENEMARK (Besemer et al., 2001), GLIMMER
models a challenging task in itself. In this section, we will (Delcher et al., 1999), or AMIGENE (Bocs et al., 2003)], which
review the main methods and resources helping in this task. discard the ORFs that are not likely to be coding for a protein.
We will first show how information from genome annotation Functional annotations are then sought for each gene using
can be used to infer biochemical reactions at large scale, a task complementary approaches: sequence homology with pro-
commonly called metabolic network reconstruction. We will teins of known function [stored for instance in UniprotKB
then review the techniques commonly used to assess the (UniProt, 2008)], conservation of genomic structure with
consistency of reconstructed models, and show how missing annotated species (e.g. synteny), and prediction of functional
biochemical activities can be identified to complete the model. domains (Apweiler et al., 2000; Claudel-Renard et al., 2003).

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Genome-scale models of bacterial metabolism 169

Table 1. Data sources for metabolic model reconstruction and refinement

DNA sequence and genome annotation databases
DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/ General nucleotide sequence database
EMBL http://www.ebi.ac.uk/embl/ General nucleotide sequence database
GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ General nucleotide sequence database
Integr8 http://www.ebi.ac.uk/integr8/ Integrated information on complete genomes
CMR http://cmr.jcvi.org/ Integrated information on complete prokaryotic genomes
IMG http://img.jgi.doe.gov/ Integrated system for analysis and annotation of microbial genomes
SEED http://seed-viewer.theseed.org/ Integrated system for analysis and annotation of genomes using functional
subsystems
Protein and enzyme databases
BRENDA http://www.brenda-enzymes.info/ Comprehensive enzyme information system gathering data collected from the
literature by curators
ENZYME http://www.expasy.ch/enzyme/ Enzyme nomenclature database providing extensive information on all enzymes
with an associated EC number
UniProt http://www.ebi.ac.uk/uniprot/ Universal Protein Resource gathering protein sequences and annotations from
SwissProt (manually reviewed), trEMBL (computer annotated), and PIR
TransportDB http://www.membranetransport.org/ Predictions of membrane transport proteins for fully sequenced genomes
PSORTdb http://db.psort.org/ Repository of experimentally determined and predicted protein localizations
Prolinks http://prolinks.mbi.ucla.edu/ Database of predicted functional links between proteins
STRING http://string.embl.de/ Database of known and predicted protein–protein interactions
Metabolic databases
CheBI http://www.ebi.ac.uk/chebi/ Database on small molecules of biological interest
Pubchem http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ Database on small molecules
LipidMaps http://www.lipidmaps.org/ Database on lipid metabolites
Reactome http://www.reactome.org/ Curated database of biological pathways
KEGG http://www.genome.jp/kegg/ Suite of databases comprising information on compounds, reactions, pathways,
genes/proteins
BioCyc http://www.biocyc.org/ Collection of organism-specific pathway/genome databases, including a curated
multiorganism pathway database: MetaCyc
UniPathway http://www.grenoble.prabi.fr/ Curated resource of metabolic pathways linked to UniProt enzyme database
obiwarehouse/unipathway/
UM-BBD http://umbbd.msi.umn.edu/ Database on microbial biocatalytic reactions and biodegradation pathways
Experimental data repositories
IntAct http://www.ebi.ac.uk/intact/ Repository of reported protein interactions
DIP http://dip.doe-mbi.ucla.edu/ Database of experimentally determined interactions between proteins
Array Express http://www.ebi.ac.uk/aerep/ Public repository of microarray data
GEO http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Public repository of microarray data
ASAP http://asap.ahabs.wisc.edu/ Repository of results of functional genomics experiments for selected bacterial
species
E. coli multi-omics DB http://ecoli.iab.keio.ac.jp/ Comprehensive dataset of transcriptomic, proteomic, metabolomic, and fluxomic
experiments for E. coli K12
Systomonas http://www.systomonas.de/ Repository of ‘omics’ datasets and molecular networks for pseudomonads species
PubMed http://www.pubmed.org/ Database on biomedical literature
Metabolic model repositories
BiGG http://bigg.ucsd.edu/ Repository of reconstructed genome-scale metabolic models
BioModels http://www.ebi.ac.uk/biomodels/ Database of mathematical models of biological systems

Combining the above methods and information sources enzyme, together with the corresponding stoichiometries.
increases the reliability of the annotation transfers from Functional annotations of enzymes therefore need to be
proteins of known function to new genes. Current annotation translated into appropriate chemical equations. The Enzyme
pipelines succeed at assigning a function to 50–80% of the Commission (EC) numbers classification offers an unam-
genes (Serreset al., 2004). A number of databases provide such biguous way to identify enzyme-catalyzed reactions. When
automatically generated annotations for most sequenced provided by the enzyme annotations, these numbers directly
bacterial genomes (see Table 1). specify which reactions they catalyze. Several enzyme and
In order to build a metabolic model, it is necessary to metabolic databases provide the correspondence between
identify the specific chemical conversions catalyzed by each EC numbers and reactions (see Tables 1 and 2). These

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metabolic databases are often comprehensive catalogues of

ed s DB known biochemical reactions with the associated chemical
bM cs information, including stoichiometry: they include most of
a
Pu mon -omi
sto l ti
Sy l i mu the reference knowledge needed to build metabolic models.
o
E. P
c
Several issues hinder this translation process. First, enzy-
matic activities that have been identified only recently are
S A
A s
O pres
G E
E x usually not included in the EC classification. Furthermore, full
ay
Arr EC numbers are not always systematically assigned in the
DIP t annotation process. As a result, many annotations retrieved
Ac from protein databases are only textual (as in UniProtKB) or
Int BD
-B ay
UM athw ontology based [as in Gene Ontology (Ashburneret al., 2000)]
P
Un yc
i
and do not provide the required metabolic information
directly. To address this shortcoming, PATHOLOGIC, the meta-
i o C
B G
bolic network reconstruction software tied to the BioCyc
G
KE tome
ac ps
e
R Ma metabolic databases, includes an algorithm performing the
id
Li p hem identification of gene-reaction links from textual annotations
bc
Pu I (Karp et al., 2002) (see Table 3). This procedure relies on a
eB
Ch NG dictionary of synonyms, however, and may fail at recognizing
RI
ST nk s an explicit reaction when uncommon terms are used. An
li
Pro RTdb expert curation step is thus necessary, for which metabolic
DB
pathway databases provide useful guidance. Recent initiatives
O
PS sport
n
Tra rot specifically aim at solving this issue: for instance, textual
iP
Un ME annotations in UniProtKB/SwissProt are being progressively
ZY
EN NDA replaced by direct references to reactions from UniPathway, a
metabolic database in which all reaction steps are specified up
E
BR
ED
SE to the chemical level (see Table 1).
IM
G The broad specificity of some enzymes may also signifi-
R
M
C r8 cantly increase the number of distinct reactions they can
eg catalyze. For instance, enzymes annotated with alcohol
Int ank
nB
Ge L dehydrogenase activity (EC 1.1.1.1) may catalyze the degra-
B
EM J dation of several distinct alcohols. Similarly, enzymes acting
B
DD on lipids are often not specific to the length of their carbon
Experimental observations

chain. In such cases, functional annotations often report the

activity using generic metabolites (e.g. ‘an alcohol’ or ‘a fatty
Biochemical activities

Biomass composition
Enzyme localization
Type of information

Enzyme specificity

Metabolite formula

acid’) representing the entire set of possible substrates.

Reaction equation
Reaction direction

GPR association1

Instantiating reactions with specific metabolites is required

when building a metabolic model, however, as accounting
Table 2. Type of information provided by each data source

for the mass balance constraint requires that all metabolites

should be well defined. It is thus necessary to identify for
each generic compound the corresponding set of specific
compounds, as much for primary substrates as for cofactors.
This task is complicated by the combinatorial effect, because
the number of substrate combinations may significantly
increase the number of specific reactions. To address this
issue, databases of chemical species can be used to identify
all metabolites of a given chemical category (see Tables 1 and
Experimental observations

2). In order to determine which metabolites are preferen-

tially recognized by enzymes, processing the literature or
Biochemical activities

Biomass composition
Enzyme localization
Type of information

Metabolite formula
Reaction equation
Enzyme specificity

Reaction direction

browsing information collected in enzyme databases such as

GPR association

BRENDA (Barthelmes et al., 2007) is often necessary.

Metabolites involved in metabolic pathways that have
already been inferred may also help in selecting the most
relevant substrates.

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Table 3. Methods for model reconstruction

Metabolic model reconstruction (beyond the use of dedicated metabolic databases)
Identification of metabolic reactions from textual gene annotations Karp et al. (2002)
Direct inference of metabolic reactions from genome sequence Sun & Zeng (2004), Arakawa et al. (2006), Notebaart et al. (2006)
Use of metabolic context to complete pathways Karp et al. (2002), Arakawa et al. (2006), DeJongh et al. (2007)
Metabolic model consistency checks
Flux variability analysis: identification of reactions that are predicted to never Mahadevan & Schilling (2003)
carry any flux
Identification of dead-end metabolites, which can never be produced or Segrè et al. (2003), Ebenhöh et al. (2004), Imielinski et al. (2005),
consumed. Kumar et al. (2007)
Assessment of thermodynamic consistency and assignment of reaction Yang et al. (2005), Kümmel et al. (2006a, b)
directions.
Gap filling and model expansion
Graph-based metabolic network expansion using shortest metabolic paths Arita (2003), Boyer & Viari (2003)
GapFill: optimization-based network expansion and reaction reversibility Kumar et al. (2007)
changes to solve dead-end metabolite inconsistencies
Optimization-based metabolic network expansion to resolve inconsistent Reed et al. (2006a, b)
growth phenotypes
Network-based identification of candidate genes for orphan metabolic activities Osterman & Overbeek (2003), Green & Karp (2004), Chen & Vitkup
(2006), Kharchenko et al. (2006), Fuhrer et al. (2007)

Alternative approaches to metabolic network reconstruc- recently (DeJongh et al., 2007); it includes a check that the
tion bypass the classical annotation step altogether, taking inferred pathways can be properly connected to form a
instead advantage of the curated links between enzyme- ‘working’ model. By leveraging a specific form of ‘guilt-by-
encoding gene sequences and reactions [or EC numbers, as association,’ approaches of this type may be able to retrieve
in the Genome-Based Modeling (GEM) system (Arakawa reactions catalyzed by enzymes that cannot be correctly
et al., 2006)] provided by some metabolic databases. Orthol- identified using current methods. In addition, the presence
ogy relationships are sought between reference sequences of spontaneous reactions in the organism may be identified
from these databases and the coding sequences from the new by the occurrence of neighboring reactions in reference
genome. While these methods [e.g. AUTOGRAPH (Notebaart metabolic pathways.
et al., 2006), or IDENTICS (Sun & Zeng, 2004), see Table 3] In addition to their equations, the reversibility and
simplify the reconstruction process, they usually do not localization of reactions need to be determined for meta-
benefit from advanced annotation techniques, such as those bolic models. Few metabolic or enzyme databases report on
derived from structural genomics or domains recognition, the reversibility of reactions in in vivo conditions (see Table
and are more difficult to combine with expert annotation. 2). When not found in the literature, reversibility is there-
They are also conditioned on the availability of curated fore often determined using simple thermodynamic con-
gene-reaction associations for a set of reference organisms. siderations based on the reaction Gibbs energy, if it is
The reconstruction of the metabolism of a new organism known, or on basic rules depending on the energy equiva-
can also benefit from the knowledge of complete pathways lents (e.g. NADH or ATP) involved in the reactions (Ma &
in related organisms. Metabolic databases often group Zeng, 2003; Kümmel et al., 2006a). Even though very few
reactions into pathways or modules that indicate known compartments divide bacterial cells (with periplasm and
co-occurrence relationships between reactions that hold cytoplasm as the only main compartments in gram-negative
across several organisms. Three main resources provide this bacteria), the presence of such physical separation between
type of information: MetaCyc (Caspi et al., 2006), KEGG metabolites need to be included in their metabolic models.
Modules (Kanehisa et al., 2007), and SEED (Overbeek et al., Enzymes present in one compartment cannot interact with
2005) (see Tables 1 and 2). Metabolic model reconstruction metabolites present in another one. To properly model the
procedures tied to such databases can exploit the known co- effect of compartments, the localization of enzymes and the
occurrences of reactions across reference organisms whose transport of metabolites need to be determined. Informa-
metabolism has been extensively studied (Arakawa et al., tion on the localization of enzymes and reactions is seldom
2006). An instance of a reconstruction procedure taking included in metabolic databases. Curated versions of BioCyc
advantage of this notion of metabolic context is again databases, especially MetaCyc, are a welcome exception,
PATHOLOGIC, which infers the presence of pathways rather however (Caspi et al., 2006). When not found in the
than that of single reactions when possible. A reconstruction literature, localization can be inferred using ab initio predic-
procedure based on the SEED database was also proposed tions from enzyme sequences (Schneider & Fechner, 2004),

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or determined experimentally, for example using fluores- of the metabolites, which are typically found in databases of
cence microscopy (Meyer & Dworkin, 2007). Transport of chemical compounds (see Table 1). For cases where the
metabolites can be inferred using comparative genomics formula is not available for all metabolites, a method was
tools that identify transport enzymes [e.g. TransportDB recently introduced to detect such balance errors in meta-
(Ren et al., 2004)]. Yet, such methods hardly determine the bolic models by solely comparing chemical equations – for
specificity of transporters; knowledge of transported meta- instance, reactions A ! B and A ! B1C would be identi-
bolites is therefore often completed using direct information fied by this method as ‘stoichiometrically inconsistent,’
on the microorganism’s physiology and the metabolites it because balancing both equations would require that at
was shown to utilize in growth experiments. least one of the metabolites has a null or negative mass
Overall, reconstructing a constraint-based model for an (Gevorgyan et al., 2008).
organism’s metabolism involves collecting various types of The assumptions on which constraint-based models are
information. A summary of the respective contributions of founded do not enforce thermodynamic consistency on the
each data source to the model construction is shown in Table 2. fluxes. Flux distributions obeying conservation of mass can
still include internal cycles that violate thermodynamic laws,
allowing for instance the artificial generation of high-energy
Checking the consistency of reconstructed
cofactors. To prevent models from predicting such unrealis-
models
tic metabolic modes, extensions of the modeling framework
Once a draft metabolic model is obtained, its consistency were proposed that directly enforce these laws (Beard et al.,
can be checked using a set of simple tests (see Fig. 2): is the 2002). Their nonlinear nature entails costly computations,
model chemically and physically coherent? Are there re- however, which hinder the use of such modeling extensions
maining ‘dead-ends’ in metabolic pathways or reactions in practice. In order to provide thermodynamically consis-
bound to be inactive? Is the model able to produce essential tent models without including such extensions, methods
metabolites from a known growth medium? have been developed to detect inconsistent cyclic modes in
Constraint-based metabolic models fundamentally rely draft metabolic models, and propose changes in reaction
on reaction stoichiometries to properly account for the mass reversibility that would avoid those modes from being
balance in metabolism at steady state. It is therefore crucial predicted (Yang et al., 2005; Kümmel et al., 2006a).
that all chemical equations are correctly balanced to avoid Before one can reap the benefits of having a model, the
unrealistic creation or destruction of matter. To control the model should be functional, i.e. it should be checked that
correctness of the reaction stoichiometries, the atom balance non-null fluxes can actually be predicted. This relates to the
of each reaction can be checked using the chemical formulae completeness of the model, because for instance a missing

Fig. 2. Pipeline for model reconstruction and

refinement. An initial model is reconstructed
from genome annotations and from preexisting
knowledge on the species’ biochemistry and
physiology. Besides collecting the biochemical
activities, this task includes several additional key
steps. The resulting model is then iteratively
corrected and refined, according to internal
consistency criteria and by comparing its
predictions to experimental data.

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reaction in a linear pathway would prevent any non-null flux reactions. Similarly, Reed et al. (2006b) proposed a method
from being predicted in it at steady state, thereby inactivat- which drives the expansion of the metabolic model to
ing all other reactions in the pathway. Metabolites that are account for the utilization of additional external com-
never consumed or never produced, so-called ‘dead-ends,’ pounds. For metabolites experimentally shown to be used
typically reveal that reactions are missing. In order to help by the organism but not predicted as such by the model (see
investigate and correct these so-called ‘metabolic gaps,’ Applications of metabolic models on growth phenotype
methods have been developed that assess whether reactions predictions for methods to perform these predictions), their
can be active in the model (Reed & Palsson, 2004), identify method automatically proposes minimal sets of reactions
dead-end metabolites (Kumar et al., 2007) or directly track from a repository of reactions that, if added, would allow the
the producibility of metabolites from source metabolites model to exploit the external metabolites.
(Segrè et al., 2003; Ebenhöh et al., 2004). In case the model is The set of reactions referenced in metabolic databases is far
later used to predict growth phenotypes (see Applications of from being comprehensive: the right candidates for complet-
metabolic models), the producibility of biomass precursors ing the model may not yet be known. Computational and
and the completeness of their biosynthetic pathways should be experimental approaches have been proposed to extend this
especially checked beforehand. Dedicated procedures have ‘universe of possible reactions.’ On the computational side,
been designed to systematically perform these checks for several methods originating from the field of chemo-infor-
newly reconstructed models (Segre ` et al., 2003; Imielinski matics have been designed to infer chemical transformations
et al., 2005; Senger & Papoutsakis, 2008). Solving such (Gasteiger, 2005). Some of them have been more specifically
inconsistencies often involves filling metabolic gaps or com- adapted to biochemical transformations, using rules on enzy-
pleting the network with additional metabolic pathways. matic conversions to infer new conversions for biologically
The methods presented in this section check the consistency relevant metabolites (Klopman et al., 1994; Arita, 2000;
of the reconstructed model with respect to a set of basic rules Hatzimanikatiset al., 2005; Ellis et al., 2008).
(see Table 3). We will review in the section on model applica- Numerous experimental methods are also being devel-
tions how model predictions can also be confronted with oped to explore the range of possible biochemical reactions.
experimental data, providing consistency checks of the model MS and nuclear magnetic resonance (NMR) techniques are
with respect to diverse additional experimental evidence. able to identify and quantify large sets of metabolites at high
Interpreting and solving identified inconsistencies of either throughput (Dunn et al., 2005; Dettmer et al., 2007).
type are key to improving the quality of the metabolic model. Computational methods have been proposed to infer reac-
tions from MS data, by analyzing mass differences between
related metabolites (Breitling et al., 2006) or correlations
Targeted searches for missing metabolic
between metabolite concentrations across distinct conditions
activities
(Steuer, 2006). They do not provide direct evidence for bio-
Consistency checks (either internal to the model or relative to chemical transformations, however: their predictions should be
experimental datasets) may showthat the reconstructed model treated as clues to be confirmed by additional information.
is incomplete and lacks some metabolic reactions. Resolving Although mostly used to determine metabolic fluxes, atom-
these metabolic gaps entails expanding the model by identify- labeling experiments could also become powerful tools to
ing and including missing biochemical activities. This process elucidate novel metabolic pathways (Sauer, 2006). They can
basically consists of two steps: (1) identifying plausible candi- advantageously complement computationalab initio pathway
date reactions that could complete the model and (2) finding inference methods by selecting candidate pathways that are
genes that could catalyze the hypothesized activities. compatible with observed isotopic patterns. Finally, untargeted
Reactions contained in metabolic databases are the pri- enzyme activity screenings have recently been performed to
mary source of information for completing the metabolic identify the substrates of enzymes of unknown function and
model (see Table 1). The search for candidate reactions discover novel activities (Saghatelianet al., 2004; Saito et al.,
within these databases can be facilitated using knowledge of 2006). The availability of large-scale libraries of ORF clones
existing pathways (as in MetaCyc, SEED, or UM-BBD, see (Kitagawa et al., 2005) should increase the likelihood of such
Table 1) or computational methods (Arita, 2003; Boyer & methods expanding the store of known reactions.
Viari, 2003; Kumar et al., 2007) (see Table 3). In the latter The search for candidate genes for orphan metabolic
category, the GapFill method was specifically developed to activities is in some ways the reverse of the classical genome
identify dead-ends in models, and correct them by adding annotation problem (i.e. searching the function of identified
reaction from a global repository of reactions, changing the genes). Yet, many of the tools developed to determine gene
reversibility status of reactions, or adding transporters functions can be adapted for this purpose. Sequence homol-
(Kumar et al., 2007). The addition of reactions to the model ogy to already characterized genes is central to most
is guided by an optimization step minimizing the number of methods for candidate gene detection, but combining it

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with additional types of evidence can significantly improve et al., 2004; Wiback et al., 2004). By sampling a significant
performance. For instance, several approaches exploit func- number of metabolic states, these approaches offer an over-
tional links, such as gene neighborhood, gene co-expression, view of the range of flux distributions that can occur in the
protein interaction, or phylogenetic co-occurrence, to relate metabolic network at steady state. The ‘uniform’ nature of
candidate genes with genes involved in the same metabolic the sampling is based only on the mathematical description
pathways or close in the metabolic network (Osterman & of the set of possible flux distributions, avoiding any prior
Overbeek, 2003; Green & Karp, 2004; Chen & Vitkup, 2006; assumption on which metabolic states are most likely to be
Kharchenko et al., 2006; Fuhrer et al., 2007). Databases such selected in vivo. For instance, these sampling methods have
as STRING (von Mering et al., 2007) or Prolinks (Bowers been used to evaluate the relative occurrence of reactions
et al., 2004) compile large sets of functional links across a within the set of possible flux distributions and across
wide range of organisms. On the experimental side, enzyme several environmental conditions (Almaas et al., 2004). This
activity screenings are used to validate the generated candi- analysis showed that a few reactions are active in many
dates. Furthermore, when the orphan activity is associated sampled flux distributions and carry high fluxes – forming a
to a specific phenotype, screens of systematic knockout so-called high-flux metabolic backbone – while many others
mutant phenotypes can help in identifying candidates are active in few sampled flux distributions and carry low
(Aghaie et al., 2008). fluxes. Similar methods were also used to evaluate the
The two types of methods – finding candidate reactions correlation of flux values between pairs of reactions across
or candidate genes – benefit from being used in combina- sampled metabolic states (Reed & Palsson, 2004; Becker
tion, as identifying genes for putative reactions can help in et al., 2007) and thereby determine metabolic dependencies
selecting the proper reactions to include. between reactions. From a more theoretical angle, sampling
was also used to evaluate the size of the set of possible flux
Applications of metabolic models distributions (Wiback et al., 2004; Braunstein et al., 2008).
When computed for distinct (genetic perturbation! environ-
A wealth of computational methods has been developed to
mental condition) pairs, the relative sizes of the corresponding
help analyze biological properties revealed by reconstructed
flux distribution sets were interpreted as indicators of the
metabolic models. Not only would a comprehensive and
respective diversity of metabolic states in the tested conditions
technical description exceed the scope of this review, but
(Wiback et al., 2004).
these methods have been extensively covered elsewhere,
The diversity of achievable metabolic fluxes can also be
either on the technical side (Price et al., 2004) or for
evaluated locally for each reaction. Flux variability analysis
applications on a specific organism, i.e. E. coli (Feist &
was designed for this purpose: an optimization procedure
Palsson, 2008). We will provide here the reader with a review
computes the minimal and maximal allowed flux of each
on the main applications for which constraint-based models
reaction independently (Mahadevan & Schilling, 2003). This
have been most successful and are mostly promising for
procedure identifies reactions that do not carry any flux, or
bacterial species. We will distinguish four main types of
conversely those that carry non-null flux in all possible
applications: (1) analysis of network properties of metabo-
metabolic states. Flux variability analysis has been broadly
lism, (2) prediction and analysis of bacterial growth pheno-
used to predict the activity of reactions for specific sets of
types, (3) model-based interpretation of experimental data,
metabolic constraints (Mahadevan & Schilling, 2003; Reed
and (4) metabolic engineering.
& Palsson, 2004; Teusink et al., 2006; Feist et al., 2007; Henry
et al., 2007; Shlomi et al., 2007a).
Analysis of network properties
Flux sampling or flux variability approaches only provide
The principle of constraint-based modeling consists in study- partial description of the set of possible flux distributions.
ing the set of reaction fluxes – namely flux distributions – that To get a comprehensive picture of the possibilities, methods
are achievable at steady state given the constraints imposed on which compute elementary modes (Schuster et al., 2000)
the system. Reaction fluxes can vary inside a continuous set of and extreme pathways (Schilling et al., 2000) have been
possible values. This set can encompass significant variability developed. These notions differ only slightly in their math-
at the level of individual pathway or reaction fluxes. A wide ematical formulation (Klamt & Stelling, 2003; Papin et al.,
range of methods have been designed to explore that varia- 2004): the main idea is to determine the set of elementary
bility and analyze specific properties of metabolites and and independent metabolic routes that can occur in the
reactions which emerge from the flux constraints. metabolic model. These elementary routes are flux distribu-
One approach consists in sampling the set of achievable tions that (1) respect all assumed constraints, including
flux distributions (Almaas et al., 2004; Reed & Palsson, 2004; steady state and irreversibility, and (2) are elementary in
Wiback et al., 2004). Methods that provide a uniform the sense that they are composed of a minimal set of active
sampling of the possible states have been proposed (Almaas reactions. This second condition ensures that the flux

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Genome-scale models of bacterial metabolism 175

distribution is not decomposable into a combination of Prediction of growth phenotypes

smaller elementary routes. It can be shown that any achiev-
able flux distribution can be expressed as a combination of One of the primary uses of genome-scale metabolic models
such elementary routes. This property, together with the fact is the prediction of growth phenotypes (Price et al., 2004;
that the set of elementary routes is unique, independently of Palsson, 2006). Because these models aim at comprehen-
the method used to compute it (Klamt & Stelling, 2003), has siveness, they are able to account for all main metabolic
inspired numerous applications. This subfield is also known processes contributing to growth, i.e. the production of
as metabolic pathway analysis. For instance, elementary energy and biomass precursors from external metabolites.
modes and extreme pathways have been used to exhaustively Growth phenotypes can therefore be predicted by examining
describe the independent metabolic routes occurring in to which extent metabolic requirements for growth, in terms
newly reconstructed models, often sorted by metabolic of energy generation and biomass precursors synthesis, can
function (Schilling & Palsson, 2000; Van Dien & Lidstrom, be fulfilled by flux distributions from the model. Growth
2002; Papin et al., 2002). The redundancy of routes can be phenotypes can be predicted either in a qualitative manner
assessed and the respective yields of routes of conversion can (prediction of the mere ability to grow) by checking
be compared (Papin et al., 2002). Conversely, the relative piecemeal for the producibility of each biomass precursor
importance of reactions in metabolism was scored using metabolite (Imielinski et al., 2005), or in a quantitative
elementary routes, reactions involved in many routes being manner (prediction of growth performance) by including a
likely to be key players in metabolism (Stelling et al., 2002). biomass reaction consuming them in proportion to their
Finally, metabolic dependencies between reactions which are ratio in biomass composition and studying the flux values it
stronger than those determined only by analyzing the correla- can attain (Price et al., 2004). Determining biomass compo-
tion of fluxes in sampled distributions can be deduced from sition is therefore a necessary prerequisite to growth pheno-
knowing elementary routes. Reactions that always appear type predictions. This is often achieved by examining the
jointly in elementary routes are bound to operate together relevant literature or adapting known biomass compositions
(Pfeiffer et al., 1999). The main obstacle in metabolic pathway of related organisms. The Flux Balance Analysis (FBA)
analysis is the size and complexity of the metabolic models, as method was specifically designed to predict quantitative
the number of elementary routes dramatically increases with growth phenotypes (Varma & Palsson, 1994b; Price et al.,
the size of the model (Yeunget al., 2007). The computation of 2004). It computes the maximal growth yield achievable in
all routes is currently only tractable for medium-size models, the metabolic model by maximizing the biomass reaction
although significant progresses have been made recently flux (representing the growth rate) given a set of bounded
(Terzer & Stelling, 2008). intake rates for external substrates. FBA relies on the strong
Alternative approaches have been developed in order to assumption that bacteria have optimized their growth
explore metabolic dependencies in models of larger size. performance in a subset of possible environments during
One of them, flux coupling analysis, has become a popular their evolution, thereby making the maximization of bio-
analytical tool (Burgard et al., 2004). Flux coupling analysis mass production a driving principle for metabolic operation
identifies all pairs of reactions whose fluxes are always (Varma & Palsson, 1994b). This assumption has been
coupled at steady state. It has been used in a wide range of confirmed by experiments in several cases (Edwards et al.,
studies, and the resulting sets of coupled reactions were for 2001). Using FBA, global quantitative relationships can be
instance compared with correlations observed in the tran- predicted between the input rates of nutrients, the output
scriptional states of enzymes (Reed & Palsson, 2004; rates of byproducts, and the growth rate (Stephanopoulos
Notebaart et al., 2008), interpreted with respect to the et al., 1998; Edwards et al., 2002; Price et al., 2004).
structure of the metabolic regulation (Notebaart et al., The global energy consumption of the cell can signifi-
2008), and used to study the horizontal transfer of genes cantly influence the outcome of quantitative growth pheno-
during bacterial evolution (Pál et al., 2005a, b). Similar type predictions. Two ATP hydrolysis fluxes are added to the
methods were developed to study metabolic relationships models in order to properly account for it. One is constant
between metabolites, either by simply examining the and models the non-growth-associated maintenance, which
co-occurrence of metabolites in reactions (Becker et al., represents the fraction of the energy demand necessary for
2006) or by determining conservation relations between the cell survival that is independent from its growth rate, for
metabolites (Nikolaev et al., 2005; Imielinski et al., 2006). example to maintain the right ionic strength (Stouthamer &
This last type of method was applied to determine coupling Bettenhaussen, 1973). The second flux is proportional to the
relationships between metabolite concentrations, identify growth rate and corresponds to the energy demand asso-
metabolite pools sharing conserved chemical moieties ciated with growth beyond the mere requirements of meta-
(Nikolaev et al., 2005), and exhaustively predict distinct bolic pathways – which are already directly accounted for in
minimal growth media for E. coli (Imielinski et al., 2006). the model – for example energy for cell division or assembly

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Table 4. Existing genome-scale metabolic models for bacterial organisms

Experimental assessment

Wild-type Quantitative
growth Knockout mutant growth
Organism Reference Genes Reactions! Metabolitesw phenotypes growth phenotypes measures
Acinetobacter baylyi Durot et al. (2008) 774 875 701 173/190 (91%) 1138/1208 (94%) –
Bacillus subtilis Oh et al. (2007) 844 1020 988 200/271 (74%) 720/766 (94%) –
Clostridium acetobutylicum Lee et al. (2008a) 432 502 479 10/11 (91%) – X
Clostridium acetobutylicum Senger & Papoutsakis (2008) 474 552 422 – – –
Escherichia coliz Feist et al. (2007) 1260 2077 1039 129/170 (74%) 1152/1260 (92%) X
Geobacter sulfurreducens Mahadevan et al. (2006) 588 523 541 – – X
Haemophilus influenza Schilling & Palsson (2000) 412 461 367 – – –
Helicobacter pylori‰ Thiele et al. (2005) 341 476 485 – 54/72 (75%) –
Lactobacillus plantarum Teusink et al. (2006) 721 643 531 – – X
Lactococcus lactis Oliveira et al. (2005) 358 621 422 – – X
Mannheimia succiniciproducens Hong et al. (2004) 335 373 332 – – –
Mycobacterium tuberculosis Beste et al. (2007) 726 849 739 – 547/705 (78%) X
Mycobacterium tuberculosis Jamshidi & Palsson (2007) 661 939 828 – 132/237 (56%) X
Neisseria meningitidis Baart et al. (2007) 555 496 471 – – X
Pseudomonas aeruginosa Oberhardt et al. (2008) 1056 883 760 78/95 (82%) 893/1056 (85%) –
Pseudomonas putida Nogales et al. (2008) 746 950 710 84/90 (93%) 665/746 (89%)z X
Rhizobium etli Resendis-Antonio et al. (2007) 363 387 371 – – –
Staphylococcus aureus Becker & Palsson (2005) 619 641 571 – – –
Staphylococcus aureus Heinemann et al. (2005) 551 774 712 – 8/14 (57%) –
Streptomyces coelicolor Borodina et al. (2005) 700 700 500 54/58 (93%) 11/12 (92%) X

First two columns of experimental assessment show the number of correct predictions among all experimentally determined qualitative growth
phenotypes. Last column specifies whether the model has been assessed against quantitative growth rate measurements.
!Number of distinct reactions including transport processes.
w
Number of biochemically distinct metabolites.
z
This model is an update of two earlier models for E. coli (Edwards & Palsson, 2000; Reed et al., 2003).
‰
This model is an update of an earlier model for H. pylori (Schilling et al., 2002).
z
Using gene essentiality data for Pseudomonas aeruginosa.

of higher order cell structures. These two parameters are evolution experiment on E. coli cells grown in glycerol
usually determined by fitting growth yield predictions minimal medium, Ibarra and colleagues actually observed
derived using FBA to measured growth yields provided by that, while the initial growth yield was suboptimal, it
growth monitoring experiments (Reed et al., 2006a). progressively evolved to reach the optimal value predicted
Measurements of growth yields for distinct growth rates are by the model. Other biological constraints, such as regula-
sufficient to fit both growth-associated and non-growth- tion or capacity constraints, may also prevent the organism
associated maintenance parameters (Varma & Palsson, from using optimal flux distributions (Oliveira et al., 2005;
1994a). The values of these parameters were determined Feist et al., 2007). Comparing predictions of growth pheno-
using experimental growth measurements for a significant types with experimental measures may also help in refining
proportion of reconstructed models (see Table 4). the model. A model component that is often refined using
Once fitted, and assuming these parameters remain con- quantitative growth predictions is the stoichiometry of
stant across environments, the model can be used to predict proton translocation that occurs in reactions of electron
growth rates on different media (Edwards et al., 2001). transport systems, such as the respiratory chain. These stoi-
Predicted growth yields revealed to be consistent with chiometries are often hard to determine a priori, yet they
observed ones on a significant number of media for E. coli impact directly the P/O ratio and the efficiency of energy
(Edwards et al., 2001). Inconsistencies between predicted generation (Reed et al., 2006a). With the help of a metabolic
and observed growth yields can have multiple interpreta- model and growth yield measurements on several distinct
tions. First, the assumption of optimal substrate utilization media, Feist et al. (2006) studied the unknown proton translo-
can be questionable for growth predictions on environments cation stoichiometry of such a reaction in Methano-
that are not commonly encountered by the organism (Ibarra sarcina barkeri by determining for each media the model
et al., 2002; Schuster et al., 2008). Using an adaptive maintenance parameters that provided the best growth yield

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predictions for different hypothesized values of the stoichiome- phenotypes, two types of inconsistencies may arise: false
try. Assuming that maintenance should not significantly change viable predictions – growth was predicted yet not observed
across media, they selected the stoichiometry that triggered the experimentally – and false lethal predictions – growth was
smallest variation among the determined maintenance para- not predicted yet observed experimentally. On the one hand,
meters across the environments.Other studies investigated the these inconsistencies may be caused by limitations of the
stoichiometry of proton translocation in the respiratory chain model or cases where the modeling assumptions do not
by directly exploiting measured ratios of electron acceptor (e.g. hold. Regulation may for instance trigger a lethal phenotype
oxygen, or Fe(III) in Geobacter sulfurreducens) consumption by blocking an alternate pathway, which would not be
rate vs. carbon source consumption rate and growth rate predicted as blocked in the merely metabolic model. On
(Heinemann et al., 2005; Mahadevanet al., 2006). the other hand, examining the inconsistencies may identify
Models can readily predict the effect of gene deletion on errors in the model and lead to its refinement. All model
growth phenotypes. To that end, a layer of Gene Protein components may comprise errors, including the GPR asso-
Reaction associations – usually called GPR (Reed et al., ciations, the metabolic network itself, and the stated bio-
2003) – is added to the model to predict the effect of gene mass requirements. False lethal predictions are often clues
deletion on reaction activity. Each reaction is associated to that some biomass component is actually not essential, or
its enzyme-encoding genes by a Boolean rule: genes encod- that the model lacks an alternative gene or pathway that
ing for subunits of an enzymatic complex are linked with an would allow it to survive in the given experimental condi-
AND rule, while genes encoding for alternative enzymes are tions. Conversely, false viable predictions can help detect
linked with an OR rule. Using GPR rules, gene deletions are missing essential biomass components, genes falsely anno-
translated into ‘blocked’ reactions, which are then inacti- tated as encoding isozymes or reactions that were wrongly
vated in the model by constraining their fluxes to zero. FBA assigned or are inactive in the experimental conditions
can be applied to predict growth phenotypes of gene knock- (Duarte et al., 2004; Joyce et al., 2006). Growth phenotype
out mutants. Nevertheless, the hypothesis of optimal growth predictions have been evaluated for a significant proportion
is largely debatable for such genetically engineered mutants, of reconstructed models, whenever experimental data were
as their metabolism was not exposed to evolutionary available (see Table 4). Interpretation of inconsistent cases
pressure. Basing on the assumption that metabolism in a by expert examination led to several annotation and model
knockout mutant operates as closely as possible to metabo- refinements, some of which were supported by the results of
lism in the wild-type strain, two specific methods were targeted experiments (Covert et al., 2004; Duarte et al., 2004;
introduced. They predict knockout mutant growth pheno- Joyce et al., 2006; Reed et al., 2006b). Automated methods
types by minimizing either the overall flux change [MoMA were recently introduced to systematically look for inter-
(Segrè et al., 2002)] or the number of regulatory changes pretations of inconsistencies and possible modifications in
[ROOM (Shlomi et al., 2005)] between the wild-type strain the model. Corrections of the GPR associations can be
and the mutant strain (see Table 5). Both methods were systematically proposed that match the gene essentiality
shown to provide slightly better predictions than FBA. observation with predicted reaction essentiality (M. Durot
The throughput of experiments evaluating qualitative et al., unpublished data). With regard to the metabolic
growth phenotypes – i.e. described simply as viable or lethal network itself, metabolic gap filling approaches have been
– has increased dramatically in the last few years. Phenotype adapted to propose network corrections that resolve wrongly
Microarrays from Biolog Inc. typically report growth phe- predicted growth phenotypes (Reed et al., 2006b). Finally,
notypes for several hundreds of media in a single experi- valuable insights into the determination of essential biomass
ment (Bochner et al., 2001). In parallel to this, collections of precursors can be provided by methods that analyze correla-
knockout mutants are being built for a growing number of tions between lethality and metabolite production (Imielinski
bacteria (Akerley et al., 2002; Jacobs et al., 2003; Kobayashi et al., 2005; Kim et al., 2007). All these methods act indepen-
et al., 2003; Baba et al., 2006; Liberati et al., 2006; Suzuki dently on distinct components of the model. A unifying
et al., 2006; de Berardinis et al., 2008). The systematic method integrating all types of corrections, which is yet to
assessment of growth phenotypes of knockout mutants come, could lead to an integrated platform for the systematic
provides a significant resource for exploring the metabolic interpretation of upcoming growth phenotyping results.
capabilities of organisms and investigating their gene func- Models can actually predict growth phenotypes for any
tions (Carpenter & Sabatini, 2004), but their direct inter- environmental condition and any combination of gene dele-
pretation is made difficult by the complexity and size of tions, which is beyond reach of experiments. Given the
metabolic networks (Gerdes et al., 2006). These results can combinatorial complexity of mixing several gene deletions,
be readily compared with model predictions, however, dedicated methods have been designed to analyze the effects of
providing a way to interpret them and assess the model multiple deletions and applied to identify epistatic interac-
correctness. Given the qualitative nature of these growth tions between genes (Klamt & Gilles, 2004; Deutscheret al.,

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Table 5. Main analytical methods for genome-scale models sorted by type of application
Analysis of network properties
Flux sampling: random sampling of flux distribution among the set of possible Almaas et al. (2004), Reed & Palsson (2004), Wiback et al. (2004)
metabolic states
Flux variability analysis: examination of flux variability for each reaction Mahadevan & Schilling (2003)
Metabolic pathway analysis, elementary modes/extreme pathways: comprehensive Schilling et al. (2000), Schuster et al. (2000), Klamt & Stelling
description of all independent metabolic modes achievable in the metabolic network (2003)
Flux coupling: identification of reaction pairs whose fluxes are coupled Burgard et al. (2004)
Metabolite coupling/evaluation of conserved metabolite pools Nikolaev et al. (2005), Becker et al. (2006), Imielinski et al. (2006)
Prediction and interpretation of bacterial growth phenotypes
Producibility analysis of biomass precursors Imielinski et al. (2005)
FBA: quantitative prediction of growth yield by maximization of growth rate given Varma & Palsson (1994a, b)
bounded nutrient input rates
MOMA: prediction of gene deletion mutant flux distribution by minimizing overall Segrè et al. (2002)
flux changes with wild type
ROOM: prediction of gene deletion mutant growth by minimizing regulatory Shlomi et al. (2005)
changes with wild type
Identification of multiple gene deletion essentialities Klamt & Gilles (2004), Deutscher et al. (2006), Imielinski & Belta
(2008)
Model-based interpretation of experimental data
Metabolic flux measurements
Metabolic Flux Analysis using labeled metabolites: prediction of attainable reaction Wiechert (2001), Sauer (2006)
fluxes given observed metabolite isotopic patterns
Global prediction of reaction activities using metabolic flux measurements on Herrgård et al. (2006a, b)
subsets of reactions
Identification of metabolic objectives best describing observed fluxes Burgard & Maranas (2003), Schuetz et al. (2007)
Metabolite concentrations
Comparison of model coverage with experimentally detected metabolites Oh et al. (2007)
NET analysis and TMFA: application of thermodynamic constraints to reaction Kümmel et al. (2006a, b), Henry et al. (2007)
directions using metabolite concentrations
Gene expression
Identification of metabolic pathways correlated with gene expression levels Schwartz et al. (2007)
Refinement of flux distribution predictions by blocking reactions corresponding Akesson et al. (2004)
to unexpressed genes
Evaluation of consistency of gene expression levels with metabolic objectives Becker & Palsson (2008)
rFBA and SR-FBA: prediction of gene expression states using Boolean regulatory Covert et al. (2001), Barrett et al. (2005), Barrett & Palsson
rules (2006), Shlomi et al. (2007a, b)
Metabolic engineering
Systematic identification of gene deletions enhancing metabolite production yield Burgard et al. (2003), Patil et al. (2004), Alper et al. (2005a, b)
OptStrain: systematic identification of reaction additions enabling the production Pharkya et al. (2004)
of novel metabolites
Prediction of adjustments of enzyme expression levels enhancing metabolite Pharkya & Maranas (2006), Lee et al. (2007)
production yield

2006, 2008; Imielinski & Belta, 2008). Prediction of growth Model-based interpretation of experimental
phenotypes have also been used to automatically assign data
condition-dependent roles to genes (Shlomiet al., 2007b),
investigate the causes of gene dispensability (Pappet al., 2004; The recent development of experimental techniques has
Kuepfer et al., 2005), or study bacterial evolution (Pál et al., enabled measurements at genome-scale of several types of
2005a, 2006). These two latter studies on bacterial evolution quantities, generating so-called ‘omics’ datasets. These data-
used an E. coli model to analyze the effect of changing growth sets provide partial yet comprehensive snapshots of cellular
environments on the acquisitionof new metabolic capabilities mechanisms (Ishii et al., 2007a), but their interpretation is
by horizontal gene transfer (Pál et al., 2005a) and to simulate made difficult by the volume of data. Computational
the reductive evolution of metabolism in specific environ- methods are thus needed if meaningful biological results
mental conditions (Pál et al., 2006). are to be extracted (Joyce & Palsson, 2006). A variety of

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methods have been developed to exploit experimental data 1994; Wiechert et al., 1999; Antoniewicz et al., 2007a). Such
related to metabolic states, for example measurements of models have been built for a few organisms, often using
metabolic fluxes, metabolite concentrations, enzyme levels, existing constraint-based models as a basis (Antoniewicz
or gene expression, in the light of genome-scale models. Two et al., 2007b; Suthers et al., 2007). While atom mappings for
cases generally arise: either experimental observations are reactions are currently mostly inferred using chemoinfor-
directly comparable to model predictions, or these observa- matics methods (Raymond et al., 2002; Arita, 2003; Hattori
tions lead to the imposition of additional constraints that et al., 2003), this information will likely be made accessible in
refine the set of predicted metabolic states. Observations dedicated databases in the coming years.
falling in the second category allow for instance the selection By qualitatively examining isotope patterns in nutrients
of those metabolic routes that are compatible with the and products, information can already be extracted about
experimental observations, or help predict quantitative values the possible routes of conversion (van Winden et al., 2001;
for the fluxes. When directly comparable to model predic- Sauer, 2006; Kuchel & Philp, 2008). Patterns in products
tions, experimental data may be used to assess model correct- actually depend on their biosynthetic pathways. Observed
ness and assumptions, identify inconsistencies, and target patterns that are inconsistent with the predicted possible
improvements, as illustrated above with growth phenotypes patterns are clues that other pathways may occur in vivo.
(Reed et al., 2006b). We will review such integration methods This approach was for instance recently used to evaluate the
in the following sections for three types of experimental data: model of G. sulfurreducens: an inconsistent isotope pattern
measurement of (1) reaction fluxes, (2) metabolite concentra- for isoleucine led to the discovery of an isoleucine biosynth-
tions, and (3) gene expression levels. esis pathway previously uncharacterized in this bacteria
Refining the model with experimental data increases its (Risso et al., 2008).
correctness with respect to the observations but may Quantitative interpretation of isotope patterns together
decrease its predictive power. Predictions performed with a with measurement of extracellular metabolite fluxes can help
refined model should actually be interpreted with care to determine the value of intracellular reaction fluxes using
avoid circular reasoning: data that have been directly used to Metabolic Flux Analysis (Zupke & Stephanopoulos, 1994;
improve the model can no more be considered as predic- Stephanopoulos et al., 1998; Wiechert et al., 1999; Sauer,
tions, they are part of the evidences on which the model is 2006; Antoniewicz et al., 2007a). Known flux values can then
based to perform predictions. For instance, a model whose be directly exploited in models to characterize which meta-
maintenance parameters have been determined using bolic pathways are operating and quantify their fluxes. As an
growth rate measurement can no more predict the growth application, Herrgård et al. (2006a) introduced the optimal
rate for the environmental condition. This problem can metabolic network identification method, which combines
become serious when models are extensively fitted with flux measurements for a fraction of the reactions with the
experimental data, as they then become more descriptive assumption of optimal growth from FBA to globally infer
than predictive. Nevertheless, some refinement processes which reactions are active. This method has been for instance
applied to genome-scale models involve finding additional used to identify bottleneck reactions that limit the growth in
biological evidence that supports the refinement, thereby engineered strains, and discard putative reactions from newly
breaking the circular reasoning. For instance, corrections of reconstructed models (Herrgård et al., 2006a).
inconsistent growth phenotype predictions by additions of Observed fluxes were also used to determine relevant
alternate enzymes often involve finding additional proofs objective functions to choose when predicting metabolic
that the introduced enzymes possess the right activity. states with FBA (Burgard & Maranas, 2003). By evaluating
the match of predicted fluxes with observed ones, these
studies could identify those metabolic objectives that pro-
Metabolic flux measurements
vided the best fit. Distinct objectives, including maximiza-
One of the most direct experimental accesses to metabolic tion of ATP or biomass yields, were identified for instance in
fluxes is provided by atom-labeling experiments (Wiechert, E. coli depending on the environmental conditions (Schuetz
2001; Sauer, 2006). By analyzing the fate of labeled metabo- et al., 2007). Observed metabolic fluxes, however, often
lites, valuable information can be deduced about the reactions show that metabolism does not necessarily operate accord-
that are actually taking place. The most common technique ing to optimality principles (Fischer et al., 2004), especially
for this consists in analyzing the stable isotope patterns when regulatory constraints are overlooked.
(mostly using 13C) found in products of metabolism given
known isotope patterns in nutrient metabolites (Wiechert,
Metabolite concentrations
2001; Sauer, 2006). These data can be properly interpreted
only using a metabolic model that includes information about High-throughput measurement of intracellular metabolite
atom mappings for each reaction (Zupke & Stephanopoulos, concentrations is becoming common practice thanks to

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recent developments in MS and NMR technologies (Dunn the level of expression of enzymes, deriving information on
et al., 2005; Dettmer et al., 2007). Metabolite profiling experi- reaction fluxes from gene expression levels is hindered by the
ments commonly detect thousands of peaks, among which numerous biological processes intervening between them.
hundreds can usually be exploited to identify metabolites and Changes in rates of translation or mRNA and enzyme
determine their concentrations, using for instance known degradation may significantly modify the quantity of enzymes
spectra of reference metabolites (Dunnet al., 2005). These available from a given amount of transcript. In addition,
datasets, while not fully comprehensive, provide significant changes in substrate/product concentrations or metabolic
information on metabolites present in the cell. regulations can influence the reaction fluxes irrespective to
Merely comparing the set of detected metabolites to the the enzyme quantities. As a consequence, no simple correla-
set of metabolites present in the model already help in tions are necessarily observed between gene expression levels
assessing the comprehensiveness of the model. For example, and reaction fluxes (Gygiet al., 1999; ter Kuile & Westerhoff,
in the reconstruction process of Bacillus subtilis metabolic 2001; Yang et al., 2002; Akesson et al., 2004).
model, Oh et al. (2007) evaluated the overlap between Some approaches have nonetheless been developed to
model metabolites and intracellular metabolites identified exploit information from gene expression data using models.
in a metabolomics dataset; among 350 intracellular metabo- In the vein of pathway- or module-based methods interpret-
lites identified, only 160 were present in the model. No ing changes of gene expressions at the level of pathways or
previously known biochemical activities could be associated biological processes (Hanisch et al., 2002; Draghici et al.,
with the remaining metabolites, illustrating the fact that a 2003; Yang et al., 2004), methods relying on a graph repre-
large part of B. subtilis metabolism remains unknown. These sentation of metabolism (Patil & Nielsen, 2005) or on a
unaccounted metabolites can guide further investigations decomposition of metabolic models into elementary modes
on missing activities, leading to expansion of the model’s (Schwartz et al., 2007) were introduced to correlate expres-
metabolite scope consequently. sion levels with possible metabolic states. These approaches
By extending the constraint-based modeling framework to are merely descriptive: the model provides a suitable meta-
encompass thermodynamic constraints on Gibbs energies of bolic context to interpret the experimental data. Gene expres-
reactions, knowledge of absolute metabolite concentrations sion data have also been used to refine the characterization of
can be translated into constraints on flux directions (K̈ummel metabolic fluxes in models. For instance, by blocking reac-
et al., 2006b; Henry et al., 2007). A first application is tions corresponding to unexpressed genes, metabolic fluxes
to check the consistency of metabolomic datasets with respect could be characterized more precisely in a yeast model
to metabolic fluxes predicted by the model. Methods (Akesson et al., 2004). In the same spirit, a method was
and software have been developed to pinpoint inconsistent recently introduced to evaluate the consistency of gene
concentration measures (Zamboniet al., 2008). Conversely, expression datasets with metabolic objectives, and identify
metabolomic-derived constraints refine the characterization subsets of active reactions that best correlate with expressed
of metabolic fluxes within the model; their integration has genes and metabolic objectives (Becker & Palsson, 2008).
allowed the prediction of ranges of concentrations for un- Even though these methods only rely on a limited depen-
measured metabolites, reaction directions, and ranges of dency between gene expression level and reaction flux –
Gibbs energies of reactions, identifying thereby potentially reactions catalyzed by unexpressed genes should have low
regulated reactions (Kümmel et al., 2006b). fluxes – they succeed in somewhat improving the character-
Thermodynamic constraints merely enforce link between ization of metabolic states, or in assessing the consistency of
the concentrations of metabolites and the directions of the model with the experimental data.
reactions. Taking reaction kinetics into consideration could As an attempt to account for transcriptional regulation,
reinforce that link and make it more quantitative. Extending regulatory interactions were introduced in models by trans-
models to handle kinetics is still an open issue (Famili et al., lating them into Boolean rules (Covert et al., 2001). In such
2005; Yugi et al., 2005; Ishii et al., 2007b; Smallbone et al., joint regulatory-metabolic model, Boolean variables quali-
2007; Covert et al., 2008; Jamshidi & Palsson, 2008), all the tatively describe the transcription state of genes, including
more challenging because of the potential influence of genes coding for enzymes and transcription factors, while
regulation, the scarcity of kinetic parameter values and the Boolean rules determine their regulatory dependencies.
lack of scalable analytical methods. Metabolic reactions are then allowed to have a nonzero flux
only if the transcriptional state of their enzymes is true.
Several methods have been developed to study these joint
Gene expression data
models. Regulatory FBA (rFBA) simulates time courses of
Thanks to technological advances, gene expression levels are gene expression states: at each time step, the new transcrip-
among the most widely accessible type of ‘large-scale’ experi- tional state is computed from the metabolic state predicted
mental data. While such datasets provide a global overview of at the previous time step, and is used to constrain FBA

