Partie 2: Techniques

chromatographiques
Partie 2: Techniques chromatographiques
1- Principes de Base et Théorie
2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)

2
 1- Principes de Base et Théorie
 Définition
La chromatographie est une méthode de séparation et d'analyse
des composants d'un mélange, basée sur leur distribution
différentielle entre une phase stationnaire (solide ou liquide fixe) et
une phase mobile (liquide ou gaz).

Chromatographie sur colonne

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 1- Principes de Base et Théorie
 Chromatographie sur colonne
La chromatographie, dans ses débuts, utilisait des colonnes en
verre où un échantillon était d'abord placé dans une colonne en
verre (exemple: séparation des pigments végétaux), suivie de l'ajout
d'un éluant (la phase mobile) qui traversait une phase stationnaire
solide ou en gel (silice, alumine, gel de silice) dans la colonne. La
séparation des constituants de l'échantillon se produisait grâce à
leurs interactions variées avec la phase stationnaire, sous
l'influence de la gravité.

Chromatographie sur colonne

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 1- Principes de Base et Théorie
 Chromatographie haute pression

Pour améliorer l'efficacité et le débit de séparation, des

méthodes utilisant une pression plus élevée ont été
introduites, aboutissant à la Chromatographie Liquide PC pour
l'acquisition
Haute Performance (HPLC), caractérisée par l'emploi de de données

colonnes plus petites et l'application de hautes pressions, Colonne HPLC

permettant une séparation plus rapide et plus précise. Injecteur

Solvant Pompe Détecteur Déchets

Colonnes HPLC

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1- Principes de Base et Théorie
 Historique
Début de la Chromatographie (1903): Mikhail Tsvet a initié la chromatographie sur colonne pour
séparer les pigments végétaux.

Développement de la Chromatographie de Partage (Milieu du 20e siècle): Martin et Synge ont

développé cette technique, base de l'HPLC et de la GC.

Invention de la Chromatographie Gazeuse: Par Anthony T. James et Archer J.P. Martin, utilisant la
chromatographie de partage.

Premier Chromatographe en Phase Gazeuse (1947): Développé par Erika Cremer et Fritz Prior,
utilisant un gaz porteur et une colonne de gel de silice.

Évolution des Colonnes de GC: Passage de colonnes remplies à des colonnes capillaires pour une
meilleure résolution.

Amélioration Continue: Les techniques et matériaux des colonnes ont constamment évolué, des
premières colonnes en verre aux colonnes capillaires modernes.

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 1- Principes de Base et Théorie
La bande d'échantillon
 Terminologie injecté (apparaît comme
"Noir") (mélange du Bleu,
Rouge et Jaune)
Phase Stationnaire (PS) : Matériau solide ou liquide sur lequel les
composants du mélange sont adsorbés ou retenus. Temps zéro
Phase mobile

Phase Mobile (PM) : Liquide ou gaz qui traverse la phase stationnaire Bandes d'analytes séparés

et entraîne les composants du mélange. Temps +10 minutes

Phase mobile

Colonne Chromatographique : Tube contenant la phase

stationnaire, à travers lequel passe la phase mobile.

Élution : Processus de passage de la phase mobile à travers la

colonne, entraînant avec elle les composants séparés.

Éluant : Solvant ou mélange de solvants composant la phase mobile.

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 1- Principes de Base et Théorie
 Terminologie
Chromatogramme : Graphique représentant la
concentration des composants élués en fonction du temps ou
du volume de phase mobile passée à travers la colonne.

Pic Chromatographique : Représentation graphique de la

détection d'un composé lorsqu'il est élué de la colonne (la
variation de la concentration en sortie de colonne en fonction
du temps).

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 1- Principes de Base et Théorie
 Terminologie
Temps de Rétention (tR) : Temps écoulé entre l'injection de l'échantillon et l'apparition d'un pic sur le
chromatogramme.

Temps mort (tM) : Temps pris par la phase mobile pour traverser la colonne. Un constituant non
retenu sort de la colonne au temps tM .