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prediction of the current metabolic state (Covert et al., acquired on them. Metabolic Flux Analysis provides for
2001). A specific representation scheme was later developed instance quantitative values for intracellular fluxes, which
to encode the sequence of expression states predicted by may be used to determine the actual pathway utilization and
rFBA in a unified manner, in order to compare regulatory pinpoint bottleneck reactions (Stephanopoulos et al., 1998).
responses across various environments (Barrett et al., 2005). Such information is of high significance for the metabolic
Another type of method has been recently developed to engineers, as it may help them in designing further meta-
determine joint steady states of gene expression and meta- bolic modifications.
bolic fluxes. Examining these steady states contributed to Metabolic models also provide the ability to formulate
the identification of redundantly expressed enzymes and the hypotheses and evaluate in silico the potential of genetic
quantification of the effect of transcriptional regulation in modifications. A common cause of low production yields
determining flux activity in E. coli (Shlomi et al., 2007a). lies in the presence of pathways that divert fluxes to the
Finally, two studies compared experimental expression production of undesirable byproducts or compete for the
levels with predicted expression states to assess the correct- utilization of precursors and cofactors. While such pathways
ness of joint regulatory-metabolic models of E. coli and yeast may be identified manually, their direct removal through
(Covert et al., 2004; Herrgård et al., 2006b). A significant gene deletion may cause side effects, for example alter the
proportion of inconsistent expression states could be cor- regeneration of cofactors, the redox balance, or the energy
rected in these models by searching for missing interactions balance (Kim et al., 2008). Genome-scale models can predict
(Covert et al., 2004; Herrgård et al., 2006b). In the same the effect of gene deletions on metabolic phenotypes. Several
vein, a method was recently designed to automate the methods were designed with the aim of selecting those gene
identification of experiments that are likely to bring most deletions that would provide the greatest benefit for a given
information on potentially missing regulatory interactions metabolite production goal. Alper et al. (2005a) developed a
(Barrett & Palsson, 2006). procedure that sequentially screen the effect of single and
multiple gene deletions in order to select those enabling the
best product yields while maintaining sufficient growth
Using genome-scale models for metabolic
rates. They successfully applied their method to enhance
engineering
the yield of a lycopene producing E. coli strain (Alper et al.,
The use of microbial organisms for industrial purposes has 2005b). Screening in silico the high number of combinations
grown considerably in the past few years, with potential of multiple gene deletions may turn out to be costly and
applications ranging from the production of valuable meta- practically impossible. Optimization methods based on
bolites to the degradation of pollutants and the generation genetic (Patil et al., 2005) or linear programming (Burgard
of renewable energy (Janssen et al., 2005; Ro et al., 2006; et al., 2003) algorithms were introduced to circumvent this
Peng et al., 2008; Rittmann, 2008). The field of metabolic issue. The second optimization method, called OptKnock,
engineering aims at designing and improving industrial specifically searches gene deletions coupling the production
microorganisms through the rational design of genetic of a targeted metabolite with growth rate; the rationale being
manipulations leading to enhanced performance (Bailey, that improving the growth rate by adaptive evolution would
1991; Stephanopoulos et al., 1998). With the advent of jointly improve the metabolite production rate and that this
genome-scale experimental technologies, the set of meta- coupling would make the engineered strain more evolu-
bolic engineering methods is progressively expanding to tionary stable (Burgard et al., 2003). Gene deletions pro-
include systems-wide analyses, enabling for instance to posed by this method were tested experimentally to enhance
study the operation of regulatory and metabolic networks lactic acid production in an E. coli strain (Fong et al., 2005).
at large scale (Park et al., 2008). In this respect, genome-scale Adaptive evolution experiments performed on the engi-
metabolic models provide to engineers an effective toolbox neered strains actually showed that lactic acid production
to investigate the metabolic behavior of their strain of was coupled to growth and achieved increased secretion
interest and target improvements (Kim et al., 2008). rates of the product. In addition to gene deletions, metabolic
As a first class of applications, all analytical methods models can explore the effect of adding new pathways,
presented in the previous sections can be directly applied to and help select the most appropriate ones. In this aim,
engineering purposes. Such methods may help for instance the OptStrain method was designed to systematically sug-
to evaluate the maximum theoretical efficiencies of path- gest additions of reactions to produce novel metabolites
ways or determine appropriate host strains by predicting (Pharkya et al., 2004). OptStrain relies on a comprehensive
their metabolic capabilities from their reconstructed database of biochemical reactions and may propose alter-
models. More importantly, metabolic models can help in native solutions. A last set of methods consists in designing
characterizing the actual metabolism operation of engi- suitable up- or downregulations of metabolic enzymes.
neered strains, especially when experimental data have been Intervening on gene expression levels is indeed a powerful

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tool to tune metabolism operation, but the specific effects of software other than the ones they were constructed with.
such interventions are often hardly predictable (Kim et al., Differences in reaction and metabolite names also hamper
2008). In a study involving a L-threonine producing strain of direct comparisons between different models. Fortunately,
E. coli, Lee et al. (2007) made use of its metabolic model to some attempts to address these issues are under way. The
predict gene expression changes enhancing the strain yield. general-purpose SBML format (Systems Biology Markup
Specifically, they predicted flux values of key reactions Language) (Hucka et al., 2003) is often used to exchange
leading to optimal L-threonine production and compared constraint-based models, thus playing the role of a ‘default’
them with measured fluxes. They then used the relative standard for models. While SBML can be imported by many
difference between them to guide the tuning of the expres- modeling tools, it is not fully adapted to the specifics of
sion of the corresponding genes. A more systematic models; this may result in information or functionality loss
approach was introduced with the OptReg method, which during exchange. In addition to providing a standard format,
identifies at genome-scale the relative changes of flux values SBML supports the association of model components with
with respect to the wild-type flux distribution that provide external references, such as reaction and metabolite identifiers
the best production yield (Pharkya & Maranas, 2006). in universal metabolic databases, using MIRIAM annotations
Results of OptReg can be used to identify candidate enzymes (Le Novère et al., 2005). If widely used, this feature should
for up- or downregulation. facilitate model reuse and comparison.
Yet, two main issues limit the predictive capabilities of In order to facilitate model reuse and comparison,
metabolic models. First, while regulation may play a central dedicated model repositories have been developed. Perhaps
role in controlling the efficiency of product synthesis, it is the most widely adopted initiative of this type is the
completely overlooked in metabolic models. Studying regu- Biomodels.net repository (Le Novère et al., 2006) which
latory interactions – using for instance models of regulatory stores biochemical models of any type in SBML format.
networks – may actually provide useful insights, for example Because of its focus on more detailed dynamic models and
to remove feedback inhibitions or fine-tune transcriptional the related generic format choice, the repository is not fully
regulatory circuits commanding the product biosynthesis compatible with constraint-based models and qualitative
(Kim et al., 2008). Not accounting for enzyme quantities but predictions, as illustrated by the current low number of such
only reaction fluxes imposes a second limitation to genome- models included. Agreements with several journals make it
scale models. Implementing changes in flux values – sug- mandatory for authors to deposit models mentioned in
gested for instance by metabolic model optimization methods their manuscripts in Biomodels.net, where they are checked
– by altering the quantity of enzymes is a difficult task, as for syntactic correctness. On some models, a more elaborate
enzyme kinetics and metabolite concentrations may signifi- test on the compatibility between model predictions and
cantly influence the flux change. In order to determine the results presented in the associated paper is also performed.
effect of enzyme quantity changes on metabolic fluxes, more Currently, the only freely accessible (to academic users)
detailed approaches are required, for example metabolic repository dedicated to constraint-based models is the BiGG
control analysis (Fell, 1992). database (http://bigg.ucsd.edu). Its unified dictionary of me-
tabolite and reaction names enables direct comparisons
between its metabolic models.
Resources, databases, and tools Relatively few software tools have been specifically devel-
At the time of this review, genome-scale models have been oped to handle genome-scale constraint-based models,
reconstructed for at least 17 bacteria (see Table 4). For all of compared with the number of tools developed for kinetic
them, extensive manual curation was required in order to modeling. As the modeling framework relies primarily on
integrate information from the literature on their biochem- linear algebra and linear programming, general purpose
istry and physiology with functional information from mathematical software platforms, for example MATLAB
genome annotation. These models are therefore of high (http://www.mathworks.com/) and MATHEMATICA (http://
quality on average, and mostly complete with respect to the www.wolfram.com/), or optimization modeling packages,
current knowledge of their metabolism. An increasing sub- for example GAMS (http://www.gams.com/), are well suited.
set is being assessed and corrected against large-scale experi- Specialized optimization packages can be added for greater
mental data (see Table 4), and an impressive array of efficiency. In addition, modules dedicated to constraint-based
analytical studies has been applied to the most popular ones, modeling have been developed for MATLAB: FLUXANALYZER
for example E. coli (Feist & Palsson, 2008). (Klamt et al., 2007), the COBRA TOOLBOX (Becker et al.,
Models used to be made available independently by their 2007), or METATOOL (von Kamp & Schuster, 2006) for
authors, under a variety of naming conventions and for- elementary mode analysis are good representatives. Libraries
mats. This is a significant obstacle to their reusability, as for importing SBML models within these programs are also
significant effort is required to adapt them to modeling provided by the SBML developer community (Bornstein

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et al., 2008). Among the software tools that are stand-alone, ‘multi-omics’ datasets (Ishii et al., 2007a) promises a wealth
one should mention the SYSTEMS BIOLOGY RESEARCH TOOLBOX of information that will be exploitable only by computer-
(Wright & Wagner, 2008), SCRUMPY (Poolman, 2006), META- assisted interpretation, with the help of models. At the same
FLUXNET (Lee et al., 2003), or FLUXEXPLORER (Luo et al., 2006), time, the field of metabolic modeling is now approaching
each with their own specific strengths. Interestingly, very few the level of maturity necessary for several data integration
programs focus or even support the model reconstruction methods to be used together as components in integrated
process by providing the analytical capabilities for consis- model reconstruction and refinement strategies.
tency checks: the commercial SYMPHENY platform (http:// Significant benefits could result from the availability of a
www.genomatica.com/) associates a metabolic database wider spectrum of bacterial metabolic models. They would
with several analytical methods, while YANASQUARE (Schwarz provide an integrated view of metabolic pathways across the
et al., 2007) facilitates the reconstruction of models from tree of life, thereby enabling so-called transverse approaches
KEGG and performs selected structural analyses (e.g. ele- to annotation, and a variety of comparative metabolic
mentary modes). Very recently, web-based tools have been analysis. To that end, the notion of pathway – defined
released to enable on-line analyses on specific metabolic unambiguously as the conversion between specified sets of
models (Beste et al., 2007; Durot et al., 2008). Given the input compounds (reactants) and output compounds (pro-
need for faster and better reconstruction, we expect more ducts) – can bring a useful decomposition of metabolism
progress in that direction. into basic biochemical functional units, in the spirit pio-
neered by SEED (Overbeek et al., 2005), KEGG Modules
(Kanehisa et al., 2007), or MetaCyc (Caspi et al., 2006). The
Concluding remarks and future directions field of bacterial evolution is poised to benefit as well: for
Constraint-based genome-scale metabolic models can be instance, the availability of models for several bacteria along
viewed as ‘systems-level’ analytical layers which enable com- the phylogenetic tree would allow more comprehensive
putation and reasoning on the consequences of the accumu- studies on the constraints implied by bacteria’s metabolic
lated knowledge on the biochemistry encoded in a given capabilities and their evolution. While this type of study has
genome, and confrontation of that knowledge with the known been pioneered with a few selected models (Pál et al., 2005a,
physiology of the corresponding species or with additional 2006), working with a larger set of models will undoubtedly
experimental evidence. These models thus bridge the gap bring different insights (see (Kreimer et al., 2008) for an
between genotype and phenotype and enable a wide spectrum example with networks). Modeling can also help in studying
of analyses and in silico experiments, providing a solid bacterial communities, as chemical interactions occurring
foundation for systems analyses and metabolic engineering. between bacteria often need to be understood within the
The systematic and automated reconstruction of genome- context of their metabolisms. Indeed, models have already
scale models from genomes and additional high-throughput been reconstructed and analyzed for small communities
data may seem like a natural extension of genome annotation (Stolyar et al., 2007); progress on that front may prove very
(Reed et al., 2006a), but remains beyond the reach of current useful in studying metabolic interactions in more complex
methods. While genome-scale models can be reconstructed communities, assisting in the functional interpretation of
using only sequence and qualitative functional information, metagenome sequences. Last but not least, metabolic en-
gaining the additional predictive and analytical power of gineering applications would clearly benefit from the avail-
models still requires significant effort and expertise. Genome ability of a large set of bacterial models, as these would
annotations must first be translated into a network, which constitute a repository of characterized metabolic pathways,
must then be turned into a model with the help facilitating the combinatorial design of new catalytic sys-
of additional information, and systematically checked with tems, providing solid bases to test hypothetical genetic
respect to biochemical consistency rules and experimental constructions, and helping with the selection of relevant
observations. Only after a model is complete enough to strains for specific engineering objectives.
enable meaningful predictions at the phenotypic level can it
be used to predict phenotypes or other properties beyond
those that can be immediately verified.
Obstacles to automating this process include technical
Acknowledgements
difficulties in translating annotations into proper biochem- We would like to thank the two anonymous reviewers for
ical activities, and also the fact that methods for model their numerous suggestions, which helped improve the
refinement have been designed and applied separately for manuscript. We are grateful for the support of the European
each type of experimental data. There is increasing pressure Networks of Excellence BIOSAPIENS (contract no. LSHG-
for this situation to evolve, however, as the boost in the CT-2003-503265) and ENFIN (contract no. LSHG-CT-
throughput of experimental techniques and the advent of 2005-518254).

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Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

3.2.2 Compléments méthodologiques

L’article de revue ci-dessus est destiné à un lectorat peu familier des notions
mathématiques. Nous compléterons donc notre présentation des modèles à base de
contraintes dans les paragraphes qui suivent en explicitant le cadre mathématique
sous-jacent aux hypothèses de modélisation présentées dans la revue.

Représentation des flux de réactions

L’état du métabolisme est décrit dans les modèles à base de contraintes

uniquement par les flux de réactions. Pour un réseau donné de réactions, l’état du
système est ainsi modélisé par un ensemble de nombre réels représentant chacun le
flux d’une réaction du réseau. Cet ensemble de nombre est appelé distribution de flux
et est manipulé mathématiquement sous la forme d’un vecteur (voir Figure 15).

Figure 15. Représentation sous forme vectorielle d’une distribution de flux. À gauche,
illustration d’un réseau métabolique théorique composé de 10 métabolites et 10 réactions. La
zone jaune délimite le système (intérieur de la cellule par exemple). Les réactions R1, R2, R3
et R4 modélisent le transport des métabolites A, B, C et P entre l’extérieur et l’intérieur du
système. Les valeurs des flux sont indiquées à proximité des réactions (en unités arbitraires)
et illustrées par l’épaisseur de leurs flèches. À droite, représentation de la même distribution
de flux sous forme vectorielle, telle qu’utilisée par les modèles à base de contraintes.

D’un point de vue physique, les flux de réactions manipulés représentent des
valeurs moyennées sur des intervalles de temps s’étendant entre la seconde à la
minute. L’échelle de temps choisie a une importance fondamentale pour ces modèles.
Elle se situe en effet entre, d’une part, les temps de relaxation des cinétiques

65
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

enzymatiques (beaucoup plus rapides34) et, d’autre part, ceux des changements
environnementaux considérés et des réponses régulatrices à ces changements
(beaucoup plus lentes) (voir Figure 16). Cette échelle de temps permet donc d’étudier
la répartition des flux métaboliques en réponse à différentes conditions
environnementales ou de régulation tout en ignorant les dynamiques complexes
d’ajustements rapides des cinétiques enzymatiques. Ces dernières peuvent être
supposées être dans un état quasi-stationnaire, flux et concentrations métaboliques
sont supposés constants (Stephanopoulos et al. 1998, pp.25-27, 82-83, 313-315). De
plus, cette échelle de temps correspond relativement bien aux observations
expérimentales typiquement réalisées : par exemple la mesure de taux de croissance
ou de vitesse de consommation / production de métabolites externes.

Figure 16. Temps de relaxations caractéristiques de différents processus cellulaires et

du fonctionnement d’un bioréacteur. En rouge, temps caractéristiques considérés dans les
modèles à base de contraintes. Adapté de (Stephanopoulos et al. 1998, p.25).

Lorsque aucune hypothèse n’est formulée sur le fonctionnement du métabolisme

et qu’aucune contrainte n’est appliquée aux flux, ceux-ci peuvent prendre n’importe
quelles valeurs réelles. L’ensemble des distributions de flux possibles dans le
métabolisme est donc représenté par l’espace vectoriel Rn tout entier, où n est le
nombre de réactions.

Expression mathématique des contraintes sur les flux

L’hypothèse d’état quasi-stationnaire se traduit dans le modèle par un ensemble de

contraintes de conservation de la masse entre les flux.

34
Notamment dans les conditions physiologiques, où les concentrations métaboliques
sont faibles en regard des vitesses de réactions à cette échelle de temps
(Stephanopoulos et al. 1998; Fell 1992).

66
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Ces contraintes statuent que, pour chacun des métabolites dont les concentrations
sont supposées stationnaires, les taux nets de formation sont nuls. En d’autres termes,
les flux des réactions consommant ces métabolites compensent ceux des réactions les
produisant. Cette contrainte n’est pas valide pour tous les métabolites. Certains
subissent de manière significative la dilution due à la croissance des cellules, tandis
que d’autres possèdent des concentrations non-stationnaires ou sont transformés par
des processus non modélisés. L’ajout de réactions artificielles dans le modèle –
réaction de biomasse dans le premier cas, réactions d’échange dans le deuxième (voir
Figure 1 de l’article de revue) – permet de modéliser ces effets et d’appliquer
correctement les contraintes de conservation de la masse à tous les métabolites.

L’utilisation d’une matrice stœchiométrique (voir Figure 1 de l’article de revue)

permet d’appliquer les contraintes de conservation de la masse simultanément pour
tous les métabolites. Le produit matriciel S.v, où S est la matrice stœchiométrique du
réseau métabolique et v le vecteur de distribution de flux, calcule en effet directement
le taux de formation de chacun des métabolites (voir Figure 17). Il en découle que
l’équation matricielle S.v=0 définit directement l’ensemble des distributions de flux
obéissant à la contrainte de conservation de la masse. Cette équation matricielle peut
être vue comme un système d’équations linéaires entre les flux. Bien que celui-ci soit
en général largement sous-déterminé, il contribue à préciser les distributions de flux
possibles dans le réseau, en éliminant celles qui ne sont pas compatibles avec la
conservation de la masse. En termes d’algèbre linéaire, l’application de cette
contrainte réduit l’espace des distributions de flux de Rn à un de ses sous-espaces de
dimension inférieure, Ker(S), appelé le noyau de la matrice S.

67
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

# v R1 &
% (
% v R2 (
# 1 0 0 0 "1 "1 "1 0 0 0 0 0 0 0 & % v R 3 (
% (% v (
% 0 1 0 0 1 0 0 "1 0 "1 0 0 0 0 ( % R 4 (
% 0 0 1 0 0 0 0 "1 0 0 0 0 0 0 ( % v R 5 (
% (% v (
% 0 0 0 0 0 1 0 0 "1 1 0 0 0 0 ( % R 6 (
% 0 0 0 0 0 0 1 0 "1 0 0 0 0 0 ( % v R 7 (
S.v = % (.% v (
% 0 0 0 "1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 ( % R 8 (
%"1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 "1 0 0 0 ( % v R 9 (
% 0 "1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 "1 0 0 ( % v (
% ( % R10 (
% 0 0 "1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 "1 0 ( %v E A ( ext ) (
% (% (
$ 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 "1' %v E B ( ext ) (
%v EC ( ext ) (
%v (
$ E P ( ext ) '
# v R1 " v R 5 " v R 6 " v R 7 & # cA &
% ( % (
%v R 2 + v R 5 " v R 8 " v R10 ( % cB (
% v R3 " v R8 ( % cC (
% ( % (
% v R 6 " v R 9 + v R10 ( % cD (
% v R7 " v R9 ( d % cE (
=% (= % (=0
% "v R 4 + v R 9 + v R10 ( dt % c P (
% "v R1 " v E A ( ext ) ( %c A (ext ) (
% "v " v ( % (
% R2 E B ( ext ) ( c
% B (ext ) (
% "v R 3 " v EC ( ext ) ( %cC (ext ) (
% v " v ( %c (
$ R4 E P ( ext ) ' $ P (ext ) '
Figure 17. Matrice stœchiométrique et conservation de la masse. L’exemple reprend le
réseau présenté Figure 15 augmenté de réactions d’échanges pour les métabolites
extracellulaires (notés EX(ext) pour un métabolite X). Les concentrations métaboliques sont
!notées cX.

Ces contraintes définissent principalement des relations entre les flux.

Typiquement, deux réactions se suivant dans une voie métabolique sans branchement
seront forcées par cette contrainte à se dérouler avec des flux égaux pour conserver la
quantité du métabolite intermédiaire.

Toute information sur la valeur des flux est également utilisée pour contraindre le
modèle. À ce sujet, nous avions montré dans l’article de revue qu’un large panel de
types de connaissances pouvait se traduire directement par des contraintes sur les
valeurs de flux. Il s’agit notamment de la réversibilité des réactions (flux uniquement
positifs pour les réactions irréversibles), de leur inactivation (flux nul), d’hypothèse
sur la valeur maximale de leurs flux (flux inférieurs à cette valeur), de valeurs
mesurées (flux directement égal à cette valeur), et de la connaissance de
l’environnement extérieur (flux des réactions d’échanges autorisés uniquement dans

68
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

le sens de l’excrétion pour les métabolites absents de l’environnement). Ces

informations se traduisent dans le modèle simplement par des équations d’égalités ou
d’inégalités sur les flux, vmin " v " vmax, qui viennent s’ajouter aux contraintes
précédentes. Ces équations affinent encore plus l’ensemble des distributions de flux
possibles dans le réseau. Notamment, les contraintes de conservation de la masse
« propagent » dans le réseau des connaissances locales de valeurs de flux. D’un point
de vue ensembliste, l’ajout de ces inégalités réduit le noyau de la matrice
stœchiométrique à un ensemble qui n’est plus un espace vectoriel, mais possède les
propriétés de linéarité et de convexité. Les ensembles ayant ces propriétés ont été
largement étudiés et un grand panel d’outils permettant de les explorer a été
développé et regroupé sous l’appellation analyse convexe (Rockafellar 1970).

Les contraintes engendrant des ensembles convexes de distribution de flux sont

majoritairement utilisées dans les modèles métaboliques à base de contraintes,
probablement grâce à la simplicité de leur utilisation. Elles suffisent à décrire les
hypothèses fondamentales de modélisation permettant de prédire les phénotypes de
croissance. Dans nos travaux, nous nous sommes donc limités à ces types de
contraintes. Comme évoqué dans l’article de revue, toute hypothèse ou connaissance
pouvant être traduite en contrainte sur les flux peut en principe être intégrée au
modèle. Des travaux ont été effectués dans ce sens pour tenir compte de la régulation
(Covert et al. 2001), de la signalisation (Lee et al. 2008), des lois de la
thermodynamique (Beard et al. 2002; Beard et al. 2004) ou de mesures de
concentrations métaboliques (Kümmel et al. 2006a; Henry et al. 2007) ; ils résultent
néanmoins en des contraintes mathématiques non linéaires et introduisant parfois des
variables entières. Toute la difficulté réside alors dans l’exploitation mathématique de
ces contraintes et la recherche des distributions de flux compatibles avec elles.

Exploration des états métaboliques

Les outils développés pour l’analyse convexe linéaire s’appliquent directement

aux modèles à base de contraintes lorsque les contraintes s’y prêtent. Nous en avons
évoqué trois classes dans l’article de revue : l’exploration de l’ensemble des
distributions de flux par échantillonnage (voir à ce propos une revue encore plus
récente par Schellenberger & Palsson (2009)), description de modes élémentaires et
optimisation. Nous ne reviendrons pas sur les deux premières méthodes ; elles sont

69
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

particulièrement bien adaptées à la caractérisation de l’ensemble des distributions de

flux, mais sont coûteuses en temps de calcul. Les méthodes d’optimisations, bien que
ne recherchant que des distributions de flux particulières, sont bien plus performantes
et également utilisables pour prédire des phénotypes de croissance.

L’essor de la recherche opérationnelle a stimulé le développement de méthodes

d’optimisation sous contraintes efficaces (Boyd & Vandenberghe 2004). Ces
méthodes ont typiquement pour but de résoudre des problèmes du type :

maximiser f0(x), tel que :

fi(x) " bi pour i = 1,…,m

où le vecteur x = (x1,…,xn) est la variable à optimiser, f0 :Rn#R la fonction objectif,

les fi : Rn#R des fonctions de contraintes, et les bi les bornes des contraintes. Lorsque
les fonctions de contraintes et d’objectif sont linéaires, ces problèmes sont dits de
programmation linéaire. Des méthodes et des logiciels particulièrement performants
existent pour les résoudre35 (Boyd & Vandenberghe 2004; Moisdon 2000; Löfberg
2004).

La linéarité des contraintes sur les valeurs de flux et de conservation de la masse

permet d’exploiter ces outils. Leur application la plus courante est la prédiction de
phénotype de croissance par la méthode de « Flux Balance Analysis » (FBA) qui
consiste à maximiser le flux de la réaction de biomasse dans le modèle (c’est une
fonction objectif évidemment linéaire, le flux de la réaction de biomasse étant
directement une variable du problème) :

maximiser vRbiomasse , tel que :

S.v = 0
vmin " v " vmax

où vRbiomasse est la variable correspondant au flux de la réaction de biomasse.

La résolution de ce problème explore les distributions de flux compatibles avec les

contraintes et en fournit une permettant d’atteindre un flux maximal pour la réaction

35
Voir par exemple un inventaire sur le Wiki des serveurs d’optimisation NEOS :
http://wiki.mcs.anl.gov/NEOS/

70
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

de biomasse. Elle permet donc d’évaluer les capacités du réseau métabolique en terme
de production de biomasse.

Bien que ne caractérisant pas l’ensemble des distributions de flux possibles, les
méthodes d’optimisation permettent néanmoins d’interroger le modèle métabolique
au coup par coup quant à ses capacités à remplir un objectif donné. Dans le cas
présenté ci-dessus, il s’agit de l’aptitude à croître (c.-à-d. à former de la biomasse),
mais, utilisée astucieusement, l’optimisation permet d’explorer de nombreuses autres
caractéristiques du réseau métabolique (Price et al. 2004). Nous mentionnerons par
exemple l’étude de contraintes de couplages métaboliques entre réactions (Burgard et
al. 2004), le calcul de plages de flux possibles pour chaque réaction (Mahadevan &
Schilling 2003) ou, à l’inverse, la recherche d’un objectif métabolique représentant au
mieux des distributions de flux observées (Burgard & Maranas 2003; Schuetz et al.
2007).

3.3 Modélisation du métabolisme et phénotypes de

croissance: état de l’art
Dans cette dernière partie introductive sur la modélisation du métabolisme, nous
effectuerons un état de l’art – à la date du début de la thèse, fin 2005 – des travaux
permettant d’interpréter les phénotypes de croissance à l’aide de modèles du
métabolisme.

3.3.1 Modèles à base de graphe

Malgré leur aisance à représenter un réseau métabolique cellulaire dans son

ensemble, les graphes métaboliques ont été relativement peu utilisés pour relier
phénotypes de croissance et métabolisme. Ces derniers se sont en effet révélés bien
adaptés à étudier l’organisation et la structure des réseaux métaboliques, mais
beaucoup moins à aborder leur fonctionnement en lui-même. De nombreux travaux
cherchant à interpréter des données d’essentialités à la lumière de graphes de réseaux
biologiques36 se sont en réalité limités à établir des corrélations entre caractéristiques
topologiques (ex. la « centralité » d’un gène) et importance phénotypique (Jeong et al.
2001; Batada et al. 2006; Hahn & Kern 2005).

36
Principalement pour les réseaux d’interactions protéines-protéines d’ailleurs.

71
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Quelques initiatives ont exploité les méthodes d’expansion de réseau pour prédire
l’effet du changement d’environnement ou de la délétion de gènes sur la viabilité des
cellules (Handorf et al. 2005; Wunderlich & Mirny 2006). Pour ce faire, ces travaux
examinèrent si les métabolites nécessaires à la survie de la cellule pouvaient être tous
synthétisés par le graphe métabolique perturbé par les délétions, à partir des
métabolites de l’environnement. Ces initiatives, bien qu’obtenant des performances de
prédictions relativement proches de celles des modèles à base de contraintes, restèrent
relativement isolées. Il est probable que l’aspect quantitatif des modèles à base de
contraintes et leur égale facilité de mise en œuvre ont favorisé leur utilisation.

3.3.2 Modèles à base de contraintes

Les modèles à base de contraintes furent très rapidement utilisés pour prédire des
phénotypes de croissance, dès lors que des réseaux d’échelles cellulaires furent
reconstruits. Ce type d’application contribua d’ailleurs fortement à populariser ce
cadre de modélisation37 (Edwards & Palsson 2000; Edwards et al. 2001). Nous avons
déjà longuement évoqué les travaux relatifs à la prédiction de phénotypes de
croissance dans l’article de revue, aussi nous contenterons-nous ici de rappeler ceux
ayant été effectués avant 2006 et en rapport avec notre thèse. Ils se répartissent en
deux types de contributions : celles d’ordre méthodologique et celles confrontant les
prédictions aux phénotypes expérimentaux.

Les méthodes de prédiction des phénotypes de croissance furent déjà largement

explorées fin 2005. À l’utilisation « classique » de la méthode FBA pour prédire les
phénotypes de mutants de délétions (Varma & Palsson 1994) vinrent s’ajouter les
méthodes MoMA (Segrè et al. 2002) et ROOM (Shlomi et al. 2005) ayant pour but de
corriger l’hypothèse de fonctionnement optimal du métabolisme. Dans le même ordre
d’idée, Imielinski et al (2005) proposa une méthode basée sur la productibilité des
métabolites pour associer la létalité des délétions à des métabolites, et définir un
ensemble de métabolites essentiels. Enfin, Klamt & Gilles (2004) proposèrent pour la
première fois une méthode permettant d’énumérer de manière exhaustive les
délétions, simples ou multiples, létales pour l’organisme.

37
Signe de l’intérêt grandissant pour ce type de modélisation, plusieurs groupes
avaient publié, notamment en 2005, des reconstructions globales de modèles
métaboliques (voir Table 4 de l’article de revue).

72
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

La fiabilité des phénotypes de croissance prédits par les modèles à base de

contraintes fut démontrée par un grand nombre de travaux confrontant prédictions et
observations expérimentales. Cette démarche fut effectuée pour évaluer à la fois la
validité des prédictions quantitatives de taux de croissance (Edwards et al. 2001;
Ibarra et al. 2002; Duarte, Palsson et al. 2004) et celle des prédictions des phénotypes
qualitatifs de croissance pour des mutants de délétion (Edwards & Palsson 2000;
Famili et al. 2003; Covert et al. 2004; Duarte, Herrgard et al. 2004; Borodina et al.
2005; Kuepfer et al. 2005; Thiele et al. 2005). Dans la majorité de ces travaux, les
observations expérimentales furent simplement utilisées pour évaluer les
performances de prédiction des modèles. Néanmoins, les travaux les plus récents
évoquèrent l’idée d’exploiter les observations expérimentales faussement prédites
pour améliorer la connaissance du métabolisme : Duarte, Herrgard et al. (2004) ont,
dans le cas de la levure, classé les fausses prédictions par type de cause probable, et
Covert et al. (2004) ont corrigé des interactions régulatrices dans un modèle mixte
métabolisme-régulation d’E. coli sur la base de données expérimentales de
phénotypes de croissance et d’expression transcriptionnelle.

4 Notre organisme modèle : Acinetobacter baylyi

ADP1
4.1 Caractéristiques remarquables
Tout au long des travaux de cette thèse, nous avons utilisé la bactérie
Acinetobacter baylyi ADP1 comme organisme modèle. Le choix de cet organisme fut
guidé par la réalisation au sein même du Genoscope d’un vaste projet expérimental
d’exploration de son métabolisme. Ce projet fut initié en 2002 par le séquençage et
l’annotation de son génome et poursuivi par la création et l’étude d’une collection de
mutants de délétion pour chacun de ses gènes (projet nommé
« Thesaurus métabolique » (de Berardinis et al. 2008)). La taille de la collection de
mutants et la capacité de tester leurs phénotypes de croissance sur divers
environnements ont constitué une ressource expérimentale précieuse à l’application
des méthodes de modélisation développées dans cette thèse. De plus, les
reconstructions du réseau et du modèle métabolique d’A. baylyi ont participé à
l’interprétation des résultats expérimentaux en apportant des outils d’analyse et de
visualisation des processus métaboliques identifiés chez la bactérie.

73
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

A. baylyi ADP1 est une !-protéobactérie Gram négative, oxidase négative et

strictement aérobie du genre Acinetobacter, lui même appartenant à l’ordre des
Pseudomonales (voir Figure 18 B). La classification précise de cette souche –
précédemment désignée par BD413 et parfois anciennement classée dans l’espèce
Acinetobacter calcoaceticus – est très récente (Vaneechoutte et al. 2006). La
caractérisation de l’espèce A. baylyi remonte d’ailleurs seulement à 2003 (Carr et al.
2003). Historiquement, cette souche est issue des travaux de Taylor et Juni (1961a;
1961b; 1961c) portant sur la synthèse des capsules de polysaccharides chez les
procaryotes. Ceux-ci avaient isolé par enrichissement sur un milieu contenant du
butane-2,3-diol comme seule source de carbone une bactérie du sol produisant de
grandes quantités d’exopolysaccharides, qu’ils désignèrent par Acinetobacter
calcoaceticus BD4 (Taylor & Juni 1961a). Une étude ultérieure par mutagenèse
conduisit Juni et Janik (1969) à mettre en évidence l’aptitude naturelle à la
transformation de cette souche, et à en dériver la souche BD413 produisant une
capsule polysaccharidique très réduite facilitant sa manipulation. A. baylyi ADP1
provient directement de cette dernière souche. Dans la suite de ce manuscrit, nous
désignerons simplement par A. baylyi la souche ADP1 lorsqu’il n’y aura pas
d’ambiguïté.

A B
Figure 18. Acinetobacter baylyi. A Vue au microscope d’une population d’Acinetobacter
baylyi. B Classification taxonomique d’A. baylyi . En bleu sont indiqués les identifiants
taxonomiques du NCBI (extrait de http://srs.ebi.ac.uk).

La caractéristique la plus remarquable d’A. baylyi est son exceptionnelle aptitude

naturelle à la transformation par de l’ADN exogène (aussi bien circulaire que
linéaire) : cette souche est naturellement compétente38 (Juni 1972; Palmen &
Hellingwerf 1997) et effectue facilement des recombinaisons homologues (de Vries &
Wackernagel 2002). Cette aptitude est a priori spécifique aux souches de l’espèce
38
La compétence désigne la capacité d’une cellule à importer de l’ADN
extracellulaire.

74
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

baylyi ; il a été montré que d’autres espèces d’Acinetobacter effectuent des

transformations naturelles, mais à des fréquences 100 à 1000 fois moindre
(Vaneechoutte et al. 2006). Alors que la question de l’avantage sélectif procuré par
cette aptitude dans un environnement naturel est encore largement ouverte (Young et
al. 2005, p.522), elle offre aux expérimentateurs un excellent outil de travail
génétique, pouvant avantageusement remplacer le modèle habituel Escherichia coli
K1239. Les possibilités expérimentales offertes sont nombreuses, en particulier : les
délétions simples ou multiples de séquences chromosomiques (notamment de gènes),
l’expression de gènes hétérologues (promouvant A. baylyi comme support à la
construction de nouveaux systèmes métaboliques), l’étiquetage de séquences
génétiques (« gene tagging »), ou le remplacement de gènes par des variants mutés
(Metzgar et al. 2004; Young et al. 2005).

Une autre caractéristique remarquable d’A. baylyi, partagée cette fois-ci avec
d’autres membres de l’ordre des Pseudomonales, est sa grande polyvalence
nutritionnelle. Étant une bactérie du sol, celle-ci est capable d’utiliser comme seules
sources de carbone et d’énergie un large panel de composés présents dans ce type
d’environnement, notamment des molécules aromatiques et des acides organiques à
longues chaînes (Young et al. 2005; Barbe et al. 2004) (voir plus loin Tableau 4). Ces
types de molécules sont en effet couramment produits par le métabolisme des plantes.
Les voies métaboliques de dégradation de ces composés chez A. baylyi ont été et font
d’ailleurs toujours l’objet de recherches relativement nombreuses, que ce soit sur les
conversions biochimiques elles-mêmes (Williams & Ray 2008) ou leurs régulations
(Gerischer et al. 2008). À l’inverse, et notamment par comparaison à Escherichia coli
dont l’environnement naturel se situe dans l’intestin d’animaux à sang chaud
(Neidhardt 1996), peu de sucres sont métabolisés par les bactéries du genre
Acinetobacter.

39
A. baylyi ADP1 est en effet 10 à 100 fois plus compétente que des cellules
Escherichia coli rendues compétentes par traitement au chloride de calcium (Metzgar
et al. 2004, p.5781).

75
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

La souche A. baylyi ADP1 est non pathogène40 ; une caractéristique qui n’est pas
commune à toutes les espèces du genre Acinetobacter. En effet, certaines d’entre elles
– notamment Acinetobacter baumanii – sont impliquées dans des cas d’infections
nosocomiales41 et opportunistes, parfois de manière épidémique (Abbott 2005;
Bergogne-Bérézin & Towner 1996). Ces souches ont en outre développé des
résistances à de multiples antibiotiques, rendant le traitement des infections
particulièrement problématique (Fournier et al. 2006). La non-pathogénicité
d’A. baylyi la rend manipulable en laboratoire sans contrainte particulière et sa
proximité phylogénétique aux espèces pathogènes peut en faire un modèle d’étude
pour ces dernières sur certains aspects, comme cela a été le cas pour l’analyse de leurs
génomes (Fournier et al. 2006; Vallenet et al. 2008).

En dehors des études académiques, les bactéries du genre Acinetobacter et

A. baylyi en particulier occupent une place non négligeable dans les applications
biotechnologiques. Celles-ci sont en effet déjà utilisées pour dégrader des polluants,
tels que des biphényls, phénols, benzoates, nitriles ou du pétrole brut, et produire des
composés biochimiques, par exemple des lipases, protéases, bioémulsifiants, de
cyanophycine et différents types de biopolymères (Gutnick & Bach 2008; Abd-El-
Haleem 2003). La manipulation génétique aisée d’A. baylyi et l’intérêt croissant porté
à son métabolisme sont propices à favoriser de nouvelles utilisations industrielles
dans le futur.

4.2 Annotation du génome

Le Genoscope a entrepris en 2002 de séquencer et de réaliser une annotation
détaillée du génome d’A. baylyi. Ce travail fut achevé et publié en 2004 (Barbe et al.
2004). Un effort relativement conséquent fut consacré à l’annotation ; faisant suite à
une étape de prédiction automatique des gènes et de leurs fonctions, l’annotation de
chacun d’entre eux fut complétée et validée manuellement au regard des

40
Une étude récente de Chen et al (2008) attribue des cas d’infections nosocomiales à
des souches de l’espèce A. baylyi, à partir d’analyses de leurs ARNr 16S. Le
séquençage ultérieur de ces souches a cependant montré des dissimilarités notables
avec A. baylyi ADP1 (B. Chen et V. de Berardinis, communication personnelle).
41
Infections dont la source se situe en milieu hospitalier.

76
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

connaissances antérieures sur la biologie d’A. baylyi et de leurs contextes génomiques

(Barbe et al. 2004; Vallenet et al. 2006).

Le génome d’A. baylyi compte 3,6 millions de paires de bases et affiche une
composition en bases G et C de 40,4%. Ces caractéristiques le distinguent
notablement de ceux des bactéries pourtant proches Pseudomonas putida KT2440 et
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (tailles d’environ 6,3 Mpb et composition en GC de
62-67%). Début 2009, son annotation comptait 3309 séquences codantes, incluant
3206 gènes validés et 103 annotés comme probablement non fonctionnels
(comprenant des pseudo-gènes, des gènes à séquences très courtes ou codant à faible
probabilité). La Figure 19 présente certaines des caractéristiques du génome sur une
vue circulaire.

Figure 19. Vue circulaire du génome d’A. baylyi. Légende des cercles, de l’intérieur vers
l’extérieur : (1) biais GC (G+C)/(G-C), (2) îlots cataboliques (rouge), région phagique
(marron), éléments transposables (triangles jaunes), ARNt (bleu), ARNr (vert), et (3) gènes
prédits dans les sens antihoraire (intérieur) et horaire (extérieur) colorés leur appartenance à
des catégories de fonctions : saumon, biosynthèse des acides aminés ; bleu clair, biosynthèse des
cofacteurs ; vert clair, enveloppe cellulaire ; rouge, processus cellulaires; jaune, métabolisme de l’ADN ; vert,
métabolisme énergétique ; violet, métabolisme des acides gras et phospholipides ; rose, synthèse des protéines ;
orange, synthèse des nucléotides ; bleu, fonctions de régulation ; gris, transcription ; turquoise, protéines de
transport et d’interaction ; noir, protéines hypothétiques. Extrait de Barbe et al (2004).

77
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

L’analyse du génome d’A. baylyi corrobora les caractéristiques de son

métabolisme connues précédemment (Barbe et al. 2004). Peu de gènes associés à des
voies de dégradation de sucres furent découverts dans le génome. Cependant, le
nombre de gènes impliqués dans le catabolisme de composés chimiques divers –
principalement des aromatiques et de longs acides organiques – est remarquablement
élevé (voir Tableau 4). L’examen de l’organisation de ces gènes sur le chromosome a
confirmé par ailleurs qu’une grande partie d’entre eux se regroupent dans des régions
chromosomiques précises, appelées îlots cataboliques (Doten et al. 1987) (voir
Tableau 4 et Figure 19). Le but de ces regroupements n’est pas élucidé ; une
hypothèse émise à ce sujet est la suivante : leur localisation dans le deuxième
quadrant leur permettrait de bénéficier des duplications fréquentes du chromosome à
cet endroit. La présence en plusieurs copies des gènes serait alors favorable à leur
expression accrue, leur évolution (une copie évolue tandis que l’autre assure le
maintien de la fonction initiale), voire leur échange avec d’autres organismes par
transformation naturelle (Reams & Neidle 2004). En dehors des processus
cataboliques, l’annotation du génome d’A. baylyi a permis d’élucider une part
significative des voies de biosynthèses et de génération d’énergie, comme nous le
verrons dans le chapitre consacré à la reconstruction de son réseau métabolique.

Tableau 4. Composés pouvant être catabolisés par A. baylyi et gènes associés aux
processus de dégradation. ACIAD désigne les identifiants uniques des gènes d’A. baylyi.
Extrait de Barbe et al (2004)

Le déchiffrage de la séquence génomique d’A. baylyi permit d’obtenir une vision

globale des activités biochimiques participant à son métabolisme. De plus, la

78
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

séquence ainsi que les annotations attenantes constituent une ressource de valeur pour
les projets de recherche sur cet organisme et ceux proches. En attestent les 67 travaux
référençant à ce jour l’annotation du génome42. L’interface MAGE met l’annotation de
ce génome à la disposition de tout utilisateur et la maintient à jour par rapport aux
gènes nouvellement annotés (Vallenet et al. 2006).

4.3 Collection de mutants de délétion

La simplicité des manipulations génétiques d’A. baylyi offerte par sa compétence
naturelle en fait un organisme idéal pour l’application à haut débit de méthodes
d’investigation génétique (Metzgar et al. 2004). Pour cette raison, et dans le but
notamment d’identifier de nouvelles fonctions enzymatiques, l’équipe Thesaurus du
Genoscope a construit une collection de mutants de délétion pour chacun des gènes
d’A. baylyi (de Berardinis et al. 2008). Ce travail s’inscrit directement dans la veine
des travaux de génétique à haut débit présentés ci-dessus (voir partie 2.2).

La technique de délétion utilisée tire naturellement parti des capacités de

transformation et de recombinaison d’A baylyi. Elle consiste à remplacer via une
recombinaison homologue le gène ciblé par une cassette d’intégration contenant un
gène de résistance à un antibiotique (la kanamycine), permettant de sélectionner sur
l’antibiotique les clones ayant recombiné correctement43 (voir Figure 20). L’insertion
correcte dans le locus ciblé est ensuite validée par une série de PCR qui amplifient des
fragments d’ADN situés à cheval entre le génome et le gène de résistance (PCR entre
amorces P1 et P6, P3 et P2, et P7 et P8, voir Figure 20). L’obtention de fragments
amplifiés de longueurs attendues confirme alors indirectement l’intégration du gène
de résistance au bon endroit dans le génome.

42
Nombre d’articles citant l’article de Barbe et al (2004) au 27 février 2009 d’après
ISI Web of Knowledge (Thomson Reuters, Inc.).
43
La méthode de création de la cassette d’intégration est basée sur la technique de
« spliced PCR » (Murphy et al. 2000) adaptée à A. baylyi par Metzgar et al (2004).

79
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 20. Technique de remplacement d’un gène d’A. baylyi par recombinaison
homologue. Tout d’abord, une cassette de remplacement est créée en encadrant un gène de
R
résistance à la kanamycine (Kan ) muni d’un promoteur fort (Pt5) par des séquences
homologues aux extrémités du gène à remplacer (R1 et R2). L’assemblage de la cassette est
réalisé par une succession de PCR. A. baylyi est ensuite transformée avec cette cassette et
mise en culture sur un milieu minimal (avec du succinate comme seule source de carbone)
contenant de la kanamycine, permettant de sélectionner les clones ayant intégrés la cassette
dans leur génome. Diverses PCR sont finalement réalisées sur les clones sélectionnés pour
vérifier la bonne intégration de la cassette en remplacement du gène ciblé (vérification des
longueurs des fragments entre les amorces P7 et P8, P1 et P6, et p3 et p2). Figure extraite de
de Berardinis et al (2008)

Cette étape de vérification a mis en évidence, au cours des expériences de création

des mutants, un phénomène de duplication de grandes régions chromosomiques
perturbant la délétion du gène ciblé. En effet, pour les clones de certains gènes ciblés,
les PCR d’amorces P7 et P8 (voir Figure 20) amplifièrent des fragments d’ADN de
deux longueurs différentes, l’une correspondant à la région génomique possédant le
gène ciblé intact et l’autre à la région génomique ayant intégré le gène de résistance
(clones appelés « doubles bandes »). Une approche par puce CGH44 montra alors que,
dans le cas de ces clones, de larges régions chromosomiques incluant les gènes ciblés
avaient effectivement été dupliquées, autorisant conjointement l’intégration du gène

44
CGH : « Comprehensive Genomic Hybridization array ». Puce d’hybridation
génomique comparative permettant de comparer, pour deux sources d’ADN
distinctes, le nombre de copies des fragments d’ADN correspondant aux
oligonucléotides (sondes) placés sur la puce. Dans le cas d’A. baylyi, des sondes
couvrant l’ensemble du génome furent placées sur les puces et les quantités d’ADN
furent comparées entre une souche sauvage et le clone mutant testé.

80
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

de résistance et la conservation d’une copie du gène cible (de Berardinis et al. 2008).
Toutefois, malgré l’échec apparent de la manipulation génétique, ces gènes ciblés
peuvent être considérés comme contribuant de manière significative à la survie de la
bactérie, voire comme étant essentiels. En effet, la fréquence d’occurrence de telles
duplications est rare (Reams & Neidle 2004) ; il est donc peu probable que des clones
présentant ces duplications aient été retenus lors de l’expérience sans que ces
duplications, et donc la conservation du gène ciblé, ne leur confère un avantage
sélectif significatif. L’interprétation d’essentialité de ces gènes a de plus été
corroborée par le fait qu’une grande majorité de leurs gènes homologues chez
Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa sont également essentiels (de Berardinis
et al. 2008).

Le processus de délétion fut appliqué à l’ensemble quasiment complet des gènes

d’A. baylyi. Parmi eux 2594 donnèrent lieu à des mutants viables, correspondant à des
gènes non-essentiels, et 499 à des mutants non viables ou « doubles bandes »,
correspondant aux gènes considérés comme essentiels. La totalité des 2594 mutants
viables a été conservée et constitue la collection de mutants d’A. baylyi.

L’examen des catégories fonctionnelles liées aux gènes essentiels montre que
ceux-ci composent une partie significative des voies métaboliques de biosynthèse
(voir Figure 21). Ce résultat est en accord avec la composition du milieu choisi pour
sélectionner les mutants. En effet, ce milieu minimal ne disposant que du succinate
comme source de carbone, le bon fonctionnement des voies de biosynthèses est
essentiel pour permettre aux mutants de disposer des métabolites nécessaires à leur
survie.

81
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 21. Proportion de gènes essentiels pour chaque catégorie fonctionnelle de la

classification TIGR Roles. En bleu, gènes essentiels ; en blanc, gènes non-essentiels. Les
catégories ne sont pas exclusives, certains gènes appartiennent à plusieurs d’entre elles.

Plusieurs facteurs de différences ont été mis en évidence par la comparaison des
essentialités avec les gènes homologues chez Pseudomonas aeruginosa et Escherichia
coli (de Berardinis et al. 2008). Dans le cas de P. aeruginosa, le principal facteur de
différence est le milieu de sélection des mutants ; celui-ci est un milieu riche (LB)
contenant de nombreux métabolites rendant non nécessaires des voies de biosynthèse
(Liberati et al. 2006). De plus, la comparaison a révélé des gènes faussement
identifiés comme essentiels chez P. aeruginosa du fait de l’utilisation d’une technique
de transposon, moins fiable que la délétion ciblée (voir partie 2.2). Ces deux facteurs
ne sont pas présents dans la comparaison aux essentialités d’E. coli ; la technique
utilisée est similaire à celle d’A. baylyi et les mutants ont été phénotypés sur un milieu
minimal (glucose) (Baba et al. 2006). Les différences d’essentialité entre A. baylyi et
E. coli sont le reflet de différences dans leur métabolisme énergétique (la capacité
anaérobie d’E. coli rend non-essentielles certaines sous-unités de l’ATP synthase), de
la présence d’isoenzymes ou de voies métaboliques alternatives dans une seule des
deux bactéries, ou de réelles différences dans certaines voies métaboliques (de
Berardinis et al. 2008). En complément de ces analyses, la confrontation des voies
métaboliques connues pour A. baylyi aux essentialités de gènes permit de relever
certaines incohérences, notamment dans les voies de synthèse de la méthionine et de
l’ubiquinone (de Berardinis et al. 2008). Ces constats conduisirent à reconsidérer le
fonctionnement de ces deux voies et appellent d’autres expériences pour en élucider
précisément la structure.

82
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

De manière à déterminer l’essentialité des gènes sur d’autres environnements,

l’équipe Thesaurus a mis en place une procédure de phénotypage de l’ensemble de la
collection de mutants sur milieu liquide (de Berardinis et al. 2008). Cette procédure,
également haut débit et basée sur des tests de croissance clonaux, se déroule
entièrement sur plaques 96 puits. Après une préculture des mutants dans le milieu
initial de sélection, ceux-ci sont inoculés dans des puits contenant le milieu à tester.
Suivent 24 heures d’incubation au terme desquels la densité optique à 600 nm de
chacun des puits est mesurée afin d’en quantifier la quantité de cellules présente.
Cette procédure a été appliquée pour un panel relativement large d’environnements.
Le phénotypage de la collection de mutants sur glucarate et galactarate a ainsi permis
de caractériser de nouveaux gènes impliqués dans leur dégradation (Aghaie et al.
2008), tandis que les résultats de phénotypage sur 2,3-butanediol et quinate ont
corroboré les voies de dégradation précédemment connues et permis de formuler des
hypothèses sur de nouveaux gènes impliqués (de Berardinis et al. 2008).

5 Synthèse et objectifs de la thèse

En conclusion de cette partie introductive, nous soulignerons les points suivants :

- Le métabolisme global d’un organisme peut être en grande partie

reconstruit à partir de l’annotation de son génome, ouvrant la voie à
l’exploration à grande échelle des caractéristiques métaboliques des
organismes séquencés. Cependant, les réseaux métaboliques reconstruits
de cette manière sont fortement biaisés par les méthodes d’annotation, qui
s’appuient pour l’essentiel sur les activités enzymatiques déjà identifiées ;
ils sont très probablement incomplets.

- L’étude des phénotypes de croissance donne une perspective

macroscopique sur le métabolisme des organismes (leur physiologie).
Associée à des techniques d’inactivation génétique, elle permet d’explorer
l’essentialité des gènes et d’associer certains d’entre eux à la survie sur
des environnements particuliers. Ces résultats peuvent compléter
utilement la connaissance issue de l’annotation. Néanmoins, leur bonne
interprétation d’un point de vue du métabolisme nécessite dans de

83
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

nombreux cas de considérer le fonctionnement global du métabolisme tout

en tenant compte des environnements de croissance.

- Les modèles métaboliques à base de contraintes se sont révélés bien

adaptés à prédire les phénotypes de croissance à partir d’une description
simple des réactions du métabolisme. Des travaux, récents au début de la
thèse, ont montré que la confrontation des phénotypes prédits aux
phénotypes observés permettait d’identifier des conflits entre la
connaissance du réseau métabolique et ces observations expérimentales.
Cependant, l’exploitation des phénotypes par les modèles manque d’un
cadre d’interprétation clair et de méthodes permettant de guider les
corrections à réaliser au réseau métabolique.

Le contexte scientifique du Genoscope s’est montré particulièrement favorable à

l’entreprise d’une étude globale du métabolisme à l’aide de phénotypes de croissance.
D’une part, l’annotation experte du génome d’A. baylyi offrait une base solide à la
reconstruction complète de son métabolisme et, d’autre part, les capacités
expérimentales de phénotypage de ses mutants fournissaient un ensemble de données
d’essentialité sans précédent pour cette bactérie.

Nous avons donc décidé d’explorer plus en détail les méthodes d’interprétations
des phénotypes de croissance à l’aide des modèles métaboliques, sur la base du
métabolisme d’A. baylyi. Dans cette optique, notre thèse s’attacha à atteindre trois
objectifs successifs. Tout d’abord, évaluer la performance des méthodes de l’état de
l’art pour reconstruire un modèle métabolique global fiable à partir de l’annotation et
de la connaissance initiale, et proposer des solutions aux faiblesses constatées.
Ensuite, confronter les phénotypes prédits par le modèle aux phénotypes observés et
proposer une méthodologie d’interprétation permettant d’exploiter au mieux leurs
incohérences dans le but de corriger le modèle reconstruit. Enfin, élaborer une
méthode originale de correction automatique des modèles à partir de données
phénotypiques expérimentales. Les résultats de nos recherches sur ces trois objectifs
sont présentés dans les trois grandes parties suivantes.

84
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

RECONSTRUCTION D’UN MODELE GLOBAL DU

METABOLISME D’ACINETOBACTER BAYLYI ADP1

Dans cette première partie consacrée à nos résultats, nous exposerons le processus
de reconstruction que nous avons mis en place pour obtenir un modèle global du
métabolisme d’A. baylyi qui représente le plus fidèlement possible notre connaissance
de son métabolisme. À cette occasion, nous présenterons les méthodes et vérifications
que nous avons notamment élaborées afin d’adapter la représentation des réactions
aux spécificités de la modélisation. Dans un deuxième temps, nous décrirons les
caractéristiques marquantes du modèle obtenu.

6 Processus de reconstruction
Fin 2005, alors même que les méthodes de modélisation du métabolisme
gagnaient en popularité, seules quelques équipes avaient entrepris de reconstruire des
modèles globaux pour un nombre limité d’organismes. Il s’avérait en effet – et à juste
titre – qu’une telle entreprise était une tâche laborieuse dont les difficultés n’étaient
pas encore toutes clairement identifiées. Des initiatives commençaient à être mises en
place pour répertorier et résoudre ces difficultés (Segrè et al. 2003), mais le processus
de reconstruction ne semble se rapprocher qu’aujourd’hui de la maturité, comme
peuvent en témoigner les apparitions récentes d’outils (DeJongh et al. 2007; Schwarz
et al. 2007) et d’articles de revue (Durot et al. 2009; Feist et al. 2009; Reed, Famili et
al. 2006). Pour cette raison, nous présenterons notre processus de reconstruction du
modèle d’A. baylyi en soulignant au lecteur les points-clés liés aux exigences de la
modélisation que nous aurons identifiés.

85
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Deux phases quasiment indépendantes se distinguent dans le processus de

reconstruction (voir Figure 22). La première consiste à répertorier les activités
métaboliques connues de l’organisme, à partir de l’annotation de son génome mais
également de la littérature biochimique et d’informations physiologiques. La seconde
adapte la représentation de ces réactions afin de construire un modèle compatible avec
les hypothèses de modélisation. Ces deux étapes sont décrites séparément dans les
deux sections suivantes.

86
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 22. Processus de reconstruction du modèle métabolique d’A. baylyi. Le réseau

métabolique est schématisé par un graphe. Les nœuds grisés indiquent des métabolites
génériques, les arrière-plans colorés des grandes catégories fonctionnelles du métabolisme.

87
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

6.1 Identification des activités métaboliques

L’annotation experte du génome d’A. baylyi, réalisée avec une attention
particulière pour les processus métaboliques, offre une base solide à la reconstruction
de son réseau métabolique. Le travail des experts a en effet contribué non seulement à
vérifier et valider les annotations assignées automatiquement, mais également à en
préciser certaines et à en définir des nouvelles à partir des connaissances spécifiques à
la bactérie. L’ensemble des annotations représente donc une source d’information
relativement complète sur le métabolisme d’A. baylyi, sur laquelle nous avons choisi
d’appuyer notre processus de reconstruction. De plus, contrairement aux quelques
organismes modèles dont la biochimie a été largement étudiée expérimentalement,
l’annotation du génome représentait pour A. baylyi la seule source d’information pour
une large majorité de ses activités enzymatiques. Le processus de reconstruction suivi
est donc transposable à tout nouvel organisme dont le génome est séquencé et annoté.

La première étape du processus a consisté à traduire les annotations textuelles du

génome en réactions définies par leurs équations bilans (voir Figure 22). Pour cela,
nous nous sommes reposés sur les outils de l’état de l’art. Deux principales ressources
étaient disponibles pour réaliser cette opération à grande échelle, à savoir les bases de
données métaboliques KEGG (Kanehisa et al. 2004) et BioCyc (Karp et al. 2002).

Nous avons rapidement arrêté notre choix sur BioCyc. Bien que répertoriant un
vaste ensemble de réactions dans ses bases de données, KEGG ne disposait pas de
méthodes aussi élaborées que celles de BioCyc pour les associer automatiquement
aux annotations des génomes. En effet, KEGG se repose pour cela exclusivement sur
les identifiants EC attribués dans les annotations et est donc sensible à la qualité de
ces attributions. Dans la pratique, une proportion significative des gènes de fonction
enzymatique n’est pas annotée avec un identifiant EC complet, rendant leur
interprétation par KEGG impossible. Par exemple pour A. baylyi, pour 794 gènes
codant pour des enzymes, seuls 576 sont annotés avec un identifiant EC complet et
103 avec un identifiant incomplet, laissant 115 gènes sans identifiant EC45. De plus, à
ces absences d’annotation EC, causées principalement par la non-exhaustivité de la

45
Décompte réalisé à partir de l’annotation d’A. baylyi disponible dans MaGe au 28
avril 2009 (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage/). Le même décompte réalisé pour
E. coli K12 donne des proportions similaires.

88
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

classification (toutes les activités enzymatiques n’y sont pas représentées) et les
difficultés des annotateurs à déterminer sans ambiguïté les bons identifiants,
s’ajoutent des problèmes de compatibilité entre identifiants provoqués par les
modifications périodiques de la classification.

Contrairement à KEGG, BioCyc exploite, en complément des identifiants EC, les

noms d’enzymes attribués textuellement dans l’annotation, rendant la détection des
réactions plus performante (Karp et al. 2002). En outre, son logiciel de reconstruction
– Pathway Tools – réalise la reconstruction voie métabolique par voie métabolique,
permettant ainsi d’inférer d’éventuelles réactions manquantes (voir Introduction,
sections 1.4.2 et 3.2.1).

Nous avons exécuté Pathway Tools (version 8.0) sur l’annotation d’A. baylyi et
obtenu en résultat la base de donnée AcinetoCyc. Cette dernière contient l’ensemble
des réactions métaboliques identifiées par Pathway Tools pour A. baylyi. Chacune
d’entre elles y est décrite par son équation chimique et est reliée aux gènes et enzymes
la catalysant. AcinetoCyc contient ainsi l’information nécessaire à la construction
d’un modèle métabolique.

Le processus de reconstruction automatique BioCyc présente cependant certains

inconvénients rendant impossible l’utilisation directe des réactions inférées. Tout
d’abord, Pathway Tools tend à « surprédire » les voies métaboliques. En effet, il suffit
parfois qu’une petite fraction des enzymes d’une voie soit codée dans le génome pour
que l’ensemble de la voie et toutes ses réactions soient prédites par Pathway Tools.
Cette méthode engendre ainsi un nombre conséquent de faux positifs – des voies
métaboliques et réactions sans gène associé n’ayant pas de réalité biologique. Ensuite,
le procédé de détection des réactions à partir des annotations textuelles commet
parfois des erreurs et infère des réactions ne correspondant pas à l’annotation ; ce cas
de figure apparaît notamment lorsque la spécificité des substrats n’est pas précisée
dans l’annotation (ex. : alcool déshydrogénase). De plus, certaines activités
enzymatiques ne sont pas encore répertoriées dans la base de données de référence de
BioCyc (MetaCyc) ; lorsqu’elles sont présentes dans une annotation, Pathway Tools
ne peut créer les réactions correspondantes. Enfin, bien que l’ensemble des réactions
inférées soit organisé en voies métaboliques, ces dernières sont nombreuses, souvent
isolées les unes des autres et parfois redondantes. Il est difficile de ce fait

89
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

d’appréhender la structure globale du réseau métabolique et de comprendre les rôles

respectifs des voies métaboliques.

Pour ces raisons et afin de garantir la qualité du réseau métabolique reconstruit, le

processus automatique de création des réactions devait nécessairement être complété
par une phase de curation manuelle. De manière à maîtriser au mieux le contenu du
modèle et étant donné le grand nombre de « faux positifs » générés par Pathway
Tools, nous avons choisi de construire le modèle progressivement en ajoutant une à
une les réactions le constituant. Nous avons pour cela défini sept grandes catégories
métaboliques dans lesquelles nous avons réparti les réactions du réseau global :

- Métabolisme central,
- Métabolisme des acides aminés
- Métabolisme des lipides et des constituants de la membrane
- Métabolisme des nucléotides
- Biosynthèse des cofacteurs
- Voies de dégradations
- Processus de transport

Pour chaque catégorie fonctionnelle, nous avons examiné les voies métaboliques
concernées prédites dans AcinetoCyc. Nous avons alors retenu dans le modèle
uniquement les réactions pour lesquelles suffisamment d’informations justifiaient leur
présence : bonne adéquation de l’annotation du gène à la réaction, importance de la
réaction dans la catégorie fonctionnelle, participation de la réaction à une voie
métabolique connue de l’organisme. Ce processus de sélection des réactions fut
réalisé en utilisant systématiquement les connaissances initiales du métabolisme
d’A. baylyi contenues dans la littérature. Nous avons ainsi pu d’une part valider la
présence de réactions sans gène associé et d’autre part compléter la reconstruction en
ajoutant les réactions connues qui n’avaient pas été inférées par Pathway Tools (voir
Figure 22). Ce dernier cas comprend (1) les voies métaboliques spécifiques à A.
baylyi décrites dans la littérature, (2) les processus de transport de métabolites mis en
évidence grâce aux connaissances sur la physiologie de la bactérie et aux prédictions
de la ressource TransportDB (Ren et al. 2004), et (3) les activités enzymatiques
présentes dans l’annotation mais n’ayant pu être interprétées par Pathway Tools. De
plus, comme nous le verrons dans la partie suivante, le bon fonctionnement du modèle

90
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

nécessite d’avoir des voies métaboliques complètes, sans réaction manquante. Nous
avons de ce fait réalisé ces ajouts de réactions dans le souci d’obtenir des voies
métaboliques complètes et fonctionnelles.

Cette étape de curation manuelle – basée notamment sur l’examen de 66

références bibliographiques (voir partie 7.3) – nous a amené à compléter
significativement le réseau métabolique, comme en témoigne la Figure 23. Les
catégories fonctionnelles incluant le plus de réactions ajoutées manuellement sont
celles des voies de dégradation et des processus de transport. La première comprend
en effet un grand nombre d’activités relativement spécifiques à A. baylyi et non
inférées dans AcinetoCyc. Les processus de transport ne sont quant à eux pas prédits
par la méthode standard de Pathway Tools et ne sont de ce fait pas inclus dans
AcinetoCyc.

Figure 23. Proportion de réactions du modèle représentées dans MicroCyc. MicroCyc

contient les reconstructions automatiques du métabolisme réalisées périodiquement par
Pathway Tools à partir des génomes contenus dans MicroScope
(http://www.genoscope.cns.fr/agc/microcyc). Compte tenu de l’évolution des identifiants de
réactions BioCyc, nous avons choisi d’effectuer la comparaison entre le modèle et la
reconstruction MicroCyc sur la base des gènes enzymatiques pris en compte par MicroCyc.
La reconstruction MicroCyc utilisée ici a été effectuée par Pathway Tools version 13.0 sur
l’annotation d’A. baylyi d’avril 2009.

Outre le fait de fournir une reconstruction organisée du métabolisme, le processus

de curation systématique de chaque réaction offre la possibilité de gérer la fiabilité de
leur présence, ce qui n’est pas effectué dans la reconstruction automatique de Pathway
Tools. Nous avons ainsi associé à chaque réaction un score de confiance évaluant la

91
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

fiabilité des informations soutenant sa présence. Celui-ci est principalement basé sur
le score de confiance attribué aux annotations de ses gènes et prend en compte les
informations supplémentaires issues de la littérature :

- 1 : activité confirmée expérimentalement dans A. baylyi

- 2 : gène annoté grâce à une homologie forte à un gène de fonction
prouvée, et activité définie précisément dans l’annotation
- 3 : annotation du gène réalisé à partir d’indice de moindre confiance
- 4 : présence de la réaction inférée pour compléter des voies métaboliques
essentielles.

Ces scores permettent d’évaluer la qualité de la reconstruction et pourront ensuite

être utilisés pour guider des corrections.

En conclusion, bien que significativement accélérée par les outils d’exploitation

automatique des annotations, l’énumération des réactions métaboliques nécessite un
travail de curation significatif, ne serait-ce que pour intégrer les connaissances
biochimiques non représentées dans les annotations.

D’un point de vue pratique, nous avons effectué ce travail au sein d’un tableur
regroupant les informations sur les réactions. En effet, aucun logiciel spécialisé
n’offrait la souplesse nécessaire à la construction d’un modèle de cette taille par ce
processus46. Les bases de données métabolique BioCyc, et a fortiori AcinetoCyc,
offre la possibilité d’être modifiée manuellement, mais elles se révèlent difficilement
utilisables pour manipuler simultanément de grands ensembles de réactions. Nous
avons donc exporté les réactions d’AcinetoCyc afin de les traiter dans le tableur. Nous
avons toutefois retranscrit dans AcinetoCyc une partie des modifications effectuées
lors de la construction du modèle – nous y avons notamment ajouté les voies
métaboliques supplémentaires – pour pouvoir utiliser AcinetoCyc à des fins de
visualisation47.

46
Les logiciels classiques de construction des modèles métaboliques (p.ex.
CellDesigner (Funahashi et al. 2003)) ne sont en effet adaptés qu’à des réseaux de
taille modeste.
47
AcinetoCyc est accessible à l’adresse http://www.genoscope.cns.fr/acinetocyc/

92
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

6.2 Adaptation aux « contraintes » de modélisation

Comme déjà évoqué dans notre revue sur les modèles à base de contraintes (voir
3.2.1), leur construction nécessite de prendre en compte certaines exigences liées aux
hypothèses de modélisation. C’est pourquoi, dans la deuxième phase du processus de
reconstruction (voir Figure 22), nous avons (1) identifié ces exigences, (2) vérifié que
le modèle y répondait et, le cas échéant, (3) appliqué des modifications pour adapter
le modèle. Dans cette partie, nous exposerons l’ensemble des vérifications et
modifications que nous avons effectué pour le modèle d’A. baylyi et détaillerons nos
contributions les plus significatives par rapport à l’état de l’art.

6.2.1 Fonctionnement des voies métaboliques

La contrainte de conservation de la masse impose aux flux de production et de

consommation de chaque métabolite interne de s’équilibrer au sein du modèle. Pour
être valide, cette contrainte suppose donc que toutes les réactions majoritairement
impliquées dans ces conversions sont incluses dans le modèle. Si tel n’était pas le cas,
cette contrainte imposerait des liens erronés entre les flux de réactions. Pour cette
raison, il est nécessaire d’inclure dans le modèle toutes les réactions majeures
impliquant chacun de ses métabolites, dans la limite, bien entendu, des activités
enzymatiques identifiées dans l’organisme.

Cette vérification est particulièrement importante car l’absence d’une réaction

peut provoquer le « blocage » d’une voie métabolique, voire du modèle entier. En
effet, si cette réaction est par exemple indispensable à la production d’un métabolite,
la contrainte de conservation de la masse imposera aux réactions consommant ce
métabolite un flux nul, lui-même potentiellement propagé à d’autres réactions par
cette même contrainte. Dans notre processus de reconstruction, nous avons donc prêté
une attention particulière à inclure des voies métaboliques complètes dans le modèle
et à vérifier la présence pour chaque métabolite de réactions de consommation et de
production. Cette vérification semble naturelle pour les métabolites intermédiaires de
grandes voies métaboliques linéaires, elle l’est moins, mais tout autant nécessaire,
pour les cofacteurs et autres métabolites dont les processus de production et
consommation sont répartis entre les catégories fonctionnelles du métabolisme.

93
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Cette vérification nous a conduit dans quelques cas à inférer et ajouter au modèle
des réactions indispensables au fonctionnement des voies métaboliques. Ces réactions
ont été choisies en examinant les voies métaboliques présentes dans A. baylyi et
déterminant les réactions les plus probables pour combler les conversions
métaboliques absentes. Dans la majorité des cas, nous nous sommes appuyés pour
cela sur les voies métaboliques connues chez les autres organismes et
automatiquement inférées par Pathway Tools (voir Figure 24). Pour refléter le peu
d’indices confirmant la présence de ces réactions, nous leur avons attribué un score de
fiabilité faible. Dans un rare cas, nous n’avons pu déterminer de réaction consommant
un métabolite : il s’agit du s-adenosyl-4-methylthio-2-oxobutanoate produit lors de la
biosynthèse de la biotine. Pour permettre le fonctionnement de la voie, nous avons
ajouté une réaction d’échange supplémentaire consommant artificiellement ce
métabolite.

Figure 24. Dernières étapes de la voie de biosynthèse de l’histidine. La réaction

manquante (histidinol phosphatase, EC 3.1.3.15) a été inférée dans le modèle pour permettre
le fonctionnement de la voie métabolique. Sa présence est cependant suggérée par
l’existence des autres réactions de la voie et la présence dans le génome de gènes annotés
comme phosphatases (sans mention du substrat). Illustration issue de AcinetoCyc.

Malgré ces vérifications, la contrainte de conservation de la masse peut tout de

même provoquer des « blocages » plus complexes à interpréter. Pour faciliter leur

94
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

détection, nous avons vérifié et validé le « fonctionnement » des voies métaboliques

au fur et à mesure de leur introduction dans le modèle. Cette stratégie nous a dispensé
d’utiliser les méthodes dédiées à la détection de ces blocages (voir revue section
3.2.1), dont les versions réellement performantes ne sont apparues que tardivement
(Kumar et al. 2007; Senger & Papoutsakis 2008).

6.2.2 Équilibre des équations bilans

La bonne application de la contrainte de conservation de la masse exige également

que les équations bilans des réactions soient correctement équilibrées. L’absence d’un
substrat ou d’un produit dans une équation fausse le bilan global de la réaction et peut
provoquer la production et consommation artificielles de certains métabolites. Seules
les réactions d’échanges, dont l’objectif est justement d’introduire ou d’extraire des
métabolites dans le modèle, ne sont pas équilibrées.

Nous nous sommes basés sur les formules chimiques des métabolites pour vérifier
l’équilibre des équations bilans, élément par élément. Toutefois, les métabolites
pouvant se trouver sous différents états de protonation, nous n’avons pas vérifié
l’équilibre des équations au proton près, en dehors des réactions impliquant le
transport de protons à travers la membrane cytoplasmique (voir partie suivante). Pour
chaque réaction à l’équation non équilibrée, nous avons alors cherché à résoudre
l’incohérence à l’aide d’autres ressources sur leur biochimie, dont principalement
BRENDA (Barthelmes et al. 2007). Les réactions créées dans AcinetoCyc contenaient
une proportion non négligeable d’erreurs dans leurs équations. Les dernières versions
de BioCyc ont cependant corrigé la grande majorité d’entre elles48.

Il est important de noter également que le fait d’équilibrer globalement toutes les
réactions du modèle implique de connaître spécifiquement tous les métabolites. Les
réactions définies à l’aide de métabolites génériques (par exemple un acide
dicarboxylique, représentant des acides carboxyliques de diverses chaînes carbonées)
ne peuvent ainsi être reliées aux autres réactions du modèle, alors même qu’elles sont
correctement équilibrées. Nous verrons plus loin au paragraphe 6.2.5 les méthodes
que nous avons mises en œuvre pour y répondre.

48
Voir l’historique des améliorations à l’adresse
http://metacyc.org/release-notes.shtml .

95
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

6.2.3 Conservation de l’énergie

Afin de réaliser des conversions métaboliques à la thermodynamique peu

favorable, certaines réactions se couplent à des processus leur apportant de l’énergie
(voir en introduction section 1.2.6). Ces derniers sont majoritairement de nature
chimique – conversion exothermique d’un métabolite très énergétique, par exemple
l’ATP, en un métabolite moins énergétique, l’ADP – mais également physique –
utilisation d’un gradient de concentration de part et d’autre d’une membrane
cellulaire. Lorsque les échanges d’énergie se limitent à ces deux formes – ce qui est
majoritairement le cas pour les organismes qui exploitent l’énergie chimique contenue
dans les métabolites du milieu – la contrainte de conservation de la masse permet de
les prendre en compte dans le modèle. En appliquant cette contrainte aux métabolites
sous leurs différentes formes énergétiques, elle impose aux flux responsables de leur
production de compenser leur consommation.

Ainsi, dans l’exemple de l’ATP, la contrainte de conservation de la masse impose

aux réactions régénérant l’ATP de le produire à un flux comblant la consommation
d’ATP par les réactions du métabolisme. À leur tour, les réactions régénérant l’ATP
imposent un flux aux réactions leur permettant d’avoir lieu (cycle de Krebs),
permettant in fine de tenir compte de la demande énergétique dans le fonctionnement
global du métabolisme.

La contrainte de conservation de la masse modélise de manière similaire les

échanges d’énergie liés aux gradients de concentration. Dans ce cas, le niveau
d’énergie des métabolites est déterminé par leur localisation, interne ou externe à la
membrane cellulaire. Le modèle représente séparément les métabolites localisés
différemment, et traduit les processus de transport par des réactions « déplaçant » ces
métabolites d’un compartiment à un autre. En imposant la conservation de la quantité
des métabolites internes, le modèle impose alors indirectement un équilibre des
échanges au travers de la membrane forçant le maintien du gradient de concentration
dans le modèle (voir Figure 25A).

L’utilisation d’un gradient de concentration comme vecteur énergétique s’applique

principalement aux protons : certaines réactions entretiennent ce gradient en expulsant
des protons (notamment les réactions de la chaîne respiratoire) tandis que d’autres
exploitent son énergie en laissant entrer des protons (notamment l’ATP synthase et

96
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

des processus actifs de transport). La difficulté à déterminer les états de protonation

des métabolites complique cependant l’obtention de réactions équilibrées au proton
près et, par conséquent, l’application de la contrainte de conservation de la masse
pour les protons intracellulaires. Nous avons choisi de contourner cette difficulté en
supposant que seuls les processus de transport de protons contribuaient
significativement à leurs conversions. Nous n’avons donc équilibré au proton près que
les réactions transportant les protons, et appliqué la contrainte de conservation de la
masse uniquement aux protons transportés (voir Figure 25B).

Figure 25. Contrainte de conservation de la masse appliquée aux protons. A. La

contrainte est appliquée à l’ensemble des protons intracellulaires et exige alors d’équilibrer au
proton près toutes les équations bilans. B. La contrainte est appliquée uniquement aux
processus transportant les protons, ces derniers étant supposés contribuer majoritairement
aux conversions de proton.

Afin d’évaluer les effets de ce choix de modélisation sur les prédictions du

modèle, nous avons comparé le modèle d’E. coli iJR904 équilibrant tous les protons
intracellulaires (Reed et al. 2003) à une version que nous avons modifié pour
n’équilibrer que les protons des processus de transport (voir Figure 25).

Nous avons tout d’abord déterminé les taux de croissance prédits pour chacun de
ces modèles sur un ensemble de 10 000 conditions environnementales composées
d’un ensemble minimal fixe de molécules (dioxyde de carbone, eau, proton, fer II,

97
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

potassium et sodium) complété aléatoirement par un métabolite de chacune des

catégories suivantes : accepteur d’électron (4 métabolites), sources de carbone (89
métabolites), sources d’azote (34 métabolites), sources de phosphore (4 métabolites)
et sources de souffre (2 métabolites). Pour chaque environnement, nous avons prédit
le taux de croissance optimal de chaque modèle par la méthode Flux Balance Analysis
(Varma & Palsson 1994) et comparé leurs valeurs. La Figure 26 trace l’histogramme
des différences relatives entre taux de croissance, calculé par la formule :

µmodèle simplifié " µmodèle complet

Drel =
max(µmodèle simplifié, µmodèle complet )

Figure 26. Histogramme des différences relatives entre les taux de croissance prédits
par les deux modèles sur les 10000 environnements simulés.

Dans 99% des environnements, la différence relative est contenue entre -30% et
30%. Pour une majorité d’entre eux (75%), le modèle simplifié prédit un taux de
croissance supérieur à celui du modèle complet. Ce résultat est dû au fait que, en
moyenne, les voies métaboliques requises pour la croissance produisent plus de
protons qu’elles n’en consomment. Le modèle complet tient compte de ces protons,
ce qui pénalise légèrement l’équilibre du gradient. Dans ce modèle, plus d’énergie est
consacrée au maintien du gradient de concentration.

98
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Pour les 1% d’environnements restants, le modèle simplifié prédit au contraire un

taux de croissance significativement plus faible que celui du modèle complet
(diminution supérieure à 30%). Pour 10 environnements de ce type, le modèle réduit
prédit un taux de croissance nul alors même que le modèle complet prédit un taux de
valeur classique. L’examen des voies métaboliques utilisées pour croître sur ces
environnements a révélé des voies pouvant capturer des protons internes et les
excréter hors de la cellule au sein d’autres métabolites. Par exemple, la voie
représentée sur la Figure 27 importe de la guanine de l’environnement, la convertit en
ammonium et xanthine qui sont ensuite excrétés dans l’environnement. Dans le
modèle, la guanine deaminase (GUAD) capture un proton qui est ensuite excrété sous
la forme de l’ion ammonium. Le bilan net de cette voie consomme un proton
intracellulaire (voir Figure 27). En utilisant cette voie avec un flux élevé, le modèle
complet réussit à maintenir une excrétion de proton suffisante à la croissance.

gua[e] nh4[e] xan[e]

NH4t
GUAt nh4 XANt

gua GUAD xan

h , h2o
H2Ot
h2o[e]
Figure 27. Consommation nette de proton intracellulaire par deamination de la
guanine. Le bilan net de cette voie est en effet gua[e] + h2o[e] + h ! nh4[e] + xan[e]. gua,
guanine; xan, xanthine ; nh4, ammonium ; h, proton ; h2o, eau ; GUAD, guanine deaminase.

Les différences majeures de prédictions de taux de croissance correspondent à des

situations similaires impliquant des voies de ce type. Ces voies ne correspondent
cependant pas à leur utilisation physiologique réelle, le flux nécessaire pour exporter
les protons de cette manière étant sans comparaison avec leurs flux habituels. Bien
que, dans l’ensemble, le modèle complet tienne compte correctement de l’effet des
consommations internes de proton, certains cas de figures semblent ainsi fausser la
prise en compte des processus majeurs de maintien du gradient.

Dans un deuxième temps, nous avons évalué l’effet du type de modélisation sur la
prédiction de phénotypes de croissance de mutants. Pour chacun des 10 000
environnements, nous avons prédit le taux de croissance d’un mutant de délétion
simple de gène choisi au hasard, et calculé la diminution relative au taux de

99
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

croissance prédit pour la souche sauvage. La Figure 28 présente les différences de

prédiction de ces diminutions relatives prédites par les deux types de modélisation.

Figure 28. Histogramme des différences entre les diminutions relatives de taux de
croissance par délétion de gène prédites par les deux modèles sur les 10000
environnements simulés.

Dans la très grande majorité des cas (94%), la diminution de croissance est
identique. Ce résultat inclut cependant un grand nombre de cas (la moitié) pour
lesquels la délétion est sans effet. Dans 2% des cas, la souche sauvage ne pouvait
croître, empêchant le calcul de la diminution de croissance. Seuls 4% des cas
présentaient une différence de prédiction de diminution de croissance entre les types
de modélisation, de valeur relativement limitée (la majorité est contenue entre -20% et
+20%).

En conclusion, cette étude nous a montré que la modélisation de l’équilibre des

protons restreinte aux processus de transport (1) prédit des taux de croissance
similaires à ceux d’une modélisation complète (quoique supérieur en moyenne), (2)
prédit des phénotypes de croissance de mutants très similaires à ceux de la
modélisation complète et (3) évite l’occurrence de voies métaboliques modifiant
l’équilibre des protons de façon physiologiquement irréaliste. Nous avons donc choisi
d’appliquer ce type de modélisation au modèle d’A. baylyi.

La stœchiométrie des réactions transportant les protons à travers la membrane est

un autre point nécessitant une attention particulière du modélisateur. Leur valeur peut

100
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

en effet influer significativement sur l’efficacité du métabolisme à générer de

l’énergie. Cependant, ces stœchiométries peuvent varier en fonction du processus de
transport, des conditions environnementales (pH) et du gradient de concentration ;
leurs valeurs ne sont pas fixées de manière aussi rigoureuse que celles des
conversions chimiques. Des études pour quelques organismes modèles ont permis
d’en déterminer des valeurs moyennes pour des conditions environnementales
précises (Gennis & Stewart 1996) ; dans le cas d’A. baylyi, nous avons retenu des
valeurs similaires à celles de ces organismes car aucune étude précise n’avait été
réalisée pour A. baylyi. Comme évoqué dans notre revue sur les modèles (section
3.2.1), ces valeurs peuvent également être inférées à partir de données physiologiques
à l’aide des modèles.

6.2.4 Localisation cellulaire

La contrainte de conservation de la masse ne s’applique en toute rigueur qu’aux

pools de métabolites situés dans le même compartiment cellulaire. Deux enzymes
situées dans deux compartiments différents n’opèrent en effet pas sur le même
ensemble de métabolites. Il est donc essentiel de tenir compte de la localisation des
enzymes pour appliquer correctement cette contrainte.

Dans le cas d’A. baylyi, bactérie gram-négative, seuls deux compartiments

segmentent son métabolisme : le cytoplasme et le périplasme. La très grande majorité
de son métabolisme se déroule dans le cytoplasme, seules quelques voies bien
identifiées opèrent dans le périplasme. Il s’agit notamment des premières étapes de la
glycolyse et des voies de dégradations du quinate, du shikimate et du chlorogenate
(Young et al. 2005). L’examen de la littérature associée à ces voies nous a permis de
déterminer précisément la localisation des enzymes impliquées dans ces voies.

Les processus de transport doivent également être modélisés avec attention pour
autoriser les échanges de métabolites entre compartiments. Lorsque l’annotation
n’indiquait pas d’enzyme impliquée dans le transport d’un métabolite, nous nous
sommes basés sur des informations physiologiques de l’organisme (métabolites
connus pour être transportés) pour inférer ces réactions et compléter le modèle.

101
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

6.2.5 Spécificité des métabolites

Comme nous l’avons vu plus haut, l’équilibre des équations bilan appliqué à
l’ensemble du réseau métabolique exige que chaque métabolite soit connu
précisément. Cependant, les substrats précis de certaines enzymes ne sont pas toujours
spécifiés dans l’annotation, soit parce qu’ils sont inconnus, soit parce que l’enzyme
possède un large spectre de substrats. De même, pour représenter cette large
spécificité, les réactions inférées par Pathway Tools utilisent des métabolites
génériques, non compatibles avec la modélisation.

Pour chaque enzyme de ce type, nous avons cherché à déterminer les substrats
spécifiques les plus probables. Nous nous sommes pour cela appuyés sur deux
grandes sources d’information.

Nous avons tout d’abord exploré la littérature associée à ces enzymes et les bases
de données enzymatiques (principalement BRENDA (Barthelmes et al. 2007)) pour
rechercher des informations sur la caractérisation expérimentale de ces enzymes. Une
large proportion de ces enzymes appartient aux voies cataboliques ; les études les
ayant identifiées ont de ce fait souvent cherché à délimiter expérimentalement le
spectre de substrats utilisables. Cette information n’est néanmoins en général pas
reprise exhaustivement dans l’annotation et subsiste uniquement dans la littérature et
les bases de données dédiées (BRENDA).

Nous avons également utilisé le contexte métabolique – constitué par les voies
métaboliques déjà reconstruites – pour identifier les substrats potentiels jouant déjà un
rôle dans le réseau métabolique et les plus à même de conférer à l’enzyme un rôle
significatif dans le métabolisme. Les bases de données répertoriant les métabolites par
catégories chimiques peuvent aider à énumérer tous les substrats potentiels
(Degtyarenko et al. 2008; Fahy et al. 2009).

Certaines enzymes ont une spécificité particulièrement large et agissent sur un

grand ensemble de métabolites. C’est le cas notamment des enzymes ayant pour
substrats des molécules à longues chaînes carbonées, incluant de nombreux lipides.
Les activités de ces enzymes sont alors représentées de manière synthétique à l’aide
de métabolites génériques spécifiant les groupes fonctionnels chimiques mais laissant
indéterminées les chaînes carbonées (voir Figure 29).

102
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 29. Voie d’élongation des acides gras représentée dans AcinetoCyc. L’élongation
de la chaîne des acides gras est représentée à l’aide de métabolites génériques (an acyl-
ACP, acyln+2-ACP) correspondant à des chaînes carbonées de longueurs arbitraires.

Afin de faciliter le travail de transformation de ces voies génériques en réactions

aux métabolites spécifiques, nous avons développé un programme spécifiant
automatiquement ces réactions pour des chaînes carbonées données en paramètre.
Nous avons pour cela représenté chaque métabolite générique par une association
entre un groupe fonctionnel et une chaîne carbonée de nature indéterminée. Nous
avons ensuite formalisé les réactions génériques par des équations bilan impliquant
ces métabolites génériques et indiquant formellement toute modification de la chaîne
carbonée. Par exemple, la réaction générique correspondant à la 3-oxoacyl-ACP
synthase est représentée sous la forme :

malonyl-ACP + Cxx-ACP ! ACP + CO2 + Cxx[+2]-3oxo-ACP

où les métabolites Cxx-… sont les métabolites génériques et la notation [+2] indique
un allongement de 2 carbones de la chaîne carbonée.

Les métabolites spécifiques furent ensuite dérivés des métabolites génériques en

explicitant les chaînes carbonées. Nous avons caractérisé ces dernières par leurs
longueurs (nombre de carbones) et les nombres, types (cis ou trans) et positions de
leurs insaturations. De cette manière, une variété relativement large de chaînes

103
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

carbonées linéaires – correspondant à celles rencontrées majoritairement chez

A. baylyi – pouvaient être prises en compte. Les réactions génériques furent alors
explicitées pour chacune des chaînes carbonées considérées, en leur appliquant les
éventuelles modifications de longueurs. Reprenant l’exemple de la 3-oxoacyl-ACP
synthase pour une chaîne carbonée de longueur 12 possédant une insaturation de type
cis entre le 3e et le 4e carbone (chaîne notée C12:1(c3)), le processus donne la réaction
spécifique suivante :

malonyl-ACP + C12:1(c3)-ACP ! ACP + CO2 + C14:1(c5)-3oxo-ACP

Dans un deuxième temps, nous avons remplacé les noms systématiques générés
pour les métabolites spécifiques par leurs identifiants dans AcinetoCyc et le modèle,
lorsque ceux-ci existent. Cette étape est indispensable pour assurer la compatibilité
des réactions créées avec le reste du modèle, et permettre leur « branchement »
correct sur les autres voies métaboliques du réseau.

Nous avons utilisé ce programme pour générer les réactions spécifiques

correspondant à trois voies métaboliques d’A. baylyi : l’élongation des acides gras,
l’oxydation des acides gras et l’oxydation des acides dicarboxyliques. L’élongation
des acides gras comprend cinq réactions génériques que nous avons implémentées
pour les chaînes carbonées saturées paires de longueurs 2 à 18, et des chaînes paires
de longueurs 12 à 18 possédant une insaturation, représentant un total de 55 réactions.
Six réactions génériques composent la voie d’oxydation des acides gras, que nous
avons implémentées pour les mêmes chaînes carbonées, représentant un ensemble de
66 réactions. Enfin, les cinq réactions génériques de la voie d’oxydation des acides
dicarboxyliques furent spécifiées pour les chaînes carbonées saturées de longueurs 10
(sebacate), 8 (suberate), 6 (adipate), 7 (pimelate) et 5 (glutarate), constituant au total
25 réactions supplémentaires.

L’ensemble de ces réactions constitue une fraction significative du modèle

métabolique global. L’utilisation d’un programme les générant automatiquement à
partir des réactions génériques permet ainsi d’accélérer significativement la
reconstruction du modèle. De plus, toute modification effectuée sur les réactions
génériques peut de cette manière être propagée directement sur l’ensemble des
réactions spécifiques. En effet, les réactions spécifiques dérivant d’une même réaction

104
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

générique partagent des caractéristiques a priori communes : réversibilité,

stœchiométrie, lien avec les enzymes catalysant leur activité. Leur modification doit
de ce fait être répercutée sur l’ensemble des réactions spécifiques, ce qui est rendu
possible par leur génération automatique.

En conclusion, l’utilisation d’un programme générant automatiquement les

réactions spécifiques à partir de réactions génériques et d’un ensemble de substrats
semble nécessaire à la reconstruction rigoureuse et rapide des modèles. Il permet de
gérer au mieux la nécessité de spécificité des modèles en séparant d’un coté la
définition des activités enzymatiques (via des équations bilan génériques) et de l’autre
l’énumération des substrats spécifiques réellement concernés.

6.2.6 Réversibilité des réactions

Les contraintes de réversibilité jouent un rôle essentiel dans les modèles globaux
du métabolisme car elles empêchent certaines réactions de fonctionner dans un sens
thermodynamiquement impossible in vivo. Leur prise en compte dans les modèles
élimine de ce fait un grand nombre de distributions de flux impossibles du point de
vue de la thermodynamique – par exemple la régénération « gratuite » d’ADP en ATP
par des réactions à l’irréversibilité ignorée.

Les grandes bases de données métaboliques ne spécifiant pas de manière

rigoureuse la réversibilité des réactions, il revient au modélisateur de recueillir les
informations nécessaires à l’application de ces contraintes. Lors de la reconstruction
du modèle d’A. baylyi, nous avons recherché ces informations dans la littérature et la
base de données enzymatiques BRENDA. Lorsque ces informations n’étaient pas
disponibles, nous nous sommes alors appuyés sur un ensemble de règles simples
définies par Ma & Zeng (2003) à partir de considérations thermodynamiques. Ces
règles consistent à rendre irréversibles des réactions mettant en jeu un ensemble de
métabolites hautement énergétiques (Ma & Zeng 2003). Il est important de noter que,
en général, la contrainte de réversibilité est appliquée au modèle quelles que soient les
conditions considérées. Les irréversibilités retenues doivent donc être valables de
manière très générale.

105
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

6.2.7 Associations gènes-réactions

Afin de prédire l’effet de l’inactivation d’un ou plusieurs gènes sur le

fonctionnement du métabolisme, le modèle doit pouvoir tenir compte des
dépendances entre les gènes et les réactions pour déterminer quelles réactions sont
inactivées par la perturbation génétique. Pour ce faire, à chaque réaction est associée
une règle booléenne appelée GPR (pour « Gene-Protein-Reaction associations »,
introduites par Reed et al (2003)) exprimant formellement la dépendance de la
réaction aux gènes codant pour ses enzymes (voir revue sur les modèles section
3.2.1) : des gènes codant pour des sous-unités d’un complexe enzymatique sont liés
par une règle ET (ils sont tous requis), tandis que des gènes codant pour des enzymes
alternatives sont liés par la règle OU (l’un ou l’autre est requis). À titre d’exemple, la
réaction de synthèse du glutamate à partir de glutamine et d’"-ketoglutarate
(glutamate synthase) est catalysée chez A. baylyi par deux complexes enzymatiques
distincts ; sa GPR dans le modèle est donnée par la formule :

(ACIAD3349 and ACIAD3350) or (ACIAD2525 and ACIAD2526 and ACIAD2527)

La construction des GPR à grande échelle est rendue difficile par la nécessité de
déterminer les complexes enzymatiques. Même si la participation du produit d’un
gène à un complexe plus grand est parfois mentionnée textuellement dans les
annotations (« enzyme subunit »), l’information n’est en général pas suffisamment
explicite et organisée pour inférer automatiquement tous les complexes enzymatiques.
Il est donc nécessaire de s’appuyer sur la connaissance des complexes identifiés dans
la bactérie (via la littérature correspondante) ou les bactéries proches (par homologie).

Certaines ressources répertorient de manière organisée les complexes identifiés

dans les organismes modèles, notamment EcoCyc pour E. coli (Keseler et al. 2009).
Afin d’accélérer la construction des GPR pour A. baylyi, nous avons cherché à
exploiter automatiquement cette connaissance en développant un programme
reconstituant les complexes d’A. baylyi par homologie à ceux d’E. coli. Pour chaque
complexe d’E. coli, ce programme recherche dans A. baylyi des homologues

106
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

proches49 pour chacun des gènes codant pour les protéines du complexe. Si un
homologue pour chacun des gènes est retrouvé dans A. baylyi, le complexe est alors
reconstitué avec ces homologues en conservant la même structure (voir Figure 30).
Nous avons implémenté ce programme en utilisant la librairie CYCLONE développée
par d’autres membres de notre groupe (Le Fèvre et al. 2007) pour interroger EcoCyc
et créer les complexes dans AcinetoCyc.

Figure 30. Inférence automatique de complexes par homologie aux complexes de

49
E. coli. Pour chaque complexe de E. coli, un homologue à chacun des gènes impliqués est
recherché chez A. baylyi. Si tous les gènes sont retrouvés, un complexe de même structure
est alors inféré chez A. baylyi. La représentation sous forme de graphe est issue de
AcinetoCyc.

L’exécution du programme a permis d’inférer la présence de 310 complexes chez

A. baylyi, pour 821 complexes examinés chez E. coli (version 9 d’Ecocyc, de 2005).
Parmi les complexes inférés, 241 sont homomériques et 69 hétéromériques, ces
derniers impliquant donc plusieurs gènes et pouvant donner lieu à des règles ET dans
les GPR.

L’inférence des complexes étant basée uniquement sur des critères d’homologie et
ne tenant pas compte des annotations fonctionnelles, nous avons (1) vérifié que les
complexes homologues catalysaient bien les mêmes réactions dans EcoCyc et
AcinetoCyc et (2) corroboré l’existence du complexe avec l’annotation des gènes
impliqués. Seuls les complexes vérifiés ont finalement été intégrés dans la dernière
version d’AcinetoCyc. Dans un deuxième temps, nous avons poursuivi ce travail de
curation manuelle en cherchant à identifier les complexes enzymatiques non prédits
(car n’existant pas chez E. coli). Nous avons pour cela exploré les annotations

49
Nous avons utilisé comme critères d’homologie un seuil minimal de similarité de
45%, une longueur d’alignement d’au moins 80% de la séquence la plus courte et une
contrainte de meilleur alignement réciproque (« Bidirectional Best Hit »).

107
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

textuelles (en recherchant les annotations possédant les mots clés « subunit »,
« complex », ou « component ») et la littérature relative aux voies métaboliques
étudiées chez A. baylyi. Une grande proportion des complexes non inférés était
constituée de transporteurs absents chez E. coli (majoritairement des transporteurs
ABC), illustrant la différence de ressources nutritionnelles utilisées par A. baylyi et E.
coli. Pour faciliter spécifiquement la reconstruction de ces complexes, nous avons
utilisé la ressource TransportDB qui décrit explicitement les sous-unités de chaque
transporteur et prédit leur présence dans le génome (Ren et al. 2004).

Le modèle d’A. baylyi comprend au total 63 complexes distincts, dont 28 furent

inférés directement par homologie à E. coli. Parmi les complexes déterminés
« manuellement », 26 possèdent une fonction enzymatique et les 9 restant assurent
des fonctions de transport.

6.2.8 Composition de la biomasse

L’introduction d’une réaction de biomasse dans les modèles à base de contraintes

permet de modéliser les effets de la croissance sur les flux métaboliques. Pour cela,
cette réaction consomme les métabolites précurseurs de la biomasse, simulant
quantitativement leur utilisation par la cellule pour construire les macromolécules
nécessaires à son fonctionnement et à sa croissance. Grâce à la contrainte de
conservation de la masse, les voies de biosynthèses de ces précurseurs sont alors
contraintes de fonctionner avec un flux permettant de répondre à cette consommation
(voir revue sur les modèles, section 3.2.1).

La définition de la réaction de biomasse se heurte cependant à une difficulté

majeure : la composition de la biomasse et les consommations en précurseurs
dépendent sensiblement des conditions de croissance, notamment l’environnement
extérieur, la vitesse de croissance atteinte ou les éventuelles perturbations génétiques.
À chaque condition de croissance devrait ainsi correspondre une réaction de biomasse
d’équation bilan particulière, rendant a priori difficile leur utilisation pour effectuer
des prédictions de croissance dans un grand ensemble de conditions. Dans un souci de
simplification, deux grandes catégories de réactions de biomasse sont utilisées, en
fonction des types de prédictions recherchées. D’une part, une première catégorie de

108
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

réactions de biomasse est formulée pour prédire quantitativement la croissance de

l’organisme sauvage50 dans des conditions expérimentales classiques. La
consommation des précurseurs est alors typiquement estimée à partir d’études de la
composition de la biomasse pour ces conditions expérimentales : on suppose que la
consommation des précurseurs est uniquement due à la dilution provoquée par la
croissance51 et est donc égale à la quantité de précurseurs employés dans la cellule
multipliée par le taux de croissance. D’autre part, la seconde catégorie de réactions de
biomasse est utilisée pour prédire qualitativement l’aptitude à croître de mutants de
délétion. Seuls sont alors retenus dans la réaction de biomasse les précurseurs
essentiels à la survie de la cellule. Ces réactions de biomasse sont généralement
formulées en soustrayant des précurseurs non vitaux aux réactions de biomasse de la
première catégorie.

Dans le cas d’A. baylyi, nous avons défini pour la souche sauvage une réaction de
biomasse « quantitative » que nous avons ensuite réduite pour prédire les phénotypes
de croissance des mutants (avec quelques améliorations opérées par la suite grâce aux
comparaisons avec les phénotypes expérimentaux, voir partie suivante). Étant donné
l’absence de données spécifiques à A. baylyi, nous nous sommes basés sur des études
de la composition de la biomasse de plusieurs souches du genre Acinetobacter en
supposant les résultats extrapolables à A. baylyi.

Afin de simplifier la « gestion » de la réaction de biomasse, nous l’avons

décomposée en plusieurs sous-réactions. Tout d’abord un ensemble de réactions
assemblant chacune un type de macromolécules à partir de ses précurseurs, puis une
réaction globale consommant toutes les macromolécules pour former la biomasse
« totale ». Nous avons retenu les macromolécules suivantes pour A. baylyi : protéines,
ADN, ARN, acides gras libres, triglycérides, wax-esters, phospholipides,
lipopolysaccharides, polysaccharides libres, peptidoglycanes et cofacteurs (ces
derniers ne constituant pas une macromolécule, mais rassemblant sous la forme d’un
métabolite virtuel un ensemble de cofacteurs dont la présence est nécessaire à la
survie de la cellule). Nous détaillerons dans les paragraphes ci-dessous les

50
Non modifié génétiquement.
51
On néglige dans ce cas les cycles potentiels de dégradation/synthèse des
précurseurs de biomasse devant leur consommation par la croissance.

109
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

compositions des macromolécules en précurseurs ainsi que la composition globale en

macromolécules retenues pour le modèle d’A. baylyi. Un compte rendu exhaustif et
détaillé des résultats extraits de la littérature est disponible sous la forme d’un tableur
Excel à l’adresse : http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752-0509-
2-85-S4.xls .