Facteur de capacité ou de Rétention (k') : Utilisé pour décrire le taux de migration de l'analyte dans
une colonne. Le facteur de rétention pour l'analyte A est défini comme : k'A = tR - tM / tM

k' 1 → Elution est si rapide qu'une détermination précise du temps de rétention est très difficile
k' élevés (supérieurs à 20) → Elution prend beaucoup de temps
1  k ' 10 → L’idéal
Facteur de sélectivité α: Décrit la séparation de deux espèces (A et B) sur la
colonne (Capacité de la phase stationnaire à préférer un composé par rapport
à un autre) : α = k'B / k'A
Lors du calcul du facteur de sélectivité, l'espèce A s'élue plus rapidement que
l'espèce B. Le facteur de sélectivité est toujours supérieur à un. tM tR A tR B
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 1- Principes de Base et Théorie
Wh

 Terminologie
Facteur de résolution: Permet de définir la qualité de la séparation Temps (min)
Wb
de deux pics consécutifs sur un chromatogramme.
tM : temps mort
tR : temps de rétention (d'élution) d'un composé
Wb : largeur du pic à la base (ω)
Wh : largeur du pic à mi-hauteur (δ)

R doit être supérieur à 1,5

https://www.youtube.com/watch?v=o-GYFTD8F1M&list=PLmRpOX9aPBrLcKidp3cy4D29w5RTnkde4&index=5 10
 1- Principes de Base et Théorie Molécules de soluté

 Terminologie PS PM
Efficacité de la Colonne : Déterminée par le nombre de plateaux
théoriques (N) requis pour permettre l'élution totale de la quantité
initiale de soluté. Cette efficacité est souvent exprimée en termes de Colonne
Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique (H).

Selon la théorie des plateaux, une colonne chromatographique est

composée d'une série de couches horizontales appelées "plateaux
théoriques".
Détecteur
Les molécules de soluté sont équilibrées entre la phase stationnaire
N = L/H
et la phase mobile à chacun de ces plateaux.
N: nombre de plateaux théoriques: 100-106
On considère ensuite que la migration du soluté se fait par une série L: longueur de la colonne
de transferts étape par étape d'un plateau au plateau H: Hauteur Equivalente à un Plateau
immédiatement inférieur. Théorique (HEPT): 1cm - 10 µm

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 1- Principes de Base et Théorie
 Terminologie
Efficacité de la Colonne :

Une colonne sera d’autant plus efficace que N est grand et H est petit.

H = L/N

Minimisation de H (Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique) :

1. Réduction du Diamètre des Particules du Support : En chromatographie, utiliser des particules de
support plus petites peut effectivement réduire H, améliorant ainsi l'efficacité de la colonne.
2. Modification de la Température en CPG : En chromatographie en phase gazeuse, la température
joue un rôle clé. Cependant, la relation entre la température et H n'est pas directe; l'effet de la
température dépend des caractéristiques spécifiques de l'analyte et de la phase stationnaire.
3. Réduction de l’Épaisseur du Film Liquide en HPLC : En chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC), réduire l'épaisseur du film de la phase stationnaire liquide peut diminuer H et
augmenter la résolution.
4. Optimisation de la Vitesse d'Écoulement de la Phase Mobile : Ajuster la vitesse d'écoulement de la
phase mobile est une autre méthode pour optimiser la performance de la colonne chromatographique.
Une vitesse trop rapide ou trop lente peut affecter la résolution et l'efficacité de la séparation.
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https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=-O2C6B1ghIA
 1- Principes de Base et Théorie
 Terminologie
Efficacité de la Colonne : N = L/H

https://www.youtube.com/watch?v=_ZPgkLQPuKI https://www.youtube.com/watch?v=vFENzNj6Jq4&list=PLmRpOX9aPBrLc 13
Kidp3cy4D29w5RTnkde4&index=4
 1- Principes de Base et Théorie
 Classification des méthodes chromatographiques
Classification selon la nature de la phase mobile (PM):
1- Chromatographie en phase liquide (CL) : Phase mobile est un LIQUIDE
Chromatographie liquide-solide ou d’adsorption (CLS): La phase stationnaire est solide (poreuse avec de petites
particules) tenue dans une colonne ou étalée sur une plaque.
Chromatographie liquide-liquide ou de partage (CLL): La phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un support
solide inerte : soit imprégnée dans un solide poreux (risques de lessivage),
soit greffée sur le solide par des liaisons covalentes (la seule utilisée).