Composition globale

La composition de la biomasse en macromolécules est, dans la plupart des études

expérimentales, donnée en pourcentage de la masse sèche totale de la biomasse. Le
modèle exprimant les quantités de métabolites converties en millimoles (l’unité de
flux choisie étant le mmol.h-1.(g DW)-1, voir 1.2.4) et non pas en masse, une étape de
conversion de grandeur est nécessaire pour intégrer ces résultats expérimentaux. Pour
ce faire, nous avons ajouté au modèle pour chaque métabolite dont l’expression en
masse est nécessaire (notamment les macromolécules), une réaction créant un
métabolite exprimé en masse :

métaboliteA # MMA métaboliteAW

(mmol) # (g.mmol-1) (g)

où MMA est la masse molaire du métabolite et l’indice W indique le métabolite

exprimé en masse. Ce dernier est inclu uniquement pour modéliser la formation de
biomasse et ne participe à aucune réaction biochimique.

La réaction globale de biomasse peut de ce fait être directement exprimée à partir

des proportions massiques en macromolécules :

pA macromoléculeAW + pB macromoléculeBW + … ! 1 biomasseW

où les pA, pB, etc. sont les proportions massiques de chacune des macromolécules. Il
est important de noter que le flux de cette réaction s’exprime alors avec l’unité
(g DW).h-1.(g DW)-1 = h-1, représentant ainsi directement le taux de croissance de
l’organisme.

Nous sommes appuyés sur diverses études présentées dans la littérature pour
déterminer la composition globale en macromolécules d’A. baylyi (voir Tableau 5).
Abbott et al (1974) et du Preez et al (1984) ont mesurés la composition de la

110
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

biomasse en protéines, ADN, ARN et carbohydrates pour A. calcoaceticus cultivée

sur des milieux minimaux d’éthanol et d’acetate. Nous avons retenu une moyenne de
leurs mesures pour un taux de croissance de 0,6 pour déterminer les proportions
massiques de protéines, ADN et ARN. Makula et al (1975) ont déterminé la
composition en lipides de la bactérie Acinetobacter sp. HO1-N cultivée sur milieu
riche et hexadecane. Nous avons retenu la composition mesurée sur milieu riche, le
milieu hexadecane provoquant une accumulation de lipides spécifique à ce type de
milieu. Les milieux étudiés par la suite se rapprochent en effet plus du milieu riche du
point de vue des lipides. Thorne et al (1973) et Scott et al (1976) ont étudié la
composition des membranes (interne pour les deux articles et externe pour Thorne et
al (1973)) de deux bactéries du genre Acinetobacter cultivées sur milieux riches.
Nous avons retenus leurs résultats pour déterminer les compositions en
polysaccharides, lipopolysaccharides et peptidoglycane. Enfin, nous avons estimé la
masse de cofacteurs et petites molécules par analogie à E. coli (Neidhardt &
Umbarger 1996).

Proportion
Macromolécule Référence
massique
Peptidoglycane 2,8% (Thorne et al. 1973)
Polysaccharides libres 4,1% (Abbott et al. 1974; du Preez et al. 1984;
Thorne et al. 1973)
Lipopolysaccharides 0,3% (Scott et al. 1976; Thorne et al. 1973)
Phospholipides 4,1% (Makula et al. 1975)
Wax esters 0,6% (Makula et al. 1975)
Triglycérides 0,2% (Makula et al. 1975)
Acides gras libres 0,2% (Makula et al. 1975)
ADN 3,2% (Abbott et al. 1974; du Preez et al. 1984)
ARN 20% (Abbott et al. 1974; du Preez et al. 1984)
Protéines 63,3% (Abbott et al. 1974; du Preez et al. 1984)
Cofacteurs 3,2% (Neidhardt & Umbarger 1996)
Tableau 5. Composition massique de la biomasse en macromolécules retenue pour le
modèle d’A. baylyi.

La consommation d’énergie requise par la croissance de la cellule est prise en

compte par deux termes énergétiques d’hydrolyse d’ATP : un terme inclu dans la
réaction de biomasse (terme proportionnel au taux de croissance) et un terme de flux
fixe (terme indépendant du taux de croissance) (voir revue sur les modèles, section
3.2.1). Ne disposant pas de mesures expérimentales de rendements de croissance
suffisamment précises pour A. baylyi, nous avons adopté celles du modèle d’E. coli
(Reed et al. 2003) :

111
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

- terme associé à la croissance : 40 mmol.(g DW)-1 d’ATP, inclus dans la

réaction globale de biomasse
- terme indépendant de la croissance : 10 mmol.h-1.(g DW)-1 d’ATP,
modélisé sous la forme d’une réaction d’hydrolyse d’ATP de flux fixe.

Nous verrons plus loin que les prédictions de taux de croissance sont d’ailleurs
peu sensibles à ces paramètres (voir 7.2).

Protéines

Nous n’avons trouvé aucune étude de la composition en acides aminés de

bactéries du genre A. baylyi. Nous nous sommes alors reportés sur la composition
d’E. coli pour construire la réaction d’assemblage de la macromolécule protéine à
partir des acides aminés (Neidhardt & Umbarger 1996) (voir Tableau 6). Nous avons
tenu compte directement, dans cette réaction, du coût énergétique de traduction
(polymérisation et correction d’erreur) à hauteur de 4,2 ATP hydrolysé par acide
aminé (Oliveira et al. 2005).

Acide aminé Composition molaire

alanine 13%
arginine 3%
asparagine 4%
aspartate 4%
cystéine 2%
glutamate 4%
glutamine 4%
glycine 20%
histidine 1%
isoleucine 5%
leucine 7%
lysine 5%
méthionine 2%
phénylalanine 2%
proline 4%
sérine 4%
thréonine 5%
tryptophane 1%
tyrosine 2%
valine 8%
Tableau 6. Composition moyenne des protéines en acides aminés retenue pour le
modèle d’A. baylyi.

Acides nucléiques

Nous avons déterminé la composition en bases nucléotidiques des

macromolécules ADN et ARN à partir du pourcentage GC pour l’ADN (voir Tableau

112
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

7) et d’un décompte moyen des bases contenues dans les ARNr, ARNt et ARNm (voir
Tableau 8). ADN et ARN sont assemblés à partir de nucléotides triphosphates (dNTP
et NTP) et des coûts énergétiques supplémentaires (d’assemblage et correction
d’erreur) de respectivement 1,37 et 0,4 ATP hydrolysés par nucléotide sont ajoutés
aux réactions assemblant ces macromolécules (Oliveira et al. 2005).

Nucléotide Proportion molaire

dAMP 30%
dTMP 30%
dGMP 20%
dCMP 20%
Tableau 7. Composition moyenne en nucléotide de l’ADN retenue pour le modèle
d’A. baylyi.

Nucléotide Proportion molaire

AMP 22%
UMP 26%
GMP 22%
CMP 30%
Tableau 8. Composition moyenne en nucléotide de l’ARN retenue pour le modèle
d’A. baylyi.

Lipides

Nous avons exploité trois études de la composition des lipides de bactéries du

genre Acinetobacter pour déterminer une composition moyenne en termes de chaînes
carbonées dans les différents lipides retenus (Makula et al. 1975; Scott et al. 1976;
Thorne et al. 1973). Seules des chaînes de longueurs paires furent détectées (en
accord avec les voies biosynthétiques identifiées), avec éventuellement une
insaturation (voir Tableau 9). Pour chaque type de lipide, nous avons alors constitué
une macromolécule « générique » à partir des lipides de chaînes carbonées définies
selon les proportions décrites dans le Tableau 9.

Wax Wax
Chaîne Phospho- Triglycéri- Acides
esters - esters -
carbonée lipides des gras libres
a. gras alcool
14:0 0% 2% 0% 0% 6%
16:0 10% 72% 24% 5% 28%
16:1 20% 5% 32% 48% 57%
18:0 10% 6% 0% 0% 0%
18:1 60% 15% 44% 47% 9%
Tableau 9. Compositions molaires moyennes en types de chaînes carbonées des
différents lipides pris en compte dans la biomasse du modèle d’A. baylyi.

113
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

L’étude de Scott et al (1976) a également permis de déterminer la composition en

phospholipides de la membrane. Nous en avons repris les résultats (sur milieu riche)
dans le modèle (voir Tableau 10).

Phospholipide Proportion molaire

phosphatidyl-glycerol 10%
phosphatidyl-ethanolamine 73%
cardiolipin 17%
Tableau 10. Composition moyenne des phospholipides retenue dans le modèle
d’A. baylyi.

Paroi cellulaire

Nous avons tenu compte de deux types de macromolécules constituant la paroi

cellulaire (en plus des phospholipides traités ci-dessus) : le peptidoglycane et les
lipopolysaccharides (LPS).

S’agissant du peptidoglycane, nous avons retenu dans le modèle une composition

typique des bactéries gram-négatives, à savoir un enchaînement de résidus N-acétyl-
glucosamine et acide N-acétyl-muramique liés au pentapeptide L-ala / D-glu /
diaminopimelate / D-ala / D-ala (voir Figure 31).

Figure 31. Agencement des chaînes de peptidoglycane dans la paroi cellulaire. NAG,
N-acétyl-glucosamine ; NAM, acide N-acétyl-muramique.
Figure extraite de http://student.ccbcmd.edu/~gkaiser/

Les molécules de LPS se composent d’un lipide A et d’un cœur

d’oligosaccharides. Nous avons exploité l’analyse expérimentale de la paroi cellulaire
réalisée par Thorne et al (1973) pour définir la composition en lipides de chaque
molécules de lipide A (voir Tableau 11). Nous avons supposé que deux glucosamines
portaient les acides gras du lipide A.

114
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Nombre de
Type d’acide molécules par Type de chaîne
gras lipide A Composition carbonée
Beta-hydroxy 4 56% 12:betaOH
44% 14:betaOH
Classique 2 62% 12:0
18% 16:0
10% 18:0
10% 18:1
Tableau 11. Composition lipidique du lipide A retenue dans le modèle d’A. baylyi.

Les travaux de Thorne et al (1973) et Bryan et al (1986) nous ont permis de définir
la composition des polysaccharides attachés au LPS. Pour chaque LPS, nous avons
associé au lipide A deux molécules de KDO ainsi que 5 molécules d’hexoses,
composés à parts égales de glucose, rhamnose et mannose.

Nous avons également adopté une composition équirépartie de ces trois hexoses
pour les polysaccharides libres (Bryan et al. 1986).

Cofacteurs

Les cofacteurs métaboliques sont inclus dans la réaction de biomasse dans le but
de tenir compte de leur essentialité pour la croissance des cellules. En effet, à l’état
stationnaire, la régénération des cofacteurs permet au modèle d’utiliser ces derniers
sans recourir à leur synthèse. Celle-ci est néanmoins vitale pour répondre à leur
dilution par la croissance.

Nous avons déterminé la liste des cofacteurs essentiels par analogie au modèle
d’E. coli (Reed et al. 2003) (voir Tableau 12).

coenzyme A
fad
fmn
folate (THF)
heme
nad
nadp
pyridoxal-5p
s-adenosylmethionine
siroheme
thiamin
ubiquinone-8
undecaprenyl-pp
Tableau 12. Cofacteurs essentiels pris en compte dans le modèle.

115
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Prédiction qualitative des phénotypes de croissance de mutants

De manière à prédire qualitativement l’aptitude à croître de la bactérie ou d’un de

ses mutants sur un environnement donné (voir application partie suivante), nous
avons dérivé des réactions de biomasse présentées ci-dessus une liste réduite de
précurseurs que nous avons considéré comme essentiels à la croissance (voir Tableau
13). Nous avons prédit les phénotypes qualitatifs de croissance en analysant ensuite la
simple productibilité de chacun des métabolites de cette liste.

tetradecanoate (C14:0) ttp

hexadecanoate (C16:0) triacylglycerol
cis-hexadec-7-enoate (C16:1) l-1-phosphatidyl-ethanolamine
cis-octadec-9-enoate (C18:1) l-1-phosphatidyl-glycerol
gdp-mannose cardiolipin
udp-d-glucose fad
dtdp-rhamnose fmn
kdo2-lipid a s-adenosyl-l-methionine
peptidoglycane thiamine-pyrophosphate
protéine pyridoxal 5'-phosphate
ctp nadp
gtp ubiquinone(40)
utp siroheme
atp heme o
datp nad
dctp coenzyme A
dgtp thf
Tableau 13. Liste des précurseurs de biomasse utilisés pour prédire la capacité à
croître de l’organisme.

7 Le modèle d’Acinetobacter baylyi

À la suite de ce processus de reconstruction, nous avons obtenu un modèle global
du métabolisme d’A. baylyi que nous avons appelé iAbaylyiv1. L’indice v1 indique que
ce modèle constitue une première version reconstruite à partir de l’ensemble des
connaissances initialement disponibles sur le métabolisme d’A. baylyi. Au fur et à
mesure des améliorations apportées au modèle grâce à l’exploitation de données
expérimentales additionnelles (voir partie suivante), nous distinguerons les versions
du modèle en incrémentant cet indice.

Une grande partie des caractéristiques du modèle iAbaylyiv1 étant présentée dans
l’article Durot et al (2008) inclus dans la partie suivante, nous avons choisi d’exposer
dans ce chapitre uniquement quelques compléments utiles. Ainsi, nous donnerons tout
d’abord au lecteur un aperçu plus détaillé des voies métaboliques modélisées, puis

116
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

nous effectuerons quelques analyses sur les prédictions quantitatives de croissance,

enfin nous présenterons quelques détails techniques sur l’utilisation du modèle.

7.1 Composition métabolique globale

Le Tableau 14 présente l’ensemble des catégories fonctionnelles et voies
métaboliques prises en compte dans le modèle iAbaylyiv1, ainsi que les nombres de
réactions et gènes impliqués dans chacune d’entre elles.

Catégorie fonctionnelle Voie métabolique Réactions Gènes

TOTAL 970 787
Amino acids metabolism 139 158
Alanine biosynthesis 3 7
Arginine biosynthesis 10 12
Arginine degradation 5 5
Aspartate / asparagine biosynthesis 2 3
Aspartate / asparagine degradation 2 3
Betaine biosynthesis 2 2
Biomass assembly 1 0
Chorismate biosynthesis 7 8
Cysteine biosynthesis 3 6
Glutamate / glutamin biosynthesis 4 11
Glutamate degradation 2 4
Glycine biosynthesis 1 1
Histidine metabolism 11 10
Isoleucine biosynthesis 5 8
Leucine and valine biosynthesis 8 12
Lysine biosynthesis 7 7
Methionine metabolism 8 8
Ornithine degradation 1 1
Other 3 3
Phenylalanine / tyrosine biosynthesis 7 6
Proline biosynthesis 4 3
Proline degradation 2 1
Serine / glycine biosynthesis 4 4
Sulfur metabolism 3 5
Threonine biosynthesis 5 7
tRNA charging pathway 22 26
Tryptophan biosynthesis 5 7
Urea degradation 2 4
Central metabolism 70 109
Acetate metabolism 3 6
Biomass assembly 1 0
Citrate cycle (TCA) 10 19
Entner-Doudoroff pathway 6 6
Glycerol metabolism 3 3
Glycolysis/gluconeogenesis 12 14
Glyoxylate shunt 2 2
Maintenance flux 1 0
Malonate metabolism 1 7
Other 1 0
Pentose phosphate 5 4
Propionate metabolism / methylcitrate
pathway 7 6

117
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Pyruvate metabolism 5 7
Radicals detoxification 3 6
Respiration 10 35
Cofactors biosynthesis 107 103
Biomass assembly 1 0
Biotin biosynthesis 5 5
Coenzyme A biosynthesis 9 8
FMN / FAD biosynthesis 9 7
Folate metabolism 16 16
Glutathione biosynthesis 2 2
Heme / siroheme biosynthesis 14 12
NAD / NADP biosynthesis 11 10
Other 4 8
Polyisoprenoids biosynthesis 14 13
Pyridoxal 5P biosynthesis 7 7
Thiamin biosynthesis 6 9
Ubiquinone biosynthesis 9 7
Degradation pathways 181 163
3,4-dihydroxyphenylpropionate
degradation 2 2
3-hydroxy-isobutyrate degradation 2 5
Acetoacetate metabolism 4 6
Aldoxime / nitrile degradation 3 4
Alkane degradation 4 5
Allantoate degradation 2 2
Anthranilate degradation 1 3
Benzyl compounds degradation 7 9
Beta-ketoadipate degradation 2 9
Butanediol and acetoin degradation 3 6
Butyric acid metabolism 2 12
Caffeate degradation 4 3
Catechol degradation 3 3
Chlorogenate / quinate degradation 4 5
Coumarate degradation 5 5
Dicarboxylates degradation 24 7
Ethanol metabolism 2 7
Fatty acids degradation 58 43
Ferulate / vanillate degradation 6 6
Fructose utilisation 1 1
Galactarate / glucarate degradation 4 4
Glyceraldehyde degradation 3 5
Glycolaldehyde degradation 1 2
Lactate utilisation 3 2
Methylglyoxal degradation 2 2
Nitrogen assimilation 3 4
Other 6 8
Protocatechuate degradation 4 8
Ribose utilisation 1 1
Salicyl compounds degradation 5 8
Sarcosine degradation 1 4
Shikimate degradation 2 2
Sulfonate degradation 4 11
UDP-glucose utilisation 3 5
Lipid, cell wall
biosynthesis 141 76
Biomass assembly 4 0
Fatty acids biosynthesis 64 20
KDO-lipid A biosynthesis 16 13

118
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Lipoate biosynthesis 1 2
Peptidoglycan biosynthesis 14 14
Phospholipids biosynthesis 9 9
Polysaccharides biosynthesis 11 11
TAG metabolism 10 5
Wax ester metabolism 12 4
Nucleotide metabolism 88 64
Biomass assembly 2 0
Other 1 3
Purine biosynthesis - de novo 27 24
Purine biosynthesis - salvage
pathways 22 12
Pyrimidine biosynthesis - de novo 22 28
Pyrimidine biosynthesis - salvage
pathways 14 8
Transport 133 127
Exchange fluxes 109 0
52
Unbalance fluxes 2 0
v1
Tableau 14. Répartition du nombre de gènes et de réactions dans le modèle iAbaylyi selon
les catégories fonctionnelles et les voies métaboliques. Chaque réaction est assignée à une
unique voie métabolique. Certains gènes sont associés à plusieurs réactions ; ils peuvent de ce fait
être comptés dans plusieurs catégories ou voies.

Le modèle compte un total de 970 réactions, comprenant 111 réactions d’échanges

(catégories « Exchange fluxes » et « Unbalance fluxes »), 9 réactions de biomasse
(voies métaboliques « Biomass assembly »), 133 transporteurs et 717 réactions
purement métaboliques. Ces dernières se répartissent dans les six grandes catégories
fonctionnelles du métabolisme que nous avons définies lors de la reconstruction,
illustrant le fait que le modèle prend en compte le métabolisme dans sa globalité. Il
comprend aussi bien les voies dédiées à l’anabolisme des constituants de la cellule
(catégories « Amino acids metabolism », « Cofactors biosynthesis », « Lipid, cell wall
biosynthesis » et « Nucleotide metabolism ») que celles impliquées dans le
catabolisme des nutriments et la génération d’énergie (catégories « Central
metabolism » et « Degradation pathways » principalement).

Les particularités métaboliques d’A. baylyi se retrouvent dans le contenu en voies

métaboliques du modèle (voir Tableau 14). Ses remarquables capacités cataboliques
sont en effet reflétées par le grand nombre de réactions et la large diversité de voies
regroupées dans la catégorie « Degradation pathways ». Ses capacités à synthétiser et

52
Les réactions de la catégorie « Unbalance fluxes » sont des réactions d’échanges de
métabolites intracellulaires ayant été introduites pour relaxer la contrainte de
conservation de la masse. Elles concernent en l’occurrence le proton (voir 6.2.3) et le
cofacteur s-adenosyl-4-methylthio-2-oxobutanoate (voir 6.2.1), tous deux localisés
dans le cytoplasme.

119
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

dégrader de nombreux lipides se reflètent également dans le modèle : un nombre

significatif de réactions y sont consacrés et une grande variété de lipides peut être
métabolisée (acides gras avec ou sans insaturation, acides dicarboxyliques, wax
esters, triglycérides notamment).

Comme évoqué plus haut à propos du processus de reconstruction (voir 6.2.5), la

création de réactions spécifiques pour les enzymes à larges spectres de substrats
augmente sensiblement le nombre de réactions dans le modèle. En témoigne la forte
représentation des voies métaboliques « Fatty acids biosynthesis », « Fatty acids
degradation » et « Dicarboxylates degradation » dans le modèle (146 réactions à elles
seules). Ces voies métaboliques contiennent des réactions ayant été générées à partir
de réactions génériques selon le processus décrit plus haut (voir 6.2.5). Ces réactions
étant catalysées par les mêmes enzymes, le nombre de gènes impliqués dans ces voies
reste donc limité ; la voie « Fatty acids degradation » déroge cependant à cette règle
(43 gènes inclus) du fait du très grand nombre d’isozymes identifiées pour catalyser
certaines des réactions de cette voie (nombreuses acyl-coa dehydrogenase, enoyl-coa
hydratase et 3-oxoacyl-coa thiolase notamment).

7.2 Prédictions quantitatives de croissance

Durant les travaux de notre thèse, nous nous sommes majoritairement concentrés
sur les prédictions qualitatives de phénotypes de croissance (prédiction de la simple
aptitude à croître, développements et résultats présentés dans les parties suivantes).
Les modèles à base de contraintes permettent cependant d’effectuer des prédictions
quantitatives de taux de croissance, prédictions utilisées avec intérêt pour un nombre
significatif d’autres applications (voir 3.2.1). Afin d’évaluer la capacité de notre
modèle à réaliser correctement ce type de prédictions, nous avons effectué deux
études relativement simples sur les taux de croissance prédits.

7.2.1 Comparaison des prédictions de taux de croissance à des

mesures expérimentales

Nous avons tout d’abord comparé les prédictions de taux de croissance du modèle
iAbaylyiv1 à des mesures expérimentales. L’équipe Thesaurus du Genoscope a pour
cela réalisé une culture suivie d’A. baylyi en milieu minimal liquide contenant du

120
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

glutamate comme seule source de carbone53. À chaque point de temps (toutes les
heures) fut effectué un prélèvement à partir duquel la densité optique à 600 nm (DO)
et la concentration en glutamate54 furent déterminées (voir Figure 32).

Figure 32. Évolution de la densité optique (DO) et de la concentration en glutamate

dans le milieu ([glu]) au cours de la croissance suivie d’A. baylyi.

En utilisant une relation entre DO et masse sèche de cellules déterminée

auparavant dans les mêmes conditions expérimentales, nous avons calculé les flux
moyens de consommation de glutamate (par unité de masse sèche de cellules) et les
taux de croissance moyens à chaque point de temps. Ces résultats sont présentés dans
la Figure 33. Le faible nombre de points de temps55 ne nous a donné accès qu’à des
moyennes relativement larges pour ces grandeurs, entachées pour les premiers points
de temps de marges d’erreurs importantes56 (voir Figure 33). Cependant, aux points
de temps correspondant à des périodes de croissance stable (notamment en fin de
phase exponentielle, points 3h, 4h et 5h), les valeurs calculées de flux de glutamate et
de taux de croissance peuvent être considérées comme suffisamment fiables pour être
comparées au moins grossièrement aux prédictions du modèle.

53
Milieu minimal contenant de l’ammoniac (NH3) comme source d’azote.
54
La concentration de glutamate fut déterminée par test enzymatique en le faisant
réagir avec le NAD à l’aide de la glutamate dehydrogenase. La quantité de NADH
produite fut déterminée par mesure d’absorption à 340 nm.
55
Exigé par les conditions de l’expérience.
56
Dues à la normalisation par la masse mesurée de cellules, faible au début de
l’expérience.

121
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Nous avons ensuite pour chaque point de temps contraint le modèle iAbaylyiv1 à
importer le glutamate avec le flux mesuré puis calculé le taux de croissance optimal
en maximisant le flux de la réaction de biomasse (méthode de « Flux Balance
Analysis » (FBA)). La Figure 33 présente ces prédictions en regard des taux de
croissance mesurés.

122
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 33. Flux de consommation de glutamate mesuré (en haut) et comparaison des
taux de croissance mesuré et prédit (en bas). Le flux de glutamate et le taux de
croissance mesuré furent déterminés à partir des mesures de concentration et de DO (la
relation entre DO et masse sèche fut déterminée en parallèle, dans des conditions
v1
expérimentales similaires). Les taux de croissance furent prédits à l’aide du modèle iAbaylyi
par « Flux Balance Analysis » (Varma & Palsson 1994) en contraignant le flux de glutamate
entrant aux valeurs mesurées. Les marges d’erreurs des taux de croissances prédits ont été
obtenues à partir des marges d’erreurs des flux de glutamate mesurés.

Sur la période 3-5 h, le flux de glutamate consommé par cellule semble se

maintenir à une valeur constante (autour de 15 mmol.h-1.(g DW)-1). Le taux de
croissance prédit pour ces points de temps est par conséquent également constant
(autour de 0,9 h-1). Cette valeur est en bon accord avec les taux de croissance
mesurés, particulièrement pour les points de temps 3 h et 4 h ; la population semble

123
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

croître de manière exponentielle à cette période. On observe ensuite une décroissance

du taux de croissance mesuré, en avance par rapport à celle du taux de croissance
prédit. On peut interpréter cette diminution du taux de croissance mesuré par rapport à
celui prédit par le fait que la population sort probablement de son régime de
croissance purement exponentiel. Il est alors probable que l’hypothèse d’exploitation
optimale du métabolisme pour la croissance ne soit plus valable dans ces conditions.

Cette comparaison aux mesures expérimentales montre que les prédictions du

modèle sont globalement en accord avec les taux de croissance mesurés. Cependant,
une étude plus précise – impliquant un plus grand nombre de points de temps – et plus
complète – utilisant différents milieux – serait nécessaire pour caractériser plus en
détail les limites de validité des prédictions quantitatives du modèle (Edwards et al.
2001). Une telle étude sort en revanche du cadre des travaux de cette thèse.

7.2.2 Sensibilité des prédictions de taux de croissance aux paramètres

énergétiques

Il est important de noter que les prédictions ci-dessus ont été réalisées en
conservant les paramètres énergétiques (et la composition de la réaction de biomasse)
déterminés initialement. Ces paramètres – le flux de maintenance associé à la
croissance (« growth associated maintenance », GAM) et le flux de maintenance
indépendant de la croissance (« non growth associated maintenance », NGAM) – sont
typiquement déterminés à partir d’expériences de culture suivie, pour lesquelles
plusieurs mesures de taux de croissance pour différents flux de consommation de
nutriments distincts sont réalisées (voir 3.2.1). Ne disposant pas de suffisant de
données expérimentales pour déterminer plus précisément ces paramètres, nous avons
adopté ceux déterminés pour le modèle d’E. coli (Reed et al. 2003),

Toutefois, afin d’évaluer la sensibilité des prédictions de taux de croissance à ces

paramètres, nous avons prédit par FBA les taux de croissance pour des valeurs de
GAM et de NGAM variant de +/- 100% autour de leurs valeurs initiales
(respectivement 40 mmol ATP/gDW and 10 mmol ATP/h/gDW). Nous avons choisi
un milieu minimal supplémenté de succinate comme environnement de croissance, en
variant son flux maximal d’import entre 0 et 20 mmol/h/gDW. Les deux figures
suivantes présentent les résultats obtenus.

124
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 34. Effet de la variation du paramètre GAM sur les prédictions de taux de
croissance. Le paramètre NGAM est fixé à 10 mmol ATP/h/gDW.

125
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 35. Effet de la variation du paramètre NGAM sur les prédictions de taux de
croissance. Le paramètre GAM est fixé à 40 mmol ATP/gDW.

La variation de +/- 100% du flux de maintenance associé à la croissance (GAM)

modifie le taux de croissance prédit de +/- 10%, quel que soit le flux d’entrée de
succinate. Étant donné l’importance de la variation imposée au paramètre, la
sensibilité des prédictions à ce paramètre est relativement réduite.

La variation du flux de maintenance non associé à la croissance (NGAM)

provoque un décalage constant de +/- 0.05 h-1 du taux de croissance prédit, quel que
soit le flux d’entrée de succinate. Bien que peu significatif pour les valeurs élevées de
taux de croissance, ce décalage peut provoquer d’importantes variations pour les
prédictions de taux de croissance faibles. Les prédictions réalisées avec le modèle
actuel dans ces derniers cas sont donc sujettes à des incertitudes plus élevées, à la fois
du fait de la forte sensibilité au paramètre NGAM mais également du fait que la
validité de l’hypothèse d’optimalité du fonctionnement du métabolisme pour des taux
de croissance aussi faible soit largement discutable.

7.3 Disponibilité du modèle

Pour faciliter l’utilisation du modèle, nous l’avons rendu disponible sous plusieurs
formats.

126
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Le format le plus complet est un tableur Excel contenant toutes les informations
utilisées dans le modèle57. L’ensemble des réactions y est classé par catégories
fonctionnelles et voies métaboliques, et, pour chacune d’entre elles, équation bilan,
association gène-réaction (GPR), numéro EC, références bibliographiques et
commentaires sont donnés. De manière à favoriser l’intégration du modèle avec
d’autres ressources sur le métabolisme, le tableur fournit également les identifiants
des réactions et métabolites du modèle dans les bases de données KEGG, MetaCyc et
BiGG58. La simplicité de ce format permet de rendre compte aisément de
l’information contenue dans le modèle, il nécessite cependant un travail de
reformatage pour exploiter le modèle à l’aide des outils classiques de modélisation.

Pour cela, nous avons également mis à disposition le modèle au format SBML59
(Systems Biology Markup Language) (Hucka et al. 2004). Ce format XML est
exploité par un grand nombre d’outils de modélisation du métabolisme, incluant
notamment YANA (Schwarz et al. 2007), CellNetAnalyzer (Klamt et al. 2007) et la
COBRA Toolbox (Becker et al. 2007), qui sont spécifiquement dédiés aux modèles à
base de contraintes. Le format SBML original ne spécifiant pas comment représenter
les liens gène-réaction, nous avons adopté les conventions utilisées par la COBRA
Toolbox et la base de données BiGG pour les inclure dans le fichier SBML60. Nous
avons également soumis le modèle au format SBML à la base de données BioModels
(Le Novère et al. 2006) ; il y est stocké sous l’identifiant MODEL1949107276.

Enfin, dans le cadre de développements informatiques menés par d’autres

membres de mon groupe, nous avons inclus le modèle d’A. baylyi dans une interface
web permettant de réaliser en ligne des prédictions de phénotypes de croissances de
mutants61. Cette interface est étroitement associée à la base de données métabolique

57
Téléchargeable à l’adresse :
http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752-0509-2-85-s2.xls
58
Base de données de modèles métaboliques à grande échelle : http://bigg.ucsd.edu .
59
Téléchargeable à l’adresse :
http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752-0509-2-85-s5.xml
60
Dans chaque objet reaction, le lien gène-réaction est ajouté dans une notes de la
forme :
<notes>
<html:p>GENE_ASSOCIATION: aciad2449 and aciad2450 and aciad2451</html:p>
</notes>
61
Disponible à l’adresse http://www.genoscope.cns.fr/nemostudio-platform/

127
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

AcinetoCyc pour visualiser les prédictions directement sur les cartes de voies
métaboliques. Nous évoquerons plus en détail cet outil dans la partie suivante.

128
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

EXPLOITATION DES PHENOTYPES DE

CROISSANCE DE MUTANTS PAR LE MODELE

Nous aborderons dans cette deuxième partie sur nos travaux les résultats de la
confrontation du modèle d’A. baylyi aux phénotypes de croissance de mutants. Nous
nous sommes pour cela reposés sur les ressources expérimentales de l’équipe
Thesaurus présentée en introduction et avons utilisé leurs résultats de phénotypes de
croissance de mutants d’A. baylyi pour 9 environnements minimaux distincts. De
nombreux facteurs influencent les prédictions de phénotypes de croissance de mutants
et peuvent être la cause d’incohérence avec les phénotypes observés. Pour faciliter
l’analyse de ces incohérences, nous introduirons dans cette partie un cadre
d’interprétation et montrerons que celui-ci permet de distinguer les sources d’erreurs
et de guider des corrections au modèle.

Nous avons organisé cette partie en trois chapitres. Le premier reprend un article
que nous avons publié dans BMC Systems Biology et expose l’ensemble des
corrections et interprétations réalisées sur le modèle d’A. baylyi à partir des
phénotypes expérimentaux. Il présente notamment les différentes versions du modèle
progressivement obtenues au cours des étapes de correction. Cet article complète
également la présentation du modèle initiée dans la partie précédente et présente une
interface Web de prédictions de phénotypes pour A. baylyi. Dans le deuxième
chapitre, nous effectuerons une synthèse des types d’interprétations réalisées à partir
des incohérences de phénotypes. Enfin, nous présenterons brièvement dans le
troisième chapitre une évolution récente de l’interface Web de prédiction de
phénotypes prenant en compte un plus grand nombre d’organismes.

129
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

8 Article : « Iterative reconstruction of a global

metabolic model of Acinetobacter baylyi ADP1
using high-throughput growth phenotype and gene
essentiality data »

130
BMC Systems Biology BioMed Central

Research article Open Access

Iterative reconstruction of a global metabolic model of
Acinetobacter baylyi ADP1 using high-throughput growth phenotype
and gene essentiality data
Maxime Durot, François Le Fèvre, Véronique de Berardinis, Annett Kreimeyer,
David Vallenet, Cyril Combe, Serge Smidtas, Marcel Salanoubat,
Jean Weissenbach and Vincent Schachter*

Address: Genoscope (Commissariat à l'Energie Atomique) and UMR 8030 CNRS-Genoscope-Université d'Evry, 2 rue Gaston Crémieux, CP5706,
91057 Evry, Cedex, France
Email: Maxime Durot - [email protected]; François Le Fèvre - [email protected]; Véronique de
Berardinis - [email protected]; Annett Kreimeyer - [email protected]; David Vallenet - [email protected];
Cyril Combe - [email protected]; Serge Smidtas - [email protected]; Marcel Salanoubat - [email protected];
Jean Weissenbach - [email protected]; Vincent Schachter* - [email protected]
* Corresponding author

Published: 7 October 2008 Received: 23 April 2008

Accepted: 7 October 2008
BMC Systems Biology 2008, 2:85 doi:10.1186/1752-0509-2-85
This article is available from: http://www.biomedcentral.com/1752-0509/2/85
© 2008 Durot et al; licensee BioMed Central Ltd.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0),
which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract
Background: Genome-scale metabolic models are powerful tools to study global properties of
metabolic networks. They provide a way to integrate various types of biological information in a
single framework, providing a structured representation of available knowledge on the metabolism
of the respective species.
Results: We reconstructed a constraint-based metabolic model of Acinetobacter baylyi ADP1, a soil
bacterium of interest for environmental and biotechnological applications with large-spectrum
biodegradation capabilities. Following initial reconstruction from genome annotation and the
literature, we iteratively refined the model by comparing its predictions with the results of large-
scale experiments: (1) high-throughput growth phenotypes of the wild-type strain on 190 distinct
environments, (2) genome-wide gene essentialities from a knockout mutant library, and (3) large-
scale growth phenotypes of all mutant strains on 8 minimal media. Out of 1412 predictions, 1262
were initially consistent with our experimental observations. Inconsistencies were systematically
examined, leading in 65 cases to model corrections. The predictions of the final version of the
model, which included three rounds of refinements, are consistent with the experimental results
for (1) 91% of the wild-type growth phenotypes, (2) 94% of the gene essentiality results, and (3)
94% of the mutant growth phenotypes. To facilitate the exploitation of the metabolic model, we
provide a web interface allowing online predictions and visualization of results on metabolic maps.
Conclusion: The iterative reconstruction procedure led to significant model improvements,
showing that genome-wide mutant phenotypes on several media can significantly facilitate the
transition from genome annotation to a high-quality model.

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Background for genetic and metabolic investigations [14-16]. As a soil

The diversity of bacterial metabolism and the perspective bacterium, A. baylyi is able to degrade a wide range of mol-
of engineering applications has spurred a steep increase in ecules, including components of suberin, a protective pol-
both the number of sequencing projects and the volume ymer produced by plants in response to stress. Its
of high throughput experiments on bacteria. The need to harmlessness, nutritional versatility, and high capacity for
interpret and integrate these datasets at the systems level adaptation have led bacteria of the Acinetobacter genus to
has triggered the development of model-based computa- be used for a variety of biotechnological applications–
tional methods [1]. Among them, the constraint-based including the degradation of pollutants (e.g. biphenyl,
modeling approach (CBM) has proved to be particularly phenol, benzoate, crude oil, nitriles) and the production
efficient at integrating large-scale omics datasets related to of valuable biochemical products such as lipases, pro-
metabolism, such as growth phenotypes, metabolite con- teases, bioemulsifiers, cyanophycine and different kinds
centrations, or reaction fluxes [2]. In addition to provid- of biopolymers [17,18]. Following its sequencing and
ing a structured summary of metabolism-related expert annotation [19], a genome-wide single-knockout
knowledge for a given species, a constraint-based model mutant library was generated (ADP1 mutant collection
allows the prediction and analysis of a variety of proper- [8]), enabling the high-throughput assessment of mutant
ties resulting from topological, stoichiometric, and physi- phenotypes in defined growth conditions.
ological constraints known to apply at steady-state to its
global metabolic network. Applications range from stud- We report below on the reconstruction and refinement of
ies on evolutionary or physiological properties to the a genome-scale metabolic model for A. baylyi with the
design of metabolic engineering strategies for biotechno- help of high-throughput experimental data. Following an
logical or therapeutical purposes [3]. Nearly twenty such initial reconstruction using metabolic information
models have been built so far [2], typically through exten- extracted from the genome annotation and the literature,
sive curation work, and, for some of them, through itera- the model was iteratively assessed and improved by com-
tive refinement processes where models were paring its predictions with (1) large-scale growth pheno-
progressively improved by comparison with experimental typing results of the wild-type strain on 190 distinct
datasets [4]. environments, (2) genome-wide gene essentiality data
from the mutant collection, and (3) conditional gene
Systematic evaluation of gene essentiality has proved to be essentiality data derived from growth phenotyping of A.
a valuable resource for investigating gene functions; baylyi mutants on eight defined media. We examined each
knockout mutant collections have been recently built in inconsistency between experimental results and model
this aim for a number of bacteria [5-8]. Rigorous analysis predictions, and corrected the model when sufficient jus-
of their results remains a challenging task, however, as tifying evidence could be collected. Combining the three
gene essentiality depends on the environmental condition refinement steps, 1262 out of 1412 predictions were ini-
and the link between genes and essential functions may tially consistent with experimental results. Among the
be blurred by genetic or metabolic redundancy [9,10]. inconsistent cases, 65 led to improvements, increasing the
Genome-scale metabolic models provide a valuable completeness and accuracy of the model. The final version
framework to help interpret essentiality screens, since they of the model, called iAbaylyiv4, predicted accurately (1)
both recapitulate knowledge on metabolic networks and 91% of the wild-type growth phenotypes, (2) 94% of the
allow prediction of gene essentiality under well-defined genome-wide gene essentialities, and (3) 94% of the phe-
conditions. They have also allowed meaningful cross-val- notypic profiles of A. baylyi mutants on the tested media.
idation of reconstructed metabolic networks with sets of
gene essentiality results, providing insights on potential We developed a web interface which provides easy access
erroneous or incomplete metabolic knowledge, and on to both model and experimental data. The interface
possible improvements [4,11,12]. In this article, we sys- allows browsing of the metabolic network, online compu-
tematically exploit inconsistencies between model predic- tation of phenotype predictions, and comparison of pre-
tions and experimental results to improve a metabolic dictions with experimental results [20].
model reconstruction.
Results and discussion
Our focus is on Acinetobacter baylyi ADP1, a strictly aerobic Initial model reconstruction
!-proteobacterium. Although phylogenetically close to The genome scale model of A. baylyi was iteratively recon-
the Acinetobacter baumanii pathogenic strains, responsible structed following a process depicted in Figure 1. We first
for a growing number of nosocomial infections [13], A. built an initial draft model iAbaylyiv1 using information
baylyi ADP1 is an innocuous soil bacterium. Because of its from the genome annotation, metabolic pathways data-
metabolic versatility and high competency for natural bases, and the literature. Although facilitated by the auto-
genetic transformation, it is a model organism of choice mated network reconstruction software PathoLogic [21],

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iAbaylyi v1 iAbaylyi v2 iAbaylyi v3 iAbaylyi v4

787 genes 789 genes 778 genes 774 genes
Model versions
859 reactions 873 reactions 874 reactions 875 reactions
697 metabolites 702 metabolites 701 metabolites 701 metabolites

Dataset 1 Dataset 2 Dataset 3

Genome-wide gene essentialities on
Experimental Growth phenotypes of wild-type strain on 190 Growth phenotypes of ADP1 mutant collection on 8
succinate-supplemented minimal medium
datasets carbon sources minimal media
derived from ADP1 mutant collection buildup

1 strain x 190 environments 3093 strains x 1 environment 2350 strains x 8 environments

Total environments
190 tested 190 767 Total genes tested 756 455 Total genes tested 452
164 total consistent 173 676 total consistent 712 422 total consistent 426
26 total inconsistent 17 91 total inconsistent 44 33 total inconsistent 26
86% global accuracy 91% 88% global accuracy 94% 93% global accuracy 94%

Conditionally
45 Carbon sources 45 251 Essential genes 251 36 essential genes 36
24 consistent 33 187 consistent 217 16 consistent 18
21 inconsistent 12 64 inconsistent 34 20 inconsistent 18
Model accuracy
8 in model 1 75% accuracy 86% 44% accuracy 50%
13 not in model 11
53% accuracy 73%

145 Non carbon sources 145 516 Dispensable genes 505 419 Dispensable genes 416
140 consistent 140 489 consistent 495 406 consistent 408
31 in model 31 27 inconsistent 10 13 inconsistent 8
109 not in model 109 95% accuracy 98% 97% accuracy 98%
5 inconsistent 5
97% accuracy 97%

Model GPR 2 genes added 1 gene added ; 12 removed ; 36 GPR modified 4 genes removed ; 9 GPR modified
NETWORK 14 reactions added 4 reactions added ; 3 removed ; 4 modified 1 reaction added ; 1 modified
corrections BIOMASS - 2 biomass precursors added ; 4 removed -

Figure
A. baylyi 1metabolic model refinement process
A. baylyi metabolic model refinement process. A. baylyi metabolic model was iteratively refined in three steps using data-
sets of experimental results. The initial reconstruction iAbaylyiv1 was assessed and improved using dataset 1; the resulting
model iAbaylyiv2 was then assessed and refined using dataset 2, yielding iAbaylyiv3 which was again evaluated and refined using
dataset 3, leading to the final model iAbaylyiv4. Since only mutants corresponding to dispensable genes in dataset 2 could be
phenotyped in dataset 3, gene essentialities revealed in dataset 3 are medium-specific, i.e. conditionally essential. Genes classi-
fied as conditionally essential in dataset 3 are conditionally essential on at least one environment. Genes classified as dispensa-
ble are dispensable on all tested environments. Model accuracy figures indicates for each dataset and its corresponding models
the counts of consistent and inconsistent predictions. Accuracy is computed as the fraction of consistent predictions among all
predictions. For dataset 1, Biolog results for metabolites that were not in the model were counted as consistent with predic-
tions if the metabolite was not a carbon source and inconsistent if the metabolite was a carbon source. Model corrections fig-
ures summarize the corrections performed on each model component.

this initial reconstruction still required extensive manual model. Out of 133 transporters, 23 were initially included
curation (see Methods). The draft metabolic network gen- in the model using this type of evidence only. The
erated by PathoLogic was first inspected to filter out and dependency between genes and reactions was modeled
correct wrongly predicted pathways and reactions, and using Boolean rules, known as GPR (Gene-Protein-Reac-
then completed by reviewing the expert genome annota- tion associations) [22]. These rules encode the presence of
tions and the metabolic information contained in the lit- isozymes or enzymatic complexes for the catalysis of reac-
erature. For instance, specific efforts were dedicated to tions, and predict the effect of genetic perturbations on
properly include pathways accounting for the particular the activity of reactions. GPR rules were first derived using
degradation capabilities of A. baylyi. Physiological infor- homology with E. coli enzyme complexes [23] and then
mation on A. baylyi was especially helpful to build the set completed by manual curation. In order to model the
of transport processes, as substrate specificities of trans- metabolic and energetic demands associated with growth,
porters are difficult to deduce from genome annotation we introduced a set of intermediary biomass reactions
only. For each metabolite shown to be consumed by A. that synthesize generic cell constituents (e.g. protein,
baylyi we added a corresponding transport reaction to the DNA, RNA, or lipid) from precursor metabolites, and a

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global growth reaction consuming them in proportion with genes of known function, or conservation of amino
defined by studies of biomass composition [24,25]. Ener- acid motifs (Figure 4). While the evidence for these genes
getic parameters required to predict quantitative growth does not fully prove the existence of associated enzymatic
rate using Flux Balance Analysis (FBA) were assumed to be activities, it suggests them with sufficient strength to jus-
similar to those of E. coli model (see Methods)[22]. No tify adding the corresponding reactions in the model. The
accurate measurement of A. baylyi growth yields could be level of evidence of each gene was tracked for later use in
used to validate these parameters, however. While such interpreting inconsistent behaviors. Out of 262 reactions
validation would be required to get more accurate predic- to which these genes contribute, 85 are solely catalyzed by
tions of growth yields, the current parameters already pro- medium-confidence genes, some of these being essential
vide good approximate values (see Additional file 1 for a to the model viability. In addition, 35% of all coding
sensitivity analysis on these parameters). For the purpose sequences are still of unknown function in A. baylyi, and
of qualitatively predicting growth ability using Metabolite may leave gaps in the actual metabolic network. Integra-
Producibility analysis (see Figure 2) [26], we designed a tion of additional experimental data was thus crucial in
reduced list of biomass precursors which are all essential order to validate the metabolic network and correct it
for growth in in vitro conditions. We used this list to pre- when necessary.
dict qualitative growth phenotypes and compare them
with those of phenotyping experiments on in vitro envi- Model validation and expansion using growth phenotype
ronments. In vivo environments may impose harsher con- results
ditions requiring additional metabolic responses; this list We used results of large-scale growth phenotyping experi-
therefore represents a minimal set of essential precursors ments to perform a first round of model assessment and
that may need to be expanded to properly predict growth refinement. Using Biolog assays, we experimentally tested
phenotypes on more realistic environments [27]. The the wild-type strain ability to use 190 distinct metabolites
Methods section provides more details on the reconstruc- as sole carbon and energy sources (see Methods). Using
tion process. the model, we predicted the growth phenotypes of the
wild-type strain on the corresponding in silico media and
This initial reconstruction process led to the model compared them to the experimental results.
iAbaylyiv1 gathering 859 reactions grouped in 7 metabolic
categories and 697 distinct metabolites, 109 of which Out of the 190 screened metabolites, 45 were found to be
could be transported from the environment. As depicted carbon and energy sources for A. baylyi. This relatively
in Figure 3, the model accounts for all main processes of small fraction of carbon sources can be explained by the
A. baylyi metabolism, including biosynthetic routes, fact that Biolog microplates are only partially adapted to
energy metabolism, and catabolic pathways. Genomic A. baylyi's biotope: they feature sugars, nucleosides or
islands of catabolic diversity endow A. baylyi with the abil- amino acids but relatively few chemicals originating from
ity to degrade a wide variety of soil compounds [19]. The plant compounds. iAbaylyiv1 model predicted 24 of them
metabolic model reflects this nutritional versatility, as and missed 21 (see Figure 1). Eight of the missed carbon
20% of its reactions are dedicated to the catabolism of source metabolites were already present in the model, but
external compounds. A list of specific compounds that with no associated transporter. Amongst them, seven
can be degraded by A. baylyi is provided in Table 1. would also be predicted as carbon and energy sources had
the corresponding transporters been included. In order to
iAbaylyiv1 involves 787 genes out of the 1518 confirmed resolve these inconsistencies, we added for each of them a
or putative enzymatic and transport genes of A. baylyi. A generic transport reaction accounting for A. baylyi's ability
large majority (94%, 681/726) of the enzymatic reactions to utilize these compounds (see Table 2). Growth on the
(excluding transporters) were associated with at least one remaining metabolite (2-ketobutyrate) was contradicted
gene, while the lower proportion (83%, 110/133) of by an additional individual growth experiment.
transport reactions linked to genes is explained by the
extensive use of physiological data to include them. The Thirteen carbon source metabolites were unknown to the
association of nearly all reactions with a gene confers a metabolic model. For two of them, sorbate and tricarbal-
high reliability to the model. The few reactions that were lylate, we were able to identify degradation pathways and
introduced with no associated gene are most often sup- add them to the model (see Table 2). Sorbate, an unsatu-
ported by indirect evidence and introduced in order to fill rated fatty acid, can be degraded by fatty acids oxidation
gaps (See Additional file 2). enzymes, which were already included in the model for
the degradation of other fatty acids. Sorbate transport and
Most A. baylyi genes were annotated by expert curation; a degradation reactions were therefore added to the model
third of the model genes relied on evidence conferring using the same set of genes. Recently, genes coding for tri-
them a medium confidence level, e.g. limited homology carballylate transport (tcuC), oxidation to cis-aconitate

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A!
G1! G2!G3! G4!G5!

GPR! BIOMASS!
OR! OR!
Essential biomass
precursors
R1!
R 2!
R3!

Metabolites of NETWORK! Producible

the medium metabolites

B! Gene deletion!
G1! G2!G3! G4!G5!
Reduction of producible
OR! OR! metabolites space!
Essential biomass
R1! precursor is no
R 2! more producible!
R3!
Inactivated reaction!

Figure 2 framework
Modeling
Modeling framework. (A) A metabolic model is represented as a combination of three model components: GPR Boolean
rules associate genes (G1 to G5) with reactions (R1 to R3), the network of reactions defines the set of feasible biochemical
transformations (illustrated by the arrows), and the set of essential biomass precursors defines the requirements for growth.
Growth phenotypes are predicted by assessing whether all biomass precursors can be produced by the metabolic network
from the set of metabolites from the medium [26] (see Methods) (B) Gene deletions potentially inactivate reactions, which in
turn may reduce the space of producible metabolites. In case where a biomass precursor is no more producible, gene deletion
is predicted lethal on the given medium.