2- Chromatographie en phase gazeuse (CG) : Phase mobile est un GAZ

Chromatographie gaz-solide ou d’adsorption (CGS): La phase stationnaire est formée de particules solides.
Chromatographie gaz-liquide ou de partage (CGL): La phase stationnaire est un liquide maintenu comme une
couche mince sur un support solide poreux.
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 1- Principes de Base et Théorie
 Classification des méthodes chromatographiques
Classification selon le mécanisme de séparation chromatographique (attachement à la PS):

Chromatographie par adsorption: Chromatographie de partage:

Séparation basée sur l'adsorption des Séparation basée sur le partage des
produits chimiques à la surface d'un produits chimiques dans une couche
support. de la phase stationnaire.

Chromatographie d'échange d'ions: Chromatographie d'exclusion de taille:

Séparation des ions basée sur leur Séparation des produits chimiques basée
liaison aux charges fixes sur un sur leur taille et leur capacité à entrer
support. dans un support poreux.

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 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.

En HPLC:
- Le principe de la chromatographie de partage en HPLC implique l'équilibre de
partage d'un soluté (analyte) entre la phase mobile et la phase stationnaire. La
rétention du soluté est déterminée par son degré de passage entre ces deux
phases. L'efficacité de la séparation est basée sur le coefficient de
distribution ou de partage K des solutés entre la phase stationnaire et la
phase mobile.

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 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.

En HPLC:
- La phase stationnaire est un film liquide déposée
sur la surface d’un support solide, généralement
des particules de silice poreuses. Pour éviter la
Soluté dissous dans la
solubilité partielle de la phase stationnaire dans la
phase liquide déposée
phase mobile, elle est liée de manière covalente
sur la surface du
aux particules de silice (phase greffée).
support solide

On distingue deux types: phase normale et phase inverse

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 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.
Gel de silice greffée
En HPLC:
- La phase normale Cyanopropyl
Gel de silice greffée: on utilise des phases
stationnaires polaires : phases greffées
(aminopropyl plus polaire que cyanopropyl) et des Phases
phases mobiles apolaires pour séparer des composés
polaires
polaires et moyennement polaires. Aminopropyl
normale

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 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.

En HPLC:
- La phase normale
On utilise en général un mélange de solvants: solvant
apolaire (hexane, heptane…) + un solvant peu polaire
(dichlorométhane, trichlorométhane …) appelé modificateur
polaire (MP).

Lorsque la polarité du mélange augmente, la force éluante

augmente et le facteur de capacité (k’) diminue;
Plus le soluté est polaire, plus son tR et son k’ sont élevés.

Les solutés moins polaires sont élués en premier.

Pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC
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 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.

En HPLC: Gel de silice greffée

- La phase inverse
La phase inverse est majoritairement composée de silice
greffées par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de
carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et C18
Phase à
nécessite donc un éluant polaire (acétonitrile: ACN,
méthanol: MeOH, H2O). Dans ce cas, ce sont les polarité
composés polaires qui seront élués en premier. inversée

Les solutés plus polaires sont élués en premier.

20
 1- Principes de Base et Théorie
 La chromatographie de partage
La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque
technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon.

En CG:
- Dans la CG, la phase mobile est un gaz (comme l'hélium) et la phase stationnaire est un liquide à point d'ébullition
élevé greffée sur un solide. La vitesse de déplacement d'un composé dépend de son temps passé dans la phase
gazeuse par rapport à son temps attaché à la phase liquide.

- Le processus de partage se produit lorsqu'une substance se répartit entre deux solvants non miscibles. Dans la CG,
une molécule passe une partie de son temps dissoute dans la phase liquide et une autre partie transportée avec le
gaz.

- Le temps de rétention d'un composé dans la colonne jusqu'au détecteur varie selon son point d'ébullition, sa
solubilité dans la phase liquide, et la température de la colonne.

Les composés à point d'ébullition élevé et solubilité élevée dans la phase liquide ont
des temps de rétention plus longs​​.

21
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Le principe de la chromatographie en phase gazeuse
(CPG) implique la vaporisation de l'échantillon, qui est
ensuite injecté au sommet de la colonne
chromatographique. L'élution, ou séparation des
composants de l'échantillon, est réalisée grâce à un
courant de gaz inerte, connu sous le nom de gaz vecteur,
qui constitue la phase mobile. Ce gaz permet le transport
de l'échantillon à travers la colonne sans aucune
interaction avec les analytes, facilitant ainsi une
séparation basée sur la répartition différentielle des
composants entre une phase stationnaire et la phase
mobile gazeuse.

22
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Alimentation en Gaz Vecteur

• Utilisation de gaz inertes : Hélium (He), Azote (N₂),

Hydrogène (H₂), Argon (Ar)
• Pureté du gaz : Exempt de H₂O et O₂, séchage par
tamis moléculaire
• Régulation du débit :
- Colonnes remplies : 25 à 100 mL/min
- Colonnes capillaires : 0,5 à 5 mL/min

23
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
fuite de gaz à
Injection de l'Échantillon septum
travers le septum

• Microseringue : 1µL à 10µL insert

gaz vecteur
• Injection à travers un septum dans une
bloc
chambre de vaporisation équipée d'un insert, insert chauffant

située à l'extrémité de la colonne. fuite de gaz de

split (division)
• Température de l'injecteur : doit être réglée
pour permettre la vaporisation de l'échantillon
sans le décomposer, idéalement environ 50°C ferrule pour
colonne colonne
au-dessus du point d'ébullition de son capillaire capillaire
composant le moins volatil.
Mélange gaz
vecteur/échantillon

24
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
fuite de gaz à
Injection de l'Échantillon septum
travers le septum

Insert d'Injecteur : insert

gaz vecteur
• Un insert est un récipient fin en verre
placé dans la chambre de vaporisation bloc
de l'injecteur. insert chauffant
• Il sert à concentrer l'échantillon et à le
fuite de gaz de
guider avec précision dans la colonne.
laine de split (division)

Laine de Verre : verre

• Un petit morceau de laine de verre est
souvent placé dans l'insert. ferrule pour
• Elle agit comme un filtre pour empêcher colonne colonne
capillaire capillaire
les particules solides de l'échantillon ou
d'autres contaminants d'entrer dans la
colonne chromatographique. Mélange gaz
vecteur/échantillon

25
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
fuite de gaz à
Injection de l'Échantillon septum
travers le septum

Spécificités de l'Injection selon le Type de

gaz vecteur
Colonne
bloc
• Colonnes remplies (les plus anciennes): insert chauffant
Injection directe de 0,1 à 0,5 µL de
fuite de gaz de
solution de l'échantillon dans un injecteur
split (division)
“classique”, à vaporisation directe

ferrule pour
colonne colonne
capillaire capillaire
• Colonnes capillaires (faibles débits):
Injecteur avec ou sans division Mélange gaz
(split/splitless) vecteur/échantillon

26
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
Ce flux contrôlé est conçu
 Instrumentation pour maintenir la pression à
l'intérieur de l'injecteur à des
fuite de gaz à niveaux appropriés et pour
Injection de l'Échantillon septum éviter toute surpression qui
travers le septum
Mode Split pourrait survenir lors de
l'injection de l'échantillon.
• Utilisé pour les échantillons concentrés gaz vecteur
• Seule une fraction de l'échantillon est introduite dans la
bloc
colonne chauffant
• Évacuation d'une grande partie du mélange par la vanne insert
de split fuite de gaz de
• Avantages : Empêche la surcharge de la colonne et split (division)
améliore la séparation des composants
Mode Splitless
ferrule pour
• Utilisé pour les échantillons à faible concentration colonne
colonne
• L'intégralité de l'échantillon est injectée dans la colonne capillaire
capillaire
• Vanne de purge activée après une période définie pour
éliminer les excès de solvant
Mélange gaz
• Avantages: Augmente la sensibilité pour les composants à vecteur/échantillon
faibles concentrations

27
 Colonnes
2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG) capillaires

 Instrumentation
Colonne et four
La colonne chromatographique est placée à l'intérieur d'une enceinte
thermostatée (Four), capable de réguler la température entre 20 et 450 °C,
avec une fonctionnalité permettant la programmation de la température.

Colonnes capillaires
• Matériau et Construction:
La majorité des colonnes modernes sont en silice fondue (très pure) souvent recouvertes d'une gaine extérieure en
polyamide pour offrir une résistance thermique à haute température.
• Caractéristiques Physiques:
Diamètre Intérieur: Varie de 0,1 à 0,35 mm, ce qui est très fin et permet une grande interaction entre l'échantillon et la
phase stationnaire.
Longueur: Peut varier de 10 à 100 mètres, mais 25 mètres est une longueur commune. La colonne est enroulée en
spirales d'environ 15 cm de diamètre pour s'adapter à l'espace de l'instrument.
Épaisseur du Film de Phase Stationnaire: Varie de 0,05 à 5 µm, ce qui influence la séparation des composants en
fonction de leur solubilité dans la phase stationnaire.