(tcuA and tcuB), and for a regulatory protein required for and ACIAD1543 (tcuR, 44% identity). Following these
tcuABC expression (tcuR) were identified in Salmonella clues, we expanded the model by implementing the corre-
enterica [28,29]. Highly homologous genes could be sponding transporter and degradation reaction, and
found in synteny in A. baylyi: ACIAD1536 (tcuB, 59% annotated the corresponding genes. In four cases, dedi-
identity), ACIAD1537 (tcuA, 76% identity), ACIAD1541 cated growth experiments contradicted the Biolog result,
(tcuC, 64% identity), ACIAD1539 (tcuR, 46% identity), weakening the case for further study (see Table 2). Finally,

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Table 1: Some substrates involved in A. baylyi degradation L-ornithine, and D-serine (see Figure 1 and Table 2).
pathways Experiments from [15] contradicted the Biolog result on
Anthranillate Octane 4-hydroxybenzoate, while additional individual experi-
Benzoate Straight chain dicarboxylic acids ments confirmed the Biolog results of the other four.
Salicylate Straight chain fatty acids
Catechol Sarcosine Interestingly, A. baylyi annotation describes a complete
Chlorogenate Propanaldoxime phosphotransferase (PTS) transport system for fructose
Quinate Propanenitrile
(ACIAD1990 and ACIAD1993, fruA &fruB) coupled with
Shikimate Propanamide
Coumarate Malonate
a 1-phosphofructokinase (ACIAD1992, fruK) leading to
Ferulate Glucarate fructose-1,6-bisphosphate (see Figure 5). In accordance
Vanillate Galactarate with the annotation, the model predicts that fructose
Caffeate Ethanesulfonate should be a carbon and energy source, yet this is not
Protocatechuate observed experimentally. To confirm the ability of the PTS
system to transport fructose, we assessed experimentally
the growth phenotype of the fructose bisphosphate aldo-
no relevant pathway could be found for the remaining lase (ACIAD1925, fda) knockout mutant (see Figure 5).
seven unmodeled carbon sources. Further investigations The !ACIAD1925 mutant could not be obtained on suc-
are needed to identify the metabolic processes allowing A. cinate-supplemented minimal media, reflecting the fact
baylyi to exploit these metabolites. that Fda is required in the gluconeogenesis pathway to
provide fructose-1,6-bisphosphate, an essential interme-
Conversely, only five of the 145 non-carbon source diate for building pentose-phosphates and polysaccha-
metabolites were wrongly predicted to be carbon sources rides. The mutant could however be obtained by adding
by the model: 4-hydroxybenzoate, D-fructose, L-arginine, fructose in the medium, showing that fructose could be

200

reactions
180
genes

160

140
Number of genes / reactions

120

100

80

60

40

20

0
Amino acids Central Cofactors Degradation Lipid, cell wall Nucleotide Transport
metabolism metabolism biosynthesis pathways biosynthesis metabolism

Figure
Number3of reactions and genes in iAbaylyiv1 distributed by model metabolic categories
Number of reactions and genes in iAbaylyiv1 distributed by model metabolic categories. Reactions were associ-
ated with a unique metabolic category. Genes linked to several reactions may be associated with multiple categories.

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Figure 4 of annotation confidence levels for genes included in iAbaylyiv1 model

Distribution
Distribution of annotation confidence levels for genes included in iAbaylyiv1 model. Confidence levels were
assigned according to the type of evidence supporting gene annotation.

imported into the cell and converted to fructose-1,6- Systematic model improvement using gene essentiality
bisphosphate. The reason why A. baylyi is unable to use data
fructose as a sole carbon source remains yet to be investi- In steps 2 and 3 of the model refinement process, we
gated. Hypothetically, A. baylyi may be unable to use the assessed and improved the model by comparing its pre-
Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway in the glyco- dictions to experimentally determined gene essentialities,
lytic direction, as it has been observed for the dissimila- derived from the ADP1 mutant collection [8] (see Figure
tion of glucose [19,30]. 1). Growth phenotypes of all single gene deletion mutants
on the corresponding environments were predicted using
As is the case in E. coli, L-ornithine and L-arginine are metabolite producibility analysis (see Figure 2 and Meth-
degraded by A. baylyi using the arginine succinyltrans- ods). Predicted phenotypes were then compared to the
ferase (AST) pathway. This pathway allows E. coli to use genome-wide gene essentiality results in order to assess
them as nitrogen sources, but not as carbon sources. Puta- the accuracy of the model and to identify inconsistent pre-
tive explanations include unsuitable regulation and inad- dictions. Inconsistencies could be either false essential
equate transport [31]. Similar reasons may explain A. (genes falsely predicted essential by the model) or false
baylyi's inability to use L-ornithine and L-arginine as car- dispensable (genes falsely predicted dispensable by the
bon sources. model) predictions. Since these inconsistencies are as
many clues that the understanding of A. baylyi's metabo-
A. baylyi's genome annotation includes genes for D-serine lism represented in the model is erroneous or incomplete,
transport (ACIAD0118 and ACIAD2662, cycA) and D-ser- we examined them carefully in order to find interpreta-
ine deaminase activity (ACIAD1048 dsdA), which should tions and, when needed, refine the model.
allow it to use D-serine as a carbon and nitrogen source.
The interpretation of this inconsistency is also unclear; a We classified refinements into three categories according
similar unexplained inconsistency was pointed out in a to the model component that was modified: GPR, NET-
study involving a metabolic model of B. subtilis [4]. WORK or BIOMASS (see Figure 2). These three compo-
nents model different kinds of biological processes which
Improvements to the model resulted in iAbaylyiv2, raising contribute to determining the growth phenotype of
predictive accuracy on Biolog-measured phenotypes from mutant strains (see Methods). The GPR component, con-
86% to 91% of the growth phenotypes (see Figure 1). sisting of the GPR Boolean rules, computes the effect of
Detailed results of the comparison with Biolog results can the genetic perturbation on the activity of reactions in the
be found in Additional file 3. model. The NETWORK component, the actual network of

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Table 2: Biolog carbon sources inconsistently predicted by metabolic, the model thus already captured a large part of
iAbaylyiv1 and corresponding corrections the bacterium's essential processes. The thoroughly
Unpredicted Biolog carbon sources 21 curated but also purely metabolic E. coli model iAF1260
includes a similar proportion of E. coli essential genes on
Prediction corrected by addition of transporter 7 glucose-supplemented minimal medium (57%, 238/419)
3-ketobutyrate [12]. As shown in Figure 6, essential genes absent from the
butyrate model were mainly related to functional categories lying
D-aspartate outside of model scope, such as protein fate, DNA metab-
L-asparagine olism, transcription, or regulatory functions. On the other
L-glutamine
hand, essential genes involved in metabolic processes
propionate
pyruvate were largely covered by the model. iAbaylyiv2 already
Prediction corrected by addition of degradation pathway 2 showed good agreement with the observed gene essential-
sorbate ities as 88% of the predictions were identical to the exper-
tricarballylate imental results (respectively 95% of dispensable genes
Biolog result contradicted by additional experiment 5 and 75% of essential genes present in the model, see Fig-
2-ketobutyrate ure 1). As depicted in Figure 7, inconsistencies were
alpha-D-glucose
D-malate
homogeneously distributed across the metabolic catego-
D-xylose ries of the model, with an exception for Transport and
L-arabinose Degradation pathways, which gathered few inconsisten-
Uncorrected inconsistencies – no relevant pathway found 7 cies. Genes in these categories are typically dedicated to
2-hydroxybutyrate the use of external substrates and most of them are not
bromo-succinate required for growth on succinate medium only. Their met-
D-lactate methyl ester
abolic role could thus not be evaluated in this first exper-
methylpyruvate
tween 20
iment: most were accordingly both observed and
tween 40 predicted as dispensable. Gene essentiality experiments
tween 80 on a variety of media were needed to assess the functions
Unpredicted Biolog non carbon sources 5 of these genes in the appropriate environmental context.

Biolog result contradicted by additional experiment 1 It is worth noticing that inconsistency results support our
4-hydroxybenzoate * choice to include medium-confidence genes into the
Uncorrected inconsistencies 4
model. Genes associated with medium-confidence meta-
D-fructose
D-serine
bolic annotations did not trigger more inconsistencies
L-arginine then high-confidence level genes. 18% (47/268) of reac-
L-ornithine tions including at least one medium-confidence gene in
their GPR are associated with an inconsistent gene, a sim-
* result from [15]. Numbers provide the count of inconsistencies ilar proportion to that of reactions containing only high
pertaining to each category. confidence genes (14%, 75/527). We examined the 91
inconsistent predictions of this step and refined the model
reactions, models the metabolic conversion capabilities of for 47 of them (see Table 3 and below for details on the
the organism. Finally, the BIOMASS component, consist- corrections). The refinements were implemented in
ing of the list of metabolites required for growth, models iAbaylyiv3, increasing global accuracy from 88% to 94%.
the biomass precursor requirements of the organism. Improvement was most noticeable for essential genes, as
86% were correctly predicted by iAbaylyiv3. As discussed
Model refinements below, a high number of false isozymes, triggering false
We performed two iterations of refinement using gene dispensable predictions, were detected in this refinement
essentiality data (see Figure 1). In a first step, we used gene step.
essentialities established during the construction of the
ADP1 mutant library to derive an intermediary version of In a second step, the model was evaluated against growth
the model iAbaylyiv3. This experimental dataset is nearly phenotyping assays of mutants from the ADP1 collection
exhaustive as it covers 97% of all A. baylyi genes [8]. The on 8 minimal media supplemented with varying carbon
mutant collection, built on succinate-supplemented min- and nitrogen sources (see Table 4 and Methods). Since all
imal medium, revealed 499 essential genes for this A. baylyi mutants were first obtained on a succinate-sup-
medium. Half of these genes were present in the model plemented minimal medium, essentialities revealed by
(251/499), which is a significantly higher fraction than these assays were strictly conditional. Furthermore, as the
for all A. baylyi genes (24%, 789/3288). Although purely succinate-supplemented medium was already minimal,

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Pentose phosphates and

polysaccharides synthesis fructose [periplasm]

ACIAD1990 PEP
& ACIAD1993
(fruAB) pyruvate
ACIAD1992 (fruK)
fructose-1,6-bisphosphate fructose-1-phosphate

ACIAD1925 (fda) ADP ATP

glyceraldehyde- dihydroxy-acetone-
3-phosphate phosphate
ACIAD0363
(tpiA)

EMP pathway

Tricarboxylic acid cycle

Figure
Map 5
of fructose utilization pathway in A. baylyi
Map of fructose utilization pathway in A. baylyi. Fructose utilization pathway produces fructose-1,6-biphosphate which
should be a precursor for the biosynthesis of pentose phosphates and polysaccharides and for the tricarboxylic acid cycle.
Model accordingly predicts growth with fructose as sole carbon source. Phenotyping experiments show no growth of A. baylyi
with fructose as sole carbon source. Supposedly, the Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway may not operate in the glyco-
lytic direction in A. baylyi, as already observed for glucose utilization [19,30]. See main text for details.

the set of conditionally essential genes was restricted to tate exhibit similar characteristics since 2,3-butanediol is
the genes directly related to the use of the tested carbon converted to acetate for its utilization [8]. The use of ace-
and nitrogen sources. These were chosen to involve differ- tate as a carbon source requires the activation of the glyox-
ent parts of A. baylyi secondary metabolism (see Table 4). ylate shunt, catalyzed by ACIAD1084 (isocitrate lyase)
Overall, 455 knockout mutants corresponding to genes in and ACIAD2335 (malate synthase G). These genes were
the model could be phenotyped (see Figure 1). therefore found to be essential on 2,3-butanediol and ace-
tate only. Accordingly, the metabolic model correctly pre-
Phenotyping experiments pointed out 2 to 10 condition- dicted the required use of this pathway and the
ally essential genes (from the set of model genes) on each subsequent essentiality of these genes on these media. As
medium (Table 4). While a majority of these genes were shown in Figure 1, iAbaylyiv3 accurately predicted the phe-
essential on a single medium, some were found condi- notypic profiles of 93% of all genes, leaving 33 genes with
tionally essential on several media. This revealed interde- inconsistent predictions on at least one medium. Nine of
pendencies between environments and might be related them led to model corrections, again mainly in the GPR
to processes specific to groups of environments. For component of the model (see Table 3). These corrections,
instance, growth phenotypes on 2,3-butanediol and ace- implemented in iAbaylyiv4, slightly improved the predic-

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Figure 6 of A. baylyi essential genes covered by iAbaylyiv2 model distributed by TIGR role categories
Proportion
Proportion of A. baylyi essential genes covered by iAbaylyiv2 model distributed by TIGR role categories. TIGR
role categories were obtained from TIGR automated annotation of A. baylyi [67]. Some genes were associated with multiple
functional classes. NA: no TIGR role has been assigned. For each role category, absolute numbers of genes in the model (left)
and not in the model (right) are provided.

tive accuracy for mutant phenotypes (94%) while keeping ACIAD0964 and ACIAD2907 (prs) were identified in the
the predictive accuracy for the previous datasets initial reconstruction as isozymes for the catalysis of the
unchanged. ribose-phosphate diphosphokinase activity, which is
required for the biosynthesis of 5-phosphoribosylpyro-
Combining both refinement steps, 56 out of 124 incon- phosphate (PRPP) (see Figure 8A). The association of
sistencies led to model corrections. In the following sec- both genes to the activity relied on homologies with pre-
tions, we will discuss these gene essentiality viously annotated genes in other organisms. The expected
inconsistencies in more details irrespective to the dataset and predicted dispensability of ACIAD2907 was yet con-
that triggered them (see also Table 3). Model corrections tradicted by its experimental essentiality. Looking further
will be presented according to the model component that into the annotation evidence, ACIAD0964 function was
was modified. supported by only limited homologies to previously
known genes (second best hit after ACIAD2907 with E.
GPR corrections coli gene prsA, with 25% identity). Conversely,
A majority of the model improvements (34/56) were ACIAD2907 function was supported by a stronger homol-
applied to the GPR component, with a clear bias towards ogy with E. coli gene prsA (68% identity) whose ribose-
false dispensable inconsistencies: 26 GPR corrections per- phosphate diphosphokinase has been experimentally
tained to experimentally essential genes against only 8 to confirmed [32]. The combination of the observed gene
experimentally dispensable genes (see Table 3). This large essentialities with the limited homology supporting the
set of false dispensable predictions includes two main annotation of ACIAD0964 led us to correct the model by
inconsistency types. In 22 cases, isofunctional genes with removing ACIAD0964 from ribose-phosphate diphos-
annotations of medium confidence were in fact unable to phokinase GPR. On the other hand, the functions of some
replace the activity of their deleted isozymes. For instance, isozymes with medium confidence level were corrobo-

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Figure 7 of gene essentiality predictions for dataset 2 and iAbaylyiv2 distributed by model metabolic categories
Consistency
Consistency of gene essentiality predictions for dataset 2 and iAbaylyiv2 distributed by model metabolic cate-
gories. Proportions of genes having inconsistent predictions for essentiality on succinate-supplemented minimal medium in
iAbaylyiv2 are shown for each model metabolic category. Genes linked to several reactions may be associated with multiple cat-
egories. For each metabolic category, absolute numbers of inconsistent (left) and consistent (right) gene essentiality predictions
are provided.

rated by the gene essentialities. For instance, two isozymes that S. cerevisiae possesses the gene ILV3, with a confirmed
were indirectly confirmed to have a dihydroxy-acid dehy- activity [34], which is homologous to ACIAD3636 (51%
dratase activity, which is essential for the synthesis of identity). Overall, amongst the reactions which were
valine, leucine and isoleucine. Two duplicate genes were essential to iAbaylyiv2 viability and associated with an iso-
associated with this activity: ACIAD1266 (ilvD) and zyme of medium confidence-level, 8 showed agreement
ACIAD3636. While the annotation of ACIAD1266 is sup- between predictions and phenotypes while 11 triggered
ported by a strong homology with E. coli gene ilvD (74% inconsistencies. In other words, while some medium-level
identity) whose activity has been experimentally shown genes were discarded thanks to essentiality data, a compa-
[33], ACIAD3636's function was supported only by rable fraction of genes was indirectly confirmed. This
weaker homologies with the reference genes (37% iden- observation provides additional confirmation that essen-
tity with E. coli gene ilvD). Gene knock-outs revealed that tiality data represents a valuable resource, as it helps vali-
both genes were dispensable while the essentiality of date or discard gene functions supported by reasonably
other genes in the pathway strongly suggested that the good but non-conclusive evidence. It also provides an a
dihydroxy-acid dehydratase activity was required. This posteriori validation of the usefulness of including
result strongly suggests that both genes could back up medium-level annotations in the initial model, as failing
each other and therefore indirectly corroborates the func- to do so would have resulted in a significant loss of infor-
tional assignment to ACIAD3636. mation in the A. baylyi metabolic model.

Further examination revealed that the duplicate genes are For three false dispensable predictions, we uncovered
also found together in other organisms, including enzymatic complexes or functional dependencies
Bradyrhizobium japonicum and Bordetella bronchiseptica, and between genes that were absent from the initial recon-

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Table 3: Inconsistent gene essentiality predictions identified in refinement steps 2 and 3 and corresponding corrections and interpretations

CORRECTION 56 NO CORRECTION 68
BIOMASS 10 Validated explanation 6

biomass precursor not essential 9 experimental error 1

ACIAD0076 (rmlB) D step 2 ACIAD0108 (lldD) D step 3
ACIAD0078 (rmlD) D step 2 known gap in the understanding of pathway 4
ACIAD0079 (rmlA) D step 2 ACIAD0856 (bioA) E step 2
ACIAD0080 (rmlC) D step 2 ACIAD0857 (bioF) E step 2
ACIAD0086 (epsM) D step 2 ACIAD0859 (bioD) E step 2
ACIAD0099 (galU) D step 2 ACIAD2045 (bioB) E step 2
ACIAD0101 (pgi) D step 2 unmodeled auxotrophy 1
ACIAD0104 (manB) D step 2 ACIAD3523 (metE) E step 2
ACIAD2429 (cyoE) D step 2 Hypothetical explanation 32

missing essential biomass precursor 1 ACIAD0178 (atpI) E step 2

ACIAD1374 (ispU) E step 2 ACIAD0180 (atpB) E step 2
GPR 34 ACIAD0182 (atpE) E step 2

activity simultaneously requiring all genes 3 ACIAD0183 (atpF) E step 2

ACIAD0661 (hisG) E step 2 ACIAD0184 (atpH) E step 2
ACIAD1257 (hisZ) E step 2 ACIAD0185 (atpA) E step 2
ACIAD3103 (ilvH) E step 2 ACIAD0186 (atpG) E step 2
gene associated to another essential reaction 1 ACIAD0187 (atpD) E step 2
ACIAD2606 E step 2 ACIAD0188 (atpC) E step 2
isozyme not functional 22 ACIAD0556 (ndk) D step 2
ACIAD0151 (guaA) E step 2 ACIAD0650 (argJ) E step 2
ACIAD0249 (ribC) E step 2 ACIAD1150 (pyrC) E step 2
ACIAD0871 (fabG) E step 2 ACIAD1346 (sodB) E step 2
ACIAD1069 (lysS) E step 2 ACIAD1358 (rpiA) E step 2
ACIAD1255 (epd) E step 2 ACIAD2282 (sahH) D step 2
ACIAD1323 (purF) E step 2 ACIAD2314 (metZ) E step 2
ACIAD1375 (cdsA) E step 2 ACIAD2458 (glnA) E step 2
ACIAD1736 (accC) E step 2 ACIAD2842 (pckG) E step 2
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ACIAD1737 (accB) E step 2 ACIAD2847 (folD) E step 2

ACIAD1925 (fda) E step 2 ACIAD3155 (mdh) E step 2
ACIAD2227 (dctA) E step 2 ACIAD3349 (gltD) E step 2
ACIAD2565 (gap) E step 2 ACIAD3350 (gltB) E step 2
ACIAD2666 E step 2 ACIAD3470 (msuE) E step 2
ACIAD2907 (prs) E step 2 ACIAD3506 (aceF) E step 2
ACIAD3062 (folK) E step 2 ACIAD0101 (pgi) E step 3
ACIAD3249 (ribA) E step 2 ACIAD0546 E step 3
ACIAD3365 (murE) E step 2 ACIAD0556 (ndk) D step 3
ACIAD3371 (gltX) E step 2 ACIAD1021 D step 3
ACIAD1710 (pcaC) E step 3 ACIAD1707 (pcaB) E step 3
ACIAD2018 (ald1) E step 3 ACIAD1711 (pcaH) E step 3
 Table 3: Inconsistent gene essentiality predictions identified in refinement steps 2 and 3 and corresponding corrections and interpretations (Continued)

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ACIAD2088 (aspQ) E step 3 ACIAD1712 (pcaG) E step 3
ACIAD2983 (gcd) E step 3 ACIAD1744 (aspA) E step 3
presence of an alternate enzyme 6 No precise interpretation 30

ACIAD1231 (argD) D step 2 ACIAD0072 (ugd) E step 2

ACIAD1642 (uppP) D step 2 ACIAD0173 (rhtB) E step 2
ACIAD2968 (ispA) D step 2 ACIAD0382 (ubiB) D step 2
ACIAD1020 (acoL) D step 3 ACIAD0505 (purU1) E step 2
ACIAD1715 (quiX) D step 3 ACIAD1482 (kdsD) D step 2
ACIAD2984 D step 3 ACIAD1483 (kdsC) D step 2
spontaneously occurring reaction 1 ACIAD2283 (metF) D step 2
ACIAD2819 D step 3 ACIAD2290 (cydA) E step 2
wrong complex subunit 1 ACIAD2525 E step 2
ACIAD0799 D step 2 ACIAD2667 (pdxB) D step 2
NETWORK 12 ACIAD2788 E step 2

false alternate pathway in the model 7 ACIAD2880 (sdhA) D step 2

ACIAD0239 (ppa) E step 2 ACIAD2911 (panD) D step 2
ACIAD0547 (proA) E step 2 ACIAD3503 (guaB) E step 2
ACIAD1105 (adk) E step 2 ACIAD3510 (lpxC) D step 2
ACIAD1920 (glnS) E step 2 ACIAD0086 (epsM) E step 3
ACIAD2560 (proB) E step 2 ACIAD0335 (fadB) E step 3
ACIAD3032 (proC) E step 2 ACIAD0382 (ubiB) D step 3
ACIAD0901 (dut) E step 2 ACIAD0922 E step 3
missing alternate pathway in the model 5 ACIAD2070 (metI) E step 3
ACIAD0106 (lldP) D step 2 ACIAD2282 (sahH) D step 3
ACIAD0451 (katA) D step 2 ACIAD2283 (metF) D step 3
ACIAD0930 (glpK) D step 2 ACIAD2667 (pdxB) D step 3
ACIAD1045 (metH) D step 2 ACIAD2755 E step 3
ACIAD0106 (lldP) D step 3 ACIAD2875 (sucB) E step 3
ACIAD2876 (sucA) E step 3
ACIAD2880 (sdhA) D step 3
ACIAD2911 (panD) E step 3
ACIAD3071 (cysM) E step 3
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ACIAD3549 (gshA) E step 3

Inconsistencies identified during the refinement steps using mutant library essentialities (step 2) and mutant growth phenotypes on 8 media (step 3). Inconsistencies leading to corrections (left
column) are listed according to the model component that was corrected: GPR, NETWORK, and BIOMASS. Inconsistencies with no correction (right column) are listed according to the level of
interpretation that could be drawn. Numbers provide the count of inconsistencies pertaining to each correction or interpretation category. For each inconsistency, E or D indicates the
experimental phenotype of the mutant: E: gene is essential (on at least one medium for step 3), D gene is dispensable (on all media for step 3).
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Table 4: Mutant phenotyping experiments: growth media and experimental results for genes included in iAbaylyiv3

Source of1 Essentiality Specific metabolic pathways a priori involved

Carbon nitrogen E D

acetate ammonia 5 431 Glyoxylate shunt

L-asparagine ammonia 3 445 Asparagine and aspartate degradation
D-2,3-butanediol ammonia 10 433 Butanediol to acetoin to acetyl-coa degradation, glyoxylate shunt
D-glucarate ammonia 5 413 Glucarate to 2-oxoglutarate degradation
!-D-glucose ammonia 7 432 Entner-Doudoroff pathway
L-lactate ammonia 2 445 Lactate dehydrogenase
quinate ammonia 8 436 Quinate to protocatechuate to acetyl-coa and succinyl-coa degradation
succinate urea 3 442 Urease

1 Italic text indicates the changed carbon or nitrogen source with respect to the medium used for mutant construction (succinate and ammonia).
E: number of conditionally essential genes
D: number of dispensable genes

struction: genes thought to be isozymes were in fact spontaneously [37]). See Additional file 3 for further
jointly required to catalyze the reactions. As an illustra- details on these corrections.
tion, ACIAD0661(hisG) and ACIAD1257 (hisZ) were ini-
tially assigned as isozymes of ATP NETWORK corrections
phosphoribosyltransferase reaction in the pathway of his- Twelve gene essentiality inconsistencies from datasets 2
tidine biosynthesis (see Figure 8A). The observed essenti- and 3 led us to improve the NETWORK component of the
ality of both genes suggested that they were both necessary model (see Table 3). Two types of inconsistencies fall
to the activity. Further examination of the literature con- within this category. On the one hand, false dispensable
firmed that, unlike in E. coli, ACIAD0661 forms a complex predictions may indicate that alternate pathways present
with ACIAD1257 [35]. In E. coli, hisG codes for an enzyme in the model are either inactive for the experimental con-
that is active on its own and is not part of a complex. ditions under observation or not present at all. Seven dis-
crepant predictions led us to reconsider alternate
Amongst the false essential predictions which led to mod- pathways in the model. For instance, ACIAD0822,
ifications of the GPR component, six cases involved asso- ACIAD0823, and ACIAD0824 (gatABC), annotated as
ciating additional enzymes to reactions. For instance, aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase, catalyzed in
ACIAD2968 (ispA, farnesyl diphosphate synthase) was iAbaylyiv2 the synthesis of charged glutamine-tRNA and
observed to be dispensable, even though it is the only cat- charged asparagine-tRNA through the transamidation of
alyst of two reactions essential for the biosynthesis of iso- misacylated glutamate-tRNA(Gln) and aspartate-
prenoids, which are the precursors of vital cofactors (see tRNA(Asn) (see Figure 8C). Charged glutamine-tRNA can
Figure 8B). Previous work showed for E. coli that ispA was also be produced by the direct charging of glutamine on
dispensable and that ispB (octaprenyl diphosphate syn- its tRNA using the glutaminyl-tRNA synthetase enzyme
thase) and ispU (undecaprenyl diphosphate synthase) (ACIAD1920, glnS), however. The observed essentiality of
could perform these activities [36]. A. baylyi's homologues ACIAD1920 is inconsistent with the redundancy of these
to these genes – ACIAD2940 (ispB) and ACIAD1374 two pathways, suggesting that the transamidation of
(ispU) – were therefore added as isozymes of ACIAD2968 glutamate-tRNA(Gln) does not occur in vivo. Furthermore,
for both reactions (see Figure 8B). aspartate-tRNA(asn) transamidation is actually the only
way of producing asparagine, as A. baylyi is lacking both
The remaining types of GPR refinement involved associat- asparagine synthetase and asparaginyl-tRNA synthetase
ing genes with already existing essential reactions enzymes. This result strongly suggests that, in A. baylyi,
(ACIAD2606: associated with nicotinate-nucleotide ade- ACIAD0822-0824 genes are predominantly employed for
nylyltransferase activity, which is essential for NAD bio- asparagine-tRNA synthesis. To account for ACIAD1920
synthesis), adding new complex subunits (ACIAD0799: essentiality, we thus removed the glutamate-tRNA(Gln)
falsely considered as a sulfite reductase subunit and transamidation pathway from the metabolic network.
replaced by ACIAD2981 after further investigations) or
assigning spontaneous activity (ACIAD2819: encodes for On the other hand, false essential predictions may suggest
gluconolactonase activity which has been shown to occur that alternate pathways are missing from the model. Cor-
rections of this type involve searching for new metabolic

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iAbaylyi v2 iAbaylyi v3

A ribose-5-phosphate ribose-5-phosphate

ACIAD0964 OR ACIAD2907 ACIAD2907

PRPP PRPP

ACIAD0661 OR ACIAD1257 ACIAD0661 AND ACIAD1257

phosphoribosyl-ATP phosphoribosyl-ATP

protein protein
histidine histidine

B dimethylallyl-PP dimethylallyl-PP

ACIAD2968 ACIAD2968 OR ACIAD2940

OR ACIAD1374
geranyl-PP geranyl-PP

ACIAD2968 ACIAD2968 OR ACIAD2940

OR ACIAD1374
farnesyl-PP farnesyl PP

ACIAD1374 ACIAD2940 ACIAD1374 ACIAD2940

cofactors cofactors
undecaprenyl-PP octaprenyl-PP undecaprenyl-PP octaprenyl-PP

C
glutamate aspartate aspartate

ACIAD3371 OR ACIAD0609 ACIAD0609

ACIAD0272

glutamate aspartate aspartate

glutamine -tRNA(gln) -tRNA(asn) glutamine -tRNA(asn)
ACIAD0822 AND ACIAD0822 AND ACIAD0822 AND
ACIAD0823 AND ACIAD0823 AND ACIAD0823 AND
ACIAD0824 ACIAD0824 ACIAD0824
ACIAD1920 ACIAD1920
glutamine asparagine glutamine asparagine
-tRNA(gln) -tRNA(asn) -tRNA(gln) -tRNA(asn)

protein protein protein protein

fructose-6-phosphate fructose-6-phosphate
D
ACIAD0086 ACIAD0101 ACIAD0086 ACIAD0101

ACIAD0902 OR ACIAD0902 OR
ACIAD0104 ACIAD0104 ACIAD0104 ACIAD0104

ACIAD0099 ACIAD0076 ACIAD0099 ACIAD0076

ACIAD0086 ACIAD0078 ACIAD0086 ACIAD0078
ACIAD0079 ACIAD0079
ACIAD0080 ACIAD0080

GDP-mannose UDP-glucose dTPD-rhamnose GDP-mannose UDP-glucose dTPD-rhamnose

Figure 8 (see legend on next page)

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Figurecorrection
Model 8 (see previous
examples
page)
Model correction examples. Examples of model corrections performed between iAbaylyiv2 (left) and iAbaylyiv3 (right) mod-
els. Metabolites are depicted by blue circles and triangles, triangles indicating essential biomass precursors. Reactions are rep-
resented by arrows colored in red if they are predicted essential and in green if they are predicted dispensable. Gene names
are indicated next to reaction arrows; they are written in red if they are experimentally essential and in green if they are dis-
pensable. Genes with inconsistent predictions are written in bold italic. Dashed boxes indicate components that have been
modified. Further evidence for model corrections are shown in main text and Additional file 3. (A) First steps of histidine bio-
synthesis. Unpredicted essentiality of ACIAD2907 encoding for ribose-phosphate diphosphokinase activity was corrected by
removing the alternate gene ACIAD0964 from the reaction GPR. Unpredicted essentialities of ACIAD0661 and ACIAD1257,
catalyzing the ATP phosphoribosyltransferase reaction, were corrected by assigning them as complex subunits instead of iso-
zymes in the reaction GPR. (B) Isoprenoids biosynthesis. Unpredicted dispensability of ACIAD2968, catalyzing farnesyl-diphos-
phate and geranyl-diphosphate synthases activities, was corrected by adding ACIAD1374 (undecaprenyl-diphosphate synthase)
and ACIAD2940 (octaprenyl-diphosphate synthase) as isozymes. Unpredicted essentiality of ACIAD1374 was resolved by add-
ing undecaprenyl-PP to the set of essential biomass precursors. (C) Synthesis of charged glutamine-tRNA(gln) and asparagine-
tRNA(asn). Unpredicted essentiality of ACIAD1920, encoding for glutaminyl-tRNA synthetase activity, was corrected by
removing from the model the alternate pathway using aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase enzyme (ACIAD0822-0824).
(D) Biosynthesis of polysaccharides. Unpredicted dispensabilities of all genes involved in GDP-mannose, UDP-glucose, and
dTDP-rhamnose synthesis were corrected by removing these three metabolites from the list of essential biomass precursors.

activities, a task that is open-ended and exploratory in Conversely, false dispensable inconsistencies may
nature and is likely to require additional experimental uncover essential metabolites that were initially over-
work. Five inconsistencies led to the addition of new reac- looked. For instance, undecaprenyl diphosphate, a cofac-
tions to the model, mainly for the transport of metabo- tor required for the synthesis of peptidoglycan, was not
lites. part of the biomass precursors list in iAbaylyiv2.
ACIAD1374 (ispU, undecaprenyl pyrophosphate syn-
BIOMASS corrections thetase), involved in its synthesis, was observed essential,
Ten inconsistent gene essentiality predictions led to mod- although predicted dispensable (see Figure 8B). As this
ifications of the BIOMASS component (see Table 3). False cofactor is regenerated during the peptidoglycan building
essential inconsistencies can reveal biomass precursors process, its synthesis was actually not required at steady
that are not necessary to the viability of the cell on the state. We therefore added undecaprenyl diphosphate to
tested environments, yet commonly produced by the the list of essential metabolites in order to account for its
wild-type strain. For instance, a large fraction of the BIO- required synthesis and resolve the unpredicted essentiality
MASS modifications (8/10) were found in the biosynthe- of ACIAD1374. An alternate method was recently intro-
sis of polysaccharides. Based on studies of the duced to account for the non-constitutive requirement for
lipopolysaccharides composition of Acinetobacter species cofactors [27]. Small consumption terms are added for
[38,39], three nucleotide sugars were initially included in each cofactor in the equation of reactions involving them,
the list of essential biomass precursors. All genes specifi- thereby creating a replenishing flux of cofactor when reac-
cally involved in the synthesis of these sugars were found tions are active. This replenishing flux enforces the synthe-
to be dispensable for growth on these in vitro environ- sis of the cofactor when required. While this method
ments (see Figure 8D). Further investigations are needed allows discarding cofactors from the general biomass
to analyze the composition of polysaccharides in the cor- requirements, it involves remodeling the reaction equa-
responding mutants and interpret the robustness to these tions in an artificial manner.
deletions. Although dispensable in our experimental
growth conditions, complete polysaccharides are likely to Interpretation of remaining inconsistencies
be essential on more realistic environments. Cell surface The analysis of inconsistent predictions did not always
polysaccharides play an important role to help coloniza- lead to model refinement. Either the explanation of the
tion and prevent desiccation while secreted polysaccha- discrepancy did not lead to model refinement, or no
rides are assumed to provide A. baylyi with better uptake explanation interpreting the discrepancy could be vali-
capabilities of hydrophobic compounds in natural envi- dated.
ronments [19,40]. In order to account for these viable
phenotypes on our experimental conditions, all three sug- Six discrepancies were confidently interpreted yet did not
ars were removed from the list of biomass precursors. lead to model modifications (see Table 3). In one case, we
identified a wrong experimental result. Four inconsisten-
cies pertained to the pathway of biotin synthesis, whose

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essentiality could not be accounted for by the model. The final model: iAbaylyiv4
Since the initial step of this pathway is unknown, it could The overall refinement process led to the final model
not be linked to the metabolic network, preventing the iAbaylyiv4 gathering 774 genes, 875 reactions and 701
model from simulating biotin synthesis. One inconsist- metabolites (see Figure 1). iAbaylyiv4 integrates all refine-
ency was caused by a requirement for a cofactor that could ments resulting from the three experimental datasets
not be modeled. Two different methionine synthase introduced in this work. Accordingly, its predictions are
enzymes catalyze the conversion of homocysteine to consistent with the experimental results in 91% of the
methionine: one B12-independent encoded by cases for dataset 1, 94% of the cases for dataset 2, and 94%
ACIAD3523 (metE) and one B12-dependent encoded by of the cases for dataset 3. Compared with iAbaylyiv1, it was
ACIAD1045 (metH). Since coenzyme-B12 is neither syn- expanded by 19 reactions and 2 genes, while 3 reactions
thesized by A. baylyi nor provided in the experimental and 16 genes were removed in the refinement process (see
media, the !ACIAD3523 mutant was unable to use the Figure 1, Model corrections).
MetH enzyme to synthesize methionine. The model could
not account for this B12 auxotrophy of the !ACIAD3523 An online software tool for the exploration of
mutant. In order to properly account for the dependency Acinetobacter baylyi metabolism
between MetH activity and the presence of a cofactor, the In order to facilitate the exploration of A. baylyi metabo-
replenishing flux method can be employed [27] or the lism using the genome scale model, we created NemoStu-
modeling framework could be extended by introducing dio [20] (Combe et al, in preparation), a web interface
rules that state which conditions are required for the combining a simulation layer for the model with Acineto-
enzymes to be active. The introduction of this additional Cyc, A. baylyi Pathway-Genome Database [21]. NemoStu-
layer of rules has already been proposed to account for dio gathers data on functional genomics annotations,
regulatory constraints [41] and may be helpful to explain metabolic reactions and pathways, and experimental
a number of inconsistent phenotypes. mutant phenotyping results within a single interface.
Additionally, it allows performing phenotype predictions
For 62 inconsistencies, we could not reach a validated using the constraint-based model.
explanation within the scope of this global analysis (see
Table 3). For 32 of them, we could formulate hypothetical AcinetoCyc gathers information on the metabolic net-
interpretations, all of which need experimental confirma- work of A. baylyi and is used to display interactive meta-
tion. A high proportion of these possible interpretations bolic maps. After its initial automated construction using
involve regulatory processes. For instance, A. baylyi pos- PathoLogic [21], AcinetoCyc has been undergoing con-
sesses like E. coli two distinct enzymes for glutamate syn- stant curation. It includes all metabolic reactions present
thesis: glutamate synthase, encoded by ACIAD3350 (gltB) in the model.
and ACIAD3349(gltD), and glutamate dehydrogenase,
encoded by ACIAD1110 (gdhA). In E. coli, these pathways NemoStudio integrates the latest version of A. baylyi met-
were shown to be regulated in response to nitrogen limi- abolic model, iAbaylyiv4. Growth phenotype predictions
tations [42]: glutamate synthase is used at low ammo- can be performed for any set of environmental conditions
nium concentrations while glutamate dehydrogenase is and genetic perturbations of this study. We implemented
used at high ammonium concentrations. E. coli strains both Flux Balance Analysis (FBA) and Metabolite Produc-
lacking glutamate synthase show severe growth deficiency ibility methods to predict growth phenotypes (see Meth-
at low ammonium concentrations [42]. Similarly, ods). When performed on sets of environmental
ACIAD3350 and ACIAD3349 were found essential in A. conditions and sets of gene deletions, prediction results
baylyi on the succinate-supplemented minimal medium. are displayed in a table format in parallel to the actual
These phenotypes contradicted model predictions, which experimental results. Predictions can thus be readily com-
considered the alternate pathway for glutamate synthesis. pared with the experimental observations. Furthermore,
Further investigation would be required to fully under- predicted and experimental phenotypes are both dis-
stand the regulatory processes at work in this pathway for played on AcinetoCyc metabolic maps, and conversely
A. baylyi and extension of the modeling framework should gene deletions can be directly set from these metabolic
be conducted to account for regulatory processes within maps (see Figure 9). When performed for a single environ-
the model. ment and a single genetic perturbation, FBA predicts an
optimal flux distribution towards biomass production;
The remaining 30 inconsistencies could not be given a these fluxes are both displayed in a table and on Acineto-
clear interpretation and also require further investiga- Cyc metabolic pathways.
tions.
The availability of this resource as a web interface makes
it easily usable by scientists interested in A. baylyi metabo-

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Figure 9 of NemoStudio web interface

Screenshot
Screenshot of NemoStudio web interface. The web interface is divided in two parts. The left panel is dedicated to setting
the analyses performed on the metabolic model. Simulated media, gene knockouts and type of analysis (metabolite producibil-
ity or flux balance analysis, see Methods) can be set in this panel. The right panel displays results in various formats for the
selected type of analysis. The "omics view" part maps the predicted and experimental results on AcinetoCyc metabolic maps.

lism. Compared with previous web-based software for assist or even drive future investigations on this bacte-
genome-scale metabolic modeling [27], the A. baylyi rium, helping for instance interpret other types of experi-
NemoStudio interface provides better interactivity, direct mental data beyond growth phenotypes, or engineer its
visualization of results on metabolic maps and integrated metabolism. An increasing number of metabolic engi-
comparison with experimental data. By interfacing as neering strategies are being designed with the help of
much as possible results deriving from systems level anal- genome-scale metabolic model predictions [43,44]: the
yses with experimental data of various forms, it allows the availability of the A. baylyi model should facilitate efforts
simultaneous exploitation of both information types. towards biotechnology goals. The A. baylyi model may
also serve as a basis for the reconstruction of metabolic
Conclusion models of the pathogen strains Acinetobacter baumanii.
In this work, we reconstructed a genome-scale model of These strains, which are involved in serious nosocomial
Acinetobacter baylyi metabolism from the annotation of its infections worldwide and have acquired multidrug-resist-
genome, metabolic knowledge reported in the literature, ance capabilities[13], share a significant number of meta-
and results of high-throughput experiments. The model bolic genes with A. baylyi [45]. This model is also the
provides a curated and structured representation of this fourth genome-scale bacterial metabolic model to be
species's metabolism for use both as a reference and as a accompanied by an exhaustive mutant library (with E. coli
foundation for further study. The reconstruction accounts [5,12], Bacillus subtilis [4,6], and Pseudomonas aeruginosa
for 875 reactions, 701 distinct metabolites, and 774 PAO1 [46,47]). The proximity between A. baylyi and P.
genes, and includes nearly all metabolic routes and bio- aeruginosa, and to a lesser extent E. coli, and the availability
chemical conversions identified for A. baylyi. A significant of model/mutant library pairs provides an invaluable
proportion of reactions belong to pathways of secondary setup for comparing the metabolism of different species
metabolism that are characteristic of A. baylyi's physiology [8].
and lifestyle. The model thus reflects the specific ability of
A. baylyi to utilize various chemicals originating from Several rounds of comparisons of model predictions to
plant metabolism, e.g. aromatic acids, hydroxylated aro- large-scale experimental results led to significant model
matic acids, or straight chain dicarboxylic acids. It may improvements. First, growth phenotypes of the wild-type

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strain on 190 distinct environments resulted in the addi- here to be the main area of model improvement. The asso-
tion of 9 transporters and 2 pathways to the model. After ciation between genes and reactions can be complex as
improvement, the model accounted correctly for the regulatory constraints may interfere with the actual gene
growth phenotypes on 173 of the 190 environments. Sec- function assignments. Computational strategies are there-
ondly, we assessed the model against gene essentiality fore needed to help interpret the consequences of gene
results on 9 defined environments. In contrast with wild- essentiality data on gene activities.
type growth phenotypes, these data can bring indirect
information on the gene functions or on the existence of Deriving the full benefits from a metabolic model entail
alternate pathways. Investigation on the causes of incon- both accessing its components and using its predictive
sistencies led us to modify the model in 56 cases out of capabilities. We realized the former by providing access to
124 inconsistent predictions. All model components were a detailed metabolic pathways database, the latter
modified, the GPR component gathering most of the through a software tool that performs online predictions,
improvements. The model accuracy in predicting mutant both being coupled at the level of genes and reactions and
growth phenotypes increased from 88% to 94% on succi- accessible through a single, highly-interactive interface.
nate-supplemented minimal medium and from 93% to This interface allows end-users to carry systems level pre-
94% for the combined conditional gene essentiality dictions, and compare them with corresponding experi-
results on 8 media. High-throughput phenotype clearly mental observations, putting the consequences of
improved the quality of the model and expanded our modeling in the context of the detailed biological infor-
understanding of A. baylyi metabolism, providing a valua- mation that went into the model. This tool should there-
ble complement to the annotation and the literature. The fore provide researchers interested in A. baylyi metabolism
refinement process was particularly useful in validating or with a valuable resource for investigating its phenotypic
contradicting functional annotations that stood in the and physiological properties.
"grey zone", i.e. for which the annotation process pro-
vided only medium-level evidence. Methods
Initial reconstruction process
Conversely, the model allowed systematic evaluation of The initial reconstruction of the metabolic network was
the results of these high-throughput experiments by com- carried out using data provided by (i) the genome expert
paring them to its predictions. Inconsistencies directly tar- annotation [19], (ii) the BioCyc metabolic pathway data-
geted informative experimental results for which further base automatically generated from these annotations [21]
investigation are required. As shown in this work, not all and (iii) various literature resources on biochemistry,
inconsistencies led to model improvements. Some of including textbooks, reviews and journal publications
them could be interpreted in terms of biological processes (see Additional file 2). The genome annotation was
lying outside the scope of the modeling framework, prob- downloaded from the MaGe interface [50,51] and used as
ably regulation in most cases. In addition, a significant input of the Pathway Tools software [21] in order to gen-
number of discrepancies reported in this work remained erate a BioCyc automatic reconstruction of the metabolic
unexplained or led to hypotheses in need of confirmation network. The predicted pathways were classified into 7
through further study. metabolic categories (central metabolism, nucleotide
metabolism, amino acids metabolism, lipid & cell wall
The process described here was driven by expert curation: metabolism, degradation pathways, cofactor biosynthe-
each inconsistency was manually examined in order to sis, transport) and examined manually before being
search for an interpretation and a possible model correc- included in the model. In order to meet the requirements
tion, a labor-intensive proposition. The systematic use of of the modeling framework the mass balance and reversi-
such experimental data for model refinements would be bility of the reactions were checked.
greatly facilitated by the development of computational
methods assisting the curator with his task, however. A Reversibility of the reactions was determined from litera-
number of methods have been developed to search for ture evidence when available or based on simple thermo-
variants of model which match better with additional dynamic considerations [52]. Proton translocation
experimental data, mainly by seeking additions or remov- efficiencies of reactions of the respiratory chain were
als of reactions in the metabolic network [48,49]. These assumed to be similar to those of E. coli [53]. Resulting P/
methods have already proven efficient at suggesting met- O ratio can range between 0.5 to 2, depending on the
abolic pathways that account for previously unexplained types of cytochrome oxidase and NADH dehydrogenase
growth on specific environments [48]. While they can be that are used. Reactions using generic compounds (for
adapted to handle growth phenotypes of knockout example a nitrile or a polymer of undetermined length)
mutant strains, they do not involve the gene-reaction were instantiated with defined representative metabolites.
association component of the model, which is shown In this respect, polymeric pathways were expanded into

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chains of specific reactions. Large polymeric molecules using linear programming tools. The main constraint is
such as the acyl carrier protein (ACP) or tRNAs were imposed by the steady-state assumption, represented by
included in the model when they were involved as sub- the matrix equation:
strate cofactors of biochemical reactions. Their specific
synthesis was not considered in the model. Dependency S·v = 0
between reactions and genes were coded by Gene-Protein-
Reaction (GPR) Boolean relationships (see below). Using where S is the stoichiometric matrix of the metabolic net-
the Cyclone interface to BioCyc [54], we implemented a work and ! the vector of reaction fluxes. The stoichiomet-
simple method based on gene homologies between ric matrix is a matrix of size (m × n) where m is the number
Escherichia coli and Acinetobacter baylyi to infer enzyme of metabolites and n the number of reactions. Each ele-
complexes and find AND Boolean associations between ment Si,j of the matrix represents the relative stoichiomet-
genes. Information from the literature was used to close ric coefficient of metabolite i in reaction j. Additional
gaps in the metabolic pathways, include pathways specific constraints on the fluxes, such as irreversibility and capac-
to A. baylyi that were unknown to the metabolic data- ity constraints, are imposed by inequalities in the form:
bases, and check the predicted pathways, for instance for
the specificity of the cofactors. Physiological information !lb, i " !i " !ub, i
derived from the literature [15,55-59] was used together
with genome annotation tools, e.g. TransportDB [60], to where !lb,i and !ub,i are respectively the lower and upper
add transport reactions in the model. A generic transport bounds of the flux of reaction i.
reaction was added to the model for each metabolite
shown to be utilized by A. baylyi. A fixed biomass compo- Environmental conditions are applied to the model by
sition was chosen according to data found in the literature constraining the exchange fluxes of extracellular metabo-
for strains growing on standard media (see Additional file lites. Exchange fluxes are sink reactions allowing to con-
4). This biomass composition was used to build the trol the input or output of metabolites in the model. They
reduced list of essential biomass precursors and derive a are constrained to 0 " !i " # for metabolites absent from
biomass reaction for Flux Balance Analyses (see below). the medium and -# " !i " # for metabolites present in the
To help properly account for all metabolic requirements medium, except for limiting nutrients for which a maxi-
associated with growth, we decomposed the biomass reac- mum uptake rate is chosen (-!uptake " !i " #). When simu-
tion into a set of intermediary biomass reactions synthe- lating the metabolic network of a knockout mutant, the
sizing generic cell constituents (e.g. protein, DNA, RNA, activity of each reaction is determined by evaluating its
or lipid) from precursor metabolites and a global growth GPR association according to the set of removed genes.
reaction consuming them according to the chosen bio- Fluxes of the inactivated reactions are constrained to be
mass composition. See Additional file 4 for details on equal to zero.
these reactions.
The BIOMASS component models the essential metabolic
Modeling framework requirements for growth. It consists of a list of metabolites
The metabolic model is composed of three components, that are considered to be essential biomass precursors.
namely GPR, NETWORK and BIOMASS. The GPR compo- Growth phenotype is therefore determined by checking
nent models the dependency between genes and reactions their producibility [26]. To do so, the steady-state con-
using Boolean functions usually called gene-protein-reac- straints for the essential biomass precursors are changed
tion (GPR) associations [22]). For each reaction, a to strict producibility constraints:
Boolean rule encodes how genes are related to the activity.
Genes that are required together are linked with an AND  S internal ⋅ ! = 0
relation while isofunctional genes are linked with an OR 
relation. The set of GPR associations yields the set of  S biomassprecursors ⋅ ! ≥ $
! ≤ ! ≤ !
potentially active reactions given the set of available  lb ,i i ub ,i
genes.
where Sinternal is the stoichiometric matrix without the bio-
The NETWORK component models the metabolic net- mass precursors, Sbiomass precursors the stoichiometric matrix
work using the constraint-based modeling framework [3]. restricted to the biomass precursors and $ a vector of small
This framework describes the distributions of reaction reals, taken as 10-3. Linear programming tools are used to
fluxes that are compatible with constraints that derive query for a flux distribution fulfilling this set of con-
from basic physical assumptions or specific biological straints. If a flux distribution could be found, the model
information. They are usually formulated as linear con- predicted growth, otherwise it predicted no growth.
straints, which allow to explore the fluxes solution space

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!"#$%&'()*'$!+,-,.&!"##$%!!&$' ())*&++,,,-./0123425)678-401+9:'";#'#<+"+$'

In order to assess quantitative growth defects, Flux Bal- Growth phenotyping of the mutant strains
ance Analyses (FBA) were performed [3]. A biomass reac- Detailed experimental protocol for the growth phenotyp-
tion was introduced in the model to quantitatively ing of the mutant strains is described in [8]. Basically,
account for the respective contributions of constituent using 96-wells plates, the mutant strains were grown in
metabolites in the biomass composition (see Additional liquid MA minimal media (31 mM Na2HPO4, 25 mM
file 4). Using linear programming, the flux through this KH2PO4, 18 mM NH4Cl, 41 !M nitrilotriacetic acid, 2
reaction was maximized under all constraints, represent- mM MgSO4, 0.45 mM CaCl2, 3 !M FeCl3, 1 !M MnCl2,
ing the maximal growth rate achievable by the model. 1 !M ZnCl2, 0.3 !M (CrCl3, H3BO3, CoCl2, CuCl2,
Energetic parameters, including growth associated (GAM) NiCl2, Na2NoO4, Na2SeO3)) supplemented with 25
and non growth associated (NGAM) maintenance fluxes, mM of carbon sources. Succinate/urea medium was com-
were assumed to be similar to those of E. coli model [22]. posed of MA minimal medium without NH4Cl supple-
We chose to set NGAM to a constant ATP hydrolysis flux mented with 25 mM of succinate and 20 mM of urea.
of 10 mmol/h/gDW and GAM to a value of 40 mmol/ Absorbance at 600 nm of 24 h cultures was measured to
gDW of ATP in the growth reaction. In all simulations, monitor growth. Experiments were performed in dupli-
upper bounds of nutrient exchange fluxes were set to 10 cates. Measures with discrepant repeats or with weak pre-
mmol/h/gDW for carbon sources and 100 mmol/h/gDW cultures were discarded from the analyses. Repeats were
for other nutrients (see Additional file 2). filtered according to the following rule: a measure was
kept if either (1) both repeats were under the growth
Model simulations were performed within FluxAnalyzer threshold or (2) the relative difference between the
[61] and MATLAB® (The MathWorks Inc., Natick, MA) repeats was lower than 50% of the highest value. A thresh-
using the YALMIP optimization toolbox [62] and MOSEK old of a tenth of the mean absorbance was chosen to clas-
optimization solver (Mosek ApS, Copenhagen, Den- sify the mutants in growth or no growth categories. This
mark). threshold was chosen particularly low in order to consider
as essential only mutants with marked fitness defect.
Availability of metabolic model
The metabolic model is available both as Excel and SBML Authors' contributions
files (see Additional files 2 and 5) and will be submitted MD reconstructed the initial model, performed model
to the Biomodels.net repository [63]. Whenever possible, predictions, interpreted inconsistent phenotypes, applied
cross-references for the model reactions and species to model corrections, and wrote the manuscript. FLF recon-
AcinetoCyc [20], KEGG [64] and BiGG [65] databases are structed the initial model and developed the NemoStudio
provided. software tool. VDB participated in the experimental phe-
notyping and the interpretation of inconsistent pheno-
The model is accessible through the NemoStudio web types. AK and DV participated in the initial reconstruction
interface [20]. NemoStudio supports growth phenotype and the interpretation of inconsistent phenotypes. CC
predictions, and comparison to experimental results, as and SS developed the NemoStudio software tool. MS par-
well as browsing of model pathways through an interface ticipated in the experimental phenotyping and the inter-
with AcinetoCyc [20]. pretation of inconsistent phenotypes. JW participated in
the design and the coordination of the study. VS con-
Growth phenotyping of the wild-type strain ceived of the study, participated in its design and coordi-
Growth phenotyping experiments of A. baylyi were per- nation, and contributed to writing the manuscript. All
formed by Biolog, Inc. (Hayward, CA) following experi- authors read and approved the final manuscript.
mental procedures described in [66]. Basically, growth of
wild-type strains of A. baylyi was monitored in PM1 and Additional material
PM2 microplates containing a defined minimal medium
supplemented with 190 distinct carbon sources. The
Biolog quantitative growth measures were discretized to Additional file 1
Sensitivity on GAM and NGAM parameters of growth rate predic-
yield growth/no-growth qualitative phenotypes by choos- tions. This file contains two plots showing the effect of changing growth
ing thresholds based on the negative growth control associated (GAM) and non growth associated (NGAM) maintenance
measures and previously known growth phenotypes for A. parameters on quantitative growth rate predictions with iAbaylyiv4.
baylyi. Growth phenotypes that were inconsistent with Click here for file
model predictions were checked by examining results [http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752-
0509-2-85-S1.pdf]
from previous work [15], or retesting them individually.
Detailed results of Biolog experiments are provided in
Additional file 3.