28
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Colonne et four
Colonnes capillaires
• La phase stationnaire:
Polysiloxanes comme Phase Stationnaire
- Structure de base: Chaîne de siloxane (R-Si-O)
- Exemple commun (R = Me) : Polydiméthylsiloxane (apolaire)
- Substitution pour augmenter la polarité:
• Groupes phényle à différents pourcentages (5%, 50%, etc.)
• Trifluoropropyle (C3H6CF3)
• Cyanopropyle (C3H6CN)

Polyéthylène Glycol (PEG) pour Polarité Élevée

- Structure chimique: Répétition de groupes d'éthylène glycol (HO-CH2-CH2-O)
- Nom commercial: Carbowax®
- Utilisation: Séparation des composés polaires

29
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Colonne et four
Colonne utilisée pour l'analyse du limonène dans l'huile essentielle de citron

Le 5% Phényl-polyméthylsiloxane est une phase stationnaire semi-polaire utilisée en chromatographie en

phase gazeuse. Elle contient un groupe phényle qui lui confère des propriétés de sélectivité pour les
composés polaires en raison de l'interaction π-π entre le groupe phényle de la phase stationnaire et les
composés aromatiques ou les doubles liaisons conjuguées de l'échantillon. Cependant, puisqu'elle n'est pas
entièrement faite de groupes phényl (seulement 5%), elle conserve une bonne part de caractère non polaire
due au polyméthylsiloxane, ce qui lui permet de séparer également des composés non polaires. Cette
combinaison permet à la phase de séparer un large éventail de composés avec différents degrés de polarité.

C'est une phase couramment utilisée dans de nombreux laboratoires pour la CPG.

30
Le limonène est un hydrocarbure monocyclique avec la Solvant:
formule C10H16. Principalement extrait des zestes hexane
d'agrumes, ce composé est renommé pour son parfum
caractéristique d'agrumes et est largement utilisé dans
l'industrie des parfums, des produits de nettoyage, des
cosmétiques et de l'alimentation. Il est également étudié
pour ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et
thérapeutiques potentielles.
Même temps de
rétention

Echantillon:
l’huile
Etalon: limonène Limonène essentielle
dans l’huile de citron
essentielle
de citron

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 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Les facteurs influençant la séparation en chromatographie en phase gazeuse (CPG) :
Température : Si les constituants du mélange à séparer ont des polarités voisines, les composés les plus volatils sont les
plus rapidement entraînés. Une température trop basse ralentit les échanges entre la phase stationnaire et le gaz vecteur,
conduisant à des pics déformés ou dissymétriques. Une température trop élevée empêche l'équilibre entre les phases,
résultant en une élution simultanée des constituants. Une température variable (gradient de température) est souvent
utilisée pour les mélanges avec de grands écarts de points d'ébullition.
Débit du gaz vecteur : Ce débit doit permettre un équilibrage entre les phases mobile et stationnaire. Un débit trop rapide
nuit à la séparation, tandis qu'un débit trop lent entraîne une perte de finesse des pics. Un débit optimisé, combiné à une
température appropriée, améliore la finesse des pics.
Longueur de la colonne : Une colonne plus longue améliore l'efficacité de la séparation mais peut réduire la finesse des
pics et nécessite une pression de gaz vecteur plus élevée.
Nature de la phase stationnaire : La phase stationnaire doit être chimiquement inerte et utilisée dans ses limites de
température. Des phases stationnaires de différentes polarités sont choisies en fonction de la nature des composés à
séparer. Des phases polaires retiennent mieux les substances polaires, et inversement pour les phases apolaires. La règle
générale est que les structures de polarités similaires ont de meilleures affinités entre elles.

32
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Principe de Base : Le FID détecte les composés organiques en mesurant les ions
produits lors de la combustion de ces composés dans une flamme. Ce détecteur est
particulièrement sensible aux substances contenant des atomes de carbone (à
l'exception du dioxyde de carbone).

33
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Processus de Détection :
• Échantillonnage : L'échantillon élué de la colonne de CPG est introduit dans la
flamme du FID.
• Combustion : La flamme est généralement produite par un mélange d'hydrogène
et d'air. Lorsque les composés organiques passent dans cette flamme, ils sont
rapidement brûlés (oxydés).
• Ionisation : La combustion des composés organiques produit des ions et des
électrons. Ces particules chargées sont ce que le FID détecte. La quantité d'ions
générée est proportionnelle à la quantité de composé organique.
Détection et Mesure :
• Un collecteur (généralement une tige métallique) placé près de la flamme capte
les ions produits.
• Un courant électrique est généré en raison du mouvement des ions vers le
collecteur. Ce courant est proportionnel à la quantité de composé organique
brûlé.
• Le signal électrique est amplifié et enregistré. Le pic dans le chromatogramme
correspond à la concentration du composé dans l'échantillon.

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https://www.youtube.com/watch?v=PV4NYBUaUrQ
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Avantages :
- Plage linéaire étendue : Convient pour une large gamme de concentrations
(jusqu'à 7 ordres de grandeur).
- Sensibilité aux composés organiques : Excellente détection des
hydrocarbures et composés contenant du carbone.
- Robustesse et fiabilité : Facile à utiliser, peu d'entretien nécessaire.
- Insensibilité à l'eau et aux gaz inorganiques : Pas de perturbations dues à
H₂O ou O₂.
- Polyvalence : Utilisable pour presque tous les composés organiques.

Inconvénients :
- Non sélectif : Pas adapté pour des analyses ciblées (azote, halogènes, etc.).
- Insensibilité aux composés non carbonés : Ne détecte pas les composés
inorganiques ou non combustibles.

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 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteur à capture d’électrons (ECD)
Principe de Base : Il s’agit d’un détecteur considéré comme sélectif car il est beaucoup plus
sensible aux dérivés halocarbonés. Un courant d’azote, ionisé par un flux d’électrons généré au
moyen d’une source radioactive β− de faible énergie, circule entre deux électrodes soumises à une
ddp d’une centaine de volts, de telle sorte qu’il s’établit, au repos, un courant de base I0 dû
essentiellement aux électrons libres, très mobiles.
Si des molécules M, contenant un halogène (F, Cl ou Br), traversent la zone entre les deux
électrodes, elles captent une partie des électrons thermiques pour former des ions négatifs lourds,
donc moins mobiles.
Avantages :
- Excellentes limites de détection : Meilleures que celles du détecteur à ionisation de flamme (FID).
- Sélectivité : Très sélectif pour les composés halocarbonés.
Inconvénients :
- Plage linéaire limitée :La réponse du détecteur est linéaire seulement sur 2 ordres de grandeur
(facteur 100).
- Interférences possibles avec H₂O et O₂ :L'eau (H₂O) et l'oxygène (O₂) peuvent capturer des
électrons, ce qui perturbe le signal. Les échantillons et les phases mobiles doivent donc être
extrêmement purs pour éviter ces interférences.
- Problèmes liés à l'utilisation de solvants chlorés lors de la préparation d'échantillons (extraction) : Les
solvants chlorés, comme le dichlorométhane (CH₂Cl₂), peuvent interférer fortement avec la détection.
Cela est dû à leur forte capacité à capturer des électrons, ce qui génère des signaux parasites.

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https://www.youtube.com/watch?v=cqAPpiytGAg
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteur thermoionique (NPD)
Principe de Base : Ce détecteur est très sensible aux composés azotés (N) ou
phosphorés (P). Il utilise une source d’ionisation chauffée, souvent un filament contenant un
métal alcalin (généralement du rubidium ou du césium). Lorsqu'un composé contenant de
l'azote ou du phosphore passe dans le détecteur, ces atomes interagissent avec la source
d'ionisation. Cette interaction libère des électrons, qui sont capturés pour générer un signal
électrique proportionnel à la concentration du composé.

Avantages :
- Spécificité : Très sensible aux composés contenant de l’azote et du phosphore.
- Limite de détection faible : Peut détecter des concentrations très faibles.
- Utilisation fréquente : Idéal pour les analyses de pesticides, de médicaments ou d'autres
composés organiques spécifiques.

Inconvénients :
- Le NPD a un domaine de réponse linéaire plus étroit par rapport à d'autres détecteurs
comme le FID. Cela peut compliquer l'analyse de composés dans des échantillons présentant
des concentrations très différentes.
- Entretien : La source d’ionisation nécessite un entretien régulier (remplacement du filament).