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/01.)$23*4)5$2,($6,5$7+(1(+,2$0350,')'8
!"#$%&'()*'$!+,-,.&!"##$%!!&$' ())*&++,,,-./0123425)678-401+9:'";#'#<+"+$'

7. Liberati NT, Urbach JM, Miyata S, Lee DG, Drenkard E, Wu G, Vil-

Additional file 2 lanueva J, Wei T, Ausubel FM: An ordered, nonredundant library
of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon inser-
Genome-scale metabolic models. This file contains the description of all tion mutants. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103:2833-2838.
model versions as well as information on reactions, species, biomass pre- 8. de Berardinis V, Vallenet D, Castelli V, Besnard M, Pinet A, Cruaud C,
cursors, modeled environments and literature references used for the Samair S, Lechaplais C, Gyapay G, Richez C, et al.: A complete col-
model reconstruction. lection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter
Click here for file baylyi ADP1. Mol Syst Biol 2008, 4:174.
9. Gerdes S, Edwards R, Kubal M, Fonstein M, Stevens R, Osterman A:
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10. Papp B, Pál C, Hurst LD: Metabolic network analysis of the
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Experimental data and model refinements. This file gathers the experi- 11. Duarte NC, Herrgard MJ, Palsson BO: Reconstruction and valida-
mental results used for model refinements, the model predictions, and the tion of Saccharomyces cerevisiae iND750, a fully compart-
corrections/interpretations associated to the inconsistent predictions. mentalized genome-scale metabolic model. Genome Res 2004,
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Broadbelt LJ, Hatzimanikatis V, Palsson BØ: A genome-scale met-
0509-2-85-S3.xls]
abolic reconstruction for Escherichia coli K-12 MG1655 that
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Additional file 4 Mol Syst Biol 2007, 3:121.
Determination of biomass composition of A. baylyi. This file gathers all 13. Bergogne-Bérézin E, Towner KJ: Acinetobacter spp. as nosoco-
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abolic model. 14. Metzgar D, Bacher JM, Pezo V, Reader J, Döring V, Schimmel P, Mar-
Click here for file lière P, de Crécy-Lagard V: Acinetobacter sp. ADP1: an ideal
[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752- model organism for genetic analysis and genome engineer-
0509-2-85-S4.xls] ing. Nucleic Acids Res 2004, 32:5780-5790.
15. Vaneechoutte M, Young DM, Ornston LN, Baere TD, Nemec A, Rei-
jden TVD, Carr E, Tjernberg I, Dijkshoorn L: Naturally transform-
Additional file 5 able Acinetobacter sp. strain ADP1 belongs to the newly
Genome-scale metabolic model in SBML format. This file contains the described species Acinetobacter baylyi. Appl Environ Microbiol
latest model iAbaylyiv4 in SBML format http://www.sbml.org. 2006, 72:932-936.
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18. Abdel-El-Haleem D: Acinetobacter: environmental and bio-
Acknowledgements technological applications. Afr J Biotechnol 2003, 2:71-74.
We would like to thank Pierre-Yves Bourguignon for comments and 19. Barbe V, Vallenet D, Fonknechten N, Kreimeyer A, Oztas S, Labarre
L, Cruveiller S, Robert C, Duprat S, Wincker P, et al.: Unique fea-
insightful discussions on this work. We are also grateful to Georges Cohen, tures revealed by the genome sequence of Acinetobacter sp.
Cécile Fischer, Alain Perret, and Agnès Pinet for their help on the fine ADP1, a versatile and naturally transformation competent
points of A. baylyi biochemistry. We wish to thank the reviewers for their bacterium. Nucleic Acids Res 2004, 32:5766-5779.
help in improving the manuscript. 20. A. baylyi NemoStudio: Acinetobacter baylyi ADP1 model
website [http://www.genoscope.cns.fr/nemostudio-platform/]
21. Karp PD, Paley S, Romero P: The Pathway Tools software. Bioin-
We are grateful for the support of the European Networks of Excellence formatics 2002, 18(Suppl 1):S225-232.
BIOSAPIENS (contract LSHG-CT-2003-503265) and ENFIN (contract 22. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO: An expanded genome-
LSHG-CT-2005-518254). scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR).
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/01.)$23*4)5$2,($6,5$7+(1(+,2$0350,')'8
!"#$%&'()*'$!+,-,.&!"##$%!!&$' ())*&++,,,-./0123425)678-401+9:'";#'#<+"+$'

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46. Jacobs MA, Alwood A, Thaipisuttikul I, Spencer D, Haugen E, Ernst S, disseminating the results of biomedical researc h in our lifetime."
Will O, Kaul R, Raymond C, Levy R, et al.: Comprehensive trans-
poson mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Sir Paul Nurse, Cancer Research UK
Acad Sci USA 2003, 100:14339-14344. Your research papers will be:
47. Oberhardt MA, Puchalka J, Fryer KE, Santos VAPMD, Papin JA:
Genome-scale metabolic network analysis of the opportun- available free of charge to the entire biomedical community
istic pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol peer reviewed and published immediately upon acceptance
2008, 190:2790-2803.
48. Reed JL, Patel TR, Chen KH, Joyce AR, Applebee MK, Herring CD, cited in PubMed and archived on PubMed Central
Bui OT, Knight EM, Fong SS, Palsson BO: Systems approach to yours — you keep the copyright
refining genome annotation. Proc Natl Acad Sci USA 2006,
103:17480-17484. Submit your manuscript here: BioMedcentral
http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp

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/01.)$23*4)5$2,($6,5$7+(1(+,2$0350,')'8
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

9 Synthèse
9.1 Le modèle confronte efficacement données
phénotypiques et connaissance du métabolisme
Comme soulevé dans l’introduction de cette thèse, l’interprétation à l’échelle
moléculaire des phénotypes de croissance d’un organisme nécessite de prendre en
compte une large variété de processus biologiques. L’utilisation d’un modèle
métabolique global permet d’orienter cette interprétation du point de vue du
métabolisme. En effet, le fonctionnement de l’ensemble des processus métaboliques y
est explicitement modélisé et leur lien à la croissance est pris en compte à l’aide d’une
réaction de biomasse ou d’une liste de métabolites précurseurs essentiels à la
croissance. La définition de ces dernières regroupe en quelque sorte l’action de tous
les autres processus biologiques non modélisés contribuant à la croissance et permet
effectivement de relier l’action du métabolisme aux phénotypes. En d’autres termes,
l’utilisation conjointe d’un modèle (mécaniste) du métabolisme et d’une réaction de
biomasse permet d’étudier isolément le rôle du métabolisme dans l’établissement des
phénotypes de croissance.

Le modèle tient compte explicitement de plusieurs composantes du métabolisme :

principalement (1) des voies de conversions métaboliques, menant des nutriments aux
précurseurs essentiels, (2) des voies de régénération des cofacteurs énergétiques, et
(3) des associations entre gènes et réactions, représentant la fonction biochimique des
enzymes. Leurs contributions aux phénotypes sont ainsi directement prises en compte
dans le modèle. En particulier, l’effet sur les phénotypes d’un changement
d’environnement de croissance62 ou de la délétion d’un gène de fonction métabolique
– l’objet des travaux expérimentaux utilisés ici – peuvent être prédit et expliqué par le
modèle.

62
Dans l’hypothèse où la liste des précurseurs essentiels de biomasse ne change pas
avec l’environnement. Cette hypothèse, relativement correcte pour des
environnements proches (p. ex. les différents milieux minimaux utilisés ici), peut
devenir complètement fausse lorsque les environnements exigent des adaptations
physiologiques différentes de la cellule. Nous en discuterons plus en détail dans la
section sur les limites de l’approche (section 9.4).

131
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Le modèle étant construit à partir de la connaissance actuelle du métabolisme, il

prédit les phénotypes attendus d’après cette connaissance. Leur comparaison aux
phénotypes observés expérimentalement permet alors de confronter indirectement
cette connaissance locale aux observations phénotypiques et d’identifier ainsi des
incohérences potentielles entre les deux échelles. Alors que les phénotypes cohérents
corroborent d’une certaine manière la connaissance du métabolisme, les phénotypes
incohérents y pointent potentiellement des erreurs ou des lacunes. Ils constituent de ce
fait un point de départ pour des investigations ultérieures qui permettront de
compléter la connaissance du métabolisme. Ce raisonnement peut être effectué
« manuellement » pour interpréter les phénotypes ; l’article présentant la banque de
mutants d’A. baylyi illustre d’ailleurs ce raisonnement pour quelques voies
métaboliques précises : biosynthèse de la méthionine, du pantothénate et de
l’ubiquinone (de Berardinis et al. 2008). Cependant, l’utilisation du modèle permet de
l’automatiser et de confronter ainsi systématiquement tous les phénotypes observés
aux phénotypes attendus. De cette manière, tous les phénotypes observés sont évalués
en regard du fonctionnement attendu du métabolisme et les phénotypes incohérents
sont directement détectés. Avec plus de 4500 phénotypes de croissance63 à examiner
dans le cas d’A. baylyi, le gain apporté par la prédiction automatique des phénotypes
attendus est notable.

Le travail réalisé sur A. baylyi nous a montré que les données phénotypiques
complètent utilement celles utilisées pour reconstruire le modèle métabolique initial
(annotation du génome et connaissance initiale de quelques voies métaboliques). Ce
constat s’applique aussi bien aux phénotypes de croissance de la souche sauvage sur
les nombreux environnements Biolog – qui ont contribué à compléter la connaissance
des capacités de transport et de catabolisme – qu’aux phénotypes de mutants – qui ont
participé à évaluer le fonctionnement des voies métaboliques. Une partie significative
des annotations et des voies métaboliques ont en effet été élucidées par analogie avec
celles des organismes modèles, principalement E. coli. Il est donc probable qu’une
partie des activités biochimiques spécifiques à A. baylyi n’aient pas été détectées et
demeure inconnue. Les phénotypes de croissance apportent justement des données
63
190 phénotypes Biolog de la souche sauvage (étape 1 de l’article) + 767 phénotypes
de croissance de mutants sur succinate (étape 2) + 8 milieux $ 455 mutants = 3640
phénotypes de croissance de mutants sur les 8 milieux minimaux (étape 3).

132
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

expérimentales propres à A. baylyi, dont l’exploitation est à même d’identifier des

incohérences dans cette reconstruction et de guider les corrections et la recherche
d’activités propres à A. baylyi. De plus, comme évoqué dans l’article, les phénotypes
ont également permis de corroborer la fonction métabolique de certains gènes ayant
un indice de confiance moyen pour l’annotation.

9.2 Cadre formel d’interprétation des incohérences

Lors de l’étude des phénotypes d’A. baylyi, nous avons également montré que le
modèle pouvait, en plus d’identifier les phénotypes incohérents, contribuer à
rechercher la cause du désaccord. Nous avons pour cela décomposé le modèle en trois
composantes représentant chacune des processus biologiques distincts (voir Figure 2A
de l’article) :

- GPR, comprenant les règles booléennes d’associations entre gènes et

réactions ;
- RESEAU (NETWORK dans l’article), comprenant le réseau de réactions
représenté dans le formalisme de la modélisation à base de contrainte ;
- BIOMASSE (BIOMASS dans l’article), comprenant les besoins essentiels
de la cellule en précurseurs de biomasse.

Les processus biologiques modélisés dans ces composantes participent tous à la

prédiction des phénotypes et peuvent être sources d’incohérence. Leur distinction
formelle en trois composantes permet alors de les considérer indépendamment les uns
des autres afin d’analyser leur rôle dans la prédiction du phénotype de croissance
incohérent.

Au sein de chaque composante, le nombre de types de corrections envisageables à

partir d’un phénotype incohérent est limité. Nous en avons regroupé les principaux
dans le Tableau 15.

133
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Prédiction : croissance Prédiction : non croissance

Observation : non croissance Observation : croissance
GPR - une isoenzyme du gène délété - il existe une isoenzyme au
n’est pas fonctionnelle gène délété
- l’isoenzyme supposée du - le gène délété code pour une
gène délété est en réalité sous-unité non-essentielle
requise simultanément (les d’un complexe enzymatique
protéines forment un - la réaction associée au gène
complexes au lieu de se délété peut s’effectuer
remplacer) spontanément
- le gène délété possède un rôle
essentiel supplémentaire
RESEAU - une voie métabolique n’est - il existe une voie
pas fonctionnelle ou n’existe métabolique supplémentaire
pas (ou alternative à la voie
inactivée par la délétion dans
le cas d’un mutant)
BIOMASSE - un précurseur essentiel n’a - un précurseur pris en compte
pas été pris en compte n’est en réalité pas essentiel
Tableau 15. Types de corrections envisageables selon la composante du modèle et la
nature de l’incohérence. Ces corrections ne sont bien entendu pas mutuellement
exclusives, certaines incohérences pouvant être le fait d’erreurs dans des composantes
différentes.

Comme présenté dans l’article, nous avons appliqué ce cadre d’interprétation au

modèle d’A. baylyi pour rechercher des corrections à ses phénotypes de croissance
incohérents. Nous avons systématiquement examiné chacune des incohérences selon
ce schéma et recherché pour chaque correction envisagée des indices ou des preuves
pouvant la confirmer ou la rejeter. Au total, sur les 124 phénotypes de mutants
incohérents, 56 furent corrigés selon ce cadre d’interprétation, concernant pour 34
d’entre elles la composante GPR, pour 12 la composante RESEAU et pour 10 la
composante BIOMASSE (voir le Tableau 3 et la Figure 8 de l’article). Des
informations supplémentaires sur toutes les incohérences examinées et les corrections
retenues sont disponibles dans un fichier Excel à l’adresse :
http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1752-0509-2-85-s3.xls .

Ce cadre d’interprétation ne prétend naturellement pas tenir compte de toutes les

causes possibles d’incohérence de phénotypes, un grand nombre d’entre elles n’étant
pas modélisables. Nous discuterons d’ailleurs plus en détail de ce sujet dans les deux
sections suivantes (9.3 et 9.4). Cependant, bien que très simple, il a le mérite
d’organiser l’investigation des incohérences de phénotype d’origine métabolique.
Comparé aux catégories d’interprétations précédemment proposées par Duarte et al

134
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

(2004), ce cadre se limite aux seules causes d’incohérences pouvant être prises en
compte dans le modèle mais explicite plus avant les corrections réalisables. De plus,
et surtout, il ouvre la voie à une automatisation de la proposition de corrections. En
effet, au sein de chaque composante, les types de corrections sont bien définis et
déterminés par le sens de l’incohérence. Il est de ce fait envisageable de développer
des méthodes proposant de manière systématique des corrections aux composantes du
modèle pour les incohérences identifiées. S’agissant de la composante BIOMASSE,
Imielinski et al (2005) ont par exemple élaboré des analyses déterminant les
métabolites les plus à même d’être essentiels pour expliquer les essentialités de gènes
observées. Pour notre part, nous introduirons dans la dernière partie de cette thèse une
méthode proposant les corrections d’associations GPR compatibles avec les
phénotypes observés. La recherche automatique de corrections dans la composante
RESEAU demeure quant à elle, encore plus que pour les autres composantes, un sujet
ouvert. Nous donnerons au lecteur des références à des travaux récents dans ce
domaine dans la conclusion du manuscrit.

9.3 Exploitation des incohérences non corrigées

Un peu plus de la moitié (68/124) des incohérences détectées sur les phénotypes
de mutants d’A. baylyi n’ont pas donné lieu à des corrections du modèle. Ces
incohérences se répartissent en deux grandes catégories.

Une première partie d’entre elles est constituée d’incohérences dont la cause est
déterminée mais qui ne peuvent être corrigées dans le modèle. Les cas causés par des
erreurs expérimentales mis à part64, ces incohérences impliquent généralement des
processus biologiques qui ne sont pas modélisés, au premier rang desquels se trouve
la régulation. Nous évoquerons ces cas de figures, qui sont associés aux limites du
modèle, dans la section suivante, certains d’entre eux pouvant être potentiellement
pris en compte en étendant le cadre de modélisation.

La seconde partie de ces incohérences regroupe celles pour lesquelles la cause

n’est pas interprétable simplement. Nous avons rencontré 62 incohérences de ce type

64
Le caractère haut débit et massivement parallèle des expériences de phénotypage
rend probable l’occurrence d’erreur de mesure, malgré le soin apporté à leur
réalisation.

135
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

pour A. baylyi ; pour 32 d’entre elles, nous avons pu avancer des hypothèses
d’explication, laissant 30 incohérences sans aucune interprétation. Ces cas
d’incohérence appellent tous des investigations ultérieures afin de les élucider,
pouvant potentiellement mener à des résultats intéressants. Parmi les incohérences de
ce type que nous avons détectées se retrouvent notamment toutes celles relevées dans
l’analyse « manuelle » de la banque de mutant (de Berardinis et al. 2008). Pour ces
dernières, de Berardinis et al (2008) ont proposé des hypothèses d’interprétation
nécessitant des recherches supplémentaires pour les valider : principalement la
recherche de voies ou d’enzymes alternatives (cas des gènes panD, pdxB, ubiC
mentionnés dans cet article) et la démonstration de la non occurrence d’une voie
alternative (cas des gènes pyrC, pyrC2, metZ mentionnés dans cet article). Nous avons
répertorié dans le fichier Excel mentionné ci-dessus l’ensemble des hypothèses que
nous avons formulées pour les incohérences non corrigées. Une partie d’entre elles
font d’ailleurs l’objet de recherches dédiées au sein du laboratoire Thesaurus.

La recherche d’une interprétation à une incohérence est souvent plus évidente

dans le cas d’un phénotype létal non prédit. En effet, puisque le modèle prédit la
croissance de l’organisme, il propose une distribution de flux métaboliques assurant la
synthèse tous les précurseurs de biomasse. L’examen de cette distribution révèle ainsi
les voies alternatives employées par le modèle pour assurer la croissance ;
l’interprétation de l’incohérence consiste alors souvent à rechercher des raisons pour
lesquelles ces voies ne seraient en réalité pas actives : existence d’une régulation
inhibitrice, enzyme alternative non fonctionnelle par exemple. À l’inverse,
l’interprétation d’un phénotype viable non prédit ne bénéficie pas d’une telle
assistance du modèle. Quand bien même celui-ci contribue à identifier les métabolites
dont la synthèse n’est plus possible, la recherche de nouvelles voies ou d’enzymes
alternatives à même de remplacer la fonction inactivée reste un problème ouvert.

En résumé, cette liste des incohérences non corrigées représente l’ensemble des
discordances détectées par le modèle entre les phénotypes observés et le réseau
métabolique connu. Elle invite donc à des investigations ultérieures afin d’élucider le
comportement métabolique réel d’A. baylyi expliquant les phénotypes observés et de
compléter la connaissance de son métabolisme.

136
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

9.4 Limites
9.4.1 Interprétation des phénotypes de croissance faible

L’interprétation de phénotypes de croissance à l’aide d’un modèle métabolique est

bien adaptée lorsque les phénotypes observés sont nets, c’est-à-dire distinguables sans
ambiguïté entre le cas létal et le cas viable. Dans la majorité des cas, la létalité nette
provoquée par la délétion d’un gène métabolique correspond à l’inactivation complète
d’une fonction métabolique, un effet qui est directement pris en compte par le modèle.

Des difficultés apparaissent pour les cas limites, lorsqu’on observe la croissance
de la souche mutée, mais à un rythme significativement plus faible que celui de la
souche sauvage. Dans notre étude, nous avons appliqué un seuil de croissance
relativement bas pour effectuer la distinction qualitative entre mutant viable et non
viable (nous l’avons fixé à 1/10 de la croissance de la souche sauvage, voir Matériels
et méthodes de l’article). De ce fait, nous avons ainsi considéré comme létales
uniquement les délétions provoquant une chute très marquée de la capacité
reproductive, d’autant plus que la croissance des mutants fut évaluée de manière
clonale et non pas en compétition au sein d’une population hétérogène (voir chapitre
introductif, section 2.2.1). Nous avons estimé que cette définition du statut létal
correspondait au plus proche à la prédiction qualitative de létalité obtenue par le test
de productibilité des précurseurs de biomasse (« metabolite producibility », voir
Matériels et méthodes de l’article). Cependant, le choix de ce seuil place
indistinctement dans la catégorie viable tous les mutants présentant une croissance,
même très réduite.

Afin d’aider l’interprétation des cas incohérents pour lesquels la croissance

observée est faible, nous avons également déterminé pour chacun des mutants le taux
de croissance prédit par la méthode FBA. Cette méthode, qui tient compte des besoins
énergétiques de la cellule (voir sections 6.2.8 et 7.2), fournit un résultat quantitatif
permettant dans certains cas d’interpréter des diminutions du taux de croissance.

137
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

La prédiction de croissance par FBA étant strictement plus contraignante que celle
par productibilité des précurseurs65, tous les phénotypes létaux prédits par test de
productibilité le sont également par FBA (taux de croissance nul). La réciproque n’est
en revanche pas nécessairement vraie : même si la très grande majorité des
phénotypes prédits viables par productibilité des précurseurs le sont aussi par FBA,
certains cas présentent des taux de croissance très faibles voire nuls par FBA,
contredisant la prédiction initiale (voir Figure 36).

Figure 36. Taux de croissance relatifs à la souche sauvage prédits par Flux Balance
Analysis (FBA) pour les mutants prédits viables par analyse de la productibilité des
précurseurs de biomasse. Les prédictions ont été effectuées sur milieu minimum avec le
succinate comme source de carbone.

Douze mutants de l’étape 2 de raffinement (essentialités sur succinate) sont ainsi

prédit viable par test de productibilité mais présentent des taux de croissance prédits
par FBA nuls (voir Figure 36). Dix d’entre eux correspondent à des incohérences.

Parmi eux, nous retrouvons neuf gènes essentiels à l’activité de l’ATP synthase
(atpA, atpB, atpC, atpD, atpE, atpF, atpG, atpH, atpI). L’inactivation de l’ATP
synthase n’est en effet pas prédite comme étant létale par le test de productibilité des

65
La réaction de biomasse utilisée par la méthode FBA contient tous les précurseurs
de biomasse utilisés par le méthode de test de productibilité.

138
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

précurseurs, ce qui est contredit par leur létalité observée expérimentalement. Pour
ces mutants, le modèle réussit à produire tous les précurseurs de biomasse en utilisant
l’énergie produite uniquement par phosphorylation au niveau du substrat. Cependant,
ce processus ne peut en réalité pas subvenir à tous les besoins énergétiques de la
cellule : la méthode FBA, qui tient compte de ces besoins de manière plus complète
grâce à la réaction de biomasse, prédit effectivement un taux de croissance nul pour
ces mutants.

Le mutant du gène rpiA (ribose-5-phosphate épimerase) correspond au dernier

phénotype incohérent prédit viable par productibilité des précurseurs et létal par FBA.
La différence de prédiction n’est pas due ici à la prise en compte des besoins
énergétiques mais à la contrainte de consommation des précurseurs en quantité
stœchiométriques imposée par la réaction de biomasse utilisée par le FBA (voir
Figure 37).

Figure 37. Interprétation de la prédiction du phénotype de croissance du mutant rpiA.

L’inactivation du gène rpiA contraint le ribose-5-phosphate et le ribulose-5-phosphate à être
produits en quantité stœchiométriques. Il en est par conséquent de même pour les composés
situés à leur aval, notamment des précurseurs de biomasse nucléotides et
lipopolysaccharides. La présence d’une contrainte stœchiométrique dans la réaction de
biomasse entre ces précurseurs (non compatible avec celle provoqué par la délétion) rend
impossible toute croissance du mutant analysée par la méthode FBA. Le test de productibilité
des précurseurs ne tient en revanche pas compte de cette contrainte et prédit la croissance
du mutant.

La prise en compte des besoins énergétiques de la cellule et la contrainte de

consommation stœchiométrique des précurseurs sont les deux seules différences entre
ces deux méthodes. L’effet de ces différences sur les prédictions de phénotypes peut
tout aussi bien être favorable que défavorable. Comme illustré ci-dessus, prendre en

139
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

compte les besoins énergétiques de la cellule peut permettre de prédire la létalité de

perturbations des processus énergétiques. Cependant, l’effet d’une telle perturbation
dépend également de la capacité de la cellule à s’adapter au manque d’énergie, un
paramètre qui n’est pas considéré dans la méthode de prédiction pour laquelle les
besoins en énergie restent identique à la souche sauvage. De même, appliquer la
contrainte stœchiométrique sur les précurseurs de biomasse peut être aussi bien
bénéfique – létalité probable lorsque les déséquilibres de productions de précurseurs
sont très marqués – que néfaste – viabilité probable pour de petits déséquilibres. Les
deux dernières prédictions divergentes entre FBA et test de productibilité
correspondent d’ailleurs à ce dernier cas.

Nous avons choisi de conserver le test de productibilité comme méthode

principale de prédiction des phénotypes à la fois pour ces raisons et pour conserver
une indépendance entre les précurseurs de biomasse. Cette indépendance facilite en
effet les raisonnements de correction de la composante biomasse, dans laquelle seules
les présences ou absences des métabolites sont alors à déterminer.

9.4.2 Incohérences d’origine métabolique non prises en compte

Comme évoqué précédemment, une partie des incohérences ayant une cause de
nature métabolique ne peuvent être corrigées facilement dans le modèle car ce dernier
ne prend pas en compte le processus biologique impliqué. Nous en énumérerons les
cas significatifs ci-dessous.

La modélisation à base de contraintes ignore les concentrations de métabolites.

Cependant, la perturbation du réseau métabolique peut conduire ces dernières à varier
significativement, provoquant potentiellement une accumulation toxique de certains
métabolites (Duarte, Herrgard et al. 2004). La prise en compte de cet effet nécessite
d’inclure les concentrations métaboliques dans le modèle, ce qui exige alors d’utiliser
un cadre de modélisation plus détaillé qui ne peut généralement être mis en œuvre que
pour une partie du réseau métabolique global.

Une forte proportion des incohérences qui ne peuvent être corrigées dans les
modèles à base de contraintes sont liées à des effets de régulation. Dans un soucis de
simplification, ces modèles ignorent en effet complètement les processus contrôlant
l’activité des enzymes et supposent que ces dernières sont toutes présentes et actives

140
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

en permanence. En réalité, les phénomènes régulateurs contrôlent leurs transcriptions

et leurs activités (voir Introduction section 1.2.5) et il est probable que certaines voies
alternatives ne puissent suppléer une voie délétée car leurs enzymes ne sont pas
suffisamment produites ou sont inhibées. Nous avons par exemple rencontré pour A.
baylyi le cas de deux enzymes capables de synthétiser indépendamment le glutamate
mais ne pouvant se remplacer, chacune d’entre elles étant utilisée sur des plages
distinctes de concentrations externes en ions ammonium. Comme mentionné
précédemment (voir article de revue, section 3.2.1), les modèles à bases de contraintes
peuvent être étendu à l’aide de règles booléennes pour tenir compte des interactions
régulatrices agissant sur le métabolisme. Ce formalisme a d’ailleurs été employé avec
un certain succès pour interpréter et corriger des phénotypes de croissance incohérents
d’E. coli (Covert et al. 2004). Cependant, son utilisation nécessite de déterminer les
interactions régulatrices à l’œuvre dans l’organisme étudié, une tâche bien plus ardue
que la reconstruction du réseau métabolique car ces interactions sont le plus souvent
inconnues pour les organismes peu étudiés. L’investigation des phénotypes
incohérents peut néanmoins aider à détecter des inhibitions de voies métaboliques et
guider ainsi la recherche de ces régulations.

Enfin, l’utilisation d’une composition de biomasse fixe pour prédire la viabilité de

l’organisme constitue également une hypothèse restrictive. L’essentialité de certains
précurseurs de biomasse dépend en effet des conditions de croissance de l’organisme :
un composé non-essentiel dans un environnement peut devenir vital dans un autre.
Nous avons par exemple constaté pour A. baylyi que certains polysaccharides ne sont
pas nécessaires à sa croissance dans les milieux de laboratoire utilisés. Il est
néanmoins tout à fait possible que leur production devienne nécessaire dans un
environnement plus exigeant, notamment dans des conditions naturelles. Cette
hypothèse restrictive est difficile à dépasser car les processus qui rentrent en jeu pour
déterminer l’essentialité des précurseurs sont en majorité extérieurs au métabolisme et
donc non modélisables dans ce formalisme. Toute méthode capable d’analyser ces
processus et de prédire l’essentialité des précurseurs en fonction des conditions
extérieures permettrait de dépasser cette limite. À l’inverse, comme illustré dans les
travaux d’Imielinski et al (2005), l’étude des phénotypes de mutants peut également
aider à déterminer l’essentialité de ces précurseurs à partir de celle des gènes.

141
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

10 Extension de l’interface Web de prédiction à

d’autres organismes : CycSim
La disponibilité de modèles métaboliques et de phénotypes de croissance de
mutants pour un nombre croissant d’organismes nous a conduit à élargir la couverture
de l’interface NemoStudio. Nous avons ainsi dérivé de NemoStudio un nouvel outil,
CycSim, permettant de contenir les modèles, les bases de données BioCyc et les
phénotypes expérimentaux de plusieurs organismes. CycSim a fait l’objet d’une
« Application Note » récente dans Bioinformatics (Le Fèvre et al. 2009) et est
accessible à l’adresse : http://www.genoscope.cns.fr/cycsim . Les fonctionnalités de
cette nouvelle interface demeurent quasiment identiques à celles de NemoStudio. Ont
été introduites comme nouvelles fonctionnalités :

- des liens directs vers les cartes métaboliques de KEGG,

- l’export des modèles sous la forme de graphes à des fins de visualisation,
- la possibilité d’accéder informatiquement aux modèles à l’aide de services
Web,
- la sauvegarde des paramètres d’analyses pour une réutilisation ultérieure.

La version initiale de CycSim contient trois organismes, Acinetobacter baylyi,

Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae, basés respectivement sur les modèles
iAbaylyiv4, iAF1260 (Feist et al. 2007) et iND750 (Duarte, Herrgard et al. 2004) et
sur les bases de données métaboliques AcinetoCyc, EcoCyc (Keseler et al. 2009) et
YeastCyc (Christie et al. 2004). Les phénotypes expérimentaux de mutants sont
identiques à ceux de NemoStudio pour A. baylyi et proviennent (1) dans le cas d’E.
coli de résultats de phénotypages de la banque de mutant Keio (Baba et al. 2006;
Joyce et al. 2006) et de ceux contenus dans la base de données ASAP (Glasner et al.
2003) et (2) dans le cas de S. cerevisiae de deux études à grande échelle de
phénotypage sur 7 milieux distincts (Giaever et al. 2002; Steinmetz et al. 2002). Cet
ensemble de résultats expérimentaux totalise environs 20 000 phénotypes.

142
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 38. Interface de l’outil de prédiction de phénotypes de croissance CycSim. Code

couleur du tableau de résultats : vert, croissance ; rouge, non croissance ; gris, résultat non
disponible.

Mes contributions dans ce projet auront été de mettre au point les méthodes de
prédiction, d’adapter les modèles extérieurs à nos outils de manière à reproduire
correctement les résultats publiés avec ces modèles, de modéliser les environnements
de croissance utilisés dans les expériences, et d’effectuer l’interprétation qualitative
des phénotypes de croissances quantitatifs.

143
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

AUTOMATISATION DE L’INTERPRETATION DES

INCOHERENCES D’ORIGINE GENETIQUE

Bénéficiant de l’expérience des corrections appliquées au modèle d’A. baylyi,

nous avons entrepris de développer une méthode suggérant automatiquement des
corrections de la composante GPR des modèles : AutoGPR. Nous consacrerons cette
dernière partie sur nos résultats à cette méthode. Dans un premier temps, nous en
exposerons le principe et l’implémentation. Nous présenterons ensuite les
performances de cette méthode pour retrouver les corrections effectuées au modèle
d’A. baylyi et l’appliquerons à la résolution des incohérences de trois autres
organismes. Enfin, nous discuterons des perspectives d’améliorations et
d’applications d’AutoGPR ainsi que de son intégration au sein de stratégies globales
de correction des modèles.

11 La méthode AutoGPR
11.1 Principe
L’objectif d’AutoGPR consiste à déterminer automatiquement des modifications
aux relations GPR permettant de lever les incohérences de prédictions de phénotypes
de croissance. Pour ce faire, la méthode se base fondamentalement sur l’organisation
des modèles métaboliques en composantes – GPR, RESEAU et BIOMASSE (voir
section 9.2) – afin d’isoler et de manipuler les relations GPR indépendamment des
autres composantes du modèle. AutoGPR suppose ainsi les composantes RESEAU et
BIOMASSE fixes et correctes et recherche les corrections applicables à la

144
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

composante GPR résolvant les prédictions incohérentes de phénotypes sans altérer les
prédictions correctes. Cette hypothèse ne préjuge pas de l’existence de corrections
dans les composantes RESEAU et BIOMASSE : AutoGPR recherche les corrections
GPR compatibles avec une configuration donnée des composantes RESEAU et
BIOMASSE. Cette recherche peut être à nouveau effectuée pour toute modification
effectuée à ces dernières composantes. Nous discuterons d’ailleurs plus loin dans ce
chapitre (section 13.3.2) de la place de la méthode AutoGPR dans une stratégie plus
globale de correction des modèles.

Les trois composantes contribuent toutes à prédire les phénotypes de croissance de

mutants : la composante GPR prédit les réactions inactivées par la délétion du ou des
gènes ciblés tandis que les composantes RESEAU et BIOMASSE prédisent le
phénotype de croissance correspondant au réseau métabolique dont ces réactions ont
été inactivées (voir Figure 39A page 146). Ainsi, du point de vue de la composante
GPR, un ensemble de gènes est prédit essentiel si sa délétion inactive un ensemble de
réactions dont l’inactivation est prédite létale (par les composantes RESEAU et
BIOMASSE) et, inversement, un ensemble de gènes est prédit non-essentiel si sa
délétion inactive un ensemble de réactions dont l’inactivation est prédite viable.

Dans le cadre de la prédiction de phénotypes de croissance, les

phénotypes d’inactivations de réactions66 prédits par les composantes RESEAU et
BIOMASSE forment l’« interface » entre les GPR et ces deux composantes ; nous les
appellerons essentialité de réaction par homologie à essentialité de gène. AutoGPR
supposant les composantes RESEAU et BIOMASSE comme fixes, cette interface
l’est également. Ainsi, les essentialités prédites de réactions constituent, tout comme
les essentialités observées de gènes, des données extérieures au problème de
correction de la composante GPR (voir Figure 39). Toutefois, à la différence des
observations expérimentales, ces essentialités de réactions peuvent être connues
exhaustivement pour tout ensemble de réactions inactivées en effectuant les
prédictions à l’aide du modèle.

66
En termes plus rigoureux : les phénotypes de croissance prédits pour des modèles
dont des ensembles de réactions ont été inactivés.

145
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Nous avons vu précédemment que l’essentialité des gènes dépend de

l’environnement dans lequel les phénotypes de croissance ont été observés. Du point
de vue du modèle, l’effet de l’environnement est uniquement considéré par la
composante RESEAU qui prend en compte l’exploitation des substrats de
l’environnement. Les composantes GPR et BIOMASSE, quant à elle, demeurent
indépendantes de l’environnement extérieur67. Du point de vue de la composante
GPR, l’effet d’un changement d’environnement sur les prédictions de phénotypes est
ainsi directement pris en compte dans les essentialités de réactions prédites ; à chaque
environnement correspondent des essentialités de réactions spécifiques.

Figure 39. La composante GPR relie l’essentialité des gènes à l’essentialité des
réactions. A Les relations booléennes des GPRs combinées aux prédictions d’essentialités
des réactions prédisent les essentialités de gènes. Dans l’exemple présenté ici, la prédiction
pour le gène G3 est incohérente avec l’observation expérimentale de son essentialité. Les
essentialités de gènes observées et les essentialités de réactions prédites constituent des
données extérieures à la composante GPR. B Principe d’AutoGPR : générer l’ensemble
des relations booléennes respectant les associations prédéfinies entre gènes et réactions et
rendant compatibles les essentialités observées de gènes avec les essentialités prédites de
réactions.

Plutôt que de chercher à construire un ensemble de corrections-types à appliquer

aux GPR existantes (retirer une isozyme, transformer deux isozymes en un complexe,
etc.), un processus qui deviendrait rapidement complexe du fait de la composition

67
pour le cadre de modélisation retenu ici, ce qui n’est pas nécessairement toujours le
cas. S’agissant de la composante BIOMASSE, nous avons déjà discuté au chapitre
précédent de la pertinence d’utiliser une composition de biomasse dépendant de
l’environnement extérieur. D’autre part, des extensions des modèles à base de
contraintes pour tenir compte des interactions régulatrices introduisent des relations
gènes-réactions dépendant de l’environnement.

146
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

possible entre les règles ET et OU, nous avons choisi une approche de type « reverse
engineering » visant à construire les GPR à partir des essentialités. La méthode
AutoGPR consiste à générer toutes les relations GPR conservant les associations
gènes-réactions prédéfinies et rendant compatibles les essentialités prédites de
réactions avec les essentialités observées de gènes. Ainsi, sur l’exemple de la Figure
39B, AutoGPR génèrera l’ensemble des relations booléennes reliant G1, G2 et G3 à
R1, et G3 et G4 à R2, qui prédisent les essentialités observées de gènes à partir des
essentialités prédites de réactions.

Pour chaque réaction, la recherche de relation GPR s’effectue à partir d’un

ensemble défini de gènes, délimité par les associations prédéfinies gènes-réactions.
Cet ensemble est défini de manière à regrouper tous les gènes susceptibles de
participer à la catalyse de la réaction, et donc d’intervenir dans sa GPR. Leur sélection
nécessite d’exploiter toute information permettant de les associer à la réaction ; dans
la pratique, cette information est contenue dans leurs annotations et la sélection de ces
gènes peut être simplement effectué à partir de la GPR initiale de la réaction, qui a
elle-même été établie à partir des annotations. La recherche de relations GPR se limite
ainsi à cet ensemble prédéterminé de gènes ; les corrections effectuées par AutoGPR
n’impliquent de ce fait pas la recherche de nouveaux gènes à associer à la réaction
mais plutôt la recherche d’associations booléennes différentes entre gènes déjà
identifiés.

La contrainte de rendre compatibles les essentialités de gènes et de réactions à

l’aide des GPR peut s’exprimer à l’aide d’une notion d’impact de la manière
suivante :

- Une délétion de gène(s) est essentielle si et seulement si elle impacte (via

les GPR) un ensemble essentiel de réaction(s).
- Une délétion de gène(s) est non-essentielle si et seulement si elle impacte
un ensemble non-essentiel de réaction(s).

Ainsi, chaque essentialité observée de gène contraint les GPR à respecter un

comportement défini. En d’autres termes, chaque essentialité observée spécifie une
partie du comportement des GPR. AutoGPR prend en compte simultanément toutes

147
 Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

ces spécifications pour toutes les délétions sur tous les environnements et en déduit
l’ensemble des relations GPR compatibles.

Pour résumer, AutoGPR détermine l’ensemble des relations booléennes répondant

à ces spécifications et satisfaisant les hypothèses :

- l’ensemble des gènes pouvant être relié à chaque réaction est connu et
prédéterminé,
- les relations GPR sont identiques sur tous les environnements,
- les composantes RESEAU et BIOMASSE sont fixes et correctes.

Ces hypothèses permettent à AutoGPR de prendre en compte un grand nombre de

types de corrections, dont la recherche d’isoenzymes non fonctionnelles, de sous-
unités non-essentielles dans un complexe ou d’associations non identifiées de
protéines en complexes. Plus globalement, toute correction impliquant une
modification des règles booléennes entre gènes préalablement connus sera identifiée
par AutoGPR.

Afin d’expliciter le fonctionnement de la méthode, introduisons des notations

mathématiques. Soient :

- Env l’ensemble des environnements considérés,

- R l’ensemble des réactions du modèle, P(R) l’ensemble des sous-
ensembles de R,
- G l’ensemble des gènes du modèle, P(G) l’ensemble des sous-ensembles
de G.

Les essentialités observées de gènes et les essentialités prédites de réactions

peuvent être entièrement décrites par deux fonctions PhenoGene et PhenoReac :

PhenoGene : P(G) " Env # {0,1}

({g1,...,gn }, M ) ! 1 si la délétion de {g1,...,gn } est non essentielle sur M
0 si la délétion de {g1,...,gn } est essentielle sur M

PhenoReac : P(R) " Env # {0,1}

! ({r1,...,rn }, M ) ! 1 si la délétion de {r1,...,rn } est non essentielle sur M
0 si la délétion de {r1,...,rn } est essentielle sur M

!
148
 Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Nous définirons la fonction Support pour décrire les associations prédéfinies

entre gènes et réactions :

Support : R " P(G)

r ! { g1,...,gn }, l'ensemble des gènes pouvant être associés à r

Les relations entre gènes et réactions sont décrites par l’ensemble de leurs GPR,
! que nous noterons GPR, mais également, de manière équivalente, par une fonction
d’impact Impact qui détermine les réactions inactivées pour toute délétion de gènes
du modèle :

Ng r
GPR = {GPRr | r " R} avec GPRr : {0,1} " {0,1} la relation booléenne liant une
réaction r à ses Ngr gènes,

! Impact : P(G) ! " P(R)

{g1,...,gn } ! {r # R | r est inactivé par la délétion de {g1,...,gn }}

La connaissance de la fonction Impact est strictement équivalente à celle de

! GPR. En effet, GPR peut être défini à partir d’Impact :

Ng r
"r # R, "b # {0,1} GPRr (b) = 0 si r # Impact($ )
1 sinon
où " = {g # Support(r) tel que la valeur de g dans b est 0}

!
et inversement, Impact peut être définie à partir de GPR :
!
"# $ P(G) Impact(# ) = {r $ R | GPRr (br ) = 0}
Ng r
où br " {0,1} est défini par bri = 0 si le gène i de r est dans #
1 sinon
!

Les contraintes de compatibilité entre les essentialités de gènes et les essentialités

! réactions s’expriment désormais simplement par une relation entre les fonctions
de
PhenoReac, PhenoGene et Impact : les relations GPR représentées dans la fonction
Impact sont compatibles avec les essentialités si et seulement si

PhenoGene(", M ) = PhenoReac(Impact(" ), M )

!
149
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

pour tout couple d’environnement M et de délétion de gènes $ pour lequel on dispose

d’une observation d’essentialité. Il est à noter que ces observations d’essentialités sont
limitées par les résultats expérimentaux d’essentialité de gènes, étant donné que les
essentialités de réactions peuvent être connues exhaustivement à l’aide des
prédictions des composantes RESEAU et BIOMASSE.

AutoGPR se base sur cette relation et sur la connaissance des valeurs des
fonctions PhenoGene et PhenoReac pour déduire des informations sur la fonction
Impact avant de déterminer les relations GPR admissibles.

La méthode procède pour cela en deux étapes, une étape de spécification suivie
d’une étape d’implémentation (voir Figure 40).

Figure 40. La méthode AutoGPR. AutoGPR déduit l’ensemble des relations GPR
compatibles avec les essentialités observées de gènes, les essentialités prédites de
réactions et les associations prédéfinies entre gènes et réactions (lignes pointillées). La
première étape d’AutoGPR consiste à générer les scénarios d’impacts admissibles compte
tenu de ces contraintes : chaque ensemble essentiel de gènes doit impacter un ensemble
essentiel de réactions ; chaque ensemble non-essentiel de gènes doit impacter un ensemble
non-essentiel (potentiellement l’ensemble vide). De plus, les scénarios d’impacts doivent
respecter les associations prédéfinies gènes-réactions. Dans une seconde étape, AutoGPR
génère pour chaque scénario d’impacts toutes les relations GPR admissibles. Pour cela, il
déduit du scénario d’impacts des spécifications sur les relations booléennes avant de
déterminer les implémentations répondant à ces spécifications.

L’étape de spécification consiste à envisager l’ensemble des scénarios d’impacts

compatibles avec les essentialités et les associations prédéfinies gènes-réactions. Pour
cela, AutoGPR cherche à attribuer à chaque délétion de gène $ dont l’essentialité est
observée une valeur d’impact pR – un ensemble de réactions inactivées par la délétion
– qui :

150
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

- respecte les associations prédéfinies gènes-réactions

"r # R,$g # % tq g # Support(r)
- rende compatibles sur le milieu M considéré les essentialités des gènes
délétés et des réactions inactivées
!
PhenoReac( pR , M ) = PhenoGene(", M )

Un scénario d’impacts est constitué par de telles attributions réalisées pour

! des essentialités observées de gènes (voir Figure 40 1/) :
chacune

scénario = (("1, pR1),...,(" n , pRn )) pour les n essentialités observées.

Ces scénarios d’impacts étant guidés par les associations prédéfinies gènes-
!réactions, les valeurs d’impact se limiteront aux ensembles de réactions reliées par ces
associations aux gènes délétés. Il est donc suffisant de générer les scénarios d’impacts
à l’échelle d’une composante connexe du graphe constitué par les associations
prédéfinies et les essentialités de gènes observées pour prendre en compte l’ensemble
des cas possibles (voir Figure 41).

Figure 41. Composantes connexes formées par le graphe des associations prédéfinies
gènes-réactions et les groupes de gènes des essentialités observées.

Pour chaque composante connexe incluant une incohérence, AutoGPR génère

l’ensemble des scénarios d’impacts envisageables en raisonnant de la manière
suivante : si la délétion d’un ensemble de gènes est observée essentielle, celle-ci doit
impacter un ensemble essentiel de réactions ; si la délétion est observée non-
essentielle, elle doit impacter un ensemble non-essentiel de réactions, possiblement
l’ensemble vide. Sur l’exemple de la Figure 40 1/, le dernier scénario d’impact
envisagé par AutoGPR est le suivant :

151
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

- Impact({G1}) = %
- Impact({G2}) = %
- Impact({G3}) = {R1, R2}
- Impact({G4}) = {R2}

Si les expériences ont permis de déterminer les essentialités pour plusieurs

environnements, seuls les scénarios d’impacts compatibles simultanément avec les
essentialités des différents milieux sont alors conservés.

Pour chaque scénario d’impact envisageable, AutoGPR procède ensuite à l’étape

d’implémentation afin de construire les relations GPR compatibles avec les impacts
proposés. Chaque valeur d’impact du scénario d’impact est tout d’abord transformée
en spécification sur la relation GPR de chacune des réactions. La Figure 40 2/ détaille
par exemple les spécifications déduites sur la relation GPR de la réaction R1 à partir
du dernier scénario d’impact envisagé. Dans un second temps, AutoGPR détermine
l’ensemble des relations booléennes entre les gènes et la réaction satisfaisant ces
spécifications. Il est important de noter ici que les relations GPR sont des règles
booléennes impliquant uniquement les opérateurs ET et OU, la négation n’ayant pas
de sens dans une GPR. Cette contrainte, dont AutoGPR tient compte, restreint
l’ensemble des relations booléennes implémentables.

Dans certains cas, les contraintes d’essentialités peuvent se révéler incompatibles :

aucun scénario d’impact et aucune GPR ne peuvent être générés. AutoGPR en déduit
alors qu’une correction purement GPR utilisant les associations prédéfinies gènes-
réactions est impossible. Toute correction de l’incohérence dans le modèle implique
alors soit de modifier les association prédéfinies gènes-réactions soit de corriger les
composantes RESEAU et BIOMASSE pour modifier les essentialités prédites de
réactions. Deux cas de figures caractéristiques, dépendant de l’essentialité observée
des gènes, sont à l’origine de ces incompatibilités. La Figure 42 les présente sur deux
exemples.

152
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 42. Cas d’incohérences sans correction GPR déductible par AutoGPR. À
gauche, les ensembles essentiels de gènes ne peuvent impacter aucun ensemble essentiel
de réaction. La correction de l’incohérence nécessite de corriger les composantes RESEAU
ou BIOMASSE pour rendre R1 essentielle ou d’associer G1 et G2 à une nouvelle réaction
essentielle. À droite, la délétion non-essentielle de G1 ne peut impacter que l’ensemble vide,
impliquant de retirer tous les gènes de la GPR de R1, ce qui n’est pas admis par AutoGPR.
La correction de l’incohérence implique de corriger les composantes RESEAU et BIOMASSE
pour rendre R1 non-essentielle ou d’associer un autre gène à R1.

Pour résumer globalement le processus, pour chaque composante connexe

comportant au moins une incohérence, AutoGPR déduit l’ensemble des scénarios
d’impact envisageables à partir des essentialités de gènes observées puis, pour chaque
scénario, génère les différentes relations GPR compatibles. Cette méthode propose
ainsi de manière exhaustive toutes les configurations possibles de relations GPR
permettant de résoudre les incohérences dans la composante connexe considérée.