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https://www.youtube.com/watch?v=ddyjZmBAO2c
 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)
 Instrumentation
Détecteurs

Make-up gaz: Par nature, ces trois détecteurs (FID, NPD, ECD) doivent être alimentés avec un débit gazeux de
20 mL/min au minimum, bien supérieur au débit réel des colonnes capillaires, pour donner une réponse correcte
et augmenter leur sensibilité. Ce débit est atteint en mélangeant en sortie de colonne un gaz d’appoint, identique
ou différent (tel le diazote) de celui qui sert de phase mobile. Cette opération est désignée par le terme make-up.

38
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
La Chromatographie Liquide Haute Performance
(HPLC) est une méthode chromatographique qui
utilise un liquide comme phase mobile. Elle est
largement applicable dans de nombreux
domaines, y compris ceux couverts par la
Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG), et
est particulièrement utile pour l'analyse de
composés qui sont soit thermosensibles, soit de
grande masse moléculaire, y compris ceux qui
sont polaires. Un des principaux avantages de la
HPLC réside dans sa capacité à offrir une
sélectivité très précise dans la séparation des
composés. Cette sélectivité est obtenue grâce à
la possibilité de choisir soigneusement la
colonne chromatographique et la composition
de l'éluant utilisé dans le processus.
39
https://www.youtube.com/watch?v=eCj0cRtJvJg
3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation

40
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Réservoirs de la phase mobile

Les contenants de la phase mobile sont des réservoirs qui contiennent

la phase mobile utilisée dans le processus chromatographique. Ces
réservoirs sont généralement fabriqués en verre et ont une capacité
variant de 200 à 1000 millilitres.

41
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Dégazeur

L’objectif du dégazeur est d'éliminer les gaz dissous, tels que l'oxygène
O2 et l'azote N2, de la phase mobile avant qu'elle n'entre dans la
colonne chromatographique.

En éliminant les gaz, le dégazeur contribue à maintenir un flux constant

et sans interruption de la phase mobile, assurant ainsi une séparation
plus précise et fiable des composés dans l'échantillon.

42
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Pompe

Dans l’HPLC, la pompe joue un rôle essentiel en assurant un débit

constant et précis de la phase mobile, tout en gérant les hautes
pressions nécessaires pour son passage à travers la colonne remplie.
Elle opère en deux modes principaux : le mode isocratique, où la
composition de la phase mobile reste invariable, adapté pour des
analytes nécessitant un solvant constant, et le mode gradient, où la
composition de la phase mobile varie au cours de l'analyse, permettant
une séparation optimale pour des échantillons plus complexes. Cette
capacité de la pompe à fournir un débit précis et à gérer efficacement
différents profils de solvants est cruciale pour la fiabilité et la précision
des analyses en HPLC.

43
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Injecteur automatique

L'injecteur automatique en HPLC, grâce à ses composants tels que l'aiguille et

le piston de la seringue, le réservoir de lavage, la vanne d'injection et le
passeur automatique, permet une injection précise et reproductible des
échantillons, essentielle pour des analyses chromatographiques fiables et
efficaces.

44
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Injecteur automatique

 L'aiguille et le piston de la seringue

Le piston de la seringue, en coordination

avec l'aiguille, remplit deux fonctions clés
dans l'injecteur automatique d'un système
HPLC : il aspire d'abord l'échantillon en
créant un vide, puis le pousse à travers
l'aiguille pour l'injection. Ce processus
d'aspiration et d'injection précis est crucial
pour garantir la fiabilité et la précision des
analyses chromatographiques en HPLC.

piston Aiguille
45
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Injecteur automatique

 Réservoir de Lavage de la Seringue :

Ce compartiment est rempli d'un solvant

spécifique (Eau ultra-pure + 10% méthanol)
destiné au nettoyage de l'aiguille et du piston
de la seringue après chaque injection. Cette
étape de nettoyage est essentielle pour
prévenir toute contamination entre différents
échantillons.

Réservoir de Lavage
de la Seringue
46
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
PM de la pompe
 Instrumentation (position 1)

Boucle
Injecteur automatique (positions 2 et 5)

 Vanne d'injection :
La vanne d'injection, munie d'un levier,
alterne entre les modes de chargement et 2 1
d'injection et intègre une boucle offrant un 3
large choix de volumes selon les exigences 6
analytiques. L'échantillon est chargé dans la 4
5
boucle en mode chargement, puis le levier
est activé pour changer le sens de circulation
vers le mode d'injection, dirigeant ainsi
l'échantillon vers la colonne. La capacité de
choisir parmi différents volumes de boucle,
combinée à la précision de la vanne, garantit
une manipulation précise et adaptable des Lié à la PM vers la
échantillons, essentielle pour la qualité et la seringue colonne
fiabilité des analyses en HPLC. (position 4) (position 6)

Effluent ou poubelle Vanne 47

(position 3) PM: phase mobile
d'injection
 Boucle 20 μL
Levier

Dans la position chargement, où Dans la position injection,

seule la communication entre pompe l’échantillon est inséré dans le flux de
et colonne est assurée (16), phase mobile (1256) par rotation
l’échantillon est introduit à pression de 60° d’un levier qui permet d’inverser
atmosphérique (4523) à l’aide le sens de circulation dans la boucle.
d’une seringue dans un petit volume
tubulaire appelé boucle, dont il existe
tout un choix de volumes.

Boucles (différents volumes)

48
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Colonne thermostatée

La colonne est généralement placée dans un four ou une chambre

thermostatée qui permet de régler la température souhaitée. Dans certaines
analyses, il peut être nécessaire de chauffer ou de refroidir la colonne par
rapport à la température ambiante pour obtenir des conditions de séparation
optimales. (Voir des exemples de colonnes utilisées en HPLC: diapos
15,16,17,18,19)

49
 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)
 Instrumentation
Dérecteur

En HPLC, les détecteurs d’absorption UV-Visible sont fréquemment

employés. Ils se divisent en trois types principaux :

• Détecteurs à longueur d'onde fixe, souvent réglés à 254 nm.

• Détecteurs à longueurs d'ondes variables, avec une plage de 200 à
700 nm, permettant le choix d'une longueur d'onde spécifique.
• Détecteurs à barrette de diodes (DAD), capables d'analyser Détecteur à
l'ensemble du spectre de manière simultanée.(voir le cours de barrette de
spectroscopie UV-visible) diodes

50
 Identification de l’acide caféique dans un extrait phénolique de margine (colonne utilisée C18, mode gradient (mélange
acétonitrile/eau), détecteur à barrette de diodes.
CAFEICACID-19-04 #6251 RT: 20.84 AV: 1 NL: 8.52E5 microAU
RT: 0.00 - 60.00
20.80 NL: 323.00
550000
Acide caféique 5.54E5
nm=230.1-
100

231.1 95
500000 PDA
CAFEICAC 90
ID-19-04
85
450000

400000
Spectre UV du 80

75
217.00

350000 composé qui sort à 70

65

Chromatogramme 20,8 min 60

238.00

Relative Absorbance
300000
55

de l’étalon: acide 250000 50

uAU
45
200000

caféique
40

150000 35

100000
(détecteur DAD) 30

25

20
50000
0.21
15
43.76 47.23 57.17 59.41
0 10

5
-50000
0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
wavelength (nm)
-100000
0 5 10 15 20 25 30
Time (min)
35 40 45 50 55 60
Même
Même temps de
RT: 0.00 - 60.00
testPHEN-23 #6222 RT: 20.74 AV: 1 NL: 1.12E5 microAU
spectre
340000 rétention
11.17 NL:
3.42E5
Total Scan
100
323.00

320000 PDA 95
testPHEN-
23 90
300000
85
280000

260000
Spectre UV du 80

75
217.00

240000

220000
composé qui sort à 70
237.00
65

Chromatogramme 200000 20,8 min 60

Relative Absorbance
55
180000

de l’échantillon:
uAU

160000 Acide caféique 50

140000 dans l’extrait 43.03 45

extrait phénolique
40
phénolique de
120000

15.81 margine
(détecteur DAD) 35

100000 30

de margine 80000 12.14 13.88

39.07
25

20
60000
43.51 15
40000
27.98 35.33
20.75 29.21 10
0.23 4.71 34.80 38.21
20000 19.77 43.65 57.52
17.36 22.44 25.29 54.73 5
31.51 41.84 45.00 47.47 53.73
4.33 6.00 10.17 49.05 55.29
0
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
Time (min) wavelength (nm)

51