En pratique AutoGPR peut être utilisé à deux niveaux. Tout d’abord, il permet de
déterminer simplement si une correction GPR est envisageable ou non. Si tel n’est pas
le cas, le type d’incohérence permet alors de guider la recherche de correction en
dehors du périmètre d’AutoGPR (voir Figure 42). Si, en revanche, une correction
purement GPR existe, AutoGPR permet ensuite d’énumérer toutes les corrections
possibles. Le nombre de relations GPR pouvant devenir extrêmement élevé, des
méthodes de sélections des corrections les plus probables peuvent s’avérer
nécessaires.

Deux méthodes de sélection sont particulièrement utiles. La première consiste à

calculer une distance entre les GPR générées et les GPR initiales du modèle. Cette
distance, définie comme le nombre de valeurs distinctes dans les tables de vérité des
deux relations booléennes (voir section suivante), cherche à quantifier la différence de
« comportement » entre les deux GPR. Nous verrons plus loin dans la partie résultat
que les corrections de GPR retenues sont souvent les plus proches des GPR initiales.
La seconde méthode de sélection consiste à contraindre des réactions associées aux
mêmes gènes à avoir des GPR identiques. Cette simplification est justifiée pour les
réactions ayant des activités similaires et opérant sur des substrats très proches (c’est

153
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

par exemple le cas des différentes réactions spécifiques dérivées de réactions

génériques, voir section 6.2.5). Il est en effet probable dans ces cas que les mêmes
enzymes catalysent de manière similaire les différentes réactions. Cette simplification
s’applique aisément dans la méthode AutoGPR en remplaçant les réactions similaires
par une seule réaction d’essentialité identique à celle de l’ensemble des réactions
remplacées, réduisant ainsi le nombre de scénarios d’impacts à considérer (voir
Figure 43).

Figure 43. Réduction du nombre de corrections proposées par AutoGPR en imposant

des GPR identiques à des réactions. Les réactions R1 et R2 sont ici supposées être
catalysées de manière identiques par G1 et G2. Cette simplification consiste dans AutoGPR à
les remplacer par une seule réaction R1,2 lors de la génération des scénarios d’impacts.

11.2 Algorithmes
Cette section présente plus en détail les algorithmes utilisés par AutoGPR. Nous
l’avons divisé en deux parties. La première détaille les algorithmes développés pour
générer toutes les corrections GPR, selon le principe présenté ci-dessus. La seconde
introduit une simplification de la méthode permettant de tester plus rapidement la
simple existence de correction GPR.

11.2.1 Génération exhaustive des corrections GPR

La génération exhaustive des relations GPR procède comme nous l’avons vu en

deux étapes : une étape de spécification et une étape d’implémentation des GPR.
Nous présenterons ici les algorithmes utilisés pour réaliser ces étapes.

Calcul des ensembles minimaux de réactions essentielles

La méthode AutoGPR requiert la connaissance de l’essentialité de tous les sous-

ensembles de réactions du modèle. Bien que la prédiction d’essentialité d’un
ensemble de réactions soit calculable très rapidement (moins de 1/10 de seconde), un
calcul exhaustif pour tous les sous-ensembles de réactions se révèlerait beaucoup trop
coûteux, le nombre de sous-ensembles augmentant exponentiellement avec le nombre
de réactions.

154
 Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Deux propriétés du modèle et de la méthode AutoGPR permettent heureusement

d’en simplifier la tâche.

Tout d’abord, la recherche des scénarios d’impacts est limitée par les associations
prédéfinies gènes-réactions. Les ensembles de réactions pouvant être impactés par une
délétion de gènes sont donc contenus dans l’ensemble des réactions reliés à ces gènes
par les associations prédéfinies. Il est ainsi suffisant de prédire uniquement
l’essentialité des sous-ensembles de réactions contenus dans ces ensembles (voir
Figure 44). Cette propriété simplifie significativement le calcul des essentialités de
réactions, les gènes étant associés majoritairement à un nombre réduit de réactions
(voir partie résultat, section 12.1).

Figure 44. Calcul de l’essentialité des sous-ensembles de réactions. Il est suffisant de

limiter le calcul aux sous-ensembles des ensembles de réactions associés aux délétions de
gènes. Ces ensembles sont désignés par les accolades.

Ensuite, lorsque les phénotypes de croissance sont prédits par les méthodes FBA
ou de productibilité des métabolites, l’essentialité des ensembles de réactions possède
la caractéristique d’être monotone par l’inclusion. En effet, dans ces cas, tout
ensemble de réactions incluant un sous-ensemble essentiel sera prédit également
essentiel. Inversement, tout sous-ensemble d’un ensemble non-essentiel sera prédit
non-essentiel.

"pR1, pR 2 # P(R) pR1 $ pR 2 % PhenoReac( pR1 ) & PhenoReac( pR 2 )

Cette propriété découle de la nature de ces deux méthodes de prédictions : elles

!explorent les distributions de flux admissibles dans le modèle pour déterminer le flux
optimal de la réaction de biomasse (FBA) ou vérifier la productibilité de l’ensemble
des précurseurs. Un premier modèle ayant un ensemble de réactions inactivées plus
grand (par l’inclusion) qu’un deuxième disposera d’un ensemble de distributions de
flux contenu dans celui du deuxième. Si aucune distribution de flux du deuxième ne

155
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

peut permettre la croissance (flux dans la réaction de biomasse ou productibilité des

précurseurs), aucune distribution de flux ne le pourra non plus pour le premier.
Inversement, s’il existe une distribution de flux permettant la croissance dans le
premier, celle-ci existera également dans le second. Il est à noter que cette propriété
de monotonie n’est pas vraie pour toutes les méthodes de prédictions de phénotypes,
notamment ROOM ou MoMA (Motter et al. 2008).

Grâce à cette propriété de monotonie, il est suffisant de déterminer les sous-

ensembles essentiels minimaux par l’inclusion pour caractériser l’essentialité de tous
les sous-ensembles d’un ensemble de réactions. En nous appuyant sur ces propriétés,
nous avons utilisé l’algorithme suivant pour déterminer les ensembles essentiels
minimaux de réactions :

• Déterminer les ensembles de réactions associés aux délétions de gènes

(première propriété, voir Figure 44)
• Pour chacun de ces ensembles
o Pour chaque environnement
" Prédire l’essentialité de l’ensemble complet (inactivation
conjointe de toutes les réactions)
• Si non-essentiel : aucun de ses sous-ensembles ne sera
essentiel, passer à l’environnement suivant
• Si essentiel : il contient alors au moins un sous-
ensemble essentiel, poursuivre la recherche
" Pour chaque réaction de l’ensemble
• Prédire son essentialité
o Si essentielle : l’ajouter aux ensembles minimaux
essentiels pour l’environnement
" Prédire l’essentialité de l’ensemble des réactions
individuellement non-essentielles (inactivation conjointe des
réactions prédites non-essentielles)
• Si non-essentiel : il n’existe pas d’autres sous-ensembles
essentiels, passer à l’environnement suivant
• Si essentiel : il existe des sous-ensembles essentiels
impliquant ces réactions, poursuivre la recherche
" Générer tous les sous-ensembles de l’ensemble des réactions
individuellement non-essentielles, ordonnés par la taille
" Pour chacun de ces sous-ensembles
• S’il contient un ensemble minimal essentiel déjà identifié :
passer au sous-ensemble suivant
• Sinon : prédire son essentialité
o Si essentiel : l’ajouter aux ensembles minimaux
essentiels pour l’environnement

Le principe de cet algorithme est simple ; il consiste à parcourir tous les sous-
ensembles de réactions par ordre croissant de taille et à prédire leur essentialité s’ils

156
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

n’incluent pas de sous-ensemble déjà identifié comme essentiel. Il introduit cependant

deux tests qui permettent d’épargner de nombreuses recherches inutiles. Il détermine
d’une part si l’ensemble de réactions examiné inclut au moins un sous-ensemble
minimal essentiel (évitant une recherche inutile dans le cas contraire), et d’autre part
s’il existe des sous-ensembles essentiels dans les ensembles de réactions
individuellement non-essentielles (teste l’existence de « synthétiques létaux » parmi
les réactions, c’est à dire des inactivations multiples létales de réactions
individuellement non-essentielles). À l’échelle des ensembles de réactions considérés
ici, les réactions « synthétiques létales » se révèlent être relativement rares. Ce second
test accélère ainsi significativement la recherche des ensembles minimaux.

Pour des grands ensembles contenant des réactions synthétiques létales, cet
algorithme d’exploration systématique peut se révéler trop coûteux. Dans ces cas –
que nous avons en pratique très rarement rencontrés pour AutoGPR – des méthodes
plus complexes, développées pour déterminer les ensembles essentiels minimaux de
gènes, peuvent être employées (Klamt & Gilles 2004; Deutscher et al. 2006; Behre et
al. 2007; Imielinski & Belta 2008; Deutscher et al. 2008) (voir également une revue
rapide sur ces méthodes en conclusion, section 15).

Génération des scénarios d’impact

Comme évoqué ci-dessus, l’étape de spécification consiste à déterminer

exhaustivement tous les scénarios d’impacts qui soient compatibles avec les
essentialités et les associations prédéfinies gènes-réactions. Étant donné la nature de
ce problème, nous avons choisi d’employer une méthode de programmation logique,
implémentée en langage Prolog68. La programmation logique se révèle en effet être
particulièrement adaptée d’une part à la manipulation d’ensembles et de sous-
ensembles d’objets et surtout d’autre part à la recherche par déductions logiques de
solutions répondant à des contraintes imposées.

68
La méthode a été implémentée sous la forme d’un programme Sicstus Prolog
http://www.sics.se/sicstus/ .

157
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Le programme Prolog s’appuie sur un ensemble de faits d’entrée définissant :

- Les essentialités observées de gènes

- Les ensembles essentiels minimaux de réactions calculés selon
l’algorithme précédent
- Les associations prédéfinies gènes-réactions.

Il définit également des règles permettant d’exprimer la compatibilité d’un impact.

Un impact ($, pR) est considéré compatible si les conditions suivantes sont remplies :

- PR doit être relié à $ par les associations prédéfinies gènes-réactions

- Si $ est essentiel, alors pR doit inclure un ensemble essentiel minimal de
réactions.
Si $ est non-essentiel, alors pR ne doit pas inclure d’ensemble essentiel
minimal de réactions.

En exploitant conjointement les faits d’entrée et ces règles, le programme Prolog

est capable de déduire l’ensemble des impacts compatibles et, à l’échelle d’une
composante connexe, de générer les scénarios d’impacts envisageables.

Ces règles définissent la compatibilité des impacts pour un environnement donné.

Afin de considérer les contraintes de compatibilité posées par tous les
environnements, le programme sélectionne uniquement les scénarios d’impacts
valables sur tous les environnements selon le pseudocode suivant :

• Pour chaque composante connexe incluant au moins une incohérence

o Pour chaque environnement
" Générer tous les scénarios d’impacts possibles dont les impacts
respectent les règles de compatibilité
o Ne conserver que les scénarios d’impacts existant sur tous les
environnements
o Ecrire les scénarios d’impacts dans le fichier de sortie

Le programme sauvegarde les scénarios d’impacts générés dans un fichier de

format XML qui sera utilisé par la suite pour implémenter les GPR.

158
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

…
Figure 45. Format de fichier spécifiant les scénarios d’impacts. Les balises
COMPONENT délimitent les informations relatives à une composante connexe. Les balises
SUPPORT rappellent les associations prédéfinies gènes-réactions. Les balises SCENARIO
définissent chacune un scénario d’impact distinct. Dans un scénario d’impacts, chaque
impact est déclaré dans une balise SPECIFICATION.

Implémentation des GPR

L’étape d’implémentation a pour objectif de construire pour chaque réaction les

relations GPR compatibles avec les scénarios d’impacts définis à l’étape précédente.

Pour ce faire, nous avons développé un algorithme s’appuyant sur la

représentation des fonctions booléennes sous forme de tables de vérités. Partant d’une
table de vérité initialement vide, l’algorithme remplit les valeurs correspondant aux
spécifications du scénario d’impacts considéré (voir pseudocode ci-dessous et Figure
46). Pour chaque entrée de la fonction booléenne correspondant à une délétion
observée de gènes, la valeur spécifiée sera 0 (réaction inactive) si la réaction
appartient à l’impact de la délétion, et 1 s’il n’appartient pas à l’impact (réaction
active) (voir Figure 40 page 150 pour un exemple de spécification).

Comme mentionné plus haut, les relations GPR sont des fonctions booléennes
utilisant uniquement les opérateurs ET et OU, la négation n’étant pas employée. Cette

159
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

caractéristique réduit l’espace des fonctions booléennes à explorer et se traduit par

une propriété de monotonie :

"b1,b2 # {0,1}N b1 $ b2 % GPRr (b1 ) $ GPRr (b2 )

où la relation d’ordre entre les entrées b1 et b2 est incomplète69.

!
L’algorithme applique directement la propriété de monotonie aux tables de vérités
en complétant les valeurs qui en découlent (voir Figure 46). Il génère ensuite
l’ensemble des tables de vérités complètes envisageables, calcule leurs distances à la
GPR initiale et les traduits en expressions booléennes sous forme normale disjonctive
simplifiée selon le pseudocode suivant :

• Pour chaque composante connexe ayant au moins une incohérence

o Pour chaque scénario d’impact
" Pour chaque réaction de la composante connexe
• Initialiser une table de vérité vide ayant pour entrées les
gènes associés à la réaction
• Remplir la table avec les valeurs spécifiées par les
impacts du scénario
o Si la GPR initiale de la réaction est compatible
avec ces spécifications : retourner uniquement
cette GPR
o Sinon : poursuivre
• Compléter la table de vérité par la propriété de
monotonie
• Si des valeurs de la table de vérité demeurent
indéterminées, en déduire toutes les tables de vérités
complètes envisageables respectant la propriété de
monotonie
• Pour chaque table de vérité complète
o Calculer la distance avec la table de vérité de la
GPR initiale (nombre de valeurs distinctes)
o Exprimer formellement la table de vérité en forme
normale disjonctive simplifiée70
o Retourner l’expression booléenne obtenue et la
distance calculée

69
b1 " b2 si les éléments de b1 sont tous un à un inférieurs à ceux de b2.
70
À l’aide d’un programme dédié à la manipulation des fonctions booléennes : BDDC
v2, disponible à l’adresse http://www-verimag.imag.fr/~raymond/tools/bddc-manual/

160
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 46. Implémentation de relation GPR à partir des spécifications d’un scénario
d’impact.

Nous avons également choisi un format XML pour représenter dans un fichier
l’ensemble des GPR générées pour une composante connexe (voir Figure 47). Le
nombre de propositions de corrections pouvant devenir très grand, nous avons
développé un programme supplémentaire exploitant ces fichiers pour d’une part
effectuer des statistiques sur les corrections proposées et d’autre part aider à la
sélection des corrections notamment en les ordonnant selon leur distance.

Figure 47. Format de fichier contenant l’ensemble des GPR générées. Ce format reprend
et complète celui utilisé pour énumérer les scénarios d’impact. Pour chaque scénario
d’impact, la balise IMPLGPR encadre les implémentations GPR possible d’une réaction. Les
balises GPR contiennent chacune une relation GPR compatible, représentée sous la forme
d’une expression booléenne (+ représente OU, . représente ET). La distance entre la GPR
proposée et la GPR initiale est donnée dans l’attribut dist de la balise GPR.

11.2.2 Test d’existence de correction GPR

La recherche exhaustive de corrections GPR par AutoGPR peut se révéler

coûteuse dans les cas où les composantes connexes sont de grandes tailles. Afin
d’accélérer le processus de recherche de corrections, nous avons élaboré une méthode
simplifiée permettant de tester la simple existence de correction GPR admissible.

161
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Cette méthode fonctionne uniquement pour les cas de délétion simple de gène dont
l’essentialité est connue sur un seul milieu. Elle réalise le test d’existence de
correction pour chaque essentialité de gène incohérente de la manière suivante.

Si le gène est observé essentiel, une correction GPR existe si et seulement

l’ensemble des réactions qui lui sont associées est essentiel. En effet, si tel est le cas,
il existe alors au moins un ensemble de réaction qui puisse être impacté de manière
compatible par la délétion du gène. Inversement, si tel n’est pas le cas, il n’existe pas
d’ensemble de réaction qui puisse être impacté ; aucune correction GPR ne peut être
obtenue pour l’incohérence.

Si le gène est observé non-essentiel, une correction GPR existe dès lors que la
délétion du gène peut impacter un ensemble non-essentiel de réaction. L’ensemble
vide étant non-essentiel, il existerait a priori une solution GPR dans tous les cas, la
délétion pouvant être contrainte à n’impacter aucune réaction. Cependant, AutoGPR
interdit les corrections aboutissant au retrait de tous les gènes d’une GPR (voir Figure
42 page 153). Le test d’existence d’une correction GPR dans ce cas consiste alors à
examiner s’il existe des réactions essentielles reliées uniquement au gène considéré.
Si tel est le cas, alors le gène sera contraint à impacter la réaction pour ne pas retirer
tous ses gènes, impact incompatible avec l’essentialité de la réaction ; aucune
correction GPR n’est de ce fait envisageable. À l’inverse, si tel n’est pas le cas, alors
une correction GPR est envisageable dans laquelle aucune des réactions essentielle
n’est impactée. Ces dernières étant associées à au moins un autre gène, elles pourront
conserver au moins un gène dans leurs GPR, et ce, quel que soit l’impact des autres
gènes sur ces réactions71.

12 Résultats
Afin d’évaluer les performances d’AutoGPR, nous avons appliqué la méthode à la
correction des incohérences de cinq modèles métaboliques pour lesquels des données
d’essentialités étaient disponibles, parfois sur plusieurs environnements. Toutes les

71
Par exemple, soit une réaction essentielle reliée à un gène G1 non-essentiel et à un
gène G2. Si G2 est non-essentiel, une GPR admissible est « G1 or G2 ». Si G2 est
essentiel, une GPR admissible est « G2 ». Dans tous les cas, la réaction conserve au
moins un gène dans sa GPR.

162
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

données d’essentialité considérées ici se rapportent à des délétions72 simples de gènes.

Aux deux versions du modèle d’A. baylyi, iAbaylyiv2 et iAbaylyiv3 (considérées
séparément car chacune est associée un ensemble de données d’essentialités distinct),
nous avons ajouté les modèles de trois organismes supplémentaires, reconstruits par
les équipes de deux laboratoires distincts. Le Tableau 16 ci-dessous présente ces
différents modèles et les ensembles de données d’essentialité utilisés. Dans un soucis
de clarté, nous désignerons ces modèles par le nom de l’organisme en précisant pour
A. baylyi le numéro de version.

Organisme Modèle Référence Milieux des Références données

modèle tests d’essentialités
d’essentialité
v2
A. baylyi iAbaylyi (Durot et al. 2008) succinate (de Berardinis et al.
2008)
v3
A. baylyi iAbaylyi (Durot et al. 2008) acetate (Durot et al. 2008; de
asparagine Berardinis et al. 2008)
butanediol
glucarate
glucose
lactate
quinate
urea
1 1
E. coli iAF1260 (Feist et al. 2007) glucose (Baba et al. 2006)
2 2
glycerol (Joyce et al. 2006)
73 (riche)
B. subtilis iYO844 (Oh et al. 2007) rich (Kobayashi et al.
2003)
(riche), 3 3
S. cerevisiae iND750 (Duarte, Herrgard ypd_ess (Giaever et al. 2002)
3 4
et al. 2004) mmd (Steinmetz et al.
(riche), 4
ypd 2002)
(riche), 4
ypdge
(riche), 4
ype
(riche), 4
ypg
(riche), 3
ypgal
(riche), 4
ypl
Tableau 16. Modèles métaboliques et données d’essentialités utilisés pour évaluer la
performance d’AutoGPR. Les milieux des tests d’essentialité sont minimaux sauf
(riche)
autrement indiqué par . Milieux pour S. cerevisiae : mmd, minimal glucose ; ypd_ess,
Yeast extract Peptone (YP) + glucose (dataset contenant uniquement les gènes essentiels) ;
ypd, YP + glucose ; ypdge, YP + glucose, glycerol et ethanol ; ype, YP + ethanol ; ypg, YP +
glycerol ; ypgal, YP + galactose ; ypl, YP + lactate. Les auteurs des modèles reconstruits
ayant tous exploité les données d’essentialité pour évaluer leurs modèles, nous avons extrait
les données d’essentialités des papiers « modèles ».

72
Les gènes de B. subtilis n’ont en toute rigueur pas été délétés, mais inactivés par
insertion d’une cassette de disruption (voir section 2.2.1).
73
Un nouveau modèle de B. subtilis, qui exploite de manière très complète des
données d’essentialité, a été publié récemment (Henry et al. 2009). Ce travail est
cependant trop récent pour pouvoir être inclus dans nos travaux.

163
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

12.1 Complexité des GPR dans les modèles métaboliques

Lors de la correction manuelle du modèle d’A. baylyi à partir des incohérences de
phénotypes, nous avons constaté qu’une partie significative d’entre elles impliquaient
la composante GPR du modèle, d’où notre motivation de développer la méthode
AutoGPR pour assister le curateur dans ces corrections.

Cependant, dans le but d’évaluer la pertinence et l’intérêt pratique réel d’une telle
méthode de raisonnement automatique sur les GPR, nous avons tout d’abord cherché
à obtenir un aperçu de la complexité des GPR dans les modèles considérés ici. Si, en
moyenne, les GPR comportaient très peu de gènes et impliquaient peu de relations
booléennes distinctes, l’intérêt pratique d’une telle méthode s’avèrerait réduit. Au
contraire, si les GPR mettaient en jeu des combinaisons complexes de plusieurs
gènes, son intérêt serait a priori plus significatif.

Dans un premier temps, nous avons évalué le nombre de GPR présentes dans ces
modèles ainsi que leur variabilité. Le Tableau 17 donne un aperçu global de la taille
des modèles et du nombre de GPR distinctes impliquées dans chacun d’entre eux.
Dans cette partie, seul le modèle A. baylyi v2 sera considéré, les résultats pour A.
baylyi v3 étant quasiment identiques.

Nombre de GPR
Nombre de
Modèle Nombre de gènes distinctes (% p. r.
réactions
aux réactions)
A. baylyi 789 993 532 (54%)
E. coli 1260 2382 960 (40%)
B. subtilis 844 1250 586 (47%)
S. cerevisiae 750 1267 546 (43%)
Tableau 17. Nombre de réactions et de GPR distinctes dans les quatre modèles.

Les modèles d’A. baylyi, de B. subtilis et de S. cerevisiae sont de tailles

relativement équivalentes. Le modèle d’A. baylyi compte moins de réactions mais
intègre un nombre équivalent de gènes et de GPR distinctes, suggérant qu’un nombre
comparable de processus biochimiques distincts sont pris en compte dans ces trois
modèles. Le modèle d’E. coli comprend quant à lui significativement plus (quasiment
le double) de gènes, réactions et GPR distinctes. Ce résultat traduit d’une part le fait
que la connaissance du métabolisme d’E. coli est bien plus complète que pour
A. baylyi, B. subtilis et, dans une moindre mesure, S. cerevisiae et d’autre part l’effort
de reconstruction plus conséquent pour cet organisme, qui profite à la fois de versions

164
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

précédentes du modèle (Edwards & Palsson 2000; Reed et al. 2003) et de la base de
données métabolique très complète Ecocyc (Keseler et al. 2009).

Le nombre de GPR distinctes ramené au nombre total de réactions est relativement

similaire pour tous les modèles (entre 40 et 54%). Ce ratio s’explique par la présence
dans les modèles d’un nombre important de réactions non associées à un gène –
notamment des réactions spécifiques à la modélisation, telles que les réactions
d’échanges ou d’assemblage de la biomasse – mais également par le fait que certaines
GPR sont partagées par plusieurs réactions. La Figure 48 illustre cet effet en traçant
les distributions du nombre de réactions associées à chaque GPR distincte pour les
quatre modèles considérés ici.

Figure 48. Distribution du nombre de réactions associées à chaque GPR distincte. Les
réactions de GPR vide (non associées à un gène) ont été écartées de cette analyse.

Bien que la grande majorité des GPR soient, dans tous les modèles, associées à
une unique réaction, une part non négligeable d’entre elles sont associées à 2
réactions ou plus. Dans ces derniers cas, les GPR représentent des activités
biochimiques capables de transformer plusieurs substrats différents. Par exemple,

165
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

dans chacun des modèles, les GPR partagées par 5 à 8 réactions sont en majorité liées
aux processus de synthèse et de dégradation des lipides, pour lesquelles plusieurs
réactions agissant similairement sur des lipides de longueurs différentes possèdent la
même GPR. La Figure 48 révèle également que certaines GPR possèdent une
« spécificité » très large, une GPR d’E. coli codant pour une porine est par exemple
associée à 228 réactions qui réalisent le transport d’une grande variété de métabolites
entre le milieu extéruieur et le périplasme. En résumé, ces premiers résultats nous
montrent que le nombre de GPR distinctes dans les modèles est élevé, malgré le fait
que certaines d’entre elles soient partagées par de nombreuses réactions.

La Figure 49 explore plus avant les interdépendances entre gènes et réactions en

traçant les distributions du nombre de gènes par réaction et de réactions par gène.

166
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

167
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 49. Distributions du nombre de gènes associés à chaque réaction et du nombre

de réactions associées à chaque gène dans les GPR des quatre modèles.

Les distributions du nombre de réactions par gène illustrent les mêmes tendances
que la Figure 48 : un grand nombre de gènes ont une spécificité très faible (liés à peu
de réactions) tandis qu’un groupe plus réduit possède une spécificité large.

À l’inverse, les distributions du nombre de gènes par réaction donnent un aperçu

du nombre de gènes impliqués dans la catalyse de chaque réaction, et ainsi du nombre
de gènes composant les GPR des modèles. Cette statistique est importante car
AutoGPR ne peut proposer des corrections que pour les réactions liées à deux gènes
ou plus. Les histogrammes de la Figure 49 (colonne de gauche) montrent qu’ une part
importante des réactions sont effectivement associées à deux gènes ou plus et que,
parmi ces réactions, une majorité est même reliée à trois gènes ou plus, rendant les
combinaisons de corrections GPR plus complexes et le recours à AutoGPR plus
intéressant.

Enfin, dans le but d’estimer la variété des règles booléennes utilisées dans les
GPR, nous avons calculé les distributions bivariées du nombre de ET et du nombre de
OU dans chaque GPR. Pour cela, et afin de pouvoir comparer rigoureusement les
résultats entre modèles, chaque GPR a été exprimée en forme normale disjonctive. La
Figure 50 présente ces résultats.

168
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 50. Distribution du nombre de ET et OU dans les GPR des quatre modèles. Pour une
comparaison rigoureuse, les relations GPR ont toutes été exprimées en formes normales
disjonctives. Par soucis de clarté, le nombre de GPR ne comptant aucun ET et aucun OU n’est
pas affiché (ce nombre peut être déduit de la Figure 49, il s’agit du nombre de réactions associées
à 0 ou 1 gène).

Pour les quatre modèles, une majorité de GPR possède exclusivement des
opérateurs ET ou des opérateurs OU ; ces GPR expriment la présence soit d’un
complexe soit d’isozymes. Le nombre d’isozymes et, dans une moindre mesure, de
sous-unités de complexe peut être relativement élevé. En effet, les modèles d’A.
baylyi, d’E. coli et de S. cerevisiae comptent par exemple un grand nombre de GPR
ayant 4 isozymes ou plus. De même, les tailles de complexes dépassent fréquemment
4 pour tous les modèles. Dans chaque modèle, une minorité tout de même non
négligeable de GPR inclut simultanément des opérateurs ET et OU, exprimant des
alternatives entre complexes ou entre sous-unités d’un même complexe. Bien que
relativement peu nombreuses, ces dernières GPR sont cependant susceptibles de
comporter des erreurs dont l’interprétation à la lumière des phénotypes de croissance
peut se révéler plus complexe.

169
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

En conclusion, cette petite étude sur les GPR des quatre modèles nous a montré
qu’un nombre significatif d’entre elles ne sont pas triviales et peuvent typiquement
bénéficier de la capacité de raisonnement automatique d’AutoGPR.

12.2 Statistiques globales sur les propositions d’AutoGPR

Dans cette partie, nous appliquerons la méthode AutoGPR à chaque modèle pour
résoudre leurs incohérences par rapport aux données expérimentales d’essentialité.
Nous présenterons ici (1) des statistiques sur les incohérences de chaque modèle, (2)
les résultats des tests simples d’existence de correction GPR et (3) les résultats des
propositions de correction GPR par AutoGPR.

12.2.1 Confrontation des modèles aux données d’essentialité

Les auteurs des cinq modèles ont tous confronté les prédictions de leurs modèles
aux données d’essentialités considérées ici. Afin d’exploiter par la suite leurs
interprétations expertes des incohérences, nous avons réalisé les prédictions en
utilisant les mêmes méthodes et paramètres, lorsque cela était possible.

Les prédictions de phénotypes avaient toutes été effectuées par la méthode FBA,
sauf pour les modèles A. baylyi (test de productibilité des précurseurs). Afin
d’uniformiser notre processus de test, nous avons tout de même réalisé les prédictions
de tous les modèles par FBA. Comme déjà discuté à la section 9.4.1, ce changement
de méthode provoque un petit nombre de différences de prédiction pour A. baylyi ; ces
différences n’impactent cependant pas significativement l’analyse effectuée ici.

Pour les modèles A. baylyi v2, A. baylyi v3, E. coli et B. subtilis, les contraintes
sur les flux d’échanges (modélisant les milieux) et les seuils de croissance à appliquer
aux réactions de biomasse (pour déterminer le phénotype qualitatif croissance/non
croissance) étaient explicités par leurs auteurs. Nous avons pu reproduire la totalité de
leurs prédictions. Dans le cas de S. cerevisiae, ces paramètres n’étaient pas précisés.
Nous les avons inférés de manière à reproduire au mieux les résultats des auteurs.
Deux ou trois prédictions par milieu demeurent différentes de celles publiées, elles
sont dans leur très grande majorité identiques.

Le Tableau 18 présente les prédictions obtenues et leur cohérence par rapport aux
données expérimentales.

170
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Gène observé non

Gène observé essentiel Tout gène
essentiel
coh. incoh. % coh. coh. incoh. % coh. coh. incoh. % coh.
A. baylyi v2
succinate 197 54 78% 487 29 94% 684 83 89%
A. baylyi v3
acetate 2 2 50% 423 9 98% 425 11 97%
asparagine 1 2 33% 437 8 98% 438 10 98%
butanediol 6 4 60% 422 11 97% 428 15 97%
glucarate 5 0 100% 406 7 98% 411 7 98%
glucose 3 4 43% 422 10 98% 425 14 97%
lactate 0 2 0% 434 11 98% 434 13 97%
quinate 4 4 50% 426 10 98% 430 14 97%
urea 3 0 100% 435 7 98% 438 7 98%
tous milieux 17 18 49% 403 17 96% 420 35 92%
E. coli
glucose 159 78 67% 982 29 97% 1141 107 91%
glycerol 156 85 65% 978 29 97% 1134 114 91%
tous milieux 151 106 59% 967 24 98% 1118 130 90%
B. subtilis
rich 63 28 69% 657 18 97% 720 46 94%
S. cerevisiae
ypd_ess 31 87 26% 0 0 - 31 87 26%
mmd 35 11 76% 502 16 97% 537 27 95%
ypd 3 73 4% 476 13 97% 479 86 85%
ypgal 7 2 78% 543 12 98% 550 14 98%
ypdge 17 64 21% 465 19 96% 482 83 85%
ypg 23 62 27% 466 14 97% 489 76 87%
ype 23 60 28% 461 21 96% 484 81 86%
ypl 22 61 27% 466 16 97% 488 77 86%
tous milieux 65 210 24% 379 28 93% 444 238 65%
Tableau 18. Confrontation des essentialités prédites aux essentialités observées
expérimentalement pour les 5 modèles et les différents milieux considérés. Toutes les
prédictions d’essentialités ont été réalisées par la méthode FBA. « coh. » et « incoh. »
désignent les gènes prédits de manière respectivement cohérente et incohérente par rapport
à l’observation expérimentale. La ligne tous milieux considère tous les milieux
simultanément : un gène est essentiel sur tous milieux s’il l’est sur au moins l’un d’entre eux ;
il est non-essentiel s’il l’est sur tous les milieux.

Sur l’ensemble des modèles et des milieux, le taux de bonnes prédictions est en
moyenne largement meilleur pour les gènes non-essentiels (toujours supérieur à 94%)
que pour les gènes essentiels. Nous avions déjà évoqué cette tendance pour A. baylyi.
Elle s’interprète par le fait qu’une large part des réactions des modèles ne participe
pas au fonctionnement métabolique sur des milieux précis ; la fonction des gènes qui
leurs sont associés ne peut être réellement évaluée par leur essentialité.

Les taux de bonnes prédictions des modèles A. baylyi v2, A. baylyi v3, E. coli et
B. subtilis sont du même ordre de grandeur (sans tenir compte des fluctuations pour
A. baylyi v3 pour les gènes essentiels, dues à leur petit nombre). En revanche, les

171
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

prédictions de S. cerevisiae pour les gènes essentiels sont significativement moins

bonnes. La technique expérimentale utilisée pour déterminer l’essentialité des gènes
en est probablement la cause. Alors que pour A. baylyi, E. coli et B. subtilis la
croissance des mutants fut évaluée de manière clonale (chaque mutant
individuellement, voir section 2.2.1), celle des mutants de S. cerevisiae fut évaluée en
compétition au sein d’une population regroupant mutants et souche sauvage (Giaever
et al. 2002; Steinmetz et al. 2002). Cette dernière méthode détecte rapidement tout
effet d’une délétion sur la capacité reproductive (voir discussion dans l’introduction,
section 2.2.2), mais tend à classer essentiels des gènes dont la délétion ralentit
simplement la croissance. Les modèles ayant plus de difficulté à prédire une
diminution quantitative de croissance qu’une létalité totale, le taux de bonnes
prédictions pour les gènes essentiels de S. cerevisiae s’en trouve affecté.

Au total, les nombres d’incohérences à traiter par AutoGPR s’élevent

respectivement à 83, 35, 130, 46 et 238 gènes pour A. baylyi v2, A. baylyi v3, E. coli,
B. subtilis et S. cerevisiae.

12.2.2 Tests simples d’existence de correction GPR

Dans un premier temps, nous avons testé l’existence de correction GPR. Nous
avons utilisé pour cela le test simple d’existence (voir 11.2.2) appliqué séparément
aux incohérences de chaque milieu. Ce test n’est en effet valable que pour des
délétions simples évaluées sur un milieu unique.

Le Tableau 19 présente les résultats de ces tests appliqués aux incohérences de

tous les modèles.

172
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Incohérence observée Incohérence observée

Tout type d'incohérence
essentielle non essentielle
cor. non cor. % cor. cor. non cor. % cor. cor. non cor. % cor.
A. baylyi v2
succinate 25 29 46% 2 27 7% 27 56 33%
A. baylyi v3
acetate 0 2 0% 2 7 22% 2 9 18%
asparagine 1 1 50% 1 7 13% 2 8 20%
butanediol 2 2 50% 3 8 27% 5 10 33%
glucarate 0 0 - 2 5 29% 2 5 29%
glucose 2 2 50% 1 9 10% 3 11 21%
lactate 0 2 0% 1 10 9% 1 12 8%
quinate 0 4 0% 2 8 20% 2 12 14%
urea 0 0 - 2 5 29% 2 5 29%
E. coli
glucose 15 63 19% 7 22 24% 22 85 21%
glycerol 19 66 22% 6 23 21% 25 89 22%
B. subtilis
rich 3 25 11% 11 7 61% 14 32 30%
S. cerevisiae
ypd_ess 2 85 2% 0 0 - 2 85 2%
mmd 1 10 9% 3 13 19% 4 23 15%
ypd 3 70 4% 3 10 23% 6 80 7%
ypgal 2 0 100% 4 8 33% 6 8 43%
ypdge 3 61 5% 10 9 53% 13 70 16%
ypg 2 60 3% 5 9 36% 7 69 9%
ype 2 58 3% 5 16 24% 7 74 9%
ypl 1 60 2% 5 11 31% 6 71 8%
Tableau 19. Nombre d’incohérences pour lesquelles une correction GPR existe, pour
chaque milieu pris séparément. Les résultats sont présentés en distinguant les
incohérences des gènes observés essentiels, des incohérences des gènes observés non-
essentiels. « cor. » une correction GPR existe ; « non cor. » aucune correction GPR n’existe.

Dans l’ensemble, ce tableau montre que seule une minorité d’incohérences (entre
2% et 43%, selon le modèle et le milieu) pourrait être corrigée uniquement par des
corrections GPR. Toutes les autres nécessitent de rechercher des corrections soit en
dehors de la composante GPR soit en ajoutant de nouveaux gènes à associer aux
réactions.

La répartition des corrections réalisables entre incohérence de gène essentiel et

incohérence de gène non-essentiel est hétérogène entre les organismes. Alors que
pour A. baylyi v2, une part élevée des incohérences de gènes essentiels dispose d’une
correction GPR (46%), cette part est bien plus réduite pour les autres organismes
(entre 2% et 22%, pour les milieux ayant plus de 10 incohérences). Inversement, peu
d’incohérences de gènes non-essentiels disposent d’une correction chez A. baylyi v2
(7%), alors qu’entre 9% et 60% en disposent pour les autres organismes.

173
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Afin d’évaluer l’effet de la taille des GPR et du nombre de réactions liées aux
gènes sur l’existence d’une correction, nous avons tracé les Box Plots de ces deux
grandeurs selon qu’une correction existe ou non (voir Figure 51).

174
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

175
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 51. Box Plot du nombre moyen de gènes contenus dans les GPR de chaque
gène incohérent et du nombre de réactions liées à chaque gène incohérent, selon
qu’une correction GPR existe ou non. Box plots de Tukey : chaque boîte est délimitée par
er ème
les 1 et 3 quartiles de la statistique et coupée par la médiane (ligne épaisse). Les
moustaches représentent les valeurs minimales et maximales rencontrées, dans la limite de
1,5 fois l’écart interquartile. Les cercles représentent les valeurs sortant de ces moustaches
(« outliers »).

Les incohérences pour lesquelles une correction GPR existe ont tendance à être
reliées à des GPR initiales de tailles plus grandes que lorsque aucune correction
n’existe (voir Figure 51 colonne de gauche). Cet effet s’interprète aisément, aucune
correction ne pouvant naturellement être proposée par AutoGPR lorsqu’un seul gène
est contenu dans la GPR à corriger. À l’inverse, on constate peu, voire aucune,
différence entre les nombres de réactions reliées aux gènes incohérents disposant ou
non de correction GPR. L’appartenance à une GPR de grande taille semble être ainsi
le premier indicateur de l’existence d’une correction purement GPR.

Ce test d’existence de correction ne vérifie cependant pas la cohérence des

corrections entre milieux. Pour cela, il est nécessaire d’exécuter la méthode complète
AutoGPR.

12.2.3 Proposition exhaustive de corrections GPR

Un préliminaire nécessaire à l’exécution d’AutoGPR est la détermination de tous

les ensembles essentiels minimaux de réactions au sein des composantes connexes
formées par les associations gènes-réactions (voir section 11.2.1). Nous les avons
calculés pour tous les organismes et tous leurs milieux en suivant l’algorithme
présenté précédemment. Dans la très grande majorité des cas, cet algorithme nous a
permis de déterminer toutes les essentialités minimales de réactions. Celles-ci sont
constituées pour la plupart de réactions individuelles, mais aussi de quelques rares
ensembles de réactions « synthétiques létales ». Ces ensembles sont le plus souvent de
taille 2, les quelques autres étant de taille 3 à 6. L’exécution de l’algorithme échoua
sur les composantes connexes de 9 gènes d’E. coli et de 4 gènes de S. cerevisiae, tous
milieux confondus ; ces composantes contiennent des ensembles essentiels de
réactions trop grands pour être explorés par cet algorithme. Cependant, seul un de ces
treize gènes est incohérent et ne pourra être traité par la suite.

Enfin, dans un dernier temps, nous avons exécuté AutoGPR sur l’ensemble des
incohérences disposant, selon le test d’existence, d’une correction GPR sur au moins

176
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

un des milieux. Des statistiques sur les corrections proposées sont données sur la
Figure 52 ci-dessous.

177
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

178
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 52. Histogrammes des nombres de GPR proposées par AutoGPR pour chaque
incohérence identifiée précédemment comme ayant une correction sur chaque milieu
pris séparément. Les GPR proposées sont compatibles simultanément sur tous les milieux.
L’échelle des abscisses est en partie logarithmique : elle demeure linéaire entre chaque
puissance de 10. Le cas « Non déterminé » indique les incohérences pour lesquelles
AutoGPR n’a pu générer les corrections pour cause de nombre excessif de combinaisons.

Pour les modèles dont les données d’essentialités existent sur plusieurs milieux
(A. baylyi v3, E. coli et S. cerevisiae), une part des incohérences ne dispose d’aucune
correction GPR, alors même que des corrections étaient envisageables pour chaque
milieu pris séparément. Ceci est particulièrement marqué chez S. cerevisiae où la
quasi-totalité des incohérences ne dispose plus de correction. Ces cas révèlent des
incompatibilités entre les contraintes d’essentialités posées sur les GPR par les
différents milieux. Ces incompatibilités traduisent une différence de comportement de
l’organisme entre les milieux qui n’est pas prise en compte par le modèle74. L’origine
de l’incohérence peut dans ce cas se trouver dans les composantes RESEAU et
BIOMASSE qui ne prédisent pas correctement les essentialités des réactions sur
certains environnements. L’origine de l’incohérence peut également porter sur la
régulation des gènes, certains d’entre eux ne s’exprimant que sur des milieux
particuliers. Dans ce cas, l’hypothèse de « GPR constante sur tous les
environnements » doit être levée pour pouvoir expliquer les phénotypes. Le recours à
des règles de régulation dépendant de l’environnement qui modulent la présence des
gènes dans les GPR – à l’image de la méthode rFBA (Covert et al. 2001) – semble
être une solution permettant de prendre efficacement ces cas en compte (Covert et al.
2004). Nous évoquerons quelques cas précis de ce type dans la section suivante.

Lorsque des GPR compatibles existent, le nombre de combinaisons réalisables

peut faire varier leur nombre sur plusieurs ordres de grandeur. Une forte proportion
d’entre elles se limite néanmoins à une seule GPR compatible : dans ces cas, les
données d’essentialités spécifient intégralement les GPR concernées (toujours bien
entendu dans les limites des hypothèses d’AutoGPR). Dans les autres cas, le nombre
de propositions demeure souvent limité (<10, notamment pour A. baylyi) mais peut
rapidement atteindre des valeurs très élevées, jusqu’à rendre la recherche de GPR non
réalisable (catégorie « Non déterminé » de la Figure 52). Cet effet est directement lié

74
En supposant bien entendu que les expériences réalisées sur les différents milieux
soient comparables et ne présentent pas de biais.

179
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

à la taille des GPR et au nombre de réactions liées aux gènes. Afin d’aider à la
sélection des corrections GPR et rendre le calcul réalisable, les stratégies de
sélection/simplification évoquées plus haut – distance à la GPR initiale et contrainte
de GPR identiques pour plusieurs réactions – peuvent être employées (voir section
11.1).

Par exemple, l’incohérence du gène b0180 chez E. coli ne pouvait initialement

être traitée par AutoGPR. Ce gène est lié à 12 réactions effectuant une activité 3-
hydroxyacyl-ACP dehydratase pour 12 substrats distincts mais chimiquement proches
du point de vue de cette activité.

Réaction Equation bilan GPR

3HAD40 3haACP[c] -> but2eACP[c] + h2o[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD60 3hhexACP[c] -> h2o[c] + thex2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD80 3hoctACP[c] -> h2o[c] + toct2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD100 3hdecACP[c] -> h2o[c] + tdec2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD120 3hddecACP[c] -> h2o[c] + tddec2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD121 3hcddec5eACP[c] -> h2o[c] + t3c5ddeceACP[c] ( b0180 or b0954 )
3HAD140 3hmrsACP[c] -> h2o[c] + tmrs2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD141 3hcmrs7eACP[c] -> h2o[c] + t3c7mrseACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD160 3hpalmACP[c] -> h2o[c] + tpalm2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD161 3hcpalm9eACP[c] -> h2o[c] + t3c9palmeACP[c] ( b0180 or b0954 )
3HAD180 3hoctaACP[c] -> h2o[c] + toctd2eACP[c] ( b0954 or b0180 )
3HAD181 3hcvac11eACP[c] -> h2o[c] + t3c11vaceACP[c] ( b0180 or b0954 )

Il est donc probable que ces réactions soient catalysées de manière similaire. En
les contraignant à avoir toutes la même GPR, la déduction des GPR compatibles
devient réalisable : seules deux configurations de GPR sont générées par AutoGPR75.

Cette stratégie de simplification nécessite cependant d’entrer dans le détail des

conversions chimiques catalysées par les gènes et ne peut ainsi être réalisée
automatiquement. Nous proposerons d’autres pistes de simplification dans la section
consacrée aux perspectives d’AutoGPR (section 13).

12.3 Comparaison des corrections d’AutoGPR aux

interprétations expertes
Les incohérences de quatre des cinq modèles ont été examinées de manière
experte par les auteurs de ces modèles. Il s’agit d’une part des modèles A. baylyi v2 et

75
b0180 et b0954 sont tous deux essentiels, les réactions présentées ici sont
essentielles. b0954 est en outre associé seul à une autre réaction essentielle. Les deux
GPR proposées pour ces réactions sont donc « b0180 » et « b0180 ET b0954 ».

180
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

A. baylyi v3 pour lesquels nous avions explicitement déterminé des corrections (voir
article inclus section 8) et d’autre part des modèles B. subtilis et E. coli dont les
auteurs ont proposés des interprétations à chaque incohérence. Cette section évalue la
pertinence des propositions d’AutoGPR en les confrontant à ces corrections et
interprétations.

12.3.1 Comparaison aux corrections des modèles d’A. baylyi

Lors du processsus de raffinement du modèle d’A. baylyi, nous avions interprété

manuellement les incohérences et proposé des corrections dans les composantes GPR,
RESEAU et BIOMASSE du modèle. Le Tableau 20 ci-dessous récapitule l’ensemble
des incohérences détectées pour les modèles v2 et v3 ainsi que les corrections et
interprétations réalisées pour chacune d’entre elles, et les compare aux propositions
de correction d’AutoGPR.

181
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

CORRECTION PAS DE CORRECTION

autogpr autogpr
gène ess test n cor sel gène ess test n cor sel

GPR Interprétation validée

activité nécessitant simultanément tous les gènes erreur expérimentale
2 ACIAD0661 hisG E o 1 o P 3 ACIAD0108 lldD D - -
2 ACIAD1257 hisZ E o 1 o P manque connu dans la connaissance d'une voie
2 ACIAD3103 ilvH E o 8 o SP 2 ACIAD0856 bioA E - -
gènes associés à une autre réaction 2 ACIAD0857 bioF E - -
2 ACIAD2606 E - - 2 ACIAD0859 bioD E - -
isozyme non fonctionnelle 2 ACIAD2045 bioB E - -
2 ACIAD0151 guaA E o 1 o P auxotrophie non modélisée
2 ACIAD0249 ribC E o 2 o P 2 ACIAD3523 metE E - -
2 ACIAD0871 fabG E o 2E+05 o SP Interprétation hypothétique
2 ACIAD1069 lysS E o 1 o P 2 ACIAD0556 ndk D - -
2 ACIAD1255 epd E o 9 o 2 ACIAD0650 argJ E o 2 n
2 ACIAD1323 purF E - - 2 ACIAD1150 pyrC E o 1 n
2 ACIAD1375 cdsA E o 1 o P 2 ACIAD1346 sodB E - -
2 ACIAD1736 accC E o 1 o P 2 ACIAD2282 sahH D - -
2 ACIAD1737 accB E o 1 o P 2 ACIAD2314 metZ E o 2 n
2 ACIAD1925 fda E o 1 o P 2 ACIAD2458 glnA E o 1 n
2 ACIAD2227 dctA E o 1E+06 o P 2 ACIAD2842 pckG E - -
2 ACIAD2565 gap E o 9 o 2 ACIAD2847 folD E o 5 n
2 ACIAD2666 E o 1 o P 2 ACIAD3155 mdh E - -
2 ACIAD2907 prs E o 1 o P 2 ACIAD3349 gltD E - -
2 ACIAD3062 folK E o 1 o P 2 ACIAD3350 gltB E - -
2 ACIAD3249 ribA E o 1 o P 2 ACIAD3470 msuE E - -
2 ACIAD3365 murE E o 1 o P 2 ACIAD3506 aceF E - -
2 ACIAD3371 gltX E o 4 o P 3 ACIAD0546 E - -
3 ACIAD1710 pcaC E - - 3 ACIAD0556 ndk D - -
3 ACIAD2018 ald1 E o 0 n 3 ACIAD1021 D - -
3 ACIAD2088 aspQ E o 4 o P 3 ACIAD1707 pcaB E - -
3 ACIAD2983 gcd E o 2 o P 3 ACIAD1711 pcaH E - -
présence d'un enzyme alternative 3 ACIAD1712 pcaG E - -
2 ACIAD1231 argD D - - 3 ACIAD1744 aspA E - -
2 ACIAD1642 uppP D - - Pas d'interprétation précise
2 ACIAD2968 ispA D - - 2 ACIAD0072 ugd E - -
3 ACIAD1020 acoD D o 1 n 2 ACIAD0173 rhtB E - -
3 ACIAD1715 quiX D - - 2 ACIAD0382 ubiB D - -
3 ACIAD2984 D - - 2 ACIAD0505 purU1 E - -
réaction occurant spontanément 2 ACIAD1482 kdsD D - -
3 ACIAD2819 D - - 2 ACIAD1483 kdsC D - -
fausse sous-unité d'un complexe 2 ACIAD2283 metF D - -
2 ACIAD0799 D o 1 n 2 ACIAD2290 cydA E - -
RESEAU 2 ACIAD2525 E - -
fausse voie alternative 2 ACIAD2667 pdxB D - -
2 ACIAD0239 ppa E - - 2 ACIAD2788 E - -
2 ACIAD0547 proA E - - 2 ACIAD2880 sdhA D o 1 n
2 ACIAD1105 adk E - - 2 ACIAD2911 panD D - -
2 ACIAD1920 glnS E - - 2 ACIAD3503 guaB E - -
2 ACIAD2560 proB E - - 2 ACIAD3510 lpxC D - -
2 ACIAD3032 proC E - - 3 ACIAD0086 epsM E - -
voie alternative manquante 3 ACIAD0382 ubiB D - -
2 ACIAD0106 lldP D - - 3 ACIAD0922 E - -
2 ACIAD0451 katA D - - 3 ACIAD2070 metI E - -
2 ACIAD0901 dut E - - 3 ACIAD2282 sahH D - -
2 ACIAD0930 glpK D - - 3 ACIAD2283 metF D o 2 n
2 ACIAD1045 metH D - - 3 ACIAD2667 pdxB D - -
3 ACIAD0106 lldP D - - 3 ACIAD2755 E o 0 n
BIOMASSE 3 ACIAD2875 sucB E - -
précurseur de biomasse non essentiel 3 ACIAD2876 sucA E - -
2 ACIAD0076 rmlB D - - 3 ACIAD2880 sdhA D o 147 n
2 ACIAD0078 rmlD D - - 3 ACIAD2911 panD E - -
2 ACIAD0079 rmlA D - - 3 ACIAD3071 cysM E o 0 n
2 ACIAD0080 rmlC D - - Incohérence ajoutée par la méthode FBA
2 ACIAD0086 epsM D - - 2 ACIAD2456 ubiC D - -
2 ACIAD0099 galU D - - 2 ACIAD3383 acr1 D - -
2 ACIAD0101 pgi D - - 3 ACIAD0080 rmlC D - -
2 ACIAD0104 manB D - - 3 ACIAD0099 galU D - -
2 ACIAD2429 cyoE D - - 3 ACIAD0104 manB D - -
précurseur de biomasse manquant 3 ACIAD3383 acr1 D - -
2 ACIAD1374 ispU E - - 3 ACIAD3549 gshA E - -

182
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Tableau 20. Comparaison des propositions d’AutoGPR aux corrections et

interprétations des incohérences des modèles A. baylyi v2 et A. baylyi v3. Les
incohérences sont classées par type de correction et d’interprétation. La colonne de gauche
identifie le modèle concerné par l’incohérence (2 ou 3). Signification des colonnes : ess,
essentialité de l’incohérence (sur le profil de milieux pour A. baylyi v3 ; E essentiel, D non-
essentiel) ; test, résultat du test d’existence de correction GPR (o existence de correction) ; n,
nombre de propositions d’AutoGPR ; cor, présence de la correction experte dans les
propositions d’AutoGPR (o oui, n non) ; sel, méthode de sélection de la GPR (P la plus
proche de la GPR initiale, S réactions contraintes à avoir des GPR similaires).

Sensibilité76

Parmi les 34 incohérences que nous avons corrigées dans la composante GPR
(pour les deux modèles), 24 disposent de propositions d’AutoGPR. Pour 22 d’entre
elles, la correction appliquée est incluse dans les propositions, donnant un score
global de sensibilité de 65% pour les modèles A. baylyi.

AutoGPR propose dans la majorité des cas des corrections uniques aux
incohérences. Lorsque plusieurs corrections distinctes sont suggérées, les stratégies de
sélection permettent d’identifier efficacement la correction retenue. En effet, en
contraignant dans deux cas des réactions à avoir des GPR similaires (ACIAD3103 et
ACIAD0871, cas analogues à celui présenté pour E. coli section 12.2.3), la correction
retenue correspond dans 7 cas sur 9 à la proposition d’AutoGPR la plus proche des
GPR initiales. Ces stratégies peuvent ainsi s’avérer être des outils utiles à la sélection
des GPR les plus probables.

Seuls deux types de corrections GPR (toutefois majoritaires) sont pris en compte
par AutoGPR : la détection (1) d’isozyme non fonctionnelle et (2) d’activités
nécessitant la présence de tous les gènes (sous-unités de complexes enzymatiques).

Pour le premier type de correction, AutoGPR propose dans 86% des cas (19/22) la
correction retenue. Il s’agit le plus souvent de retirer une isozyme hypothétique d’une
GPR afin de retrouver l’essentialité de l’enzyme principale. Dans le cas par exemple
des incohérences de epd (ACIAD1255) et gap (ACIAD2565) qu’AutoGPR corrigea

76
Nous utiliserons un peu par abus de langage les termes de sensibilité et de
spécificité pour désigner respectivement la part de corrections expertes GPR
retrouvées par AutoGPR et la part de corrections d’AutoGPR effectivement retenues.
AutoGPR déduisant toutes les corrections GPR réalisables dans son champ
d’application, sa spécificité est théoriquement de 100%. La « spécificité » que nous
utiliserons ici cherche plutôt à évaluer quelle part des corrections expertes de la
composante GPR rentre dans le champ d’application d’AutoGPR.

183
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

correctement, la correction consiste à associer chaque gène spécifiquement à une

réaction alors qu’ils étaient considérés initialement comme des isozymes de ces
réactions. Les trois cas où AutoGPR ne proposa pas de solution sont dus soit à la
présence d’une autre incohérence non résoluble dans la même composante connexe
(ACIAD1323) soit à la nécessité d’effectuer en plus une correction dans la
composante RESEAU du modèle (ACIAD1710 et ACIAD2018).

Pour le deuxième type de correction, AutoGPR proposa dans les trois cas la
correction experte réalisée. Parmi les corrections de ce type, celle de l’incohérence de
ilvH (ACIAD3103) mérite d’être détaillée (voir Figure 53).

Figure 53. Correction de l’incohérence du gène ilvH dans A. baylyi v2. La couleur rouge
(respectivement verte) indique une réaction ou un gène essentiel (respectivement non-
essentiel). Le gène en gras possède une essentialité incohérente avec la prédiction du
modèle. Les métabolites en triangle sont des précurseurs de biomasse.

Initialement, deux isozymes étaient supposés catalyser deux réactions essentielles

d’activité de type acetolactate synthase : un complexe IlvI & IlvH et une protéine
codée par ACIAD0999. Cette redondance génétique contredisant l’essentialité de
ilvH, AutoGPR génère 8 corrections distinctes qui combinent indépendamment des
impacts de la délétion de ilvH sur chaque réaction. En contraignant les deux réactions
à avoir des GPR identiques, seules deux corrections demeurent : « ilvH » ou
« ( ilvI OU ACIAD0999 ) ET ilvH ». L’examen de la littérature nous avait permis de
déterminer cette deuxième correction : ilvH est en réalité un facteur de stabilisation
pouvant fonctionner indistinctement avec les unités catalytiques alternatives codées
par ACIAD0999 ou ilvI (Vyazmensky et al. 1996). Cet exemple illustre le fait que les
données d’essentialités (sur lesquelles AutoGPR repose) peuvent dans certains cas
aider à déterminer de manière précise des règles d’associations complexes entre gènes
et réactions.

184
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Les quatre autres types de corrections GPR expertes appliquées aux modèles d’A.
baylyi impliquent d’ajouter de nouveaux gènes aux GPR. Ces corrections sortent de
ce fait du cadre d’application d’AutoGPR, expliquant la quasi-inexistence de
proposition pour les incohérences de ces types.

Il est intéressant de noter ici que toutes les corrections GPR correctement
détectées par AutoGPR concernent des gènes essentiels. Il semble donc sur cet
exemple qu’AutoGPR ait un biais très fort envers les corrections d’incohérences de
gène essentiel. Ce biais peut s’interpréter de la manière suivante. La correction type
d’AutoGPR pour les gènes non-essentiels incohérents (prédits donc essentiels)
consiste à remplacer une relation ET en OU, c’est à dire à considérer les sous-unités
d’un complexe comme isozymes. Les complexes faisant généralement l’objet d’une
attention particulière lors de leur construction, il est relativement rare d’introduire par
erreur des interactions entre sous-unités. Toute autre correction GPR d’une
incohérence de gène non-essentiel consiste à ajouter une isozyme en introduisant un
nouveau gène dans la GPR (voir Tableau 20). Ce type de modification sort alors du
cadre d’action d’AutoGPR (correction à ensemble de gènes constant).

Spécificité

S’agissant de la spécificité de la méthode, sur 32 incohérences pour lesquelles

AutoGPR propose des corrections, 22 ont été corrigées manuellement selon une des
propositions d’AutoGPR (score de spécificité de 69%). Les corrections AutoGPR de
deux incohérences sont explicitement en désaccord avec la correction réelle
(ACIAD1020 et ACIAD0799), les corrections appliquées nécessitant d’ajouter un
nouveau gène à la GPR.

Il est cependant important de considérer ce score avec précaution. En effet,

certaines corrections d’AutoGPR non retenues peuvent toutefois avoir un réel sens
biologique et aider à interpréter les incohérences. Ainsi, les incohérences des gènes
essentiels pyrC et folD sont résolues par AutoGPR en supprimant leurs isozymes.
Cependant, aucune information supplémentaire ne permettant de corroborer ni
d’infirmer ces corrections, celles-ci n’ont pas été réalisées et nécessitent d’investiguer
plus avant les activités des isozymes. Dans un autre ordre d’idée, l’incohérence du
gène essentiel glnA (ACIAD2458), qui catalyse l’activité glutamine synthetase
conjointement avec le gène glnT (ACIAD2528), pourrait s’expliquer par l’existence

185
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

d’une contrainte régulatrice favorisant l’utilisation de l’un ou l’autre de ces gènes en

fonction de la disponibilité en ammonium (Reitzer 1996). Pour cette incohérence,
AutoGPR propose justement d’écarter glnT de la GPR de la glutamine synthetase,
traduisant le fait que l’enzyme de ce gène n’est potentiellement pas active dans les
conditions des expériences.

Il est ainsi probable que, dans l’ensemble des incohérences n’ayant pu être
interprétées, les propositions réalisées par AutoGPR puissent fournir des pistes
d’investigation utiles.

12.3.2 Comparaison aux interprétations expertes des modèles de B.

subtilis et S. cerevisiae

Bien que les incohérences des modèles B. subtilis et S. cerevisiae n’aient pas
donné lieu à des corrections, leurs auteurs les ont tout de même examinées de manière
experte afin d’en déterminer la cause. L’ensemble de ces interprétations étant mis
librement à disposition sous la forme de données supplémentaires aux articles des
modèles (Oh et al. 2007; Duarte, Herrgard et al. 2004), nous les avons utilisées pour
évaluer la pertinence des propositions d’AutoGPR pour ces modèles.

B. subtilis

Le Tableau 21 confronte les interprétations expertes réalisées pour B. subtilis aux

propositions d’AutoGPR pour ce modèle.

186
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

autogpr
gène ess test n Commentaire des auteurs
GPR
BG10412 fbaA E - - Possibly regulation effect. fbaA could not be replaced by
fbaB.
BG11955 murAA E o 1 Possibly regulation effect. murAA could not replaced by a
homologue murAB.
BG11964 racE E o 1 Regulation effect. racE could not be replaced by yrpC.
BG12391 yumC E - - Possibly regulation effect. Both yumC and trxB products
seem to be essential for cell growth.
BG12398 trxB E - - Possibly regulation effect. Both yumC and trxB products
seem to be essential for cell growth.
RESEAU
BG10282 ndk D - - Metabolic gap and/or external source
BG10305 bkdB D o 1E+06 Metabolic gap and/or external source
BG10306 bkdAB D o 1E+06 Metabolic gap and/or external source
BG10307 bkdAA D o 1E+06 Metabolic gap and/or external source
BG11725 lpdV D o 1E+06 Metabolic gap and/or external source
BG13951 yubB D - - Metabolic gap and/or external source
BIOMASSE
BG10402 gtaB D - - Biomass composition
BG10548 dltD D o ND Biomass composition
BG10549 dltC D o ND Biomass composition
BG10550 dltB D o ND Biomass composition
BG10551 dltA D o ND Biomass composition
BG10724 tagE D o ND Biomass composition
BG11012 pssA D - - Biomass composition
BG11013 psd D - - Biomass composition
BG11192 ggaB D o 1 Biomass composition
BG11367 ggaA D o 1 Biomass composition
BG11611 ugtP D - - Biomass composition
BG11840 metK E - - Synthesize S-adenosylmethionine, which is necessary for
siroheme synthesis.
BG12089 acpS E - - Synthesize acyl-carrier protein.
BG12900 yfiX D - - Biomass composition
BG13824 ytaG E - - Synthesize coenzyme A.
Autre interprétation
BG10897 tpiA E - - Possibly toxic effect. Accumulation of dihydroxyacetone
phosphate, which may leads to the formation of the
bactericidal compound methylglyoxal
BG11062 pgk E - - Conditionally essential gene.
BG11937 fmt E - - Other function. Required for the formylation of methionyl
tRNA
BG12344 mrpF E - - Other function. Multiple resistance and pH homeostasis
BG12345 mrpD E - - Other function. Multiple resistance and pH homeostasis
BG12355 mrpA E - - Other function. Multiple resistance and pH homeostasis
BG12356 mrpB E - - Other function. Multiple resistance and pH homeostasis
BG12357 mrpC E - - Other function. Multiple resistance and pH homeostasis
BG13966 yueK E - - Toxic effect. Nicotinate accumulation.
Pas d'interprétation précise
BG10073 guaB E - - Not well understood.
BG10131 hprT E - - Not well understood.
BG10207 pdhA E - - Not well understood.
BG10273 odhB E - - Not well understood.
BG10410 pyrG E - - Not well understood.
BG11004 cmk E o 4 Not well understood.
BG11247 tkt E - - Not well understood.
BG11404 nrdE E - - Not well understood.
BG11405 nrdF E - - Not well understood.
BG11426 ymaA E - - Not well understood.
BG12644 pfkA E - - Not well understood.
Tableau 21. Comparaison des propositions d’AutoGPR aux interprétations expertes
des incohérences de B. subtilis. Les gènes incohérents sont classés par type
d’interprétation (les commentaires des auteurs sont repris en dernière colonne). Signification
des colonnes : ess, essentialité du gène (E essentiel, D non-essentiel) ; test, résultat du test
d’existence de correction GPR (o existence de correction) ; n, nombre de propositions
d’AutoGPR (ND proposition non réalisable).

187
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Nous avons pu classer les commentaires des auteurs en cinq catégories, selon que
l’interprétation se rattache à une des composantes du modèle (GPR, RESEAU et
BIOMASSE) ou non (« Autre interprétation » et « Pas d’interprétation précise »).

Toutes les interprétations liées à la composante GPR supposent ici l’existence

d’interactions régulatrices inhibant l’expression d’isozymes. Sur les cinq incohérences
de ce type, deux disposent d’une proposition d’AutoGPR correspondant correctement
à l’interprétation. Pour les trois cas ne correspondant pas (fbaA, yumC et trxB), les
réactions catalysées ne sont en fait elles-mêmes pas essentielles : une correction
purement GPR ne peut donc pas exister (aucune réaction essentielle à impacter par
ces gènes essentiels). Pour corriger ces incohérences selon les interprétations
avancées ici, il est nécessaire d’effectuer également des corrections aux composantes
RESEAU ou BIOMASSE afin de rendre ces réactions essentielles. Il est intéressant
de remarquer pour cet organisme aussi que l’ensemble des interprétations de type
GPR concernent des incohérences de gènes essentiels, corroborant la remarque faite
pour A. baylyi.

AutoGPR propose des corrections GPR pour une part significative des
incohérences interprétées comme liées aux composantes RESEAU et BIOMASSE.
Tous ces cas correspondent à des incohérences de gènes non-essentiels appartenant à
des complexes. Pour rendre ces gènes effectivement non-essentiels, AutoGPR
propose logiquement de transformer les relations de « complexes » en relations
d’« isozymes ». Cependant, l’examen des fonctions de ces gènes montre clairement
que ceux-ci ne peuvent se comporter comme des isozymes et forment réellement un
ensemble nécessitant leur présence conjointe. Si AutoGPR était contraint à ne pas
effectuer ce type de transformation pour ces complexes, aucune correction GPR
n’aurait alors été proposée. Ceci corrobore également une autre remarque faite ci-
dessus pour A. baylyi à propos de la correction de gènes non-essentiels.

En conclusion pour B. subtilis, la correspondance entre les interprétations et les

propositions d’AutoGPR est donc fortement altérée par ce comportement d’AutoGPR
sur les complexes. En revanche, les deux seules interprétations purement GPR (racE
et yumC) sont correctement détectées par AutoGPR.

188
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

S. cerevisiae

Avec des interprétations pour plus de 230 incohérences, le modèle S. cerevisiae

offre une perspective de confrontation avec les propositions d’AutoGPR plus large
que pour les modèles précédents. Cependant, les incompatibilités entre milieux font
qu’une seule incohérence dispose d’une correction GPR compatible simultanément
avec les phénotypes des huit milieux de S. cerevisiae. La présence de régulation, les
conditions expérimentales différentes entre les études et la possibilité d’erreurs dans
les composantes RESEAU et BIOMASSE peuvent expliquer ces incompatibilités.

Les auteurs n’ont cependant pas cherché à interpréter systématiquement les

incohérences sur tous les milieux à la fois. Nous avons donc plutôt confronté leurs
interprétations aux résultats des tests d’existence de correction GPR, valables pour
chaque milieu pris séparément. Le Tableau 22 présente les résultats de cette
confrontation regroupés par catégorie d’interprétation, tels que définis par les auteurs
eux-mêmes.

Catégorie d’interprétation cor. non cor. % cor.

Acc Accumulation d'intermédiaire toxique 0 6 0%
Bio Problème avec la constitution de la biomasse 1 41 2%
Den Impasse métabolique dans le modèle 0 8 0%
Dis Incohérence entre données expérimentales 2 12 14%
Iso Problème avec les associations GPR 10 9 53%
Med Problème dans la composition du milieu in 7 22 24%
silico
Mod Problème dans la structure du réseau 0 4 0%
métabolique
Oth Implication du gène dans des processus non 1 78 1%
métaboliques
Reg Régulation transcriptionnelle manquante 2 0 100%
Slo Croissance ralentie in silico 0 4 0%
Unk Cause de fausse prédiction inconnue 1 28 3%
Incohérence non présente dans l’article 0 1 0%
Tableau 22. Comparaison des types d’interprétation des incohérences de S. cerevisiae
aux tests d’existence de correction GPR. Rappel : ces tests ne vérifient l’existence de
correction GPR que sur chaque milieu pris séparément, les corrections n’étant pas
nécessairement compatibles entre les milieux. Signification des colonnes : cor, nombre
d’incohérences disposant (selon le test) d’une correction GPR sur chaque milieu ; non cor,
nombre d’incohérences ne disposant pas de correction GPR sur au moins un des milieux ;
% cor, part des incohérences disposant d’une correction GPR sur chaque milieu
(cor/(cor + non cor)). Les % en gras indiquent les cas où les incohérences disposant d’une
correction GPR sont majoritaires.

Les incohérences disposant d’après AutoGPR de corrections GPR sont

majoritaires dans les catégories Reg et Iso, et minoritaires (souvent largement) dans
toutes les autres. Les catégories Reg et Iso sont les seules à concerner explicitement la

189
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

composante GPR, les tests d’existences de correction GPR correspondent ainsi

globalement bien aux classes interprétations.

La catégorie Reg regroupe deux incohérences dues à des régulations. Toutes deux
ont été clairement interprétées comme dépendant de l’environnement : la première
implique une pyruvate kinase (CDC19 77) dont la seule isozyme (PYK2 78) est connue
pour être active uniquement pour de faibles flux glycolytiques, rendant CDC19
essentielle sur milieu glucose ; la seconde implique la réaction acetaldehyde
dehydrogenase dont seule une des cinq isozymes (ADH1 79) est a priori exprimée sur
milieu glucose, celui-ci réprimant l’expression des autres. AutoGPR identifie
correctement l’existence de correction sur les milieux glucose (ypd et ypd_ess).
Cependant, ces corrections sont incompatibles avec les autres milieux, car les
isozymes y « redeviennent » actives.

La catégorie Iso regroupe des interprétations liées aux GPR elles-mêmes, incluant
majoritairement l’ajout ou le retrait d’isozyme et la détection de sous-unité non-
essentielle dans un complexe. Sur les 19 incohérences classées dans cette catégorie,
10 disposent de corrections individuellement sur les milieux selon AutoGPR. Parmi
ces dernières 8 sont des incohérences de gènes essentiels et 2 de gènes non-essentiels,
corroborant ici aussi le biais constaté pour A. baylyi et S. cerevisiae. Les 9
incohérences ne disposant pas de corrections sont quant à elles équiréparties entre
gènes essentiels et non-essentiels.

Tous les autres types d’interprétations ne concernent pas la composante GPR ; il

est donc naturel que l’existence de correction selon AutoGPR y soit minoritaire. Dans
ces catégories, 12 incohérences disposent tout de même d’une correction GPR. 11
d’entre elles concernent des gènes non-essentiels. Ce résultat corrobore ici aussi un
constat effectué avec B. subtilis, selon lequel les propositions de correction pour les
gènes non-essentiels ont tendance à être moins réalistes que celles pour les gènes
essentiels.

77
Nom systématique : YAL038W
78
Nom systématique : YOR347C
79
Nom systématique : YOL086C

190
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

13 Limites et perspectives
En conclusion, le développement de la méthode AutoGPR nous a montré que,
exploitées de manière appropriée, les données d’essentialité pouvaient conduire par
des déductions logiques à proposer automatiquement des corrections aux relations
GPR. L’implémentation que nous avons retenue ici – déduction systématique de
toutes les GPR envisageables, à ensemble constant de gènes – nous a permis
d’illustrer l’intérêt et de montrer la faisabilité d’une telle méthode sur cinq modèles.
Nous avons cependant évoqué à plusieurs reprises l’existence de limites et de
faiblesses. Nous allons les reprendre ici et proposer des possibilités d’amélioration de
la méthode, ainsi que des perspectives d’utilisation plus large.

13.1 Réduction de la combinatoire des propositions de

correction
Lors de la génération des corrections GPR pour les cinq modèles, nous avions
constaté que le nombre de propositions pouvaient devenir particulièrement élevé, en
particulier lorsque les composantes connexes comptaient plusieurs gènes et réactions.
Cet effet, dû aux combinaisons des différents impacts possibles pour chaque délétion
de gène, s’avère particulièrement gênant. D’une part, il augmente le nombre de
propositions à considérer et, d’autre part, rend dans certains cas les déductions tout
bonnement impossibles.

Cependant, un examen plus approfondi des spécifications sur les GPR déduites
des scénarios d’impacts met en évidence des spécifications non-informatives qui
augmentent inutilement le nombre d’alternatives. La Figure 54 illustre cet effet sur
l’exemple que nous avions utilisé dans la partie théorique.

191
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

Figure 54. Simplification des spécifications issues des scénarios d’impact générés par
AutoGPR. Les différents scénarios proposent des spécifications alternatives pour R2 qui,
lorsqu’on considère tous les ensembles de spécifications simultanément, se simplifient. Seul
un ensemble de spécifications se déduit réellement des contraintes posées par les
essentialités et les supports de réactions.

Les quatre scénarios d’impact générés par AutoGPR se traduisent en quatre

ensembles alternatifs de spécifications sur R1 et R2. En examinant simultanément ces
quatre ensembles, il s’avère que les spécifications alternatives pour R2 décrivent en
réalité la totalité de ses comportements possibles. De ce fait, les quatre ensembles se
simplifient pour ne retenir que les spécifications sur R1, seules spécifications
réellement à l’œuvre. Lors de l’étape d’implémentation des GPR, ces spécifications
détermineront les GPR correctes pour R1, la GPR initiale de R2 pouvant être
conservée pour R2.

En incorporant directement ce type de simplification dans la partie spécification

de la méthode AutoGPR, le nombre de propositions « non-informatives » pourrait
alors se trouver largement réduit dans certains cas.

13.2 Amélioration de la spécificité pour les corrections de

gènes non-essentiels
Alors qu’AutoGPR détecte avec une relative bonne spécificité des corrections
GPR pour les gènes essentiels, nous avons relevé que la spécificité pour les gènes
non-essentiels est bien moins bonne. Comme déjà évoqué plus haut à propos du
modèle B. subtilis (voir 12.3.2), ceci est principalement dû au fait que les corrections

192
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

proposées par AutoGPR pour les gènes non-essentiels consistent à transformer des
sous-unités d’un complexe en isozymes, corrections relativement peu probables étant
donné l’attention particulière généralement portée à la construction des complexes.

La spécificité d’AutoGPR pourrait être améliorée en prenant en compte cette

information sur la fiabilité des complexes. Pour chaque complexe dont les interactions
entre sous-unités sont confirmées (ou lorsque la probabilité d’existence de
l’interaction dépasse un seuil de confiance), une méthode interdisant à AutoGPR de
remplacer la relation ET en relation OU entre les gènes permettrait d’éliminer ces cas
de fausse proposition.

13.3 Au delà des trois hypothèses fondamentales d’AutoGPR

Les trois hypothèses fondamentales sur lesquelles repose AutoGPR – associations
gènes-réactions connues, composantes RESEAU et BIOMASSE fixes, GPR
identiques sur tous les milieux – définissent précisément son champ d’action, mais, en
contrepartie, écartent d’autres types d’interprétations. Nous discuterons rapidement de
ces cas dans cette partie en proposant des pistes d’amélioration.

13.3.1 Associations gène-réaction prédéfinies

L’hypothèse d’associations gènes-réactions prédéfinies prive AutoGPR d’une part

significative des corrections réalisées dans la composante GPR, dans lesquelles de
nouveaux gènes sont ajoutés aux GPR.

La recherche de gènes candidats pouvant être nouvellement associés à des

réactions est un thème de recherche à part entière, qui sort du cadre d’AutoGPR. Un
grand nombre de méthodes, expérimentales et bioinformatiques, ont été proposées
pour identifier ces gènes – nous en avions évoqué quelques unes en introduction (voir
sections 1.4.1 et 1.4.2).

Ces méthodes pourraient être avantageusement combinées à AutoGPR pour d’une

part tenir compte de l’essentialité des gènes candidats et d’autre part définir la place
de ces nouveaux gènes dans les GPR des réactions qui leur sont associées. La Figure
55 ci-après illustre une manière d’intégrer AutoGPR avec ces approches. La
combinaison de ces approches avec AutoGPR serait d’autant plus bénéfique qu’elles
exploitent des données réellement complémentaires : AutoGPR ignore en effet

193
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

totalement les fonctions des gènes80 et la plupart des méthodes de recherche de gènes
candidats n’exploitent pas leur essentialité et prennent en considération leurs places
dans les réseaux métaboliques de manière très simple.

13.3.2 Composantes RESEAU et BIOMASSE fixes

L’hypothèse selon laquelle les composantes RESEAU et BIOMASSE sont

considérées correctes limite également la recherche de corrections par AutoGPR.
Nous avions ainsi vu pour B. subtilis que trois interprétations d’incohérence mettaient
en jeu des corrections GPR associées à des modifications des composantes RESEAU
et BIOMASSE (gènes fbaA, yumC et trxB, voir section 12.3.2). Les essentialités de
réactions étant initialement fausses et incompatibles avec les essentialités de gènes,
aucune correction GPR ne pouvaient être proposée par AutoGPR.

Dans ce cas également, AutoGPR peut être avantageusement associé à des

stratégies de correction des autres composantes (voir Figure 55).

Figure 55. Intégration de stratégies de correction des liens gènes-réactions et des

composantes RESEAU et BIOMASSE avec AutoGPR.

Suivant par exemple le constat qu’aucune correction GPR n’existe, ces stratégies
pourraient être mises en œuvre pour corriger les composantes RESEAU ou

80
sauf, indirectement, à travers les liens gènes-réactions prédéfinis ; mais ceux-ci ne
sont pas modifiés par AutoGPR.

194
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

BIOMASSE et modifier les essentialités de réactions. AutoGPR exploiterait alors ces

nouvelles essentialités afin de rechercher à nouveau des liens GPR compatibles.

Des interactions existent entre AutoGPR et ces stratégies de correction des autres
composantes. En effet, si aucune correction GPR n’existe pour une incohérence de
gène essentiel, cela signifie qu’il manque une ou un groupe de réactions essentielles à
associer au gène. Ce constat guide la recherche de corrections dans les autres
composantes : ces dernières doivent rendre essentiel au moins un groupe de réactions
parmi celles associées au gène pour qu’une correction GPR compatible soit ensuite
envisageable. Inversement, une incohérence de gène non-essentiel sans correction
GPR « demande » aux méthodes de correction des autres composantes à rendre non-
essentielle la réaction liée à ce gène.

13.3.3 GPR constantes sur tous les milieux

Enfin, l’hypothèse d’uniformité des GPR sur tous les milieux est mise à mal par la
présence de régulations modifiant l’expression des gènes en fonction des milieux.
Dans ces cas, AutoGPR ne peut souvent pas concilier les essentialités sur les
différents milieux, ces dernières étant influencées par les régulations (voir l’exemple
des régulations pour S. cerevisiae sur milieu glucose).

La méthode AutoGPR pourrait être étendue pour, dans un deuxième temps,

chercher à introduire les règles de régulation les plus probables permettant
d’expliquer les essentialités distinctes sur les milieux. Ces règles s’exprimant déjà
sous forme booléenne dans le cadre de modélisation rFBA (Covert et al. 2001), elles
pourraient bénéficier du cadre de raisonnement logique mis en place dans AutoGPR.
Ce type de raisonnement a déjà été effectué manuellement pour corriger les
interactions de régulation d’un modèle d’E. coli à l’aide de données phénotypiques
(Covert et al. 2004).

13.4 Perspectives d’utilisation des délétions multiples

Bien que nous n’ayons ici appliqué AutoGPR qu’à des phénotypes de délétions
simples de gènes, AutoGPR peut théoriquement prendre en compte les essentialités de
n’importe quels groupes de gènes inclus dans le modèle. La disponibilité de
phénotypes de délétions multiples contribuerait d’ailleurs avantageusement à
l’efficacité d’AutoGPR. D’une part, ces essentialités ajouteraient des spécifications

195
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

supplémentaires aux GPR, réduisant de ce fait le nombre de propositions et, d’autre

part, l’utilisation de délétions multiples permet de perturber et ainsi d’étudier un plus
grand nombre de fonctions biologiques, comme constaté dans des études explorant ce
sujet (Deutscher et al. 2006; Behre et al. 2007; Deutscher et al. 2008).

Toutefois, le nombre de combinaisons de délétions multiples augmente

exponentiellement avec leur taille, rendant extrêmement lourde la génération
exhaustive de tels ensembles de données. AutoGPR pourrait être exploité afin de
proposer les délétions multiples les plus intéressantes à réaliser dans le cadre de la
recherche de GPR. En effet, les grands nombres de propositions de corrections
proposées par AutoGPR pourraient être significativement réduits en incluant des
résultats de phénotypes de délétions multiples bien choisies. Ces dernières pourraient
par exemple être sélectionnées selon un critère évaluant l’intérêt des spécifications
qu’elles apporteraient.

196
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

14 Contributions principales
Le principal objectif de cette thèse aura été de montrer que les capacités
d’analyses des modèles mathématiques du métabolisme pouvaient être
avantageusement mises à profit pour élucider le métabolisme des microorganismes.
Plus spécifiquement, cette thèse se sera concentrée sur un type de modèles – les
modèles globaux du métabolisme – et leur aptitude à exploiter une catégorie de
données expérimentales auparavant difficilement interprétable à la lumière du
métabolisme – les phénotypes de croissance. Elle se sera appuyée pour cela sur
l’organisme Acinetobacter baylyi ADP1, dont nous aurons reconstruit puis corrigé le
modèle métabolique à l’aide des phénotypes de croissance de ses mutants. Nous
allons reprendre ici succinctement les principales conclusions de nos travaux pour en
souligner nos contributions.

Dans un premier temps, nous avons abordé le problème de la reconstruction des

modèles globaux à partir de la connaissance des voies métaboliques, cette
connaissance étant pour la majorité des microorganismes principalement déduite de
l’annotation de leurs génomes. Ces reconstructions s’effectuent en deux étapes : (1)
l’identification des activités du réseau métabolique et (2) l’adaptation du réseau au
formalisme mathématique. Sur l’exemple d’A. baylyi, nous avons proposé un
processus complet de reconstruction. Nous nous sommes largement appuyés sur les
outils logiciels existants pour effectuer la première étape. Notre principale
contribution à cette étape aura été de souligner l’importance de combiner diverses

197
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

sources d’informations et de prendre en compte les niveaux de confiance des activités

identifiées. Les points difficiles de la deuxième étape étant moins clairement
maîtrisés, nous en avons décris les principaux et proposé pour une partie d’entre eux
des analyses et méthodes de résolution originales: la prise en compte de la
conservation de l’énergie, la génération de métabolites spécifiques et la recherche de
complexes enzymatiques. Enfin, nous avons réalisé l’ensemble de ce processus de
reconstruction pour A. baylyi, résultant en un modèle de son métabolisme complet
permettant d’effectuer des prédictions quantitatives de croissance.

La deuxième partie de nos travaux a été consacrée à l’exploitation des phénotypes

de croissance par les modèles globaux. Dans la lignée de travaux précédents pour
quelques autres organismes, nous avons confronté phénotypes prédits et phénotypes
expérimentaux d’A. baylyi afin d’évaluer la cohérence du modèle avec ces
observations expérimentales et de proposer, le cas échéant, des corrections au modèle.
Ce travail pour A. baylyi nous a conduit à réaliser un nombre substantiel
d’amélioration au modèle initialement reconstruit et de déduire à partir des
phénotypes de nouvelles informations sur son fonctionnement métabolique. Du point
de vue méthodologique, nous avons introduit une distinction formelle simple entre
différentes composantes des modèles métaboliques globaux – composantes GPR,
RESEAU et BIOMASSE – dont le découplage permet de rechercher indépendamment
des corrections. Du point de vue logiciel, nous avons participé au développement de
NemoStudio et CycSim, deux interfaces web facilitant la prédiction de phénotypes de
croissance, leur confrontation aux observations expérimentales et leur interprétation à
la lumière des voies métaboliques.

Enfin, la dernière partie de nos travaux s’est concentrée sur la formalisation de la

recherche de corrections pour la composante GPR. Nous avons ainsi participé au
développement d’une méthode – AutoGPR – déduisant automatiquement l’ensemble
des corrections GPR qui lèvent les incohérences des prédictions de phénotypes. Afin
de montrer la pertinence d’une telle méthode, nous l’avons appliquée à la recherche
de corrections pour cinq modèles métaboliques distincts et comparé ses propositions
aux interprétations expertes des incohérences. Dans un dernier temps, nous avons
répertorié les principales limites de cette méthode et proposé des améliorations

198
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

permettant de les surmonter et d’intégrer AutoGPR avec des stratégies de corrections

des autres composantes des modèles.

15 Revue de travaux sur le même sujet effectués sur

la période de la thèse (2005–2009)
Le thème de recherche de nos travaux s’est révélé être extrêmement actif durant
les années de notre thèse. Des avancées sont ainsi venues progressivement compléter
l’état de l’art présenté en introduction de ce manuscrit. Afin de situer nos travaux dans
leur contexte actuel et d’en présenter de manière plus complète les perspectives, nous
effectuerons dans cette section un rapide tour d’horizon des travaux publiés entre fin
2005 et début 2009, et liés à la reconstruction des modèles et l’exploitation des
phénotypes de croissance81.

Initialement réalisées seulement par un nombre réduit d’équipes de recherche, les

reconstructions de modèles métaboliques ont rapidement gagné en popularité à partir
de fin 2005, impliquant aujourd’hui plus d’une dizaine d’équipes. Le nombre de
nouveaux modèles publiés chaque année a lui aussi augmenté significativement,
passant de 4 modèles publiés en 2006 à une quinzaine en 2008, et déjà une dizaine
pour le premier semestre de 200982. Parmi ces reconstructions, une proportion
toujours plus large utilise les données expérimentales de phénotypes de croissance
pour évaluer la qualité du modèle et éventuellement le compléter. C’est le cas
notamment des modèles d’E. coli (Joyce et al. 2006), B. subtilis (Oh et al. 2007;
Henry et al. 2009), Pseudomonas aeruginosa (Oberhardt et al. 2008) et Pseudomonas
putida (Pucha#ka et al. 2008), Mycoplasma genitalium (Suthers et al. 2009),
Geobacter sulfurreducens (Segura et al. 2008), et S. cerevisiae (Snitkin et al. 2008).

Cette hausse du nombre de reconstructions s’est accompagnée du développement

d’outils facilitant la transformation d’un réseau métabolique en un modèle
mathématique. Tout d’abord, la base de données métabolique MetaCyc s’est

81
Nous nous excusons auprès des lecteurs des quelques répétitions avec la revue sur
les modèles métaboliques incluse en introduction.
82
Un tableau disponible à l’adresse
http://gcrg.ucsd.edu/In_Silico_Organisms/Other_Organisms cherche à répertorier les
modèles métaboliques globaux.

199
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

progressivement adaptée aux contraintes posées par la modélisation : les

compartiments cellulaires sont désormais pris en compte et des efforts de curation ont
été réalisés pour équilibrer systématiquement toutes les réactions83. Des méthodes de
reconstruction spécifiquement adaptées aux modèles à base de contraintes ont
également vu le jour (Feist et al. 2009; Durot et al. 2009). Celle développée par
exemple par DeJongh et al (2007) reconstruit progressivement les modèles en
assemblant des « sous-modèles » des fonctions métaboliques représentées dans la
base de données SEED et dont le bon fonctionnement est vérifié isolément. D’autres
méthodes ont été développées pour corriger des aspects spécifiques aux modèles.
Ainsi, Kumar et al (2007) ont proposé les méthodes GapFill et GapFind pour détecter
et combler les impasses dans les voies métaboliques, Kümmel et al (2006b) ont
introduit des règles pour établir la réversibilité des réactions, et Gevorgyan et al
(2008) ont élaboré un algorithme pour détecter les incohérences de stœchiométrie
entre réactions sans recourir aux formules chimiques des métabolites.

S’agissant de la prédiction des phénotypes de croissance, quelques nouvelles

méthodes ont également été introduites. Kaleta et al (2008) ont par exemple exploité
la notion d’organisation chimique84 pour prédire les phénotypes de croissance de
modèles intégrant métabolisme et régulation. Whelan & King (2008) ont pour leur
part développé un modèle logique du métabolisme de S. cerevisiae dans le but
d’exploiter des techniques d’inférence logique afin d’améliorer le modèle à partir de
données de phénotypes. Plusieurs méthodes ont également été proposées pour prédire
à grande échelle les environnements de croissance d’organismes à partir de leurs
réseaux métaboliques ; c’est le cas des travaux de Borenstein et al (2008) et de
Handorf et al (2008) à l’aide de graphes métaboliques, et d’Imielinski et al (2006) à
partir des modèles à base de contraintes. Parallèlement, la recherche des ensembles
essentiels minimaux de gènes a motivé plusieurs projets distincts. Klamt et al (2004)
avaient ainsi développé une méthode basée sur les modes élémentaires pour

83
Voir les améliorations apportées à MetaCyc à l’adresse suivante :
http://metacyc.org/release-notes.shtml
84
Une organisation chimique est un ensemble de métabolite ayant les propriétés de
clôture (aucun métabolite extérieur à l’ensemble ne peut être produit par une réaction
à partir de métabolites de l’organisation chimique) et d’autosuffisance (chaque
métabolite consommé dans l’organisation peut être recréé à partir d’autres métabolites
de l’organisation à une vitesse suffisante pour assurer sa présence).

200
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

déterminer exhaustivement les ensembles minimaux de gènes essentiels (appelés

Minimal Cut Sets), Cette méthode et une exploration systématique étant trop
complexes pour être appliquées aux modèles métaboliques d’échelle globale,
Deutscher et al (2006) et Imielinski & Belta (2008) ont exploré les ensembles
essentiels de gènes en développant des méthodes applicables à cette échelle, basées
respectivement sur un échantillonnage des ensembles essentiels et des modes
élémentaires partiels. Behre et al (2007) ont quand à eux introduit une mesure
quantitative de la robustesse aux délétions multiples permettant d’évaluer de manière
plus complète85 la robustesse d’un réseau aux perturbations génétiques. Enfin,
Deutscher et (2008) ont élaboré un indicateur basé sur la théorie des jeux permettant
d’exploiter les phénotypes de perturbations génétiques multiples pour quantifier la
contribution d’un gène à la réalisation de fonction biologiques.

Dans le même esprit qu’AutoGPR ont été proposées des méthodes de corrections
automatiques des modèles permettant de résoudre les prédictions incohérentes de
phénotypes de croissances. Reed, Patel et al (2006) ont ainsi développé un algorithme
recherchant le nombre minimal de réactions à ajouter à un modèle pour lui permettre
de prédire la croissance sur un environnement particulier. Kumar & Maranas (2009)
ont quant à eux élaboré la méthode GrowMatch qui vise à réconcilier prédictions et
observations d’essentialités de gènes en modifiant principalement la composante
RESEAU des modèles (ajout/suppression de réactions, changement de leurs
réversibilités). Cette dernière méthode complèterait de manière appropriée AutoGPR
pour élaborer des corrections plus complètes des modèles.

Enfin, il est intéressant de signaler une initiative visant à automatiser entièrement

la recherche des gènes des activités orphelines par des approches génétiques (King et
al. 2009). En se basant sur le modèle logique du métabolisme de S. cerevisiae
mentionné plus haut (Whelan & King 2008), King et al ont implémenté une méthode
qui, pour chaque activité orpheline, (1) sélectionne des gènes candidats, (2) infère les
expériences de génétique (délétions de gènes, environnement) à réaliser pour
identifier le bon candidat, (3) effectue automatiquement les expériences à l’aide d’un
robot, et (4) conclut à partir des phénotypes observés expérimentalement. Ce

85
par rapport aux délétions uniquement simples.

201
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

processus, appliqué à la recherche des gènes de 13 activités orphelines, a permis

d’identifier 20 candidats dont les fonctions ont été confirmées pour une partie d’entre
eux par des tests biochimiques directs ou des recherches dans la littérature.

16 Perspectives
Nous conclurons ce manuscrit en évoquant quelques perspectives ouvertes par
l’amélioration de la reconstruction des modèles et de leur capacité à intégrer des
données expérimentales.

Il semble en effet que la reconstruction des réseaux métaboliques devienne une

extension naturelle de l’annotation des génomes. L’essor des outils de reconstruction
et des bases de données métaboliques (notamment BioCyc et KEGG) témoignent de
cette tendance. De même, les plateformes d’annotation actuelles86 évoluent
progressivement afin de replacer les fonctions des gènes dans le contexte de processus
biologiques complets – à l’instar des sous-systèmes définis dans SEED (Overbeek et
al. 2005). Ces plateformes reconstruisent désormais systématiquement les réseaux
métaboliques correspondant à chaque génome (souvent à l’aide de KEGG ou BioCyc)
et cherchent à en exploiter la vision par voies métaboliques pour préciser les fonctions
des gènes et compléter les annotations. Ces plateformes se limitent pour le moment à
capturer les annotations expertes de la fonction des gènes ; il est probable que ces
outils évolueront pour prendre en compte des informations expertes sur les voies
métaboliques elles-mêmes, comme cela est déjà proposé aux curateurs des bases de
données BioCyc (Caspi et al. 2008).

Les modèles métaboliques peuvent également prétendre à devenir des

compléments systématiques à l’annotation des génomes. En effet, les méthodes
introduites dans cette thèse et, plus largement, les travaux portant sur la reconstruction
des modèles vont vraisemblablement réussir à lever les contraintes liées au
formalisme mathématique, qui entravent actuellement la création d’un modèle à partir
d’un réseau métabolique. De plus, comme suggéré dans cette thèse pour les
phénotypes de croissance, l’aptitude des modèles à exploiter des données

86
Notamment MaGe (Vallenet et al. 2006), IMG (Markowitz et al. 2009) ou SEED
(Aziz et al. 2008).

202
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

expérimentales de diverses natures va très certainement promouvoir leur utilisation

pour élucider le métabolisme des organismes et compléter l’annotation de leurs
génomes. Cet argumentaire est à la base de Microme, un projet européen devant
débuter fin 2009 dans lequel le Genoscope est impliqué. L’objectif de Microme sera
de fournir des méthodes et des infrastructures logicielles pour reconstruire
automatiquement et effectuer la curation experte des réseaux et modèles métaboliques
d’organismes procaryotes. Microme intègrera notamment des méthodes de
confrontations des modèles aux données expérimentales qui suggèreront des pistes de
curation aux experts.

La mise en place d’infrastructures du type envisagé par Microme ouvre alors la

voie à la reconstruction en grand nombre de modèles métaboliques, offrant de
nouvelles perspectives à la communauté scientifique.

Tout d’abord, la disponibilité de modèles métaboliques pour un grand nombre

d’organismes distribués sur l’arbre de la vie fournirait de nouveaux outils pour étudier
l’évolution des organismes, notamment procaryotes. Les modèles relient en effet
directement les gènes à leurs rôles dans le métabolisme, permettant d’étudier en retour
les contraintes posées par le métabolisme sur l’évolution des gènes. Quelques travaux
ont déjà été réalisés dans cet esprit sur un nombre limité d’organismes (Pál et al.
2005; Pál et al. 2006), mais l’utilisation de modèles en plus grand nombre permettra
très certainement d’élargir leur champ d’applications dans ce domaine.

Ensuite, des modèles systématiquement reconstruits sont autant d’outils à la

disposition de la communauté scientifique pour interpréter les grands ensembles de
données expérimentales. Les progrès techniques offrent aux expérimentateurs la
possibilité de mesurer à grande échelle une large variété de grandeurs liées aux entités
biologiques : par exemple les concentrations métaboliques, flux de réactions
métaboliques, expressions de gènes, concentrations de protéines et, au niveau
macroscopique, phénotypes de croissance. Cependant, il s’avère que ces ensembles de
données ne peuvent prendre tout leurs sens que lorsqu’ils sont interprétés à la lumière
du fonctionnement biochimique réel de la cellule. Les modèles permettent justement
d’intégrer ces données et de les mettre en regard du fonctionnement métabolique
modélisé. En disposant de modèles métaboliques pour un grand nombre
d’organismes, les logiciels implémentant les méthodes d’intégration de données, telle

203
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

que CycSim pour les phénotypes de croissance, constitueraient des outils bienvenus
pour interpréter ces données.

Enfin, l’ingénierie du métabolisme est un autre domaine susceptible de bénéficier

de la disponibilité de nombreux modèles. Ces ensembles de modèles constitueraient
en effet de véritables répertoires virtuels d’organismes et de voies métaboliques,
permettant de réaliser et de tester in silico un grand nombre de « constructions
métaboliques », avant même toute expérience en laboratoire. Ils pourraient
notamment être employés pour (1) sélectionner les organismes aux caractéristiques
métaboliques les plus adaptés à l’objectif métabolique, (2) prédire les performances
théoriques de modifications métaboliques envisagées ou (3) suggérer
automatiquement des modifications métaboliques répondant à un objectif, constituant
de ce fait une véritable boîte à outils numérique à la disposition des ingénieurs du
métabolisme.

204
Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

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Maxime DUROT Thèse de doctorat 2009

ANNEXE

Nous plaçons en annexes deux articles supplémentaires auxquels nous avons

contribués. Le premier présente l’interface web CycSim de prédiction des phénotypes
de croissance de mutants pour plusieurs organismes, le second est une revue des
approches de biologie systémique appliquées à l’exploration du métabolisme
d’A. baylyi.

Le Fèvre, F., Smidtas, S., Combe, C., Durot, M., d'Alché-Buc, F. & Schachter, V.,
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227
 BIOINFORMATICS APPLICATIONS NOTE
Vol. 25 no. 15 2009, pages 1987–1988
doi:10.1093/bioinformatics/btp268

Systems biology

CycSim—an online tool for exploring and experimenting with

genome-scale metabolic models
F. Le Fèvre1 , S. Smidtas1 , C. Combe1,2 , M. Durot1 , Florence d’Alché-Buc2
and V. Schachter1,∗
1 CEA, DSV, IG, Genoscope, UMR 8030, Evry, F-91057 and 2 IBISC, FRE 3190 CNRS, Université d’Evry, Evry, France
Received on October 7, 2008; revised on March 20, 2009; accepted on April 17, 2009
Advance Access publication May 6, 2009
Associate Editor: Thomas Lengauer

ABSTRACT descriptive and queriable views of the genetic and biochemical

Summary: CycSim is a web application dedicated to in silico components of metabolism, but do not support modelling, simulation
experiments with genome-scale metabolic models coupled to the or prediction.
exploration of knowledge from BioCyc and KEGG. Specifically, To address these shortcomings, we introduce CycSim, a web
CycSim supports the design of knockout experiments: simulation of platform which supports in silico experiments with a variety of
growth phenotypes of single or multiple gene deletions mutants on metabolic models, puts both the design and the results of these
specified media, comparison of these predictions with experimental experiments in the visual context of reference pathways databases
phenotypes and direct visualization of both on metabolic maps. The and allows confrontation with experimental data.
web interface is designed for simplicity, putting constraint-based
modelling techniques within easier reach of biologists. CycSim also
functions as an online repository of genome-scale metabolic models. 2 FUNCTIONALITIES
Availability: http://www.genoscope.cns.fr/cycsim Predictions: CycSim supports in silico experiments with metabolic
Contact: [email protected] models. Each experiment consists in selecting a wild-type strain,
choosing one or several genetic perturbations (e.g. knockout), and
picking a set of growth media. Growth phenotype predictions are
1 INTRODUCTION then generated for all (mutant, medium) pairs. These predictions
Constraint-based modelling (Price et al., 2004) is a framework, can be compared against experimental growth phenotypes when
simple and abstract enough to allow tractable modelling of available (Fig. 1). Two prediction methods are implemented: flux
metabolism at genome-scale, providing direct insights into the balance analysis and metabolites producibility check (Feist and
genotype–phenotype relationship. Constraint-based models (CBM) Palsson, 2008). For any given (mutant, medium) pair, CycSim can
consist of a stoichiometric representation of the whole-cell also compute a flux distribution that is compatible with the model
metabolism together with a set of constraints on reaction fluxes. constraints and the objective function.
A wide variety of computational methods have been developed Visualisation: reactions, pathways and genes can be visualized in
for this framework to characterize metabolic capabilities, help to their context through a tight coupling of the CycSim core with the
discover new reactions, simulate scenarios of metabolic evolution or pathway display layers of BioCyc and KEGG. For instance, clicking
design experimental strategies to investigate metabolic behaviours on a reaction in the simulation panel will show the corresponding
(Feist and Palsson, 2008). BioCyc reaction page augmented with information from the active
A few simulation tools (Becker et al., 2007; Beste et al., 2007; model (i.e. balanced reaction equations or the Boolean gene-reaction
Lee et al., 2003; Sympheny, www.genomatica.com) and model correspondence). Conversely, a gene can be deleted from the
repositories (Le Novère et al., 2006; BiGG, unpublished data, current model by selecting it from a pathway map. Predictions and
http://bigg.ucsd.edu) have been proposed to the growing community experimental results can be directly visualized and compared on
of CBM users. These software tools have been limited in their pathways.
usefulness to biologists for several reasons. First, most are either Model and data repository: the online CycSim repository stores
commercial, or add-ons to commercial platforms (e.g. MATLAB, information relative to three organisms: Escherichia coli (Feist
http://www.mathworks.com). Next, they are typically directed at et al., 2007), Saccharomyces cerevisae (Duarte et al., 2004)
users with a background in modelling. Lastly, these tools are and Acinetobacter baylyi ADP1 (Durot et al., 2008). For each,
not designed to explore the biochemical and genomic knowledge CycSim includes (i) a genome-scale metabolic model; (ii) a
underlying the metabolic models. Currently, the most convenient detailed correspondence between that model and relevant data of
tools to reconstruct metabolic networks from genome annotation that organism [EcoCyc, (Karp et al., 2007); YeastCyc (Christie
are databases of reference pathways such as BioCyc (Karp et al., et al., 2004); and AcinetoCyc (Durot et al., 2008)]; (iii) a set of
2005) and KEGG (Kanehisa et al., 2008). These databases provide media definitions; and (iv) experimental growth phenotype datasets.
Altogether, CycSim includes 2800 genes, 3700 reactions, 1400
∗ To whom correspondence should be addressed. metabolites, 190 media, 20 000 experimental phenotypes and 550

© 2009 The Author(s)

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/
by-nc/2.0/uk/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

[11:56 3/7/2009 Bioinformatics-btp268.tex] Page: 1987 1987–1988

 F.Le Fèvre et al.

Fig. 1. CycSim screenshots. From the analysis of growth phenotypes of multiple mutants on multiple media (left), a flux distribution can be computed and
visualized directly on relevant pathways (right).

pathways. Any of these four data types can be submitted online, Funding: European FP6 Networks of Excellence BioSapiens
using for models the SBML format, enhanced with MIRIAM (LSHG-CT-2003-503265); ENFIN (LSHG-CT-2005-518254).
annotations (Finney and Hucka, 2003; Le Novère et al., 2005).
Conflict of Interest: none declared.

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